JPS63202369A - レ−ザ穿孔方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、レーザ穿孔装置に係り、特に生細胞を対象に
穿孔し、これに遺伝子を移入するレーザ穿孔装置に関す
る。

〔従来の技術〕

第５図は、従来公知のレーザ穿孔装置を示す。

第５図において、１は穿孔用レーザ、２はレーザ１の発
生するレーザ光の光路を見るための参照用レーザ光を発
生する参照用レーザである。また、３は顕微鏡、４は顕
微鏡に組込まれた光路偏光装置である。上記穿孔用レー
ザ１によって発生されたレーザ光は、シャッタ５を経由
して、また参照用レーザ光はそのままの状態で光学的イ
ンターフェイス６に入射され、ここで両者のレーザ光が
所望の特性に変換された後、両者を同軸にして光路偏光
装置４に入射される。同軸にされたレンズはここで微少
な位置決めをされ、対物レンズ７で集光され、ステージ
８上に設置された試料容器９中の試料１０に入射される
。上記光路偏光装置はここに入射されたレーザ光を試料
１０のＸＹ方向へ偏光できる構造になっている０以上の
ように構成された同装置において、生試料をモニタに映
し。

このモニタ上の生試料の任意の箇所にライトペンで指示
することにより、レーザ穿孔を行なっている。この場合
、生試料の細胞膜上にレーザ焦点が合致した場合のみ穿
孔が可能であるが、従来技術においては、この合焦操作
が自動化されていなかった。

なお、上記した如き従来技術は、特開昭６０−８３５８
３号公報に開示されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

レーザ穿孔装置を用いての生試料への遺伝子移入は、穿
孔用パルスレーザ光を生試料表皮に照射し一時的に孔が
あいたところに遺伝子が流れ込むことを利用している。

一時的に孔をあけるという動作は、適当なエネルギで、
生試料表皮に穿孔用レーザを合焦させると、生試料のレ
ーザ照射部位が一瞬開孔し、その後生試料自身の自己修
復作用により自ら孔を閉じることで起きる。以下このよ
うな状態を「有効な穿孔」と呼ぶ。

従って、遺伝子移入効率を高めるためには有効な穿孔が
必要であり、生試料表皮に穿孔用レーザ光を確実に合焦
させるということが重要となる。

従来技術において、合焦操作の自動化はなされていない
、つまり、モニタ上に映し出されている各各の補胞等の
生試料において光軸方向に起伏があれば、各々の箇所に
応じて１合焦操作を行なわなければ有効な穿孔は不可能
となる。この合焦操作とは手動でステージを上下させ顕
微鏡やモニタ画像から受ける印象や、ライトペンの指示
箇所へ照射されている参照用レーザ光のスポットをｓｔ
ｍしながら、その焦点位置を判断する。その後穿孔レー
ザ光を照射してみることで合焦を確認する。有効な穿孔
が得られるまで試行を繰り返すことになる。

以上のように、モニタに映った任意の生試料に対しすば
やく有効な穿孔を行なうことは難しかった。

本発明は、生試料表皮にすばやく自動合焦し、高能率な
穿孔を可能にすることを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明は、ライトペンでのモニタ画面上の指示位置の光
強度を検出し、この光強度を用いてビームウェスト位置
と生試料表面とが合致する位置を含む所定領域を求め、
この所定領域内でビームウェスト位置と生試料表面位置
との距離を変更し。

この変更期間中に穿孔用レーザ光を生試料に照射するよ
うにしたことを特徴とする。

［作用〕 対物レンズ通過後の参照用レーザ光のビームウェスト位
置と生試料表面との距離を変化させて。

モニタ画面上のライトペン指示位置での光強度の変化を
検出する。この段階で、ビームウェスト位置と生試料表
面とが合致した位置（合焦位置）をみつけ、この位置を
含む所定範囲の領域を見出す。

次に、この領域内でビームウェスト位置と生試料表面と
の距離を変更させる。この変更によって、上記合焦の状
態が存在するので、この変更期間中に穿孔用レーザ光を
生試料に照してやれば、合焦した状態でのレーザ光の距
離の確率は高くなる。

これによって、生試料表面に合焦したレーザ光は、穿孔
可能なエネルギ密度に達し、有効な穿孔を行う。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。

