KR19990082064A - 피페라진 옥시란 유도체를 사용하여 신생 세포의 사멸을유도하는 방법 - Google Patents

피페라진 옥시란 유도체를 사용하여 신생 세포의 사멸을유도하는 방법 Download PDF

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우치가사키 이사오
히다치 가세고교 가부시끼가이샤
야마구치 가즈시로
닛뽄케미파가부시키가이샤
가토 료지
히타치 케미칼 리서치 센터, 인코포레이티드
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Abstract

주요 화학요법제로서 신생 세포에서 세포 사멸을 유도하거나 멀티드럭-저항성 신생 세포를 치료하는 화학요법의 효능을 높이기 위한 약제를 제조하는 데 있어서의 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
화학식 1
상기 식에서,
R1은 하이드록실, C1-4알콕실, C1-4알킬카보닐옥시메톡실, 페닐 C1-2알킬아미노 그룹, 2,5-피롤리딘디온-1-(C1-4) 알콕시 또는(여기서, X1은 화학 결합 또는 C1-2알킬렌이고, X2는 수소이거나, X1이 메틸렌인 경우, X1과 함께 5원 환을 형성하는 카복실이고, X3은 수소 또는 C1-2알킬이고, X4는 수소 또는 C1-2알킬이거나, X3과 X4는 함께 5원 환을 형성하고, X2, X3및 X4중의 하나 이상은 수소이다)이고,
R2는 C3-4알킬이고,
R3은 C1-4알킬,,,
,또는

Description

피페라진 옥시란 유도체를 사용하여 신생 세포의 사멸을 유도하는 방법
암 치료 분야를 포함한 각종 약제학 분야에서, 특정한 에폭사이드 화합물들이 약제학적으로 활성인 화합물로서 공지되어 있다. 수많은 에폭사이드 화합물이 다양한 목적으로 합성되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제4,507,297호와 제4,596,803호(Masaki et al.)에는 심근 경색증을 억제시키고자 하는 목적으로 사용되는 NCO-700을 포함하여, 에폭사이드 그룹을 갖는 피페라진 유도체가 기술되어 있다. 미국 특허 제5,336,783호(Omura et al.)에는 칼파인(calpain) 억제 활성을 가진, 카바모일 그룹을 갖는 피롤 유도체가 기술되어 있다. 미국 특허 제4,732,910호(Yaginuma et al.)에는 구아니디노 그룹과 벤질 그룹을 갖는 에폭사이드 화합물이 기술되어 있으며, 이는 티올 프로테아제에 대하여 강력한 효소 억제 활성을 갖는다. 미국 특허 제4,333,879호와 제4,382,889호(Tamai et al.)에는 티올 프로테아제 억제 활성, 특히 칼슘-활성화 중성 프로테아제(CANP) 억제 활성을 갖는 화합물로서 EST가 기술되어 있다. 미국 특허 제4,418,075호와 제4,474,800호(Tamai et al.)에는 EST와 유사한 화학적 구조를 갖지만 EST보다 더 많은 이미노 그룹을 갖는 화합물이 기술되어 있다.
상기에 기술된 화합물들은 티올 프로테아제 억제 활성, 특히 CANP(칼파인으로 공지되어 있음)에 대한 억제 활성을 가진다. 그러나, 칼파인 억제제가 사람에 게 약간의 약제학적 효과를 미치기는 하지만, 상기 화합물 중의 어느 것도 암 세포를 직접적으로 치료하는 데 효과적인 것으로 보고된 적은 없다.
그외의 수많은 칼파인 억제제가 각종 용도로 기술되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제5,403,834호(Malfroy-Camine et al.)에는 강력한 항산화 특성 및/또는 유리 라디칼 포착(scavenging) 특성을 가지는 살렌(salen)-전이금속 착물이 기술되어 있다. 이러한 화합물은 심근 및 중추 신경계와 같은 중요한 조직에 대한 허혈성/재관류 손상을 방지하거나 감소시키는 것으로 전해지고 있다. 미국 특허 제5,328,922호(Nixon et al.)에는 고분자량 칼파스타틴(HMWC)과 저분자량 칼파스타틴(LMWC)으로서 알려져 있는, 두 가지의 관련된 내인성 신경(특히 사람의 뇌)의 칼슘-활성화 중성 프로테아제(CANP 또는 칼파인) 억제제가 기술되어 있다. 미국 특허 제5,268,164호(Kozarich et al.)에는 동물에서 혈액뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 아미노산 또는 아미노산 유사체의 중심 서열을 갖는 펩타이드(투과제 A-7)가 기술되어 있다. 미국 특허 제5,424,325호, 제5,422,359호, 제5,416,117호, 제5,395,958호 및 제5,340,909호(Ando et al.)에는 칼파인과 같은 티올 프로테아제의 가역적인 억제제인, 아미노케톤 유도체('325), 알파-아미노케톤 유도체('359) 및 사이클로프로페논 유도체('117, '958 및 '909)가 기술되어 있다. 이러한 화합물들은 조직 분포, 세포막 투과성 및 경구 투여시의 흡수에 있어서 탁월한 특성을 가지는 것으로 전해지고 있다. 암 세포의 치료는 이러한 화합물과 관련하여 언급되지 않는다.
국제공개공보 WO 제94/00095호에는 세포 주기를 동시에 일어나게 하기 위한 각종 칼파인 억제제의 용도가 기술되어 있다. 동기화(同期化; synchronization)가 암에 대한 화학요법의 지속기간을 단축시키고 화합요법제의 활성을 증가시키는 것으로 기술되어 있다. S기에서 모든 세포를 동기화시킬 경우 세포가 화학요법제에 대하여 보다 더 민감해진다는 것이 이론적 근거가 된다. 이러한 참조사항은 암 치료에 칼파인 억제제를 사용할 경우, 암 세포를 주요 화학요법제로 치료하기 전에 칼파인 억제제를 사용해야 한다는 것을 교시한다. 추가로, 멀티드럭 저항성을 갖는 암 세포의 치료법에 대해서는 기술되거나 제안된 바가 없다. 또한, 칼파인 억제제를 단독으로 투여하여 암에서 세포사를 유도시킨다고 기술되거나 제안된 바는 없으며, 즉 암을 주요 화학요법제로 치료하기 전에 칼파인 억제제를 투여하지 않을 경우에 칼파인 억제제가 유익한 효과를 나타낸다고 기술되어 있지 않다.
쇼지-가사이 등[문헌 참조; Shoji-Kasai et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 85: 146-150(1988)]은 화학적으로 정의된 매질에서 배양한 유표피암 A431 세포가 티올 프로테아제-특이 억제제 E-64의 막-투과성 유도체인 E-64-d에 의해 유사분열 중기에 정지될 수 있음을 증명하였다. 이러한 참조사항은 CANP의 억제제가 특정 암의 성장을 지연시키는데 유의적인 효과를 가진다는 사실을 보여준다. 그러나, 암세포가 멀티드럭 저항성을 가질 경우에는 이러한 효과가 나타나지 않으며, 이로 인해 암에서 세포사를 유도시키지 않을 것이다.
항암제의 임상적 유용성을 제한하는 주요한 인자는 종양에서의 약제 저항성의 발달이다. 빈카 알칼로이드(빈블라스틴) 및 안트라사이클린(독소루비신)과 같은 항생제로 치료되는 다수의 종양들은 이러한 약제에 대한 내성이 발달되어 있으며, 또한 그외의 다른 암 약제에 대한 상호-저항성을 나타낸다. 몇가지 경우에 있어서, 환자들은 초기 화학요법에 대해 전혀 반응을 나타내지 않는데, 이는 신생물이 고유의 약제 저항성을 가지기 때문이라고 사료된다. 이러한 약제 저항성의 메카니즘 중의 하나는 mdr(multiple drug resistance) 단백질이라고 불리우는 표면 단백질에 의해 암 약제가 암세포의 외부로 능동적으로 펌핑되기 때문인 것으로 사료된다(문헌 참조; Gottesman et al., J Clinical Oncology 7:409-411, 1989, Goldstein et al., J Nat'l Cancer Inst. 81:116-124, 1989, Fojo et al., Cancer Res. 45:3002-3007, 1985). 이러한 단백질은 암세포 내의 항암제 농도를 효과적으로 낮추어 종양 세포를 생존시키고 성장시킨다. mdr 단백질은 170,000dalton, 에너지-의존성 당단백질임을 특징으로 하며, 약제 저항성을 갖게 되면 암세포에서 고도로 팽창된다. 펌프는 수많은 소수성 약제를 인지하고 유출시키는 것으로 생각되며, 펌프가 체내에서 하는 정상적인 역할은 강력한 독성 화합물을 인지하고 이를 세포로부터 제거시키는 펌프로서의 역할을 하는 것으로 사료된다.
수많은 화학적 화합물이 mdr 펌프의 활성을 차단하여 항암제가 표적 세포에 축적되도록 하는 것으로 보고되었다. 이러한 화합물들은 멀티드럭 펌프 시스템을 위한 기질로서 작용하고 펌프를 압도하여 암 약제의 유출을 방지함으로써 암세포를 사멸시키는 것으로 사료된다. 이러한 mdr-차단 화합물 중에서 가장 광범위하게 연구되어 온 것이 칼슘-채널 차단제인 베라파밀이며, 이는 상이한 임상적 용도, 소위 고혈압의 치료에 사용된다. 예비임상 연구 및 임상 연구 둘다(문헌 참조; Gottesman et al., J Clinical Oncology 7:409-411, 1989)에서, 베라파밀은 mdr 펌프를 억제시키는데 있어서 우수한 활성을 나타내어 암세포의 사멸을 강화시키는 것으로 나타났다. 불행하게도, 펌프를 억제시키는데 필요한 베라파밀의 투여량은 매우 과량이므로 환자에서 독성 심혈관 부작용이 나타나기 때문에, 이러한 약제를 암 환자에게 사용하는 것을 금하고 있다. 그럼에도 불구하고, mdr 펌프를 전환시킬 수 있는 비독성 약제의 개발이 요구되며, 이는 암 환자를 치료하는데 중요한 부가물이 되고 있다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 약제 저항성을 가진 미국 암환자 수는 대략 30%이며, 따라서 안전하고 효과적인 mdr 펌프 차단제의 시판이 중요하다.
미국 암 환자에서의 약제 저항성1
암 환자의 수(U.S) 1,200,000
새로운 환자 수/년 900,000
약제-저항성 암을 앓고 있는 환자의 추정 수 350,000
1은 문헌(참조;Biotechnology News and Journal of the National Cancer Institute)로부터 인용된 숫자임
멀티드럭 저항성 암세포의 치료와 관련하여, 미국 특허 제5,371,081호에 N-치환된 펜옥사진이 기술되어 있다. 이러한 화합물은 앞서 논의한 에폭사이드 화합물 및 칼파인 억제제와는 화학적으로 관련이 없다. 또한, 이들 화합물을 단독으로 투여하는 것은 유리하지 않은 것으로 기술되어 있으며, 이러한 화합물의 독성이 임상적 사용에 장애가 되고 있는 것으로 보인다.
통상적인 화학요법에 있어서, 가장 심각한 문제 중의 하나는 화학요법제의 독성이다. 예를 들면, 화학요법제를 대표하는 빈블라스틴과 아드리아마이신은 탈모, 체중 감소 및 간과 신장 손상과 같은 불가피한 부작용을 가진다. 이들은 독성이 높기 때문에 장기간 동안 매일 복용할 수 없다. 예를 들면, 이러한 화학요법제는 정상적으로는 2개월 또는 3개월 동안 일주일에 몇일간 복용하며, 화학요법제를 복용하지 않고 회복한 지 몇주일 후 이의 복용을 반복한다. 통상의 화학요법제와 효능제는 모두 독성을 가진다.
결론적으로, 선행 기술에서는 자체로 암에서 세포사를 유도할 수 있는 칼파인 억제 화합물 또는 에폭사이드 화합물이 기술되거나 제안되어 있지 않다. 또한, 암세포의 멀티드럭 저항성의 유무에 상관없이 유의적인 부작용이나 독성을 가지지 않으면서 암세포를 사멸시키는 작용을 하는 화합물에 대하여 기술된 바도 없다.
