TW475897B - A composition for inducing cell of neoplastic cells - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 ______B7___ 五、發明説明（） 發明領域： 本發明係關於一包含殺死腫瘤細胞和增加以化學療法治 療腫瘤細胞效果的方法，特別是有關能啓動腫瘤細胞自我死 亡程式並以六氫η比fl井衍生物來逆轉腫瘤細胞多重抗藥性之 方法。 發明背景： 在許多藥學領域中某些環氧化物以身具藥學活性而著 稱，此包括癌症治療。無數的環氧化物因各種理由而被合 成。例如，核定授予Masaki等人之美專利案號 4,507,297和4,595,803中揭露了以具環氧化物性質之六 氩ϋ比Q井衍生物包括NCO-7 00來抑制心肌梗塞。核定授予 Ο mu ra等人之美專利案號5,336,783中揭露了具胺甲醢基 之〇比咯衍生物具有能抑制蛋白質裂解_，卡本 (calpain)，之特性。核定授予Yaginuma等人之美專利 案號 4,732,910 中揭露了 含狐基（guanidino group ) 和苯基之環氧化物具有很強能抑制硫蛋白酶之活性。核定 授予Tamai等人之美專利案號4,338,879和4,382,889 中揭露了 EST為具有能抑制硫蛋白轉:活性的化合物，特別 是能抑制那些會被鈣離子活化之中性蛋白Hr(CANP)。核 定授予 Tamai等人之美專利案號4,4 1 8,0 75和 4,474,800中揭露了 一類似EST結構，但較EST多了一 個亞胺基（imino group)之化合物。 前段文章中所述具有能抑制硫蛋白_活性的化合物， 4 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 475897 A7 B7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 特別是能抑制那些會被鈣離子活化之中性蛋白_ (C ANP ，又稱卡本（calpain))的化合物。然而，儘管已知 卡本（calpain)抑制劑能對人體產生一些藥學效果，卻從未 有報導提到任何一種上述化合物可以被用來有效的對抗癌知 胞0 已知卡本（calpain)抑制劑有許多其它的用途。例如， 核定授予Malfroy-Camine等人之美專利案號5,403,834 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 中揭露了一種具強抗氧化性和或自由基補獲性質之赛倫-過 渡金屬複合物（ Salen-transition metal complexes )。此化合物被認為可預防或減輕重要組織， 例如心臟細胞和中樞神經系統，因缺氧/復甦灌注時所引起 之組織傷害。核定授予Nixen等人之美專利案號 5,328,922中揭露了兩種與體内神經系統，特別是和人腦 相關的，由鈣離子所活化之中性蛋白I每（CANPor卡本 (calpain))的抑制劑，又稱為高分子量卡巴斯塔汀（high molecular weight calpastatin，HMWC)和低分子量卡 巴斯塔 ί丁（lowhigh molecular weight calpastatin， LMWC)。核定授予Kozarich等人之美專利案號 5，268,164中揭露了一些胜收（胞膜通透物A-7, permeabilizer Α·7 )，其具有一段氨基酸或氨基酸類似 物的序列能增加動物體中腦血障之通透率。核定授予Ando 等人之美專利案號 5,424,3 25，5,422,3 59，5,416，117, 5,395,958和5,340,909中揭露了以氨基丙酮衍生物 (’ 3 2 5 ) ( a m i η 〇 k e t ο n e d e r i v i t i v e s )，λ -氨基丙網衍 5 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 生物（’359)，和環丙烷衍生物（，n7，，958和，903 )作 為硫蛋白S每，如卡本（calPain)，之可逆性抑制劑。這些 化合物有極佳的組織分布性，細胞膜通透性，和極佳的口腔 吸收率。但並未提及以這些化合物來治療癌細胞的可能性。 國際申請案號WO 94/00095中揭露了藉各種卡本 (calpain)抑制劑的使用來使細胞週期同步的方法。此同步 作用可縮短在癌症治療時使用化學療法的時間並可增加化療 法藥劑的活性。藉著讓所有處於S期的細胞同步可降低細胞 對化療法藥劑的敏感性。由此文獻中可知，當以卡本 (calpain)抑制劑來治療癌症時，卡本（calpain)抑制劑的 使用必須在以化療法藥劑治療癌症之前。其次，其中並未揭 露或建議提到當有多重抗藥性時治療癌症的方法。再者，其 中也未揭露或建議提到單獨施用卡本（calpain)抑制劑來殺 死癌細胞，亦即，除了在以化療法藥劑治療癌症之前施用卡 本（calpain)抑制劑之外，並未揭露卡本（caipain)抑制劑 具有此種有利的效用。

Shoji-Kasai 等人在 Proc· Natl· Acad· Sci·，USA 85:146-150 (1988)的報導中指出，可以E-64-d將培養 在一定化學組成基質中的上皮腫瘤 A431知胞 (epidermoid carcinoma A431 c e 11 s)之生長停止在有 絲分裂的中期，E-64-d乃是一種可穿透細胞膜之硫蛋白 择特定抑制劑E-64之衍生物。此文獻頰示C ANP抑制劑 能顯著的降低某些癌細胞的生長。但是，當細胞具有多重抗 藥性時，便無法顯示出此效果，也不會導致癌細跑的死亡。 6 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 /^897 /^897 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A7 _B7__ 五、發明説明（） 限制抗癌藥物在臨床上使用的一個主要因素乃是腫瘤所 發展出來的多重抗藥性。以抗癌藥物來治療癌症，例如文卡 生物驗（vinca alkaloids，（vinblastine))和安卓赛克林 (antrcyclines)(又稱多索慮比新 doxorubicin)，不但 會使其對這類藥物的容忍度增高，同時也會和其它抗癌藥發 展出交互抗性。在某些情況下，患者對初期的化療法毫無反 應，一般認為這種情形下乃是因腫瘤細胞本身具有抗藥性所 致。此抗藥性的機轉之一乃是癌細胞可以很有效的藉鈿胞表 面蛋白質mdr蛋白（多重抗藥性 multiple drug resistance)將抗癌藥物運送到細胞膜外（Gottesman et al·， J. clinical Oncology 7:409-4 1 1， 1 9 89,

Goldstain et al., J. Natfl Cancer Inst. 81: 118- 124，1989，Fojo et al·，Cancer Res· 45: 30 02- 3 0 0 7, 1 9 8 5 )。此蛋白質很有效率的降低癌細胞内抗癌藥 物的濃度使得癌細胞得以存活並生長。已知mdr蛋白之分 子量為170,000dalton，乃是一種須耗費能量的醣蛋白， 當癌細胞大量製造此蛋白質時便會發展出抗藥性。此蛋白質 可認得許多親油性藥物並將其運送到細胞外，所以其在麵跑 内之正常生理功能應是能認識可能具有毒性之物質並將其排 出細胞外。 已知有許多化合物能抑制mdr蛋白質之活性而使抗癌物 能聚積在其標的細胞中。一般認為這些化合物在體内可作為 mdr蛋白質之受質，藉著大量佔據mdr蛋白質而使抗癌物 不會被送出細胞，因而造成癌細胞的死亡。這類能抑制 mdr蛋白質的化合物被研究得最清楚的乃是維拉鄱米耳 ----------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 7

475897 A7 ________ Β7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (verapamil)，其本身乃是一種鈣離子管道抑制劑，有許 多臨床方面的應用性質，最主要的是用來治療高血壓。在臨 床試驗研究前和臨床研究上（G〇ttesman et al·，J. Climeal 〇ne〇i0gy 7: 4〇9-411 )，維拉鄱米耳 (verapamil)對mdr蛋白質有很好的抑制效果，能提高癌 細胞的死亡率。很不幸的，所須要能抑制mdr蛋白質的維 拉鄱米耳（verapamil)之劑量太高了，其副作用會對病人 的心臟血管系統帶來毒性，因而使這項藥物無法被進一步研 發用在癌症患者身上。但是，仍然迫切須要研發一種能抑制 mdr蛋白質且不具毒性的藥劑，此對癌症患者的治療將會 有很重要贡獻。如下列表I中所示，美國境内發展出抗藥性 之癌症患者的數目約為30%，因此，安全、有效之mdr蛋 白質抑制劑的市場仍是顯著不可忽視的。

表I _美國境內癌症患者之抗藥性1 _ 癌症患者之數目（美國） 1，200,000 新患者數目/每年 900,000 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 預估具有抗藥性之癌症患者數目 3 50,000 1數目字乃摘錄自生物科技新聞（Biotechnology News)和國家癌 症硏究所期刊（Journal of the National Cancer Institute) 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 __B7 五、發明説明（） 至於具有多重抗藥性癌細胞之治療，美專利案號 5, 371，081中揭露了 一種氮原子上有取代基的芬若赛林 (N-substituted phenoxazines)化合物。這類化合物與 上文中所討論的環氧化物及卡本（calpaLn)抑制劑在化學性 質上並不相近。此外，專利案中並未揭露單獨使用這類化合 衿時會有任何益處，而且此物質之毒性也可能會對將其運用 在臨床上造成困難。 傳統化療法中最嚴重的問題在於化療藥劑本身所具有的 毒性。例如，典型的化療藥劑，敏布萊思定（v i n b 1 a s t i n e ) 和安卓黴素（adriamycin)，具有一些無法避免的副作用如 掉髮’體重減輕’肝臟及腎臟的破壞。由於毒性太高，無法 每天長時間施用這類藥物。例如，一般這類藥物的施用乃是 以每週數天，連續施用二至三個月，接著休息數週不施用， 之後再重複藥物施用過程。沒有一種傳統的抗癌藥物或能增 強抗癌作用之藥物是不具毒性的。 總而言之，沒有一項先前技藝曾揭露或建議卡本 (calpain)抑制劑或環氧化物本身即足以引發癌細胞的死 亡。再者，也沒有一項先前技藝曾揭露或建議一種化合物能 在具有多重抗藥性之癌細胞内，在不引起副作用且不具毒性 的情況下投死癌細胞。 發明目的與概述： 本發明開發了使用環氧化物衍生物來治療癌症，特別 是，在具有多重抗藥性之癌細胞内，以具有環氧基團的六氫 9___ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------·------tr------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 B7 五、發明説明（ B比汫衍生物作為主要的化療藥劑或作為其它化療藥劑之輔 助藥物來治療腫瘤細胞。本發明的目的之一即是提供一個使 用能抑制癌細胞進行有絲分裂之具環氧基困的六氫〇比 α井衍生物或先前技藝中所揭露之類似物作為可以引發癌細 胞死亡的方法。本發明的另一目的即是提供一個單獨使用具 環氧基圏的六氫II比讲衍生物或以其作為主要化療藥劑來引 發癌細胞死亡的方法。換言之，即使在癌知胞具多重抗藥性 的情況下，基於和傳統抗癌藥物不同之作用機轉，六氫〇比 汫衍生物本身可以作為一種抗癌藥物。本發明之另一目的即 是提供一種可以逆轉癌細胞多重抗藥性的方法，藉著使用具 環氧基團的六氫此汫衍生物為其它化療藥劑時之輔劑來達 到逆轉癌細胞多重抗藥性的方法。 本發明之一主要觀點即是一種能殺死腫瘤細胞的方法， 包含：施用足夠殺死腫瘤細胞量之具化學式（I)的化合物或 其藥學上可接受的鹽類至患有腫瘤之患者身上： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Η

Η R1OC CONHC-CO^N N-R3 ⑴ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 其中R1是羥基，含有1至4個碳原子之烷氧基（Cl-4烷 氧基），含有1至4個碳原子之烷基羰基氧基甲氧基（C1-4 alkylcarbonyloxymathoxyl)，含有 1 至 2 個後原子之燒 氨苯基（phenyl C 1 - 2 alky lamino group)，2,5· b比哈 啶二酮_1-烷氧基（含有 1 至 4個碳原子）（2,5-pyrrolidinedione - 1 - alkoxyl (Cl-4))，或 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（）

其中χΐ是一化學鍵或含有丨至2個碳原子之烷烯，χ2 是-氫原子或當XI為甲烯時，一可與χ1形成五元環之碳 酸基圏’ X 3為氫原子或含有42個碳原子之烷基，χ4 為氫原子或含有1至2個碳原子之烷基，或χ3與χ4 一同 形成五it環，其中Χ2，χ3與χ4至少有_個是氳原子， R2是含有3至4個碳原子之烷基，r3是含有u :個碳 原子之燒基。 -CHj % 祝飞 N Ο—· 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 其中η為0至3之整數。 在上述方法中，化合物最好具有以下之化學式· Φ—·1T· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Η 0.

