JPH02117380A

JPH02117380A - 細胞の捕捉方法ならびに処理方法および装置

Info

Publication number: JPH02117380A
Application number: JP63268030A
Authority: JP
Inventors: Yoshio Kawamura; 河村　喜雄; Shinji Tanaka; 伸司田中; Kazuo Sato; 一雄佐藤; Noritaka Uchida; 憲孝内田; Hiroyuki Kohita; 啓之小比田
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1988-10-26
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1990-05-01
Anticipated expiration: 2013-05-06
Also published as: JP2747304B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野〕本発明は粒子および細胞の処理装置に係り、特に粒子の
搬送方法および細胞処理装置ならびに細胞融合装置に関
する。

〔従来の技術〕

従来の装置は文献（昭和６２年度精密工学会春季大会学
術講演会論文集、ｐ８４５〜８４６）に記載のようにマ
トリックス状に配列した隔室（マイクロチャンバ）に異
種細胞を１対づつ供給し、吸引ノズルで隔室の小さな開
口部に吸引固定して、各隔室ごとに細胞処理を行うもの
であった。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では、細胞の対を形成するために、フロー
セルを用いて細胞を１個ずつマイクロチャンバに挿入し
ていた。このため、短時間に大量の細胞の処理が困難で
、細胞の活性を持つことが困難であった。

本発明の目的は、細胞の活性を保ちつつ搬送し、大量に
細胞処理することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的は以下のことで達成できる。粒子または細胞を
マイクロチャンバへ大量に搬送する方法として、該粒子
または細胞を大量に容器に収納し、容器内の第１番目の
緩衝液として、該粒子または細胞より大なる比重の液を
注入することにより、該粒子または細胞を捕捉面に浮上
させて一括に吸引し捕捉する・捕捉されない他の粒子ま
たは細胞を捕捉面より沈降させるため、容器内の第２番
目の緩衝液として、該粒子または細胞より小なる比重の
液を注入する。これにより粒子または細胞を取り出し、
マイクロチャンバへ移し替えて収納する。上記工程を別
の種類の粒子または細胞に対して繰り返し行うことによ
り異種の粒子または細胞対を同一のマイクロチャンバへ
搬送することができる。

また、粒子または細胞をマイクロチャンバへ大量に注入
する手段として、該粒子または細胞を大量に容器に収納
する手段と、容器内の第１番目の緩衝液として、該粒子
または細胞より大なる比重の液を注入する。浮上した粒
子または細胞を一括して吸引し捕捉する吸引孔を有する
平板状の捕捉手段を有し、捕捉されない他の粒子または
細胞を捕捉面より沈降させるため、容器内の第２番目の
緩衝液として該粒子または細胞より小なる比重の液を注
入する。平板状捕捉手段で所望の粒子または細胞を取り
出し、マイクロチャンバへ移し替えて収納する手段と、
上記作業を別の種類の粒子または細胞に対して繰り返し
行うことにより異種の粒子または細胞対を同一のマイク
ロチャンバへ搬送する手段から成る。

さらに、短時間に大量の異種の細胞対の細胞融合を図る
ためには、前記細胞搬送手段と電極を有する隔室（マイ
クロチャンバ）手段と電圧印加の制御手段とにより達成
することができる。

〔作用〕

多数の吸引孔を有する平板状の捕捉手段に細胞ある。一
方、捕捉手段に細胞を吸引した後には。

吸引孔に吸引された細胞以外の不要な細胞が吸引孔の近
傍に存在しないこと、即ち、吸引孔近傍のル衝撃液中の
細胞の密度が小さいことが望ましい。

本発明で示すように、緩衝液の比重を変化させて細胞の
比重より大にすれば細胞は浮上し、反対に小さくすれば
、下方に沈降する。この原理を利用して、緩衝液中で捕
捉手段を水平に設置して、平板状の捕捉手段の吸引孔近
傍の細胞の濃度を任意に制御することができる。その結
果、捕捉手段による吸着効率を高め、かつ不要細胞の数
を極めて少なくできるため、処理手段への高い移し替え
率を達成することが可能となり、短時間で目的とする異
種細胞の対を確実にかつ大量に形成できる。

（実施例〕以下、本発明の実施例を第１図〜第３図により説明する
６本発明の例として取り扱う粒子が大きさ２０〜１００
μｍ程度の細胞の場合について述べる。なお、本発明の
各回において、共通部分の番号は同一にした。また、図
中の矢印は、緩衝液の流れの方向を示している。

