TW201121956A - Use of N-(4-((3-(2-amino-4-pyrimidinyl)-2-pyridinyl)oxy)phenyl)-4-(4-methyl-2-thienyl)-1-phthalazinamine in the treatment of antimitotic agent resistant cancer - Google Patents

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201121956 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）_2_。比啶基）氧 基）苯基）-4-(4-曱基-2-噻吩基）-1_呔畊胺之用途，其用於治 療已對利用抗有絲分裂劑及/或其他化學治療劑^治療有 抗性之癌症（包括實體腫瘤）。 本申請案主張2 〇 〇 9年9月11曰申請之美國臨時申請案第 6W24U527號之權利，該說明書之全文以5丨用方式併人本 文中。 【先前技術】 癌症係影響人類《最普遍疾病中之一種且係全球死亡之 主要原因。僅在美國’癌症係僅次於心臟病之第二主要死 亡原因。癌症之特徵通常在於正常細胞過程失㈣不受調 節之細胞增瘦。已轉化為癌性細胞之細胞往往以失控及不 受調節之方式增殖，在某些情形下會導致癌症轉移或擴 散。細胞增殖失調可由-或多種負責控制細胞週期進程之 細胞途徑之基因發生改變而引起。或者，其可由一或多個 允許細胞自細胞週期之一個期移動至另一未經檢查期之細 胞週期檢查點調節子φ夕ηΜ Λ L , u π即卞甲之DNA發生改變（包括但不限於突 變、擴增、重排、缺失及表觀遺傳基因沉默）而引起。另 方式係八自身細胞機制之改變可產生不能適當檢測或修 復之有絲分裂錯誤（mitotie erw)，且可允許細胞移動經過 未經檢查之細胞週期。 有絲分裂係真核細胞將其複製染色體分離至兩個相同子 150546.doc 201121956 核中之過程。隨後通常立即進行胞質分裂，其使細胞核、 細胞質、細胞器及細胞膜分裂至含有大致等份此等細胞組 份之兩個子細胞中。有絲分裂及胞質分裂一起界定細胞週 期之有絲分裂（M)期-母細胞分裂成在遺傳上彼此相同且與 其親代細胞相同之兩個子細胞。 有絲分裂之過程複雜且受高度調節。事件之順序分為不 同期，對應於一組活化之完成及下—組活化之開始。此等 階段係前期、前中期、中期、後期及末期。在該過程期 間’有絲分裂複製染色體縮短並連接至纖維，該等纖維將 姐姝染色單體向細胞相反側拉開。然後細胞在胞質分裂期 間分裂，生成兩個相同的子細胞。有絲分裂錯誤可經由細 胞凋亡殺死細胞或導致可引發癌症之染色體誤離。 正常情況下，若檢測到DNA錯誤（例如DNA損傷），則細 胞週期檢查點被激活。若不能制止基因組之此等錯誤，則 細胞正常經歷細胞計。然而’若允許細胞移動經過其未 經檢查之細胞週期及進程，則隨時間流逝會積累更多的突 變。此等基因改變會增長且經過適應，最終產生具有惡化 前或惡性腫瘤特性（例如失控增殖）之細胞子代。 〜 /有絲分裂劑係抑制微管功能之抗癌劑。微管係由微 官蛋白及β-微管蛋白異源二聚體形成之蛋白聚合物，其在 有絲分裂紡錘體形成及有絲分裂末期之胞質分裂中起重要 作用。乾向微管之抗癌劑代表經證實可用於干涉癌細胞增 殖之方法。 θ 已研發出數類抗有絲分裂劑作為抗❹卜紫減類係最 150546.doc 201121956 突出的一類抗有絲分裂劑，其包括紫杉醇（paclitaxel)(泰素 (taxol))及多西紫杉醇（Docetaxel)(泰素帝（tax〇tere))。長春 花生物鹼（vinca alkaloid)類係一類微管去穩定劑，其包括 長春新鹼（vincristine)、長春鹼（Vinblastine)、長春地辛 (vindesine)及長春瑞濱（vinorelbine)。其他出現的種類包括 埃博黴素（epothilone)類（伊沙匹隆（ixabepil〇ne》。此等抗 有絲分裂劑藉由使微管穩定或去穩定起阻止癌細胞增殖之 作用。對微管之此直接抑制經由細胞凋亡或有絲分裂災變 導致細胞阻滯（cell arrest)及死亡。所發現之首個紫杉烷系 列化合物係紫杉醇。隨後發現多西紫杉醇，其結構與紫杉 醇類似。紫杉醇及多西紫杉醇通常用於治療各種人類惡性 腫瘤，包括卵巢癌、乳癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、食道 癌、前列腺癌及AIDS相關之卡波西氏（Kap〇si，s)肉瘤。紫 杉烷類之主要副作用係骨髓抑制（主要為嗜中性白血球減 少症），而其他副作用包括外周性水腫及神經毒性（周圍神 經病變）。 '、/、元類有抗性係成功癌症治療之併發性因 (comp丨ieating faetG〇且通常與〗編碼基因及其產物p_ 蛋白（P-gP)表現增加有關。所獲得對紫杉烷之抗性之其 已記載機制包括微管蛋白突變、過表現、擴增及同種里 轉換。或β·微管蛋白突變抑制紫杉炫類與微管上之^ 位置結合’從而導致藥物無效。另外，一些有抗性之細 亦顯不以㈣（-種促進有絲分裂完成之酶）增加。 長春花生物驗類（VinCaS;亦稱為植物生物驗類）能夠』 150546.doc 201121956 微管之β-微管蛋白亞單元結合，阻礙其與α_微管蛋白亞單 元聚合之能力以形成完整微管。此導致細胞週期在中期阻 滞，致使〉周亡細胞死亡，此乃因缺乏完整的有絲分裂纺鍾 體，複製染色體不能沿分裂板對準所致。研究已識別二聚 不對稱長春花生物鹼類：長春鹼、長春新鹼、長春瑞濱及 長春地辛其巾每—者皆可用於治療癌症包括膀脱及畢 丸癌、卡波西氏肉瘤、神經胚細胞瘤及霍奇金氏病 (H〇dgkin，s disease)、及肺癌及乳癌。長春杧生物鹼類之主 要副作用係其會引起患者之神經毒性及骨髓抑制。 在實驗模型中會快速地出現對長春花生物鹼類之抗性。 在過表現ATP結合盒（ABC)轉運體_調介藥物外排轉運體（例 如P_gp及MRP1)的多重抗藥性細胞系中長春花生物鹼類之 抗腫瘤效果會受到阻礙。抗性之其他形式源自可阻止抑制 劑與其靶標結合之β-微管蛋白突變。 其他化學治療劑包括拓撲異構酶抑制劑，例如伊立替康 (irinotecan)及托泊替康型抑制劑）及安吖啶 (amsacrine)、依託泊苷（etoposide)、磷酸依託泊苷及替尼 泊苷（teniP〇side)(II型抑制劑）。拓撲異構酶抑制劑影響 DNA合成且具體而言，藉由阻止dna轉錄及複製來起作 用。 又一類化學治療劑係蒽環抗生素抗生素類，包括柔紅黴素 (daunorubicin)、多柔比星（doxorubicin)、伊達比星（idarubicin)、 表柔比星（epirubicin)及米托蒽醒（mitoxantrone)。迄今，蒽 環抗生素類可用於治療大多數癌症，包括淋巴瘤、白血 150546.doc 201121956 病、及子宮癌、卵巢癌、肺癌及乳癌。蒽環抗生素類藉由 形成可使DNA鏈斷裂之游離氧自由基來起作用，藉此抑制 DNA合成及功能。蒽環抗生素類之一個主要副作用係其會 損傷心臟肌肉細胞，從而產生心臟毒性。 對抗癌劑（包括但不限於化學治療劑及抗有絲分裂劑）之 抗性已成為癌症治療之主要障礙。該抗性已導致患者對多 種不同藥物之效果具有交又抗性。更具體而言，一個問題 係夕重耐藥性。此外，該對抗癌治療抗性之抗性必然導致 患者死亡。因此，所有癌症療法之問題仍在於產生抗藥 性，且因此，人們需要識別一種對癌症治療不再易起反應 或僅稍微有影響之癌症治療，包括利用化學治療劑（例如 紫杉烷類及長春花生物鹼類）以及監管部門批准之經過臨 床測試之抗癌劑的傳統治療。 【發明内容】 本發明提供化合物N_(4-((3-(2_胺基冰。密咬基）_2“比咬 基）氧基）苯基）-4-(4-甲基·2_。塞吩基）小吹相（在本文中亦 稱為「AMG 900」或「化合物」)及其醫藥上可接受之鹽 形式之用途，其用於治療以下物質難以治療之晚期癌症 (包括實體腫瘤及癌細胞）：政府批准之護理標準抗有絲分 裂劑’例如紫㈣類，包括紫杉醇及多西紫杉肖；及宜他 化學治療劑’包括多柔比星；及其他在癌症 中所投與之試劑。八祕900具有如下化學結構：床。式驗 I50546.doc 201121956

本發明進一步提供包含此化合物或其醫藥上可接受之_ 形式之醫藥組合物之用途，其用於先前曾接受過化學治療 劑（包括抗有絲分裂劑）治療之患者之癌症及癌細胞的治療 性、預防性、急性或慢性治療。在一個實施例中，本發明 提供AMG 900在製造藥劑及醫藥組合物中之用途，該等藥 劑及醫藥組合物用於先前曾接受過下列物質治療之個體癌 症的治療方法：抗有絲分裂劑，包括有絲分裂紡錘體抑制 劑及抗微管蛋白劑；或其他癌症化學療法中所用之藥物 (在本文中亦稱為化學治療劑），包括多柔比星、柔紅黴 素、更生黴素（dactinomycin)、秋水仙素（c〇lchicine)、長 春鹼、長春新鹼、依託泊苷及米托蒽醌。在另一實施例 中，本發明提供治療對紫減有抗性之腫瘤類型（包括個 體非小細胞肺癌、乳癌及激素難治性前列腺癌）之方法， 該方法包含向個體投與效劑量的AMG _或其醫藥上可接 受之鹽，以治療對紫杉烷有抗性之腫瘤。 【實施方式】