第１図は本発明の一実施例を示すブロック図である。第
２ａ図はステージを移動させた時参照用レーザ光のビー
ムウェスト位置が生試料内部に存在する場合のモニタＴ
Ｖ像を表わし、第２ｂ図はレーザ光と生試料表皮の相対
位置関係を示す概念図である。同様に第３ａ図、第３ｂ
図は、生試料表皮ビームウェスト位置と合致した場合の
モニタＴＶ像、概念図を夫々表わす、第４ａ図、第４ｂ
図は、生試料表皮がビームウェスト位置から離れたとこ
ろに存在する場合のモニタＴＶ像、概念図を夫々表わす
、第５図は、第２ａ図〜第４ｂ図のようにテーブルを移
動させ、生試料表面のレーザ光反射強度をセンシングし
ていった場合の補助説明図である。第６ａ図はビームエ
キスパンダ２２を変動させた場合の対物レンズ７による
穿孔用レーザ光２１のビームウェスト位置の変化を表わ
し、上から■、■、■とすると、第６ｂ図は第６ａ図の
■、■、■に対応したビームウェストと生試料表皮の相
対位置関係を示す概念図である。第７図は第６ａ図のよ
うにビームエキスパンダ２２が■から■まで変化する間
の発振回数だけ穿孔用レーザ光を照射した時各照射ごと
のレーザ光ビームウェスト位置を示した図である。

第１図において、穿孔用レーザ光２１を発生する穿孔用
レーザ１と、参照用レーザ光１５を発生する参照用レー
ザ２は、光学的インターフェース（例えばダイクロイッ
クミラー）６によって、上記２つのレーザ光が同軸にな
るように配置されている。顕微鏡３は対物レンズ７を有
し、該レーザ光をステージ８上の生試料１０に照射する
ように配置されている。生試料１０は、試料容器９の内
側に保存されている。ＴＶカメラ１９は、顕微鏡３で得
られた生試料像を撮像できるように顕微鏡３の図示しな
い鏡筒に固定されている。モニタＴＶ１２は、間にスキ
ャナコントローラ２８２位置検出回路２７．カメラコン
トローラ２６を介してＴＶカメラ１９に接続されている
。モニタＴＶ１２上の画像の任意の位置を指示するライ
トペン１１は位置検出回路２７と結線されている。スキ
ャナコントローラ２８は、位置検出回路２７から送られ
てくる搬像信号とライトペン指示位置信号を受けてスキ
ャナドライバ２９に制御信号を、モニタＴＶ１２に画像
信号を送るように結線されている。

スキャナドライバ２９は、その制御信号を入力してライ
トペンで指示された位置に対応する生試料上の位置に前
記レーザ光を偏光する光路偏光装置４に結線されている
。穿孔の際に穿孔用レーザ光２１を通過させるためシャ
ッタ５が穿孔用レーザ１の出口直後のところに配置され
ている。ライトペン１１の指示位置に対応する生試料上
には参照用レーザ光１５のスポットができる。スポット
は、モニタＴＶ１２上で光輝エリア１６として映し出さ
れる。ライトペン１１の先端には、この光輝エリアの光
強度をセンシングできる光輝度センサ３０が併設されて
いる。光輝度センサの信号は光強度検出部２０へ入力さ
れ、さらに演算制御部２５へ出力される。演算制御部２
５には、上記入力の他に穿孔用レーザ１からのレーザ光
発振信号を入力し、各制御指令がシャッタコントローラ
２８、ビームエキスパンダコントローラ２７．ステージ
コントローラ２６へ各々出力されるように結線されてい
る。シャッタコントローラ２８は前記シャッタ５へ開閉
タイミングを与える信号を発する。ビームエキスパンダ
コントローラ２７の信号は、モータ２４に伝達するよう
に結線されている。ギヤ部２３は、モータ軸出力をビー
ムエキスパンダ２２に伝達するように設置されている。

ステージコントローラ２日も同様にモータ１４と結線さ
れギヤ部１３はモータ１４の出力をステージ８へ伝達す
るように設置されている。

次に、第１図に示す実施例の動作を詳細に説明する。

第１図に示すように、ライトペン１１をモニタＴＶ１２
の画面上、生試料１０の穿孔したい箇所へ移し軽く押え
る。それは操作開始信号として演算制御部２５へ伝達さ
れる。演算制御部２５は。

この信号を受けて、ステージ８を第５図に示すように現
在位［Ｚ　ｏからＺｌへ、その後Ｚ１からＺｌまで移動
させる命令をステージコントローラ２６へ伝達する。こ
のテーブル移動範囲は１合焦位置がその範囲内に入るよ
うに設定する必要がある。上記命令を受けてステージ８
は、顕微鏡３の微動つまみに連動したギヤ部１３．モー
タ１４によって所定量移動する。このステージの移動に
伴って、生試料１０に照射されている参照用レーザ光１
５による光輝エリア１６の光輝度が変化する。

