JPH0533985B2 - - Google Patents
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- JPH0533985B2 JPH0533985B2 JP1832584A JP1832584A JPH0533985B2 JP H0533985 B2 JPH0533985 B2 JP H0533985B2 JP 1832584 A JP1832584 A JP 1832584A JP 1832584 A JP1832584 A JP 1832584A JP H0533985 B2 JPH0533985 B2 JP H0533985B2
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- Japan
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- cells
- cell
- fusion
- cell fusion
- laser beam
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Links
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
- C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Electromagnetism (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は細胞融合方法の改良に関するものであ
る。
る。
細胞融合は、種の異なつた細胞を融合促進剤な
どを用いて融合・合体させ、両細胞の特徴を備え
持つ雑種細胞を作る技術であり、バイオテクノロ
ジーの有力な技術として医学・薬学・農学をはじ
め広い分野で応用されている。
どを用いて融合・合体させ、両細胞の特徴を備え
持つ雑種細胞を作る技術であり、バイオテクノロ
ジーの有力な技術として医学・薬学・農学をはじ
め広い分野で応用されている。
融合促進剤としては、動物細胞の場合、紫外線
照射により不活化したセンダイウイルス（HVJ）
が有効とされている。植物細胞は細胞壁でおおわ
れているため、細胞壁分解酵素を作用させて細胞
壁を取り除したプロトプラストを形成した後、ポ
リエチレングリコールなどを添加して融合を促進
させている。このような細胞融合技術について
は、たとえば「自然、1980年、３月号、26ペー
ジ」や「生物物理、1982年22巻５号、14ページ」
に詳細に記述されている。
照射により不活化したセンダイウイルス（HVJ）
が有効とされている。植物細胞は細胞壁でおおわ
れているため、細胞壁分解酵素を作用させて細胞
壁を取り除したプロトプラストを形成した後、ポ
リエチレングリコールなどを添加して融合を促進
させている。このような細胞融合技術について
は、たとえば「自然、1980年、３月号、26ペー
ジ」や「生物物理、1982年22巻５号、14ページ」
に詳細に記述されている。
しかしながらこのような従来技術では、二種類
の細胞で融合を行わせると、異種の細胞が融合し
た結果生じる雑種細胞（ヘテロカリオン）と同時
に、同種の細胞が融合した結果生じるホモカリオ
ンが形成するために、両者をふるい分け、目的と
するヘテロカリオンのみを選別することが困難で
あるという問題点があつた。また、高濃度で、か
つ高粘度のポリエチレングリコールを使用する細
胞融合方法においては、融合後、細胞を洗浄し、
ポリエチレングリコールを除去しなければならな
いなど、手順が繁雑であるとともに、細胞を長時
間にわたつて非生理的条件下に置かねばならない
という欠点があつた。
の細胞で融合を行わせると、異種の細胞が融合し
た結果生じる雑種細胞（ヘテロカリオン）と同時
に、同種の細胞が融合した結果生じるホモカリオ
ンが形成するために、両者をふるい分け、目的と
するヘテロカリオンのみを選別することが困難で
あるという問題点があつた。また、高濃度で、か
つ高粘度のポリエチレングリコールを使用する細
胞融合方法においては、融合後、細胞を洗浄し、
ポリエチレングリコールを除去しなければならな
いなど、手順が繁雑であるとともに、細胞を長時
間にわたつて非生理的条件下に置かねばならない
という欠点があつた。
本発明の目的は、上記問題点を除去し異種間の
細胞を融合を確実にかつ簡便に行わせ得る細胞融
合方法を提供することにある。
細胞を融合を確実にかつ簡便に行わせ得る細胞融
合方法を提供することにある。
上記目的を達成するために本発明においては、細
胞膜を介して異種細胞が互いに接触した状態にあ
るものに対して、レーザー光線を照射することを
特徴としている。
胞膜を介して異種細胞が互いに接触した状態にあ
るものに対して、レーザー光線を照射することを
特徴としている。
かかる本発明の特徴的な方法により、同種細胞
が融合した結果生じるホモカリオンの生成を仰
え、ヘテロカリオンのみえを選択的に作成するこ
とができる。また、従来方法のように高濃度、高
粘度のポリエチレングリコールを使用することな
く、簡単な操作で細胞融合を行うことができる。
が融合した結果生じるホモカリオンの生成を仰
え、ヘテロカリオンのみえを選択的に作成するこ
とができる。また、従来方法のように高濃度、高
粘度のポリエチレングリコールを使用することな
く、簡単な操作で細胞融合を行うことができる。