R40C 〇CH; och. 11 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 ____B7 五'發明説明（）’ 其中R4乃選自由下列基團所組成的族群中：

---------Lmw—I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

； znd <y^ * * anJ R6 乃選自由， -CH2CH(CH3)2 和-C(CH3)3基困所組成的族群中。 同時，在上述方法中，化合物最好具有以下之化學式：

475897 A7 ______ B7 五、發明説明（）

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) R6 乃選自由.（CH2)2CH3 ， -CH2CH(CH3)2 和- C ( C Η 3 ) 3基圏所组成的族群中。 即使腫瘤細胞具多重抗藥性，上述化合物也能有效的投 死腫瘤細胞。這些化合物最好是以硫酸鹽的形式存在。 上述化合物包含揭露於授予Masaki等人之美專利案號 4,507,297 和 4,596,803 ，和日本專利號 63-275576(1988)和 63-276576(1988)中之六氩 d比拼衍 生物。這些專利在此以參考文款方式列出。但是，在，297 和’ 8 0 3中之六氫π比〇井衍生物已有報導指出只有抑制心肌 梗塞的作用。上述六氫B比讲衍生物的化合物族群出乎意料 的表現出很高的抗》癌活性’特別是針對那些具有多重抗華性 的腫瘤細胞。能被有效治療之腫瘤細胞包括人類的乳癌細 胞，黑色瘤細胞，卵巢癌細胞，直腸癌細胞，胰島腺癌細 胞，和前列腺癌細胞，特別是未分化之癌細胞。 13 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） "" — '

，1T 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 B7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之另一重要觀點乃是一治療腫瘤的方法，包含在 一具多重抗藥性之腫瘤細胞内施用一足夠量能殺死腫瘤細胞 之組成或其藥學上可接受之鹽類，此組成乃是由具有上述化 學式（I)之化合物所構成。上述化合物中較有效能治療腫瘤 之化合物可以被涵蓋在上述之方法中。即使在不使用其它化 療藥物的情況下，本發明中之六氫D比讲衍生物本身即有很 高的抗癌活性。這些預期外的抗癌效果顯然與引發“細胞之 自我死亡”有關，亦即，除了逆轉因mdr基因活化所表現 出的多重抗藥性外，尚包括最近才被重視之細胞自我死亡 ( Desoize G·， Anticancer Res. 14:221 -2 24, 1994 )。本發明中之六氫fl比畊衍生物藉著引發細胞自我 死亡程式和多重抗藥性之逆轉可顯著的殺死腫瘤細胞，其藥 學性質與已報導過具環氧基但不含六氩D比畊環（Shoji-Kasai e t al·， P r o c. Natl. Acad. Sci·， USA 85:146-150，1988 )之硫蛋白碑抑制劑非常不同。再 者’本發明使用六氫a比d井衍生物做為一種主要的化療藥劑 或作為其它化療藥劑之輔劑，此與前人之報導中使用卡本 (calpain)抑制劑不同，卡本（calpain)抑制劑必須在以一 主要化療藥劑治療腫瘤之前使用（國際專利申請案wo 84/00095 ) 〇 已知卡本（calpain)抑制劑乃是細胞自我死亡之抑制 劑，而非誘導者（Thompson, Science vol· 267，10 r March 1995，ρρ· 1456-1462) 〇 另一方面，已知卡本 (calpain)抑制劑1和N-Cbz-白氨酸·白氨酸-酪氨酸二氮 14 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 甲基丙酮（N-Cbz-Leu-Leu-Tyr diazomethyl ketone) 可謗發細胞自我死亡程式（Biochemical and biophysical Research communications v o 1. 214,

No· 3，2 5 September 1995，pp. 1130-1137)。由這 些互相矛盾的結果報導中，可知引發或抑制細胞自我死亡程 式無法簡單的以卡本（calpain)抑制劑活性來加以解釋。此 外，也未考慮到細胞的特異性（亦即，對正常細胞之毒 性），雖然這點非常重要。很意外的本發明中特定之六氫 fl比η井化合物可引發腫瘤細胞内特定之細胞自我死亡程式至 一比預期外更高的程度。 藉著將六氫η比讲衍生物與其它化療藥劑一同施用於患 有腫瘤之患者身上，特別是對於那些帶有活化的mdr基因 之腫瘤細胞而言，上述之六氩8比汫衍生物與化療藥劑如敏 布萊思定（vinblastine)和安卓黴素（adriamycin)—同使 用時也很有效。 因此，本發明之另一項重要的觀點即是一種能增強腫瘤 細胞之治療療效的方法，包括施用上述足夠增強此化學療效 之具化學式I之化合物或其藥學上可接受之鹽類至一具多重 抗藥性的腫瘤細胞内。上述較適合之化合物和腫瘤均可涵蓋 在此方法内。本發明之六氫吡汫衍生物，藉著將抗癌藥物 大量聚集於這些癌紐胞内，導致癌細胞死亡，因此對逆轉人 知癌細跑和具抗藥性之腫瘤非常有效。 附圖之簡單説明： 15 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） ----------Φ-- (請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁)

-、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 475897 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 圖1顯示在人類卵巢腫瘤細胞株SW-626和AN-3-CA 腫瘤細胞死亡分析中所釋出之乳酸去氫轉：（LDH)與NCO-700濃度之關係圖。 圖2顯示在黑色瘤細胞株B6F10(老鼠鈿胞株）和SK-Mel-2(人類細胞株）腫瘤氣胞死亡分析中所釋出之LDH與 NCO-700濃度之關係圏。 圖3顯示在人類腫瘤細胞株SK-Mel-2(黑色瘤細胞 株）100,000和250, 〇〇〇個腫瘤細胞死亡分析中所釋出之 LDH與NCO-700濃度之關係圖。 圖4顯示在人類腫瘤細胞株MCF-7(乳癌細胞株）， HL-60(血癌細胞株），和HEP-129(肝癌細胞株）細胞中， 腫瘤知胞死亡分析所釋出之LDH與NCO-700濃度之關係 圈0 圖5顯示在人類腫瘤細胞株HS-578T(乳癌細胞株）， T-47D(乳癌知胞株），和DU-145(前列腺癌細胞株）細胞 中，腫瘤知胞死亡分析中所釋出之LDH與NCO-700濃度 之關係圖。 圖ό顯示在人類腫瘤細胞株MCF-7(乳癌細胞株）， MDA-MB231(乳癌細胞株），和LS-174T(直腸癌細胞株） 細胞中，腫瘤細胞死亡分析中所釋出之LDH與NCO-700 濃度之關係圈。 圈7顯示在人類腫瘤細胞株JJS-578T(乳癌細胞株)細 胞中，腫瘤麵胞死亡分析中所釋出之LDH與NCO-700， TOP-00 8，TOP-009，TOP-013，和 TOP-017 濃度 _：_ 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（ ---------Φ------、訂------#. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 之關係圖。 圖8顯示在人類腫瘤細胞株HS-578T(乳癌細胞株）， DU-145(前列腺癌細胞株），PC-3 (前列腺癌細胞株）， 和WIDR(直腸癌細胞株）細胞中，腫瘤細胞死亡分析中所 釋出之LDH與TOP-008濃度的關係圈。 圖9顯示在人類腫瘤細胞株SK-Mel-2(黑色瘤細胞株） 腫瘤細胞殘存試驗分析中標的區域（由電腦計算出之殘存細 胞數目）與NCO-700濃度之關係圖。 圖10顯示在人類腫瘤細胞株LS-174T(直腸癌知胞株） 腫瘤細胞殘存試驗分析中標的區域與NCO-700濃度之關係 圖° 圖11顯示在人類腫瘤細胞株T-74D(乳癌細胞株）腫瘤 知胞殘存試驗分析中標的區域與NCO-700濃度之關係圖。 圖12顯示在人類腫瘤細胞株HS-578T(乳癌細胞株）腫 瘤細胞殘存試驗分析中標的區域與NCO-700濃度之關係 圖。 圖13顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500個和1，〇〇〇個人類腫瘤細胞DU-145(前列腺癌細 胞株），其標的區域與NCO-700濃度之關係圖。 圖14顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500個和1，〇〇〇個人類腫瘤細胞株PC-3(前列腺癌細 胞株）之知胞，其標的區域與NCO-700濃度之關係圈。 圖15顯示在人類腫瘤細胞株ln(前列腺癌細胞株）之腫 瘤知胞殘存試驗分析中標的區域與NCO-700濃度之關係 ____ 17 ^纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2i〇x297公慶) ^ ---------— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 475897 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 A7 B7_五、發明説明（） 圖0 圖16顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔含 1，〇〇〇個人類腫瘤細胞株WIDR(直腸癌細胞株）之細胞， 其標的區域與NCO-700濃度之關係圖。 圖17顯示人類前列腺癌細胞在BDF/1老鼠之次腎脂囊 分析中其腫瘤平均大小的改變（平均値之淨變化）與NCO-7 0 0劑量之關係圖。 圖18顯示人類乳癌細胞在BDF/1老鼠之次腎脂囊分析 中其腫瘤平均大小的改變與NC 0-7 00劑量之關係圈。 圖19類示人類直腸癌細胞在BDF/1老鼠之次腎脂囊分 析中其腫瘤平均大小的改變與NCO_700劑量之關係圈。 圖20顯示在人類癌知胞株DU-145(前列腺癌細胞株） 之腫瘤細胞死亡分析中，以25//M之NCO-700，TOP-008，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圈。 圈21顯示在人類癌細胞株HS-578T(乳癌細胞株）之腫 瘤兔胞死亡分析中，以25 之NCO-700 ， TOP- 008，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圈。 圖22顯示在人類癌細胞株T-47D(乳癌鉍胞株）之腫瘤 細胞死亡分析中，以25 之NCO-700，TOP-008， 及其類似物刺激後所釋出之L D Η之關係圈。 圈23顯示在人類癌細胞株SK-MEL-2(黑色瘤知胞株） 之腫瘤細胞死亡分析中，以25 之NCO-700，TOP- 0 08，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圈。 圖24顯示在人類癌細胞株WIDR之腫瘤細胞死亡分析 18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 B7_ _ 五、發明説明（） 中，以25 之NCO-700，TOP-008，及其類似物刺 激後所釋出之L D Η之關係圖。 圖25顯示在人類癌細胞株LS-174T(直腸癌細胞株）之 腫瘤細胞死亡分析中，以25mM之NCO-700 ，ΤΟΡ- 008，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圖。 圖26顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500和1，〇〇〇個人類癌細胞株HS-578T(乳癌細胞株） 之細胞，其標的區域和TOP-008濃度之關係圖。 圖27顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500個和1，〇〇〇個人類癌細胞株T-47D(乳癌細胞株） 之細胞，其標的區域和TOP-008濃度之關係圈。 圖28類示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500個細胞和1，〇〇〇個人類癌細胞株DU-145(前列腺 癌細胞株）之細胞，其標的區域和TOP-008濃度之關係 圖。 圖29顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含500個和1，〇〇〇個人類癌細胞株PC-3(前列腺癌細胞 株）之知胞，其標的區域和TOP-008濃度之關係圖。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖30顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔分 別含1，000個和2,000個人類癌細胞株LS-174T(直腸癌 知胞株）之細胞，其標的區域和TOP-008濃度之關係圖。 圖31顯示在腫瘤細胞殘存試驗分析中，每個培養孔含 5〇〇個人類癌細胞株WIDR(直腸癌細胞株）之細胞，其標 的區域和TOP-008濃度之關係圖。 19 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^ y 9 8 5 7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -A7 _____B7_ 五、發明説明（） 圖32顯示在人類癌細胞株HS-766T(胰島腺癌細胞株） 和ASPC-1(胰島腺癌細胞株）之腫瘤細胞死亡分析中以25 #MtNCO-700，TOP-008，及其類似物刺激後所釋出 之LDH之關係圖。 圖33顯示在人類腫瘤細胞株DU-145(前列腺癌知胞株） 之腫瘤細胞死亡分析中所釋出之LDH與NCO-700和卡本 (c a 1 p a i η)抑制劑1之濃度關係圖。 圖34顯示在人類癌細胞株HS-578T (每個培養孔含 1，000個細胞）之腫瘤細胞死亡分析中以NCO-700 ， TOP-008，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圖。 圖35顯示在人類癌細胞株HS-578T (每個培養孔含 1，500個細胞）之腫瘤細胞死亡分析中以NCO-70 0 , TOP-00 8，及其類似物刺激後所釋出之LDH之關係圈。 圖36顯示在細胞自我死亡試驗分析中，TOP-008引 發人類癌細胞株HS-578T之細胞自我死亡活性之結果。圖 36a ， 36b ，和36c分別顯示正常癌細跑，以TOP- 00 8( 5 0mM)處理過之癌細胞，及TOP-00 8 (2 5 mM)處理 過之癌細胞之結果。 圖37顯示以有或無安卓黴素（adriamycin)處理過之裸 鼠其腫瘤重量變化與NCO -700濃度之關係圖。 圖38顯示相對於TOP-008(以TOP-8表示），TOP-018(以 TOP-18 表示）和 NCO-700(以 NCO 表示）， TOP-009 (以TOP-9表示）對人類癌細胞株HS578-T 之影響。 20 I紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ~ ~ ---------Φ------II------#1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 ---------B7____ 五、發明説明（） 圖39顯示相對於ΤΟΡ·〇〇8(以T0P-8表示），TOP- 018(以 Τ0Ρ·18 表示）和 nc〇-700(以 NCO 表示）， TOP-013 (以Τ〇ρ·13表示）對人類癌細胞株HS578-T 之影響。 圖40顯示相對於τ〇ρ·〇〇8(以ΤΟΡ·8表示），Τ0Ρ-018(以 Τ0Ρ-18 表示）和 nCO-700(以 NC0 表示）， TOP-017 (以Τ〇ρ·17表示）對人類癌細胞株HS578-T 之影響。 圖41分別以TOP-008 (以TOP表示），TOP-018(以TOP-18表示），和nCO-700(以NCO表示）處瑷 人類癌細胞株HS578T (每個培養孔含6,000個知胞）， 其LDH之分析結果。 圖42顯示相對於TOP-008(以TOP-8表示），ΤΟΡ- 019 (以Τ0Ρ·19表示）對人類癌細胞株HS578-T之影 響。 圖43顯示相對於ΤΟΡ-008(以ΤΟΡ-8表示），ΤΟΡ- 020 (以ΤΟΡ-20表示）對人類癌細胞株HS578-T中之 影響。 圖 44 顯示 TOP-008 (以 ΤΟΡ-8 表示），〇〇9(ΤΟΡ-9)，〇13(ΤΟΡ-13)，017(ΤΟΡ-17)，019(ΤΟΡ-19)和 020(Τ〇Ρ-20)對人類癌細胞株HS578-T之細胞殘存分析 試驗之影響。