본 발명은 암 치료, 특히 암세포의 멀티드럭 저항성의 유무에 상관없이 암세포를 치료하기 위한 에폭사이드 유도체의 용도, 주요한 화학요법제로서 또는 기타의 화학요법제와 같이 사용할 경우 보조 치료제로서 에폭시 그룹을 가지는 피페라진 유도체의 용도를 개발하였다. 본 발명의 목적은 에폭시 그룹을 가지는 피페라진 유도체를 사용하여, 암에서 세포사를 유의적으로 유도시키는 방법을 제공하는 것으로서, 이는 선행 기술분야에 언급된 바와 같은 암의 전이를 막는 수준을 약제학적으로 능가하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 에폭시 그룹만을 가지는 피페라진 유도체를 주요한 화학요법제로서 사용하여, 암에서 세포사를 유의적으로 유도시키는 방법을 제공하는 것이다. 즉, 피페라진 유도체가 통상의 항암제와는 상이한 메커니즘에 기초하여, 암세포의 멀티드럭 저항성의 유무에 상관없이 피페라진 유도체 자체로 항암제로서 작용한다. 본 발명의 또다른 목적은 에폭시 그룹을 가지는 피페라진 유도체를 기타의 화학요법제와 같이 사용하는 경우, 피페라진 유도체를 보조 치료제로서 사용함으로써 암세포에 있어서의 멀티드럭 저항성을 전환시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 한가지 중요한 양태는 신생 세포를 가지는 환자에게 화학식 1의 화합물과 약제학적으로 허용되는 이의 염을 당해 신생 세포에서 세포사를 유도시키기에 충분한 양으로 투여함을 포함하여, 신생 세포에서 세포사를 유도하는 방법이다.
상기 식에서,
R1은 하이드록실, C1-4알콕실, C1-4알킬카보닐옥시메톡실, 페닐 C1-2알킬아미노 그룹, 2,5-피롤리딘디온-1-(C1-4) 알콕시 또는(여기서, X1은 화학 결합 또는 C1-2알킬렌이고, X2는 수소이거나, X1이 메틸렌인 경우, X1과 함께 5원 환을 형성하는 카복실이고, X3은 수소 또는 C1-2알킬이고, X4는 수소 또는 C1-2알킬이거나, X3과 X4는 함께 5원 환을 형성하고, X2, X3및 X4중의 하나 이상은 수소이다)이고,
R2는 C3-4알킬이고,
R3은 C1-4알킬,,,
,또는(여기서, n은 0 내지 3의 정수이다)이다.
상기 방법에 있어서, 화합물은 바람직하게는 하기의 화학식을 나타낸다.
상기 식에서,
R4는
및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R6은 -(CH2)2CH3-, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
또한, 상기 방법에 있어서, 화합물은 바람직하게는 하기의 화학식을 나타낸다.
상기 식에서,
R4는
및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고,
R6은 -(CH2)2CH3-, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 화합물들은 암세포가 멀티드럭 저항성을 가지는 경우라 하더라도 암에서 세포사를 유도시키는데 효과적이다. 화합물은 바람직하게는 황산염 형태이다.
상기 화합물에는 미국 특허 제4,507,297호와 제4,596,803호(Masaki et al.) 및 일본 특허공개공보 제63-275575(1988)호와 제63-275576(1988)호에 기술되어 있는 피페라진 유도체가 포함된다. 이러한 특허원들이 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다. 그러나, '297과 '803 중의 피페라진 유도체는 단지 심근경색을 억제시키는 용도로만 보고되었다. 상기 특정 그룹의 피페라진 유도체는 신생물에 대해, 특히 멀티드럭 저항성을 가지는 신생물에 대하여 놀랍고도 예기치 못하게 높은 항종양 활성을 나타낸다. 효과적으로 치료될 수 있는 신생물은 사람 유방암 세포, 사람 흑색종 세포, 사람 난소암 세포, 사람 결장암 세포, 사람 췌장암 세포 및 사람 전립선암 세포, 특히 미분화된 암세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 중요한 양태는 주로 앞서 명시된 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염으로 이루어진 조성물을 멀티드럭-저항성 신생 세포를 가지는 환자에게 당해 신생 세포에서 세포사를 유도시키기에 충분한 양으로 투여하는 것으로 주로 구성된, 신생 세포의 치료방법이다. 바람직한 화합물 및 상기의 유효한 신생물이 상기 방법에 채택될 수 있다. 비록 기타의 화학요법제를 전혀 사용하지 않는 경우라 하더라도, 본 발명의 피페라진 유도체 자체가 암세포에 대해 유의적으로 높은 항종양(antineoplastic) 활성을 나타내는 것으로 증명되었다. 이러한 예기치 못한 조사결과는 활성 mdr 유전자에 의해 발현되는 멀티드럭 저항성의 전환뿐만 아니라 고사(apoptosis), 즉 최근에서야 밝혀진 프로그램된 세포사에 근거하는 것으로 보인다(문헌 참조; Desoize B., Anticancer Res. 14:221-2294, 1994). 본 발명의 피페라진 유도체에 의한 암세포의 고사 및 멀티드럭 저항성의 전환을 통하여 암에서 세포사가 유의적으로 유도된다는 사실은 예를 들면, 피페라진 환은 가지지 않으나 에폭시 그룹을 가지는 티올 프로테아제-특이적 억제제 E-64-d에 의해 암의 전이가 방지된다는 보고와는 약제학적으로 매우 다르며 이를 능가한다(문헌 참조; Shoji-Kasai et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:146-150, 1988). 또한, 본 발명의 피페라진 유도체의 주요 화학요법제로서 또는 기타의 화학요법제와 함께 사용되는 경우 보조 치료제로서의 용도는 암을 주요 화학요법제로 치료하기 전에 사용해야 하는 칼파인 억제제의 보도된 용도와는 매우 차이가 있다(국제공개공보 WO제94/00095호).
고사와 관련하여, 칼파인 억제제는 고사 유도제가 아니라 고사 억제제인 것으로 보고되었다(문헌 참조; Thompson, Science Vol. 267, 10 March 1995, pp. 1456-1462). 다른 한편으로, 칼파인 억제제 1과 N-Cbz-Leu-Leu-Tyr 디아조메틸 케톤은 고사 유도제인 것으로 보고되었다(문헌 참조; Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 214, No. 3, 25 September 1995, pp. 1130-1137). 이러한 상반되는 보고들로부터, 고사의 유도 또는 억제를 단순히 칼파인 억제 활성만으로는 설명할 수 없다는 것을 분명히 알 수 있다. 또한, 세포-특이성(예를 들면, 정상 세포에 대한 독성)은 매우 중여한 특성이기는 하지만 덜 고려된다. 본 발명의 특이적인 피페라진 화합물이 신생 세포에서 특히 고사를 예측하지 못한 정도로 높은 수준으로 유도시킬 수 있다는 것은 놀라운 사실이다.
상기 피페라진 유도체는 또한 신생 세포를 가진 환자, 특히 활성 mdr 유전자를 가지는 환자에게 피페라진 유도체를 화학요법제와 동시에 투여함으로써 빈블라스틴 및 아드리아마이신과 같은 화학요법제와 함께 사용하는 것이 효과적이다.
따라서, 본 발명의 또다른 중요한 양태는 앞서 명시된 화학식 1의 화합물과 약제학적으로 허용되는 이의 염을 당해 화학요법의 효능을 증가시키기에 충분한 양으로 화학요법제과 함께 멀티드럭-저항성 신생세포를 가지는 환자에게 투여함을 포함하는, 신생 세포를 치료하는 화학요법의 효능을 높이기 위한 방법이다. 바람직한 화합물과 앞서 언급된 효과적인 신생물이 상기 방법에 채택될 수 있다. 본 발명의 피페라진 유도체는 암세포에 항암제를 고도로 축적시킴으로써 이러한 암세포의 사멸을 증가시켜 항암제에 저항성을 가지는 사람 암세포 및 종양에서 약제 저항성을 전환시키는데 매우 효과적이다.
또한, 본 발명은 또다른 양태, 신생 세포에서 세포사를 유도하는 약제를 제조하는데 있어서의 피페라진 유도체의 용도, 멀디드럭-저항성 신생 세포를 치료하는 화학요법의 효능을 높이기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 피페라진 유도체의 용도를 포함한다. 상기 약제들 자체도 또한 본 발명의 중요한 양태이다.
본 발명은 피페라진 유도체를 사용하여 신생 세포의 사멸을 유도하고 신생 세포를 치료하는 화학요법의 효능을 증가시키는 방법 및 특히, 신생 세포의 프로그램된 세포사(cell death)를 활성화시키고 신생 세포에서의 멀티드럭(multidrug) 저항성을 전환시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약제를 제조하는 데 있어서의 피페라진 유도체의 용도에 관한 것이다.
도 1은 사람 난소암 세포계 SW-626과 AN-3-CA의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 흑색종 세포계 B16F10(마우스 라인)과 SK-Mel-2(사람 라인)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 100,000개 세포와 250,000개 세포의 사람 세포계 SK-Mel-2(흑색종)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 사람 암세포계 MCF-7(유방), HL-60(백혈병) 및 HEP-129(간)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 사람 암세포계 HS-578T(유방), T-47D(유방) 및 DU-145(전립선)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 6은 사람 암세포계 MCF-7(유방), MDA-MB231(유방) 및 LS-174T(결장)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 사람 암세포계 HS-578T(유방)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700, TOP-008, TPO-009, TOP-013 및 TOP-017의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 사람 암세포계 HS-578T(유방), DU-145(전립선), PC-3(전립선) 및 WIDR(결장)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 TOP-008의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 사람 암세포계 SK-Mel-2(흑색종)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적(컴퓨터로 계산된 생존하는 암세포의 수)과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 사람 암세포계 LS-174T(결장)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 11은 사람 암세포계 T-47D(유방)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 12는 사람 암세포계 HS-578T(유방)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 13은 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 DU-145(전립선)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 14는 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 PC-3(전립선)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 15는 사람 암세포계 LN(전립선)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 1,000세포/웰의 사람 암세포계 WIDR(결장)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 NCO-700의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 17은 BDF/1 마우스에서 사람 전립선암의 부신피질 분석에 있어서, 종양 크기의 평균 변화(델타 평균)와 NCO-700의 투여량 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 18은 BDF/1 마우스에서 사람 유방암의 부신피질 분석에 있어서, 종양의 크기 변화와 NCO-700의 투여량 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 19는 BDF/1 마우스에서 사람 결장암의 부신피질 분석에 있어서, 종양의 크기 변화와 NCO-700의 투여량 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 20은 25μM에서 사람 암세포계 DU-145(전립선)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 21은 25μM에서 사람 암세포계 HS-578T(유방)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 22는 25μM에서 사람 암세포계 T-47D(유방)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 23은 25μM에서 사람 암세포계 SK-Mel-2(흑색종)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 24는 25μM에서 사람 암세포계 WIDR의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 25는 25μM에서 사람 암세포계 LS-174T(결장)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 26은 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 HS-578T(유방)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 27은 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 T-47D(유방)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 28은 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 DU-145(전립선)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 29는 500세포/웰과 1,000세포/웰의 사람 암세포계 PC-3(전립선)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 30은 1,000세포/웰과 2,000세포/웰의 사람 암세포계 LS-174T(결장)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 31은 500세포/웰의 사람 암세포계 WIDR(결장)의 암세포 생존 분석에 있어서, 대상 면적과 TOP-008 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 32는 사람 암세포계 HS-766T(췌장)와 ASPC-1(췌장)의 암세포사 분석에 있어서, 25μM의 NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극된 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 33은 사람 암세포계 DU-145(전립선)의 암세포사 분석에 있어서, 방출된 LDH와 NCO-700 및 칼파인 억제제 1의 농도 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 34는 사람 암세포계 HS-578T(1,000세포/웰)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극되는 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 35는 사람 암세포계 HS-578T(1,500세포/웰)의 암세포사 분석에 있어서, NCO-700, TOP-008 및 유사체에 의해 자극되는 LDH 방출 정도를 나타내는 그래프이다.
도 36은 사람 암세포계 HS-578T의 고사 검출 분석에 있어서, TOP-008의 고사 활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 37은 아드리아마이신의 존재 및 부재하에 치료된 누드 마우스에 있어서 종양의 중량 변화와 NCO-700의 투여량 간의 상관성을 나타내는 그래프이다.
도 38은 HS578-T 세포에 미치는 TOP-009(TOP-9로 표시함)의 효과와 TOP-008(TOP-8로 표시함), TOP-018(TOP-18로 표시함) 및 NCO-700(NCO로 표시함)의 효과의 대비를 나타내는 그래프이다.
도 39는 HS578-T 세포에 미치는 TOP-013(TOP-13으로 표시함)의 효과와 TOP-008(TOP-8로 표시함), TOP-018(TOP-18로 표시함) 및 NCO-700(NCO로 표시함)의 효과의 대비를 나타내는 그래프이다.
