EA020526B1

EA020526B1 - Применение n-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина для лечения резистентного к антимитотическому агенту рака

Info

Publication number: EA020526B1
Application number: EA201270383A
Authority: EA
Inventors: Марк Пейтон; Ричард Кендалл
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2014-11-28
Also published as: SI2475368T1; EP2818170A1; JP2013504582A; NZ598758A; UA107675C2; CL2012000640A1; CA2773838C; ES2528485T3; EP2475368B1; HK1205457A1; HUE024568T2; US20120028917A1; BR112012008325A2; ZA201202472B; MX2012003041A; HK1173655A1; CN102869361A; EP2475368A1; JP5851403B2; TW201121956A

Abstract

Изобретение относится к способам применения соединения N-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака, включающего солидные опухоли, которые стали резистентными к лечению химиотерапевтическими агентами, включающими антимитотические агенты, такие как таксаны, и/или другими противораковыми агентами, включающими ингибирующие Aurora киназу агенты. Изобретение также включает способы лечения рака, рефрактерного к таким терапиям, путем введения фармацевтической композиции, содержащей соединение, субъекту, имеющему рак.

Description

Настоящее изобретение относится к применению Ы-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил) окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина для лечения рака, включающего солидные опухоли, которые стали резистентными к лечению антимитотическими агентами и/или другими химиотерапевтическими агентами.

Сведения о предшествующем уровне техники

Рак является одним из самых широко распространенных заболеваний, поражающих человечество и ведущей причиной смертности по всему миру. Только в США рак является второй ведущей причиной смерти после болезней сердца. Рак, как правило, характеризуется разрегулированием нормальных клеточных процессов или нерегулируемой клеточной пролиферацией. Клетки, которые были трансформированы в раковые клетки, имеют тенденцию к пролиферации неконтролируемым и нерегулируемым образом, что приводит в некоторых случаях к метастазам или распространению рака. Разрегулирование клеточной пролиферации может возникнуть в результате изменения одного или нескольких генов, ответственных за клеточные пути, которые контролируют прогрессию клеточного цикла. Или же разрегулирование может возникнуть в результате изменений ДНК (включая, но без ограничения, мутации, амплификации, реаранжировки, делеции и эпигенетический сайленсинг гена), в одной или нескольких сверочных точках (сЬескрош!) клеточного цикла, что позволяет клеткам переходить из одной фазы клеточного цикла в другую непроверенными. С другой стороны, изменения в клеточном механизме сами по себе могут привести к ошибкам в процессе митоза, которые должным образом не выявлены или восстановлены, и клетка может проходить через клеточный цикл непроверенной.

Митоз представляет собой процесс, во время которого эукариотическая клетка распределяет свои дублицированные хромосомы между двумя идентичными дочерними ядрами. После митоза, как правило, следует цитокинез, в ходе которого происходит деление ядра, цитоплазмы, органелл и клеточных мембран на две дочерние клетки, имеющие примерно равные формы этих клеточных компонентов. Митоз и цитокинез вместе определяют митотическую (М) фазу клеточного цикла - деление материнской клетки на две дочерние клетки, генетически идентичные друг другу и их родительской клетке.

Процесс митоза является сложным и строго контролируемым процессом. Последовательность событий делится на отдельные фазы, соответствующие завершению одной совокупности активностей и началу следующей. Этими стадиями являются профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Во время процесса митоза дуплицированные хромосомы конденсируются и присоединяются к волокнам, которые растаскивают сестринские хроматиды к противоположным концам клетки. Клетка затем делится в результате цитокинеза с образованием двух идентичных дочерних клеток. Ошибки в процессе митоза могут уничтожить клетку посредством апоптоза или вызвать неправильное расхождение хромосом, что может привести к раку.

Как правило, сверочные точки клеточного цикла (сЬескрош18) активируются при обнаружении ошибок в ДНК (например, повреждение ДНК). Если эти ошибки в геноме не могут быть зафиксированы, то клетка обычно подвергается апоптозу. Однако, если клетка может проходить через свой клеточный цикл и процесс является непроверенным, то со временем может накапливаться большее количество мутаций. Эти изменения генов могут нарастать и в конечном итоге привести к потомству клетки с предраковыми или раковыми неопластическими свойствами (например, неконтролируемая пролиферация) посредством адаптации.

Антимитотические агенты представляют собой противораковые агенты, которые ингибируют функцию микротрубочек. Микротрубочки представляют собой полимеры белка, образованные гетеродимерами α- и β-тубулина, которые играют важную роль в формировании веретена митотического аппарата и цитокинезе в конце митоза. Подтвержденным подходом к препятствованию пролиферации раковых клеток являются противораковые агенты, действующие на микротрубочки.

В качестве противораковых агентов было разработано несколько классов антимитотических агентов. Таксаны являются самым известным классом антимитотического агента, который включает паклитаксел (таксол) и доцетаксел (таксотер). Алкалоиды барвинка представляют собой класс дестабилизирующих микротрубочки агентов, включающих винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин. Другие новые классы включают эпотилоны (иксабепилон). Эти антимитотические агенты предназначены для предотвращения пролиферации раковых клеток путем стабилизации или дестабилизации микротрубочек. Это прямое ингибирование микротрубочек приводит к аресту клетки и гибели посредством апоптоза или митотической катастрофы. Первым открытым соединением из серий таксанов был Паклитаксел. Доцетаксел, структурный аналог паклитаксела, был открыт позднее. Паклитаксел и доцетаксел широко применяются для лечения разных злокачественных новообразований у человека, включающих рак яичников, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак легкого, рак ЖКТ, рак пищевода, рак предстательной железы и СПИД-ассоциированную саркому Капоши. Первичным побочным эффектом таксанов является миелосуппрессия, первичная нейтропения, в то время как другие побочные эффекты включают перифериче- 1 020526 ский отек и нейротоксичность (периферическая нейропатия).

Резистентность к таксанам является осложняющим фактором для успешного лечения рака и, как правило, связана с повышенной экспрессией гена множественной лекарственной резистентности шйг-1 и его продукта, Р-гликопротеина (Р-др). Другими документально подтвержденными механизмами вторичной резистентности к таксанам являются мутации тубулина, гиперэкспрессия, амплификация и переключение изотипа. Мутации в α- и β-тубулине ингибируют связывание таксанов с правильным участком на микротрубочках, что делает лекарственный препарат неэффективным. Кроме того, некоторые резистентные клетки также проявляют повышенное содержание Лигога киназы, фермента, который способствует завершению митоза.

Алкалоиды барвинка (Ушеак, также называемые как растительные алкалоиды) способны связываться с субъединицей микротрубочек β-тубулином, блокируя их способность к полимеризации с αсубъединицей тубулина для формирования полных микротрубочек. Это вызывает арест клеточного цикла в метафазе, что приводит к апоптотической гибели клетки, так как в отсутствие интактного митотического веретена дуплицированные хромосомы не могут выстроиться вдоль метафазной пластинки. Во время исследования были идентифицированы димерные ассиметричные алкалоиды барвинка: винбластин, винкристин, винорелбин и виндезин, каждый из которых является эффективным для лечения рака, включающего рак мочевого пузыря и рак яичка, саркому Капоши, нейробластому и болезнь Ходжкина, и также карциному легкого и рак молочной железы. Основными побочными действиями алкалоидов барвинка являются нейротоксичность и миелосуппрессия у пациентов.

Резистентность к алкалоидам барвинка может быстро возникнуть в экспериментальных моделях. Противоопухолевые эффекты алкалоидов барвинка могут блокироваться в мультирезистентных клеточных линиях, которые гиперэкспрессируют переносчики, выводящие лекарственное средство, такие как Рдр и МКР1, опосредованные АТФ-связывающим кассетным транспортером (АВС). Другие формы резистентности возникают в результате мутаций в β-тубулине, которые предотвращают связывание ингибиторов с их целью.

Другие химиотерапевтические агенты включают ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан и топотекан (ингибиторы типа I), а также амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенопозид (ингибиторы типа II). Ингибиторы топоизомеразы нарушают синтез ДНК и в частности работают путем предотвращения транскрипции и репликации ДНК.

Еще другим классом химиотерапевтических агентов является класс антрациклиновых антибиотиков, включающий даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, эпирубицин и митоксантрон. На сегодняшний день антрациклины применяются для лечения разных видов рака, включающих лимфомы, лейкоз, а также рак матки, яичника, легкого и молочной железы. Антрациклины работают путем формирования свободных радикалов кислорода, которые разрушают ветви ДНК, ингибируя, таким образом, синтез ДНК и функцию. Одним из основных побочных эффектов антрациклинов является повреждение клетки сердечной мышцы, приводящее к сердечной токсичности.

Резистентность к противораковым агентам, включающим без ограничения химиотерапевтические агенты и антимитотические агенты, является главным недостатком при лечении рака. Такая резистентность проводит к тому, что пациенты становятся перекрестно-резистентными к действиям многих различных лекарственных препаратов. Таким образом, множественная лекарственная резистентность является проблемой. Кроме того, такая резистентность к противораковой(ым) терапии(ям) неминуемо приводит к гибели пациента. Таким образом, сохраняется проблема развития лекарственной резистентности для всех противораковых терапий и, следовательно, сохраняется потребность в идентификации терапии для рака, который более не является восприимчивым или только незначительно поддается лечению, включающему традиционное лечение химиотерапевтическими агентами, такими как таксаны и алкалоиды барвинка, а также лечению противораковыми агентами, прошедшими клинические испытания с целью получения разрешения уполномоченного органа.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 представляет собой график, показывающий действие АМО 900 и таксола на клеточные линии МЕ8-8А и МЕ8-8А Их5, значения ЕС₅₀ для р-гистона Н3;

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий действие АМО 900 и таксола на родительскую клеточную линию ИС1-Н460 и таксол-резистентную клеточную линию ИС1-Н460, значения ЕС₅₀ для содержания ДНК в клеточном цикле;

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий действие АМО 900 и таксола на клеточную линию МИА-МВ-231 и таксол-резистентную клеточную линию МИА-МВ-231, значения ЕС₅₀ для содержания ДНК в клеточном цикле;

Фиг. 4 представляет собой график, показывающий ингибирование с помощью АМО 900 роста установленных опухолевых ксенотрансплантатов МЕ8-8А Их5; и

Фиг. 5 представляет собой график, показывающий действие лечения АМО 900 и таксолом на рост установленных таксол-резистентных ксенотрансплантатов ИС1-Н460.

Фиг. 6 представляет собой график, показывающий действие АМО 900 на родительскую клеточную

- 2 020526 линию НСТ116, Л2О1152-резистентную клеточную линию НСТ116 и паклитакссл-рсзистснтныс клеточные линии.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении предложено применение соединения И-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)2-пиридинил)окси)фснил)-4-(4-мстил-2-тиснил)-1-фталазинамина (также называемого здесь как АМО 900 или соединение) и его фармацевтически приемлемых солей для лечения рака на поздней стадии, включающего солидные опухоли и раковые клетки, которые являются рефрактерными к стандартному лечению утвержденными правительством антимитотическими агентами, такими как таксаны, включающие паклитаксел и доцетаксел, и другими химиотерапевтическими агентами, включающими доксорубицин, и другими агентами, вводимыми при клинических испытаниях на лечение рака. АМО 900 имеет химическую структуру:

В изобретение, кроме того, предложено применение фармацевтической композиции, содержащей это соединение или его фармацевтически приемлемую соль, для терапевтического, профилактического, кратковременного и долговременного лечения рака и раковых клеток у пациентов, которые ранее проходили лечение химиотерапевтическими агентами, включающими антимитотические агенты. В одном варианте изобретения предложено применение АМО 900 в производстве лекарственных средств и фармацевтических композиций для способов лечения рака у субъектов, которые ранее проходили лечение антимитотическими агентами, включающими ингибиторы митотического веретена, и антимикротубулиновыми агентами или другими лекарственными средствами, используемыми в химиотерапии рака (также называемыми здесь как химиотерапевтические агенты), включающими доксорубицин, даунорубицин, дактиномуцин, колхицин, винбластин, винкристин, эторозид и митоксантрон. В другом варианте в изобретении предложен способ лечения таксан-резистентных типов опухолей, включающих немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы и гормонорезистентный рак предстательной железы у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту эффективного количества АМО 900 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения таксан-резистентных опухолей.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Во время клинических испытаний на моделях было обнаружено, что АМО 900, ингибитор Аигога киназы, обеспечивает удивительное и неожиданное преимущество над современными стандартными раковыми терапевтическими агентами, которые поражают тубулин (такие как паклитаксел, иксабепилон и алкалоиды барвинка) и другими химиотерапевтическими агентами (такими как доксорубицин), включая ΛΖΩ1152. В частности, АМО 900 обеспечивает эффективность ингибирования или замедления прогрессирования или роста опухолей, которые стали кросс-резистентными к антимитотическим агентам, с помощью различных предложенных механизмов, включающих, например, выведение лекарственного средства, опосредованное АТФ-связывающим кассетным транспортером (АВС), амплификацию или модификацию гена тубулина, или структурные изменения в белке α- или β-тубулине. Кроме того, АМО 900 поражает пролиферирующие клетки в О₂М-фазе клеточного цикла и, следовательно, с малой вероятностью будет вызывать периферическую нейропатию, наблюдаемую в случае антимитотиков, которые поражают микротрубочки.

Определения

Следующие определения будут также способствовать пониманию объема изобретения, описанного здесь.

Используемые здесь термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у субъектов, которое, как правило, характеризуется разрегулированным клеточным ростом. Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, саркому, бластому и лейкоз. Более конкретными примерами раковых заболевания являются плоскоклеточная карцинома, рак легкого, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак мочевого пузыря, гепатома, рак молочной железы, рак ободочной кишки и рак головы и шеи. Поскольку используемый здесь термин рак не ограничивается какой-либо конкретной формой заболевания, то полагают, что способы изобретения будут особенно эффективными для лечения рака, который стал резистентным в некоторой степени к лечению противораковыми агентами, включающими без ограничения химиотерапевтические агенты, антимитотические агенты, антрациклины и подобные, а также рака, который рецидивировал после лечения такими противораковыми агентами.