圖 45 顯示 NCO-7〇〇(以 NCO 表示），TOP-008 (以 T0P-8表示）和〇18(TOP-18)對人類癌細胞株HS578-T 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------_------if------ΛΨ (请先閲讀背面之注意事項存填寫本 A7 ^__B7_ 五、發明説明（） 之細胞殘存分析試驗之影響。 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 圖4 6顯示以次腎脂囊分析測試Τ Ο P - 0 0 8化合物對位 於BDF/1老鼠中之人類前列腺癌細胞之影響。 圖47顯示以次腎脂囊分析測試TOP-009化合物對位 於BDF/1老鼠中之人類前列腺癌細胞之影響。 圖48顯示以次腎脂囊分析測試TOP-013對位於 BDF/1老鼠體内之人類前列腺癌細胞之影響。 圖49顯示以次腎脂囊分析測試TOP-017對位於 BDF/1老鼠體内之人類前列腺癌細胞之影響。 圖50顯示以次腎脂囊分析測試TOP-018，019，和 020化合物對位於BDF/1老鼠體内之人類前列腺癌細胞之 影響。 圈51顯示TOP-008 (以T0P-8表示），卡本 (calpain)抑制刺1 (以CAL1表示），和N-Cbz-白氨酸 -白氨酸-酪氨酸二氮甲基丙酮（以N_CBZ表示）對人類癌細 胞株HS578-T之影響。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 圖52顯示經以NCO-700(以NC0表示）或TOP-008 (以TOP-8表示）處理或未經處理（以控制組表示）殖有 S-180人類肉瘤細胞之瑞典韋氏特老鼠之圖片，其中控制 組老鼠腫起之腹部顯示這些老鼠身上所帶有的巨大腫瘤。 圖53顯示經以NCO-700(以NCO表示）或TOP-008 (以TOP-8表示）處理或未經處琛（以控制组表示）殖有 S-180人類肉瘤細胞之黑老鼠C57BL/6J之圖片，其中控 制組老鼠腫起之腹部顯示這些老鼠身上所帶有的巨大腫瘤。 22 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 ___B7_ 五、發明説明（） 圖54為圖52中之控制組瑞典韋氏特老鼠之圖片經以 0.01 %之B丫啶橙（acridine orange)染色後再以雷射共軛 焦顯微鏡照相後之圖片，其中細胞核中所染出明亮，球形之 核酸顯示出排列相當整齊之核酸物質，表示細胞正在分裂。 圖55為圖52中經NCO-700處理過之瑞典章氏特老鼠 之圖片經以0.01%之D丫咬燈（acridine orange)染色後再 以雷射共軛焦顯微鏡照相後之圖片，其中細胞核中所染出核 酸呈葉片分裂狀，排列散亂，表示細胞正處於細胞自我死亡 的過程中。 圖56為圖52中經TOP-008處理過之瑞典韋氏特老鼠 之圈片經以0.01%之0丫咬燈（acridine orange)染色後再 以雷射共軛焦顯微鏡照相後之圖片，其中細胞核中所染出核 酸呈葉片分裂狀，排列散亂，表示細胞正處於細胞自我死亡 的過程中。 圖57為由圖54中之控制組瑞典韋氏特老鼠身上所取下 之知胞其核酸的螢光分佈圈，其中腫瘤細跑内排列整齊之 DNA之顏色較亮，在螢光分佈圖（類似蛋糕的圖形）（第 二和第三層分別為粉紅色與黃色）的頂端可看出其如白色糖 霜之分布。 圖58為由圖55中之老鼠身上所取下之細胞其核酸的螢 光分侑圖，其中排列整齊之DNA在經過NCO-700處理後 明顯的降低許多（頂端如白色糖霜之分布）（第二和第三層 分別為粉紅色與黃色）。 圖59為由圖56中之老鼠身上所取下之細胞其核酸的螢 _ 23 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------------IT------φί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 ____ B7_ 五、發明説明（） 光分佈圖，其中排列整齊之DNA在經過TOP-008處理後 便消失了（頂端沒有如白色糖霜之分布）（頂端和第二層分 別為粉紅色與黃色）。 圖60顯示NCO-700和TOP-008及其衍生物對 HS578-T細胞之影響，雖然其中TOP-101至TOP-115 之結構與NCO-700和TOP-008之結構類似，但這些化合 物在細胞死亡分析中卻不具任何效果。 較佳實施例之詳細説明： 吾人發現本發明中具環氧基困之六氫0比讲衍生物可被 施用於生物體内來殺死腫瘤細胞。我們的研究顯示，當衍生 物被施用於帶有具抗藥性人類腫瘤之裸鼠身上時，可抑制腫 瘤的發展約60%，例如，在動物體體重不變的情況下減輕 腫瘤的重量。再者，此藥物無論是單獨使用或與其它療法一 併施用，即使是癌細胞具有多重抗藥性，此藥物仍然非常有 效0 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如上述本發明背景中所討論的，限制抗癌藥物在臨床上 施用的一項主要因素乃是腫瘤細胞對其所發展出來的抗藥 性。最近的研究指出使癌細胞發展出抗藥性的兩種機制包括 (i)mdr多重基因家族的複製放大（ii)抑制細胞自我死亡程 式的啓動。在mdr基因被大量放大的細胞中，其抗藥性的 機轉主要在其能將抗癌藥物經過mdr蛋白不斷的泵出細胞 外以降低細胞内抗癌藥物的濃度。癌細胞中第二種主要的抗 藥性機制，直到最近才被發現，乃是藉著抑制細胞自我死亡 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 475897 A7 五、發明説明（） 程式的啓動而達成，此不僅使癌細胞能對抗化學療法，也使 癌知胞能對抗放射線治療（Desoize B·，Anticancer Res. 14: 221-2294，1994 )。目前已知能抑制細胞自 我死亡程式的蛋白質乃是Bcl-2基因的產物，此蛋白質在 能抗藥及抗輻射線的癌細胞中被大量表現。許多快速且獨特 的分子事件會發生在正進行細胞自我死亡程式的細胞中，例 如核染色質的凝聚，細胞大小的改變，及内生性細胞核4每 的活化，此會導致DNA片斷的生成。具多重抗藥性之腫瘤 細胞有抑制細胞自我死亡程式的活性。 我們發現本發明中具有環氧基国之六氩B比B井衍生物能 很有效的逆轉人類癌細胞之抗藥性以及對抗癌藥物具抗性之 腫瘤。此衍生物可使抗癌藥物，例如敏布萊思定 (vinblastine)，聚集在人類肉癥細胞株中高達五倍之多。 此結果大大提高了在腫瘤細胞死亡分析試驗中被殺死之腫瘤 細胞比例。這些研究結果顯示具有環氧基困之六氩D比讲衍 生物能有效的使具抗藥性之癌細胞對抗癌藥物敏感而被殺， 因此此藥物有很大的潛力可被用於癌症患者身上。 以下將作較詳盡的討論，一般深信本發明之藥學組成可 很有效的殺死腫瘤細胞。因此，這些組成具有能克服兩種癌 症患者抗藥性機轉之優點。 具有環氧基圏之六氩ji比_衍生物 本發明中具有環氧基困之六氫β比讲衍生物為具有化學 式I之化合物， 25 本纸張尺度適财關家縣（CNS ) Α4規格（训/別公董） ----- 1_·_ι·«ιιν ϋ·— In ϋϋ HI —ϋ an·.— · i··—— «n (请先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 475897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） h〉/、，hH3-r3 (1) R1 OC^ ^ 其中R1是羥基，含有1至4個碳原子之烷氧基（C1-4烷 氧基），含有1至4個碳原子之烷基羰基氧基甲氧基（ci-4 还lkylcarbonyloxymathoxyl)，含有1至2個碳原子之烷 氨苯基（phenyl C 1-2 alky la mi no group)，2,5- ί比洛 啶二酮-1-烷氧基（含1至 4個碳原子）（2,5-pyrrolidinedione-1 - alkoxyl (Cl-4))，或

其中X1是一化學鍵或含有1至2個碳原子之烷烯，χ2 是一氩原子或當X1為甲烯時，一可與X1形成五元環之碳 酸基圏，X3為氫原子或含有1至2個碳原子之烷基，χ4 為氫原子或含有1至2個碳原子之烷基，或χ3與χ4 一同 形成五元環，其中X2，Χ3與χ4至少有一個是氫原子， R2是含有3至4個碳原子之烷基，R3是含有1至4個後 原子之虎基。 26 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ----------0------1T--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 B7 五、發明説明（） α wCHUr . 、(〇CH 山 ,ch-〇

其中n為0至3之整數。 具有化學式I之化合物最好具有以下之化學式結構：ν〇〇α：ι：

Η R4OC

V

OCH 3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其中R4乃選自由下列基图所组成的族群中：C2H5〇- ： <^V-CHgQ- ； 〔 4痛

Ο 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Ο (CHg^CCOCHgO-

0 : ch2nh. ο- 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 同時，其它典型的化合物具有以下之化學式結構：

其中R4乃選自由下列基團所組成的族群中：

0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 (CHg^doCHgO-

0 '· Ο 0· ； «nd ch2nh- 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 以下為典型化合物可含有之取代基的範例： 化學通式 Η /—\ 〇. C0NHC-C0-N N-n3

Η P?0C

28 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） R1 0 C. (cHOaCHCH^O-0 ，

ch2nh， 0·

0·

0. CH jCOCHgO-

.U 0"叫2〇 〔I。- Ρ· ο £· ich3j2ch5och2o-

N-(CH2l4〇- CHjO5, Ρ· Ο ΡΗ3}2〇2Η3Ϊ〇ΟΗ2〇· Ο <· Γ N-(CH2)2〇-

ο (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ο c2hs ，ch3/\ CHjO· Ο

V. 經濟部中央禕準局員H消費合作社印策 R2 A: -(CH2)2CH3 B : -CH2CH(CH3)2 c： -c(ch3)3 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

-CH

〇ch3 475897 五、發明説明（ I3

A

ο 包含於具有環氧基圏之六氣 取0井衍生物之典型化合物 如下列（括號内之名稱為在以下益 夂A卜範例中此化何物之指定名 稱）： 號碼 R1 R2 R3 備註 1 A B A 反式，鈉 2 A B B 反式，鈉（TOP-201) 3 A B C 反式，鈉（ΤΟΡ-202) 4 A B D 反式，鈉 5 A B D (2R，3R)，鉀（TOP-207) 6 A B D (2S，3S)，鈉 7 A B E 反式，鈉 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----1----4------、訂------#, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 8 A B F 反式，鈉 9 A B G 反式，鈉 10 A B H 反式，鈉 11 A B H (2R，3R)，鈉（TOP-203) 12 A B H (2S，3S)，鈉（TOP-204) 13 B B D 反式，1/2硫酸鹽（TOP-205) 14 B B D 反式，鈉 15 B B D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (NCO-700) 16 B B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-008) 17 B A D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 18 B A F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-019) 19 B C D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 20 B C D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-020) 21 C B D 反式，1/2硫酸鹽（TOP_ 206) 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部中夬樣隼局員工消費合作社印裝 22 D B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 23 E B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 24 F B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 25 G B D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-003) 26 Η B D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-015) 27 Η B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-017) 28 I B F (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 29 J B F (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 30 K B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-010) 31 L B D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-005) 32 L B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-013) 33 M B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 34 N B D (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-006) 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 —_ ___B7 五、發明説明（） 35 0 B D (2R，3R) ” 1/2 硫酸鹽 (TOP-001) 36 0 B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-009) 37 P B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 38 Q B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 39 R B F (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 40 S B F (2R，3R)， 1/2 硫酸鹽 (TOP-012) 41 T B F (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 42 U B F (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 43 V B D (2R，3R)，1/2 硫酸鹽 44 B B F (2R，3R)，鈉（TOP-007) 45 C B F (2R，3R)，1/2 硫酸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 鹽（TOP-018) 鯉濟都中央椋準局舅贄哈竹社印m 上述中，Rl和R2最好分別是c2h5〇 -和· (CH3)2CHCH2-。再者，在鹽類中，硫酸鹽乃是較適合 的。當Rl是C4H9O -時，任何一級（η·)，二級（s-)，三級 (t·) ’和異丁氧基（iso-buthoxyl)均可用。 本發明中所定義之具環氧基困之六氩0比汫衍生物之效 33 本纸張尺度適用中關家標準（CNS )〜規格—（21G X297公慶）" ·一*- 475897 A7 B7 五、發明説明（ (请先《讀背面之注意事項真填寫本買) 用，一般相信乃是經由環氧基困之作用而達成，但e-64亦 含有環氧基團。在Shoji-Kasai等人之文章中所描述的較 早期的發現，例如與E-64類似之E-64-d也會表現出類似 的作用，亦即，減缓腫瘤細胞的生長速率，且其部分結構類 似本發明範例中之化合物。但是，不論是E_64或E-64-d 均不含有六氫d比ϋ井環，且已知E-64對具有多重抗藥性之 癌知胞的效果不佳，即使已知Ε·64·(1可減緩腫瘤細胞的生 長速率。因此在殺死腫瘤細胞上，不僅環氧基團很重要，在 結構上六氩〇比讲環也是不可或缺的。已知卡本（caipain) 抑制劑1對上述殺死腫瘤細胞的效果上有些作用，但其本身 的毒性卻可能是一項難以克服的缺點。其它具類似本發明六 氩ti比讲衍生物結構之化合物，亦即含有六氩η比讲環和環 氧基圏，但跗試時卻未發現其具有任何能殺死腫瘤細胞的顯 著效果，亦即，在不對正常组織細胞造成毒害的情況下，能 逆轉mdr蛋白質並殺死腫瘤細胞，此種在藥學上抑制癌細 胞有絲分裂的性質，僅出現在本發明所定義之化合物上。 六氬II比ir#衍生物的製造 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明中以化學式I所代表之六氫B比讲衍生物，可藉 常見之由化酸方法或一混合脱水方法來合成，方法詳見核定 授與 Masaki等人之美專利案號 4,507,297 和 4,598,803 ，標題“六氩毗讲衍生物及含有六氩β比讲 折生物之藥品”及日本專利案號Laid-open Nos.63-275575(1988)和 63-275576(1988)，在此以參考文獻 方式列出。 34 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（) 例如，當化學式I中之R1為一烷氧基困時，一種亮氨 酸衍生物可以通式（2)來代表， (2) 其中R2同化學式I中之r2，R5乃是氨基酸中氨基的保護 基團，例如四級丁氧基碳基圈，或其反應性衍生物’與具通 式（3)之氨基衍生物反應， HN N- 其中R3如上述所定義，以得到通式（4)之化合物， (3) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NHCHCOH R1 ’ H—R* (4) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

HiNCMCON N—R I 口 R1

接下來，以傳統的方式將保護基移除，得到具通式（5)之亮 氨酸穴氫fl比碑衍生物， (5) 再與具通式（6)之反環氧琥珀酸單酯（trans-epoxy succinic acidmonoester)反應， (6) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ^/5897 五、 A7 B7 發明説明（ 其中Ri同化學式I中之Rl ，或其反應性衍生物，因此可 得到一種具通式（7)之化合物： Η K〇c

COWCHCON I ， Η

N-R 3 (7) 或者，上述化學通式（6)中之反環氧琥珀酸單騎，或其 反應性衍生物，可與亮氨酸反應以獲得一具通式（8)之環氧 琥珀酸基亮氨酸衍生物， Η 〇 comcHco% (8) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 其中R1除了不能是羥基外，可以是化學式I中所定義之 R1 ，或其反應性衍生物。之後通式（8)之化合物可和上述 通式（3)之氨基衍生物反應，以獲得上述具通式（7)之化合 物0 此外，化學式I之化合物也可以下列聚缩反應（脱水反 應）來合成： -訂 4 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 HOoc/N "