도 40은 HS578-T 세포에 미치는 TOP-017(TOP-17로 표시함)의 효과와 TOP-008(TOP-8로 표시함), TOP-018(TOP-18로 표시함) 및 NCO-700(NCO로 표시함)의 효과의 대비를 나타내는 그래프이다.
도 41은 HS578-T 세포를 TOP-008(TOP-8로 표시함), TOP-018(TOP-18로 표시함) 및 NCO-700 (NCO로 표시함)로 치료한 경우의 LDH 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 42는 HS578-T 세포에 미치는 TOP-019(TOP-19로 표시함)의 효과와 TOP-008(TOP-8로 표시함)의 효과의 대비를 나타내는 그래프이다.
도 43은 HS578-T 세포에 미치는 TOP-020(TOP-20로 표시함)의 효과와 TOP-008(TOP-8로 표시함)의 효과의 대비를 나타내는 그래프이다.
도 44는 생존 분석에서 TOP-008(TOP-8로 표시함), 009(TOP-9), 013(TOP-13), 017(TOP-17), 019(TOP-19) 및 020(TOP-20)이 접종된 HS578-T 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 45는 생존 분석에서 NCO-700(NCO로 표시함), TOP-008(TOP-8로 표시함) 및 018(TOP-18)이 접종된 HS578-T 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 46은 부신피질 분석을 사용한, BDF/1 마우스에서 TOP-008이 사람 전립선암에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 47은 부신피질 분석을 사용한, BDF/1 마우스에서 TOP-009가 사람 전립선암에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 48은 부신피질 분석을 사용한, BDF/1 마우스에서 TOP-013이 사람 전립선암에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 49는 부신피질 분석을 사용한, BDF/1 마우스에서 TOP-017이 사람 전립선암에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 50은 부신피질 분석을 사용한, BDF/1 마우스에서 TOP-018, 019 및 020이 사람 전립선암에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 51은 TOP-008(TOP으로 표시함), 칼파인 억제제 1(CAL 1로 표시함) 및 N-Lbz-Leu-Leu-Tyr 디아조메틸 케톤(N-CBZ로 표시함)이 HS578T 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
도 52는 NCO-700(NC0.700으로 표시함) 또는 TOP-008(TOP.008로 표시함)로 처리하거나 처리하지 않은(대조군으로 표시함) S-180 사람 육종 세포를 이식한 스위스-웹스터 마우스를 나타내는 사진(여기서, 대조 동물에서 복부 팽윤이 나타나는데, 이는 이러한 동물에서의 종양의 과중한 정도를 나타낸다)이다.
도 53은 NCO-700(NC0.700으로 표시함) 또는 TOP-008(TOP.008로 표시함)로 처리하거나 처리하지 않은(대조군으로 표시함) S-180 사람 육종 세포를 이식한 블랙 마우스, C57BL/6J를 보여주는 사진(여기서, 대조 동물에서 복부 팽윤이 나타나는데, 이는 이러한 동물에서의 종양의 과중한 정도를 나타낸다)이다.
도 54는 아크리딘 오렌지(0.01%)로 염색하여 공초점 레이저 현미경으로 관찰한, 도 52의 대조 스위스-웹스터 마우스로부터의 종양 세포를 보여주는 사진(여기서, 핵 구획에 있는 핵산의 밝은 구형 염색부는 생식 또는 분열 세포를 표시하는 고도로 정렬된 핵 물질을 나타낸다)이다.
도 55는 아크리딘 오렌지(0.01%)로 염색하여 공초점 레이저 현미경으로 관찰한, 도 52의 NCD-700-처리된 스위스-웹스터 마우스로부터의 종양세포를 보여주는 사진(여기서, 이러한 세포 중의 핵 물질은 소엽이고 무질서하며, 이들은 전형적으로 프로그림된 세포사 또는 고사를 겪는다)이다.
도 56은 아크리딘 오렌지(0.01%)로 염색하여 공초점 레이저 현미경으로 관찰한, 도 52의 TOP-008-처리된 스위스-웹스터 마우스로부터의 종양세포를 보여주는 사진(여기서, 이러한 세포 중의 핵 물질은 소엽이고 무질서하며, 이들은 전형적으로 프로그램된 세포사 또는 고사를 겪는다)이다.
도 57은 도 54의 대조 동물에서의 핵산 형광 분포를 나타내는 사진[여기서, 색상가가 높은 종양 세포 중의 고도로 정렬된 DNA는 형광 분포의 상부에 있는 백색 "프로스팅(frosting)"으로 보인다(케이크형 그림)(두 번째 층과 세 번째 층은 각각 분홍색, 황색이다)이다.
도 58은 도 55의 동물로부터 떼어낸 세포의 핵산 형광 분포를 나타내는 사진[여기서, NCO-700에 노출된 동물에서는 고도로 정렬된 DNA가 유의적으로 감소한다(상부에 밝은 "프로스팅"이 있음)(상층과 두 번째 층은 각각 분홍색, 황색이다)]이다.
도 59는 도 56의 동물로부터 떼어낸 세포의 핵산 형광 분포를 나타내는 사진[여기서, TOP-008에 노출된 동물에서는 고도로 정렬된 DNA가 없다(상부에 백색"상"이 없음)(상층과 두 번째 층은 각각 분홍색, 황색이다)]이다.
도 60은 NCO-700과 TOP-008 및 이들의 유도체가 HS578-T 세포에 미치는 효과를 나타내는 그래프(여기서, TOP-101 내지 TOP-115가 NCO-700 및 TOP-008과 공통되는 구조를 가지기는 하지만 세포사 분석에 있어서 효과를 나타내지 않는다)이다.
본 발명가들은 에폭시 그룹을 가지는 본 발명의 피페라진 유도체가 생체내에서 종양 세포를 사멸시키는데 사용될 수 있다는 사실을 발견하였다. 본 발명가들의 연구는 유도체를 약제-저항성 사람 종양을 가진 누드 마우스에게 투여할 경우, 상응하는 체중 감량없이 종양 질량이 60%까지 감소된다는 것을 보여준다. 따라서, 약제는 단독으로 또는 배합요법으로, 멀티드럭 저항성을 나타내는 암세포에 대해 효과적이다.
상기 발명의 배경 부분에서 논의된 바와 같이, 항암제의 임상적 유용성을 제한하는 주요한 인자는 종양에서의 약제 저항성의 발달이다. 최근 연구들은 암세포에서의 약제 저항성의 기초가 되는 두가지 주요 메커니즘에는 (ⅰ) mdr 다유전자 과(科)의 증폭 및 (ⅱ) 프로그램된 세포사(고사)의 억제가 포함된다고 지적하였다. mdr 유전자가 증폭된 세포에서 약제 저항성이 나타나는 메커니즘은 mdr 단백질에 의해 암 약제가 암세포 밖으로 활발하게 펌핑되어 암세포 내에서 항암제의 농도가 효과적으로 낮아지는데 있다. 최근에서야 밝혀진, 암세포에서의 약제 저항성의 두 번째로 주요한 메커니즘은 프로그램된 세포사, 즉 고사의 억제이며, 이는 화학요법뿐만 아니라 방사선 요법에 대한 저항성을 야기시킨다(문헌 참조; Desoize B., Anticancer Res. 14:221-2294, 1994). 고사의 가장 특징적인 억제제는 Bcl-2 유전자의 단백질 생성물이며, 이는 약제와 방사선에 저항성을 가지는 암세포에서 과발현된다. 고사 세포에서는 핵 염색질 농축, 세포 크기의 변화 및 내인성 엔도뉴클리아제 활성과 같은 각종의 빠르고 뚜렷한 분자 이벤트가 일어나며, 이로 인해 올리고솜(oligosomal) DNA 단편이 생성된다. 멀티드럭-저항성 암세포는 고사 억제 활성을 가진다.
본 발명가들은 에폭시 그룹을 가지는 본 발명의 피페라진 유도체가 항암제에 저항성을 가지는 사람 암세포 및 종양에서 약제 저항성을 전환시키는데 매우 효과적임을 발견하였다. 유도체는 예를 들면, 사람 암세포계에서 항암제인 빈블라스틴의 축적을 5배 자극할 수 있다. 이로 인해, 암세포 생존 분석에서 측정된 바와 같이, 이들 암세포의 사멸이 매우 유의적으로 증가된다. 이러한 연구들은 에폭시 그룹을 가지는 피페라진 유도체가 약제-저항성 암세포를 항암제의 사멸효과에 민감하게 하는데 있어서 유의적인 활성을 가진다는 사실을 제시하며, 암환자에게 사용하는데 대한 이의 높은 가능성을 증명해준다.
하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 약제학적 조성물은 암세포에서 고사를 유도시키는데 효과적이다. 따라서, 이러한 조성물은 유리하게도 암환자에 있어서 약제 저항성에 대해 공지된 중요한 메커니즘 둘다를 압도하기에 효과적이다.
에폭시 그룹을 갖는 피페라진 유도체
본 발명에 있어서 에폭시 그룹을 가지는 피페라진 유도체는 하기 화학식 1의 화합물이다.
화학식 1
상기 식에서,
R1은 하이드록실, C1-4알콕실, C1-4알킬카보닐옥시메톡실, 페닐 C1-2알킬아미노 그룹, 2,5-피롤리딘디온-1-(C1-4) 알콕시 또는(여기서, X1은 화학 결합 또는 C1-2알킬렌이고, X2는 수소이거나, X1이 메틸렌인 경우, X1과 함께 5원 환을 형성하는 카복실이고, X3은 수소 또는 C1-2알킬이고, X4는 수소 또는 C1-2알킬이거나, X3과 X4는 함께 5원 환을 형성하고, X2, X3및 X4중의 하나 이상은 수소이다)이고,
R2는 C3-4알킬이고,
R3은 C1-4알킬,,,
,또는(여기서, n은 0 내지 3의 정수이다)이다.
화학식 1의 화합물은 통상적으로 하기의 화학식을 나타낸다.
(여기서, R4는
및로 이루어진 그룹으로부터 선택된다).
또한, 그외의 전형적인 화합물은 하기의 화학식을 나타낸다 .
(여기서, R4는
및로 이루어진 그룹으로부터 선택된다).
화합물의 예로는 통상적으로 하기의 치환체들이 포함된다:
일반적인 화학식
상기 식에서,
R1은
이고,
R2는 A : -(CH2)2CH3
B : -CH2CH(CH3)2
C : -C(CH3)3이고,
R3은
이다.
에폭시 그룹을 갖는 피페라진 유도체에 포함되는 전형적인 화합물은 다음과 같다(괄호 안의 명칭은 하기 실시예에서 사용되는 화합물을 가리키는 명칭이다).
번호 R1R2R3비고
1 A B A 트랜스, 나트륨
2 A B B 트랜스, 나트륨(TOP-201)
3 A B C 트랜스, 나트륨(YOP-202)
4 A B D 트랜스, 나트륨
5 A B D (2R,3R), 칼륨(TOP-207)
6 A B D (2R,3R), 나트륨
7 A B E 트랜스, 나트륨
8 A B F 트랜스, 나트륨
9 A B G 트랜스, 나트륨
10 A B H 트랜스, 나트륨
11 A B H (2R,3R), 나트륨(TOP-203)
12 A B H (2R,3R), 나트륨(TOP-204)
13 B B D 트랜스, 1/2황산염(TOP-205)
14 B B D 트랜스, 나트륨
15 B B D (2R,3R), 1/2황산염(NCO-700)
16 B B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-008)
17 B A D (2R,3R), 1/2황산염
18 B A F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-019)
19 B C D (2R,3R), 1/2황산염
20 B C F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-020)
21 C B D 트랜스, 1/2황산염(TOP-206)
22 D B D (2R,3R), 1/2황산염
23 E B D (2R,3R), 1/2황산염
24 F B D (2R,3R), 1/2황산염
25 G B D (2R,3R), 1/2황산염(TOP-003)
26 H B D (2R,3R), 1/2황산염(TOP-015)
27 H B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-017)
28 I B F (2R,3R), 1/2황산염
29 J B F (2R,3R), 1/2황산염
30 K B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-010)
31 L B D (2R,3R), 1/2황산염(TOP-005)
32 L B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-013)
33 M B D (2R,3R), 1/2황산염
34 N B D (2R,3R), 1/2황산염(TOP-006)
35 O B D (2R,3R), 1/2황산염(TOP-001)
36 O B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-009)
37 P B D (2R,3R), 1/2황산염
38 O B D (2R,3R), 1/2황산염
39 R B F (2R,3R), 1/2황산염
40 S B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-012)
41 T B F (2R,3R), 1/2황산염
42 U B F (2R,3R), 1/2황산염
43 V B D (2R,3R), 1/2황산염
44 B B F (2R,3R), 나트륨(TOP-007)
45 C B F (2R,3R), 1/2황산염(TOP-018)
상기에 있어서, R1및 R2는 바람직하게는 각각 C2H5O-, (CH3)2CHCH2-이다. 또한, 염들 중에서, 황산염이 바람직하다. R1이 C4H9O-인 경우, n-, s-, t- 및 이소-부톡실 중의 어떠한 것이든 사용될 수 있다.