まず、第１図において、捕捉手段３１　（または４１）
とそのホルダ３７（または４７）、供給手段３２（また
は４２）が図示していない容器の中の第２の緩衝液（第
４図、第５図の容器５４．！荷液５３に相当）に浸って
いる。捕捉手段３１、（または４１）は厚さ３６０μｍ
のＳｉウェーハに半導体プロセス技術を用いて１０μｍ
口の吸引孔２０１を間隔７７０μｍのピッチで格子状に
形成したものである。供給手段３２（または４２）は捕
捉手段３１（または４１）に対して所定の間隙３３（ま
たは４３）を保ち、細胞２０２を混合した緩衝液を流す
流路を形成する構造となっている。

間隙３３（または４３）は流路抵抗などを考慮して３０
０μｍとした。

供給手段には供給孔３４（または４４）と排出孔３５（
または４５）が設けられている。供給孔３４（または４
４）から第１の緩衝液と共に細胞を流す。

ここで、第２の緩衝液は、細胞の比重より小さい比重の
液体であり、細胞を沈降させる。第１の緩Ａｌｌは、細
胞の比重より大きい比重の液体であり、細胞を浮上させ
る。活性を損なうことなく細胞を取り扱うために、第２
の緩衝液として０．５ｍｏｌのソルビトール液を用い、
第１の緩衝液として０．５ｍｏｌのシュークロース液を
用いた。

間隙３３（または４３）に供給された細胞はホルダの配
管孔３６（または４６）からの吸引背圧により吸引孔２
０１に１個／孔の割合で捕捉される。しかし、細胞の活
性を損なわずに捕捉するための吸引背圧は数〜数十ｍｍ
Ａｑと小さいため、吸引孔２０１の近傍にない細胞を吸
い寄せることができない。したがって、吸引孔近傍の緩
衝液中の細胞の濃度が薄いと吸引孔に細胞を捕捉する効
率が低下してしまう。本発明で示すように第１の緩衝液
を用いると細胞が浮上し捕捉手段３１（または４１）に
接するため吸引孔２０１近傍の細胞の濃度を濃くするこ
とが容易になる。その結果、捕捉効率が向上する。本発
明の場合、第１の緩衝液を用いないときに比較して捕捉
率が３倍に向上した。

捕捉手段に細胞を捕捉したのちには、１個／孔の割合で
捕捉した細胞以外の細胞は不要となり、吸引孔２０１近
傍の細胞の濃度を薄くすることが望まれる。本発明では
捕捉後のクリーニング操作時に第２の緩衝液を間隙３３
（または４３）に流すことによってこの目的を達成した
。第２図は第２の緩衝液によるクリーニング操作時の細
胞の挙動を示したもので、第１図の場合と異なって、不
要な細胞２０２が沈降して洗い流されるため吸引孔の近
傍には捕捉された細胞２０３以外の細胞が存在しなくな
る。この結果、捕捉手段には、所望の細胞のみが効率良
く、確実に捕捉される。なお、（沈降力）＝（比重差）
×（細胞の体積）、（吸引力）＝（吸引孔の面積）×（
吸引圧力差）で与えられる。（沈降力）＜（吸引力）の
関係を満たすことにより、吸引孔に捕捉されている細胞
が脱落することを防げる。

捕捉された細胞を処理手段に移し替えるところを第３図
を用いて述べる。図示していない緩衝液（第４図、第５
図の５３に相当）のなかに、捕捉手段３１（または４１
）に近接して処理手段５１が位置決めされている。処理
手段５１は厚さ３６０μｍのＳｉウェーハに半導体プロ
セス技術を用いて１０μｍ　Ｘ　１００μｍのスリット
３０１を、捕捉手段の吸引孔２０１と同じ間隔７７０μ
ｍの格千秋に開け、このスリットを挟む配置で電極３０
５を形成した部分３０４に、隔室部３０３を重ねた構造
である。

捕捉手段の吸引背圧を正圧にし、処理手段のホルダ５５
の配管５２経由で処理手段に数ｗ　Ａ　ｑの吸引背圧を
かけると、捕捉されていた細胞がスリット上に移し替え
られる。細胞３０２はスリット上に吸引されたもので、
他の細胞は、落下中の状態を示している。

処理手段の各々の隔室に１個ずつ細胞を移し替えた後、
再度、捕捉手段で異種の細胞を捕捉して処理手段に移し
替えると、各々の隔室に、異種細胞の対ができる。細胞
の対は、前述の１電極間に位置決めされるので、電極間
に電圧を印加することにより細胞融合ができる。