R· 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央棣準局員工消費合作社印11 475897 A 7 ____ B7_ 五、發明説明（）

具通式（2)之化合物與具通式（3)之化合物的聚縮反應， 具通式（5)之化合物與具通式（6)之化合物的聚縮反應，具 通式（8)之化合物與具通式（3)之化合物的聚縮反應，均可 以傳統之由化酸方法或一混合脱丰方法來加以合成，或是在 有機溶劑如二氣甲坑，氣乙烯，氣仿，乙酸乙酯，四氩 吹喃或其類似物中和已知之聚縮物，例如N -羥基琥珀醢 亞胺（N-hydroxy succinimide)N，N -二環己碳二醯胺 (N，N、dicyclohexylcarbodi-mide)在-1〇〇C 到 4 0 °C T 一起反應，最好是在-5 °C到30 °C的溫度範圍内反應。 以已知鹸水解方式很容易的將通式（7)化合物的酯類殘 餘物轉變成其相對的碳酸化合物。 至於R1為羥基之化合物可以藉將通式（7)化合物的酯 基固水解而得。 也可將以此方法製備之本發明的六氩毗併衍生物轉換 成其藥學上可接受的鹽類，例如，鈉，鉀，鈣或鎂，或三烷 基氨，二苯基氨，氮原予上有低碳數烷基取代之六氫〇比 讲（N-l〇wer alkylpiperidine)，N -苯基-万-早基氨 (N-benzl- β -phenety 1 amine) ， a - I 基氣(a _ phenethylamine) ， 1-(1-秦基 )乙基氨（1-(1- naphthyl)ethylamine)，以及氣酸，棚酸，甲酸，硫 酸，反-丁烯二酸，順-丁烯二酸，或酒石酸。再者，使用一 具光學活性之反環氧琥珀酸單酯（6)，例如依Kenji Mori 等人（Tetrahedron，vo 1. 36(1)，87-90，1980)或曰本 專利案號Νο·3-18629(1991)中所述之方法合成 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ----------MW------^------,0, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) B7 五、發明説明（） (2S，3S) -環氧琥珀酸單酯（（2S，3S)-epoxy sueeinic acid monoester)或（2R，3R)-環氧琥珀酸單酯 ((2R，3R)-epoxy succinic acid monoester)化合物， 可以得到本發明中具化學式I之化合物，帶有以上述方法合 成之具光學活性之環氧琥珀酸基圏。 藥學應用 依本發明更進一步之觀點，本發明所提供能殺死腫瘤細 胞的藥品，乃是含有具化學式I之化合物或其藥學上可接受 的鹽類作為其活性成分之藥品。 依本發明具化學式I之化合物或其藥學上可接受的壅 類，其作為能殺死腫瘤細胞之藥品的效用已經被確認，因其 對引起知胞自我死亡和逆轉癌細胞多重抗藥性上具有非凡的 效用。 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 再者，以老鼠和大白鼠所作的急性毒性試驗中，已知本 發明之化合物對人類的安全不構成危險。例如，經由靜脈注 射NCO-700至大白鼠體内其百分之五十致死率（LD5〇)是 3 1 7mg/Kg。因其不具毒性因此可每天長時間毋須中斷的 施用於患者身上，直到腫瘤被抑制，也不會造成任何類著的 副作用。化合物此種無毒性，引發癌細胞自我死亡，並逆轉 其多重抗藥性的效果，將會使傳統化療法的施行步驟完全改 觀0 具化學式I之化合物及其藥學上可接受鹽類的劑量視腫 瘤發展的過程，腫瘤的型式，其多重抗藥性的程度，和同時 配合使用之化療法而有所變化。一般而言，可以約 38 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） 475897 A7 ____ B7__ 五、發明説明（） t5mg/Kg至250mg/Kg之量施用於患者身上，較好是以 約250mg/Kg至l〇〇mg/Kg之量施用，更好是以約 lmg/K：g至5 0mg/K：g之董施用，以期能有效的引發癌細胞 自我死亡程式並逆轉其多重抗藥性。適用之腫瘤細胞為人類 乳癌細胞，黑色瘤細胞，卵巢癌細胞，直腸癌細胞，胰島腺 癌細胞，和前列腺癌細胞，特別是當腫瘤仍處於未分化之階 段。 至於作為各種藥品之配方，一般將具化學式I之化合物 及其鹽類與藥學載體一起混合來製作藥學组成。適宜之藥學 載體之範例包括稀釋物或載體如填充劑，黏著劑，分解劑和 潤滑劑。 此種藥品劑量可以各種注射，粉末，膠囊，顆粒，藥錠 或注射小瓶之型式存在。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在製為藥錠的情況下，其所使用之載體可選自下列，例 如，乳糖，薦糖，氣化到，葡萄糖溶液，藏粉，竣酸舞，纖 維素結晶或矽酸；黏著劑例如水，乙醇，丙酵，葡萄糖，爽 粉溶液，明膠溶液，碳酸甲基織維素，甲基纖維素或靖酸 鉀；分解劑如乾燥的澱粉，海澡酸鈉，凝膠粉末，唉酸氩 鈉，碳酸鈣，硬脂酸甘油，澱粉或乳糖；或潤滑劑例如硬脂 酸鹽，硼酸粉末或眾所習知之聚乙烯甘油固體。視須要可將 藥錠外鍍上糖衣或明膠或薄膜外衣。 在製為注射液的情沉下，其所使用之稀釋劑可選自，例 如，水，乙醇’丙晞乙二醇，多氧基乙稀山梨酸或山樂酸 酯。在此情沉下，可添加足夠量之氣化鈉，葡萄糖或甘油以 39 本ϋ尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）—~ -- 475897 A7 __B7_ 五、發明説明（） 形成等張溶液。也可於其内添加常用可幫助溶解之物質，緩 衝溶液，減輕疼痛的藥物或保存劑。 本六氩II比U井衍生物可單獨使用或與化療藥劑，或其它 化學療法如放射線治療一起合併使用。當本六氩1比汫衍生 物與一化療藥劑如敏布萊思定（vinblastine)和安卓黴素 (adriamycin)合併使用時，六氫a比讲衍生物幾乎可以和 化療藥劑同時施用，以使六氫β比讲衍生物可以和任何化療 藥劑形成均句的藥學型式施用。 本發明將經由以下特定之範例及供作説明之文字範例加 以闞述，但本發明之範疇並不因此受到限制。每一個測試化 合物乃經由上述之方法合成。測試範例之目的在於顯’示具化 學式I之化合物及其藥學上可接受鹽類對引發癌細胞自我死 亡程式並逆轉其多重抗藥性上所展現出的非凡效果。 範例V : NCO-700及其相關之類似物箪獨存在時之抗腫痼 活性 鑛 NCO-700 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 雙[乙基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基-1-[4·(2,3,4-三甲氧基 苯基甲基）六氫η比讲-1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷- 2-羰酸酯]硫酸鹽）（815|>11171(211，311)-3-[(8)_3-11^11^1-1 - [4-(2,3,4-trimethoxyphenylmethyl)piperazin - 1 -ylcarbonyl]butylcarbomoyl]〇xirane-2-carboxylate] sulfate ) 40 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格( 210X 297^釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（）

HiS04 TOP-008雙[乙基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基- -苯基·2 -丙缔基）六氫比井-1-基羰基）丁基胺甲癌基]環氧虎談酸醋] 硫酸鹽）（315[611^1(2厌，311)-3-[(3)-3-111611171-1-[4- (3 - p h e n y 1 - 2 - p r 〇 p e n y 1 ) p i p e r a z i η - 1 y 1 c a r b 0 n y 1 ] unwlatel sulfate) butylcarbo mo y 1] oxirane-2-car〇〇A^ H28〇4 TOP-009 ^ 丨3 -苯基-2·丙烯 雙[;*(2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基-I]4 斑基]球一-2^酸 基）六氫η比讲-1-基羰基]丁基胺甲 硫酸鹽）（Bis[benzyl (2R,3R)-3 ----------0------IT------Φ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 [4-(3-phenyl-2-propenyl)pipera^ [(s ) - 3 - m e t h y 1 - 1 -卜y 1 carbonyl] in butylcarbomoyl]oxirane-2-carb〇?c e ] sulfate) H*9〇4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 3 -本基-2 -丙婦

2 475897 五、發明説明（ ΤΟΡ·0 1 3 雙[苯基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基-卜[4 ^ d觅1瓖氧淀-2-幾酸醋] 基）六氫υ比fl井-1 -基羰基]丁基胺甲醢暴』琢 Λ Γ/ς^-3-methyl-l- 硫酸鹽）（Bis[phenyl (2R，3R)-3-U 〜 • 卜 yl carbonyl] [4-(3-phenyl-2-propenyl)piperazin- iate] sulfate) butylcarbomoyl]oxirane-2-carb〇xy H18O4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ΤΟΡ·0 1 7 雙[(2R，3R)-2 -卡基胺甲酿基- 3-[(Sh *、< Ί T基胺甲殖基]環氧 苯基·2·丙烯基）六氣13比讲-1-基談基] ^ vie arbamo y 1- 3 -烷]硫酸鹽）（Bis[(2R，3R)-2-bei^y ,r〇penyl)

[(S)-3-methyl-l-[4-(3-phenyl-2-P piperazin - 1 - yl carbonyl] b u t y1c a sulfate) rb〇m〇yn〇xirane] 訂 -^9.

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Η«β04 方法 〜物之抗癌活性0 在此實驗中使用三種方法來測量化θ ^換所釋出之酵素活 1 .腔瘤知胞死亡分析•藉著測量 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X 297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 性，乳酸去氫a^r(LDH)，來定量受傷或死亡之細胞數目。 當細胞經抗癌藥物處理24小時後，以Decker等人所提出 之方法（J. Immunology Methods 15:61-99，1988)測 量釋出至胞外之LDH的酵素活性。 2·腫瘤細胞殘存試驗分折:以培養之腫瘤細胞來作細 胞殘存試驗之測定。在有24個培養孔之培養皿中以每一培 養孔500-1000個細胞的密度培養，並以藥物處理7天。 經藥物處理後，以電腦細胞影像之技術來確認每一培養孔中 殘存細胞之數目。由數據中，畫出殘存細胞曲線並計算 ED50(達到百分之五十致死率時之藥物濃度）。 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3.體内模型/次腎囊（SRC)腫瘤移殖分析••一種腫瘤殖 入模型，將人類腫瘤殖入老鼠之次腎囊中。腫瘤很成功的避 開老鼠髏内免疫系統的攻擊並允許其成長6天。此分析方法 的優點是能在體内測試化療藥劑的效果。此模型乃是由加州 大學，爾文（Irvine)校區之Stratton等人所發展出來的 (Gynecologic Oncology 1 7:1 8 5 - 1 8 8, 1 9 84 )。在 第一天殖入人類腫瘤，之後在第二至六天以藥物處理。分別 在0時間和經藥物處理五天後測定所殖入腫瘤之大小，其與 殖入後第六天之差別，相較於未經藥物處理之控制組，所得 數値在此稱為平均淨値。 所用之細胞株 所有本發明中所用之細胞株均來自美國組織培養實驗室 (American Type Tissue Culture Labratory )並依 其指示方法培養。除非特別聲明，否則所用均為人類腫瘤細 43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 胞株。以下為本實驗所使用之細胞株及其組織來源： 細胞株 組織 備註 1 MCF-7 胸部 有雌激素受體 2 MDA-MB231 胸部 有雌激素受體 3 T-47D 胸部 有雌激素受體 4 HS-578T 胸部 有雌激素受體 5 B16F10 黑色腺 老氲細胞株 6 SK-Mel-2 黑色腺 7 SW-626 卵巢 8 AN-3-CA 卵巢 9 HL-60 白血球 10 Hep-129 肝臟 11 LS-174T 直腸 12 WIDR 直腸 13 DU-145 前列腺 無雄激素受體 14 PC-3 前列腺 無雄激素受體 15 LN 前列腺 有雄激素受體 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 結果 1)NCO-700和腫瘤細胞死亡：此第一個試驗乃是測試 44 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） B7 五、發明説明（） NCO-700單獨在各類人類腫瘤之細胞死亡試驗中之抗癌活 性。這些實驗的結果顯示於圖丨_8 ，其中顯示NCO-700 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 相對於所釋出之ldh%之劑量區線，被釋量愈高 表示其抗癌效果愈好。由這些試驗中可看出（i)在乳癌細胞 株中，對NCO-700有反應之癌細胞並不具有雌激素受體， 此種情況常見於未分化，屬於較惡性之腫瘤鈿胞；（ii)在黑 色瘤知胞中，所有的細胞均對NCO-700敏感；（iii)在前 列腺腫瘤给胞中，沒有雄激素受體之細胞（屬於較惡性之腫 瘤）對NCO-700之反應極佳；（iv)直腸及卵巢癌細胞則為 部分有反應，且（v)血癌及肝癌細胞株對NCO-700則無反 應。但是，如以下實驗所示（實驗7)，當NCO-700與一 傳統之化療藥劑如敏布萊思定（vinblastine)和安卓微素 (adriamycin) —併使用在具多重抗藥性之腫瘤上時仍會產 生一些效用，即使NCO-700無法有效的在腫瘤中引發細胞 自我死亡的效果。 2)NCO-700之類似物和腫瘤細胞死亡：在細胞死亡試 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 驗中測試一系列與N C 0 - 7 0 0相關之類似物之活性。如圖7 所示，當測量由一種乳癌細胞HS-578T所釋出之LDH， 可知許多與NCO-700相關之類似物均具有抗癌活性。相較 於NCO-700 ，有三種類似物表現出相當高的活性，包括 TOP-008，TOP-009，和 TOP-013 ° 特別是 TOP-008 顯出最高的活性，其殺死乳癌細胞的能力較NCO-700要高 出3倍。請注意類似物乃單獨進行測試，未添加任何化療藥 劑0 45 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 ____ B7 五、發明説明（） 由於TOP-008乃是所有體内測試中最有效的NC〇-700類似物’因此也檢視其對其它腫瘤細胞株之抗癌活性。 圖8顯示TOP-008殺死乳癌，前列腺和直腸癌細胞之劑量 反應曲線。此類似物，在單獨使用時，即可對這些腫瘤知胞 表現出極佳的活性。 3) NCO-700和腫瘤細胞殘存試驗分析··腫瘤細胞殘存 試驗分析在化合物之抗癌活性的禮外分析上非常重要，這些 癌細胞均經過長時間（7天）的抗癌藥物處理。圖9-16顯 示增加NCO-700劑量對殘存之腫瘤細胞株的影響。殘存試 驗確認了在細胞死亡分析中所得之結果，亦即NCO-700單 獨使用時，對許多人類腫瘤（乳癌細胞株T-47D和HS-578T，直腸癌細胞株LS-174T和WIDR，前列腺癌釦施 株DU-145 ，PC-3和LN)即有顯著的抗癌活性質。圖中 縱軸為標的區域，亦即由電腦所計算出殘存的細胞數目。 4) 在«内SRC試驗中，NCO-700對人類前列腺癌麯 胞生長之影響：人類癌細胞可在老鼠之次腎囊中生長，這些 癌細胞在短期間内可避開老鼠之免疫系統而不被偵测到。此 分析方法提供了一個很方便的系統來研究藥物對體内癌細胞 生長的影響。由於此分析方法較為費時，且較體外分析試驗 須要用掉更多的藥物，因此僅在前列腺癌細胞上測試NCO-700的影響。以3種NCO-700的濃度包括10mg/Kg ， 2 Omg/Kg，和40mg/Kg分別在3组動物（n = 23 )上作 測試。如圖17所示，老鼠體内腫瘤大小的減低與NCO-700的劑量相關。10mg/Kg的劑量無效，當NCO-700為 46 本紙^尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） — "^ ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 475897 A7 _____B7_ 五、發明説明（） 20mg/Kg和 40mg/Kg時則有明顯的抗癌效果。 40mg/Kg的NCO-700有非常顯著的抗癌活性，其P値> 0.001 (參見圖17)。同樣的，NCO-700的抗癌效果乃 是單獨測試的結果，並未添加任何其它與此相關之抗癌藥 物。 5) 在體内SRC試驗中，NCO-700對人類乳癌細胞生 長之影響：NCO-700對人類乳癌細胞生長之影響以SRC 試驗來加以測定。以 3種NCO-700的濃度包括 10mg/Kg ，25mg/Kg ，和 50mg/Kg 分別在 3 組動物 (n=18 )上作測試。如圖18所示，老鼠髏内腫瘤大小的 減低與NCO-700的劑量相關。l〇mg/Kg的劑量無效，當 NCO-700為25mg/Kg和50mg/Kg時則有明類的抗癌效 果。這些結果確認了 NCO-700和其相關化合物作為新一代 抗癌藥物的潛力。 經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 6) 在體内SRC試驗中，NCO-700對人類直腸癌細胞 生長之影響：NCO-700對人類直腸癌細胞生長之影響以 SRC試驗來加以測定。以2種NCO-700的濃度包括 50mg/Kg和100mg/Kg分別在3組動物（n=18 )上作測 試。如圖19所示，老鼠體内腫瘤大小的減低與NCO-700 的劑量相關。50mg/Kg的NCO-700僅有一點效用，但當 NCO-700為100mg/Kg時則有明顯的抗癌效果。這些結 果確認了 NCO-700和其相關化合物作為新一代抗癌藥物的 潛力。 結論 47 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） "—' 475897 A7 B7 五、發明説明（） 實驗1建立了 NCO-700單獨使用時，即可對所選定之 腫瘤細胞表現出極佳的抗癌活性。NCO-700的類似物， Τ Ο P - 0 0 8 ’其抗癌活性約為NCO-700活性的3倍。 NCO-700抗癌活性之機轉似乎與啓動細胞自我死亡機制有 關。 範例2 : TOP-008及其它NCO-700類似物蕈潘存在時之 抗癌活性 TOP-00 1 雙[+基（2R，3R)-3-[(S)-3·甲基-l-[4-(2,3,4-三甲氧基 苯基甲基）六氩〇比〇井·1-基羰基}丁基胺甲醯基]環氧烷·2-羰酸酯]硫酸鹽）（815[6611271(2&，311)-3-[(8)-3-methyl-l-[4-(2,3,4-trimethoxyphenylmethyl) piper azin-l-yl carbonyl]butylcarbomoyl1〇xirane- 2-carboxylate] sulfate) -I- flu HI ml mmml ϋ— m ml n·— HI I 11« in m ,一^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0Μ·