구체적으로 정의된 본 발명의, 에폭시 그룹을 갖는 피페라진 유도체는 에폭사이드 그룹을 통해 작용하지만, E-64도 또한 에폭사이드 그룹을 함유하는 것으로 여겨진다. 앞서 기술된 쇼지-가사이 등의 문헌에는 E-64와 유사한 E-64-d가 관련 효과, 즉 암세포 성장을 지연시키는 효과를 나타내며 본 발명의 예시된 화합물과 부분적으로 유사한 구조를 갖는 것으로 기술되어 있다. 그러나, E-64와 E-64-d는 둘다 피페라진 환을 함유하지 않으며, E-64-d가 암세포의 성장을 지연시키는 것으로 보고된 사실에도 불구하고, E-64는 멀티드럭 저항성을 가지는 암세포에서 특히 효과적이지는 않은 것으로 보고되었다. 에폭시 그룹뿐만 아니라 피페라진 환도 암에서 세포사를 유도시키는데 필수적인 것으로 여겨진다. 상기 문맥에서는 칼파인 억제제 1이 다소 효과적인 것으로 밝혀졌지만, 이의 독성이 장애물이 될 수 있다. 존재할 경우의 피페라진 환과 에폭시 그룹과 관련하여, 본 발명의 피페라진 유도체와 유사한 구조를 갖는 기타의 화합물을 시험하였으나(본원에는 데이터가 생략되어 있음) 유의적인 효과는 관찰되지 않았으며, 이것은 암에서 세포사를 유도하는데 놀랍고도 예기치 못한 효과, 즉 정상 조직에 유의적인 독성을 미치지 않으면서 mdr을 변이시키고 암세포의 사멸을 유도하며 이로써 암의 전이를 약제학적으로 방지하는 효과가 구체적으로 정의된 본 발명의 화합물에서 발견되었다는 것을 의미한다.
피페라진 유도체의 제조
본 발명에 있어서, 화학식 1의 피페라진 유도체는 통상적인 산 할로겐화물 방법 또는 혼합된 무수물 방법에 기초하여 합성될 수 있는데, 이에 대하여 미국 특허 제4,507,297호와 제4,596,803호(문헌 참조; Masaki et al. 둘다 발명의 명칭은 "Piperazine Derivates and A Medicine Containing the Same"이다) 및 일본특허공개공보 제63-275575호(1988)와 제63-275576호(1988)에 상세하게 설명되어 있으며, 이러한 문헌이 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.
예를 들면, 화학식 1에서 R1이 알콕시 그룹인 경우에 있어서, 하기 화학식 2의 류신 유도체 또는 이의 반응성 유도체를 화학식 3의 아미노 유도체와 반응시켜 화학식 4의 화합물을 수득한다. 이어서, 보호 그룹을 통상의 방법으로 제거하고, 이로서 수득된 화학식 5의 류실피페라진 유도체를 화학식 6의 트랜스-에폭시 숙신산 모노에스테르 또는 이의 반응성 유도체와 반응시켜 화학식 7의 화합물을 수득한다.
상기 식에서,
R2는 화학식 1에서와 동일하고,
R5는 3급-부톡시카보닐 그룹과 같은, 아미노산의 아미노 그룹에 대한 보호그룹이다.
상기 식에서, R3은 앞서 정의한 바와 같다.
상기 식에서, R1은 화학식 1에서와 동일하다.
또한, 상기 화학식 6의 트랜스-에폭시 숙신산 모노에스테르 또는 이의 반응성 유도체를 류신과 반응시켜 화학식 8의 에폭시 숙시닐 류신 유도체 또는 이의 반응성 유도체를 수득한다. 그후, 화학식 8의 화합물을 상기 화학식 3의 아민 유도체와 반응시켜 상기 화학식 7의 화합물을 수득한다.
상기 식에서,
R1이 하이드록실 그룹이 아니라는 점을 제외하고는, R1은 화학식 1에서와 동일하다.
추가로, 화학식 1의 화합물은 하기의 축합(탈수)반응에 의해 수득될 수 있다;
화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물의 축합반응, 화학식 5의 화합물과 화학식 6의 화합물의 축합반응 및 화학식 8의 화합물과 화학식 3의 화합물의 축합반응은 통상적인 산 할로겐화물 방법이나 혼합된 무수물 방법에 의해 수행되거나 N-하이드록시 숙신이미드와 N,N'-디사이클로헥실카보드이미드와 같은 공지된 축합제의 존재하에서 -10 내지 +40℃, 바람직하게는 -5 내지 +30℃에서 메틸렌 클로라이드, 에틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 테트라하이드로푸란 등과 같은 유기 용매 속에서 수행된다.
화학식 7의 화합물의 에스테르 잔기는 존재하는 모든 알칼리성 가수분해법에 의해 상응하는 카복실산으로 용이하게 전환될 수 있다.
R1이 하이드록실 그룹인 화합물은 화학식 7의 화합물의 에스테르 그룹을 가수분해시킴으로써 수득될 수 있다.
이렇게 제조된 피페라진 유도체는 임의로 염산, 브롬화수소산, 포름산, 황산, 푸말산, 말레산 또는 타르타르산 뿐만 아니라 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 또는 트리알킬아민, 디벤질아민, N-저급알킬피페리딘, N-벤질-β-펜에틸아민, α-펜에틸아민, 1-(1-나프틸)에틸아민의 약제학적으로 허용되는 염으로 전환될 수 있다. 또한, 겐지 모리 등의 방법(문헌 참조; Kenji Mori et al. Tetrahedron, vol. 36(1), 87-90, 1980) 또는 일본특허공보 제3-18629(1991)에 따라 합성할 수 있는, 화학식 6의 광학활성 트랜스-에폭시 숙신산 모노에스테르(예를 들면, (2S,3S)-에폭시숙신산 모노에스테르 또는 (2R,3R)-에폭시숙신산 모노에스테르)를 사용하여, 광학활성 에폭시 숙신산 그룹을 가지는 본 발명의 화학식 1의 화합물을 앞서 주지된 방법에 의해 수득할 수 있다.
약제학적 용도
본 발명의 추가의 양태에 따라, 활성 성분으로서 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염을 포함하며 암에서 세포사를 유도시키는 약제가 제공된다.
본 발명에 따르는 화학식 1의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염의 암에서 세포사를 유도하기 위한 약제로서의 유용성은 이들이 고사를 유도하고 암세포의 멀티드럭 저항성을 전환시키는데 보다 우수한 효과를 가진다는 사실에 의해 확인되었다.
또한, 마우스 및 래트를 사용한 급성 독성 시험으로부터, 본 발명의 화합물이 사람에게 사용하기에 매우 안전한 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 래트에게 정맥주사한 NCO-700의 LD50은 317㎎/㎏이다. 이러한 화합물의 비독성으로 인하여, 암 종양이 억제될 때까지 유의적인 부작용없이 화합물을 중단하지 않고 장기간 동안 환자에게 매일 투여할 수 있다. 화합물의 비독성, 고사 효과 및 멀티드럭 저항성의 전환은 통상적인 화학요법의 과정을 완전히 변화시킬 것이다.
화학식 1의 화합물과 약제학적으로 허용되는 이의 염의 투여량은 암 진전 단계, 암의 유형, 이의 멀티드럭 저항성의 정도 및 동시에 수행될 수 있는 화학요법의 유형에 따라 좌우된다. 일반적으로, 고사를 유발시키고 암세포의 멀티드럭 저항성을 효과적으로 전환시키기 위해, 이러한 화합물을 약 15㎍/㎏ 내지 약 250㎎/㎏, 바람직하게는 약 250㎍/㎏ 내지 약 100㎎/㎏, 보다 바람직하게는 약 1 내지 50㎎/㎏의 양으로 환자에게 투여할 수 있다. 적합한 표적 암으로는 사람 유방 암세포, 사람 흑색종 세포, 사람 난소암 세포, 사람 결장암 세포, 사람 췌장암 세포, 사람 전립선암 세포가 있으며, 특히 이러한 암세포들이 미분화 상태에 있는 경우를 들 수 있다.
약제로서의 다양한 제형을 위해, 화학식 1의 화합물과 이의 염을 통상적으로 약제학적 담체와 배합하여 약제학적 조성물을 제조할 수 있다. 담체의 예로는 희석제 또는 부형제(예를 들면, 충전제, 결합제, 붕해제 및 윤활제)가 포함된다.
이러한 약제는 주사, 분말, 캡슐, 입제, 정제 또는 앰풀의 투여 형태로 이용가능하다.
정제의 경우에 있어서, 예를 들면 락토오즈, 사카로스, 염화나트륨, 포도당 용액, 전분, 탄산칼슘, 결정성 셀룰로즈 또는 실릭산과 같은 부형제; 물, 에탄올, 프로판올, 글루오즈, 전분 용액, 젤라틴 용액, 카복실메틸 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈 또는 인산칼륨과 같은 결합제; 건조 전분, 알긴산나트륨, 한천 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 스테아르산 모노글리세라이드, 전분 또는 락토오즈와 같은 붕해제; 또는 스테아레이트, 붕산 분말 또는 당해 기술분야에 공지되어 있는 고체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제로부터 선택될 수 있는 담체가 사용된다. 바람직한 경우, 정제를 당이나 젤라틴으로 피복시키거나 필름으로 피복시킬 수 있다.
주사하는 경우에 있어서, 예를 들면 물, 에틸 알콜, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 솔비트 또는 솔비탄 에스테르로부터 선택될 수 있는 희석제가 사용된다. 이러한 예에서, 염화나트륨, 글루코즈 또는 글리세린을 등장액을 형성시키기에 충분한 양으로 가할 수 있다. 또한, 일반적으로 사용되는 용해 보조제, 완충액, 동통 완화제 또는 방부제를 통상적으로 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 피페라진 유도체를 단독으로 투여하거나 화학요법제와 함께 투여하거나 또는 방사선 치료와 같은 기타의 화학요법과 함께 투여할 수 있다. 피페라진 유도체와 빈블라스틴 및 아드리아마이신과 같은 화합요법제를 배합하는 경우, 피페라진 유도체를 이러한 화학요법제와 거의 동시에 투여하여 피페라진 유도체가 화학요법제와 균일하게 약제학적 형태로 형성되게 할 수 있다.
본 발명은 제한하고자 함이 아니라 단지 예시의 목적으로 제공된 몇가지 특정 실시예 및 시험 실시예를 참조로 하여 더욱 상세하게 기술되어질 것이다. 시험하고자 하는 각각의 화합물은 상기에서 설명한 제조방법에 근거하여 합성하였다. 시험 실시예는 화학식 1의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 이의 염이 고사 및 암세포의 멀티드럭 저항성의 전환에 우수한 영향을 나타낸다는 사실을 보여주고자 의도된다.
실시예 1: NCO-700과 이의 관련 유사체의 항종양 활성
NC0-700 비스[에틸(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-008 비스[에틸(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-009 비스[벤질(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-013 비스[페닐(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-017 비스[(2R,3R)-2-벤질카바모일-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란]설페이트
방법
실시예 1에서, 3가지 상이한 분석법을 사용하여 화합물의 항종양 활성을 측정한다.
1. 암세포사 분석 :
세포사는 손상되거나 죽은 세포로부터의 세포내 표지 효소인 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출에 의해 정량적으로 측정한다. 약제를 암세포에 노출시킨지 24시간 후에 세포외액으로 방출된 LDH를 측정하고, 효소 활성은 덱커 등의 방법(문헌 참조; Decker et al. J. Immunology Methods 15:61-99, 1988)으로 측정한다.
2. 세포 생존 분석 :
세포 생존은 배양된 종양 세포에서 분석한다. 500 내지 1000세포/웰로부터, 24웰 배양접시에 평판배양하여 약제에 7일 동안 노출시킨다. 약제를 노출시킨 후, 컴퓨터화된 세포 상(imaging) 기법을 사용하여 각 배지에 잔존하는 가시적인 세포의 수를 확인한다. 데이터로부터, 생존 곡선을 작성하여 ED50(세포가 50% 생존할 수 있는 약제의 농도)을 계산한다.