第３ａ図に示すように、この光輝度は生試料表皮１８に
参照用レーザ光１５のビームウェストが合致した時、最
も強くなる。ライトペン１１先端の光輝度センサ３０は
、この光輝度変化を検知し、光強度検出部で例えば第５
図の３１のようにデジタル信号化される。さらに、メモ
リによってそれらの信号は保存される。ステージ８の移
動によるセンシングが終了すると演算制御部２５は、上
記メモリ中のデータを受けとり、ビームウェストと生試
料表皮１８が合致する位置Ｚｒと測定による位置の誤差
範囲ΔＺを演算する１次に、その値の決定方法を示す。

得られたデータは第５図３２に示すように回帰曲線で補
正される。この曲線でピークとなる位置をＺｒ　とする
。Ｚｒは確実な値ではなく測定による誤差を含む。そこ
でＺｒでの光強度値Ｉ　＋ａｌ１ｍに対してＩ　＝０　
、９５　Ｘ　Ｉ　ｍＪＩＫの光強度値をとるピーク両端
のステージ位置の差をΔＺとする。ＺｒとΔＺの決定方
法としては、微分を用いてピーク位置を決定する方法や
、しきい値を設けて上記合致点が含まれる範囲ΔＺを定
め、その中間位置をＺｒ　とする方法なども用いること
ができる。演算制御部２５はＺｒの位置へステージ８を
移動させる命令をステージコントローラ２６へ送る。

次のステップとして演算制御部２５ではΔＺの値よりビ
ームエキスパンダ作動量を演算する。上記作動量の演算
には、ビームエキスパンダ２２のレンズ間距離と対物レ
ンズ７を通過したレーザ光の焦点位置との実験式を用い
る。

この実験式からΔＺに対応したビームエキスパンダレン
ズ間変化量ΔＬが計算される。この値は、演算制御部２
５からビームエキスパンダコントローラ２７へ伝達され
る。コントローラはモータ２４に対して、現在のレンズ
間距離ΔＬ／２縮めるための信号を発する。

その後、演算制御部２５は、穿孔用レーザ１によるレー
ザ光発振パルスの最も早い信号をトリガとして捉え、即
座にシャッタコントローラ２８゜ビームエキスパンダコ
ントローラ２７へ信号を発する。これを受けて、はぼ同
時にシャッタ５は開き、ビームエキスパンダ２２のレン
ズ間距離は第６ａ図の■、■、■のように変化する。す
なわち、第６図の■、■、■に示すように細胞１０に対
して焦点位置が所定量変化する。

第７図に示す例では、焦点位置がΩ−五からＱｌまでΔ
Ｑ変化する間に穿孔用レーザ光２１は１０回照射される
。この１０回の内、焦点が細胞表皮１８と重なった■の
場合、有効な穿孔が起こることになる。所定量の走査が
終了すると、シャッタ５は閉じられ、ビームエキスパン
ダ２２のレンズ間距離は初期設定値へ戻る。

以上の過程を経て、確実に生試料に有効な穿孔を行なう
ことができる。生試料表皮１８は、表面の状態が一様と
は限らないので、参照用レーザ光１５の光輝エリア１６
の光輝度の最大値は、ライトペン指示位置によって異な
る。また、その指示位置の光輝度センシングデータ自体
にもばらつきがある６以上のような理由から、本実施例
においては、データから回帰曲線を求め、そのピーク値
を選ぶという方法を採っている。しかし１個々のポイン
トにおいて、平坦に近い面を持つ試料に対しては、ステ
ージを上下振動させ、レーザスポツトの光輝度変化によ
ってフィードバックをかけながら目的の焦点位置へステ
ージを収束させてゆく方法でも良い、このような方法だ
と、本実施例に比べて、さらに短かい時間で穿孔が可能
となる。

また、光輝度センシングをさらにに正確にするために次
のような方法が考えられる。

テレビカメラの直前にハーフミラ−を設け、試料像を反
射して光感応素子をマトリックス状に分布したセンサー
へ導く。この光感応素子は、参照用レーザ光の波長（本
実施例においては、波長６３３ｎｍ）に特に敏感なもの
を選ぶ、ライトペンの指示箇所に対応した素子に試料か
らの参照用レーザ光反射光が照射されているので、該光
感応素子は上述のライトベン先端の開度センサの役割を
代用する。この方法を用いると、さらに合焦精度は向上
する。

上記した実施例に用いた穿孔用レーザは、パルス発振型
のレーザであるが、例えば連続発振型のレーザを用いる
こともできる。レーザ光出口において光シャッタを設け
、ビームエキスパンダの距離変化の際レーザ光を一定時
間開放しながら照射する方法や断続的に通してレーザ光
をパルス化しながら照射する方法などが可能である。