HaS〇4 I t 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 0Μ· ΓΟΡ-Ο 1 2 雙[3-氧·2-苯并丁内酯-1-基（2R，3R)-3_[(S)-3 -甲基-1-[4-(3 -苯基-2-丙烯基）六氩此讲-1·基羰基]丁基胺甲醯 基]環氧烷-2-羰酸酯]硫酸壅）（Bis[3-oxo-2-benzoxolan-l-yl (2R,3R)-3-[(S)-3-methyl-l-[4- 48 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五 發明説明（ 1 -yl carbonyl] (3-phenyl-2-propenyl ) pipera^ 1 vVlate] sulfate) butylcarbomoyl] ox irane-2-carb〇x^

K2S〇4 TOP-015 雙[(2R，3R)-2 -孚基胺甲醯基- 3-[(S)-3 -甲基 (2,3，4-三甲氧基苯基甲基）六氫ii比命-卜基叛基】丁基胺 甲醢基]環氧烷]硫酸«) (BlS[(2R’3R)l benzylcarbamoyl-3-[(S)-3-methyl-卜[4 (2,3,4 trimethoxyphenylmethyl) piperazin“-yl carb〇nyl] butylcarbomoyl]oxirane] sulfate)

HtS04 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 T Ο P - 0 0 3 雙[三甲基乙醯甲基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基- l- [4-(2,3，4 -三甲氧基苯基甲基）六氩p比#-1-基羰基]丁基胺 甲醯基]環氧烷-2· 羰酸酯]硫酸鹽） (Bis[ trimethylacetoxymethyl (2R,3R)-3-[ (S)-3-methyl - 1 - [4-(2,3,4-trimethoxyphenylmethyl) piperazin- 1 -yl carbonyl]butylcarbomoyl]oxirane- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

475897 A7 B7 五、發明説明（） 2-carboxylate] sulfate) 2 TOP-005 雙[苯基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基-1-[4-(2,3,4-三甲氧基 苯基甲基）六氫〇比〇井·1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷-2_ 羰酸酯]硫酸鹽）013[?1^1^1(211，311)-3-[(3)-3-methyl-l-[4-(2,3,4-trimethoxyphenylmethyl) piperazin- 1 -yl carbonyl]butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate] sulfate) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

TOP-006 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 雙[5·苯并環丙烷基（2R，3R)-3-[(S)-3·甲基- l-[4· (2,3,4-三甲氧基苯基甲基）六氫〇比汫-1-基羰基]丁基胺 甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯]硫酸鹽）（BistS-indanylGRJRH-KSW-methyl-l-H-p’Sj-trimethoxyphenylmethyl)piperazin - 1 - yl carbonyl] butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate] sulfate) ____50_ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897

經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 A7 五、發明説明（） m m _ TOP-0 1 0 雙[2-(2,5-二氧-4- 〇比咯啶美）乙基（2R，3R)-3-[(S)-3-酽基-苯基-2 -丙烯基）六氫II比并-卜基談基]丁基 胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯]硫酸鹽）（Bis[2-(2’5_dioxG_ l-pyrrolidinyl)ethyl(2R,3R)-3 -[(S)-3-methyl -1- [4-(3-phenyl-2-propenyl)piperazin-l-yl carb〇nyl] butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate] sulfate) o 、co 方法 如範例1所述，以三種方法來測量化合物之抗癌活性。 結果 1)NCO-700類似物和腫瘤細胞死亡：此第一個試驗測 試NCO-700類似物在各類人類腫瘤之細胞死亡試驗中之抗 癌活性。這些實驗之結果顯示於圖20-25 ，其中柱狀圖顯 示某一特定類似物之活性，以所釋出之L D Η %來表示★被 釋出之LDH量愈高表示其抗癌效果愈好。所有類似物均以 25 的濃度進行測試。由這些試驗中可看出NCO-700 51 本紙張尺ϋ用中國國家標準（CMS ) Α4規格（210Χ 297公釐)一一·---------- ϋ··—^— ί I I! m I—-- In -- am m m ml «II —ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 475897 A7 ____B7_ 五、發明説明（） 類似物之抗癌活性有很高的選擇性，某些類似物之活性顯著 的高於NCO-700之活性。即便這些類似物單獨使用時並未 具有明顯能使細胞自我死亡的效果，但當與傳統化療藥劑一 併施用於具多重抗藥性之腫瘤上時，這些類似物便會表現出 很高的抗癌活性。 2)TOP-008和腫瘤知胞殘存試驗分析：圖26-31顯示 增加TOP-008劑量對許多腫瘤細胞株的影響。殘存試驗確 認了 TOP-008具有很強的抗癌活性質（使細胞自我死亡的 效果），在某些情況下甚至比NCO-700更具活性。例如， 若以人類直腸癌細胞株和WIDR來比較NCO-700與 ΤΟΡ-008的活性，（範例1圈16與圖31相比），可看出 在此特定的試驗中TOP-008之有效劑量較NCO-700來得 低0 範例3 : NCO-700及其它類似物在胰島腺癌細胞中之抗癌_ 活性 方法 如實驗1所述，以腫瘤細胞死亡試驗來測定下列物質之 抗癌活性，NCO-700，TOP-001，TOP-003，ΤΟΡ-0 0 5 ， TOP-008 ， TOP-009 ， TOP-010 ， ΤΟΡ- 012，TOP- 013，ΤΟΡ-Ο 1 5，和 TOP-017 〇 所使用之知胞株 下列所使用之細胞株：人類胰島腺腫瘤細胞株ASPC-1 和HS-766T均來自美國組織培養實驗室（American 52 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------------IT------.φ— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明説明（

Type Tissue Culture Labratory )並依其指示方法培 養。 結果 本實驗之結果如圖32所示’其中之柱狀圖顯示以某一 特定類似物處理24小時後細胞所釋出之LDH%量，以此來 作為類似物抗癌活性的代表，LDH値愈高表示其抗癌活性 愈高。所有類似物均以25 //M濃度進行測試。由這些分析 中’可知某些類似物，特別是TOP-008和TOP-009，所 表現出之抗癌活性較NCO-700本身來得更高。 範例4 : NCO-700及卡本抑制劑在腫瘤細胞死亡分折試路 中之比較 基於上述實驗1之結果，以腫瘤細胞死亡分析試驗比較 NC 0-700及卡本抑制劑l(N-乙醯基-亮氨酸-亮氨酸-正亮 胺趁 ( N-acetyl-leu-leu-norleucinal ) ， C2〇H37N3〇4)對人類腫瘤細胞株DU-14 5之影響。圖33 顯示由Boshringer-Ingelheim公司中買來的卡本抑制劑 1及NCO-700之結果。在圖33中，很顯然的NCO-700 之效果較優於卡本抑制劑1 。在100 的濃度下， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) NCO-700之效果為卡本抑制劑1的1〇倍。 當欲長時間測試（細胞殘存試驗）卡本抑制劑1的效果 時，發現其對細胞具有毒性，這點也是由其本身化學結構上 即可預期的結果，且卡本抑制劑1的毒性在進行體外或細胞 殘存試驗進行中會千擾試驗結果。 53 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 範例5 : NCO-700，TOP-008及其類似物單獨存在時之 抗癌活性 TOP-20 1 [(2RS，3RS)-3-[(S)-3 -甲基-1-(4 -苯基甲基）六氩此 _ •1·基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯]鈉鹽Sodium (2RS,3RS)-3-[(S)-3-methyl-l-[4-phenylmethyl) piperazin- 1 -y 1 carbonyl] utylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate]

TOP-202 [(2RS，3RS)-3-[(S)-3 -甲基-l-[4-(4 -甲氧基苯基甲基） 六氫u比讲-1-基羰基]丁基胺甲醢基]環氧烷-2·羰酸酯]鈉 鹽 Sodium(2RS，3RS)-3-[(S)-3-methyl_l-[4-(4- methoxyphenylmethyl ) piperazin-l-yl carbonyl] butylcarbomoyl] oxirane-2-carboxylate] 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

OMt TOP-203 [(2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基- -嘧啶基）六氩 ti 比 1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯]鈉鹽Sodium (2RS,3RS)-3-[(S)-3- methyl -1-[4-(2-pyrimidinyl) 54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 ______ 五、發明説明（） piperazin-l>yl car^onyl]butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate]

TOP-204 [(2S，3S)-3-[(S)-3 -甲基- -嘧啶基）六氫 〇比汫· 1- 基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷·2·羰酸酯]鈉鹽Sodium (2S，3S)-3-[(S)-3-methyl-i，[4-(2-pyrimidinyl) piperazin-l-yl carbonyl]butylcarbomoyl]oxirane- 2- carboxylate]

#/CON TOP-205 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 雙[乙基（2RS，3RS)-3-[(S)-3 -甲基-l-[4-(2,3,4-三甲 氧基苯基甲基）六氫d比讲-1-基羰基]丁基胺甲酿基]環氧烷 -2-羰酸酯]硫酸鹽）813卜11171(2厌8,31^)-3-[(8)-3-methyl - 1 - [4-(2,3,4-trimethoxyphenylmethyl) piperazin- 1 -y 1 carbonyl]butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate] sulfate

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 475897 A7 .^ _B7_ 五、發明説明（） TOP-206 雙[異 丁基（2RS，3RS)-3-[(S)-3 -甲基- l- [4-(2,3,4 -三 甲氧基苯基甲基）六氫毗讲-1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧 烷-2-羰酸酯]硫酸鹽）Bis[isobutyl(2RS，3RS)-3-[(S)-3-Inethyl-l-[4-(2,3,4-trimethoxypilenylmethyl) piperazin-l-yl carbonyl]butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate] sulfate

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) • Hs3〇· 2 TOP-207 (2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基-l_[4-(2,3,4-三甲氧基苯基甲 基）穴氣比讲-1-基談基]丁基胺甲殖基]環氧娱*-2 -幾酸黯] if 鹽 Potasium(2R，3R)-3-[(S)-3-methyl-l-[4_ (2,3，4-trimethoxyphenylmethyl)piperazin - 1 - yl carbony!]butylcarbomoyl]oxirane-2-carboxylate]