Используемый здесь термин химиотерапевтический агент относится к терапии рака путем уничтожения раковых клеток. Этот термин к тому же относится к противоопухолевым препаратам, используемым для лечения рака, или комбинированию этих препаратов в стандартизированный режим лечения. Примеры химиотерапевтических агентов включают без ограничения алкилирующие агенты, такие как

- 3 020526 цисплатин, карбоплатин, оксаплатин; алкалоиды, включающие алкалоиды барвинка (примеры включают винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин), и таксаны (примеры включают паклитаксел (Таксол) и доцетаксел); ингибиторы топоизомеразы, такие как иринотекан, топотекан, амсакрин, этопозид, этопозида фосфат и тенипозид; и разные противоопухолевые агенты, такие как дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, блеомицин и другие.

Термин содержащий означает неограниченный, включающий указанный(е) компонент(ы), но не исключающий других элементов.

Используемый здесь термин мультирезистентный относится к раковым клеткам, резистентным ко многим лекарственным препаратам с разными химическими структурами и/или устойчивым к лекарственным препаратам, направленным на разные цели.

Используемый здесь термин рефрактерный относится к неподдаваемости, устойчивости или неотвечаемости на лечение, стимулы (терапию) или лекарство, включая резистентность ко многим терапевтическим средствам лечения. Термин рефрактерный, при использовании здесь в контексте характеристики рака или опухоли, относится к раку или опухоли, которая не отвечает или имеет резистентный или уменьшенный ответ на лечение одним или несколькими противораковыми агентами. Лечение, как правило, является продолжительным, пролонгированным и/или периодическим в течение периода времени, что приводит к тому, что рак или опухоль развивают резистентность или становятся рефрактерными к именно такому лечению.

Используемый здесь термин субъект относится к любому млекопитающему, включая человека и животных, таких как коровы, лошади, собаки и кошки. Таким образом, изобретение может применяться для пациентов-людей, а также для ветеринарных субъектов и пациентов. В одном варианте изобретения субъектом является человек.

Выражение терапевтически эффективный означает количество соединения (ΛΜΟ 900), которое обеспечивает уменьшение размера или тяжести рака или опухоли во время лечения рака традиционными антимитотическими терапиями при уменьшении или отсутствии вредных побочных эффектов, как правило, связанных с традиционными терапиями рака.

Используемые здесь термины лечить, лечение и терапия относятся к терапии, включающей без ограничения лекарственную терапию, профилактическую терапию и превентивную терапию. Профилактическое лечение в целом состоит в предупреждении начала нарушений вообще или задержки начала преклинически очевидной стадии нарушений у индивидов.

Термин фармацевтически приемлемые соли охватывает соли, обычно используемые для формирования солей щелочных металлов и для образования солей присоединения свободных кислот или свободных оснований. Природа соли не является решающей при условии, что соль является фармацевтически приемлемой. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединения могут быть приготовлены из неорганической кислоты или из органической кислоты. Примеры таких неорганических кислот включают без ограничения хлористоводородную, бромистоводородную, йодистоводородную, азотную, угольную, серную и фосфорную кислоту. Примеры органических кислот включают без ограничения алифатические, циклоалифатические, ароматические, арилалифатические, гетероциклические, карбоновые и сульфоновые классы органических кислот, примерами которых являются муравьиная, уксусная, адипиновая, масляная, пропионовая, янтарная, гликолевая, глюконовая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, глюкуроновая, малеиновая, фумаровая, пировиноградная, аспарагиновая, глютаминовая, бензойная, аминобензойная, месиликовая, 4-гидроксибензойная, фенилуксусная, миндальная, эмбоновая (памовая), метансульфоновая, этансульфоновая, этандисульфоновая, бензолсульфоновая, пантотеновая, 2-гидроксиэтансульфоновая, толуолсульфоновая, сульфаниловая, циклогексиламиносульфоновая, камфарная, камфорсульфоновая, диглюконовая, циклопентанпропионовая, додецилсульфоновая, глюкогептановая, глицерофосфорная, гептановая, гексановая, 2-гидроксиэтансульфоновая, никотиновая, 2-нафталинсульфоновая, щавелевая, пальмитиновая, пектиновая, надсерная, 2фенилпропионовая, пикриновая, пивалиновая, пропионовая, янтарная, винная, тиоциановая, метансульфоновая, ундекановая, стеариновая, альгиновая, β-гидроксимасляная, салициловая, галактаровая и галактуроновая кислота.

Подходящие фармацевтически приемлемые основно-аддитивные соли присоединения основания соединения включают без ограничения соли металлов, такие как соли, полученные из алюминия, кальция, лития, магния, калия, натрия и цинка, или соли, полученные из органических оснований, включающих первичные, вторичные, третичные амины и замещенные амины, включающие циклические амины, такие как кофеин, аргинин, диэтиламин, Ν-этилпиперидин, гистидин, глюкамин, изопропиламин, лизин, морфолин, Ν-этилморфолин, пиперазин, пиперидин, триэтиламин, триметиламин. Все соли, указанные здесь, могут быть приготовлены традиционными способами из соответствующего соединения путем реакции, например, соответствующей кислоты или основания с соединением.

ΛΜΟ 900, ^(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)оксо)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин, может быть приготовлен способом, аналогичным способу, описанному в публикации РСТ \νϋ 2007087276, иллюстративные способы от А1 до А2 на стр. 70, но с использованием 1-хлор-4-(4метил-2-тиенил)фталазина в качестве исходного материала, в сочетании с примерами 15 (стр. 50), 25

- 4 020526 (стр. 55) и 30 (стр. 59). Эти способы также описаны в патенте США 7560551, описание которого включено здесь полностью в виде ссылки. В частности, АМС 900 может быть приготовлен так, как описано в примере 1 ниже.

Пример 1. Синтез Ы-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина (АМС 900).

Стадия 1. 4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин-2-амин.

В продутую аргоном колбу с круглым дном емкостью 500 мл, помещенную в изопропаноловую ванну, медленно добавляли металлический натрий (3.40 г, 148 ммоль) в метанол (180 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре (КТ) в течение примерно 30 мин. В смесь добавляли гидрохлорид гуанидина (12.0 мл, 182 ммоль) и перемешивали при КТ в течение 30 мин с последующим добавлением (Е)-1-(2-хлорпиридин-3-ил)-3-(диметиламино)проп-2-ен-1-она (12.0 г, 57.0 ммоль), присоединяли конденсатор с воздушным охлаждением, переносили реакционную смесь в масляную ванну, в которой смесь нагревали примерно до 50°С в течение 24 ч. Примерно половину метанола выпаривали при пониженном давлении и твердые вещества фильтровали в вакууме, затем отмывали насыщенным раствором бикарбоната натрия (ЫаНСОз) и Н₂О, высушивали на воздухе с получением 4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин2-амина в виде грязно-белого твердого вещества. М8 т/ζ = 207 [М+1]+.

Вычислено для С₉Н₇СШ₄: 206.63.

Стадия 2. 4-(2-(4-Аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин-2-амин.

В повторно герметизируемую пробирку добавляли 4-аминофенол (1.3 г, 12 ммоль), карбонат цезия (7.8 г, 24 ммоль) и ЭМ8О (16 мл, 0.75 М). Смесь нагревали до 100°С в течение 5 мин и затем добавляли 4-(2-хлорпиридин-3-ил)пиримидин-2-амин (2.5 г, 12 ммоль), и реакционную смесь нагревали до 130°С в течение ночи. После завершения реакции по данным ЬСМ8 реакционную смесь оставляли охлаждаться до КТ и разбавляли водой. Полученный преципитат фильтровали и твердую фазу отмывали водой и диэтиловым эфиром. Твердое вещество затем брали в соотношении 9:1 СН₂С1₂:МеОН и пропускали через слой силикагеля с использованием в качестве элюента смесь 9:1 СН₂С1₂:МеОН. Растворитель концентрировали в вакууме для получения требуемого продукта, 4-(2-(4-аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин2-амина. М8 т/ζ = 280 [М+1]+. Вычислено для С₁₅Н₁₃^О: 279.30.

Стадия 3. 1-Хлор-4-(4-метилтиофен-2-ил)фталазин.

1,4-Дихлорфталазин.

(1.40 г, 7.03 ммоль), 4-метилтиофен-2-илборную кислоту (999 мг, 7.03 ммоль) и РбС1₂(ЭРРР) (721 мг, 985 мкмоль) добавляли в герметичную пробирку. Пробирку продували аргоном. Затем добавляли карбонат натрия (2.0 М в воде) (7.74 мл, 15.5 ммоль) и 1,4-диоксан (35.2 мл, 7.03 ммоль). Пробирку герметично закрывали, перемешивали при КТ в течение 5 мин и помещали в предварительно нагретую масляную ванну при 110°С. Через 1 ч анализ методом ЬС-М8 показал продукт и побочный продукт (двойное связывание), и исходный материал дихлорфталазин. Реакционную смесь охлаждали до КТ, фильтровали через слой целита при помощи этилацетата (Е1ОАе), концентрировали и нагружали на колонку. Продукт очищали колоночной хроматографией с использованием Нех для удаления верхнего пятна, затем смеси 80:20 гексаны:Е1ОАе для сбора продукта. Продукт 1-хлор-4-(4-метилтиофен-2-ил)фталазин получали в виде желтого твердого вещества. Анализ методом ЬС-М8 показал, что продукт содержал примеси в небольшом количестве дихлорфталазина и побочный продукт бис-связывания. М8 т/ζ = 261 [М+1]+. Вычислено для С1₃Н₉С1Х₂§: 260.12.

Стадия 4. Ы-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин.

В 4-(2-(4-аминофенокси)пиридин-3-ил)пиримидин-2-амин и 1-хлор-4-(4-метил-2-тиенил)фталазин добавляли !ВиОН. Полученную смесь нагревали при 100°С в герметичной пробирке в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляли диэтиловым эфиром и насыщенным раствором карбоната натрия и энергично встряхивали. Полученные твердые вещества фильтровали и отмывали водой, диэтиловым эфиром и сущили на воздухе с получением Ы-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина в виде грязно-белого твердого вещества. М8 т/ζ = 504 [М+Н]+. Вычислено для С₂₈ Н₂1 Ν₇ О 8: 503.58.

- 5 020526

Метод ЬС-М8

Образцы анализировали на приборе АдПеп! модели1100 ЬС-ΜδΌ на колонке с обращенной фазой производства АдбеШ ТесЬпо1од1ек, ХИВ-С₈ (3.5 мкм) (4.6x75 мм) при 30°С. Скорость потока была постоянной и изменялась примерно от 0.75 мл/мин до 1.0 мл/мин.

В качестве подвижной фазы использовали смесь растворителя А (Н₂О/0.1% НОАс) и растворителя В (АсСЫ/0.1% НОАс) с периодом времени 9 мин для градиента от 10 до 90% растворителя В. Затем следовал период в 0.5 мин для возвращения к 10% растворителя В и период в 2.5 мин для повторного уравновешивания (промывки) колонки 10% растворителя В.

Также для синтеза АМС 900 могут применяться другие способы. В данной области известно много синтетических химических трансформаций, а также методов защитных групп, эффективных для синтеза АМС 900. Полезная литература, описывающая органические химические превращения, включает, например, К. Ьатоск, Сотргекеи51уе Огдашс Тгаиккоттабоиз, УСН РиЬ11ккегк (1989); Т.У. Сгеепе аиб Р.С.М. \УиК Рто4есбуе Сгоирк ίη Огдашс 8уп1кек1к, 3-е издание, .Токи \УПеу апб 8опк (1999); Ь. Р1екет апб М. Р1екег, Р1екет апб Р1екет'к РеадеШк кот Огдашс ЗуШкек® 1оЬп \УПеу апб 8опк (1994); А. Ка1гк/ку апб А. Ро/кагккк НапбЬоок ок Не1егосускс Скетшбу, 2-е издание (2001); М. Вобапк/ку, А. Вобапк/ку, Тке Ргасбсе ок Рер11бе ЗуШкекЫ 8ргтдег-Уег1ад, Вегкп Не1бе1Ьегд (1984); Т §еубеп-Реппе, Кебисбопк Ьу 1ке А1иттоапб Вогокубпбек ш Огдашс 8уп1кек1к, 2-е издание, Убеу-УСН, (1997); апб Ь. Рациебе, ебког Епсус1ореб1а ок Кеадепб ког Огдашс 8уп1кек1к, 1окп \УПеу апб 8опк (1995).

АМС 900 тестировали на его способность уменьшать или ингибировать прогрессирование опухоли в разных клеточных линиях (ш-укго) и многих типах солидных опухолей (ш-у1уо), некоторых из которых ранее подвергались лечению и развили резистентность к стандартным антимитотическим агентам, включая таксаны и алкалоиды барвинка, а также к другим химиотерапевтическим агентам. Последующие примеры и полученные данные иллюстрируют способность АМС 900 лечить рак, включающий рак, резистентный к современным стандартным терапиям, включающим антимитотические агенты, такие как паклитаксел, и другие лекарственные препараты, используемые в сочетании с химиотерапией, такие как доксорубицин. Если не указано иное, АМС 900 в форме свободного основания использовали в примерах, описанных далее.

Пример 2.

Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью АМС 900-индуцированной супрессии активности Аигога киназы А и В, антипролиферативное действие АМС 900 оценивали щ \або с использованием 32 человеческих опухолевых клеточных линий. Как показано в табл. 1 и 2, АМС 900 проявил антипролиферативную активность как в солидных, так и в гематологических опухолевых клеточных линиях. Эта антипролиферативная активность наблюдалась при концентрациях АМС 900 в низком наномолярном диапазоне (значение ЕС₅₀ от 1 до 5 нМ). Примечательно, что четыре из этих чувствительных к АМС 900 солидных опухолевых клеточных линий (НСТ15, МЕ8-8А Их5, 769Р и 8Νυ449) являются резистентными к паклитакселу и другим химиотерапевтическим агентам. Раковые клетки, резистентные ко многим лекарственным препаратам разных химических структур и/или резистентные к лекарственным препаратам, направленным на разные цели, называются мультирезистентными. Одним основным механизмом множественной лекарственной устойчивости (МЭК), используемой раковыми клетками, является выведение лекарственного препарата, вызванное семейством АТФ-связывающих кассетных транспортеров (АВС), таким как продукт гена тбг-1, Р-гликопротеин (Р-др). Например, резистентная к доксорубицину человеческая клеточная линия матки МЕ8-8А Их5 экспрессирует Р-др и является резистентной (30-1200-кратно родительской линии) к ряду химиотерапевтических агентов, включающих даунорубицин, дактиномицин, колхицин, винбластин, винкристин, паклитаксел, этопозид и митоксантрон. Для дальнейшего изучения активности АМС 900 в МИК-экспрессирующих клетках проводили тестирование трех таксол-резистентных опухолевых клеточных линий и сравнили с их соответствующими родительскими клеточными линиями. Как показано на фиг. 1-3 и в табл. 3, АМС 900 сохранил активность во всех трех указанных резистентных и чувствительных к таксолу опухолевых клеточных линиях со значениями ЕС₅₀ < 2 нМ. Таксол показал значительную потерю активности (10-100-кратно) в Р-др-экспрессирующих опухолевых сублиниях по сравнению с родительскими линиями. В то же время эти данные указывают на то, что АМС 900 ингибирует фосфорилирование гистона Н3 (проксимальный субстрат Аигога киназы В) и блокирует деление клеток опухолевых клеточных линий, резистентных к паклитакселу и другим химиотерапевтическим агентам.