3. 생체내 모델/부신피질(SRC) 종양 이식 분석 :
사람 종양을 마우스의 부신으로 이식시키는 종양 이식 모델을 수행시킨다. 종양이 성공적으로 마우스의 면역계에서 벗어나도록 하여 6일 동안 성장시킨다. 이러한 분석법의 장점은 화학요법제의 효과를 생체내에서 시험할 수 있다는 것이다. 이러한 모델은 스트라톤 등(문헌 참조; Stratton et al. Gynecoloic Oncology 17:185-188, 1984)에 의해 캘리포니아 대학에서 개달되었다. 사람 종양을 하루에 이식하여 2 내지 6일 동안 약제에 노출시킨다. 이식물의 크기를 제로 시간과 약제 처리기간인 5일이 끝나는 시간에 측정하고, 약제에 노출시키지 않은 대조 동물과 비교하여 이식된 종양의 6일째 크기의 차이를 본원에서 델타 평균으로서 나타낸다.
사용되는 세포계
본 연구에 사용되는 모든 세포계는 아메리칸 타입 조직 배양 실험실(american type tissue culture laboratory)로부터 입수하며 이의 명세서에 따라 배양한다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 세포계는 사람 암선이다. 본 연구에 사용되는 세포계 및 기원된 조직은 다음과 같다 ;
세포계 조직 비고
1. MCF-7 유방 + 에스트로겐 rec
2. MDA-MB231 유방 +에스트로겐 rec
3. T-47D 유방 +에스트로겐 rec
4. HS-578T 유방 -에스트로겐 rec
5. B16F10 흑색종 마우스 라인
6. SK-Mel-2 흑색종
7. SW-626 난소
8. AN-3-CA 난소
9. HL-60 백혈병
10. Hep-129 간
11. LS-174T 결장
12. WIDR 결장
13. DU-145 전립선 -테스토스테론 rec
14. PC-3 전립선 -테스토스테론 rec
15. LN 전립선 +테스토스테론 rec
결과
1) NCO-700과 암세포사 :
예비로 수행한 첫번쩨 분석으로 광범위한 사람 암세포의 세포사 분석에 있어서 NCO-700 단독의 항종양 활성을 측정하였다. 이러한 실험 결과가 도 1 내지 6에 나타나 있는데, 여기에는 LDH 방출률(%)에 대한 NCO-700의 투여량-반응 곡선이 그어져 있으며 LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 이러한 분석으로부터, (ⅰ) 유방암 세포계에 있어서, NCO-700에 반응하는 세포는 에스트로겐 수용체 네거티브이며, 일반적으로 보다 더 미분화되고 따라서 보다 강력한 악성 종양과 관련된 형질이고, (ⅱ) 흑색종 그룹에 있어서, 모든 세포계는 NCO-700에 대한 감수성을 나타내며, (ⅲ) 전립선암 세포계에 있어서, 테스토스테론 수용체 네거티브인 (보다 악성인) 세포계가 NCO-700에 더 잘 반응하고, (ⅳ) 결장암 및 난소암 세포계는 부분적으로 반응하며, (ⅴ) 백혈병 및 간암 세포계는 NCO-700에 반응하지 않다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 이후에 기술되는 실시예(실시예 7)에서 보여지는 바와 같이, NCO-700은 이들이 종양의 고사에 유의적인 효과가 없을 경우라 하더라도 빈블라스틴 및 아드리아마이신과 같은 표준 화학요법제와 함께 사용될 경우 약제-저항성 종양에 대하여 유의적인 항종양 활성을 가진다.
2) NCO-700 유사체와 세포사 :
NCO-700과 관련된 일련의 유사체를 암세포사 분석에서 분석하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포계인 HS-578T로부터의 LDH 방출에 의해 측정한 경우 이러한 수많은 유사체는 유의적인 항종양 활성을 가지고 있었다. NCO-700과 비교하여, 유사체 TOP-008, TOP-009 및 TOP-013을 포함한 3가지 유사체가 보다 높은 효능을 나타내었다. 특히, TOP-008은 NCO-700보다 대략 3배 더 높은 유방암 세포계의 치사율을 가지는 가장 높은 효능을 나타내었다. 이러한 유사체는 화학요법제를 가하지 않고 단독으로 시험해야 한다는 것을 강조하는 바이다.
TOP-008이 시험관내에서 지금까지 시험한 가장 강력한 NCO-700 유사체인 것으로 보여지므로, 다른 암세포계에 대하여 이의 항종양 활성을 시험하였다. 도 8에서, 투여량-반응 곡선은 TOP-008이 유방, 전립선 및 결장 세포계를 사멸시키는데 미치는 효과를 보여준다. 이러한 유사체는 그 자체로 암세포계에 대한 탁월한 활성을 나타낸다.
3) NCO-700과 암세포 생존 분석 :
암세포 생존 분석은 세포를 약제에 장기간(7일) 노출시켜 화합물의 항종양 활성을 평가하기 위한 중요한 부가적인 시험관내 분석법이다. 도 9 내지 16은 NCO-700의 투여량의 증가가 수많은 암세포계의 생존에 미치는 영향을 나타낸다. 생존 연구는 세포사 분석으로 수득된 결과, 이른바, NCO-700은 단독으로 수많은 사람 암(유방암 세포계 T-47D 및 HS-578T, 결장암 세포계 LS-174T 및 WIDR, 전립선암 세포계 DU-145, PC-3 및 LN)에 대하여 유의적인 항종양 활성을 가진다는 결과를 확인시켜 준다. 도면에서, 수직축은 컴퓨터로 계산된 암세포의 생존 수인 대상 면적이다.
4) SRC 분석에서 NCO-700이 생체내에서 성장된 사람 전립선암 세포에 미치는 효과 :
사람 암세포를 마우스의 부신피질에서 성장시킬 수 있으며, 여기서 제한된 시간 동안 암세포는 마우스의 면역계에 감지되지 않게 된다. 이러한 분석법은 약제가 생체내에서 종양 세포의 성장에 미치는 효과를 연구하는 편리한 시스템을 제공한다. 이러한 분석법은 시험관내 분석보다 훨씬 많은 시간이 소비되며 보다 많은 약제를 필요로 하기 때문에, 단일 전립선암 세포계에서 NCO-700의 효과를 시험하였다. 3가지 농도의 NCO-700(10㎎/㎏, 20㎎/㎏ 및 40㎎/㎏)를 사용하여 3가지 동물 그룹(n=총 23)을 대상으로 시험하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, NCO-700은 마우스에서 종양의 크기를 감소시키는데 투여량 반응 효과를 나타내었다. 10㎎/㎏은 효과를 나타내지 않는 반면에, 20㎎/㎏ 및 40㎎/㎏ 수준에서 NCO-700은 유의적인 항종양 효과를 나타내었다. 40㎎/㎏에서, NCO-700은 p값>0.001에서 매우 유의적이었다(도 17 참조). 다시 말하자면, 항종양 효과는 어떠한 추가로 첨가되는 약제를 함유하지 않는 NCO-700 단독에 의한 것으로 보여지며, 이는 신규한 항종양제로서의 NCO-700 및 관련 화합물들의 높은 가능성을 교시한다.
5) SRC 분석에서 NCO-700이 생체내에서 성장된 사람 유방 암세포에 미치는 효과 :
NCO-700이 유방암 세포계에 미치는 효과를 SRC 분석으로 시험하였다. 3가지 농도의 NCO-700(10㎎/㎏, 25㎎/㎏ 및 50㎎/㎏)에 대하여 3가지 동물 그룹(n=총 18)을 대상으로 시험하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, NCO-700은 마우스에서 종양의 크기를 감소시키는데 투여량 반응 효과를 나타내었다. 10㎎/㎏은 효과를 나타내지 않는 반면에, 25㎎/㎏ 및 50㎎/㎏ 수준에서 NCO-700은 유의적인 항종양 효과를 나타내었다. 이러한 연구들은 신규한 항종양제로서의 NCO-700 및 관련 화합물들의 높은 가능성을 확인시켜 준다.
6) SRC 분석에서 NCO-700이 생체내에서 성장된 사람 결장암 세포에 미치는 효과 :
NCO-700이 결장암 세포계에 미치는 효과를 SRC 분석으로 시험하였다. 2가지 농도의 NCO-700(50㎎/㎏ 및 100㎎/㎏)에 대하여 3가지 동물 그룹(n=총 18)을 대상으로 시험하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, NCO-700은 마우스에서 종양의 크기를 감소시키는데 투여량 반응 효과를 나타내었다. 50㎎/㎏은 경미한 효과를 나타내는 반면에, 100㎎/㎏ 수준에서 NCO-700은 유의적인 항종양 효과를 나타내었다. 이러한 연구들은 신규한 항종양제로서의 NCO-700 및 관련 화합물들의 높은 가능성을 확인시켜 준다.
결론
실시예 1은 NCO-700이 단독으로 선택적 종양에 대한 항종양제로서 매우 효과적이라는 사실을 입증한다. NCO-700 유사체인 TOP-008은 항종양 효능 측면에서 NCO-700보다 3배 더 효능이 높다. NCO-700의 항종양 활성의 메커니즘은 고사와 관련된 메커니즘에 근거하는 것으로 보인다.
실시예 2: TOP-008과 그외의 NCO-700 유사체의 항종양 활성
TOP-001 비스[벤질(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-012 비스[3-옥소-2-벤즈옥솔란-1-일(2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-015 비스[(2R,3R)-2-벤질카바모일-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란]설페이트
TOP-003 비스[트리메틸아세톡시메틸 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-005 비스[페닐 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-006 비스[5-인다닐 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-010 비스[2-(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)에틸 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
방법
실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 3가지 상이한 분석을 수행하여 화합물의 항종양 활성을 측정한다.
결과
1) NCO-700 유사체와 암세포사 :
예비로 수행한 첫번째 분석으로 세포사 분석에 있어서 수많은 사람 암세포에 대한 NCO-700 유사체의 항종양 활성을 측정하였다. 이러한 실험 결과가 도 20 내지 25에 나타나 있는데, 여기서 막대 그래프는 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 특정 유사체의 활성을 나타내며, LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 모든 유사체는 25μM의 농도에서 시험하였다. 이러한 분석으로부터, NCO-700 유사체는 이들의 항종양 활성에 있어서 고도로 선택적이며 몇가지 유사체는 NCO-700 자체보다 유의적으로 보다 큰 활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다. 유사체는 이들이 종양의 고사에 유의적인 효과가 없다 하더라도 표준 화학요법제와 함께 사용될 경우 약제-저항성 종양에 대하여 유의적인 항종양 활성을 가질 것이다.
2) TOP-008과 암세포 생존 분석 :
도 26 내지 31은 TOP-008의 투여량의 증가가 수많은 암세포계에 미치는 효과를 나타낸다. 생존 연구는 TOP-008이 고도의 활성 항종양제(고사 약제)이며, 몇가지 경우에 있어서는 NCO-700보다 훨씬 더 활성적이라는 것을 확인시켜 준다. 예를 들면, 사람 결장암 세포계 WIDR에 대한 NCO-700과 TOP-008의 활성을 비교할 경우(실시예 1의 도 16 대 실시예 31), 이러한 특정한 분석에서 TOP-008의 유효량이 훨씬 더 낮은 것으로 확인된다.
실시예 3: NCO-700 및 관련 유사체가 단독으로 췌장암 세포에 미치는 항종양 활성
방법
실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 암세포사 분석을 수행하여 화합물, NCO-700, TOP-001, TOP-003, TOP-005, TOP-006, TOP-008, TOP-009, TOP-010, TOP-012, TOP-013, TOP-015 및 TOP-017의 항종양 활성을 측정한다.
사용되는 세포계
하기의 세포계를 아메리칸 타입 조직 배양 실험실로부터 입수하여 이의 명세서에 따라 배양한다 : 사람 췌장암 세포계 ASPC-1과 HS-766T.
결과
실험 결과가 도 32에 나타나 있으며, 여기서 막대 그래프는 24시간 동안 각각의 유사체에 의해 자극된 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 바와 같은 특정 유사체의 활성을 나타내며, LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 모든 유사체는 25μM의 농도에서 시험하였다. 이러한 분석으로부터, 몇가지 유사체, 특히 TOP-008과 TOP-009는 NCO-700 자체보다 유의적으로 보다 큰 활성을 나타낸다는 사실을 알수 있다.