在人類臨床試驗中，P政^日A 锹中，已發現AMG 900(極光激酶抑 可提供優於目前乾而测_总疋 向0蛋白之護則票準癌症治療劑“ 150546.doc 201121956 如紫杉醇、伊沙匹隆及長春花生物鹼類）及其他化學治療 劑（例如多柔比星）（包括AZD1152)的令人驚奇且出人意料 之優點。具體而言，AMG 900可藉助多種所提出之機理在 抑制或減緩已對抗有絲分裂劑有交叉抗性之腫瘤之進程或 生長中遞送效力，該等機理包括（例如）經由Ατρ結合盒 (ABC)轉運體調介之藥物外排，微管蛋白基因擴增或改 變，或α或β微管蛋白之結構變化。另外，在細胞週期之 GiM-期中AMG 900靶向增殖細胞且因此不可能引起在靶向 微管之抗有絲分裂物質情況下所見到之周圍神經病變。 定義 以下定義將幫助進一步理解本文所述本發明之範疇。 術語「癌症」及「癌性的」在本文中使用時係指或描述 個體之特徵通常在於細胞生長失調之生理病況。癌症之實 例包括（但不限於）癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚細胞瘤及白血 病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌、肺癌、胰腺 癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌及頭頸 癌。儘管本文所用術語「癌症」並不限於疾病之任一特定 形式，但據信本發明方法將對已對利用抗癌劑之治療有某 種程度抗性之個體癌症尤為有效，該等抗癌劑包括（但不 限於）化學治㈣、抗有絲分裂劑、葱環抗生素類及諸如 此類。 術語「化學治療劑」在本文中使用時係指可殺死癌性細 胞之癌症治療物。該術語另外係、指用於治療癌症之抗腫瘤 藥物或由此等藥物組合而成的標準化治療方案。化學治療 150546.doc 201121956 , ^ (〇.ρΜη)^ 卡銘（carbopUtin)、奥沙利鉑（oxaliplatin);生物鹼類包 括長春花生物鹼類（實例包括長春新鹼、長春驗、長春瑞 濱及長春地辛）及紫杉烷類（實例包括紫杉醇（泰素）及多西 紫杉醇）；拓撲異構酶抑制劑，例如伊立替康、托泊替 康、安吖啶、依託泊苷、磷酸依託泊苷及替尼泊苷丨及各 種抗腫瘤劑，例如更生黴素、多柔比星、表柔比星、博來 黴素（bleomycin)及其他。 術語「包含」意欲具有開放性意義，包括所指定之組份 但不排除其他要素。 術語「多重抗藥性」在本文中使用時係指對多種具有不 同化學結構之藥物有抗性及/或對定位於不同靶標之藥物 有抗性的癌細胞。 術語「難治性」在本文中使用時欲指未對治療、刺激 (療法）或治癒產生抗性或無反應，包括對多種治療性治癒 劑之抗性。「難治性」在本文表現癌症或腫瘤特徵之背景 下使用時欲指癌症或腫瘤對利用一或多種抗癌劑之治療無 反應或有抗性或反應減低。治療在一段時期内通常係連 續、長期及/或重複的，致使癌症或腫瘤對十分相同之治 療產生抗性或難以治療。 本文所用術s吾「個體」係指任一哺乳動物，包括人類及 動物’例如奶牛、馬、犬或貓。因此，本發明可用於人類 患者以及獸類個體及患者。在本發明之一個實施例甲，該 個體係人類。 150546.doc •10· 201121956 片語「治療有效」意欲量化化合物（AMG 9〇〇)之量， 得在藉由習用抗有絲分裂癌症療法進行癌症治療期；將: 成癌症或腫瘤之尺寸縮小或嚴重程度降低，同時減小或避 免通；1¾與習用抗有絲分裂癌症療法有關之不利副作用^ 本文所用術語「治療（treat，treating，treatment)」係指療 法，包括（但不限於）治癒性療法、防護性療法及預防性療 法。防護性治療通常涵蓋完全防止個體中病症之發作或延 遲病症之臨床前明顯階段之發作。 術語「醫藥上可接受之鹽」涵蓋通常用於形成鹼金屬鹽 及用於形成游離酸或游離驗之加成鹽的鹽。鹽之性質並不 重要’只要其為醫藥上可接受即可。該化合物之適宜醫藥 上可接受之酸加成鹽可自無機酸或自有機酸來製備。該等 無機酸之實例包括（但不限於）氫氣酸、氫溴酸、氫蛾酸、 硝酸、碳酸 '硫酸及磷酸。有機酸之實例包括（但不限於） 脂肪族酸、環脂族酸、芳香族酸、芳基脂肪族酸、雜琴 酸、羧酸及磺酸類有機酸，其實例為曱酸、乙酸、已二 酸、丁酸、丙酸、琥ίό酸、經乙酸、葡糖酸、乳酸、頻果 酸、酒石酸、擰檬酸、抗壞血酸、葡糖越酸、馬來酸、富 馬酸、丙酮酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯甲酸、鄰胺基苯甲 酸、甲石黃酸、4-經基苯曱酸、苯基乙酸、苦杏仁酸、雙經 萘酸（巴莫酸（pamoic acid))、甲續酸、乙續酸、乙二續 酸、笨磺酸、泛酸、2-羥基乙磺酸、曱苯磺酸、對胺基笨 磺酸、環己基胺基磺酸、樟腦酸、樟腦磺酸、二葡糖酸、 環戊烷丙酸、十二烷基磺酸、葡庚糖酸、甘油膦酸、庚 150546.doc -11 - 201121956 酸、己酸、2-羥基-乙磺酸、煙酸、2_萘磺酸、草酸、棕櫚 酸、果膠醋酸、過硫酸、2-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、 丙酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、甲磺酸、十—酸、硬月匕 酸、海薄酸、β-羥基丁酸、水楊酸、黏酸及半乳糖醛酸。 該化合物之適宜醫藥上可接受之鹼加成鹽包括（但不限 於）金屬鹽，例如自銘、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉及辞製得之 鹽；或自有機鹼製得之鹽，該等有機鹼包括一級' 二級、 級胺及經取代胺（包括環胺），例如咖啡因、精胺酸 乙胺、Ν-乙基六氫吡啶、組胺酸、葡糖胺、異丙胺、離胺 酸、嗎淋、Ν-乙基嗎琳、六氫。比味、六氮吼咬、三乙胺、 三曱胺。本文所涵蓋之所有鹽均可藉助習用方式自相應化 合物藉由使（例如）適當酸或鹼與該化合物反應來製備。 AMG 900 Ν-(4-((3·(2-胺基_4“密咬基）·2·η比唆基）氧基）笨 土）4 (4甲基-2-噻吩基w _吹ρ井胺可藉由與pCT公開案 007087276第70頁實例方法A1或Α2中所述程序類似之 序（<_使用1_氣_4_(4_甲基、2_。塞吩基）七井作為起始材料） 並、° °實例15(第50頁）、25(第55頁）及30(第59頁）進行製 ^此等程序亦閣述於美國專利第7,56(),551號中，該說明 曰王文以引用方式併入本文中。特定而言，AMG 900可 如下文實例1中所述進行製備。 實例1 150546.doc -12· 201121956

N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）-2-"比啶基）氧基）苯基）_4·(4·甲 基-2-噻吩基）-1-呔畊胺（AMG 900)之合成 步驟1 : 4-(2-氣吡啶-3-基）嘧啶-2-胺 在放置於異丙醇浴中之經氬吹掃之500 mL圓底燒瓶中， 將金屬納（3.40 g，148 mmol)緩慢添加至甲醇（180 mL)中。 將混合物在室溫（RT)下攪拌約30分鐘。向其中添加鹽酸胍 (12.0 mL，182 mmol)並將混合物在室溫下攪拌30分鐘，隨 後添加（E)-l-(2 -氣°比。定-3-基）-3-(二曱基胺基）丙-2-稀-1-晒 (12.0 g，57.0 mmol)，連接上空氣冷凝器，將反應移至油 浴’於其中將其加熱至約50T：並持續24 h。在減壓下蒸發 掉約一半的曱醇並在真空下濾出固體，然後用飽和碳酸氫 鈉（NaHCOd及HiO洗滌，空氣乾燥，得到呈灰白色固體形 式之 4-(2-氣。比啶-3-基）嘧咬 _2-胺。MS m/z=207 [M+l]+。 C9H7C1N4之計算值：206.63。 步驟2 : 4-(2-(4-胺基苯氧基）吼咬_3_基）鳴咬-2-胺

向可再密封之管中添加4-胺基苯酚（1_3 g, 12 mmol)、碳 酸鉋（7_8 g，24 mmol)及 DMSO(16 ml，0.75 Μ)。將混合物 加熱至100°C並持續5分鐘，且然後添加4-(2-氣β比咬-3-基） 嘴。定-2-胺（2.5 g，12 mmol)，並將反應混合物加熱至13(TC 150546.doc -13- 201121956 過夜。如由LCMS判斷完成後，使反應混合物冷卻至室溫 並用水稀釋。濾出所得沉澱，並用水及乙醚洗滌固體。將 固體吸收於9:1 CH2Cl2:MeOH中並利用9:1 CH2Cl2:MeOH作 為洗脫液使其通過矽膠墊。在真空中濃縮溶劑以提供期望 產物4-(2-(4-胺基苯氧基）吡啶-3-基）嘧啶-2-胺。MS m/z=280 [M+l]+。Ci5H丨3N50之計算值：279.30。 步驟3: 1-氣-4-(4-甲基噻吩-2-基）呔畊 將1,4-二氣呔畊（l_4〇 g, 7.03 mmol)、4-曱基噻吩-2-基蝴 酸（999 mg，7.03 mmol)及 PdCl2(DPPF) (721 mg，985 μηιοί) 添加至密封管中。將管用氬吹掃。然後添加碳酸鈉（2.0 Μ 存於水中）（7.74 ml, 15.5 mmol)及 1，4-二噁烷（35.2 ml, 7.03 mmol)。將管密封，在室溫下攪拌5 min，並放置於下經預 熱之110°C油浴中。1 h後，LC-MS顯示產物及副產物（雙偶 合）、及起始材料二氣吹p井。將反應冷卻至室溫，經由石夕 藻土墊借助乙酸乙酯（EtOAc)進行過濾，濃縮並負載至管 柱上。藉由管柱層析使用己烷來純化產物以去除頂部斑 點，然後使用80:20己烷：EtOAc收集產物。獲得呈黃色固 體形式之產物1-氯-4-(4-曱基售吩-2-基）吠》井。LC-MS顯示 產物被少量的二氣呔，井及雙偶合副產物污染。MS m/z=261 [M+l]、C13H9ClN2Si計算值：260.12。 步驟4 : N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）-2·"比啶基）氧基）苯基）_ 4-(4-甲基-2-嗟吩基）-1-吹_胺 向4-(2-(4-胺基苯氧基）吡咬_3_基）嘧啶_2_胺及1_氣_4_(4-曱基-2-噻吩基）呔畊中添加tBu〇H。在密封管中將所得混 150546.doc -14· 201121956 合物在100°c下加熱16小時。用乙醚及飽和碳酸鈉稀釋反 應並劇烈搖動。濾出所得固體並用水、乙醚洗滌並實施空 氣乾燥，得到呈灰白色固體形式之N_(4_((3_(2胺基_4_嘧 啶基）-2-吼啶基）氧基）苯基）_4·(4-甲基_2_噻吩基呔畊 月女。MS m/z-504 [M+H]+。C28H2iN7〇S 之計算值：503.58。 LC-MS方法： 在 30 C 下使樣品在具有 Agilent Technologies XDB-C8 (3.5 μ)反相管柱（4.6x75 mm)之 Agilent-1100 型 LC-MSD 系 統上運行。流動速率恆定且介於約0.75 mL/min至約1.0 mL/min之間。 移動相使用溶劑A(H2〇/0.1% HOAc)與溶劑B (八〇01^/0_1°/。110八(^)之混合物，經9 111丨11時間梯度自1〇%溶 劑B至90%溶劑B。隨後經0.5 min時間梯度返回至丨〇%溶劑 B且10◦/〇溶劑B經2.5 min使管柱重新達到平衡（沖洗）。 亦可使用其他方法來合成AMG 900。用於合成AMG 900 之多種合成化學轉化以及保護基團之方法已為業内所知。可 用之有機化學轉化文獻包括（例如）R_ Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W.

Greene 及 P.G.M. Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第 3版，John Wiley and Sons (1999); L. Fieser A M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); A. Katritzky及 A. Pozharski，Handbook of Heterocyclic Chemistry，第 2版 (2001); M. Bodanszky, A. Bodanszky, The Practice of 150546.doc -15- 201121956

Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1984), J. Seyden-Penne, Reductions by the Alumino-and Borohydrides in Organic Synthesis，第 2版，Wiley-VCH， (1997)，及 L. Paquette(編輯）Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)。 在不同細胞系（活體外）及多種實體腫瘤類型（活體内）中 測試AMG 900減緩或抑制腫瘤進程之能力，其中一些先前 就已對護理標準抗有絲分裂劑（包括紫杉烷類及長春花生 物驗類）以及對其他化學治療劑顯露出並產生抗性。以下 貫例及所得數據將闡釋AMG 900治療癌症（包括對當前護 理標準療法有抗性之癌症）之能力，該療法包括抗有絲分 裂劑（例如紫杉醇）及其他與化學療法結合使用之藥物（例如 多柔比星）。除非另有說明，否則在下文所述實例中使用 AMG 900之游離鹼形式。 實例2 為研究AMG 900誘導之極光激酶A&B活性之抑制是否 會抑制細胞增殖，在活體外使用32種人類腫瘤細胞系評價 AMG 900之抗增殖作用。如表i及表2中所示，AMG 9〇〇對 貫體腫瘤細胞系及血液腫瘤細胞系二者均展示抗增殖活 f·生。在AMG 900濃度處於低微莫耳範圍内之情況下可看到 此杬增殖活性（ECsq值為1 nM至5 nM)。重要的是，此等對 AMG 900敏感之實體腫瘤細胞系中有四種（HCTi5、 SA Dx5、769P及SNU449)對紫杉醇及其他化學治療劑有抗 性。對多種具有不同化學結構之藥物有抗性及/或對定位 150546.doc • 16 - 201121956 於不同靶標之藥物有抗性之癌細胞稱為具有「多重抗藥 性」。癌細胞所利用之一種突出的多重抗藥性（mdr)機制 係由ATP結合盒（ABC)轉運體家族（例如mdr_〗基因產物糖 • 蛋白（p-gp))調介之藥物外排。.舉例而言，對多柔比星有抗 • 性之人類子宮細胞系MES_SA Dx5表現P_gp且對多種化^ 治療劑有抗性（超過親代系3〇倍至1 200倍），該等化學户療 劑包括柔紅黴素、更生黴素、秋水仙素、長春鹼、長春新 鹼、紫杉醇、依託泊苷及米托蒽醌。為進—步研究 900在表現出MDR之細胞中之活性，測試三種對泰素有抗 性之腫瘤細胞系並與其各自之親代細胞系進行比較。如圖 1至3及表3中所示，AMG 900在全部三種配對之對泰素有 抗性且敏感之腫瘤細胞系中皆保持效力，其中EC5〇值< 2 nM。與親代系相比，泰素在表現p_gp之腫瘤亞系中顯示顯 著的效力損失（10倍至1〇〇倍）。此等數據共同指示AMq 9〇〇 抑制磷酸化組蛋白H3(極光激酶3之近端基質）且可阻礙對 紫杉醇及其他化學治療劑有抗性之腫瘤細胞系之細胞分 裂。 、匕刀 測試材料 測試物品： 調配物： 來源： 關鍵試劑 洗滌及固定溶液 材料及方法 AMG 900 DMSO Amgen公司 150546.doc 17 201121956 IX PBS 達爾伯克氏(Dulbecco's)構酸鹽緩衝液，目 錄編號 14090-144，Invitrogen公司， Carlsbad. CA 92008 蒸餾⑷h2o 目錄編號2F7115，Baxter Health care公司， Deerfield, IL 60015 90%甲醇，存於dH20中 曱醇，目錄編號3041-10，Mallinckrodt Chemicals, Phillipsburg, NJ 08865 洗滌緩衝液(存於IX PBS 中)-FACS分析 1%BSA 0.2% Triton X-100 目錄編號810111，數量50mL，ICN Biomedicals公司，Aurora, OH 44202 目錄編號9284，Sigma-Aldrich, St. Louis， MO 63178 洗務緩衝液_ Cellomics IX PBS 1%正常山羊血清 1% Tween-20 達爾伯克氏磷酸鹽緩衝液，目錄編號 14090-144，Invitrogen公司，Carlsbad, CA 92008 目錄編號G-9023-10mL，Sigma-Aldrich, % Louis, MO 63178 目錄編號P-1379，Sigma-Aldrich, !St. Louis， MO 63178 酸緩衝液(存於dH20) 2NHCL 0.5% Triton X-100 鹽酸37%，目錄編號JT953000，批號未獲 得，Sigma-Aldrich，St. Louis，MO 63178 目錄編號9284，批號未獲得，500 mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 2X甲醛固定液(存於IX PBS 中）-Cellomics 20%曱醛， 0.024°/。戊二醛 目錄編號F1635-500mL，Sigma-Aldrich, Sit. Louis, MO 63178 目錄編號85191，尸1111<;〇/8丨§1113-八1(11^11，81;. Louis, MO 63178 試劑 碘化丙啶/RNAse染色 緩衝液 PI/RNAse，目錄編號550825，100 mL， Becton Dickinson, San Jose, CA 95131 DMSO，二甲基亞颯 目錄編號D2650，Sigma-Aldrich, St. Louis， MO 63178 抗磷酸化組蛋白H3 (SerlO)抗體(p-組蛋白 H3)，有絲分裂標記物 目錄編號06-570，Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY 12946 Alexa Flour 488 山羊抗兔 IgG抗體 目錄編號A11001 ’ Invitrogen公司’ Carlsbad, CA 92008 150546.doc • 18* 201121956 二水合 Hoechst 33342 二越 酸化物 目錄編號H3570，Invitrogen公司 ’ Carlsbad, CA 92008 抗溴脫氧尿苷，小鼠 IgGl，單株PRB_i， Alexa Fluor 647結合物 (抗BrdU，Alexa-647、 目錄編號A21305，批號54656A ’ Invitrogen 公司，Carlsbad，CA92008 H 1(J結合之兔抗活性半脱 胺酸天冬胺酸蛋白酶_3單 株抗體(抗半胱胺酸天 冬胺酸蛋白酶-FITQ 100次測試，目錄編號559341，批號 60509 j BD Pharmingen, San Diego, CA 92121 BrdU標記試劑(原料濃度 無詳細說明） 目錄編號00-0103，Zymed Laboratories, Carlsbad, CA 92008 IX胰蛋白酶-EDTA， 0.5% 目錄編號25300-054，Invirtogen公司， Carlsbad, CA 92008 1X 維耳新(Versene) 目錄編號 15040-066，Invirtogen公司， Carlsbad, CA 92008 McCoys 5A培養基， (+) L-麩胺酸 目錄編號 16600-082，Invitrogen公司， Carlsbad, CA 92008 RPMI培養基1640， (+)L-麩胺酸_ 目錄編號 11875-093，Invitrogen公司， Carlsbad, CA 92008 DMEM，高糖，（+)4.5 g/ L D-葡萄糖，（+) L-麩胺酸 目錄編號 11965-092，Invitrogen公司， Carlsbad, CA 92008 FBS ’胎牛血清，源於澳 大利亞 目錄編號 10099-141，Invitrogen公司， Carlsbad, CA 92008 泰素(紫杉醇） 目錄編號T7402，Sigma-Aldrich，St. Louis, MO 63178 長春驗 目錄編號V1377，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 實驗室設備、輔助材料、軟體 桌上型冷凍離心機(Table top refrigerated centrifuge) AllegraX-15R離心機，Beckman Coulter, Fullerton, CA 92834 GraFit v5 軟體 Erithacus Software, Horley Surrey, RH6 9YJ, UK XLfit4.2 軟體 Excel，Microsoft公司，USA GraphPad Prism v5 GraphPad Soft ware公司，2236 Avenida de la Playa, La Jolla, CA 92037 流式細胞儀 Becton Dickinson LSRII流式細胞儀，BD Biosciences, San Jose, CA95131 S>6孔組織培養板，平底， 具有低蒸發性蓋，無堯 目錄編號3595，批號未獲得，Coming Life Sciences公司，Lowell ΜΑ 01851 12孔組織培養板，平底， 具有低蒸發性蓋，無ΐ 目錄編號353043，批號未獲得，BD Labware, Franklin Lakes, NJ 07417 150546.doc •19· 201121956 6孔組織培養板，平底， 具有低蒸發性蓋，無菌 目錄編號353046，批號未獲得’ BD Labware, Franklin Lakes, NJ 07417 用於FACS染色之PCR 管條 目錄編號20170-004，批號711C7-7074，0.2 mL PCR條管，VWR Inti” West Chester，PA 19380 1.5 mL微量離心管 (EppendorfTube) 目錄編號20901-551，批號未獲得’ VWR Inti., West Chester, PA 19380 Packard View-96孔板 目錄編號-6005182，批號未獲得’ PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA 02451 ELX405洗板機 目錄編號ELX405HT，BioTek，Winooski, VT 05404 Multidrop DW(深孔） 目錄編號5840177，Thermo Fisher Scientific 公司，Waltham, MA 02454 Cellomics Array Scan VTi Cellomics-Thermo Fisher公司，Waltham， MA 02454 方法 在活體外評估AMG 900對源自子宮、乳房及肺組織之親 代腫瘤細胞系及抗藥性腫瘤細胞系之活性。分別藉助流式 細胞術及高内涵（high-content)細胞成像來評估細胞週期及 P-組蛋白H3終點。 人類細胞及細胞培養 除非另有說明，否則人類腫瘤細胞系係自美國菌種保存 中心（American Type Culture Collection)(Manassas，VA)獲 得。所有細胞均保持在37攝氏度下及5% C〇2氣氛中。源自 乳房腫瘤之CAL51(ACC 302)細胞系係自DSMZ(GmbH)獲 得。源自結腸腫瘤之HCT_116_JH(基因型p21 +/+)及HCT- 116_JH(基因型p21 -/-)細胞系經許可自約翰霍普金斯大學 遺傳學資源核心研究所（John Hopkins University Genetics

Resources Core Facility)獲得。 人類腫瘤細胞系及相應培養基 腫瘤細胞系 來源 組織培養生長條件 (所有培養基均含有lx麩醯胺酸） 150546.doc -20- 201121956 HCT-l 16_JH(基因型 P21 +/+) 結腸 HCT-116_JH(基因型 P21 -/-) 結腸 HCT-15 結腸 HT29 結腸 SW-620 結腸 SW480 結腸 HOP-92 肺 HOP-62 肺 NCI-H460 肺 A549 - 肺 PC-3 前列腺 DU-145 前列腺 BT-549 乳房 BT-474 乳房 MDA-MB-231 乳房 T47D 乳房 MCF-7 p53(+) 乳房 MCF-7 p53(-) 乳房 CAL51 乳房 SK-OV-3 卵巢 MES-SA/Dx5 子宮 MES-SA 子宮 SK-MEL-2 皮膚 A498 腎臟 769P 腎臟 CAKI-1 腎臟 SK-HEP-1 肝臟 SNU449 肝臟 K562 白血病 MOLT-4 白血病 HL-60 白血病 Jurkat 白血病 U266-B1 骨髓瘤 RPMI-8226 骨髓瘤 對泰素有抗性之NCI-H460 肺 MDA-MB-231 (Fll)-luc 乳房 對泰素有抗性之MDA-MB-231(F11)-1uc 乳房 經AMG 900處理 之實體 150546.doc

McCoy's 5A, 10% FBS + L·麩醢胺酸 McCoy's 5A, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 McCoys 5A, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醢胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMn640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 Ham's F12K + 10% FBS + L-麩醢胺酸 RPMI 1640,10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI ] 640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醢胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 DMEM+10% FBS + 1XNEAA + L-麩醯胺酸 McCoy's 5A，10% FBS + L-麩醯胺酸 McCoy's 5A, 10% FBS + L·麩醯胺酸 McCoy's 5A, 10% FBS MEM, 10% FBS, 1 mM 丙酮酸鈉，〇_l mMNEAA + L-麩醯胺酸 MEM, 10% FBS，lxNEAA + L·麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸

McCoy's 5A, 10% FBS + L-麩醯胺酸 MEM, 10%FBS, lxNEAA+L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS，10 mM HEPES，1 mM 丙酮 S复納+L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L·麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 15% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI] 640, 20% FBS + L-麩醯胺酸 RPMI 1640, 10% FBS，75 nM泰素

DMEM, 10% FBS DMEM, 10% FBS，50 nM泰素 瘤細胞系組：抗增殖分析 •21 - 201121956 (ArrayScan VTi) 端視細胞系生長動力學在Packard View 96孔板中在loo μι適當完全培養基中以3000個細胞/孔或5000個細胞/孔之 密度（廣泛定義為慢與快）接種腫瘤細胞。所有稀釋均使用

Biomek FX工作站實施。次曰，用AMG 900處理細胞（^點

劑：S範圍為0· 1 56 μΜ至0.0003 μΜ)，培養基中最終DMSO 濃度為0.12%。24小時後，去除含有化合物之培養基並用 完全培養基洗滌細胞。然後在1〇〇 pL新鮮完全培養基（無 化合物）申將細胞培育48小時。48小時後，藉由向1 〇〇 μΐ 完全培養基中添加1 00 μΐ^固定緩衝液來固定細胞。在室溫 下將細胞培育1 〇分鐘。吸去固定緩衝液且然後在室溫下在 1 〇〇 μί洗滌緩衝液中對細胞進行通透處理3 〇分鐘，隨後添 加100 μί DNA染色緩衝液並在黑暗中在室溫下培育3 〇分 鐘。然後，用100 μί洗滌緩衝液洗滌細胞並在4攝氏度下 儲存於100叫lx PBS中直至分析為止。藉由在八”叮以⑽

