JPS60164487A - 細胞融合方法 - Google Patents
細胞融合方法Info
- Publication number
- JPS60164487A JPS60164487A JP1832584A JP1832584A JPS60164487A JP S60164487 A JPS60164487 A JP S60164487A JP 1832584 A JP1832584 A JP 1832584A JP 1832584 A JP1832584 A JP 1832584A JP S60164487 A JPS60164487 A JP S60164487A
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- JP
- Japan
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- cells
- cell
- cell fusion
- fusion
- laser light
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- Granted
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Physics & Mathematics (AREA)
- Electromagnetism (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は細胞融合方法の改良に関するものである。
〔発明の１！ｆ景〕
細胞融合は、種の異なった細胞を融合促進剤などを用い
て融合・合体させ、両細胞の特徴を備え持つ雑種細胞を
作る技術であり、バイオテクノロジーの有力な技術とし
て医学・薬学・農学をはじめ広い分野で応用されている
。
て融合・合体させ、両細胞の特徴を備え持つ雑種細胞を
作る技術であり、バイオテクノロジーの有力な技術とし
て医学・薬学・農学をはじめ広い分野で応用されている
。
融合促進剤としては、動物細胞の場合、紫外線照射によ
り不活化したセンダイウィルス（ＨＶＪ）が有効とされ
ている。植物細胞は細胞壁でおおわれているため、細胞
壁分解酵素を作用させて細胞壁を取り除したプロトプラ
ストを形成した後、ポリエチレングリコールなどを添加
して融合を促進させている。このような細胞融合技術に
ついては。
り不活化したセンダイウィルス（ＨＶＪ）が有効とされ
ている。植物細胞は細胞壁でおおわれているため、細胞
壁分解酵素を作用させて細胞壁を取り除したプロトプラ
ストを形成した後、ポリエチレングリコールなどを添加
して融合を促進させている。このような細胞融合技術に
ついては。
たとえば［自然、１９８０年、３月号、２６ページ」や
「生物物理、１９８２年２２巻５号、１４ページ」に詳
細に記述されている。
「生物物理、１９８２年２２巻５号、１４ページ」に詳
細に記述されている。
しかしながらこのような従来技術では、二種類の細胞で
融合を行わせると、異種の細胞が融合した結果生じる雑
種細胞（ヘテロカリオン）と同時に、同種の細胞が融合
した結果生じるホモカリオンが形成するために、両者を
ふるい分け、目的とするヘテロカリオンのみを選別する
ことが困難であるという問題点があった。また、高濃度
で、かつ高粘度のポリエチレングリコールを使用する細
胞融合方法においては、融合後、細胞を洗浄し、ポリエ
チレングリコールを除去しなければならないなど、手順
が鵬雑であるとともに、細胞を長時間にわたって非生理
的条件下に置かねばならないという欠点があった。
融合を行わせると、異種の細胞が融合した結果生じる雑
種細胞（ヘテロカリオン）と同時に、同種の細胞が融合
した結果生じるホモカリオンが形成するために、両者を
ふるい分け、目的とするヘテロカリオンのみを選別する
ことが困難であるという問題点があった。また、高濃度
で、かつ高粘度のポリエチレングリコールを使用する細
胞融合方法においては、融合後、細胞を洗浄し、ポリエ
チレングリコールを除去しなければならないなど、手順
が鵬雑であるとともに、細胞を長時間にわたって非生理
的条件下に置かねばならないという欠点があった。
本発明の目的は、上記問題点を除去し異種間の細胞の融
合を確実にかつ簡便に行わせ得る細胞融合方法を提供す
ることにある。
合を確実にかつ簡便に行わせ得る細胞融合方法を提供す
ることにある。
上記目的を達成するために本発明においては、細胞膜を
介して異種細胞が互いに接触した状態にあるものに対し
て、レーザー光線を照射することを特徴としている。
介して異種細胞が互いに接触した状態にあるものに対し
て、レーザー光線を照射することを特徴としている。
かかる本発明の特徴的な方法により、同種細胞が融合し
た結果化じるホモカリオンの生成を抑え、ヘテロカリオ
ンのみを選択的に作成することができる。また、従来方
法のように高濃度、高粘度のポリエチレングリコールを
使用することなく、簡便な操作で細胞融合を行うことが
できる。
た結果化じるホモカリオンの生成を抑え、ヘテロカリオ
ンのみを選択的に作成することができる。また、従来方
法のように高濃度、高粘度のポリエチレングリコールを
使用することなく、簡便な操作で細胞融合を行うことが
できる。
以下、本発明を図にもとづいて詳細にのべる。
本発明を実施するにあたっては、融合を行わせる異種細
胞を互いの細胞膜を介して接触させる過程が必要である
。このような異種細胞赤互いの細胞膜を介して接触した
状態にあるものを以下被照射対象細胞とよぶ。これを実
施するためには、たとえば異種細胞のプロトプラストを
含む懸濁液中に塩化カルシウム溶液や比較的低濃度（１
〜１０％）のポリエチレングリコール溶液などを添加す
るとよい。このような化学的手法の他に、細胞浮遊液中
に２本の電極を浸し、交流電圧を印加する電気的手法に
よっても電極表面に接触細胞を形成することができる。