以下、本発明を図にもとづいて詳細にのべる。
本発明を実施するにあたつては、融合を行わせる
異種細胞を互いの細胞膜を介して接触させる過程
が必要である。このような異種細胞が互いの細胞
膜を介して接触した状態にあるものを以下被照射
対象細胞とよぶ。これを実施するためには、たと
えば異種細胞のプロトプラストを含む懸濁液中に
塩化カルシウム溶液や比較的低濃度（１〜10％）
のポリエチレングリコール溶液などを添加すると
よい。このような化学的手法の他に、細胞浮遊液
中に２本の電極を浸し、交流電圧を印加する電気
的手法によつても電極表面に接触細胞を形成する
ことができる。
本発明を実施するにあたつては、融合を行わせる
異種細胞を互いの細胞膜を介して接触させる過程
が必要である。このような異種細胞が互いの細胞
膜を介して接触した状態にあるものを以下被照射
対象細胞とよぶ。これを実施するためには、たと
えば異種細胞のプロトプラストを含む懸濁液中に
塩化カルシウム溶液や比較的低濃度（１〜10％）
のポリエチレングリコール溶液などを添加すると
よい。このような化学的手法の他に、細胞浮遊液
中に２本の電極を浸し、交流電圧を印加する電気
的手法によつても電極表面に接触細胞を形成する
ことができる。
第１図は本発明による細胞融合方法を実施する
装置の１つの実施例であり、細胞が接触した初期
状態から、雑種細胞の形成に至るまでの過程を観
察するための顕微鏡機能を備えたものである。同
図において１は細胞融合を誘起するためのレーザ
ー源である。レーザー光の照射エネルギーが高い
と細胞を破壊するため、細胞融合用レーザー光と
しては短パルスレーザー光が適している。本発明
者らの実験では、波長1.06μmのYAGレーザー光
の第２高周波（530nm）や第３高周波（355nm）
を10〜50ナノ秒のパルス幅で照射して融合反応を
行つた。レーザー源１から出たレーザービーム２
はピンホール３を経た後、顕微鏡４内に設けられ
たハーフミラー５で反射され、試料台６上に置か
れた細胞浮遊液７中に存在する被照射対象細胞の
細胞膜に照射し、細胞のの融合反応を開始させ
る。細胞浮遊液７中で進行する細胞融合の状況
は、テレビカメラ９及びデイスプレイ１０からな
るテレビモニター装置により観察できる。なお、
８はレーザー光を除くフイルター、１１は顕微鏡
観察用の光源である。
装置の１つの実施例であり、細胞が接触した初期
状態から、雑種細胞の形成に至るまでの過程を観
察するための顕微鏡機能を備えたものである。同
図において１は細胞融合を誘起するためのレーザ
ー源である。レーザー光の照射エネルギーが高い
と細胞を破壊するため、細胞融合用レーザー光と
しては短パルスレーザー光が適している。本発明
者らの実験では、波長1.06μmのYAGレーザー光
の第２高周波（530nm）や第３高周波（355nm）
を10〜50ナノ秒のパルス幅で照射して融合反応を
行つた。レーザー源１から出たレーザービーム２
はピンホール３を経た後、顕微鏡４内に設けられ
たハーフミラー５で反射され、試料台６上に置か
れた細胞浮遊液７中に存在する被照射対象細胞の
細胞膜に照射し、細胞のの融合反応を開始させ
る。細胞浮遊液７中で進行する細胞融合の状況
は、テレビカメラ９及びデイスプレイ１０からな
るテレビモニター装置により観察できる。なお、
８はレーザー光を除くフイルター、１１は顕微鏡
観察用の光源である。
第２図Ａ〜Ｃは、細胞融合の進行過程を示す説
明図である。同図Ａは異種の細胞１４と１５とが
互いの細胞膜を介して接触した状態を示す。この
状態におかれた被照射対象細胞膜にμmオーダー
に絞つたパルス状のレーザーを照射すると、異種
の細胞１４と１５との細胞融合が開始する。第２
図Ｂは、細胞融合が進行した段階で観察され、細
胞膜のかなり広い面積で接触した状態を示す。細
胞融合反応が更に進行すると最終的には、第２図
Ｃに示すように１個の雑種細胞１６が完成する。
第２図ＡからＣへの反応は温度に依存するが、25
〜37℃の温度条件で５〜20分程度で完了する。
明図である。同図Ａは異種の細胞１４と１５とが
互いの細胞膜を介して接触した状態を示す。この
状態におかれた被照射対象細胞膜にμmオーダー
に絞つたパルス状のレーザーを照射すると、異種
の細胞１４と１５との細胞融合が開始する。第２
図Ｂは、細胞融合が進行した段階で観察され、細
胞膜のかなり広い面積で接触した状態を示す。細
胞融合反応が更に進行すると最終的には、第２図
Ｃに示すように１個の雑種細胞１６が完成する。
第２図ＡからＣへの反応は温度に依存するが、25
〜37℃の温度条件で５〜20分程度で完了する。
完成した雑種細胞１６は、テレビモニター装置
９，１０を観察することにより、第１図に示す先
端に穴のあいた毛細管１２を通して吸引ポンプ１
３により選別できる。
９，１０を観察することにより、第１図に示す先
端に穴のあいた毛細管１２を通して吸引ポンプ１
３により選別できる。
なお、レーザー光の照射位置は細胞のどこでも
よいが、接触した異種細胞の接触点か、あるいは
その近傍であることが最も効率的である。
よいが、接触した異種細胞の接触点か、あるいは
その近傍であることが最も効率的である。
本発明により、同種細胞間の融合で生じるホモ
カリオンをつくることなく、ヘテロカリオンのみ
を効率よく事成し、さらに選別することが可能に
なつた。また、操作過程で高濃度のポリエチレン
グリコールを使用せずに細胞融合を行うことがで