以上述べてきたように、本発明により細胞や、その他の
粒子等を正確に位置決めできるので、それらの薬品処理
操作や、物質挿入操作、さらには、識別マーク付けや、
反応等の時間的経緯の追跡検討等を容易に行うことがで
きる。従って、小さな、粒子等を短時間に大量にかつ正
確に処理可能な処理装置を提供することができる。なお
、捕捉手段の向きが上述の例と逆の場合には、第１の緩
衝液と第２の緩衝液との細胞に対する比重を逆にすれば
良いことは容易に類推できる。

異種細胞（Ａ、Ｂと称する）の移し替えをより短時間で
行うため、捕捉手段と供給手段を細胞Ａ用に３１〜３５
と細胞Ｂ用に４１〜４５と専用に設けたものである。タ
ンク６１と８１に比重の大きい第１の緩衝液を入れ、タ
ンク６３と８３に比重の小さい第２の緩衝液を入れ、タ
ンク６２に第１の緩衝液に混ぜた細胞Ａを入れ、タンク
８２に第１の緩衝液に混ぜた細胞Ｂを入れ、容器５４に
は第２の緩衝液５３を入れである。水面１３２゜１３３
．１３４，１３５は供給手段３２．４２に必要な水頭差
として基準の水面１３１に対して十数ｍ　Ａ　ｑだけ高
くなるように設定しである。

捕捉手段や処理手段の微小な吸引背圧を発生する手段と
して、サイホン式の吸引系１０１，１１１゜１２１を用
いている。これらの吸引系は、ねじ駆動で上下動する移
動台１０２，１１２，１２２に第２の緩衝液を入れた容
器を設置したものである。

水面５３を基準にして、各容器の水面１３６゜１３７．
１３８の高さを低くすれば吸引圧が生じる、水面１３６
と１３７を基準水面１３１より高くすれば捕捉手段に対
して、捕捉した細胞を押し出す正圧が生じる。吸引する
につれこれらの４つの水位が変化するので、常に一定の
背圧にするために、捕捉手段や処理手段の背圧を、容器
５４の基準水面に対する差圧として検出する図示してい
ない圧力変換器を用いた制御系により３つの移動台が上
下に駆動される。なお、圧力変換器を用いずに、各容器
の水面の位置を測定して相対位置を制御しても良い。

微小な圧力差で細胞を制御する本発明の細胞融合装置に
とって、配管系や捕捉手段、供給手段、処理手段に付着
した微小な気泡は、移し替えの効率を低下する原因とな
る０図示していない手段を用いて、加圧状態で配管系の
緩衝液を送ったり、強制吸引したり、超音波振動を併用
する等してあらかじめ問題となる配管系等の気泡を除去
し、弁６４〜６８．８４〜８８，７０．９０〜９２を閉
じて準備を終わる。

次に、細胞の供給手順を述べる。

■弁６７．６５および８７．８５を所定時間だけ開いて
、細胞Ａおよび細胞Ｂを流路６９，８９にセットする。

■弁６４（または８４）、６８（または８８）。

７０（または９０）を所定時間だけ開いて細胞Ａ（また
は細胞Ｂ）を供給手段３２（または４２）に送る。

■弁７１（または９１）を開けて供給手段の間隙３３（
または４３）に送りこまれ浮上している細胞Ａ（または
細胞Ｂ）を捕捉手段３１（または４１）に吸引捕捉する
。

■弁６６（または８６）を所定時間開いて、供給手段の
間隙３３（または４３）の不要細胞を沈降させ洗い流す
。

■捕捉手段３１（または４１）を処理手段５１に近接さ
せ位置決めしてから、弁９２を開け、吸引系１ｏ１（ま
たは１１２）を所定量だけ上昇させて正圧にし、捕捉し
た細胞を処理手段に移し替える。なお、移し替えられた
細胞や融合処理後の細胞が長時間処理手段の側壁に接触
することにより活性度を損なうことを防ぐため、微小加
圧手段１５２を用い、配管１５１を経て数秒間隔で細胞
を数十μｍ側壁より離脱させている。微小加圧手段１５
２は１弾力性のある配管を往復の速度を制御したピスト
ンで微小ストロークだけ打撃することで達成できる。

第５図は細胞ＡとＢを処理装置に移し替える手順にした
がって、各手段の位置関係と給排水の動き（矢印）を示
したものである。なお、本発明では、捕捉手段３１と４
１は互いに図示していないアームで一体化されており１
図示していない上下機構によって同時に上下し、さらに
、水平方向の案内機構によって同時に左右に移動できる
機構となっている。ａ図は捕捉手段３７に細胞Ａを吸引
捕捉する状態である。ｂ図は捕捉手段３１に細胞Ａを捕
捉してから、１ｍだけ上昇して、処理手段に近接するた
め右方向に移動中の状態である。０図は処理手段に対し
て位置決め後、細胞Ａを移し替えている状態である。ｄ
図は、捕捉手段４１に細胞Ｂを吸引捕捉している状態で
ある。０図は、既に細胞Ａの移し替えられている処理手
段に、細胞Ｂを移し替えている状態である。