Vti成像系統（Cellomics)上掃描96孔板來獲得細胞數據。基 於Hoechst 33342 DNA染料螢光量化個別細胞核面積及強 度。對基於經DMSO處理之對照孔之細胞核面積設定_臨限 值以量化來自細胞核碎片及多倍性細胞之正常尺寸細胞核 之數量。使用10x放大率應用此臨限值來計算6個像場/孔 中正常細胞核之數量。使用4參數公式計算劑量·濃度曲線 及EC50值。 里AMG 900處理之血液細胞系組：多參數細胞週期dna含 量分析（流式細胞術） 150546.doc -22- 201121956 在300 μί深96孔板中，在150 μΐ^適當完全培養基中，以 100,000個細胞/孔之密度接種腫瘤細胞。用AMG 900處理 細胞（10點劑量範圍為0.156 μΜ至0.0003 μΜ)，培養基中最 終DMSO濃度為0.2%。在收穫期前2小時，在培養基中以 1:100之最終濃度用BrdU對細胞進行施脈衝處理。48小時 後，利用多孔移液器自每一孔去除1 00 μί培養基。然後將 細胞轉移至存於200 μί培養基中之PCR管條中。在18°C下 將細胞以2000 rpm離心4分鐘並吸出上清液。然後將細胞 固定於200 μΐ^冰冷90%甲醇中並在抗體及DNA染色前，先 在-20°C下儲存至少24小時。將固定細胞以2000 rpm離心4 分鐘，以去除90%甲醇。用200 μί洗滌緩衝液洗滌細胞， 然後在黑暗中在室溫下，用1 00 pL酸緩衝液處理1小時。 用200 pL洗滌緩衝液洗滌細胞2次（直至pH為7.0，經pH試 紙證實）。在室溫下在黑暗中，使用含在洗滌緩衝液中之 抗BrdU-Alexa 647(3 pg/mL)及抗半胱胺酸天冬胺酸蛋白酶 3-FITC(20 μΐ/孔）抗體混合物培育細胞2小時。將染色細胞 離心，並用200 pL洗滌緩衝液洗滌。在4°C下在黑暗中， 用200 μί峨化丙咬（PI)對細胞進行對比染色過夜。藉助流 式細胞儀（LSRII)獲得數據並分析。根據DNA含量、BrdU 及半胱胺酸天冬胺酸蛋白酶-3陽性/陰性群體，基於DMSO 對照組及低劑量/高劑量藥物治療組採用臨界閘。數據以 SubGl DNA含量、4N+ DNA含量、BrdU及半胱胺酸天冬 胺酸蛋白酶-3裂解陽性群體之百分比表示。使用4參數公 式計算濃度-反應曲線及EC5〇值。 150546.doc -23 - 201121956 經AMG 900或紫杉醇（泰素）處理之MES-SA Dx5及MES-SA 細胞系：p-組蛋白H3分析（ArrayScanVTi) 在完全培養基中，將MES-SA Dx5及MES-SA細胞以 10,000個細胞/孔之密度鋪展於96孔板上並培育24小時。次 曰，在10點濃度範圍内（1.25 μΜ至0.0024 μΜ)，用AMG 900或泰素處理細胞24小時，培養基中最終DMSO濃度為 0.1 %。洗滌細胞，並在室溫下添加100 pL 2χ甲醛固定緩 衝液固定10分鐘。洗滌細胞，並用100 kl洗滌缓衝液進行 通透處理15分鐘。用p-組蛋白H3抗體（5 gg/mL)對細胞進行 免疫螢光染色，並在室溫下培育2小時。在100 kL洗滌緩 衝液中洗滌細胞。然後，在補充有Hoechest DNA染料（1 pg/mL)之洗蘇緩衝液中，用山羊抗兔alexa-488結合抗體 (1.5 pg/mL)培育細胞，並在室溫下在黑暗中培育30分鐘。 用100 pL洗滌緩衝液洗滌細胞2次。在Array Scan VTi (Cellomics)上使用生物應用算法（TargetActivation. V2)分 析96孔板。使用4參數公式，由p-組蛋白H3 +標的物（在10x 接物鏡下6個視野/孔之總和）之百分比來產生濃度-反應曲 線及EC5g值。 經AMG 900或紫杉醇（泰素）處理之親代及對泰素有抗性之 NCI-H460細胞系：細胞週期DNA含量分析（流式細胞術） 以500,000個細胞/孔之密度，將親代NCI-H460細胞及對 泰素有抗性之NCI-H460細胞接種於6孔板中的2 mL適當完 全培養基中。次曰，在6點濃度範圍内用AMG 900或泰素 處理細胞，培養基中最終DMSO濃度為0.05°/。。24小時 150546.doc -24- 201121956 後，用BrdU對細胞實施脈衝（1:1 〇〇稀釋）並收穫。將細胞以 1600 rpm離心4分鐘並吸去上清液。在1X pbS中洗滌細胞 並固定於900 pL冰冷90%曱醇中並儲存於-20°C下。將固定 細胞以2000 rpm離心4分鐘以去除90%甲醇。在4°C下在黑 暗中將細胞用200 pL洗滌緩衝液洗滌並用200 μί碘化丙啶 (ΡΙ)染色過夜。藉助流式細胞儀（LSRII)獲得並分析數據。 根據+4Ν(等同於>4N)DNA含量及SubGl陽性群體基於 DMSO治療對照組及低劑量/高劑量藥物治療組應用臨限值 閘門。數據以+4N DNA及SubGl陽性細胞亞群之百分比表 示。使用4參數公式計算+4N(等同於>4N)DNA含量或 S u b G1 細胞 E C 5 〇 值。 經AMG 900或紫杉醇（泰素）處理之親代及對泰素有抗性之 MDA-MB-231 (Fll)-luc細胞系：細胞週期DNA含量分析 (流式細胞術） 以 250,000個細胞/孔之密度，將MDA-MB-231(F11)-1uc 親代細胞及對泰素有抗性之細胞接種於12孔板中的1 mL適 當培養基中，一式兩份。次日，在1 0點濃度範圍内用AMG 900或泰素處理細胞，不含泰素之培養基中最終DMSΟ濃度 為0.1 %。24小時後’用1X胰蛋白酶-EDTA收穫細胞並轉移 至PCR管。將細胞以2000 rpm離心4分鐘並吸出上清液。將 細胞固定於200 μί冰冷90%甲醇中並在-2〇°c下儲存24小 時。將固定細胞以2000 rpm離心4分鐘以去除90%曱醇。將 細胞用洗滌缓衝液洗滌並在4°C下在黑暗中用200 μΐ^碘化 丙啶（PI)染色30分鐘。在獲得數據前，再PI添加4〇〇 0 150546.doc •25- 201121956 PI。藉助流式細胞術（LSRII)獲得並分析數據。根據+4N (等同於24N) DNA含量及SubGl陽性群體基於DMSO治療對 照組及低劑量/高劑量藥物治療組應用鄰限值閘門。數據 以+4N DNA含量陽性群體之對照之百分比表示。使用4參 數公式確定+4N DNA含量細胞EC5〇值。 表1.在活體外AMG 900抑制多種實體腫瘤類型 腫瘤細胞系 來源 AMG 900 ECs〇 (μΜ) HCT 116_JH_p21 -/- 結腸 0.001 HCT 116_JH_p21 +/+ 結腸 0.001 HCT15* 結腸 0.002 HT29 結腸 0.005 SW620 結腸 0.002 SW480 結腸 0.002 HOP-92 肺 0.002 HOP-62 肺 0.002 NCI-H460 肺 0.001 A549 肺 0.001 PC3 前列腺 0.002 DU 145 前列腺 0.002 BT549 乳房 0.004 MDA-MB-231 乳房 0.002 T47D 乳房 0.005 MCF7-p53+ 乳房 0.001 MCF7-p53- 乳房 0.003 CAL51 乳房 0.002 SK-OV-3 卵巢 0.002 MES-SA Dx5* 子宮 0.001 SK-MEL-2 皮膚 0.002 A498 腎臟 0.001 769P* 腎臟 0.002 CAKI-1 腎臟 0.001 SK-HEP-1 肝臟 0.001 SNU449* 肝臟 0.002 111對紫杉醇有抗性之腫瘤細胞系(Gyorffy等人，2006 ; _之細胞增殖

Harker，G.A.等人，Multidrug (Pleiotropic) Resistance in Doxorubicin-selected Variants of Human Sarcoma Cell Line MES-SA. Cancer Research 1985: 45: 4091-4096 ；

Szakacs, G.^A > Predicting drug sensitivity and resistance: Profiling ABC transporter -26- 150546.doc 201121956 genes in cancer cells. Cancer Cell 2004: 6: 129-137 ；

Szakacs，G.等人，Targeting multi-drug resistance in cancer. Nat. Rev. Drug Discovery 2006: 5: 219-234) 表2·在活體外AMG 900阻礙數種血液腫瘤類型之細胞分裂 腫瘤細胞系 血液類型 AMG 900 ECm inM) HL-60 前趙細胞性白血病 0.002 K562 慢性髓樣白血病 0.001 MOLT-4 T細胞白企病 0.002 Jurkat T細胞白血病 0.001 RPMI-8226 多發性骨髓瘤 1 0.002 U266-B1 多發性骨髓瘤 0.002 將細胞用AMG 900處理48小時(無化合物戒斷）。使用多個終點(半胱胺酸天冬胺酸蛋 白酶-3裂解、BrdU、SubGl及+4N DNA含量(24N DNA含量;))實施基於流式細胞術之 分析。使用+4N DNA含量終點產生EC50值。所報告之EC50值代表單一 10點劑量-反應 曲線。 來源 腫瘤細胞系 在24小時下 AMG 900 ECs〇 (μΜ) 在24小時 下紫杉醇 Ε€5〇ίμΜ) 子宮a MES-SA 親代系 <0.002 0.01 MES-SA Dx5* 多柔比星 <0.002 >1.25 乳房b MDA-MB-231 親代系 0.001 0.002 對泰素有抗性之MDA-MB-2311 紫杉醇 0.001 0.095 肺C NCI-H460 親代系 0.001 0.01 對泰素有抗性之NCI-H460 1 紫杉醇 0.001 >0.1 抗性定義為在亞系中之效力(EC50值)損失與親代系相比210倍。 表3.在活體外AMG 900在對紫杉醇有抗性之 _腫瘤細胞系中保持效力 a基於Cellomics之P-組蛋白H3分析。所報告之EC50值代表利用10點劑量反應之單一 實驗。 b基於流式細胞術之DNA含量分析。利用適當DNA含量終點泛4N DNA含量(AMG 900)及Sub G!(紫杉醇))產生EC5〇值。EC50值代表利用10點劑量反應實施兩次之單一實 驗。MDA-MB-231細胞系含有表現綠色螢光蛋白及螢光素酶蛋白二者之轉基因。 e基於流式細胞術之DNA含量分析。利用適當DNA含量终點〇4N DNA含量(AMG 900)及SubGi(紫杉醇))產生EC50值。EC5〇值代表利用6點劑量反應實施之單一實驗。 1對多種藥物有抗性之亞系MES-SA Dx5係自親代MES-SA細胞系藉由使細胞在濃度 漸増之多柔比星存在下生長而形成。MES-SA Dx5細胞系過表現P-gp(Harker等人， 1985)。 150546.doc •27- 1 對紫杉醇有抗性之亞系對泰素有抗性之MDA-MB-231-及對泰素有抗性之NCI-H460 係自其各自之親代系藉由使細胞在濃度漸增之紫杉醇存在下生長而得到。藉助流式 201121956 細胞術，兩種亞系均對P-gp呈陽性。 在10點劑量範圍内（0.0024 μ¥至1.25 μΜ)將子宮腫瘤細 胞系用對照（DMSO)、AMG 900或紫杉醇（泰素）處理24小 時。然後將細胞固定並用Ρ-組蛋白Η3抗體染色並用DNA染 料（Hoechest)進行對比染色。實施基於成像之分析（ArrayScan VTi)以量測ρ -組蛋白H3陽性細胞之百分比。劑量反應曲線 代表對Ρ-組蛋白Η3陽性細胞以經DMSO處理之對照之百分 比（POC)形式繪示的AMG 900或泰素濃度。藉由4-參數擬 合模型計算EC5C值。 在6點劑量範圍内將肺腫瘤細胞系用對照（DMSO)、AMG 900或泰素處理24小時。實施基於流式細胞術之細胞週期 分析以量測24N DNA含量或SubGl DNA含量陽性細胞之百 分比。AMG 900之劑量-反應曲線代表對24N DNA含量陽 性細胞之百分比繪示之藥物濃度。泰素之劑量-反應曲線 代表對SubGl DNA含量陽性細胞之百分比繪示之藥物濃 度。藉由4-參數擬合模型計算EC5〇值。 在10點劑量範圍内將乳房腫瘤細胞系用對照（DMSO)、 AMG 900或泰素處理24小時。實施基於流式細胞術之細胞 週期分析以量測24N DNA含量或SubGl DNA含量陽性細胞 之百分比。AMG 900之劑量-反應曲線代表對24N DNA含 量陽性細胞之百分比繪示之藥物濃度。泰素之劑量-反應 曲線代表對SubG 1 DNA含量陽性細胞之百分比繪示之藥物 濃度。藉由4-參數擬合模型計算EC5〇值。 實例3 150546.doc 28-‘ 201121956 為研究AMG 900誘導之對極光激酶活性之抑制是否會抑 制細胞增殖，在活體内在生長於無胸腺裸鼠中之多種人類 癌症異種移植模型（包括乳癌、結腸癌、白血病、肺癌、 胰腺癌及子宮癌模型）中評價對AMG 900之抗增殖效力。 當形成腫瘤時，在研究開始期間每週連續2天以3.75 mg/kg、7_5 mg/kg或 1 5 mg/kg BID或每天以 3 mg/kg BID經 口投與小鼠AMG 900。試劑、溶液、設備、AMG 900之調 配物、腫瘤體積量測及計算通常係如下文實例4中所述。 與媒劑對照組相比，發現AMG 900在所測試之所有異種移 植模型中均可顯著抑制腫瘤生長（表4)。 _表4· AMG 900抑制多種異種移植模型之生長_ 在活體外*杉醇 M AMG 900^ 之敏感性 來源 ，.’月系 ％TGI*