き、融合の操作が簡便化された。
カリオンをつくることなく、ヘテロカリオンのみ
を効率よく事成し、さらに選別することが可能に
なつた。また、操作過程で高濃度のポリエチレン
グリコールを使用せずに細胞融合を行うことがで
き、融合の操作が簡便化された。
第１図は本発明による細胞融合方法を実施する
に好適な装置構成図、第２図Ａ〜Ｃはそれぞれ細
胞融合の進行過程を示す説明図である。 １……レーザー光源、２……レーザービーム、
３……ピンホール、４……顕微鏡、５……ハーフ
ミラー、６……試料台、７……細胞浮遊液、８…
…フイルター、９……テレビカメラ、１０……デ
イスプレイ、１１……光源、１２……毛細管、１
３……吸引ポンプ、１４，１５……細胞、１６…
…雑種細胞。
に好適な装置構成図、第２図Ａ〜Ｃはそれぞれ細
胞融合の進行過程を示す説明図である。 １……レーザー光源、２……レーザービーム、
３……ピンホール、４……顕微鏡、５……ハーフ
ミラー、６……試料台、７……細胞浮遊液、８…
…フイルター、９……テレビカメラ、１０……デ
イスプレイ、１１……光源、１２……毛細管、１
３……吸引ポンプ、１４，１５……細胞、１６…
…雑種細胞。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞にレーザー光を照射し、該細胞同志を融
合することを特徴とする細胞融合方法。 ２ 上記レーザー光としてパルスレーザーを使用
することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の細胞融合方法。 ３ 顕微鏡によつて細胞を観察しながら上記レー
ザー光を照射することを特徴とする特許請求の範
囲第１項あるいは第２項記載の細胞融合方法。 ４ 上記レーザー光照射により生成した融合細胞
を、先端に穴のあいた毛細管を通じて吸引選別す
ることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
細胞融合方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1832584A JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1832584A JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60164487A JPS60164487A (ja) | 1985-08-27 |
| JPH0533985B2 true JPH0533985B2 (ja) | 1993-05-20 |
Family
ID=11968460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1832584A Granted JPS60164487A (ja) | 1984-02-06 | 1984-02-06 | 細胞融合方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60164487A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6192567A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-10 | Inoue Japax Res Inc | 植物細胞をプロトプラスト化する方法 |
| DE3623194A1 (de) * | 1986-07-10 | 1988-03-24 | Basf Ag | Verfahren zur fusion biologischer zellen und protoplasten mit einem laser-mikrostrahl |
| JP2747304B2 (ja) * | 1988-10-26 | 1998-05-06 | 株式会社日立製作所 | 細胞の捕捉方法ならびに処理方法および装置 |
| DE10018255C2 (de) * | 2000-04-13 | 2003-08-28 | Leica Microsystems | Laserschneid-Verfahren und Laserschneid-Vorrichtung zum Laserschneiden mit mikroskopischer Proben |
| AU2003254879A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-02-25 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Method of transferring selected molecule into target cells, method of cell-fusing target cells and plasma exposure device to be used in these methods |
-
1984
- 1984-02-06 JP JP1832584A patent/JPS60164487A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60164487A (ja) | 1985-08-27 |
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