胞を互いの細胞膜を介して接触させる過程が必要である
。このような異種細胞赤互いの細胞膜を介して接触した
状態にあるものを以下被照射対象細胞とよぶ。これを実
施するためには、たとえば異種細胞のプロトプラストを
含む懸濁液中に塩化カルシウム溶液や比較的低濃度（１
〜１０％）のポリエチレングリコール溶液などを添加す
るとよい。このような化学的手法の他に、細胞浮遊液中
に２本の電極を浸し、交流電圧を印加する電気的手法に
よっても電極表面に接触細胞を形成することができる。
第１図は本発明による細胞融合方法を実施する装置の１
つの実施例であり、細胞が接触した初期状態から、雑種
細胞の形成に至るまでの過程を観察するための顕微鏡機
能を１８えたものである。同図において１は細胞融合を
誘起するためのレーザー源である。レーザー光の照射エ
ネルギーが高いと細胞を破壊するため、細胞融合用レー
ザー光としては短パルスレーザ−光が適している。本発
明者らの実験では、波長１．０６μｍのＹＡＧレーザー
光の第２高周波（５３０ｎ ｍ） ヤｍ ３１ｔｌｉＪ
ｉｉ波（３５５ｎｍ）を１０〜５０ナノ秒のパルス幅で
照射して融合反応を行った。レーザー源１がら出たレー
ザービーｉｓ ２はピンホール３を経た移、顕微鏡４内
に設けられたハーフミラ−５で反射され、試料台６にに
「かれた８Ｉ胞浮遊浦７中に存在する被照射対象細胞の
細胞膜に照射し、細胞のの融合反応を開始させる。細胞
浮遊液７中で進行する細胞融合の状況は、テレビカメラ
９及びディスプレイ１０からなるテレビモニター装置に
より観察できる。なお、８はレーザー光を除くフィルタ
ー、１１は顕ｖｆｉ鏡１！！察用の光源である。
つの実施例であり、細胞が接触した初期状態から、雑種
細胞の形成に至るまでの過程を観察するための顕微鏡機
能を１８えたものである。同図において１は細胞融合を
誘起するためのレーザー源である。レーザー光の照射エ
ネルギーが高いと細胞を破壊するため、細胞融合用レー
ザー光としては短パルスレーザ−光が適している。本発
明者らの実験では、波長１．０６μｍのＹＡＧレーザー
光の第２高周波（５３０ｎ ｍ） ヤｍ ３１ｔｌｉＪ
ｉｉ波（３５５ｎｍ）を１０〜５０ナノ秒のパルス幅で
照射して融合反応を行った。レーザー源１がら出たレー
ザービーｉｓ ２はピンホール３を経た移、顕微鏡４内
に設けられたハーフミラ−５で反射され、試料台６にに
「かれた８Ｉ胞浮遊浦７中に存在する被照射対象細胞の
細胞膜に照射し、細胞のの融合反応を開始させる。細胞
浮遊液７中で進行する細胞融合の状況は、テレビカメラ
９及びディスプレイ１０からなるテレビモニター装置に
より観察できる。なお、８はレーザー光を除くフィルタ
ー、１１は顕ｖｆｉ鏡１！！察用の光源である。
第２図（Ａ）〜（Ｃ）は、細胞融合の進行過程を示す説
明図である。同図（Ａ）は異種の細胞１４と１５とが互
いの細胞膜を介して接触した状態を示す。この状態にお
かれた被照射対象細胞膜にμｍオーダーに絞ったパルス
状のレーザーを照射すると、異種の細胞１４と１５との
細胞融合が開始する。第２図（Ｂ）は、細胞融合が進行
した段階で観察され、細胞膜のがなり広い面積で接触し
た状態を示す。細胞融合反応が更に進行すると最終的に
は、第２図（Ｃ）に示すように１個の雑種細胞１６が完
成する。第２図（Ａ）から（Ｃ）への反応は温度に依存
するが、２５〜３７℃の温度条件で５〜２０分程度で完
了する。
明図である。同図（Ａ）は異種の細胞１４と１５とが互
いの細胞膜を介して接触した状態を示す。この状態にお
かれた被照射対象細胞膜にμｍオーダーに絞ったパルス
状のレーザーを照射すると、異種の細胞１４と１５との
細胞融合が開始する。第２図（Ｂ）は、細胞融合が進行
した段階で観察され、細胞膜のがなり広い面積で接触し
た状態を示す。細胞融合反応が更に進行すると最終的に
は、第２図（Ｃ）に示すように１個の雑種細胞１６が完
成する。第２図（Ａ）から（Ｃ）への反応は温度に依存
するが、２５〜３７℃の温度条件で５〜２０分程度で完
了する。
完成した雑種細胞１６は、テレビモニター装置９．１０
を１１察することにより、第１図に示す先端に穴のあい
た毛細管１２を通して吸引ポンプ１３により選別できる
。
を１１察することにより、第１図に示す先端に穴のあい
た毛細管１２を通して吸引ポンプ１３により選別できる
。
なお、レーザー光の照射位置は細胞のどこでもよいが、
接触した異種細胞の接触点が、あるいはその近傍である
ことが最も効率的である。
接触した異種細胞の接触点が、あるいはその近傍である
ことが最も効率的である。
本発明により、同種細胞間の融合で生じるホモカリオン
をつくることなく、ヘテロカリオンのみを効率よく事成
し、さらに選別することが可能になった。また、操作過
程で高濃度のポリエチレングリコールを使用せずに細胞
融合を行うことができ、融合の操作が簡便化された。
をつくることなく、ヘテロカリオンのみを効率よく事成
し、さらに選別することが可能になった。また、操作過
程で高濃度のポリエチレングリコールを使用せずに細胞
融合を行うことができ、融合の操作が簡便化された。
第１図は本発明による細胞融合方法を実施するに好適な
装ＬｉＥ１’ｌ成図、第２図（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ
細胞融合の進行過程を示す説明図である。 １・・・レーザー光源、２・・・レーザービーム、３・
・・ピンホール、４・・・ＩｉＩ微鏡、５・・・ハーフ
ミラ−１６・・・試料台、７・・・細胞浮遊液、８・・
・フィルター、９・・・テレビカメラ、１０・・・ディ
スプレイ、１１・・・光源、１２・・・毛細管、１３・
・・吸引ポンプ、１４．１５・・・芋２ 目 （Ａ） （Ｂン （Ｃ）
装ＬｉＥ１’ｌ成図、第２図（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれ
細胞融合の進行過程を示す説明図である。 １・・・レーザー光源、２・・・レーザービーム、３・
・・ピンホール、４・・・ＩｉＩ微鏡、５・・・ハーフ
ミラ−１６・・・試料台、７・・・細胞浮遊液、８・・
・フィルター、９・・・テレビカメラ、１０・・・ディ
スプレイ、１１・・・光源、１２・・・毛細管、１３・
・・吸引ポンプ、１４．１５・・・芋２ 目 （Ａ） （Ｂン （Ｃ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、＃Ｉ胞膜を介して異種細胞が互いに接触した状態の
細胞にレーザー光を照射してＭ１種細胞の形成を促進さ
せることを特徴とする細胞融合方法。 ２、上記レーザ光としてパルスレーザ−を使用すること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞融合方法
。 ３、顕＊Ｓによって細胞を観察しながら上記レーザー光
を照射することを特徴とする特許請求の範囲第１項ある
いは第２項記載の細胞融合方法。 ４、上記レーザー光照射により生成した融合細胞を、先
端に穴のあいた毛細管を通じて吸引選別することを特徴
とする特許請求の範囲第３項記載の細胞融合方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1832584A JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1832584A JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60164487A true JPS60164487A (ja) | 1985-08-27 |
| JPH0533985B2 JPH0533985B2 (ja) | 1993-05-20 |
Family
ID=11968460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1832584A Granted JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60164487A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6192567A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-10 | Inoue Japax Res Inc | 植物細胞をプロトプラスト化する方法 |
| EP0252409A2 (de) * | 1986-07-10 | 1988-01-13 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Fusion biologischer Zellen und Protoplasten mit einem Laser-Mikrostrahl |
| JPH02117380A (ja) * | 1988-10-26 | 1990-05-01 | Hitachi Ltd | 細胞の捕捉方法ならびに処理方法および装置 |
| JP2003531369A (ja) * | 2000-04-13 | 2003-10-21 | ライカ ミクロジュステムス ヴェツラー ゲーエムベーハー | 顕微鏡試料をレーザ切断するための方法および装置 |
| WO2004015101A1 (ja) * | 2002-08-08 | 2004-02-19 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 標的細胞への選定分子の導入方法、標的細胞の細胞融合方法およびそれらの方法に用いるプラズマ照射装置 |
-
1984
- 1984-02-06 JP JP1832584A patent/JPS60164487A/ja active Granted
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6192567A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-10 | Inoue Japax Res Inc | 植物細胞をプロトプラスト化する方法 |
| EP0252409A2 (de) * | 1986-07-10 | 1988-01-13 | BASF Aktiengesellschaft | Verfahren zur Fusion biologischer Zellen und Protoplasten mit einem Laser-Mikrostrahl |
| JPH02117380A (ja) * | 1988-10-26 | 1990-05-01 | Hitachi Ltd | 細胞の捕捉方法ならびに処理方法および装置 |
| JP2747304B2 (ja) * | 1988-10-26 | 1998-05-06 | 株式会社日立製作所 | 細胞の捕捉方法ならびに処理方法および装置 |
| JP2003531369A (ja) * | 2000-04-13 | 2003-10-21 | ライカ ミクロジュステムス ヴェツラー ゲーエムベーハー | 顕微鏡試料をレーザ切断するための方法および装置 |
| WO2004015101A1 (ja) * | 2002-08-08 | 2004-02-19 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | 標的細胞への選定分子の導入方法、標的細胞の細胞融合方法およびそれらの方法に用いるプラズマ照射装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0533985B2 (ja) | 1993-05-20 |
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