敏感 不敏感 敏感 敏感 不敏感 不敏感 敏感 敏感 敏感 ND 腸腸腸市市宮宮 <房腺 結結結对胡子子W乳騰 HCT116 83 HCT15 51 Colo 205 58 NCI-H460 85 對泰素有抗性之NCI-H460 66 MES-SADx5 73 MES-SA 86 HL60 68 MDA-MB-231 82 MiaPaCa2 62 (TGI)腫瘤生長抑制，*%TGI選自基於最佳效力反應之間歇或連續劑量療程。 (ND)未測疋’抗性定義為與對紫杉烧有抗性之腫瘤細胞系相比效力損失出c5〇值它倍 測5式AMG 900對以腫瘤異種移植物形式生長於活體内之 多重抗藥性細胞系MES-SA Dx5之效果。在研究期間每週 連續2天以15 mg/kg BID或每天以3.0 mg/kg BID經口投與 小鼠AMG 900。當形成腫瘤時（在腫瘤植入後1〇天）開始給 藥。與媒劑對照組相比，使用AMG 900之劑量及方案二者 150546.doc -29- 201121956 使得AMG 900治療達成統計學上顯著之腫瘤生長抑制（圖 4 ’· ρ<0·0001 ’ 鄧尼特氏事後檢定（Dunnett,s p〇st h〇c test))。在另外2種抗藥性模型（對泰素有抗性之HCTl5& NCI-H460 [I·，抗性;)）中使用類似治療方案亦令人驚奇地達 成與之相當的腫瘤生長抑制（參見表4)。 將MES-SA Dx5多重抗藥性細胞（2xl〇6)經皮下注入雌性 無胸腺裸鼠右側腹中。每週量測腫瘤2次。在第1〇天開始 治療，此時腫瘤為約1 〇〇 mm3 ^以間歇或連續方式p〇給予 小鼠AMG 900(BID)。在整個研究期間所有組每天均提供 營養補充劑以維持體重。數據代表每一組之平均值土sem (每組n=l〇)。P值對應於藉由RmAn〇VA隨後藉由鄧尼特氏 事後檢定測得之經媒劑與經AMG 900處理之各組間的統計 差。箭頭表示開始給藥。 實例4 為研究AMG 900-誘發之對極光激酶活性之抑制是否會 抑制細胞增殖’在活體内評價AMG 900對抗無胸腺裸鼠中 對NCI-H460-泰素有抗性之腫瘤異種移植物之抗腫瘤效 力。以間歇或連續方式PO給予小鼠AMG 900(BID)。11}給 予小鼠紫杉醇（泰素）5天/週。在此研究中使用内部八〇1#11 化合物作為陽性對照（數據未顯示）。每週量測腫瘤2次。在 第12天當形成腫瘤時開始治療。在整個研究期間所有組每 天均提供營養補充劑以保持體重。 動物及組織 種類/品種： 無胸腺裸體 150546.doc -30- 201121956

數量/性別： 平均體重： 組織類型： 來源： 125只/雌性 在隨機曰為20-30克 對NCI-H460泰素有抗性 Amgen癌症藥理學細胞庫（Amgen 個體疾病狀態： 動物護理： Cancer Pharmacology Cell Bank) 荷瘤小鼠 AM!ALAR言免万包 測試物品： 製造商： 測試材料 AMG 900 Amgen公司 測試物品： 製造商： 泰素 Bristo-Myers Squibb 測試化合物： 原料濃度： 調配方式： 媒劑： 臨床試劑調配物 AMG 900 1.5 mg/mL、0.3 mg/mL 一週一次，在7天内使用 2% HPMC/1% TW80 pH 2.2 劑量（以個體體 重計 10 mL/kg): 投與途徑： 劑量範圍：0.20-0.30 mL PO 測試化合物： 原料濃度： 調配方式： 泰素 6 mg/mL 購自 BurtVPharmacy 製造商：Bristol-Meyer's Squibb 媒劑： 鹽水 劑量（以個體體 劑量範圍：0.20-0.30 mL I50546.doc •31 · 201121956 重計 10 mL/kg):

投與途徑： IP 調配物 將AMG 900(游離鹼）調配成濃度為1.5 mg/mL及0_3 mg/mL的懸浮液。給藥體積等效於10 mL/kg。泰素（Bristol Meyers Squibb)係購自 Burt's Pharmacy (Newbury Park, CA) 並每天自6 mg/mL的原料濃度稀釋至1.25 mg/mL工作溶 液0 治療方案 組 η 途徑 治療劑 劑量(mg/kg) 方案 1 10 Ρ0 媒劑 - BID 7天/週X 3週 ~~ 2 10 Ρ0 AMG 900 3 BID 7天/週X 3週^ 3 10 Ρ0 AMG 900 15 BID每週2天給藥/5天^^ 3週 ” 4 10 IP 泰素 12.5 QD5 天/週 ><2ii〜一 _ AMG 900給藥期之持續時間為3週，且泰素組為2週。利 用數位卡尺量測腫瘤並每週稱量小鼠2次。腫瘤體積如下 計算：腫瘤體積（mm3)=[(W2xL)/2]，其中寬度（W)定義為2 次量測中較小者且長度（L)定義為2次量測中較大者。腫冑 抑制如下計算：首先，對對照及所有治療組採用[初始腫 瘤體積減去最終腫瘤體積];其次，採用經治療腫瘤體積 之變化除以對照腫瘤體積，減去1且然後乘以1 〇〇。下文表 5及圖5闡述腫瘤體積及腫瘤生長抑制結果。 150546.doc •32· 201121956 表5.腫瘤體積數據之匯總 組 平均值 標準誤差 %抑制 中值 媒劑(HPMC)，PO BID 7 天 1680 215 0.0 1749.7 AMG 900 3 mpk，PO BID 7天 771 104 60.4 715.6 AMG 900 15 mpk，PO BID 2 天 689 107 65.7 612.5 泰素 12.5 mpk，IP QD 5天 1383 283 19.7 1072.0 圖5圖解說明AMG 900及泰素治療對所形成對H46〇-泰素 有抗性之腫瘤生長之效果。將細胞（每個動物2x 1 〇6個）經皮 下注入雌性裸鼠右側腹中（每組n= 1〇)。每週量測腫瘤2 次。在腫瘤植入12天後開始治療（箭頭），此時腫瘤為約1 7〇 mm3。小鼠每天PO或IP給藥1或2次，持續3週。數據代表 每組之平均值土 SE。*P值（未顯示）對應於經媒劑與AMG 900或泰素處理之各組間的統計差異，其係利用隨時間流 逝重複量測薛費氏（Sheffe's) ANOVA使用STATview進行分 析。圖例中所列示之計劃天數代表天/週。在整個研究中 所有組均提供營養補充劑。 如上文圖5所圖解說明，當以連續方式（3 mg/kg BID，持 續7天（60。/。抑制，ρ=0·00〇3))或以間歇方式（15 mg/kg BID，每週2天給藥/5天不給藥（66%抑制，ρ<〇·〇〇〇1))投與 時，用AMG 900治療荷瘤小鼠可顯著抑制腫瘤生長。在此 實驗中，當經兩次給藥週期以12.5 mg/kg IP給藥計5天/週 時，泰素不能顯著抑制腫瘤生長（20%抑制，p=0_5399)。 令人驚奇且出人意料地發現AMG 900在對下述3種經良 好表徵之極光激酶抑制劑有抗性之腫瘤細胞系中保持活 150546.doc -33· 201121956 性：AZD1152 ; VX-680(通常亦稱為 ΜΚ-0457);及 PHA-73 93 5 8(達努塞替（〇31111361^13))。用於此等實驗之抑制劑係 於文獻中公佈並表徵之化合物。例如，參見Expert Opinion Investigational Drugs (2009) 18 (4)，第 379 頁至第 398 頁； Expert Opinion Therapeutic Patents, (2009) 19 (3)，第 321 頁至第3 56頁。達努塞替（PHA-73 93 58)在患有晚期或轉移 性實體腫瘤之I期患者中之詳細安全性、耐受性及pK特性 (包括化學結構）係自Steeghs等人，Journal of Clinical Oncology，27, 2009 中獲得。 下文所給出之數據指示AMG 900在對泰素有抗性之細胞 系中之活性，並與上文所提及之三種吾人所熟知之極光激 酶抑制劑在相同的對泰素有抗性之細胞中抑制組蛋白H3磷 酸化之能力進行比較。 實例5 在表現Ρ-gp或BCRP藥物外排轉運體之MDR腫瘤細胞系 亞群中評價三種極光激酶抑制劑（AZD1152、MK-0457及 PHA·739358)。出人意料地，對於所測試之所有細胞系， AMG 900均可抑制P-組蛋白H3或誘導多倍性而無論P-gp或 8<：111>狀態如何，其中具有一致IC50或EC50值（2 nmol/L至3 nmol/L)。相反，與配對敏感腫瘤細胞系相比，其他極光 激酶抑制劑在MDR細胞系中一或多者中之效力較小，如下 文表6中所示。 材料及方法 化合物材料：以下化合物之分子結構係在公共領域獲得： I50546.doc -34- 201121956 紫杉醇及多西紫杉醇、MLN8054、ΜΚ-0457、AZDl 152及 PHA-739358。該等材料係自市售來源購得，若適用，紫 杉烧類亦可自市售來源購得。 細胞系：除非另有說明，否則腫瘤細胞系係自美國菌種保 存中心（ATCC)獲得。MDA-MB-231-PTX及 NCI-H460-PTX 細胞系係藉由使細胞在濃度漸增之紫杉醇存在下生長6個 月時間而形成。對AZD1152有抗性之HCT116細胞系係藉 由使細胞在80 nmol/L AZD1152存在下生長而形成。 動物：所有實驗程序均係按照機構動物管理及使用委員會 (Institutional Animal Care and Use Committee)及美國農業 部（U.S· Department of Agriculture)規則實施。將4至6週大 的雌性無胸腺裸鼠（Harlan Sprague Dawley)圈養在滅菌籠 裏並保持在無菌條件下。圈養動物的實驗室需提供交替晝 夜週期（各12小時）並滿足國際實驗動物評估及認可管理委 員會（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)規範之標準。食物、水及營養補 充劑均自由獲取。所有藥物均基於每一小鼠之個體體重投 與。 基於螢光之細胞成像分析：所有高内涵細胞分析均係在 Array Scan VTi HCS讀數儀（Cell omics)上實施。將腫瘤細胞 用 AMG 900、AZD11 52、MK-04 57 或 PHA-7393 58(濃度範 圍基於效力而變化）處理。如先前所述（1)製備細胞用以經 抗p-組蛋白H3 Ser10抗體細胞内染色。用抗兔igG_aiexa_ 568抗體及DAPI實施檢測。使用乾標活化V2算法 150546.doc -35- 201121956 (Cellomics)來分析p-組蛋白H3之細胞含量以確定陽性細胞 之百分比。對於成像分析而言，使用感染細胞與DMSO對 照之百分比計算濃度-反應曲線及相應IC5()&EC5()值。 集落形成分析：將腫瘤細胞用AMG 900、紫杉醇或 AZD1152(0.5 nmol/L、5 nmol/L、50 nmol/L)處理 48小時， 用完全培養基洗滌2次，並在不含藥物之完全培養基中重 新將細胞以5000個細胞/孔之密度鋪展。使細胞生長直至 DMSO對照孔鋪滿。用結晶紫色染料（Sigma)對細胞進行染 色，用蒸餾水洗滌，並使用數位掃描儀（Hewlett-Packard) 成像。 24N DNA含量分析：將腫瘤細胞用AMG 900、AZD1152、 MK-0457或PHA-739358(濃度範圍基於效力而變化）處理24 小時並如先前所述（1)加以處理以用於細胞週期分析（僅 DNA染色）。在LSRII流式細胞儀上使用BD FACS Diva軟體 分析細胞。使用具有^4N DNA含量之細胞與DM SO對照之 百分比計算濃度-反應曲線及相應EC5〇值。 P-gp及BCRP細胞表面染色：藉由在冰上用FITC-結合之P-gp(BD Bioscience)或 APC-結合之 BCRP(Millipore)抗體將肝 細胞染色30分鐘來測定P-gp(ABCBl)及BCRP(ABCG2)之細 胞表面表現。使用配對同種型抗體（BD Bioscience)作為對 照並使用存活染劑7-胺基放線菌素D(7-aminoactinomycin D)(BD Biosciences)來排除死亡細胞。在LSRII流式細胞儀 上使用BD FACS Diva軟體分析細胞。 極光激酶基因分析：使用標準核酸提取方法自冷凍 150546.doc •36- 201121956 HCT116細胞沉澱（三種對AZD1152有抗性之細胞亞純系及 一種親代細胞對照）分離出所有RNA及基因組DNA。所有 RNA均用於產生cDNA(先進RT-PCR套組，Clontech)。使用 長效型聚合酶套組（Expand-polymerase-long-template kit) (Roche)實施全長極光激酶-A及-B基因轉錄物之PCR擴增。 PCR引物對包括：極光激酶-A(GCTTGTTACTTATTACAGC TAGAGGCATCATG及 TCAAGGATTTCTCCCCCTGCACGAT TC)、極光激酶-B(TCTCCTCCCCCTTTCTCTCTAAGGATG 及 ACCCGAGTGAATGACAGGGACCATC) 〇 使用與上文戶斤 述相同之PCR套組自基因組DNA使用7個引物組基於5’及3’ 側翼内含子擴增極光激酶-C之7個外顯子 ((AACAGCCATCCAGAGGGTTCAGGAAGACCACACACCC AGTCTGTTCTTCATCC)、（AAGGGG AGCATTGGCATCCCT GACTTTC 及 GTATTTGGGGAAAATGCTGGGCTCAGAC)、 (ACCAGGCAGTGACGGTGGCATCATATG 及 TGACAGCCAC AAACAGAGCTCCCAC)、 （GGTAAGTGTTCCACCTCAGAC GGAAATTG及 CATTAAACTGGGTCATTCCTAACTGGTACT CAG)、（CTCAATGAAAGCTGGGGAAGGAGAATTTCC 及 AGAGGCATTGATAGTGGAAACCTCACATC)、及（ACAGTG AGACTTACAGACGCATCCTCAAG及 AGGAGAGCTCCCTG AACACACACAAAG))。根據製造商推薦之方案（Invitrogen) 將PCR DNA產物亞選殖至pCR2.1載體中。使用側翼載體引 物對含有極光激酶-A、-B及-C基因產物之純化質粒實施雙 脫氧循環測序。在3730x1 DNA分析儀（Applied Biosystems) 150546.doc • 37- 201121956 上進行測序反應，並使用Sequencher軟體（Gene Codes公 司）分析輸出序列。 表6圖解說明AMG 900如何對多重抗藥性腫瘤細胞系展 示同等效力。