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TOP-007 [(2R，3R)-3- [(S)-3 -甲基-1·[4-(3 -苯基-2-丙烯基）六 氫α比讲-1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯]鈉鹽 _ 56 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 4/5897 A7 _____B7__--- 五、發明説明（） 1 r4-(3-phenyl-

Sodium (2R，3R)-3-[(S)-3-methy卜卜 2-propenyl)piperazin-l-yl 2-carboxylate] carbonyl]butylcarbomoyl] 〇xiratie^

基於上述實驗1之結果，以腫瘤細胞死亡分析試驗比較 NCO-700，TOP-20 1 , 202 , 2〇3，204 ’ 205， 206 , 207，和007對人類腫瘤細胞株HS-578T之影 響。圖34 (每個培養孔含1，〇〇〇個細胞）和圖35(每個培 養孔含1，500個細胞）之柱狀圖顯示以某一特定類似物處理 後細胞所釋出之LDH%量（以二甲基亞〇比讲（DMSO, dimethyl sulfoxide)作為控制組）來作為類似物抗癌活 性的代表，LDH値愈高表示其抗癌活性愈高。所有類似物 均以25 濃度進行測試。由這些分析中，可知無論是舊 的TOP-008 ( 6個月之久，OLD )或新合成之化合物 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} (NEW)均具有良好的抗癌活性，而TOP-208和NCO-700也有不錯之抗癌活性。其它經測試之類似物也表現出一 些抗癌活性。而以硫酸鹽形式存在之化合物之效果較好。 矣-M···6 · T 0 P - 〇 〇 8在引發細胞自我死亡謎赂分折中夕括慮 活性 以R&D公司（Minnesota)所發售之麵胞自我死亡债測 57 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X297公釐）— -—- 475897 A7 ______B7 五、發明説明（） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 劑，依公司所建議的步驟來測試TOP-008之抗癌活性。此 試劑内含見附件素V(annexin V)，其乃是可與鈣離子及 磷脂結合之眾多蛋白質的一員，可用來偵測細胞自我死亡的 過程。在人類乳房腫瘤細胞株HS-578T中以50 TOP-008的濃度進行測試。以冰冷的磷酸緩衝液（PBS>清 洗細胞2次並使其重新懸浮於1倍的結合緩衝液（binding buffer)中。在細胞懸浮液中加入已接了螢光物之附件素 V (annexin V)和波皮地琪（propidium iodine) 〇 那些 iw 胞外膜上具有絲氨酸鱗腊（phosphatidylserine)的知跑可 與附件素V(annexin V)結合而使波皮地破（propidium iodine)能與細胞内之去氧核糖核酸（DNA)結合。立即以 流動細胞篩選儀（flow cytometer )來篩選細胞，發現 可將細胞分為3個族群：不會與任一螢光物質結合的細胞， 會與兩種螢光物結合之腫瘤細胞，以及正處於細胞死亡過程 中僅會和附件素V-異硫氰酸螢光素（annexin V-FITC)複 合物結合之知胞。測試乃在具備有單隻雷射，且發射波長為 488nm之麵胞筛選儀上進行。以異硫氰酸螢光素（FITC)訊 號偵測器（FL1)來偵測附件素V-異硫氰酸螢光素（annexin V-FITC)複合物產生的訊號。結果如圖36所示，其中縱軸 為發射出之螢光強度，橫軸則是細胞數目。圖36a ， 36b，和36c分別顯示正常癌細胞（控制組），經T0P-〇〇8(50mM)處理之癌細胞，和經TOP-00 8 (2 5mM)處理 之癌細胞之結果。很顯然的由圖36可看出TOP-008可降 低人類乳房腫瘤知胞之細胞自我死亡過程。 _____58 :紙張尺度適用中關家鮮（CNS ) M規格（21Gx297公着） -— 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 ----_ 五、發明説明（） 範例7:細胞自我死亡遇程所引發的DNA齡裂現象 以 25 TOP-008，50 NCO-700 或水將前列 腺癌細胞株PC-3處理48小時。藉苯酚萃取純化每一個測 試樣品内之DNA，並將其片段於洋菜明膠上溶解。結果發 現以TOP-008和NCO-70 0處理過的樣品其DNA明顯的 呈現斷裂現象，而控制组（以水處理）則否。已知此種 DNA斷裂現象乃是細胞進行自我死亡過程中的一種特有現 象（Jarvis e t al·，Cane. Res. 1 154:1707-1714, 1 9 8 4, p and e y e t al., biochem· Cell b io 1. 72:625 -629, 1 984 ) ° 範例8 :其它相關化合物之抗癌活性 方法 測試物之結搛:如上述，以三種方法分別測定下列物質 之抗癌活性，NCO-700 ， TOP-008 ，TOP-009 ， ΤΟΡ-013 ，ΤΟΡ-Ο 1 7 ，ΤΟΡ-Ο 1 8 ，TOP-0 1 9 ，和 ΤΌΡ-020 。其中 TOP-018 ，TOP-019 ，和 TOP-020 之結構如下： 雙[異 丁基（2R，3R)-3-[(S)-3 -甲基- -苯基-2-丙 烯基）六氫π比a井-1-基羰基]丁基胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸 酯]硫酸鹽）Bis[i-butyl (2R，3R)-3-[(S)-methyl-l-[4-(3-phenyl-2-propenyl)piparazin-l - ylcarbonyl] butylcarbamoyl]-oxirane-2-carboxylate] sulfate 59 本紙悵尺度適用中國园家標隼（CNS ) Λ4規洛（210X 297公簸） I!-------Φ------IT------禮 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 五、發明说明（ TOP·0

1

HtS〇4 0

KOHinEiOH k〇jC

h*s〇4 ---------曹II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T t 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 NMR (CDCI3) δ: 0.89-0.86 (24H, m) 1.40-2.05 (8H, m) 2.8 5 -4.40 (2 8H, m) 4.7 8-4.8 8 (2H, m) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210>< 297公董） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 6.3 7 - 6.4 8 (2H, m) 6.70 (2H, d, J=16H2) 6.92-6.98 (2H, m) 7.2 5 - 7.3 3 (6H, m) 7.40-7.45 (4H, m) 2 _丙烯基） 雙[乙基（2R，3R)-3-[(S)-l-[4-(反式" 广羰酸酯]硫 六氫0比α井-1-基羰基]丁基胺甲醯基]瓖象$ 酸鹽）Bis[ethyl (2R，3R)-3-[(S) 一 ί4 (transe- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ar b〇 yl] phenyl-2-propenyl)piparazin-l-ylc- sUlfate butylcarbamoyl]-oxirane-2-carbo"l TOP-0 19

HaS04 2 經濟部中央標準局員工消费合作社印策 0

HJlOk 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公慶） 475897 A7 ____B7_ 五、發明説明（） 狀態：白色無定形 NMR (CDC13) δ : 0.85 (6Η, t，J = 7.2Hz) 1.20(6H, t, J = 7.2Hz) 1 .24- 1 .3 3 (4H, m) 1 .5 4- 1 .62 (4H, m) 2.95-4.13 (20H, m) 3.81 (4H，d，J = 7.3Hz) 4.13-4.18 (4H, m) 4.69-4.72 (2H, m) 6.38 (2H, dt，J= 1 5.6 Hz, 7.3 Hz) 6.78 (2H，d，J=1 5.6Hz) 7. 1 9-7.26 (6H, m) 7.42-7.44 (4H, m) 1R (KBr) Umaxcm-1 ： 3435， 2984， 2937， 1747， 1651， 1448， 1275， 1203, 1120, 1028 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 雙[乙基（211，311)-3-[(8)-2,2-二甲基-1-[4-(反式-3-苯 基·2·丙烯基）六氫毗汫-1-基羰基]丁基胺甲醢基]環氧烷 •2-羰酸酯]硫酸鹽）Bis[ethyl (2R，3R)-3-[(S)-2,2-dimethyl - 1 - [4-(transe-3-phenyl-2-propenyl) piparazin - 1 - ylcarbonyl]butylcarbamoyl]-oxirane-2-carboxylate] sulfate 62 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） TOP-020

(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 狀態：白色無定形 NMR (CDC13) δ: 0.90 (1 8Η，s) 1.19-1.22 (6H，t，J = 7.2Hz) 2.97-4.22 (20H， m) 3.52 (2H，d，J = 2Hz) 3.72 (2H，d，J = 2Hz) 4.12-4.22 (4H，m) 4.72 (2H，s) 6.3 4-8.42 (2H, dt，J=1 5.6 Hz, 7.3Hz) 6.7 5 - 6.79 (2H，d，J=15.8Hz) 7.1 7-7.26 (6H，m) 63 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 ______B7_ 五、發明説明（） 7.42-7.44 (4H，m) 1 R (KBr) Umaxcm· 1 : 3423， 2968， 1747,1647, 1448, 1371, 1259, 1203, 1 1 1 9, 1 028,, 95 8, 750，694 1 -朦瘤細胞死亡分析：藉著測量由受傷或死亡之人類乳 房腫瘤細胞HS578-T所釋出之酵素活性，乳酸去氩ft# (LDH)，來定量受傷或死亡之細胞數目。當細胞經抗癌藥 物處理24小時後，以I>ecker等人所提出之方法（J· Immunology Methods 15:61-99，1988)測量釋出至胞 外之LDH的酵素活性。 2. 腫瘤細胞殘存試驗分析：以培養人類乳房腫瘤細胞 HS578-T腫瘤知胞來作細胞殘存試驗之測定。在有24個 培養孔之培養m中以每一培養孔1000個細胞的密度培養， 並以藥物處理7天。經藥物處理後，以電腦細胞影像之技術 來確認每一培養孔中殘存細胞之數目。由數據中，畫出殘存 細胞曲線。 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 3. 體内模型/次腎囊（SRC)腫痼移殖分析（英吋）：一種 腫瘤殖入模型，將人類腫瘤殖入老鼠之次腎囊中。腫瘤很成 功的避開老鼠體内免疫系統的攻擊並允許其成長6天。此分 析方法的優點是能在體内測試化療藥劑的效果。此模型乃是 由加州大學，爾文（Irvine)校區之Stratton等人所發展出 東的（Gynecologic Oncology 17: U8 5-188, 1984 )。在第一天殖入人類前列腺腫瘤，之後在第二至六 天以藥物處理。分別在0時間和經藥物處理五天後測定所殖 64 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 475897 A7 __B7 五、發明説明（） 入腫瘤之大小，比較其與殖入腫瘤後第六天之差別，相較於 未經藥物處理之控制組，所得値在此稱為平均淨値。 結果 腫瘤細胞死亡：第一個試驗測試NCO-700類似物在人 類乳房腫瘤細胞HS578-T之死亡試驗中的抗癌活性。這些 實驗的結果顯示於圖38-43，分別以1 ，5，1〇，25， 和50 Μ五種不同濃度對這些類似物進行測試。此外，某 些測試中尚包括25mM的TOP-008，TOP-018和NCO· 7〇〇以期能將這些新類似物的結果能和先前已測試之化合物 結果互相比較。在圖38-43中，其中之柱狀圈類示某一特 定類似物之活性，以所釋出之LDH%來表示，被釋出之 LDH量愈高表示其抗癌效果愈好。由這些試驗中可看出除 了 TOP-017和TOP-020外，這些新類似物均較NCO-700具有更高的抗癌活性。 腫瘤細胞殘存試驗分析：腫瘤細胞殘存試驗乃是一項很 重要的體外試驗分析，能估算長時間（7天）以藥物處理細 胞時藥物之抗癌活性。圈44和45類示以1 ，5 ，10， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 25，和50#M五種不同濃度之NCO-700類似物處理人類 乳房腫瘤細胞HS578-T，其對殘存試驗的影響。殘存試驗 中確認了這些類似物中有數種具有很強的抗癌活性。 人類前列腺腫瘤細胞體内生長情形：如以上所討論的， 人類腫瘤細胞能在老鼠之腎小管内生長一小段時間，在這短 暫期間它們可躲過老鼠體内免疫系统的偵測。此分析提供了 一種非常方便，可在體内研究藥物對腫瘤細胞生長情形之影 65 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — 475897 A7 --- B7_ 五、發明説明（） 響的系統。我們以兩種不同濃度，包括每公斤體重25和 5〇mg的濃度測試了 NCO-700類似物對人類前列腺腫瘤之 影響。每一實驗組均含6隻動物，且如果較高濃度如每公斤 體重50mg可見到效果的話，就再以較低的每公斤體重 25mg之濃度進行測試。如圖46-50中所示，TOP-008， TOP-009和TOP-017無論是以每公斤體重25或50mg 的濃度施用，在統計上均能有效的縮減腫瘤髏積之大小，而 TOP-013在高濃度下則僅有些許作用。TOP-018 ， TOP-019和TOP-020在此試驗中則不見成效。很意外的 是TOP-018在體内試驗中竟不具效果，因其在體外試驗中 的活性相當高，因此有可能與此化合物本身之生物可利用性 有關。 嚴例9 :以NCO-700和T OP-008在腫瘤細胞中引發細 _!我死亡的過程並以共軛焦雷射顯微影像來作楨測 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗証明本發明之化合物可在體内引發癌知胞自我死亡 的程序。將已培育至高密度之人類肉瘤細胞直接注射至老鼠 的腹膜腔來作腫瘤測試。當腫瘤在老鼠的腹腔内開始生長以 後，再以NCO-700或TOP-008來為其作治療。之後以共 軛焦顯微影像技術來檢視以經藥物處理之腫瘤細胞。此項技 術使吾人能觀察腫瘤鉍胞之細胞核内排列整齊的核酸物質， 並能直接觀察在細胞内正進行之細胞自我死亡的程序。 方法 以共軛焦雪射顯微影像在經NCO-700和TOP-008虛 66 本纸張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^/5897 A7 _________B7_ 五、發明説明（） 1過的腫癥細胞中測定細胞自我死亡的過程：麵胞核中核酸 物質的瓦解乃是細胞自我死亡程式被啓動後的一個特有的現 象。藉著腫瘤細胞中核酸物質（DNA或RNA )的標定及 雷射共軛焦顯微影像技術可將此現象呈現在研究者的眼前以 利觀測（Smith GJ et al·，J. electro Microsc Tech 18:38-49, 1981; Kressel M and Groscurth PI5