Материалы и способы

Тестируемые материалы.

Тестируемый продукт: АМС 900.

Состав: ИМ8О.

Источник: Атдеп 1пс.

Основные реагенты.

- 6 020526

Отмывочные и фиксирующие растворы

IX РВЗ	Раствор фосфатного буфера Дульбекко, Кат.Х» 14090144, ΙηνΐΐΓ0§εη Согр., СагЬЬай, СА 92008
Дистилированная вода (ά) Н₂0	Кат.№ 2Р7115, Вах1ег НеаИЬ саге Согр., ОеегбеМ, 1Ь 60015
90 % Метанол в с!Н20	Метиловый спирт, Кат.Х» 3041-10, Ма1Ьпскгой1 СЬет1са1з, РЬППрзЬиг^, N1 08865
Отмывочный буфер (в IX РВЗ) - РАСЗ анализ 1%В5А	Кат.Х® 810111, Кол-во 50 мл, ΙΟΝ В1отеШса1з 1пс. Аигога, ОН 44202
0.2% ТлЮп Х-100	Кат, № 9284, 51®та-А1<1псЬ, 8г. Ьошз, МО 63178
Отмывочный буфер СеПотиз
IX РВЗ	Раствор фосфатного буфера Дульбекко, Кат.Х» 14090-
1% нормальная козья сыворотка 1% Твин-20	144,1пУ11го§еп Согр., Саг1$ЬаЙ, СА 92008 Кат. Х° 0-9023-10 мл, Зщта-АШпсЬ, 5ΐ. Ьошз, МО 63178 Кат. Хе Р-1379, §1§та-А1йпсЬ, 8ί. Ьошз, МО 63178

Кислотный буфер (в 4Н₂0) 2]ЧНСЬ	Соляная кислота 37 %, Кат.Хг ΙΤ953000, Номер партии отсутствует, 51$та-АИг)сЬ, δΐ. Σουίδ, МО
0.5%ΤήΙοη Х-100	63178
2Х Фиксация формальдегидом (в IX РВЗ) - СеПопнсз	Кат. N° 9284, Номер партии отсутствует, 500 мл, 31§та-А16псЬ, 3ι. Ьошз, МО 63178
20% формальдегид, 0,024% глутаральдегид	Кат. N° Р1635-5ОО мл, З^та-АМпсЬ, 81. Σοιιίδ, МО 63178 Кат. N° 85191, Пика/Звдпа-АМпсН, 81. Ьошз, МО

	63178 1
Иодид пропидия/ окрашивающий буфер с иодидом пропидия и РНКазой	Реагенты ΡΙ/ΚΝΑδβ, Кат. N2 550825, 100 мл, ВесЮп ЕИсЬпзоп, ЗапЪзе, СА 95131
ϋΜ30, даметилсульфоксид	КатХ° 02650, 81С.ша-А1йпсЬ, $ι. Ьошз, МО 63178
Анти-фосфо-Гистон НЗ (ЗегЮ) антитела (р-гистон НЗ), маркер митоза	Кат. Хе 06-570, ирзГаЮ СеП ЗдепаКпд 8о1ийопз, Ьаке ΡΙααά,ΝΥ 12946
Антикроличьи козьи антитела {§оаг алп-гаЬЬй 1§С), конъюгированные с флюоресцентным красителем Акха Р1оиг 488	Кат.Х» А11001, ΙηνϊΐΓ0£6η Согр., СагкЬай, СА 92008
Ноесйз! 33342 тригидрохлорид, тригидрат	Ка.№ Н3570,1пуйго§еп Согр., СагкЬаД, СА 92008
Анги-бромдеоксиуридин, мышиные ΙβΟ 1, моноклональные РРВ-1, А1еха Пиог 647 конъюгат (анти-ВпШ, Акха-647)	Кат№ А21305, Ьо1#54656А, 1пукго£еп Согр.СагкЬай, СА 92008
Кроличьи моноклональные апй-асГп’е Сазразе-З антитела, конъюгированные с Р1ТС (анти -Каспаза-РГГС)	100 тестов, Кэт.№ 559341, ЬоГ# 60509, В Г) РЬатнп§еп, 8ап ϋϊε§ο, СА 92121
ВМС- реагент для мечения (базовая концентрация не указана)	КатХг 00-0103, гущей ЬаЬога1опез, СайзЬай, СА 92008
IX Тгурзш-ЕОТА, 0.5%	Кат Хе 25300-054, ΙηνίΛο^βη Согр., Саг1зЬай, СА 92008
IX Уегзепе	Кат Хе 15040-066, Ιηνϊιΐοββη Согр,, СагкЬай, СА 92008
среда МсСоуз 5А с ЬГлутамином	Кат Хе 16600-082 ΙηνίΧο^ιι Согр., СагкЬай, СА 92008
среда ΚΡΜΙ 1640 с ЬГлутамином	Кат.Х° 11875-093, ΙηνΐίΓΟβοη Согр., СагкЪай, СА 92008
ΏΜΕΜ с высоким содержанием глюкозы, 4.5 г/л ϋ-глюкозы, с ЬГлутамином	Кат,Хе 11965-092 1пуйго@еп Согр., СагкЪай, СА 92008
РВ5, фетальная бычья сыворотка, происхождение Австралия	КатКг 10099-141, ΙηνίίΓοβίη Согр., Саг^ЬаО, СА 92008
Таксол (Паклитаксел)	Кат Хе Т7402, Згета-АМпсЬ, 8г. Ьошз, МО 63178

| Винбластин

I Кат.№ V1377, К^та-АМОсЬ, 81. Ьошз, МО 63178

- 7 020526

Лабораторное оборудование, поставщики, программное обеспечение

Настольная охлаждаемая центрифуга	А11е£гаХ-15К СеШпйщс, Вескюап Соикег, РиНеПоп, СА 92834
Программное обеспечение ОгаРп ν5	ЕпШасиб ЗоЙдааге, НоНеу 8штеу, КН6 9Υ1, иК
Программное обеспечение ХЬЙ14.2	Ехсе1, МшгозоЙ 1пс., Ы8А
ОгарЬРаб Ριίίϋη ν5	ОгарЬРаН Зойтеаге, 1пс. 2236 АсепИа бе 1а Р1ауа, Ьа ]о11а, СА 92037
Проточный цитометр	ВесЮп Ошкшзоп ЬЗКП Ρ1ο\ν СуЮтеЮг, Βϋ Вюыаепсез, 8ап 1озе, СА 95131
96-луночный планшет для тканевой культуры, плоское дно с крышкой с низким испарением, стерильный	Кат Ха 3595, Номер партии отсутствует, Согпш§ 1псогр. Ы& 8с1епсе5, ЬомеИ МА 01851
12-луночный планшет для тканевой культуры, плоское дно с крышкой с низким испарением, стерильный	Кат Ха 353043, Номер партии отсутствует, Βϋ ЬаЬухаге, РгапкНп Ьаксз, N1 07417
6-луночный планшет для тканевой культуры, плоское дно с крышкой с низким испарением, стерильный	Ка.№ 353046, Номер партии отсутствует, ΒΩ ЬаЬ^аге. РгапкНп Ьаксз, N1 07417
Стрипы пробирок для ПЦР, используемые для РАС8 окрашивания	КатХ» 20170-004, № партии 711С7-7074, 0.2 мл пробирка для ПЦР, ν\¥Κ 1пй., ХУсьТ СЬезЮг, РА 19380.
1.5 мл пробирки Эппендорфа	Кат.Х» 20901-551, Номер партии отсутствует, У\У'К Ιηΐΐ., АУе$1 СЬейег, РА 19380
Планшеты Раскагй νίε\ν-96	Ка.Хг6005182, Номер партии отсутствует, РегкшЕ1тег апй Апа1уйса1 Зшепсея, ХУаккат, МА 02451
Устройство отмывки планшетов ЕЬХ405	КаЛ» ЕЬХ405НТ, ВюТск, \Утоозк1, УТ 05404
МиИйгор ЬРАЗПсср \Уе11)	Ка.№ 5840177, ТЬегто РЕЬсг 5ыепбйс 1пс, УАЦНат, МА 02454
СеНописк Апгау 5сап ΥΤί	СеИопнсз-ТЬеппо ΡΐδΚετ 1пс, ХУаккат, МА 02454

Способы

Активность АМС 900 оценивали ίη νίΐτο в родительских и резистентных к лекарственным препаратам опухолевых клеточных линиях, полученных из матки, молочной железы и тканей легкого. Конечные показатели клеточного цикла и р-гистона Н3 определяли методом проточной цитометрии и многопараметрической визуализации клетки, соответственно.

Человеческая клетка и клеточная культура

Человеческие опухолевые клеточные линии были приобретены у компании АТСС (Атепсап Туре СиЬиге Со11есСоп, Мапаккак, УА), если не указано иное. Все клетки содержались при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Извлеченная из опухоли молочной железы клеточная линия САИ51 (АСС 302) была получена от компании ΌδΜΖ (СтЬН). Извлеченные из опухоли ободочной кишки клеточные линии НСТ-116_!И (генотип р21+/+) и НСТ-116_Ш (генотип р21 -/-) были получены по лицензии от компании ΐοΐιη Иорктк ИпАегкйу Сепейск Кекоигсек Соге Расййу.

- 8 020526

Человеческие опухолевые клеточные линии с соответствующей культурной средой

Опухолевая клеточная линия

НСТ-116_1Н (генотип р21 +/+) НСТ-116_Ж (генотип р21 -/-)

НСТ-15

НТ29

3Ά'-620

35Υ480

НОР-92

НОР-62

МС1-Н460

А549

РС-3 пи-145

ВТ-549

ВТ-474

МОА-МВ-231

Τ47ϋ

МСР-7 р53(+)

Происхождение

Ободочная кишка

Легкое

Предстательная железа

Молочная железа

Молочная

Условия роста культуры тканей (все среды содержат 1х глутамин) МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин НалГз Р12К +10% РВЗ+ Ь-глутамин ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

КРМ1 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

КРМ1 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин ЕРМ11640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

МСР-7 р53(-> САЬ51 3Κ-ΟΥ-3 МЕ5-5А/Ох5 МЕ5-ЗА	железа Молочная железа Молочная железа Яичник Матка Матка
ЗК-МЕЬ-2	Кожное
А498	Почки
769Р	Почки
САКИ	Почки
5К-НЕР-1	Печень
8Ν11449	Печень
К562	Лейкоз
МОЬТ-4	Лейкоз
НЬ-60	Лейкоз
1дгка1	Лейкоз
Ы266-В1	Миелома
ΚΡΜΙ-8226	Миелома
ΝΟΙ-Η460 таксол-г	Легкое Молочная
МОА-МВ-231 (Р11)-1ис	железа
ΜΟΛ-ΜΒ-231 (Р11)-1ис таксол-	Молочная
г	железа

ИРМ1 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

ОМЕМ+ +10% РВЗ+ ΙΧΝΕΑΑ + Ь-глутамин МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин МсСоу’з 5А, 10% РВЗ МЕМ, 10% РВЗ, ΙιηΜΝα РуттаЮ, 0.1 мМ ΝΕΑΑ + Ь-глутамин

МЕМ, 10% РВЗ, ΙχΝΕΑΑ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

МсСоу’з 5А, 10% РВЗ + Ь-глутамин

МЕМ, 10% РВЗ, 1х ΝΕΑΑ + Ь-глутамин

ΕΡΜΙ 1640, 10% РВЗ, 10 мМ НЕРЕЗ, 1 мМ Να

Ругиуай + Ь-глутамин

ΕΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 15% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 20% РВЗ + Ь-глутамин

ΚΡΜΙ 1640, 10% РВЗ, 75 нМ Таксол □ МЕМ, 10% РВЗ

ОМЕМ, 10% РВЗ, 50 нМ Таксол

Панель клеточной линии солидной опухоли, обработанной ΆΜΟ 900: Антипролиферативный анализ (Аггау8сап ντί).

Опухолевые клетки засевали в 96-луночный планшет Раекагй νίσ№ в 100 мкл соответствующей полной среды при плотности 3000 или 5000 клеток на лунку в зависимости от кинетики роста клеточной линии (в широком понимании - медленный νδ быстрый). Все разведения выполняли с использованием рабочей станции Вютек РХ. На следующий день клетки обрабатывали АМО 900 (11-точечный диапазон доз от 0.156 до 0.0003 мкМ) с конечной концентрацией ΌΜ8Θ в среде 0.12%. Через 24 ч среду, содержащую соединение, удаляли и клетки отмывали полной средой. Клетки затем инкубировали в 100 мкл свежей полной среды (без соединения) в течение 48 ч. Через 48 ч клетки фиксировали путем добавления 100 мкл фиксирующего буфера в 100 мкл полной среды. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Фиксирующий буфер аспирировали и клетки затем пермеабилизировали в 100 мкл отмывочного буфера в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 100 мкл ДНК-окрашивающего буфера и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Затем клетки отмывали 100 мкл отмывочного буфера и хранили в 100 мкл 1хРВ8 при 4°С до проведения анализа. Клеточные характеристики получали путем сканирования 96-луночных планшетов на системе

- 9 020526

Се11ош1С8 Лггау8сап νΤΐ. Количественное определение площади ядра индивидуальной клетки и интенсивности выполняли по окрашиванию флуоресцентным ДНК-красителем Ноес1м 33342. Пороговое значение площади ядра было установлено на основе контрольных лунок, обработанных ΌΜδΟ, для расчета количества ядер с нормальным размером из ядерного дебриса и полиплоидных клеток. Эта пороговая величина применялась для подсчета количества нормальных ядер в шести полях изображения на лунку с использованием увеличения 10/. Кривые доза-концентрация и значения ЕС₅₀ были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.