실시예 4 : 암세포사 분석에 있어서 NCO-700과 칼파인 억제제의 비교
상기 실시예 1을 기초로 하여, 사람 암세포계 DU-145의 암세포사 분석으로 NCO-700과 칼파인 억제제 1(N-아세틸-leu-leu-norleucinal, C20H37N3O4)의 항암 활성을 시험하였다. 도 33은 뵈링거 인겔하임으로부터 입수한 칼파인 억제제 1과 NCO-700에 대한 데이터를 보여준다. 100μM의 농도에서, NCO-700은 거의 10배 더 높은 효능을 나타낸다.
장기간 분석(세포 생존 분석)으로 칼파인 억제제 1을 시험할 경우, 이의 화학 구조로부터 예상되는 바와 같이 칼파인 억제제 1은 세포에 독성을 나타내며, 칼파인 억제제 1의 독성이 세포 생존 분석에서 또는 생체내에서 이러한 화합물을 시험하는 것을 방해한다.
실시예 5 : NCO-700, TOP-008 및 관련 유사체의 항종양 활성
TOP-201 (2RS,3RS)-3-[(S)-3-메틸-1-(4-페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
TOP-202 (2RS,3RS)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(4-메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
TOP-203 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2-피리미디닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
TOP-204 (2RS,3RS)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2-피리미디닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
TOP-205 비스[에틸 (2RS,3RS)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-206 비스[이소부틸 (2RS,3RS)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
TOP-207 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(2,3,4-트리메톡시페닐메틸)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 칼륨
TOP-007 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
상기 실시예 1을 기초로 하여, 사람 암세포계 HS-578T의 암세포사 분석으로 NCO-700, TOP-008 및 유사체 TOP-201, 202, 203, 204, 205, 206, 207 및 007의 항암 활성을 측정하였다. 도 34(1,000세포/웰) 및 도 35(1,500세포/웰)에서, 막대 그래프는 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 바와 같은 특정 유사체의 활성을 나타내며(DMSO, 디메틸 설폭사이드=대조군), LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 모든 유사체는 25μM의 농도에서 시험하였다. 이러한 분석으로부터, 6개월된 TOP-008(OLD)과 새로 합성된 TOP-008(NEW)는 매우 우수한 항종양 활성을 가지며, TOP-206과 NCO-700은 상당히 우수한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 알수 있다. 시험한 기타의 유사체들도 약간의 항암 활성을 보였다. 황산염 형태가 보다 나은 결과를 나타내는 것으로 보인다.
실시예 6 : 고사 감지 분석에 있어서 TOP-008의 항종양 활성
TOP-008의 항종양 활성은 시판되는 키트(제품명: Apoptosis Detection Kit, 제조원: R & D SYSTEMS, 미네소타)를 사용하여 시험하였다(여기서, 칼슘 및 인지질 결합 단백질의 일종인 안넥신 V를 제조업자들이 권장하는 프로토콜에 따라 고사를 감지하는데 사용한다). TOP-008은 사람 유방암 세포계 HS-578T를 사용하여 50μM의 농도에서 시험하였다. 세포를 냉각된 PBS 속에서 2회 세척하고 1×소량의 결합 완충액으로 재현탁시킨다. 플루오레세인-표지된 안넥신 V와 요오드화프로피듐을 세포에 가한다. 세포막의 외엽에서 포스파디닐세신을 발현시키는 세포가 안넥신과 결합하며, 절충된 세포막을 가지는 세포는 요오드화프로피듐이 세포성 DNA에 결합되게 한다. 유량 세포 계산법(flow cytometry)으로 즉시 분석할 경우, 상기로부터 수득된 세포에는 3가지 가능한 그룹이 존재할 수 있다; 두가지 형광색소 중의 하나로 염색되지 않은 살아있는 세포, 형광색소 둘다로 염색되는 괴사 세포 및 안넥신 V-FITC 시약으로만 염색되는, 고사가 진행되는 세포. 단일 레이저 방사 여기 광이 장착된 세포 계산기를 사용하여 488㎚에서 분석을 수행하였다. 안넥신 V-FITC-에서 발생한 시그널이 FITC 시그널 감지기(FL 1)에 감지되었다. 결과가 도 36에 나타나 있으며, 여기서 수직축은 플루오레세인 방출 강도이고, 수평축은 세포수이다. 도 36a, 36b 및 36c는 각각 통상적인 암세포(대조군), TOP-008(50μM)로 처리된 암세포 및 TOP-008(25μM)로 처리된 암세포를 나타낸다. 도 36은 TOP-008이 사람 유방암 세포에서 고사를 유도한다는 것을 명확하게 보여준다.
실시예 7 : 고사-유도된 DNA 분절
전립선 종양 세포계인 PC-3을 25μM TOP-700, 50μM NCO-700 또는 물로 48시간 동안 처리한다. 각 샘플로부터의 DNA를 페놀 추출에 의해 정제하고, 분절을 아가로스 겔에서 분석한다. 그 결과, TOP-008과 NCO-700으로 처리한 샘플은 둘다 유의적인 DNA 분절을 나타내는 반면, 대조군(물로 처리한 군)은 그렇지 않았다. 이러한 분절이 고사의 증후가 되는 것으로 지적되어 왔다(문헌 참조; Javis et al., Cac. Res. 1154: 1707-1714, 1994, Pandey et al., Biochem. Cell Bio. 72: 625-629, 1994).
실시예 8: 그외의 관련 화합물의 항종양 활성
방법
앞서 기술한 바와 같이, 3가지 분석법을 사용하여 NCO-700, TOP-008, TOP-009, TOP-013, TOP-017, TOP-018, TOP-019 및 TOP-020의 항종양 활성을 평가하였다. TOP-018, TOP-019 및 TOP-020의 구조는 다음과 같다;
비스[i-부틸 (2R,3R)-3-[(S)-3-메틸-1-[4-(3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
비스[에틸 (2R,3R)-3-[(S)-1-[4-(트랜스-3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]부틸카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
비스[에틸(2R,3R)-3-[(S)-2,2-디메틸-1-[4-(트랜스-3-페닐-2-프로페닐)피페라진-1-일카보닐]프로필카바모일]옥시란-2-카복실레이트]설페이트
암세포사 분석 :
세포사는 손상되거나 죽은 HS578-T 사람 유방암 세포로부터의 세포내 표지 효소인 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출에 의해 정량적으로 측정한다. 약제를 암세포에 노출시킨지 24시간 후에 세포외액으로 방출된 LDH를 측정하고, 효소 활성은 덱커 등의 방법(문헌 참조; Decker et al. J. Immunology Methods 15:61-99, 1988)으로 측정한다.
세포 생존 분석 :
세포 생존은 배양된 HS578-T 사람 유방암 세포에서 분석한다. 1000세포/웰을 24웰 배양접시에서 평판배양하여 약제에 7일 동안 노출시킨다. 약제를 노출시킨 후, 컴퓨터화된 세포 상 기법을 사용하여 각 배지에 잔존하는 가시적인 세포의 수를 확인한다. 데이터로부터 생존 곡선을 작성한다.
생체내 모델/부신피질(SRC) 종양 이식 분석(ip) :
사람 종양을 마우스의 부신으로 이식시키는 종양 이식 모델을 수행한다. 종양을 성공적으로 마우스의 면역계로부터 벗어나도록 하여 6일간 성장시킨다. 이러한 분석법의 장점은 화학요법제의 효과를 생체내에서 시험할 수 있다는 것이다. 이러한 모델은 스트라톤 등(문헌 참조; Stratton et al. Gynecoloic Oncology 17:185-188, 1984)에 의해 캘리포니아 대학에서 개발되었다. 사람 전립선 종양을 하루에 이식하여 2 내지 6일 동안 약제에 노출시킨다. 이식물의 크기를 제로 시간과 약제 처리기간인 5일이 끝나는 시간에 측정하고, 약제에 노출시키지 않은 대조 동물과 비교하여 이식된 전립선 종양의 6일째 크기 차이를 본원에서 델타 평균으로서 나타낸다.
결과
암세포사 :
예비로 수행한 첫번째 분석으로 암세포의 세포사 분석에 있어서 HS578-T 사람 유방암 세포에 대한 NCO-700 유사체의 항종양 활성을 측정하였다. 이러한 실험 결과가 도 38 내지 43에 나타나 있다. 각각의 분석에 있어서, 유사체를 상이한 5가지 농도(1, 5, 10, 25 및 50uM)에서 시험하였다. 또한, 분석 중의 몇가지에 25μM 투여량의 TOP-008, TOP-018 및 NCO-700을 포함시켜, 신규한 유사체의 효능을 상기 시험된 화합물과 직접 비교하였다. 도 38 내지 42에서, 막대 그래프는 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 특정 유사체의 활성을 나타내며, LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 이러한 분석으로부터, TOP-017과 TOP-020을 제외한 신규한 유사체가 NCO-017에 비해 당해 분석에서 보다 효능이 높다는 것을 알 수 있다.
암세포 생존 분석 : 암세포 생존 분석은 세포를 약제에 장기간(7일) 노출시켜 화합물의 항종양 활성을 평가하기 위한 중요한 부가적인 시험관내 분석법이다. 도 44와 45는 1, 5, 10, 25 및 50μM 농도의 NCO-700 유사체가 사람 유방암 세포인 HS578-T의 생존에 미치는 효과를 나타낸다. 생존 연구는 이러한 유사체들이 높은 효능을 가진다는 것을 확인시켜 준다.
생체내에서 성장된 사람 전립선 종양 :
앞서 논의한 바와 같이, 사람 암세포는 마우스의 부신피질에서 성장할 수 있으며, 여기서 제한된 시간동안 마우스의 면역계의 탐지를 피하게 된다. 이러한 분석법은 약제가 생체내 종양 세포의 성장에 미치는 효과를 연구하는데 편리한 시스템을 제공해준다. 본 발명가들은 두가지 상이한 농도(체중 ㎏당 약제 25 및 50㎎)에서 NCO-700이 사람 전립선 종양에 미치는 효과를 시험하였다. 실험군은 각각 6마리로 구성되며, 50㎎/㎏에서 활성을 나타낼 경우, 보다 적은 양(25㎎/㎏)을 투여한다. 도 46 내지 50에 나타낸 바와 같이, TOP-008, TOP-009 및 TOP-017은 투여량 25 및 50㎎/㎏ 둘다에서 종양을 위축시키는데 통계적으로 유의한 효과를 가지는 반면에, TOP-013은 시험된 최고 투여량에서도 단지 경미한 효과만을 나타내었다. TOP-018, TOP-019 및 TOP-020은 당해 분석에서 활성을 나타내지 않았다. TOP-018이 시험관내에서는 강력한 효능을 나타내었기 때문에, TOP-018이 생체내에서 활성이 부족하다는 사실은 특히 놀라우며, 이는 이러한 화합물에 대한 생체내 이용효율상의 문제를 반영할 수 있다.
실시예 9 : 공초점 레이저 현미경법에 의해 감지되는, 암세포에서 NCO-700과 TOP-008에 의한 고사의 유도
실시예 9는 본 발명의 화합물이 생체내 암세포에서 고사를 유발시킨다는 것을 확인시켜 준다. 암 분석은 세포 배양기에서 고밀도로 성장된 사람 육종 암세포를 사용하여 수행하며, 그후 이를 마우스의 복강에 직접 주사하였다. 마우스의 복부에서 종양 세포를 성장시킨 후, 동물을 NCO-700 또는 TOP-008로 처리한다. 그후 처리된 암세포를 공초점 레이저 현미경으로 관찰한다. 이러한 방법으로 암세포의 핵 중의 핵 물질의 정렬된 구조를 관찰할 수 있으며, 이는 세포에서의 고사를 직접적으로 가시화시켜준다.
방법 :
NCO-700과 TOP-008로 처리된 암세포에서 공초점 레이저 현미경법에 의한 고사의 측정
세포 핵 내의 핵산이 분해하고 무질서하게 되는 것이 고사의 특성이다. 이러한 현상을 동일한 반응계 내에서 암세포 중의 핵산(DNA 및 RNA)을 라벨링한 다음, 핵산을 가시화시켜 공초점 스캐닝 레이저 현미경으로 관찰하였다(문헌 참조; Smith GJ et al. Electron Microsc Tech 18:38-49, 1991; Kressel M 및 Groscurth PI, Cell Tissue Res. 278:549-561, 1994).
20 내지 22g의 스위스-웹스터 마우스의 복강에 1×107S-180 사람 육종 암세포를 주사하여 배양시킨다. 암세포가 동물 내에 자리를 굳히도록 48시간 후, NCO-700 또는 TOP-008을 동물 1마리당 2㎎의 일일 단일 투여량으로 동물에게 복부내로 투여한다. 약제를 8일 동안 처리하고, 8일째에 암세포를 동물로부터 단리하여 상기 인용된 두가지 참조문헌에 상세하게 기술되어 있는 바와 같이 공초점 레이저 현미경으로 스캐닝한다. 또한, 동종의 블랙 마우스, c578BL/6J(Jackson labs)를 사용하여 추가적인 시험을 수행한다.