以上の移し替え操作の結果、処理手段には、細胞ＡとＢ
の対が多量に形成されているので、−括して細胞融合処
理を行うことにより、細胞ＡＢの融合細胞のみを得るこ
とができる。

なお、捕捉手段や供給手段、処理手段の形状寸法等は、
取り扱う粒子の大きさに応じて変更することは容易であ
る。

〔発明の効果〕

本発明によれば、粒子を効率良く一つずつ捕捉して処理
することが短時間で行え、さらに比重差を利用して目的
とする粒子の濃度を変えられるため、少ない試料でも処
理効率の高い処理装置が得られる。

また、粒子として細胞を用る揚台として、従来はバッチ
処理を行い、種々の組合せができた中から（例えばＡＢ
、ＡＡ、ＢＢ、ＡＢＡ、ＡＢＢ・・・）、所望の組み合
わせ（ＡＢ）のみを選別するのに甚大な労力を必要とし
たり、さもなくば１個１個の細胞を人手で操作（１００
対／日／人程度）していた。このような細胞融合分野に
対して、本発明を適用すれば、１００００対７日／台以
上の処理を自動的に行うことが可能となる細胞融合装置
を礎供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の拡大図、第２図は第１凹ｊ装置を示す概略図、第５図は第４図の主要部分の動作
状態を示す概略図である。３１．４１・・・捕捉手段、３２．４２・・・供給手段
。５１・・・処理手段、２０１・・・吸引孔、３０２・・
・スリット、２０２，２０３，３０２・・細胞。第５１！］【α）（Ｃ）

Claims

【特許請求の範囲】１、粒子の比重より大きい比重の第１番目の液体で、該
粒子を捕捉面に浮上し、該粒子を捕捉し、捕捉後、該粒
子の比重より小さい比重の第２番目の液体で、捕捉した
粒子以外の粒子を沈降し、捕捉した粒子を搬送すること
を特徴とする粒子の搬送方法。２、粒子の比重より小さい比重の第２番目の液体で、該
粒子を捕捉面に沈降し、該粒子を捕捉し、捕捉後、該粒
子の比重より大きい比重の第１番目の液体で、捕捉した
粒子以外の粒子を浮上し、捕捉した粒子を搬送すること
を特徴とする粒子の搬送方法。３、細胞を流体を用いて供給する供給手段と、該細胞を
浮上させて捕捉する手段と、捕捉した細胞以外の細胞と
粒子とを沈降させる手段と捕捉後の細胞を処理する処理
室からなることを特徴とした細胞処理装置。４、細胞を流体を用いて供給する供給手段と、該細胞を
沈降させて捕捉する手段と、捕捉した細胞以外の細胞と
粒子とを浮上させる手段と捕捉後の細胞を処理する処理
室からなることを特徴とした細胞処理装置。５、請求項３または請求項４に記載の細胞処理装置にお
いて、異種の細胞をそれぞれ捕捉する手段と、１対の細
胞として処理室に移し替え、しかる後に１対の細胞に電
圧を印加する手段により、融合処理することを特徴とす
る細胞融合装置。６、請求項３または請求項４に記載の細胞処理装置にお
いて、粒子の捕捉手段として、粒子の大きさより小さな
寸法の孔を所定の間隔で有する平板状の治具を有する手
段と、該捕捉手段と同じ間隔で粒子を保持する隔室を有
する手段から成ることを特徴とする細胞処理装置。７、請求項３または請求項４に記載の細胞処理装置にお
いて、細胞を処理する処理室において、所定時間ごとに
細胞を処理室の壁面に接触しないようにする手段を設け
たことを特徴とする細胞処理装置。８、請求項３または請求項４に記載の細胞処理装置にお
いて、細胞の捕捉手段と処理室における処理手段として
流体的吸引および排出機能を有することを特徴とする細
胞処理装置。９、請求項３または請求項４に記載の細胞処理装置にお
いて、細胞を処理する処理室において、所定時間ごとに
細胞を処理室の壁面に接触しないようにする手段として
、流体を細胞の処理室の壁面の孔から出入させて、壁面
に対して一定時間非接触に保つことを可能としたことを
特徴とする細胞処理装置。