Панель гематологической клеточной линии, обработанной ΛΜΟ 900: Многопараметрический анализ содержания ДНК в клеточном цикле (проточная цитометрия).

Опухолевые клетки засевали в 300 мкл глубокий 96-луночный планшет в 150 мкл соответствующей полной среды при плотности 100000 клеток на лунку. Клетки обрабатывали ΆΜΟ 900 (10-точечных доз в диапазоне от 0.156 до 0.0003 мкМ) с конечной концентрацией ΌΜδΟ в среде 0.2%. За два часа до сбора клетки импульсно метили с помощью Βτάυ при конечной концентрации 1:100 в среде. Через 48 ч 100 мкл среды удаляли из каждой лунки с помощью пипеточного дозатора для мультилуночных планшетов. Затем клетки переносили в ПЦР-пробирки стрипов в 200 мкл среды. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин при 18°С в течение 4 мин и супернатант аспирировали. Клетки затем фиксировали в 200 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°С в течение по меньшей мере 24 ч перед окрашиванием антител и ДНК. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для удаления 90% метанола. Клетки промывали 200 мкл отмывочного буфера и затем обрабатывали 100 мкл кислотного буфера при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте. Клетки дважды промывали 200 мкл отмывочного буфера (до установления рН 7.0, подтвержденного индикаторной бумагой). Клетки инкубировали с коктейлем антител анти-Вгйи-А1еха 647 (3 мкг/мл) и анти-Каспаза 3-РГГС (20 мкл/ячейка) в отмывочном буфере в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Окрашенные клетки центрифугировали и промывали 200 мкл отмывочного буфера. Клетки контрокрашивали 200 мкл иодида пропидия (РГ) в течение ночи при 4°С в темноте. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра (ΌδΚΠ). Пороговый интервал применяли согласно содержанию ДНК, Βτάυ и популяциям, положительным/отрицательным по каспазе-3, на основе контроля ΌΜδΟ и групп, обработанных лекарственным средством с низкой/высокой концентрацией. Данные представлены в виде процента содержания διιΕ01 ДНК, содержания 4Ν+ ДНК, Βτάυ и популяций, положительных по расщеплению каспазой-3. Кривые концентрация-эффект и значения ЕС₅₀ рассчитывали с использованием четырехпараметрического уравнения.

Клеточные линии ΜΕδ-δΑ Ό/5 и ΜΕδ-δΑ, обработанные ΑΜ0 900 или паклитакселом (таксолом): Анализ р-Г истона Н3 (Α^^ауδсаη νΤΐ).

Клетки ΜΕδ-δΑ Ό/5 и ΜΕδ-δΑ наносили при плотности 10000 клеток на ячейку на 96-луночный планшет в полной среде и культивировали в течение 24 ч. На следующий день клетки обрабатывали ΑΜ0 900 или таксолом в диапазоне 10 значений концентрации (от 1.25 мкМ до 0.0024 мкМ) в течение 24 ч с конечной ΌΜδΟ концентрацией в среде 0.1%. Клетки отмывали и фиксировали путем добавления 100 мкл 2/ формальдегидного фиксирующего буфера в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки отмывали и пермеабилизировали 100 мкл отмывочного буфера в течение 15 мин. Клетки иммунофлуоресцентно окрашивали антителом к р-гистону Н3 (5 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Клетки промывали в 100 мкл отмывочного буфера. Затем клетки инкубировали с антикроличьим козьим антителом, конъюгированным с флюоресцентным красителем А1еха-488 (1.5 мкг/мл) в отмывочном буфере, дополненном ДНК-красителем НоесНех! (1 мкг/мл), и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Клетки дважды промывали 100 мкл отмывочного буфера. 96Луночные планшеты анализировали на системе Се11ош1С8 Αιτ;·ι\^;·ιη УЛ с использованием ΒίοΑρρΙκαбоп Αί^η^ω (Τа^§еΐΑсбνабοη.V2). Процентное содержание р-гистона Н3+ (суммирование 6 полей зрения на лунку с объективом 10/) использовали для получения кривых концентрация-эффект и значений ЕС₅₀ с помощью четырехпараметрического уравнения.

Родительская клеточная линия ΝΟ-Η460 и таксол-резистентная клеточная линия, обработанные ΑΜ0 900 или паклитакселом (таксолом): Анализ содержания ДНК в клеточном цикле (проточная циометрия).

Родительские ΝΟ-Η460 и таксол-резистентные ΝΟ-Η460 клетки засевали при плотности 500000 клеток на лунку в 6-луночный планшет в 2 мл соответствующей полной среды. На следующий день клетки обрабатывали ΑΜ0 900 или таксолом в диапазоне концентраций с 6 точками с конечной концентрацией ΌΜδΟ в среде 0.05%. Через 24 ч клетки импульсно метили с помощью Βτάυ (1:100 разведение) и собирали. Клетки центрифугировали при 1600 об/мин в течение 4 мин и супернатант аспирировали. Клетки отмывали в 1/ΡΒδ, фиксировали в 900 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°С. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для удаления 90% метанола. Клетки промывали 200 мкл отмывочного буфера и окрашивали с помощью 200 мкл иодида пропидия (РГ) в течение ночи при 4°С в темноте. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра (ΌδΜΙ). Пороговый интервал применяли согласно содержанию +4Ν (аналогично >4Ν) ДНК, и δι.ιΌ01- 10 020526 положительных популяций на основе обработанных ΌΜδΘ контролей и групп, обработанных лекарственным средством с низкой/высокой концентрацией. Данные представлены в виде процентного содержания +4Ν ДНК и §иЪО1-положительных субпопуляций. Значения ЕС₅₀ для содержания 4Ν+ (аналогично >4Ν) ДНК или §иЪС1 в клетке были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.

Родительская клеточная линия ΜΌΑ-ΜΒ-231 (Р11)-1ис и таксол-резистентные клеточные линии, обработанные ΆΜΟ 900 или паклитакселом (таксолом): Анализ содержанию ДНК в клеточном цикле (проточная цитометрия).

Родительские ΜΌΑ-ΜΒ-231(Ρ11)-1υο и таксол-резистентные клетки засевали при плотности 250000 клеток на ячейку в 12-луночный планшет в 1 мл соответствующей среды в двух повторностях. На следующий день клетки обрабатывали ΑΜΟ 900 или таксолом в диапазоне 10-точечной концентрации с конечной ΌΜδΘ концентрацией в среде 0.1%. Через 24 ч клетки собирали с помощью 1х трипсин-ЭДТА и переносили в ПЦР пробирки. Клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин и супернатант аспирировали. Клетки фиксировали в 200 мкл ледяного 90% метанола и хранили при -20°С по меньшей мере в течение 24 ч. Фиксированные клетки центрифугировали при 2000 об/мин в течение 4 мин для удаления 90% метанола. Клетки промывали отмывочным буфером и окрашивали с помощью 200 мкл иодида пропидия (ΡΙ) в течение 30 мин при 4°С в темноте. Перед получением данных добавляли дополнительно 400 мкл ΡΙ. Данные получали и анализировали с помощью проточного цитометра (Ь8Р11). Пороговый интервал применяли согласно содержанию +4Ν (аналогично >4Ν) ДНК на основе ΌΜδΘ контролей и групп, обработанных лекарственным средством с низкой/высокой концентрацией. Данные представлены в виде процентного содержания контроля для популяций, положительных на содержание +4Ν ДНК. Значения ЕС₅₀ для содержания 4Ν+ ДНК в клетке были рассчитаны с использованием четырехпараметрического уравнения.

Таблица 1. Ιη Υίίτο ΑΜΟ 900 ингибирует клеточную пролиферацию многих видов солидных опухолей

Опухолевая клеточная линия	Происхождение	АМС 900 ЕС» (мкМ)
нет 11б т р21-/-	Ободочная кишка	0 001
нет 116ДНр21 1/1	Ободочная кишка	0.001
НСТ15*	Ободочная кишка	0.002
НТ29	Ободочная кишка	0.005
8\У620	Ободочная кишка	0.002
8\У480	Ободочная кишка	0.002
НОР-92	Легкое	0.002
НОР-62	Легкое	0.002
ΝΟΙ-Η460	Легкое	0.001
А549	Легкое	0.001
РСЗ	Предстатель ная железа	0.002
ЩЛ45	Предстатель ная железа	0.002
ВТ549	Молочная железа	0.004
МЦА-МВ-231	Молочная железа	0.002
Т47Ц	Молочная железа	0.005
МСР7-р53+	Молочная железа	0.001
МСГ7-р53-	Молочная железа	0.003
СА1.51	Молочная железа	0.002
ЗК-ОУ-З	Яичник	0.002
МЕ8-8А Цх5*	Матка	0.001
8К-МЕ1.-2	Кожное	0.002
А498	Почки	0.001
769Р*	Почки	0.002
САКМ	Почки	0.001
5К-НЕР-1	Печень	0.001
8Νυ449*	Печень	0.002

*Паклитаксел-резистентные опухолевые клеточные линии (ОуогГГу с1 а1., 2006, Наткет, Ο. Α. с1 а1. Μιιΐΐίύπΐβ (Р1с1о1гор1с) РемЧапсе ίη Оо\огаЫст-5е1ес1ей УапапЕ оГ Нитап δαίΌΟίηα Се11 Ьше ΜΕδ-δΑ Сапсег КекеагсЬ, 1985, 45, 4091-4096;

δζакас5, Ο. е! а1. РтеФсйпд йгид кепкйтуйу апй те8181апсе РтойНпд ΑΒС йапкройет депек ίη сапсег се115. Сапсег Се11, 2004, 6, 129-137;

δζакас5, Ο. е! а1 Татдейпд тиЮ-йтид те8181апсе ш сапсег ΝηΙ Кеу Нтид Н18соуету, 2006, 5, 219-234.

- 11 020526

Таблица 2. Ιη νίίτο ΛΜΟ 900 блокирует клеточное деление в некоторых гематологических типах опухолей

Опухолевая клеточная линия	Гематологический тип	АМС 900 ЕС»(мкМ)
НЬ-60	Промиелоцитарный лейкоз	0 002
К562	Хронический миелолейкоз	0 001
МОЬТ-4	Т-клеточный лейкоз	0 002
Дигка(	Т-клеточный лейкоз	0 001
ΚΡΜΙ-8226	Множественная миелома	0 002
Ы266-В1	Множественная миелома	0 002

Клетки обрабатывали ΛΜΟ 900 в течение 48 ч (без удаления соединения) Проточная цитометрия основной анализ выполняли с использованием множественных конечных показателей (расщепление каспазой-3, Втби, 8иЬО1 и содержание +4Ν ДНК (содержание >4Ν ДНК) Значения ЕС₅₀ получали с использованием конечного показателя содержания +4Ν ДНК Представленные значения ЕС₅₀ представляют собой одну кривую доза - эффект для 10 точек.

Таблица 3. Ιη νίίτο ΛΜΟ 900 сохраняет активность в опухолевых клеточных линиях, устойчивых к паклитакселу

Пронсхояеде ние	Опухолевая клеточная линия	АМС 900 ЕС₃„ (икМ) @ 24 ч	Паклитаксел ЕС_М (мкМ) @ 24 ч
Маточное³	МЕ8-5А	Родительская линия	<0 002	001
МЕ8-5А Щ5¹	Доксорубицин	<0 002	>125
Молочная железа⁶	МЦА-МВ-231	Родительская линия	0 001	0 002
МЦА-МВ-231-Тк\о]-г	Паклитаксел	0 001	0 095
Легкое⁵	ΝΟ-Η460	Родительская линия	0 001	001
ХС1-Н460-Та.хо1-г²	Паклитаксел	0 001	>0 1

Резистентность (г) определена как > 10-кратная потеря активности (значение ЕС₅₀) в сублинии по сравнению с родительской линией.

* Анализ р-гистона Н3 на основе целломикса. Показанные значения ЕС₅₀ представляют собой один эксперимент по определению доза-эффект для 10 точек.

^Ь Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии. Значения ЕС₅₀ получали с помощью соответствующих конечных показателей содержания ДНК (содержание >4Ν ДНК (ΑΜΟ 900) и §иЬ Ο₁(паклитаксел)). Значения ЕС50 представляют один эксперимент, выполненный в двух повторностях для 10 точек доза-эффект. Клеточные линии ΜΌΑ-ΜΒ-231 содержат трансген, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок и люциферазу.

^с Анализ содержания ДНК методом проточной цитометрии. Значения ЕС₅₀ получали с помощью соответствующего конечного показателя содержания ДНК (содержание >4Ν ДНК (ΑΜΟ 900) и §иЬ Οι (паклитаксел)). Значения ЕС₅₀ представляют один эксперимент, выполненный в двух повторностях для 6 точек доза-эффект.

¹ Сублиния, резистентная ко многим лекарственным препаратам, ΜΕδ-δΑ Ό/5, была образована из родительской клеточной линии ΜΕδ-δΑ путем выращивания клеток в присутствии повышающихся концентраций доксорубицина. Клеточная линия ΜΕδ-δΑ Ό/5 гиперэкспрессировала Р-др (Наткет е( а1, 1985).

² Паклитаксел-резистентные сублинии ΜΌΑ-ΜΒ-231-Таксол-т и НС1-Н460-Таксол-г были получены из их соответствующей родительской линии путем выращивания клеток в присутствии повышающихся концентраций паклитаксела. Обе сублинии являются положительными по Р-др на основании метода проточной цитометрии.

Фиг. 1. Действие ΑΜΟ 900 и таксола на клеточные линии ΜΕδ-δΑ и ΜΕδ-δΑ Ό/5, значения ЕС₅₀для р-Г истона Н3.