암세포를 공초점 현미경으로 관찰하기 전에 이를 아크리딘 오렌지로 염색한다. 아크리딘 오렌지는 핵산을 특이적으로 염색시키는 염료이며 핵산과 결합하게 되면 형광을 나타낸다. 개별적인 암세포에 대한 형광 분포를 작성할 수 있으며, 각각의 도면에 나타낸 색상값(color value)은 DNA의 강도를 반영하는 것으로, 가장 높은 값(백색)은 건강한 세포의 전형으로서 치밀하고 고도로 정렬된 핵산을 나타내고, 낮은 색상값은 고사의 특징으로서 덜 치밀하고 무질서한 DNA를 나타내며, 여기서 DNA 분절이 일어난다(문헌 참조; Kressel M 및 Groscurth PI, Cell Tissue Res. 278:549-561, 1994). 메리디언 기구(Olemos, MI) 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 현미경법을 수행한다.
암세포사 분석 :
TOP-008, 칼파인 억제제 1 및 N-Cbz-Leu-Leu-Tyr 디아조메틸 케톤을 포함하여, 선택된 화합물을 세포사 분석으로 측정한다(문헌 참조; Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 214, No. 3, 1995. 9. 25, pp. 1130-1137). 손상되거나 죽은 HS578-T 사람 유방암 세포로부터의 세포내 표지 효소인 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출에 의해 세포사를 정량적으로 측정한다. 암세포에 약제를 노출시킨지 24시간 후에 세포외액으로 방출된 LDH를 측정하며, 효소활성은 덱커 등의 방법(문헌 참조; J Immunology Methods 15:61-99, 1988)에 의해 결정한다.
결과
암세포사 분석:
사람 유방암 세포 HS578-T에 대한 TOP-008(TOP), 칼파인 억제제 1(CAL.1) 및 N-Cbz-Leu-Leu-Tyr 디아조메틸 케톤(N-CBZ)의 항종양 활성을 세포사 분석에서 측정하였다. 실험 결과가 도 51에 나타나 있다. 이러한 분석에서, 화합물을 μM 양으로 1에 열거되어 있는 농도에서 시험하였다. 도 51에서, 막대 그래프는 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 특정 유사체의 활성을 나타내며, LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 이러한 분석으로부터, 시험한 모든 화합물이 항종양 활성을 가지며, TOP-008이 가장 효능이 높다는 것을 알 수 있다. 시험한 최고 농도(50μM)에서 N-CBZ가 배양기 안에 침전하였다. N-CBZ가 어느 수준까지 암세포를 사멸시킨다 하더라도, N-CBZ가 암세포를 사멸시키는 메커니즘은 세포에 대한 독성을 반영할 수 있다.
NCO-700과 TOP-008로 처리한 암세포에서 공초점 레이저 현미경법에 의한 고사의 측정
복강에 사람 육종을 가진 마우스를 TOP-008 또는 NCO-700(2㎎/day; 복강내 주사)으로 8일 동안 처리한 결과, 동물에서 종양 부담이 유의적으로 감소하였다. 동물의 대표적인 사진이 도 52와 53에 제시되어 있다. 도 52는 S-180 사람 육종 세포를 이식시킨 스위스-웹스터 마우스를 나타낸다. 대조 동물에서 복부 팽윤을 쉽게 확인할 수 있는데, 이는 이러한 동물에서는 종양 부담이 크다는 것을 나타낸다. NCO-700 또는 TOP-008로 처리한 동물은 종양 부담이 훨씬 감소한다. 도 53에서도 유사한 결과를 볼 수 있는데, 여기서 블랙 마우스, C57BL/6J를 2가지 약제를 동량으로 처리하였다. 이러한 마우스 표본에서, NCO-700이 복부에서 종양 부담을 낮추는데 있어서 보다 효능이 높은 것으로 나타났다.
8일 마지막에, 동물로부터 복막액을 제거하고 유체 중의 종양 세포를 아크리딘 오렌지(0.01%)로 염색하여 공초점 레이저 현미경으로 관찰하였다. 도 54 내지 56은 S-180 사람 육종 세포를 이식시킨 대조군 및 약제-처리한 스위스-웹스터 마우스로부터 수득한 단일 암세포를 통한 대표적인 체내 방사능 분포 사진(scan)을 나타낸다. 도 54는 대조군으로부터의 전형적인 세포이며, 핵 구획 중의 핵산의 밝은 구형 염색물은 고도로 정렬된 핵 물질을 나타내며 이는 건강한 분열 세포의 지표이다. 반대로, NCO-700(도 55) 및 TOP-008(도 56) 처리된 동물로부터 떼어낸 전형적인 암세포를 보여주는 도 55와 56에 나타낸 바와 같이, 이들 세포 중의 핵 물질은 소엽이고 무질서하며 프로그램된 세포사 또는 고사가 진행되고 있는 세포의 전형이다.
공초점 레이저 현미경법은 또한 건강한 세포의 특징을 나타내는, 고도로 정렬된 핵 물질의 상대적인 양을 추정하여 이를 고사를 특징으로 하는 세포 중의 덜 정돈된 핵 물질의 양과 비교할 수 있다. 도 57 내지 59는 도 54 내지 56과 동일한 동물로부터 떼어낸 세포 중의 핵산 형광 분포를 나타낸다. 대조 동물(도 57)에 있어서, 이러한 동물로부터 떼어낸 종양 세포에는 고도로 정렬된 핵산(DNA 및 RNA)이 비교적 높은 비율(%)로 존재한다. 도 57에서, 고도로 정렬된 DNA는 색상가가 높고 형광 분포의 첨단에 백색 "프로스팅"(케이크형 모양)으로서 보여질 수 있다. 반대로, 고도로 정렬된 DNA는 NCO-700에 노출시킨 동물(도 58)에서 유의적으로 감소되며 TOP-008에 노출시킨 동물(도 59)에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과들은 고사가 약제-처리한 동물로부터 단리된 암세포에서 일어난다는 사실을 나타내며, 고사를 NCO-700과 TOP-008의 항암효과의 가능한 메커니즘으로써 확립시켜준다.
실시예 10(비교 실시예) : 관련 화합물들의 항종양 활성
방법
시험된 화합물의 구조 :
앞서 기술한 바와 동일한 방법으로, 유방암 세포계 HS578T(가장 민감한 세포계 중의 하나)를 사용한 암세포사 분석을 이용하여 TOP-101 내지 TOP-115(WO 제9630378호, WO 제9630354호)의 항종양 활성을 NCO-700 및 TOP-008과 비교하여 평가하였다. 이들 화합물의 구조는 다음과 같다 :
(2R,3R)-[3(RS)-3-메틸-1-페닐부틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일옥시란-2-카복실산 나트륨
(2S,3S)-3-[4-메틸-1-(3-메틸부틸)펜틸카바모일]옥시란-2-카복실산 나트륨
에틸 (2S,3S)-3-디페닐카바모일옥시란-2-카복실레이트
(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일-2-에틸카바모일옥시란
[4-[(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일옥시란-2-카보닐]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 이나트륨 염
[4-[N-(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일옥시란-2-카보닐]글리실]옥시피페리딜]메틸렌비스포스폰산 이나트륨 염
[4-[(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일옥시란-2-카보닐]-옥시피페리딜]메틸렌비스포스폰산 이나트륨 염
[4-N-[(2S,3S)-3-디페닐메틸카바모일옥시란-2-카보닐]글리실]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 이나트륨 염
[4-N-[(2S,3S)-3-에톡시카보닐옥시란-2-카보닐]-L-류실]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 이나트륨 염
[4-[N-(2S,3S)-3-카복시옥시란-2-카보닐]-L-류실]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 삼나트륨 염
[4-[N-(2S,3S)-3-에톡시카보닐옥시란-2-카보닐]-L-류실-L-류실]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 삼나트륨 염
[3-[4-[N-(2S,3S)-3-카복시옥시란-2-카보닐]-L-류실]-1-피페라지닐]-3-옥소]프로판-1,1-비스포스폰산 삼나트륨 염
[4-[N-(2S,3S)-3-카복시옥시란-2-카보닐]-L-류실-L-류실]-1-피페라지닐]메틸렌비스포스폰산 삼나트륨 염
[4-[(2S,3S)-2-[(S)-3-메틸-1-(3-메틸부틸카바모일)부틸-카바모일]옥시란-2-카보닐]옥시피페리딜]메틸렌-비스포스폰산 이나트륨 염
결과
유방암 세포를 사용한 세포사 분석에서 NCO-700 유사체의 항종양 활성이 도 60에 나타나 있으며, 여기서 막대 그래프는 LDH 방출률(%)에 의해 측정된 특정 유사체의 활성을 나타내며, LDH의 방출값이 높을수록 항종양 활성이 크다는 것을 나타낸다. 모든 유사체는 25μM 농도에서 측정하었다. 이러한 분석으로부터, NCO-700과 유사체 TOP-008은 앞서 보고된 바와 같이 우수한 항종양 활성을 가진다는 것을 알 수 있다. 시험한 그외의 유사체 중에서, 단지 TOP-014만이 항암 효과를 나타냈으나 비교적 약했다.
실시예 11 : 사람 신생물에 있어서 NCO-700의 멀티드럭 저항성-전환 효과
상기 실시예들은 본 발명의 피페라진 유도체의 새로운 양태, 고사, 즉 유도체가 단독으로 항종양제로서 매우 효과적이라는 새로운 양태를 수립하였다. 하기의 실시예는 화합물들이 특정 암선을 고사시키는데 유의적인 효과가 없는 경우라고 하더라고 피페라진 유도체를 비블라스틴 및 아드리아마이신과 같은 표준 화학요법제와 함께 사용할 경우 약제-저항성 종양에 유의적인 항종양 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 예이다.
방법 및 결과
본 실시예에서는 4가지 상이한 분석을 사용하여, 암세포 또는 종양의 약제-저항성 표현형을 차단하거나 전환시킬 수 있는 NCO-700의 능력을 평가하였다. 이러한 분석에는 다음의 분석법이 포함된다.
1. 약제 축적 분석 : 약제-저항성이면서 약제-민감성인 배양된 암세포에서 NCO-700이 항암제인 방사능 (3H)-빈블라스틴의 흡수에 미치는 효과를 측정하였다(참조 3).
2. 세포 생존 분석 : 빈블라스틴에 의해 암세포사를 증가시키는 NCO-700의 효과를 측정하였다.
3. 종양형성의 생체내 모델 : 약제-저항성 신생물에서 종양의 질량을 감소시킬 수 있는 아드리아마이신의 능력에 미치는 NCO-700의 효과를 측정하였다.
사용되는 세포계
전자의 두가지 시험관내 분석(약제 축적 분석 및 세포 생존 분석)에서, 항암제에 매우 저항적인 사람 인두 암종 세포계(KB-V-1)를 사용하였다. 이러한 세포계는 국제 암기구의 이라 파스탄과 마이클 콧티스만에 의해 약제-저항성 세포의 콜치신에서 단계적 선택에 의해 개발되었다. 저항 세포계를 유도시키는 대조 암세포계(KB-3)는 항암제에 민감하다. 저항성 KB-V-1 세포계는 민감성 KB-3 선보다 빈블라스틴에 대한 저항성이 대략 275배 더 높으며, 이러한 저항성을 유발시키는 mdr 유전자가 매우 증폭되어 있다.
종양 형성의 생체내 모델을 위해, 누드 마우스에서 고형 종양으로서 성장할 수 있는, 파스탄고 곳티스만에 의해 개발된 암선을 사용하였다. 이러한 세포계가 KB-CH 8-5이며 비가역적인 저항성 세포계이다. 이러한 암세포계는 모두 닥터 곳티스만에 의해 충분히 제공되었다.
하기 표 2에는 약제 축적 분석에서 수득된 결과들이 요약되어 있다. [3H]-빈블라스틴 축적은 닥터 곳티스만과 파스탄 등의 실험실에서 개발된 방법(문헌 참조; Fojo et al., Cancer Res. 45:3002-3007, 1985)으로 측정하였다. 이러한 방법에서, KB-V-1과 KB-3 세포를 24-웰 코스타 플레이트 속에서 3×105세포/웰의 밀도로 10% 태아 우형 혈청에서 평판배양한다. 이튿날, 성장 배지를 20μM NCO-700을 함유하거나 함유하지 않는(대조 세포) 둘베코 개질된 이글 배지로 대체한다. 10분 후, 배지를 제거하고 20μM NCO-700의 존재 또는 부재하에서 0.1μCi, (13pmol) [3H] 빈블라스틴을 함유하는 분석 배지(0.5㎖)로 대체한다. 30분 후, 배지를 제거하고, 플레이트를 빙냉 인산-완충 염수로 3회 세척하고 세포를 트립신으로 분리시켜 섬휘 계수관으로 방사능을 측정하였다.