表6-A 細胞系名稱 P-gp 狀 態 AMG 900 P-組蛋白H3分析，IC5〇值(nmol/L) AZD1152 MK-0457 PHA-739358 親代 NCI-H460 - 3 131 123 510 對紫杉醇有抗性之 NCI-H460 PTX + 3 >500 468 >1250 親代 MDA-MB-231 2 16 43 49 對紫杉醇有抗性之 MDA-MB-231 PTX + 3 >500 277 >1250 親代MES-SA - 3 51 51 113 對多柔比星有抗性 之 MES-SA-Dx5 + 2 >500 >1250 >1250 細胞系 BCRP 狀態 2 4NDNA含量分析，EC5{)值(nmol/L) AM G 900 AZD1152 MK-0457 PHA-7^935R U226-B1 - 2 12 46 67 RPMI8226 + 3 865 162 >1250 注意：NCI-H460-PTX細胞系來源於肺；MDA-MB-231-PTX細胞系來源於乳腺， MES-SADx5細胞系來源於子宮，且RPMI-8226細胞來自多發性骨髓瘤。 利用如下文表6-B中所示之額外細胞系實施類似實驗。 150546.doc 38- 201121956

表6-B 細胞 EC5〇 (nM) AMG 900 AZD1152- HQPA PHA- 739358 MK-0457 細胞系 來源 MCF-7 乳房 1 11 68 27 NCI-H460-PTX* 肺 3 >500 >1250 468 HCT15* 結腸 2 >625 >1250 908 MES-SADx5* 子宮 2 >500 >1250 >1250 MDA-MB-231- PTX* 乳房 3 >500 >1250 277 SNU499* 肝臟 2 >1250 >1250 ND 769Ρ* 腎臟 4 703 >1250 ND RPMI-8226** 多發性骨 髓瘤 3 865 >1250 162 注意：ABC轉運體狀態(*=P-gp+ ; **=P-gp-及/或BCRP+) ND =未測定 實例6 另外，在活體内評價AMG 900對抗適合在AZD 1152(極 光激酶B之一種選擇性抑制劑）存在下生長之HCT-116細 胞。此實驗亦為對極光激酶抑制劑之抗性之可能替代機制 提供了一些信息。因此，HCT116細胞適合在AZD1152存 在下生長。然後，在親代HCT116細胞系及對AZD1152有 抗性之HCT11 6細胞系中評價AMG 900之活性。 已驚奇地發現AMG 900可誘發多倍性並抑制適於在 AZD1152存在下生長之HCT116亞系集落之形成。與 AZD1152 之 34 nmol/L 及 672 nmol/L相比，AMG 900 之細胞 之 4N DNA含量 EC50值分別為 2 nmol/L及 5 nmol/L(圖 6-A)。 AMG 900在濃度之5 nmol/L下即可抑制兩種HCT116細胞系 150546.doc •39- 201121956 之集落形成，而變體亞系在50 nmol/L下仍對AZD1152不敏 感（圖6-B)。兩種HCT116細胞系對紫杉醇同樣敏感且對p-gp及BCRP表現呈陰性（圖6-C)。令人感興趣的是，HCT110 變體亞系在極光激酶-B基因之等位基因中包含錯義突變 (TGG4TTG ; W221L)，而在極光激酶-A及-C基因中未檢 測到突變。此等結果表明AMG 900在對AZD1152有抗性之 腫瘤細胞（且更具體而言，在極光激酶-B中攜帶雜合子突 變之腫瘤細胞，該雜合子突變可能係造成對AZD1152之抗 性之原因）中保持活性。因此，出人意料之陽性數據指示 MAG 900具有在治療已對AZD1152有抗性之腫瘤細胞中保 持有效之令人驚奇的能力。 方法： 圖6-A :將HCT116細胞系用濃度漸增之AMG 900或 AZD1152處理24小時。使用流式細胞術來評估細胞積累， MN DNA含量以經DMSO處理之對照之百分比（POC)表 示。濃度-反應曲線及所計算之EC5Q值係自兩個獨立的實 驗（巴，土SD)測得。 圖6-B :利用HCT116細胞系（親代及對AZD1152有抗性）實 施集落形成分析。將細胞用DMSO、AMG 900、AZD1152 或紫杉醇以指定濃度處理48小時並重新鋪展於不含抑制劑 之完全培養基中。在經DMSO處理之細胞鋪滿時，用結晶 紫將細胞染色並成像（成對孔）。 圖6-C :藉由流式細胞術評價並分析p_gp及BCRP在經藻紅 蛋白（PE)-結合之p_gp及別藻藍蛋白（APC)-結合之BCRP抗 150546.doc •40· 201121956 體共染色之HCT116細胞系（親代及對AZD1152有抗性）之細 胞表面上之表現程度。對每一細胞系使用同種型對照以建 立背景螢光。MES-SA-Dx5及RPMI 8226細胞系分別用作p_ gp及BCRP表現之陽性對照。 動物： 接收5-6週大的雌性無胸腺裸鼠（Harlan Sprague Dawley) 並圈養在滅菌籠裏。反滲透水及高壓滅菌食物自由獲取。 所有動物研究均係按照國際IACUC方案實施且滿足所有 AAALAC規範。 藥效分析（磷酸化組蛋白H3之檢測）： 以指定劑量向已形成人類HCT 116或Colo 205異種移植 腫瘤之小鼠投與單次口服劑量的對照（僅媒劑）或AMG 900(n=3只動物/組）。3或6個小時後，收集腫瘤、骨髓或皮 膚組織以用於藥效評價（P_組蛋白H3含量）。亦收集血漿以 用於藥物代謝動力學分析。 流式細胞術（FCM):將腫瘤分離至在單一細胞懸浮液中並 在-20°C下在90%甲醇中固定至少24小時。然後用抗p_組蛋 白H3(ser-10)及抗細胞角蛋白抗體對細胞進行染色並用碘 化丙啶進行對比染色。在LSRII流式細胞儀上運用 FACSDiva軟體來獲得數據。針對p_組蛋白H3評價細胞週 期之G2M期中之骨髓及細胞角蛋白陽性腫瘤細胞。自經媒 劑處理之小鼠收集腫瘤及骨髓細胞以用作組蛋白基線 對照。統計顯著性係藉由單程ANOVA分析來測定。 雷射掃描細胞計數儀（LSC):使用抗p-組蛋白H3抗體，隨 150546.doc • 41 - 201121956 後使用alexa-633結合之山羊抗兔igG對來自FFPE組織樣品 (皮膚及腫瘤）之三份切片進行染色。載玻片安裝有Pr〇1〇ng

Gold抗衰退劑（包括DNA染料Hoechst33342)。在LSC上使 用40x物鏡（在0.5 μ像素解析度下）捕獲圖像。基於所定義 紅色螢光閾值來測定ρ-組蛋白Η3事件之數量。只有事件大 於20 μηι2時才會計數》將經計數之事件重新放置於圖像工 作臺（image gallery)上以檢驗分割準確度。使用SAS V9.3 利用所應用鄧尼特氏檢定來分析數據。所有統計測試均係 在α=0.05顯著性水準下評價。 細針抽吸檢查（Fine Needle Aspirate)(FNA):藉由經由小 切口將25號針插入在預定及連貫圖案（3X)内之腫瘤周圍皮 膚中來收集腫瘤抽吸物，然後排至2%多聚曱醛中。用細 胞離心儀將細胞甩至顯微鏡載玻片上並用對EpCAM(上皮 細胞腫瘤標記物，Alexa Fluor 488)及pHH3(有絲分裂標記 物，Alexa Fluor 647)有特異性之抗體染色並用DAPI(DNA 含量）進行對比染色。使用iCyte LSC(lasers 405 nm，488 nm，633 nm，PMT filters : 450/40，530/30，650/LP)來捕獲 40x放大倍率圖像並量化EpCAM、pHH3及DNA含量。藉由 將細胞圖像重新放置於工作臺上來檢驗群體之完整性。報 告了 G2M中EpCAM、pHH3陽性細胞之數量。數據以平均 +/-平均標準誤差（SEM)之形式表示。使用ANOVA，隨後使 用邦弗朗尼鄭尼特氏（Bonferroni Dunnett's)事後分析來測 定統計顯著性。 血漿中之AMG 900濃度（藥物代謝動力學分析）： 150546.doc -42- 201121956 藉由添加溶劑混合物（？〇%曱醇、含有0.01%三氟乙酸之 10%水）來提取血漿樣品（5〇 pL)以將分析物與沉澱血漿蛋 白分離。藉由LC-MS/MS使用反相液相層析在Varian Pursuit PFP分析管柱（2.0x30 mm，5微米）上利用存於水中 之0.1%甲酸（移動相A)及含有〇_1〇/。曱酸之乙腈（移動相B)來 測定提取樣品中之AMG 900濃度。 異種移植模型： 小鼠經皮下注射2x1 〇6個人類HCT 11 6結腸腫瘤細胞。當 形成腫瘤時（約200 mm3) ’隨機抓取小鼠進入實驗治療組 (n=10)並在實驗期間每天以丨5 mg/kg、2·25 mg/kg或3 mg/kg或以間歇方式以3.75 mg/kg、7 5 mg/kg415 mg/kg 經 口給予AMG 900進行治療。每天均提供小鼠營養補充劑。 仔細地使用卡尺及數位分析天平每週記錄腫瘤體積及體重 2次。腫瘤數據由平均腫瘤體積+/_量測標準誤差表示。腫 瘤生長抑制之統計顯著性係藉由重複量測an〇va (RMANOVA) ’隨後進行薛費（Scheffe)事後檢定分析來測 實例7