Опухолевые клеточные линии матки обрабатывали контролем (ΌΜδΟ), ΑΜΟ 900 или паклитакселом (таксолом) в диапазоне доз с 10 точками (от 0.0024 до 1.25 мкМ) в течение 24 ч. Клетки затем фиксировали и окрашивали антителом к р-гистону Н3 и контрокрашивали с помощью ДНК-красителя (Ноесйе8(). Анализ на основе изображений (Лгга\>сап νΤί) выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по р-гистону Н3. Кривые доза - эффект представляют концентрации ΑΜΟ 900 или таксола, нанесенные против положительных по р-гистону Н3 клеток в виде процента ΌΜδΟ-обработанного контроля (РОС). Значения ЕС₅₀ были рассчитаны с помощью четырехпараметрической подобранной модели.

Фиг. 2. Действие ΑΜΟ 900 и таксола на родительскую клеточную линию ΝΟΙΉ460 и таксорезистентную клеточную линию ΝΟ-4460, значения Ε^₀ для содержания ДНК в клеточном цикле.

- 12 020526

Клеточные линии опухоли легкого обрабатывали контролем (ΌΜδΘ), ЛМС 900 или таксолом в диапазоне доз с 6 точками в течение 24 ч. Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по >4Ν ДНК или 8иЬС1 ДНК. Кривые доза - эффект для АМС 900 представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по >4Ν ДНК. Кривые доза - эффект для таксола представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по 8иЬС1 ДНК. Значения ЕС₅₀ были рассчитаны с помощью четырехпараметрической модели подбора.

Фиг. 3. Действие АМС 900 и таксола на клеточную линию ΜΌΑ-ΜΒ-231 и таксол-резистентную клеточную линию ΜΌΑ-ΜΒ-231, значения ЕС₅₀ для содержания ДНК в клеточном цикле.

Опухолевые клеточные линии молочной железы обрабатывали контролем (ΌΜ8Θ), ΑΜС 900 или таксолом в диапазоне доз с 10 точками в течение 24 ч. Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии выполняли для измерения процентного содержания клеток, положительных по >4Ν ДНК или 8иЬС1 ДНК. Кривые доза - эффект для ΑΜС 900 представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по >4Ν ДНК. Кривые доза - эффект для таксола представляют концентрацию лекарственного средства, нанесенную против процентного содержания клеток, положительных по 8иЬС1 ДНК. Значения ЕС₅₀ были рассчитаны с помощью четырехпараметрической модели подбора.

Пример 3.

Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью ΑΜС 900-индуцированного подавления активности Аигога киназы, антипролиферативную активность ΑΜС 900 оценивали ίη νίνο во многих человеческих моделях ксенотрансплантатов, включающих модели рака молочной железы, ободочной кишки, лейкоза, легкого, поджелудочной железы и матки, выращенных у бестимусных мышей. Мышам вводили орально ΑΜС 900 в дозе 3.75, 7.5 или 15 мг/кг ΒΙΌ (два раза в сутки) в течение 2-х последовательных дней в неделю или 3 мг/кг ΒΙΌ ежедневно на протяжении исследования, начиная с момента установления опухолей Реагенты, растворы, оборудование, формулирование ΑΜС 900, измерение объема опухоли и расчеты проводили в целом, как описано в примере 4 ниже. Было обнаружено, что ΑΜС 900 значительно ингибирует рост опухолей во всех протестированных моделях ксенотрансплантатов по сравнению с контрольной группой, которой вводили носитель (табл. 4).

Таблица 4. ΑΜС 900 ингибирует рост многих моделей ксенотрансплантатов

Паклитаксел восприимчивость ги νιίη>	Происхождение опухоли	Клеточная линия	АМС 900 %ТО1*
да	Ободочная кишка	нет 116	83
нет	Ободочная кишка	НСТ15	51
да	Ободочная кишка	Со1о 205	58
да	Легкое	ΝΟΙ-Η460	85
нет	Легкое	ХС1-Н460-3’а\о1-г	66
нет	Матка	МЕЗ-8А 0x5	73
да	Матка	МЕЗ-ЗА	86
да	Лейкоз	НЬ60	68
да	Молочная железа	ΜϋΑ-ΜΒ-231	82
Νϋ	Поджелудочная железа	М\|аРаСа2	62

(ТС1) ингибирование роста опухоли, *%ТС1, выбранный из прерывного или непрерывного режима введения на основе самого лучшего эффективного ответа (ΝΏ) не определен, резистентность (г), определенная как >10-кратная потеря активности (значение ЕС50) по сравнению с восприимчивыми к таксану опухолевыми клеточными линиями.

Действие АМС 900 тестировали на мультирезистентной клеточной линии МЕ8-8А ϋχ5, выращенной ΐη νίνο в виде ксенотрансплантата опухоли

Мышам вводили перорально ΑΜС 900 в дозе 15 мг/кг ΒΙΌ (два раза в сутки) в течение 2-х последовательных дней в неделю или 3.0 мг/кг два раза в сутки на протяжении исследования. Дозирование инициировали после установления опухоли (через 10 дней после имплантации опухоли). Терапия ΑΜС 900 вызвала статистически значимое ингибирование роста опухоли с использованием доз и режимов ΑΜС 900 по сравнению с контрольной группой носителя (фиг. 4; р < 0.0001, апостериорный тест Даннета). Сравнимое ингибирование роста опухоли было также удивительно достигнуто в 2-х других резистентных к лекарственным средствам моделях (НСТ15 и NСI-Н460-Таксол-^ [резистентный]) с использовани- 13 020526 ем аналогичных режимов лечения (см. табл. 4).

Фиг. 4. ЛМО 900 ингибирует рост установленных ксенотрансплантатов опухолей ΜΕδ-δΆ Όχ5.

ΜΕδ-δΆ Όχ5, мультирезистентные клетки (2х10⁶) инъецировали подкожно в правый бок самок бестимусных мышей. Опухоли измеряли дважды в неделю. Лечение начинали на 10 день, когда объем опухоли составил ~100 мм. Мышей дозировали перорально ЛМО 900 два раза в сутки, прерывисто или непрерывно. Все группы снабжались пищевыми добавками на ежедневной основе на протяжении исследования для поддержания массы тела. Данные представлены как среднее ±δΕΜ для каждой группы (п = 10 на группу), Р-величины соответствуют статистической разнице между группами, обработанными носителем и АМО 900, определенные с помощью КМАЫОУА с последующим тестом Даннета роЧ-Ьос. Стрелка обозначает начало дозирования.

Пример 4.

Для изучения ингибирования клеточной пролиферации с помощью индуцированного АМО 900 подавления активности Аигога киназы, антиопухолевую активность АМО 900 оценивали ίη νί\Ό против таксол-резистентных опухолевых ксенотрансплантатов ΝΕΙ-Η460 у бестимусных мышей. Мышам вводили перорально (РО) АМО 900 ΒΙΌ (два раза в сутки) с интервалом или непрерывно. Мышам внутривенно (ΙΡ) вводили паклитаксел (таксол) 5 дней в неделю. Соединение компании Атдеп использовали в качестве положительного контроля в этом исследовании (данные не показаны). Опухоли измеряли дважды в неделю. Лечение начинали на 12 день после установления опухолей. Все группы снабжались пищевыми добавками на ежедневной основе на протяжении исследования для поддержания массы тела.

Животные и ткани

Вид/Линия: бестимусные.

Количество/Пол: 125/самки.

Средний вес: 20 - 30 г в день рандомизации.

Тип ткани: Νί'.Ί-Η460 таксол-резистентная.

Источник: Атдеп Сапсег РЬагтасо1оду Се11 Вапк.

Статус заболевания субъекта: Несущая опухоль мышь

Уход за животными: средства АМАЬАК.

Тестируемые материалы

Тестируемый продукт: АМО 900.

Производитель: Атдеп 1пс.

Тестируемый продукт: таксол.

Производитель: ВгМоЬМуеге δςυίόό.

Основной состав реагентов

Тестируемое соединение: АМО 900.

Исходная концентрация: 1.5, 0.3 мг/мл.

Формулирование: еженедельно, использовать в течение 7 дней.

Носитель: 2% НРМС/1% ΊΑΑ80 рН2.2.

Доза (10 мл/кг при индивидуальной массе тела) - диапазон дозы: 0.20-0.30 мл.

Способ введения: перорально (РО).

Тестируемое соединение: таксол.

Исходная концентрация: 6 мг/мл.

Формулирование: получено от компании ВшТк РЬагтасу.

Производитель: ВгМоЬМеуегА δςυίόό.

Носитель: физиологический раствор.

Способ введение: внутривенно (ΙΡ).

Составы

АМО 900 (свободное основание) готовили в виде суспензии с концентрациями 1.5 и 0.3 мг/мл. Объем доз был эквивалентен 10 мл/кг. Таксол (Вг181о1 Меуеге δςυίόό) приобретали от компании ВшТк РЬагтасу (№\\Ьигу Рагк, СА) и ежедневно разводили базовую концентрацию 6 мг/мл до концентрации рабочего раствора 1.25 мг/мл.

Протокол лечения

Группа	К-во	Способ	Лечение	Доза (мг/кг)	График
1	10	РО	Носитель	-	ВТО 7 дней/ неделю х 3 недели
2	10	РО	АМО 900	3	ВТО 7 дней/ неделю х 3 недели
3	10	РО	АМО 900	15	ВТО 2 дней ΟΝ/5 дней ОРГ/ недель х 3 недели
4	10	ΙΡ	Таксол	12.5	ОТО 5 дней/ неделю х 2 недели

- 14 020526

Продолжительность периода лечения для АМО 900 составила три недели и две недели для группы таксола. Опухоли измеряли с помощью цифрового калипера и мышей взвешивали два раза в неделю. Объемы опухолей рассчитывали следующим образом: Объем опухоли (мм³) = [(V² ХЬ)/2], где ширина (XV) определена как самая маленькая из 2-х измерений и длина (Ь) определена как самая большая из 2-х измерений. Ингибирование опухоли рассчитывали следующим образом: сначала брали [начальный объем опухоли минус конечный объем опухоли] для контрольной и всех лечебных групп; далее брали изменение объема обработанной опухоли, деленное на объем контрольной опухоли, минус один, и затем умножали на 100. В табл. 5 и фиг. 5 ниже представлены объем опухоли и результаты ингибирования роста опухоли.

Таблица 5. Итоговые данные объема опухоли

Группа	Среднее	ЗЕ	% Ингибирование	Усредненное
Носитель (НРМС) РО ВЮ 7 дней	1580	215	0.0	1749.7
АМО 900 Зтрк РО ВЮ 7 дней	771	104	80.4	715.6
АМС 900 15трк РО ВЮ 2 дня	689	107	65.7	612.5
Таксол 12.5трк ΙΡ Οϋ 5 дней	1383	283	19.7	1072.0

Фиг. 5. Действие лечения АМО 900 и таксолом на рост установленных таксол-резистентных ксенотрансплантатов Н460.

Фиг. 5 иллюстрирует действие лечения с помощью АМО 900 и таксола на рост установленных таксол-резистентных опухолей Н460. Клетки (2х10⁶ на животное) подкожно инъецировали в правый бок самок бестимусных мышей (п = 10 на группу). Опухоли измеряли два раза в неделю. Лечение начинали через 12 дней после имплантирования опухоли (стрелка), когда объем опухоли составил примерно 170 мм³. Мышей дозировали РО или ΡΙ один или два раза в день в течение 3 недель. Данные представлены как среднее ±8Е (стандартное отношение) для каждой группы. *Р значения (не показаны) соответствуют статистической разнице между группами, обработанными носителем и АМО 900 или таксолом, анализированные при помощи дисперсионного анализа АКОУА с повторными измерениями и критерия Шеффе в течение времени с помощью программы 8ТАТу1Ц№. Дни, предусмотренные графиком, приведены в обозначениях, представляющих дни/неделю. Все группы снабжались пищевыми добавками на протяжении исследования.

Как показано на фиг. 5 выше, лечение несущих опухоль мышей с помощью АМО 900 значительно ингибировало рост опухоли при непрерывном введении (3 мг/кг ВГО в течение 7 дней (60% ингибирования, р = 0.0003)) или с интервалами (15 мг/кг ВГО в течение 2 дней ΟΝ/5 дней ОРР/неделю (66% ингибирования, р < 0.0001)). Таксол значительно не ингибировал рост опухоли при введении дозы 12.5 мг/кг ΙΡ в течение 5 дней/неделю в течение двух циклов дозирования (20% ингибирования, р = 0.5399) в этом эксперименте.

Удивительно и неожиданно было обнаружено, что АМО 900 остается активным в опухолевых клеточных линиях, которые резистентны к трем хорошо охарактеризованным ингибиторам Аигога киназы: ΛΖ^1152; УХ-680 (также называемый как МК-0457); и РНА-739358 (Данусертиб). Ингибиторы, которые были использованы для этих экспериментов, представляют собой соединения, описанные и охарактеризованные в литературе. Например, смотри Ехрей Ορίηίοη 1пуе8Йдайона1 Огнд5 (2009) 18 (4) стр. 379-398; Ехрей Ορίηίοη ТЬегареийе Ра1епК (2009) 19 (3), стр. 321-356. Подробный профиль безопасности, переносимости и рК, включая химическую структуру данусертиба (РНА-739358), в фазе I у пациентов с распространенными или метастатическими солидными опухолями описаны в 81еедЙ8 е1 а1, 1онгна1 о£ Сйтеа1 Опсо1оду, 27, 2009.

Данные, представленные ниже, показывают активность АМО 900 в таксол-резистентных клеточных линиях в сравнении со способностью указанных выше трех хорошо известных ингибиторов Аигога киназы ингибировать фосфорилирование гистона Н3 в этих же самых таксол-резистентных клетках.

Пример 5.

Три ингибитора Аигога киназы (ΛΖ^1152, МК-0457 и РНА-739358) оценивали вначале экспрессирования опухолевыми клеточными линиями МОК переносчиков, выводящих лекарственное средство, Рдр или ВСКР. Неожиданно, АМО 900 ингибировал р-гистон Н3 или индуцировал полиплоидию во всех клеточных линиях, протестированных в отношении статуса Р-др или ВСКР, с одинаковыми значениями 1С₅₀ или ЕС₅₀ (от 2 до 3 ммоль/л). В противоположность этому другие ингибиторы Аигога киназы были менее активными в одной или нескольких клеточных линиях МОК по сравнению с отмеченными чувствительными опухолевыми клеточными линиями, как показано в табл. 6 ниже.