Cell Tissue Res. 278:549-5 6 1, 1 994 ) 〇 藉著腹腔直接注射，在重約20-22克之瑞士韋斯特鼠 身上接種lxl〇7之人類肉瘤細胞S-180。讓腫瘤紅胞在老 鼠體内生長48小時後，再以每天每隻動物2mg的劑量於腹 腔内注射NCO-700或TOP-008。連續以藥物處理8天， 之後將腫瘤取出以上述兩分文獻報告中所使用的掃描式雷射 共軛焦顯微影像技術來觀察癌細胞。以家族内交配繁衍產生 的黑鼠，c57BL/6J(Jackson Labs)，來進行其它的試 驗。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在以雷射共軛焦顯微影像技術掃描前，先以吖啶橙將 細胞染色。Q丫啶橙乃是一種專門染核酸的染劑且其與核酸 結合後會產生螢光。將每一個癌細胞中的螢光分伟畫成圖 形，且每一張圖中的顏色數値代表其DNA的完整性，數値 愈高（白色）表示核酸物質的排列愈整齊，愈緊密，細胞也 愈健康，數値愈低表示核酸物質的排列較不整齊且散亂，也 是自我死亡細胞的特點，細胞核内出現DNA的片斷 (Kressel M and Groscurth PI, cell Tissue res. 278:54 9-561，1994 )。所用之雷射共軛焦顯微鏡系統乃 67 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 475897 A7 B7_ 五、發明説明（）

Mericjian儀器公司（Okemos，MI)所發展的。 腫瘤細胞死亡分析:所選用以測定腫瘤細胞死亡的化合 物包括 TOP-008 ，卡本抑制劑 l(calpain inhibitor 1) 和N-Cbz·亮氨酸-亮氨酸·酪氨酸二氮甲基丙酮（N-Cbt leu-Leu-Tyr diazomethyl ketone) (Biochemical and Biophysical Communications v o 1. 214，N o . 3 5 September 25，1995，pp. 1130-1137) 〇 藉著測量由 受傷或死亡之人類乳房腫瘤細胞HS578-T中所釋出之酵素 活性，乳酸去氫&^(LDH)，來定量死亡之細胞數目。當知 胞經抗癌藥物處理24小時後，以Decker等人所提出之方 法（J· Immunology Methods 15:61-99，1988)測量釋 出至胞外之LDH的酵素活性。 結果 腫瘤知胞死亡分析：在人類乳房腫瘤細胞HS578-T之 細胞死亡試驗中測量TOP-008(TOP)，卡本抑制劑 l(calpain inhibitor 1，CAL 1)和 N-Cbz-亮氨酸-亮氨 酸-酪氨酸二氮甲基丙酮（N-CBZ)之抗癌活性。此實驗之結 果顯示於圖51 。在此實驗中所用化合物之濃度以的量 標示於囷上。圖51中之柱狀圓顯示某一特定類似物之活 性’以所釋出之LDH %來表示，被釋出之LDH量愈高表示 其抗癌效果愈妤。由這些試驗中可看出所有測試物均具有抗 癌活性，其中以TOP-008之活性最高，巧N-cBZ則是在 高濃度時（50 pM )會出現沉狹。雖然n-CBZ具有某一 程度殺死癌細胞的能力，但其導致細胞死亡的機轉極可能是 68 本纸&尺度適用中因國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ---------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 475897 A7 __B7___ 五、發明説明（） 因其對細胞邊成毒性所致。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以共軛焦雷射顯微影像在經NCO-700釦TOP-008虚 理過的腫瘤細胞中測定細胞自我死亡的過程：以Τ Ο P · 0 0 8 或NCO-700(2mg/day :腹腔注射）治療腹腔内帶有人類 肉瘤之老鼠8天後，可大大減低老鼠體内腫瘤的大小。所得 結果具代表性之動物，其照片顯示於圖52和53。圖52顯 示體内殖有人類肉瘤S-180之瑞士韋斯特鼠之照片。控制 組老鼠腫脹的腹部明顯的顯示出其體内攜帶的巨大腫瘤。而 以NCO-700或TOP-008治療過之老鼠則可看出其體内攜 帶的腫瘤體積要小的多。類似的結果也類示於圖53中，其 中之黑鼠，C57BL/6J ，同樣經相同劑量的兩種藥物加以 處理。對減低老鼠腹腔内腫瘤體積而言，在此品種之老鼠中 NCO-700顯然較為有效。 · 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在8天後由動物體内取出腹腔液，以D丫啶橙（0.01%) 對腹腔液中的癌細胞染色後再以雷射共軛焦顯微影像技術觀 察。圖54-58分別為由殖有人類肉瘤S-180之控制組老鼠 和經藥物處理過的瑞士韋斯特鼠身上取出之癌細胞的單細胞 掃描圖。圖54為控制组老鼠之照片，其中細胞核中所染出 之明亮，呈球形的核酸物質顯示其為一個健康可分裂的細 胞。相反的，圖55和56顯示由經過NCO-700 (圖55 ) 或TOP-008 (圈56)治療之老鼠身上所取得之細胞，其 核酸物質呈斷裂，不整齊狀，顯示細胞正處於自我死亡過 程。 也可以雷射共軛焦顯微影像技術將相關健康麵胞中排列 69 度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297H) ^~ 475897 A7 ____ _B7_ 五、發明説明（） 整齊之核酸物質的數値一起計算，並與正値細胞自我死亡過 程細胞中排列鬆散之核酸物質的數値互相比較。圖57-59 顳示由圖54-56乏動物體中所取出細胞之核酸物質的螢光 分佈。控制組動物中（圈57 )有較高比例排列整齊之核蘇 物質（DNA或RNA )。圖57中排列整齊之DNA的顏色 數値較高，且呈現白色“糖霜”似的螢光分佈（類似蛋糕 狀）〇 相反的，經 NCO-700 (圖 58 )，和 TOP-008 (圖59 )處理之老鼠細胞，其中排列整齊之DNA的比例 大為減少。這些結果顯示由藥物處理過之動物體内所分離出 的細胞正處於自我死亡的過程，同時也證實NCO-700和 TOP-008之抗癌機制乃在於引發癌知胞的自我死亡程式。 範例1 0 (對照範例）：相關化合物之抗癌活性 方法 趾試餘之結構L如上述，以腫瘤細胞死亡分析在乳房腫 瘤細胞株HS578-T (最敏感細胞株中的一種）中分析 TOP- 1 0 1 至 T0P-115 化合物(WO9 6 3 03 7 8 ， WO9630354)與NCO-700和TOP-008相較後之抗癌活 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ----------f! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 性。這些化合物之結構如下：

TOP· 1 0 1 (2R，3R)-3-[(RS)-3 -甲基-1-苯基丁基胺甲醯基]環氧烷· 70 玉紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x297公廢 475897 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A 7 B7 五、發明説明（） 2 -羰酸酯鈉（Sodium (2R，3 R)-3-[(RS)-3-methyl l-phenylbutylcarbamoyl]oxirane-2-carboxylate ) TOP- 1 ο 2 (2S，3S)-3 -二苯基甲基胺甲醯基]環氧烷-2-羰酸酯鈉鹽 ( Sodium(2S，3S)-3- diphenylmethylcarbamoyloxirane-2-carboxylate ) TOP- 1 03 (2S，3S)-3-[4 -甲基-1-(3 -甲基丁基）戊基胺甲醯基]環氧 烷-2-羰酸酯鈉鹽（Sodium (2S，3S)-3-[ 4-methyl-1-(3-methylbutyl)pentylcarbamayl] oxirane-2- carbo xylate ) TOP- 1 04 乙基（2S，3S)-3 -二苯基胺甲醯基環氧烷-2 -羰酸酯 (Ethyl(2S,3S)-3-diphenylcarbamoyl]oxirane-2-carboxylate ) 71 本泜浪尺度適β中国围家標隼（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） ---------费------IT------*·1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7 B7 五、發明説明（ TOP- 1 05 (2S,3S)-3 -二苯基甲基胺甲醢基-2-乙基胺甲醢環氧烷 ( (2S,3S)-3-diphenylmethylcarbamoyl-2- ethylcarbamoyloxirane ) TOP- 1 06 [4-(2S，3S)-3·二苯基甲基胺甲醯環氧烷-2-羰基]-1-六氩 η比 〇井]甲烯雙瞵酸二鈉鹽 （4-(2S，3S)-3- diphenylmethylcarbamoyloxirane-2-carbonyl]-l-piperazine] methylenebisphosphonic acid disodium salt ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) TOP- 1 07 [4-[N-[(2S，3S)-3-二苯基甲基胺甲醯環氧烷·2·羰基]甘 胺酸基]氧基六氩ϊ比啶基}甲烯雙膦酸二鈉锺 （4-[Ν-[(2S,3S)-3-diphenylmethylcarbamoyloxirane-2-carbonyl]glycyl]oxypiperidyl]methylenebisphosph 72 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) Λ4規格（210X 297公慶) 五、

A7 B7 發明説明（） 〇 n i c acid disodium salt ) TOP- 1 08 [4-(2S，3S)-3-二苯基甲基胺甲醯環氧烷-2-羰基]氧基六 氫〇比啶基]甲烯雙瞵酸二鈉鹽（4-[(23,33)-3-diphenylmethylcarbamoyloxirane-2-carbonyl] oxypiperidyl] methylenebisphosphonic acid disodium salt ) ---------#τι (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TOP-109 [4-[N-[(2S，3S)-3-二苯基甲基胺甲醯環氧烷-2-羰基]甘 胺醯基]-1 -六氫D比α井基]甲烯雙瞵酸二鈉鹽 （4-[Ν-[(2S,3S)-3-diphenylmethylcarbamoyloxirane-2-carbonyl]glycyl]-l-piperazinyl] methylenebisphosphonic acid disodium salt ) TOP-1 1 0 [4-[1^-[(23,38)-3-乙氧基羰基環氧烷-2-羰基卜1^亮胺 73 本紙张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210x 297公釐） 475897 .A 7 B7 _五、發明説明（） 醯基]-1-六氫此fl井基]甲烯雙膦酸二鈉鹽 （CfN-f^SdShS-Ethoxycarbonyloxirane-S-carbonylJ-L-leucyl]- 1 -piperazinyl] methylenebisphosphonic acid disodium salt ) Ν·Ογ^，% >·0Ν· TOP- 1 1 1 [4-[N-[(2S，3S)-3-羧基環氧烷-2-羰基]-L -亮胺酿基]-1-六氩0比ϋ井基]甲烯雙膦酸三鈉鹽 （4-[N-[(2S，3S)-3-carboxyoxirane-2-carbonyl]-L-leucyl] - 1 -piperazinyl] methylenebisphosphonic acid trisodium salt ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 TOP- 1 1 2 [4_[N-[(2S，3S)-3 -乙氧基羰基環氧烷-2-羰基]-L-亮胺 醯基卜L -亮胺醯基]·1·六氫0比d并基]甲烯雙膦酸二鈉鹽 ( 4-[N-[(2S,3S)-3-Ethoxycarbonyloxirane-2- carbonyl]-L-leucyl]-L-leucyl]-l-piperazinyi] methylenebisphosphonic acid disodium salt ) 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X2W公釐） ^«97 Μ Β7 五、 發明説明（

Top. 1 1 3 [3-|；4-[N-[(2S，3S)-3 -羧基環氧烷-2-羰基]-L -亮胺磁 基]-卜六氫π比fl井基]-3 -氧]丙烷-1，1·雙膦酸三鈉鹽（3-[4-[N-[(2S,3S)-3-carboxyoxirane-2-carbonyl]-L-leucyl]-l-piperazinyl]-3-oxo]propane-l，l-bisphosphonic acid trisodium salt ) TOP- 1 1 4 [4-[>1-[(23,33卜3-羧基環氧烷-2-羰基]-1^亮胺醯基-L -亮胺醢基]-1-六氩β比Q井基]甲烯雙麟酸三鈉鹽（4- [N-[(2S,3S)-3-carb〇xy0xjrane-2.carbonyl]-L- leucyl.L-leucyl]-l.piperazinyl] methylenebisphosphonic acid trisodium salt ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 TOP- 1 1 5 >K〇'Na0t° [4-[(2S,3S)-3-[(S).3. 甲基-1-(3 -甲基胺甲醢基）丁基-胺甲殖基]環氧燒-2-幾其 田地 氧六氫0比啶基]甲烯雙膦酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格 -1〇Λ