NCO-700이 저항성 사람 암세포에서 빈블라스틴의 축적을 자극한다
약제 축적(빈블라스틴 pmol/단백질 ㎎)
KB-V-1(저항성 세포) KB-3(민감성 세포)
대조(빈블라스틴 단독) 0.29±0.03 2.99±0.12
20μM NCO-700 + 빈블라스틴 1.56±0.03 3.17±0.09
표 2에 나타낸 바와 같이, 항암제인 빈블라스틴의 축적은 mdr 펌프의 작용으로 인해 약제-저항성 세포계인 KB-V-1에서 심하게 제한되었다. 그러나, 이러한 세포계를 20μM NCO-700에 노출시킬 경우, 암세포에 잔존하는 빈블라스틴의 양이 5배 증가하였다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 이는 약제-저항성 세포를 더욱 사멸시킨다.
NCO-700이 빈블라스틴에 의한 저항성 암세포의 사멸을 증가시킨다
세포계 세포를 50%까지 사멸시키는 빈블라스틴의 양(ng)
KB-3(민감성)+25μM NCO-700 3.21.6
KB-V-1(저항성)+25μM NCO-700 792148
상기에 나타낸 세포 생존 실험은 32mm 웰 플라스틱 접시 속에서 KB-3(민감성) 세포와 KB-V-1(저항성) 세포를 300 내지 500세포/웰의 세포 밀도로 평판배양하으로써 수행하였다. 초기 세포를 평판배양한지 16시간 후, 빈블라스틴과 NCO-700을 가한다. 37℃에서 10일간 배양한 후, 세포 콜로니를 염색하여 수를 센다.
표 3에 나타낸 바와 같이, NCO-700은 KB-V-1 저항성 암세포의 생존에 극적인 효과를 나타내었다. 저항성 세포를 30μM NCO-700와 같이 배양하는 경우, 종양 세포를 50%까지 사멸하는데 필요한 빈블라스틴의 양은 825ng에서 160ng으로 감소하였다. 이러한 효과는 mdr 펌프의 억제 또는 차단을 반영하며, 이로 인해 세포 중의 항암제의 농도가 증가하게 된다. 흥미롭게도, 당해 실시예에서는 또한 민감성 KB-3 세포의 사멸도 약간 증가하였다.
후속의 일련의 실시예에서는 종양형성 생체내 모델을 사용하여 NCO-700이 종양 질량에 미치는 효과를 시험하였다. 이러한 실험은 동물 중의 생체내 고형 종양으로부터의 세포로서 사용하기 위한 KB-CH-8/5 세포계(닥터 곳티스만과 파스탄에 의해 개발된 세포계)를 사용하여 수행하였다. 체중이 25 내지 30g 정도이고 5 내지 6주령된 수컷 누드 마우스에 2.5×106KB-CH-8/5 세포를 피하주사하고, 0 내지 0.80㎎/㎏/d 범위의 양으로 NCO-700를 처리하거나 처리하지 않고서 0.6㎎/㎏ 아드리아마이신으로 14일 동안 처리한다. 도 37에 제시된 데이터는 웰-캡슐화되고 절개된 종양을 칭량하고 마우스의 체중을 기록함으로써 수득된다. 도 37에서 명확하게 보여지는 바와 같이, NCO-700를 가함으로써 아드리아마이신의 효과가 유의적으로 증가되었으며, 특히 40㎎/㎏ 이상의 양일 때 그러하였다.
결론
NCO-700이 사람 암종 세포계에서 항암제인 빈블라스틴의 축적을 5배 자극하였다. 이는 이러한 암세포의 사멸을 매우 유의적으로 증가시켰다. NCO-700이 자체로는 유의적인 효과가 없다 하더라도, NCO-700을 아드리아마이신과 함께 저항성 사람 종양(KB-CH 8-5)을 갖는 누드 마우스에 투여할 경우, 상응하는 체중 감소없이 종양의 질량이 60%까지 감소하였다.
상기 실시예는 피페라진 유도체가 특정 암선의 고사에 유의적인 효과가 없는 경우라 하더라도 이러한 화합물을 빈블라스틴 및 아드리아마이신과 같은 표준 화학요법제와 함께 사용할 경우, 약제-저항성 종양에 대해 유의적인 항종양 활성을 나타낸다는 것을 보여주는 예이다. 따라서, 임상적 시도로서 본 발명의 피페라진 유도체 화합물은 암을 앓고 있는 환자에게 (멀티드럭 저항성의 존재에 관계없이) 주요한 화학요법제로서 투여되며, 화합물이 자체로는 효과가 없는 것으로 보이는 경우에는 기타의 화학요법(예를 들면, 기타의 화학요법제를 본 발명의 피페라진 유도체와 거의 동시에 투여함)을 보조적인 치료법으로서 추가로 수행한다.
또한, 본 발명의 약제는 피부 각질 증식증, 건선, 유방 및 전립선의 양성 과형성, 호지킨병과 기타의 림프종, 백혈병 및 결장 폴립증을 포함한 증식성 세포 또는 암전구성 세포를 치료하는 데 이용할 수 있다.
당해 기술분야의 숙련가들은 본 발명의 의도를 벗어남이 없이 수많은 변화와 개질이 가해질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 형태는 단지 예시적이 것이지 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니라는 것을 명확히 이해하여야 한다.

Claims (15)

  1. 증식성 세포, 암전구성 세포 또는 신생 세포에서 세포 사멸을 유도하는 약제를 제조하기 위한, 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1은 하이드록실, C1-4알콕실, C1-4알킬카보닐옥시메톡실, 페닐 C1-2알킬아미노 그룹, 2,5-피롤리딘디온-1-(C1-4) 알콕시 또는(여기서, X1은 화학 결합 또는 C1-2알킬렌이고, X2는 수소이거나, X1이 메틸렌인 경우, X1과 함께 5원 환을 형성하는 카복실이고, X3은 수소 또는 C1-2알킬이고, X4는 수소 또는 C1-2알킬이거나, X3과 X4는 함께 5원 환을 형성하고, X2, X3및 X4중의 하나 이상은 수소이다)이고,
    R2는 C3-4알킬이고,
    R3은 C1-4알킬,,,
    ,또는(여기서, n은 0 내지 3의 정수이다)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    화학식의 화합물(여기서, R4는
    및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, R6은 -(CH2)2CH3, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 용도.
  3. 제1항에 있어서,
    화학식의 화합물(여기서, R4는
    및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, R6은 -(CH2)2CH3, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 용도.
  4. 제1항에 있어서, 화합물이 황산염 형태인 용도.
  5. 제1항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 사람 유방암 세포, 사람 흑색종 세포, 사람 난소암 세포, 사람 결장암 세포, 사람 췌장암 세포 및 사람 전립선암 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  6. 제1항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 미분화된 암세포인 용도.
  7. 제1항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 활성 mdr 유전자를 가지는 용도.
  8. 멀티드럭-저항성 신생 세포를 치료하는 화학요법의 효능을 높이는 약제를 제조하기 위한, 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 용도.
    화학식 1
    상기 식에서,
    R1은 하이드록실, C1-4알콕실, C1-4알킬카보닐옥시메톡실, 페닐 C1-2알킬아미노 그룹, 2,5-피롤리딘디온-1-(C1-4) 알콕시 또는(여기서, X1은 화학 결합 또는 C1-2알킬렌이고, X2는 수소이거나, X1이 메틸렌인 경우, X1과 함께 5원 환을 형성하는 카복실이고, X3은 수소 또는 C1-2알킬이고, X4는 수소 또는 C1-2알킬이거나, X3과 X4는 함께 5원 환을 형성하고, X2, X3및 X4중의 하나 이상은 수소이다)이고,
    R2는 C3-4알킬이고,
    R3은 C1-4알킬,,,
    ,또는(여기서, n은 0 내지 3의 정수이다)이다.
  9. 제8항에 있어서, 화학요법이 적어도 빈블라스틴 또는 아드리아마이신의 투여인 용도.
  10. 제8항에 있어서,
    화학식의 화합물(여기서, R4는
    및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, R6은 -(CH2)2CH3, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 용도.
  11. 제8항에 있어서,
    화학식의 화합물(여기서, R4는
    및로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, R6은 -(CH2)2CH3, -CH2CH(CH3)2및 -C(CH3)3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 용도.
  12. 제8항에 있어서, 화합물이 황산염 형태인 용도.
  13. 제8항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 사람 유방암 세포, 사람 흑색종 세포, 사람 난소암 세포, 사람 결장암 세포, 사람 췌장암 세포 및 사람 전립선암 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 용도.
  14. 제8항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 미분화된 암세포인 용도.
  15. 제8항에 있어서, 치료되는 신생 세포가 활성 mdr 유전자를 가지는 용도.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA000438B1 (ru) * 1995-03-31 1999-08-26 Ниппон Кемифар Ко., Лтд. Производные эпоксиянтарной кислоты
US5733911A (en) * 1996-01-26 1998-03-31 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method for inducing death of neoplastic cells using piperazne derivatives
AU8997898A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Nippon Chemiphar Co. Ltd. Epoxysuccinamide derivatives
EP1094063A1 (en) * 1999-10-18 2001-04-25 Applied Research Systems ARS Holding N.V. 9-(Piperazinylalkyl)carbazoles as Bax-modulators
US6376514B1 (en) * 2000-10-17 2002-04-23 The Procter & Gamble Co. Substituted six-membered heterocyclic compounds useful for treating multidrug resistance and compositions and methods thereof
US6693099B2 (en) 2000-10-17 2004-02-17 The Procter & Gamble Company Substituted piperazine compounds optionally containing a quinolyl moiety for treating multidrug resistance
AU2002213408A1 (en) * 2000-10-23 2002-05-06 The Arizona Disease Control Research Commission Anticancer agents based on regulation of protein prenylation
WO2003044535A1 (en) * 2001-11-22 2003-05-30 Mehmet Ozturk Method, antigen and antibody for distinguishing viable and apoptotic cells
CN112472699A (zh) * 2013-07-26 2021-03-12 种族肿瘤学公司 改善比生群及衍生物的治疗益处的组合方法
PL407922A1 (pl) * 2014-04-16 2015-10-26 Wrocławskie Centrum Badań Eit + Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Nowe bisfosfoniany i ich zastosowanie

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS55115878A (en) * 1979-02-27 1980-09-06 Taisho Pharmaceut Co Ltd Epoxysuccinic acid derivative
JPS55153778A (en) * 1979-05-17 1980-11-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd Epoxysuccinylamino acid derivative
US4474800A (en) * 1980-05-13 1984-10-02 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Epoxysuccinyl amino acid derivatives
JPS57169478A (en) * 1981-04-10 1982-10-19 Nippon Chemiphar Co Ltd Piperazine derivative
JPS6276A (ja) * 1985-03-26 1987-01-06 Toyo Jozo Co Ltd 酵素阻害性新規物質
JPH0832698B2 (ja) * 1987-05-08 1996-03-29 日本ケミファ株式会社 ピペラジン誘導体
US5214056A (en) * 1989-12-27 1993-05-25 Japan Tobacco Inc. 1,3,2-dioxathiolane oxide derivative
WO1993006143A1 (fr) * 1991-09-19 1993-04-01 Cray Valley Sa Resines de petrole thermiquement stables, leur procede de preparation et leur application a la formulation d'adhesifs thermofusibles
JPH0641067A (ja) * 1992-04-20 1994-02-15 Kitasato Inst:The 新規カルパイン阻害物質ｋｐ−１２４１及びその製造法
ES2124281T3 (es) * 1992-12-25 1999-02-01 Mitsubishi Chem Corp Derivados de alfa-aminocetonas.
US5733911A (en) * 1996-01-26 1998-03-31 Hitachi Chemical Co., Ltd. Method for inducing death of neoplastic cells using piperazne derivatives

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Publication number Publication date
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JP2000505792A (ja) 2000-05-16
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DE69713570D1 (de) 2002-08-01
JP4117404B2 (ja) 2008-07-16
US5733911A (en) 1998-03-31
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EP0877614A1 (en) 1998-11-18

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