Материалы и методы

Составляющие материалы: молекулярная структура для следующих соединений: паклитаксел и доцетаксел, МЬК8054, МК-0457, ΛΖ^1152 и РНА-739358 имеется в открытом доступе. Материалы были получены от коммерческих источников, при наличии, также как таксаны.

- 15 020526

Клеточные линии: опухолевые клеточные линии были получены от компании АТСС (Ашепсап Туре СиЙиге Со11есйоп), если не указано иное. Клеточные линии ΜΌΑ-ΜΒ-231-РТХ и ΝΟ-Η460-ΡΤΧ были образованы путем выращивания клеток в присутствии увеличивающихся концентраций паклитаксела в течение 6 месяцев. А2П1152-резистентная клеточная линия НСТ116 была образована путем выращивания клеток в присутствии ΑΖΌ1152 при 80 ммоль/л.

Животные: все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с требованиями Национального комитета по содержанию и использованию животных (1АСИС) и Министерством сельского хозяйства США. Бестимусных самок мышей в возрасте от четырех до шести недель (Наг1ап 8ргадие Эа\\1еу) помещали в стерильные клетки и содержали в стерильных условиях. Лабораторное содержание животных предусматривало чередующиеся циклы темноты и света (по 12 ч каждый) и отвечало стандартам Ассоциации по оценке и аккредитации условий содержания лабораторных животных (АААЬАС). Пища, вода и пищевые добавки предлагались ай ПЬйиш. Все лекарственные средства вводились исходя из индивидуальной массы тела каждой мыши.

Анализы изображения клетки на основе флуоресценции: одновременный многопараметрический анализ выполняли на Аггау8сап νΤί НС8 Кеайег (Се11отю8). Опухолевые клеточные линии обрабатывали АМС 900, ΑΖΌ1152, ΜΚ-0457 или РНА-739358 (диапазон концентраций изменялся на основании активности). Клетки готовили для внутриклеточного окрашивания анти-р-гистон Н3 8ег¹⁰ антителом, как описано ранее (1). Обнаружение проводили с помощью антитела апй-гаЬЬй 1дС-а1еха-568 и ΌΑΡΙ. Клеточные уровни р-гистона Н3 анализировали с использованием алгоритма Тагде! Асйуайоп ν2 а1догййт (Се11от1С8) для определения процента положительных клеток. Для анализов изображений кривые концентрация - эффект и соответствующие значения 1С₅₀ и ЕС₅₀ рассчитывали с использованием процентного содержания пораженных клеток по сравнению с контролем ΌΜ8Θ.

Анализ колониеобразования: опухолевые клетки обрабатывали АΜС 900, паклитакселом или ΑΖΌ1152 (0.5, 5, 50 нмоль/л) в течение 48 ч, дважды отмывали полной средой, и заново засевали при плотности 5000 клеток на лунку в свободную от лекарственного средства среду. Клетки выращивали до тех пор, пока лунки с ΌΜ8Θ контролем не становились конфлюэнтными. Клетки окрашивали красителем кристаллическим фиолетовым (81дта), отмывали дистиллированной водой и снимали изображение с использованием цифрового сканера (Не^1е11-Раскагй).

Анализ содержания > 4Ν ДНК: опухолевые клетки обрабатывали_АΜС 900, ΑΖΌ1152, ΜΚ-0457 или РНА-739358 (диапазон концентрации изменялся исходя из активности) в течение 24 ч и готовили к анализу клеточного цикла (ДНК окрашивание только), как описано ранее (1). Клетки анализировали на Ь8К11 проточном цитометре с использованием программного обеспечения ΒΌ РАС8. Кривые концентрация - эффект и соответствующие значения ЕС₅₀ рассчитывали с помощью процентного содержания >4Ν ДНК в клетках по сравнению с ΌΜ8Θ контролем.

Окрашивание клеточной поверхности на Ρ-др и ВСКР: экспрессию на поверхности клеток Ρ-др (АВСВ1) и ΒΤ'ΡΡ (АВСС2) определяли путем окрашивания живых клеток на льду в течение 30 мин с помощью Р1ТС-конъюгированных Ρ-др (ΒΌ Вюкаепсе) или АРС-конъюгированных Βί’ΡΡ (^ПИроге) антител. Сходные по изотипу антитела (ΒΌ Вюкшепсе) использовали в качестве контролей, а также стойкости краски 7-аминоактиномицина Ό (ΒΌ РюхаепсеО для исключения мертвых клеток. Клетки анализировали на проточном цитометре Ь8К11 с использованием программного обеспечения ΒΌ РАС8 ЭКа.

Анализ гена аигога киназы: тотальную РНК и геномную ДНК выделяли из замороженной клеточной массы (три А7П1152-резистентных клеточных субклона и одна контрольная родительская клетка) стандартными методами экстракции нуклеиновых кислот. Тотальную РНК использовали для синтеза кДНК (набор Айуап1аде ΡΤ-Ρί’Ρ кй, С1оп1есй). ПЦР-амплификацию непроцессированных транскриптов аигога-А и -В выполняли с использованием набора Ехрапй-ро1утега8е-1опд-1етр1а1е кй (Косйе). Пары праймеров для ПЦР включали: аигога-А (ССТТСТТАСТТАТТАСАССТАСАСССАТСАТС и

ТСААССАТТТСТСССССТССАССАТТС), аигога-Β (ТСТССТСССССТТТСТСТСТААССАТС и

АССССАСТСААТСАСАСССАССАТС).

Семь экзонов аигога-С были амплифицированы с помощью такого же набора ΡΤ'Ρ. как описано выше, из геномной ДНК с использованием семи наборов праймеров на основе 5' и 3' фланкирующих интронов ((ААСАСССАТССАСАСССТТСАССААС и

ССАСАСАСССАСТСТСТТСТТСАТСС), (ААССССАССАТТСССАТСССТСАСТТТС и

СТАТТТССССААААТССТССССТСАСАС), (АССАСССАСТСАСССТСССАТСАТАТС и

ТСАСАСССАСАААСАСАССТСССАС), (ССТААСТСТТССАССТСАСАСССАААТТС и

САТТАААСТСССТСАТТССТААСТССТАСТСАС),

- 16 020526 (СТСААТОАААОСТООООААООАОААТТТСС и

АОАООСАТТОАТАОТООАААССТСАСАТС), и (АСАОТОАОАСТТАСАОАСОСАТССТСААО и

АООАОАОСТСССТОААСАСАСАСАААО)).

ПЦР-продукты ДНК субклонировали в вектор рСК2.1 согласно рекомендуемому производителем протоколу (йпуйгодеп). Очищенные плазмиды, содержащие продукты гена аигога-А, -В и -С, подвергали циклическому дидезокси-секвенированию с использованием фланкирующих векторных праймеров. Реакции секвенирования выполняли на автоматическом генетическом анализаторе 3730x1 ПЫА Лпа1у/сг5 (АррПсй ВюкуЫепъ) и результаты анализировали с использованием программного обеспечения §есщепсНег войуаге (Оепе Сойек Согрогайоп).

В табл. 6 проиллюстрировано проявление АМО 900 одинаковой активности во всех мультирезистентных опухолевых клеточных линиях.

Таблица 6-А

Обозначение клеточной линии	Р-8Р статус	Анализ р-гистона НЗ, значение 1С50 (нмоль/л)
АМО 900	ΑΖΟ1152	МК-0457	РНА-739358
ΝΟΙ-Η460 родительская		3	131	123	510
ΝΟΗ460 РТХ паклитаксел резистентная	+	3	>500	468	>1250
МОА-МВ-231 родительская		2	16	43	49
МОА-МВ-231 РТХ паю итаксел-ре зистентная	+	3	>500	277	>1250
МЕ8-5А родительская		3	51	51	113
МЕ5-5А-Ох5 доксорубицин резистентная	+	2	>500	>1250	>1250

Клеточная линия	ВСКР статус	Анализ содержания >4Ν ДНК, значение ЕС₅₀ (нмоль/л)
АМС 900	ΑΖϋ1152	МК-0457	РНА-739358
Ш26-И1	-	2	12	46	67
ΚΡΜΙ8226	+	3	865	162	>1250

Примечание: происхождением клеточной линии ЫС1-Н460-РТХ является легкое; клеточной линией МПА-МВ-231-РТХ является молочная железа, клеточной линией МЕ8-8А Όχ5 является матка, и клетками РРМ1-8226 являются клетки множественной миеломы.

Аналогичные эксперименты проводили с другими клеточными линиями, как показано в табл. 6-В ниже.

Клеточная ЕС50 (пМ)	АМС	ΑΖϋ1152-	РИА-	мк-
Клеточная линия	Происхо ждение	900	НОРА	739358	0457
МСР-7	Молочная железа	1	11	6»	27
1ЧС1-Н460-РТХ*	Легкое	3	>500	>1250	468
НСТ15*	Ободочна я кишка	2	>625	>1250	908
МЕ5-8А Цх5*	Матка	2	>500	>1250	>1250
МЦА-МВ-231-РТХ*	Молочная железа	3	>500	>1250	277
5ΝΓ499*	Печень	2	>1250	>1250	Νϋ
769Р*	Почка	4	703	>1250	Νϋ
ΚΡΜΙ-8226**	Множеств енная миелома	3	865	>1250	162

Примечание: статус переносчика АВС (* = Р-др+; ** = Р-др и/или ВСРР+) ΝΏ = не определено.

- 17 020526

Пример 6.

Кроме того, АМС 900 оценивали ίη νίνο против клеток НСТ-116, адаптированных к росту в присутствии ΑΖΌ1152, селективного ингибитора аигога В киназы. Этот эксперимент также проливал свет на возможные альтернативные механизмы резистентности к ингибиторам аигога киназы. Таким образом, клетки НСТ116 адаптировали к росту в присутствии ΑΖΌ1152. Активность АМС 900 оценивали в родительской клеточной линии НСТ116 и ΑΖ^1152-резистентной клеточной линии.

Было обнаружено, что АМС 900 индуцирует полиплоидию и ингибирует колониеобразование сублинии НСТ116, адаптированной к росту в присутствии ΑΖ^1152. Значения ЕС₅₀ для АМС 900 для клеточного содержания >4Ν ДНК составили 2 и 5 нмоль/л по сравнению с 34 и 672 нмоль/л для ΑΖ^1152, соответственно (фиг. 6-А). АМС 900 ингибировало колониеобразование в обоих клеточных линиях НСТ116 при концентрациях >5 нмоль/л, в то время как другая сублиния была нечувствительна к ΑΖ^1152 при 50 нмоль/л (фиг. 6-В). Обе клеточные линии НСТ116 были одинаково чувствительными к паклитакселу и были отрицательными в отношении экспрессии Р-др и ВСКР (фиг. 6-С). Примечательно, что другая сублиния НСТ116 содержит миссенс-мутацию в аллели гена аигога-В (ТСС ТТС; Ж221Б), в то время как мутаций в генах аигога-А и -С не было обнаружено. На основании полученных результатов можно предположить, что АМС 900 сохраняет активность в опухолевых клетках, которые являются резистентными к ΑΖ^1152 и в особенности опухолевых клетках, несущих гетерозиготную мутацию в аигога-В, которая может быть ответственной за резистентность к ΑΖ^1152. Таким образом, неожиданные положительные результаты указывают на удивительную способность МАС 900 сохранять эффективность при лечении опухолевых клеток, которые стали резистентными к ΑΖ^1152.

Фиг. 6. Эффект АМС 900 на родительскую клеточную линию НСТ116, ΑΖ^1152-резистентную НСТ116 клеточную линию (фиг. 6-А) и паклитаксел-резистентные клеточные линии (фиг. 6-В).

Способы.

Фиг. 6-А - клеточные линии НСТ116 обрабатывали увеличивающимися концентрациями АМС 900 или ΑΖ^1152 в течение 24 ч. Проточную цитометрию использовали для оценки накопления клеток с содержанием >4Ν ДНК, выраженным как процент обработанных ЭМ8О контролей (РОС). Кривые концентрация-эффект и вычисленные значения ЕС50 были определены на основании двух независимых экспериментов (столбцы, ±8Ό (стандартное отклонение).

Фиг. 6-В - анализ колониеобразования выполняли с помощью клеточных линий НСТ116 (родительской и ΑΖ^1152-резистентной). Клетки обрабатывали ЭМ8О, АМС 900, ΑΖ^1152 или паклитакселом в указанных концентрациях в течение 48 ч и заново засевали в полную среду, не содержащую ингибитор. После того, как ОМ8О-обработанные клетки достигали конфлюэнтности, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и снимали изображение (лунки в двух повторностях).

Фиг. 6-С - распространенность экспрессии Р-др и ВСКР на клеточной поверхности клеточных линий НСТ116 (родительской и ΑΖ^1152-резистентной), совместно окрашенных фикоэритрин (РЕ)конъюгированными Р-др и аллофикоцианин (АРС)-конъюгированными ВСКР антителами оценивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Контрольные изотипы использовали для каждой клеточной линии для установления фона флуоресценции. Клеточные линии МЕ8-8А-Ох5 и КРМ1 8226 использовали в качестве положительных контролей для экспрессии Р-др и ВСКР, соответственно.

Животные: самок бестимусных мышей (Наг1ап 8ргадие ИаМеу) в возрасте 5-6 недель получали и помещали в стерильные клетки. Водой, очищенной обратным осмосом, и обработанной в автоклаве пищей снабжали неограниченно. Все исследования на животных выполняли согласно внутреннему протоколу БАСИС и соблюдали все требования АААИАС.

Фармакодинамические анализы (обнаружение фосфо-Гистона Н3): мышам с установленными ксенотрансплантатами человеческих опухолей НСТ 116 или Со1о 205 перорально вводили однократную дозу контроля (только носитель) или АМС 900 в указанном диапазоне (η = 3 животных на группу). Через 3 или 6 ч собирали опухоль, костный мозг или кожные ткани для фармакодинамической оценки (уровни ргистона Н3). Также, собирали плазму для фармакокинетического анализа.

Проточная цитометрия (РСМ): опухоли диссоциировали в одноклеточную суспензию и фиксировали в 90% метаноле при -20°С в течение по меньшей мере 24 ч. Клетки затем окрашивали анти-ргистоном Н3 (зег-10) и антицитокератин антителами и контрокрашивали иодидом пропидия. Показатели получали на проточном цитометре Ь8К11 с использованием программного обеспечения РАС8Итуа. Костный мозг и цитокератин-положительные опухолевые клетки в С2М-фазе клеточного цикла оценивали на р-гистон Н3. Клетки опухоли и костного мозга собирали из обработанных носителем мышей, которые получали в качестве контролей р-гистон Н3. Статистическую значимость определяли с помощью анализа А^УА.