生長抑制（TGI)之最大百分比報告於 t长之活體内效果。每週連續2 >或每天以3 mg/kg b.i.d·(計3週） 900。每—異種移植模型之腫瘤 比報告於下文表7中。在研究期 150546.doc -43- 201121956 期間TGI之百分比係按經媒劑處理之對照之腫瘤體積與經 AMG 900處理之腫瘤體積的變化差進行計算。藉由 RMANOVA，隨後藉由薛費或鄧尼特事後檢定來測定統計 學上顯著之腫瘤生長抑制且由星號表示（*Ρ<0·005， **Ρ‘<0·0005)，並與經媒劑處理之對照進行比較。 與經媒劑處理之對照組相比，AMG 900在全部9種異種 移植模型中均展示顯著抗腫瘤活性（腫瘤生長抑制（TGI)為 50%至97%)。重要的是，AMG 900在多西紫杉醇或紫杉醇 有抗性之MES-SA-Dx5(840/。TGI，Ρ<0.0001)及 NCI-H460-PTX(66% TGI，Ρ<0·0001)異種移植模型中具有活性， AMG 900係以兩種模型各自之最大耐受劑量投與。 因此，AMG 900抑制活體内多種人類腫瘤異種移植物之 生長，其包括多重抗藥性模型及護理標準抗有絲分裂藥 物。特定而言，數據顯示AMG 900令人驚奇地抑制激光-Β 在HCT116腫瘤中之活性且抑制代表多種腫瘤類型之多種 異種移植物之生長。 表7 腫瘤模型 來源 最大TGI (%) MDA-MB-231 乳房 82** COLO 205 結腸 73* HCT-15(MDR) 結腸 50* HCT116 結腸 85** NCI-H460 肺 85** NCI-H460-PTX (MDR) 肺 65** MiaPaCa2 胰腺 60** MES-SA 子宮 87** MES-SA-Dx5 (MDR) 子宮 84** 參考文獻：Payton M，Chung G，Yakowec Ρ等人，Discovery and evaluation of dua CDK1 and CDK2 inhibitors. Cancer Res 2006; 66:4299-4308。 適應症 150546.doc -44· 201121956