7529^iT 475897 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 一鈉鹽（ 4 - [ ( 2 S，3 S ) - 3 - [ ( S ) - 3 - hi e t h y 1 1 - ( 3 · methylcarbamoyl)butyl.l-carbamoyl] 〇 xirane-2-carbonyl]- oxypiperidyl]methylenebisphosphonic acid disodium salt ) 結果 圓60顯示在人類乳房腫瘤細胞之腫瘤細胞死亡試驗中 測試NCO-700類似物的抗癌活性，其中之柱狀圖顯示某一 特定類似物之活性，以所釋出之LDH %來表示，被釋出之 LDH量愈高表示其抗癌效果愈好。以25 //M的濃度對所有 類似物進行試驗。由這些試驗中可看出如前述已知的結論， NCO-700和TOP-008具有很好的抗癌活性。在其它經測 試的化合物中，只有ΤΟΡ·1〇4表現出些許的抗癌活性，但 相較之下顯得非常微弱。 麗例11 : NCO-700對逆棘人類腫瘤多重抗藥性之影孿 前述實驗確立了本發明中六氫^^汫衍生物的一項新作 用，亦即引發細胞自我死亡程式，因此衍生物本身即已是非 常有效的抗癌藥物。下列實驗範例乃是當六氫β比α井衍生物 與一般標準的化療藥物如敏布萊思定（vinblastine)和安卓 黴素（adriamycin)—同使用於具抗藥性的腫瘤時，即使化 合物本身無法在某些癌細胞株中啓動細胞自我死亡程式，但 其仍能明顯的表現出抗癌性贫。 76 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐) Φ------,訂------.# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) · A7 B7 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 '發明説明（ 万法和結果 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在此實驗中，以四種不同的分析方法來測定NCO-700 抑制或逆轉癌鈿胞或腫瘤之抗藥性。這些分析法包括： 1 ·藥物累積試驗，在人工培育的癌細胞中測定NCO-7〇〇對細胞吸取有氫同位素標示的敏布萊思定（（3H)-vinblastine)的影響，此癌細胞不僅有抗藥性同時也對某 些藥相當敏感（參考文獻3 )。 2 ·細胞殘存分析試驗，測定NCO-700提高敏布萊思定 (vinblastine)殺死癌細胞能力的影響。 3 ·致癌性之體内模型，測定NCO-700對安卓黴素 (adriamycin)減低具抗藥性腫瘤質量之影響。 4 ·人類腫癍切片分析，測定NCO-700對提高以敏布萊 思定（vinblastine)或安卓黴素（adriamycin)殺死直接由 患者腫瘤中分離培養出的癌細胞之能力的影響（Von Ho ft et al·, Cancer Res. 43:1 926- 1 93 1,1 9 83 ) 0 所用鉍跑株 前述兩種分析方法，藥物累積試驗和細胞殘存試驗中， 所用的細胞株乃是抗藥性非常強的人類咽喉癌細胞株（KB-V-1)。此細胞株乃是由國家癌症研究所（National Cancer Institute )中的 Ira P as t an 和 Michael Gottasman兩位博士，逐步篩選出能對抗秋水仙素的細 胞。具抗藥性之細胞株乃是由對抗癌藥劑敏感的控制組細胞 株（KB-3 )中繁衍出來的。具抗藥性之KB-V-1細胞對 77 本纸張尺度適用中园國家標準（CNS ) Λ4坭格（210X 297公釐） 475897 A7 一一_ B7__ 五、發明説明（） 敏布萊思定（vinblastine)的抗性約為敏感株KB-3的275 倍，且其抗藥性乃因mdr蛋白質被大量表現所致。 至於致癌性體内模型所用的細胞株，乃是由Pastail和 Gottesman兩人所研發出的一種無法逆轉，且能在裸鼠身 上長成腫瘤，被命名為KB-CH8-5的一種細胞株。所有的 癌細胞株均為Gottesman博士熱心提供的。 在腫瘤切片分析中，將由患者身上取下的腫瘤樣本以細 胞培養的技術加以培育。以安卓黴素（adriamycin)或敏布 萊思定（vinblastine)加NC 0-700處理後以懸浮性聚落方 式培育在明膠上兩星期，之後拿來作細胞殘存試驗。 表2乃是藥物累積試驗所得結果之總結。以pastail和 Gottesman兩人實驗室所研發出的方法來測定[3h卜敏布 萊思定（[3H]-vinblastine)的累積（Foja et al·， Cancer Res. 45:3 002-3 007 ) 〇 在此法中，將 KB-V-1 和KB-3細胞以每個培養孔3xl〇5個細胞的密度培養在含 有10 %牛血清之24孔培養盤中。第二天再將培養基換成有 或無（控制組）添加20 NCO-700之DMEM培養基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 0 10 分鐘 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 後，將培養基移除改換成有或無20 # M NCO-700存在 下，内含O.lmCi ，（13 pmol)[3H卜敏布菜思定（[3H]-vinblastine)之分析緩衝液。再經额外的30分鐘後，移去 培養基，以冰冷的磷酸緩衝液清洗培養盤3次，以胰蛋白 〇比讲將細胞沖下，並以液態閃爍法測定放射線強度。 78 本紙汉尺度適用ϋ國家標隼（CNS ) Λ4現格（210x297公釐 475897 A7 B7 五、發明説明（） 表2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) NCO-700能刺激敏布萊思定(vinblastine) 累積在具抗藥性的人類癌細胞中 藥物累積（pmol敏布萊思定/mg蛋白質） KB-V-1 KB-3 (對藥物敏感細胞）（具抗藥性細胞） 控制組（只含敏布萊思〇·29±：〇·〇3 2.99 ±0.12 定） 20μΜ NCO-700+ 敏布 1·56 + 〇·〇3 3.17 + 0.09 萊思定（vinblastine) 經濟部中失標準局員工消費合作社印製 如表2所示，在具抗藥性之細胞株KB-1中，由於其本 身mdr蛋白質幫浦的作用，使得敏布萊思定抗癌藥物在此 細胞中的累積受到極大的限制。然而，當細胞經20 # M NCO-700處理後，可使敏布萊思定在此細胞中的累積增加 5倍。如以下表3所示，此可提高殺死具抗藥性細胞株的能 力0 本纸浪尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規洛（210X297公釐） 475897 A7 B7 五、發明説明（） 表3 NCO-700會g增力卩敏布萊思定(vinblastine) 殺死具抗藥性癌細胞的能力 細胞株 殺死50¾細胞之敏布萊思定 (vinblastine )量（ng) KB-3 (對藥敏感細胞株） 3.2 + 20μΜ NCO-700 1.8 KB-V-1 (具抗藥性細胞株） 792 + 25μΜ NCO-700 148 以上之細胞殘存試驗乃是以每個孔洞300-500個細胞 的密度將KB-3 (對藥敏感細胞株）和KB-V-1 (具抗藥 性細胞株）培養在32mm之細胞培養盤上。18小時後再加 入NCO-700和敏布萊思定（vinblastine)。在37 °C下經 過10天的培養，將細胞族群染色後計算其細胞數目。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦ 如表3所示，NCO-700對具抗藥性細胞株KB-V-1的 生存有戲劇性的影響。當具抗藥性細胞株KB-V-1與30 //}4>1(：0-700 —同培養時，殺死50%癌細胞所須之敏布 萊思定（vinblastine)的量由原有的 82^ng劇降至 160ng 。此效果乃是因累積於癌細胞内之抗癌藥物量增 加，因而倒致mdr蛋白質被抑制之故。有趣的是，在此實 ____ 80 本紙張尺度適用中S國家標準（CNS ) Λ4規格（210 <297公慶了 475897 經濟部中央標準总員工消費合作社印製 Α7 Β7 五'發明説明（） 驗中發現其同樣會提高殺死對藥敏感細胞株ΚΒ·3之能力。 在下一系列之實驗中，以致癌性之體内模型來測定 NCO-700對減低腫瘤質量之影響。這一系列實驗乃是在由 Gottesman和P a s t an兩位博士所研發，由體内實質腫瘤 上取下且專用於動物體之細胞株KB-CH-8/5中進行。在 5-8週大重約25·30克之裸鼠體内注入2-5xl〇8之KB-CH-8/5知胞，並以0.6mg/Kg之安卓微素（adriamycin) 在有或沒有每天0-80 mg/Kg之NCO-700存在下治療14 天。圖37顯示所穫得老鼠體重及所取下腫瘤稱重後之重量 數據。由圖37可清楚的看出，添加NCO-700能顯著的促 進安卓黴素（adriamycin)的效果，特別是當所用劑量在 40mg/Kg或更高時，會有更明顯的效果。 結論 NCO-700能刺激敏布萊思定（vinblastine)抗癌藥物 在人類癌細胞中的累績達5倍。此結果能顯著的提高殺死這 些癌細胞的能力。雖然NCO-700單獨使用時並無特別成 效，但當NCO-700與安卓徽素（adriamycin)—同施用於 帶有人類腫瘤（KB-CH 8-5)之裸鼠身上時，在不使老鼠體 重減輕的情況下可使腫瘤質量減低約8 0 %。 雖然六氫α比σ井衍生物無法在某些癌細胞株中引發細胞 自我死亡程序，但當其與標準化療藥劑如敏布萊思定 (vinblastine)和安卓徽素（adriamycin) —同使用於具抗 藥性腫瘤時，卻可展現出顯著抗癌活性，上述實驗即為此現 象之最佳範例。因此，在臨床試驗上，首先，將本發明中六 81 本纸张尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4坭格（210x 297公慶) 111 訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 475897 A7

五、發明説明（） 氩毗畊衍生物之一的化合物當作是一種主要的化療藥物施 用於癌症患者身上（不論mdr蛋白質是否存在），當單獨 使用此化合物無法達到任何成效時，再引入其它化療程序作 為輔助治療方法，如加入其它化療藥劑與本六氫毗讲衍生 物一同施用。 對習知此技藝之人士而言，應瞭解在不超出本發明範轉 下可針對本發明做許多的改變或改良。因此，本文中所闞述 之範例僅作為説明之用，本發明之範疇應不受其限制。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 82 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

1. 475897 A8 B8 C8 D8 ί蒌請i·丨 5;吁年(# 丨補 0 =一種〜f殺死癌細胞的組合物，其係包含： 1 ) 一有效量足以殺死癌細胞之式 I 化合物 或其藥學上可接受的鹽類， Η R"OC S、/〇\/CONH〒-C。'' N-R3 (I)k2 N/ 3 其中 R1是羥基、Ci.4烷氧基、叔-丁羰 .氧甲氧基、苯甲氨基、2 - ( 2，5 -二酮-1 -说 洛垸基）乙氧基、苯氧基、苯甲氧基、

   0- 或 少。· R2是異丁基，且R3是 Me0v_v0Me •CH，一/ \-〇Me -CH 厂 CS ------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ H :霣 n HI n n 一 VI n n ·ϋ fl— i I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΟΜβ )一種藥學上可接受之載體 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 83 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 475897 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 之化合物可具有下列之結構式： Η

   3 其中R1係選自由下列基團所組成的族群中： C2H5°^ ;C-^HqO

   CH2〇- ; j ο

   CH^NH- # r2為異丁基

   .0 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： •線； 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 之化合物具有下列之結構式··

   84 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 475897 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 其中 R1 乃選自由下列基團所組成的族群 中··

   O-CH (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¾ · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 r2為異丁基。 4. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 之化合物乃以硫酸鹽形式存在。 5 . 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 可被治療之癌細胞乃選自由人類乳房癌細 胞、人類黑色瘤細胞、人類卵巢癌細胞、人 類直腸癌細胞、人類胰島腺癌細胞、和人類 前列腺癌細胞所組成之族群中。 85 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -線 475897 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 6 . 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 可被治療之癌細胞乃指尚未分化之癌細胞。 7 · 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中 可被治療之癌細胞乃指帶有活化的 mdr蛋白 質基因之細胞。 8 · —種可促進具抗藥性腫瘤化學療法之治療效 果的組合物，其係包含： (1 ) 一有效量足夠提高化學療法效果之式 I 化合物或其藥學上可接受的鹽類； R丄0C 平 / CONHC-CO-N 、 N-R3 (I) 其中 R1是羥基、C1-4烷氧基、叔-丁羰 氧甲氧基、苯甲氨基、2-(2,5 -二酮-1-口比 咯烷基）乙氧基、苯氧基、苯甲氧基、 -i i n n n ΐ— 1 - n 1 -1 n I · n I Hi n - - I Is ..... 一 4 d d I t n n n I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

   或 〇- R2是異丁基，且R3是 86 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) 475897 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 •CH •CH

   -c^-〇 2) —種藥學上可接受之載體。 9 . 如申請專利範圍第 8項所述之組合物，其中 所述之化學療法係指至少施用敏布莱思定 (vinblastine)或安卓黴素（adriamycin)。 1 0 .如申請專利範圍第8項所述之組合物，其中 所述之化合物具有下列結構式： R.JOC

   CONH^ . Rz CON OCH. OCH- -------------¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----訂i n n λ— n l n I OCH. m 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 其中 Ri乃選自由下列基團所組成的族群 中： W-· 〇-ch2( ^4HqO -；

   ο (ch2!2〇-； 87 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t〉 475897 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 •Ο (CHg CCO CH -

   ； G. a r2為異丁基。 1 1 ·如申請專利範圍第8項所述之組合物，其中 所述之化合物具有下列之結構式： R，OC

   CONH. ,C〇N n

   (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ¾ LSJ. z 其中 R 1乃選自由下列基團所組成的族群 中： 丨線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 C2H5°'· 〇4 HqO-) CH,〇-

   .(α^】2〇· 88 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) ο 475897 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍

   0 ο

   基 丁 異 為 2 R 2 中 其 物 合 組 。 之在 述存 所式 項形 8 鹽 第酸 圍硫 範 以 利乃 專物 請合 申：化 如之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 3 OH 選 乃 胞 細 範癌 利之 專療 請治 申被 如可 之 述 所 項 8 第 圍 中細 其癌 ’ 房 物乳 合類人 由 人類 ， 人 胞和 細 ， 癌胞 巢細 。 卵癌中 類腺群 人島族 ， 胰之 胞類成 細人組 瘤，所 色胞胞 黑細細 類癌癌 人腸腺 , 直列 胞類前 訂- -線 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中。 其胞 ， 細 物癌 合之 組化 之分 述未 所尚 項旨 才 8 乃 第胞 圍細 範癌 利之 專療 請治 申被 如可 物 合的 組化 之活 述有 所帶 項旨 才 8 乃 第胞 圍細 。 範癌胞 利之細 專療之 請治因 申被基 如可質 d m 中白 其蛋 9 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 475897 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 1 6 . —種可治療癌細胞的組合物，包括： 1 ) 一有效量足以殺死癌細胞之式 I 化合物 或其藥學上可接受的鹽類， S Η RXOC /CONHC- C ί2 K' R -CO-N N—R3 (I) 其中 R1是羥基、（：丨_4烷氧基、叔-丁基 羰基氧甲氧基、苯甲氨基、2 - ( 2，5 -二酮-1〃比咯烷基）乙氧基、苯氧基、苯甲氧基、

   或 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· R2是異丁基，且R3是 _ OMe •CH2—/ V〇Me -CH2-CH=CH Ό

   in •線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CH- 2) —種化療藥劑；及 3) —種藥學上可接受之載體 90 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) 475897 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 1 7 .如申請專利範圍第 1 6 項所述之組合物，其 中所述之化合物具有下列結構式：

   ------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϋ n n ϋ n n )eJI n I* «IV n ·ϋ an n I -

   2〇-； 〇4HqO -) •0

   ^ι2〇- · Ο 0 0· ο- ch2nh- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 r2為異丁基。 1 8 .如申請專利範圍第 1 6項所述之組合物，其 中所述之化合物具有下列結構式： 91 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) 475897 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍

   (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •線 1 9 ·如申請專利範圍第 1 6項所述之組合物，其 中之化合物乃以硫酸鹽形式存在。 2 0 ·如申請專利範圍第 1 6項所述之組合物，其 中可被治療之癌細胞乃指帶有活化的 m d r蛋 白質基因之細胞。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) « 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製