Сканирующая лазерная цитометрия (Ь8С): срезы в трех повторностях из образцов ткани РРРЕ (кожа и опухоль) окрашивали анти-р-гистон Н3 антителом с последующим козьим антителом против кроличьего 1дС, конъюгированным с А1еха-633. На срезы наносили раствор Рго1опд Со1й апШайе, включая ДНК-краситель НоесЙ5133342. Изображения делали на Б8С с использованием объектива 40х (при разрешающей способности 0.5 мк). Число р-гистон Н3 событий определяли на основе установленного порого- 18 020526 вого значения красного флуоресцентного. Подсчитывали только события, которые были больше 20 мкм². Контурные события были перенесены в галерею изображений для верификации точности сегментирования. Данные анализировали с использованием 8Α8 У9.3 с прилагаемой регулировкой Даннетта. Все статистические тесты оценивали при альфа = 0.05 уровне значимости.

Тонкоиголъные пунктаты (ΡΝΑ): опухолевые пунктаты собирали с помощью иглы 25 калибра через маленький надрез в коже, окружающей опухоль, в предварительно установленном и соответствующем паттерне (3х), затем вытесняли в 2% параформальдегид. Клетки наносили на предметное стекло микроскопа и окрашивали антителами, специфичными к ЕрСАМ (эпителиальный опухолевый маркер, А1еха Р1иог 488) и рНН3 (маркер митоза, А1еха 647), и контрокрашивали ЭАР1 (содержание ДНК). 1Су1е Ь8С (лазеры 405 нм, 488 нм, 633 нм, РМТ фильтры: 450/40, 530/30, 650/ЬР) использовали для получения изображений с увеличением 40 х и количественного определения содержания ЕрСАМ, рНН3 и ДНК. Целостность популяции устанавливали путем перемещения изображений клеток в галереи. Представлено количество клеток, положительных по ЕрСАМ, рНН3, в Ο2Μ. Данные представлены как среднее +/- стандартная ошибка среднего (8ΕΜ). Статистическую значимость определяли с использованием ΑΝΟνΑ с помощью апостериорного (ροβΐ Нос) анализа методом Бонферрони и Даннета.

Концентрация ΑΜΟ 900 в плазме (фармакокинетический анализ): образцы плазмы (50 мкл) экстрагировали путем добавления смеси растворителя (90% метанола, 10% воды с 0.01% трифторуксусной кислотой) для изолирования аналита и осаждения белков плазмы. Концентрации ΑΜΟ 900 в экстрагированных образцах определяли методом ЬС-М8/М8 с использованием обращено-фазовой хроматографии на аналитической колонке ναπαη РитвиН РРР (2.0х30 мм, 5 микрон) с помощью 0.1% муравьиной кислоты в воде (подвижная фаза А) и ацетонитрила с 0.1% муравьиной кислотой (подвижная фаза В).

Модели ксенотрансплантатов: мышей инъецировали подкожно 2х10⁶ человеческих опухолевых клеток ободочной кишки НСТ 116. После установления опухолей (примерно 200 мм³) мышей рандомизировали в экспериментальные лечебные группы (п = 10) и перорально обрабатывали ΑΜΟ 900 в дозе 1.5, 2.25 или 3 мг/кг ежедневно, либо 3.75, 7.5 или 15 мг/кг с интервалами на протяжении эксперимента. Мышей снабжали пищевыми добавками на ежедневной основе. Объемы опухолей и массу тела записывали два раза в неделю с помощью калипера и аналитических цифровых весов, соответственно. Данные по опухоли представлены как средний объем опухоли +/- 8ΕΜ (среднее стандартное отклонение). Статистическую значимость для ингибирования роста опухоли определяли с помощью повторных экспериментов ΑΝΟνΑ (ΚΜΑΝΟνΑ) с последующим ροβΐ-Нос анализом Шеффе.

Пример 7.

Кроме того, действие ίη-νίνο ΑΜΟ 900 на рост опухоли оценивали на панели человеческих ксенотрансплантатов пяти разных типов опухолей (молочная железа, ободочная кишка, легкое, поджелудочная железа и матка), включая модели ксенотрансплантата ΜΌΚ. Мышам, несущим установленные опухоли, вводили перорально ΑΜΟ 900 в дозе 15 мг/кг ВГО в течение 2 последовательных дней в неделю в течение 3 недель или при 3 мг/кг ВГО каждый день в течение 3 недель. Максимальный процент ингибирования роста опухоли (ΤΟΙ) представлен в табл. 7 ниже для каждой модели ксенотрансплантата. Процент ΤΟΙ рассчитывали как разность между изменением объемов опухолей, обработанных носителем контролей и ΑΜΟ 900 за период исследования. Статистическую значимость ингибирования роста опухоли по сравнению с обработанным носителем контролем определяли с помощью ΚΜΑΝΟνΑ с последующими апостериорными тестами Шиффа или Данетта и обозначали звездочкой (*Р < 0.005, **Р < 0.0005).

ΑΜΟ 900 проявил значительную противоопухолевую активность во всех 9 моделях ксенотрансплантатов (от 50 до 97% ингибирования роста опухоли (ΤΟΙ)) по сравнению с обработанной носителем контрольной группой. Примечательно, что ΑΜΟ 900 был активным в моделях ксенотрансплантатов ΜΕ8-8Α-Όχ5 (84% ΤΟΙ, Р < 0.0001) и ^1-Н460-РТХ (66% ΤΟΙ, Р < 0.0001), которые были резистентными к доцетакселу или паклитакселу, введенным в соответствующих максимально переносимых дозах.

Таким образом, ΑΜΟ 900 ингибирует рост многих человеческих опухолевых ксенотрансплантатов ίη νίνο, включая мультирезистентные модели и стандартные антимитотические лекарственные агенты. В частности, данные показывают, что ΑΜΟ 900 удивительный образом ингибирует активность аитота-В в опухолях НСТ 116 и подавляет рост множества ксенотрансплантатов, представляющих разные типы опухолей.

- 19 020526

Таблица 7

Модель опухоли	Происхождение	Максимум ΤΟΙ (%)
ΜϋΑ-ΜΒ-231	Молочная железа	82**
СОЬО 205	Ободочная кишка	73*
НСТ-15 (МОК)	Ободочная кишка	50*
НСТ116	Ободочная кишка	85**
Ж1-Н460	Легкое	85**
ΝΟΙ-Η460-ΡΤΧ (МОР)	Легкое	65**
М1аРаСа2	Поджелудочная железа	60**
МЕ8-8А	Матка	87**
МЕ5-8А-Эх5 (МОК)	Матка	84**

Ссылки: РауЮп Μ., СЬипд О., Уако\уес Р., е! а1. П18соуегу αηά еуа1иаЬоп о£ άιι;·ι1 СЭК1 αηά СЭК2 ίηЫЬког8. Сапсег Ке8, 2006, 66:4299-4308.

Показания

Механизм, посредством которого опухоли развивают устойчивость к ингибиторам ΑωΌΐΗ киназы, различается для разных агентов. В то время как более четкое понимание молекулярных сил, которые управляют фенотипами рака, будет обеспечивать основу для действия лекарственных средств на молекулярном уровне или терапий, в которых могут использовать идентифицируемые генетические или эпигенетические чувствительности к назначенной терапии, также важно понимать генетическую предрасположенность к резистентности к терапии. Это понимание генетической предрасположенности может являться дополнительным критерием разделения групп пациентов для проспективного исследования. Например, опубликованные наследственные проявления показывают, что ингибитор Αи^ο^а киназы, ΑΖΌ1152, который в настоящее время проходит клиническую оценку, и потенциальное второе клиническое соединение, УХ-680, могут быть относительно неэффективными в опухолевых клетках, которые гиперэкспрессируют ΜΌΚ1 или ΒΟΚΡ. Мутации в домене Αи^ο^а киназы В, которые возникают во время отбора ДНК-репарационно-дефектной клеточной линии карциномы ободочной кишки НСТ116, могут привести к резистентности. Было обнаружено, что эти мутации в каталитическом домене также являются достаточными для того, чтобы сделать клетки резистентными к ΑΖΌ1152 и УХ-680, что указывает на то, что устойчивость к этим агентам может возникнуть независимо от ΜΌΚ. ТЬе РЬатшасодепошюк 1оигпа1. (2009) 9, р§к 90-102.

Настоящее изобретение предлагает соединение ΑΜΟ 900, ингибитор Αи^ο^а киназы, которое обладает способностью лечить рак, который стал рефрактерным к традиционным стандартным химиотерапевтическим агентам, включающим антимитотические средства, такие как таксаны (паклитаксел и доцетаксел), и алкалоиды барвинка. Кроме того, ΑΜΟ 900 обладает способностью лечить рак, который является резистентным к другим ингибирующим Αιιιόηι киназу агентам, включающим, но без ограничения, ΑΖΌ 1152, УХ-680 и РНА-739358. В целом, такие опухоли развивают резистентность в результате более раннего и/или пролонгированного лечения противораковыми агентами.

Соответственно, в одном варианте изобретения предложен способ лечения рака у субъекта, который предусматривает введение субъекту эффективного количества соединения, ^(4-((3-(2-амино-4пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1-фталазинамина, при этом лечение рака у субъекта производилось ранее противораковыми агентами. В другом варианте противораковым агентом является химиотерапевтический агент. В другом варианте химиотерапевтическим агентом является антимитотическое средство или антрациклин. В еще другом варианте химиотерапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из таксола, децетаксела, винкристина, винбластина, виндестина, а также винорелбина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона. В еще другом варианте противораковым агентом является ΑΖΌ1152, РНА-739358, ΜΚ-0457 или их комбинация.

Таким образом, ΑΜΟ 900 может применяться для лечения клеточных пролиферативных нарушений, включающих неконтролируемый клеточный рост и аберрантную регуляцию клеточного цикла, лечение которых производилось ранее стандартными терапиями с помощью таксанов.

- 20 020526

Таким образом, АМС 900 является эффективным, но без ограничения, для предупреждения или лечения рака, включающего, например, разные солидные и гематологические опухоли, такие как карцинома, включая без ограничения рак мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почек, печени, легкого (включая мелкоклеточный рак легкого), пищевода, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы, предстательной железы, матки и кожи (включая плоскоклеточную карциному); гематопоэтические опухоли лимфоидной линии (включая лейкоз, острый лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжскинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Буркетта); гематопоэтические опухоли миелоидной линии (включая острые и хронические миелогенные лейкозы (АМЬ и СМЬ), миелодиспластический синдром и промиелоцитарный лейкоз); опухоли мезенхимального происхождения (включая фибросаркому и рабдомиосаркому и другие саркомы, например, мягких тканей и костей); опухоли центральной и периферической нервной системы (включая астроцитому, нейробластому, глиому и невриному); и другие опухоли (включающие меланому, семиному, тератокарциному, остеосаркому, пигментную ксеродерму, фиброкератому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши), при этом такие виды рака рецидивировали или становились рефрактерными. Рак, такой как рак предстательной железы, рак яичника, рак легкого, рак молочной железы, холангиокарцинома или другие виды рака, которые стали рефрактерными к противораковой терапии, такой как гормоны, также можно лечить с помощью АМС 900.

В одном варианте изобретение предлагает способ лечения одного или нескольких видов рака, выбранных из группы, состоящей из рака матки, рака молочной железы, рака легкого, включая немелкоклеточный рак легкого, рака ободочной кишки, рака предстательной железы, рака кожи, рака почки, рака печени, лейкоза, включая промиелоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз и Т-клеточный лейкоз, множественной миеломы, рака яичника и рака костного мозга у субъекта, при этом способ предусматривает введение субъекту эффективного количества АМС 900, при этом ранее производилось лечение рака у субъекта и он стал рефрактерным к одному или нескольким химиотерапевтическим агентам, выбранным из группы, состоящей из доксорубицина, даунорубицина, дактиномицина, колхицина, винбластина, винкристина, паклитаксела, доцетаксела, этопозида и митоксантрона. В другом варианте изобретения предложен способ лечения одного или нескольких видов рака, выбранных из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, немелкоклеточного рака легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и предстательной железы, или лимфомы, или лейкоза. АМС 900 также является эффективным для лечения опухолей на поздней стадии, включающих без ограничения опухоли мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, немелкоклеточного рака легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и предстательной железы.

Изобретение также предлагает способ лечения солидных опухолей, саркомы (в особенности саркомы Юинга и остеосаркомы), ретинобластомы, рабдомиосаркомы, нейробластомы, гематологических злокачественных заболеваний, включающих лейкоз и лимфому, опухоль-индуцированного плеврита или перикардиального выпота и злокачественного асцита.

Помимо эффективности в лечении человека соединение также является эффективным для ветеринарного лечения домашних животных, экзотических животных и сельскохозяйственных животных, включая млекопитающих, грызунов и подобных. Например, с помощью АМС 900 можно аналогично лечить рак, рефрактерный к стандартному лечению химиотерапиями, у животных, включающих лошадей, собак и кошек.

Составы

АМС 900 может вводиться субъектам, имеющим рак, в виде фармацевтической композиции, содержащей соединение (которое представляет собой активный фармацевтический ингредиент или АР1 изобретения), ^(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4-метил-2-тиенил)-1фталазинамин, в сочетании с одним или несколькими нетоксическими, фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или адъювантами (совместно называемые здесь как вспомогательные материалы). АМС 900 или его фармацевтически приемлемая соль может быть обработана известными в фармацевтике стандартными способами для получения лекарственных и фармацевтических композиций для введения пациентам, включающим человека и других млекопитающих.

Фармацевтическую композицию можно вводить субъекту любым подходящим путем, адаптированным к такому способу, и в дозе, эффективной для лечения рефрактерного рака. Композицию или АР1 можно вводить, например, перорально, мукозально, местно, ректально, пульмонально, например, путем ингаляции распыления, или парентерально, включая внутриваскулярное, внутривенное, интраперитонеальное, подкожное, внутримышечное, внутригрудинное введение и способы инфузии, в виде стандартной лекарственной формы, содержащей традиционные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители.