また、上記の実施例では、参照用レーザ光１５のビーム
ウェスト位置と生試料表皮１８の距離を変化させる手段
としてテーブル８を移動させる方法を採ったが、振動等
の外力を嫌う試料等の場合は光学的インターフェース６
と試料の間にビームエキスパンダを追加して上記手段を
代行させることが可能である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、モニタに映った生試料の任意の箇所に
おいて、ライトベンを近づけることにより、そのポイン
トにおける自動合焦が可能となる。

さらに、上記合焦操作の誤差を補うために、穿孔用レー
ザ光を、光軸方向に走査させることで、ライトペンで指
示した箇所に対し、確実に有効な穿孔が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す概略図、第２８図、第
２ｂ図、第３ａ図、第３ｂ図、第４ａ図および第４ｂ図
は生試料をパイロットレーザ光焦点に対して移動させた
場合のモニタに映るスポット像の変化を示した図、第５
図はステージ位置とレーザスポット光輝度の関係の一例
を示した図、第６ａ図および第６ｂ図はビームエキスパ
ンダレンズ間距離と穿孔レーザの焦点走査の状態を表わ
した図、第７図はレーザ焦点走査と照射タイミングを示
す図、第８図は従来技術を示す図である。 １・・・穿孔用レーザ、２・・・参照用レーザ、３・・
・顕微鏡、４・・・光路変更装置、５・・・シャッタ、
６・・・光学的インターフェース、７・・・対物レンズ
、９・・・試料容器、１０・・・生試料、１１・・・ラ
イトペン、１２・・・モニタＴＶ、１３・・・ギヤ部、
１４・・・モータ、１５・・・参照用レーザ光、１９・
・・ＴＶカメラ、２０・・・光強度検出部、２１・・・
穿孔用レーザ光、２２・・・ビームエキスパンダ、２３
・・・ギヤ部、２４・・・モータ、２５・・・演算制御
部、２６・・・カメラコントローラ、２７・・・位置検
出回路、２８・・・スキャナコントローラ、２９・・・
スキャナドライバ、３３・・・シャッタコントローラ、
３４・・・ビームエキスパンダコントロ第２４図　ｆ北
国　　Ｔ４に ”ｔｚｂ図　　　’ＥＥｂ図　　　第４ｂ図冨５図 Ｚ−：ｊ１８ズｆ−３；４ｆＬ＃ ３２　　　看り′￥４６し９回帰−シ秀鳴しＴ〆久図　
　　　　　ｆＺｂ図 ７７　カム゛−り゛クス １８主麩）り仮 第　７　　図 ノ、−ノーｌ＝ΔＺ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、穿孔用レーザ光と参照用レーザ光とを同軸にして顕
   微鏡に導き、該顕微鏡の対物レンズを介してステージ上
   の生試料に該参照用レーザ光を照射した状態における生
   試料像を撮像してモニタ上に画像表示し、該モニタ上の
   画像の任意の位置をライトペンで指示した位置と該画像
   における参照用レーザ光の照射位置とを合致させるべく
   光路偏光を行い、該合致後において前記穿孔用レーザを
   該生試料に照射して穿孔を行うレーザ穿孔方法において
   、 前記ライトペンの指示位置における画面上の光強度を検
   出し、該光強度が最も大となるビームウェスト位置を含
   む所定領域を求めてこの領域内でレーザ光のビームウェ
   スト位置と前記生試料表面との間の距離を変動させ、該
   変動期間内において前記穿孔用レーザ光を前記生試料に
   照射することを特徴とするレーザ穿孔方法。 ２、穿孔用レーザ光を発生する穿孔用レーザと、参照用
   レーザ光を発生する参照用レーザと、上記２つのレーザ
   光を同軸にして顕微鏡に導く光学系と、上記レーザ光を
   入射してステージ上の生試料に照射する対物レンズを有
   する該顕微鏡と、該顕微鏡で得られた生試料像を画像表
   示するモニタと、該モニタ上の画像の任意の位置を指示
   するライトペンと、該ライトペンで指示された位置に対
   応する該生試料の位置に前記レーザ光を偏光する光路偏
   光手段と、穿孔の際に前記穿孔用レーザ光を通過させる
   シャッタとを有するレーザ穿孔装置において、 前記ライトペンの指示位置における光強度を検出する光
   強度検出手段と、前記対物レンズ通過後のレーザ光のビ
   ームウェスト位置と前記生試料表面との距離を変更せし
   める変動手段と、該距離変化によって得られる該指示位
   置における前記光強度の変化から該ビームウェスト位置
   と前記生試料表面とが合致する距離を含む所定領域を求
   め、該所定領域に基づいて前記距離を該所定領域内で変
   更させるための制御信号を前記変動手段に出力すると共
   に、該制御信号の出力期間中に前記シャッタに前記穿孔
   用レーザ光の照射指令を出力する演算制御手段とを設け
   たことを特徴とするレーザ穿孔装置。