Для перорального введения фармацевтическая композиция может находиться в форме, например, таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Фармацевтическую композицию предпочтительно готовят в

- 21 020526 форме дискретной единицы, содержащей конкретное количество активного ингредиента. Примерами таких дискретных единиц являются таблетки или капсулы. Например, они могут содержать количество активного ингредиента примерно от 1 до 2000 мг и, как правило, примерно от 1 до 500 мг. Подходящие ежедневные дозы для человека или другого млекопитающего могут изменяться в зависимости от состояния пациента и других факторов, но еще раз могут быть определены обычными способами и практиками.

Количество вводимого АР1 (АМО 900) и режим дозирования для лечения рефрактерного рака зависят от ряда факторов, включая возраст, массу, пол и состояние здоровья субъекта, вид заболевания, тяжесть рака, способ и частоту введения, а также физических и химических свойства АМО 900 или его конкретной формы, включая конкретную форму соли. Таким образом, режим дозирования может различаться. Может быть подходящей суточная доза от 0.01 до 500 мг/кг, предпочтительно от 0.01 до 50 мг/кг, более предпочтительно примерно от 0.1 до 30 мг/кг и еще более предпочтительно примерно от 0.1 до 25 мг/кг массы тела. В одном варианте в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который предусматривает введение субъекту АМО 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективной дозе в интервале примерно от 0.5 мг/кг до 25 мг/кг, при этом рак у субъекта является рефрактерным к лечению антимитотическим агентом. В другом варианте в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который предусматривает введение субъекту АМО 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективной дозе в интервале примерно от 1.0 мг/кг до 20 мг/кг, при этом рак субъекта является рефрактерным к лечению стандартным химиотерапевтическим агентом, включающим антимитотический агент. В еще другом варианте в изобретении предложен способ лечения рака у субъекта, который предусматривает введение субъекту АМО 900 или его фармацевтически приемлемой соли в эффективном количестве в интервале примерно от 3.0 мг/кг до 15 мг/кг, при этом рак субъекта является рефрактерным к лечению антимитотическим агентом. Суточная доза может быть введена в виде одной-четырех доз в сутки.

Для терапевтических целей АМО 900 можно объединить с одним или несколькими адъювантами или эксипиентами, подходящими для указанного способа введения. При введении на основе разовой дозы АМО 900 может быть смешан с лактозой, сахарозой, крахмальным порошком, сложными эфирами целлюлозы и алкановых кислот, целлюлозными алкиловыми сложными эфирами, тальком, стеариновой кислотой, стеаратом магния, оксидом магния, натриевыми и кальциевыми солями фосфорной и серной кислот, желатином, аравийской камедью, альгинатом натрия, поливинилпирролидоном, и/или поливиниловым спиртом для получения конечного состава. Например, АМО 900 и адъювант(ы) могут быть таблетированы или инкапсулированы известными и признанными способами для удобного введения. Примерами подходящих составов являются без ограничения пилюли, таблетки, мягкие и твердые гелевые капсулы, пластинки, орально-растворимые формы и составы с замедленным или контролируемым высвобождением. В частности, составы в виде капсул или таблеток могут содержать один или более агентов с контролируемым высвобождением, таких как гидроксипропилметилцеллюлоза, в виде дисперсии с АР1.

В случае псориаза и других кожных заболеваний может быть предпочтительным наносить составы АМО 900 для местного применения на область воздействия от двух до четырех раз в сутки. Составы, подходящие для местного введения, включают жидкие или полужидкие составы, подходящие для проникновения через кожу (например, линименты, лосьоны, мази, кремы, пасты, суспензии и подобные), а также капли, подходящие для введения в глаза, уши или нос. Подходящие дозы активного ингредиента для местного введения составляют от 0.1 мг до 150 мг, вводимые от одного до четырех, предпочтительно один или два раза в день. Для местных введений АР1 может содержать от 0.001 до 10 мас.%, например, от 1 до 2 мас.% состава, хотя может содержать до 10 мас.%, но предпочтительно не больше чем 5 мас.% и более предпочтительно от 0.1 до 1 мас.% состава.

При изготовлении в виде мази АМО 900 может быть использован либо с парафиновой, либо со смешиваемой с водой мазевой основой. Или же, АМО 900 может быть формулирован в виде крема на основе эмульсии типа масло-в-воде. При необходимости водная фаза основы для крема может включать, например, по меньшей мере 30 мас.% многоатомного спирта, такого как пропиленгликоль, бутан1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин, полиэтиленгликоль и их смеси. Препараты для местного применения при желании могут включать соединение, усиливающее абсорбцию или проникновение активного ингредиента через кожу или другие области воздействия. Примеры таких агентов, усиливающих проникновение через кожу, включают ^ΜδО и родственные аналоги.

АМО 900 также может вводиться посредством трансдермального устройства. Местное введение предпочтительно осуществлять, используя пластырь либо резервуарного и пористо-мембранного типа, либо твердо-матричного типа. В обоих случаях АМО 900 непрерывно высвобождается из резервуара или микрокапсулы через мембрану в проницаемый для активного агента адгезив, который находится в контакте с кожей или слизистой оболочкой реципиента. Если АМО 900 абсорбируется через кожу, то реципиенту вводят контролируемое или предварительно определенное количество АМО 900. В случае микрокапсул инкапсулирующий агент может также действовать как мембрана.

Масляная фаза эмульсий может быть составлена из известных ингредиентов известным способом. Хотя эта фаза может содержать только эмульгатор, она может также содержать смесь по меньшей мере одного эмульгатора с жиром или маслом, либо и с жиром, и с маслом. Предпочтительно гидрофильный

- 22 020526 эмульгатор входит в состав вместе с липофильным эмульгатором, который действует как стабилизатор. Также предпочтительно включать и масло, и жир. Эмульгатор(ы) вместе со стабилизатором(ами) или без них образуют так называемый эмульгирующий воск, и этот воск вместе с маслом и жиром составляет так называемую эмульгирующую мазевую основу, которая образует масляную, дисперсную фазу кремовых препаратов. Эмульгаторы и стабилизаторы эмульсий, подходящие для использования в препарате, включают, например, Твин 60, Спан 80, цетостеариловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат, лаурилсульфат натрия, глицерил дистеарат, по отдельности или с воском, или другими материалами, хорошо известными в данной области.

Выбор подходящих масел или жиров для состава основан на достижении желаемых косметических свойств, поскольку растворимость АР1 в большинстве маслах, пригодных для использования в фармацевтических эмульсионных препаратах, крайне низка. Таким образом, крем предпочтительно должен быть непачкающим, неокрашивающим и смываемым продуктом с подходящей консистенцией, чтобы избежать вытекания из тюбиков или других контейнеров. Могут быть использованы прямые или разветвленные одно- или двухосновные алкиловые сложные эфиры, такие как диизодипат, изоцетилстеарат, диэфир пропиленгликоля и кокосовых жирных кислот, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпалмитат, бутилстеарат, 2-этилгексилпалмитат, или смесь сложных эфиров с разветвленной цепью. Они могут быть использованы по отдельности или в комбинации, в зависимости от требуемых свойств. Или же могут быть использованы липиды с высокой температурой плавления, такие как белый мягкий парафин и/или вазелиновое масло, или другие минеральные масла.

Кроме того, составы, подходящие для местного введения в глаза, включают глазные капли, где активные ингредиенты растворены или суспендированы в подходящем носителе, особенно в водном растворителе для АМО 900. АМО 900 предпочтительно присутствует в таких составах в концентрации от 0.5 до 20%, предпочтительно от 0.5 до 10% и особенно предпочтительно примерно 1.5 мас.%.

Составы для парентерального введения могут быть в форме водных или неводных изотонических стерильных инъекционных растворов или суспензий. Эти растворы и суспензии могут быть приготовлены из стерильных порошков или гранул, содержащих один или несколько носителей или разбавителей, упомянутых для применения в составах для перорального введения, или с использованием других пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Например, АМО 900 может быть растворен в воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, кукурузном масле, хлопковом масле, арахисовом масле, кунжутном масле, бензиловом спирте, хлориде натрия, траганте и/или различных буферах. Другие адъюванты и способы введения хорошо и широко известны в фармацевтической области. АМО 900 также можно вводить путем инъекции в виде композиции, где в качестве подходящего носителя могут быть использованы, например, физиологический раствор, декстроза или вода, или циклодекстрин (например, капситол), солюбилизаторы для сорастворителя (например, пропиленгликоль), солюбилизаторы мицелл (например, Твин 80).

Стерильный инъекционный состав может представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, можно упомянуть воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно используются стерильные нелетучие жирные масла. Для этой цели может быть использовано любое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в приготовлении инъекционных составов находят применение такие жирные кислоты, как олеиновая кислота.

Для ингаляционного введения фармацевтическая композиция может вводиться в форме аэрозоля или с помощью ингалятора, включающего сухой порошковый аэрозоль.

Суппозитории для ректального введения лекарственного средства могут быть приготовлены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим вспомогательным веществом, таким как кокосовое масло и полиэтиленгликоли, которое является твердыми при обычной температуре, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет расплавляются в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства.

Фармацевтические композиции могут подвергаться обычным фармацевтическим процедурам, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычно используемые адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы и подобные. Таблетки и пилюли дополнительно могут содержать энтеросолюбильные покрытия. Такие композиции могут также содержать адъюванты, такие как смачивающие агенты, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.

Комбинации

Несмотря на то что АМО 900 можно дозировать или вводить в виде единственного активного фармацевтического агента, его также можно применять в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими и/или антимитотическими агентами. При введении в виде комбинации, АМО 900 может быть формулирован в виде отдельных композиций, вводимых одновременно или последовательно в разные моменты времени, или АМО 900 может быть введен в виде индивидуальной композиции.

Выражение котерапия (или комбинаторная терапия) относится к применению АМО 900 на- 23 020526 стоящего изобретения и другого химиотерапевтического агента, и предусматривает введение каждого агента последовательно в режиме, который будет обеспечивать благоприятное действие лекарственной комбинации, и, кроме того, предусматривает совместное введение этих агентов главным образом последовательно, например, в виде одной капсулы, содержащей фиксированное соотношение этих активных агентов, или в виде нескольких отдельных капсул для каждого агента.

В частности, введение ЛМО 900 можно сочетать с дополнительным химиотерапевтическим агентом, включая антимитотические терапии, известные опытным специалистам для предупреждения или лечения рака. Изобретение не ограничено в отношении последовательности введения, а именно, ЛМО 900 может вводиться до, одновременно или после введения известного противоракового или антимитотического агента.

Перечисленное выше является только иллюстрацией изобретения и не предполагает ограничения изобретения описанными применениями. Варианты и изменения, которые являются простыми для опытного в данной области специалиста, находятся в рамках объема и сущности изобретения, которые определены в прилагаемой формуле. Все указанные ссылки, патенты, заявки и публикации включены здесь полностью в виде ссылки.

Claims

1. Применение соединения И-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака у субъекта, при этом рак у субъекта является рефрактерным к лечению противораковым агентом.

2. Применение по п.1, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент.

3. Применение по п.2, в котором химиотерапевтическим агентом является агент, выбранный из группы, состоящей из антимитотического агента и антрациклина.

4. Применение по п.2, в котором химиотерапевтическим агентом является агент, выбранный из группы, состоящей из таксола, доцетаксела, винкристина, винбластина, виндезина, а также винорелбина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона.

5. Применение по п.1, в котором противораковым агентом является ΛΖΌ1152, РНА-739358, МК0457 или их комбинация.

6. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой один или несколько из (а) солидных или гематологических опухолей, выбранных из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, мелкоклеточного рака легкого, пищевода, желчного пузыря, яичника, поджелудочной железы, желудка, матки, щитовидной железы, предстательной железы и кожи, (Ь) гематопоэтических опухолей лимфоидной линии, выбранных из лейкоза, острого лимфоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжскинской лимфомы, волосатоклеточной лимфомы и лимфомы Беркитта, (с) гематопоэтических опухолей миелоидной линии, выбранных из острого и хронического миелогенного лейкоза, миелодиспластического синдрома и промиелоцитарного лейкоза, (б) опухолей мезенхимального происхождения, выбранных из фибросаркомы и рабдомиосаркомы, (е) опухолей центральной и периферической нервной системы, выбранных из астроцитомы, нейробластомы, глиомы и шваномы или (Г) меланомы, семиномы, тератокарциномы, остеосаркомы, пигментной ксеродеромы, кератоакантомы, фолликулярного рака щитовидной железы или саркомы Капоши.

7. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой одну или несколько из солидных опухолей, выбранных из рака мочевого пузыря, молочной железы, ободочной кишки, почки, печени, легкого, немелкоклеточного рака легкого, головы и шеи, пищевода, ЖКТ, яичника, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и предстательной железы, или лимфомы, или лейкоза.

8. Применение по любому пп.1-5, в котором рак представляет собой рак предстательной железы, рак яичников, рак молочной железы, холангиокарциному, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз или их комбинацию.

9. Применение соединения И-(4-((3-(2-амино-4-пиримидинил)-2-пиридинил)окси)фенил)-4-(4метил-2-тиенил)-1-фталазинамина или его фармацевтически приемлемой соли для приготовления лекарственного средства для лечения рака, рефрактерного к лечению противораковыми агентами.

10. Применение по п.9 для приготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака ободочной кишки, рака почки, рака печени, рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, рака головы и шеи, рака пищевода, рака ЖКТ, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака желудка, рака матки, рака щитовидной железы, рака предстательной железы, лимфомы, лейкоза, множественной миеломы или их комбинации, при этом рак является рефрактерным к лечению противораковым агентом.

11. Применение по п.9 для уменьшения размера солидной опухоли у субъекта, при этом лечение опухоли у субъекта ранее производили химиотерапевтическим агентом, выбранным из группы, состоящей из паклитаксела, доцетаксела, доксорубицина и алкалоида барвинка.

12. Применение по п.9, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент,

- 24 020526 выбранный из группы, состоящей из антимитотического агента и антрациклина.

13. Применение по п.9, в котором противораковым агентом является химиотерапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из таксола, доцетаксела, винкристина, винбластина, виндезина, а также винорелбина, даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, эпирубицина и митоксантрона.

14. Применение по п.9, в котором противораковый агент представляет собой ΑΖΌ1152, РНА739358, ΜΚ-0457 или их комбинацию.