對於不同試劑，腫瘤對極光激酶抑制劑產生抗性之機制 可能有所不同。儘管更清楚地瞭解驅動癌症表型之分子力 將為可利用對給定療法之可識別遺傳或表觀遺傳易感性之 分子乾向藥物或療法提供依據，但瞭解對療法之抗性的遺 傳學基礎亦至關重要。此遺傳學瞭解可提供劃分預期患者 群體之額外篩選程序。舉例而言’已公佈之遺傳學證據表 明極光激酶抑制劑AZD11 52(目前正對其進行臨床評價）及 潛在地另一臨床化合物νχ_680在過表現MDR1或BCRP之 腫瘤細胞中可能相對無效。在選擇DNA修復有缺陷的結腸 癌系HCT116期間出現的極光b激酶結構域突變可導致抗 性°發現此等催化結構域突變亦足以致使細胞對Azd 11 52及 VX-680產生抗性’表明對此等試劑之抗性之出現與MDR 無關。The Pharmacogenomics Journal, (2009) 9 ’ 第 90 頁至 第102頁。 本發明提供化合物AMG 900( —種極光激酶抑制劑），其 月色夠治療傳統護理標準化學治療劑難以治療之癌症，該等 化學治療劑包括抗有絲分裂劑，例如紫杉烷類（紫杉醇及 多西紫杉醇）及春花生物鹼類。另外，AMG 9〇〇能夠治療 對其他極光激酶抑制劑有抗性之癌症，該等極光激酶抑制 劑包括（但不限於）AZD 11 52、VX-680及PHA-739358。通 常，此等腫瘤因先前及/或長期經抗癌劑治療而產生抗 性。 因此，在本發明之一個實施例中，提供治療個體癌症之 方法，該方法包含向個體投與有效劑量的化合物N_(4_((3_ 150546.doc •45- 201121956 (2-胺基-4-t定基）_2·吼咬基）氧基）苯基Μ_(4·甲基i噻吩 基）-1-吹畊胺，其中個體癌症先前曾接受過抗癌劑治療。 在另一實施例中，抗癌劑係化學治療劑。在另一實施例 中，化學治療劑係抗有絲分裂劑或蒽環抗生素。在又一實 施例中，化學治療劑係選自由下列組成之群之試劑：泰 素、多西紫杉醇、長春新鹼、長春鹼、長春地辛、及長春 瑞濱、柔紅黴素、多柔比星、伊達比星、表柔比星、及米 托惹酿。在又一實施例中，抗癌劑係AZD1152、PHA-739358、MK-0457或其組合。 因此’ AMG 900可用於治療細胞增殖病症（包括失控之 細胞生長及細胞週期調控異常），該等病症先前亦已經紫 杉烷類護理標準療法治療。 為此’ AMG 900可用於（但不限於）預防或治療癌症，該 等癌症包括（例如）各種實體腫瘤及血液學上衍生之腫瘤， 例如癌，包括（但不限於）膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、 肝癌、肺癌（包括小細胞肺癌）、食道癌、膽囊癌、印巢 癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、曱狀腺癌、前列腺癌、子 宮癌及皮膚癌（包括鱗狀上皮細胞癌）；淋巴譜系之造血系 統腫瘤（包括白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴 胚細胞性白血病、B-細胞淋巴瘤、T-細胞淋巴瘤、霍奇金 氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤及伯基特氏 (Burkett's)淋巴瘤）；骨髓譜系之造血系統腫瘤（包括急性及 慢性髓細胞性白血病（AML及CML)、骨髓間質異常症候群 及早幼粒細胞性白血病）；間質來源腫瘤（包括纖維肉瘤及 150546.doc •46· 201121956 裰.’·文肌肉瘤、及其他肉瘤，例如軟組織肉瘤及骨肉瘤）； 中枢及外週神經系統腫瘤(包括星形細胞瘤、神經胚細胞 瘤、膠質瘤及許旺氏細胞瘤（schwann〇ma));及其他腫瘤 (包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、骨肉冑、著色性 乾皮症、角化棘皮瘤、甲狀腺毛囊癌及卡波西氏肉瘤）， 其中該等癌症已難以治療。 在-個實施例中，本發明提供治療—或多種選自由下列 組成之群之個體癌症的方法：子宮癌、乳癌、肺癌包括非 小細胞肺癌'結腸癌、前列腺癌、皮膚癌、腎癌、肝癌、 白血病（包括早幼粒細胞性白血病、慢性骨髓性白血病及τ 細胞白血病）、多發性骨髓瘤、印巢癌及骨髓癌，該方法 包含向個體投與有效劑量的AMG刪，其中個體之癌症先 前經-或多種選自由下肋成之群之化學治療劑治療過且 難以治療：多柔比星、柔紅黴素、更生徽素、秋水仙素、 長春鹼、長春新鹼、紫杉醇、多西紫杉醇、依託泊苷及米 托蒽醌。在另一實施例中，本發明提供治療一或多種選自 由下列組成之群之癌症的方法：膀胱癌、乳癌、結腸癌、 腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、食道癌、胃 癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、曱狀腺癌及前列 腺癌或淋巴瘤或白血病。 本發明亦提供治療以下疾病之方法：實體腫瘤、肉瘤 (尤其尤因氏（Ewing’s)肉瘤及骨肉瘤）、視網膜胚細胞瘤、 橫紋肌肉瘤、神經胚細胞瘤、造血系統惡性腫瘤（包括白 血病及淋巴瘤）、腫瘤誘發之胸膜或心包積液、及惡性腹 150546.doc -47· 201121956 水。 除可用於人類治療外，該化合物亦可用於伴㈣物、外 來動物及家畜（包括哺乳動物、餐齒類動物及諸如此類）等 獸類治療。舉例而言，護理標準癌症化學療法治療難以治 療之動物（包括馬、犬及猫）癌症同樣可用amg 9〇〇進行治 療0 AMG _可與一或多種無毒醫藥上可接受之載劑、稀釋 劑及/或佐劑（在本文中共同稱為「賦形劑」材料）以包含化 合物（其為本發明之活性醫藥成份或Αρι)Ν_(4·((3_(2_胺基· 4♦定基W定基）氧基）苯基）_4_(4_甲基〜塞吩基）小吹 呼胺之醫藥組合物或藥劑形式聯合投與癌症個體。可根據 習用配藥方法處理AMG 9〇〇或其醫藥上可接受之鹽形式以 製造投與患者（包括人類及其他哺乳動物）之醫療:醫藥組 合物。 醫藥組合物可藉由任-適宜途徑（適合此一途徑）且以預 計對難治性癌症治療有效之劑量投與個體。組合物或奶 可（例如）經口、經黏膜、經㈣、經直腸、經肺（例如藉由 或非㈣（包括血管内、靜脈内、腹膜内、皮 下、肌内、胸t内及輸注技術）以含有習用f藥上可接受 之載劑、佐劑及媒劑之劑量單元調配物&肖。 又 對於口服投與而言’醫藥組合物可呈(例如)錠劑、膠 囊、懸浮H液體形式。„組合物較㈣成含有特定量 活性成份之劑量單元形式1等劑量單元之實例係鍵劑或 150546.doc -48- 201121956 膠囊。舉例而言，此等可含右的 哥』3有、力1 „^至2〇〇〇 mg且通常約i mg至500 mg之量的活性成份。人 风物人類或其他哺乳動物之適宜 日劑量可視患者病況及其他因夸古 口京有所變化，但可再次使用 例行方法及實踐確定。 所投與API (AMG 900)之量及用於治療難治性癌症病況 之劑罝療程取決於多種因素，包括個體年齡、體重、性別 及醫學病況、疾病類型、癌症嚴重程度、投與途徑及頻 率及AMG 900或其具體形式（包括特定鹽形式）之物理及 化學性質。因，劑量療程可能有變化。日劑量為約〇〇1 mg/kg體重至500 mg/kg體重可能較為適當，有利地介於約 〇.〇1 mg/kg體重與約50 mg/kg體重之間’更有利地介於約 〇·1 mg/kg體重與約30爪以“體重之間且甚至更有利地介於 約0.1 mg/kg體重與約25 mg/kg體重之間。在一個實施例 中，本發明k供治療個體癌症之方法，該方法包括以介於 約0.5 mg/kg至約25 mg/kg間之有效劑量向個體投與amG 900或其醫藥上可接受之鹽’其中該個體癌症利用抗有絲 分裂劑難以治療。在另一實施例中，本發明提供治療個體 癌症之方法’該方法包括以介於約1 .〇 mg/kg至約20 mg/kg 間之有效劑量向個體投與AMG 900或其醫藥上可接受之 鹽’其中該個體癌症利用標準護理化學治療劑（包括抗有 絲分裂劑）難以治療。在又一實施例中，本發明提供一種 治療個體癌症之方法，該方法包括以介於約3.〇 mg/kg至約 15 mg/kg間之有效劑量向個體投與amG 900或其醫藥上可 接受之鹽’其中該個體癌症利用抗有絲分裂劑難以治療。 150546.doc -49- 201121956 曰劑量可以1 -4次給藥/天投與。 就治療目的而言’ AMG 900可與一或多種適合指定投與 途徑之佐劑或「賦形劑」組合。若以每劑量計投與，則可 將AMG 900與乳糖、蔗糖、澱粉粉末、鏈烷酸之纖維素 酉曰、纖維素烧基醋、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎮、氧化 鎂、磷酸及硫酸之鈉鹽及鈣鹽、明膠、阿拉伯膠、海藻酸 鈉、聚乙烯基吼咯啶酮及/或聚乙烯醇混合，形成最終調 配物。舉例而s，AMG 900及賦形劑可藉由已知且接受之 習用投與方法製錠或囊封。適宜調配物之實例包括（但不 限於）丸劑、錠劑、軟殼及硬殼明膠膠囊、含片、可經口 溶解之形式及延遲或控制釋放之調配物。具體而言，膝囊 或錠劑調配物可以含有一或多種控制釋放劑（例如羥丙基 曱基纖維素），其與API —起形成分散液形式。 在牛皮癖及其他皮膚病況之情況下，較佳可將AMG 9〇〇 之局部製劑施於患部，每天2次至4次。適於局部投與之調 配物包括適於透過皮膚之液體或半液體製劑（例如，擦 劑、洗劑、軟膏、乳霜、膏劑、懸浮液及諸如此類）及適 於投與眼睛、耳或鼻之滴劑。活性成份之適宜局部劑量為 0.1 mg至150 mg，每天投與丨次至4次，較佳丨次或2次。對 於局部投與而言，API可佔調配物的〇·〇〇1%〜&至1〇% w/w(例如，i重量％至2重量％)，但其可佔調配物之至多達 10% w/w，但較佳不超過5%w/w，且更佳〇 1%至1%。 當以軟膏形式調配時，AMG 900可與石蠟或水可混溶軟 膏基質-起使用。另一選擇為，水包油型乳霜基質將 150546.doc -50· 201121956 其調配成乳霜。若期望，則乳霜基質之水相可包括（例如） 至少30% w/w的多元醇，例如丙二醇、丁烷二醇、甘 露醇、山梨醇、甘油、聚乙二醇及其混合物。局部調配物 可合意地包括一種可增強活性成份經過皮膚或其他受感染 區域之吸收或滲透之化合物。該等真皮滲透增強劑之實例 包括DMSO及相關類似物。 AMG 900亦可藉由透皮裝置投與。較佳地，透皮投與可 使用儲層及多孔膜型貼片或固體底物類貼片來實現。在任 一情形下，AMG 900均係自儲層或微膠囊經由膜進入活性 5式劑可滲透黏著劑來連續遞送，該黏著劑係與接受者之皮 膚或黏膜接觸。若AMG 900係經由皮膚吸收，則向接受者 投與控制且預定流量的AMG 9〇〇。在微膠囊之情形下，微 膠囊劑亦可用作膜。 乳液之油相可由已知成份以已知方式構成。儘管該相可 能僅包含乳化劑，但其可包含至少―種乳化劑與脂肪或油 或者與脂肪及油：者之混合物。較佳地，包括親水性乳化 劑與用作穩定劑之親脂性乳化劑。亦較佳包括油與脂肪二 者同時，乳化劑在有《沒有穩定劑之情況下形成所謂的 礼化蠟，且該蠟與油及脂肪一起形成所謂的乳化軟膏基 質卞’其形成乳霜調配物之油十生分散才目。適用於調配物之^ =及孔液穩定劑包括（例如）Tween 6〇、外时8〇、_硬 月=、肉豆謹醇、單硬脂酸甘油s旨、月桂基硫酸鈉、二硬 醋酸甘油酿，1¾等可單獨或與蠟或其他業内習知材料一起 150546.doc •51 - 201121956 由於A PI在大多數可能用於f藥乳液調配物之油中之溶 解度極低’制於該調配物之適宜油或脂肪之選擇應基於 達成預期化妝性質…匕，乳霜較佳應為非油脂、未染色 且可洗產品’同時應具有適宜之稠度以避免自管或其他容 器洩漏。可使用直鏈或具支鏈、一元或二元烷基醋，例如 二異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子脂肪酸之丙二醇二 酿、肉豆慈酸異丙酿、油酸癸基酉旨、掠搁酸異丙醋、硬脂 夂丁西曰；^栎]酉夂2-乙基己基酉旨或若干具支鏈_之摻合物。 端視所需性質而定，此等可單獨或組合使用。另一選擇 為，可使用諸如白色軟石躐及/或液體石壤或其他礦物油 等高熔點脂質。 適於局部投與眼睛之調配物亦包括其巾活性成份已溶解 或懸浮於適宜載劑中之滴眼劑，尤其AMG 900之水溶劑。 AMG _較佳以〇.5%心至2〇%咖之濃度存於該等調配 物中，有利地0.5〇/〇咖至10%士且尤其約15%咖。 用於非、、’i腸技與之調配物可呈水性或非水性等渗無菌注 射溶液或懸浮液形式°此等溶液及懸浮液可由無菌粉末或 顆粒使用—或多種針對用於經口投與調配物中所提及之載 1或稀釋劑或藉由使用其他適宜分散劑或潤濕劑及懸浮劑 ，備。舉例而言，AMG 900可溶於水、聚乙二醇、丙二 2乙醇、玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、苯甲醇、 氯化鈉、黃蓍膠及/或各種緩衝液中。其他佐劑及投與方 弋已為语藥業眾所周知。AMG 900亦可與適宜載劑（包括 ^ 阄萄糖或水）、或與環糊精（即Captisol)、共溶劑穩 150546.doc -52· 201121956 定劑（即丙二醇）或膠束穩定劑 形式藉由注射投與。 歡η 80)-起以組合物 =注射編可為存於無毒非經腸可接受之稀釋劑 二《無囷可注射溶液或懸浮液，例如，呈存於丨，3_ 中之溶液形式。在可接受之媒劑及溶劑中可使用者 =、林格氏_㈣)溶液及等參氣化鈉溶液。另外，通 :使用無菌不揮發油作為溶劑或懸浮介質。就此目的而 I t可使用任一溫和不揮發油’包括合成甘油單酿或甘油 ^曰、另外’在可注射製劑中可使用諸如油酸等脂肪酸。 :肺礼與而s ’醫藥組合物可以氣溶膠形式或利用包 乾粉末氣溶膠之吸入器投與。 用於直腸投與藥物之栓劑可藉由將藥物與適宜無刺激賦 ::(例如可可脂及聚乙二醇)混合來製備，該等賦形劑在 吊益下為固體但在直腸溫度下為液體且因此在直腸中溶化 並釋放藥物。 醫藥組合物可經受習用醫藥作業（例如滅菌）及/或可含有 ^佐劑’例如防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝 d等另外可將錠劑及丸劑製備成帶有腸溶包衣。該等組 口物亦可包含佐劑，例如潤濕劑、甜味劑、矯味劑及香味 劑。 組合 儘管AMG 900可以單獨活性醫藥試劑形式給藥或投與， 仁八亦可與一或多種化學治療性及/或抗有絲分裂劑組合 使用。當以組合形式投與時，AMG 9〇〇可調配為同時或在 150546.doc -53- 201121956 不同時間相繼投與之單獨組合物，或者amg 9〇〇可以單一 組合物形式給予。 ▲在界定本發明AMG 900及另—化學治療劑之用途中，片 〇〇八療法」（或「組合療法」）意欲涵蓋在可提供藥物組 合之有益效果之方案中以相繼方式投與每一試劑，且亦意 欲涵蓋以實質上同時之方式（例如以具有固定比率此等活 陡。式劑之單一膠囊或以多個每—試劑之單獨膠囊）共投與 此等試劑。 特疋而5，在癌症之預防或治療中，Amg 900之投與可 結合熟習此項技術者已知之額外化學治療劑（包括抗有絲 分裂療法）。本發明並不限制投與順序，即，AMG 9〇〇可 在已知抗癌劑或抗有絲分裂劑投與之前、與其同時或之後 投與。 以上内容僅用於闡釋本發明且並非意欲將本發明限制於 所揭示之用途。熟習此項技術者可例行做出變化及改變， 該等變化及修改意欲處於本發明之範疇及性質内且定義於 隨附申請專利範圍中。如本文所寫，所有提及之參考文 獻、專利、申請案及公開案之全部内容特此均以引用方式 納入。 【圖式簡單說明】 圖1係繪示AMG 900及泰素對MES-SA及MES-SA Dx5細 胞系之效果、p-組蛋白H3 EC50值的圖形； 圖2係繪示AMG 900及泰素對親代NCI-H460及對泰素有 抗性之NCI-H460細胞系之效果、細胞週期DNA含量EC50值 150546.doc • 54- 201121956 的圖形； 圖3係繪示AMG 900及泰素對MDA-MB-231及對泰素有 抗性之MDA-MB-23 1細胞系之效果、細胞週期DNA含量 EC5〇值的圖形； 圖4係圖解說明AMG 900如何抑制所形成MES-SA Dx5異 種移植腫瘤生長的圖形； 圖5係繪示AMG 900及泰素治療對所形成對泰素有抗性 之NCI-H460異種移植物生長之效果的圖形；及 圖6係繪示AMG 900對HCT116親代細胞系、對AZD1152 有抗性之HCT116細胞系及對紫杉醇有抗性之細胞系之效 果的圖形。 150546.doc 55 -

Claims (1)

1. 201121956 七、申請專利範圍： 1. 一種化合物N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）_2_吡啶基）氧基） 苯基）-4-(4-甲基-2-噻吩基）_ι_呔畊胺或其醫藥上可接受 之鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療個體癌症， 其中該個體之癌症利用抗癌劑難以治療。 2. 如請求項1之用途，其中該抗癌劑係化學治療劑。 3. 如請求項2之用途，其中該化學治療劑係選自由抗有絲 分裂劑及蒽環抗生素組成之群之藥劑。 4. 如請求項2之用途，其中該化學治療劑係選自由下列組 成之群之試劑·泰素（taxol)、多西紫杉醇（d〇cetaxei)、 長春新鹼（vincristine)、長春鹼（vinblastine)、長春地辛 (vindesine)、及長春瑞濱（vinoreibine)、柔紅黴素 (daunorubicin)、多柔比星（doxorubicin)、伊達比星 (idarubicin)、表柔比星（epirubicin)及米托蒽酿 (mitoxantrone)。 5. 如請求項1之用途，其中該抗癌劑係AZD1152、PHA-739358、MK-0457或其組合。 6. 如請求項1之用途’其中該癌症係下列中之一或多者： (a)實體或血液學上衍生之腫瘤，其選自膀胱癌、乳癌、 結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、膽 囊癌、卵巢癌、姨腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、 前列腺癌及皮膚癌；（b)淋巴譜系之造血系統腫瘤，其選 自白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性淋巴胚細胞性 白A病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏 150546.doc 201121956 (Hodgkin’s)淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤 及伯基特氏（Burkett's)淋巴瘤’（c)骨髓譜系之造血系統 腫瘤，其選自急性及慢性髓細胞性白血病、骨髓增殖異 常症候群及早幼粒細胞性白血病，（d)間質起源之腫瘤， 其選自纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤，（e)中樞及外周神經系統 腫瘤，其選自星形細胞瘤、神經胚細胞瘤、膠質瘤及許 旺氏細胞瘤（schwannoma)，或（f)黑色素瘤、精原細胞 瘤、畸胎癌、骨肉瘤、著色性乾皮症、角化棘皮瘤、甲 狀腺毛囊癌或卡波西氏（Kaposi’s)肉瘤。 7. 如請求項1之用途，其中該癌症係選自下列之一或多種 實體腫瘤：膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺 癌、非小細胞肺癌、頭頸癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、 胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及前列腺癌；或為 淋巴瘤或白血病。 8. 如明求項1之用途，其中該化合物之量介於〇. 1 mg/公斤 該個體體重至30 mg/公斤該個體體重之間。 9·.如請求項1之用途，其中該化合物之量介於丨〇 mg/公斤 該個體體重至20 mg/公斤該個體體重之間。 10· —種化合物N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）-2-吡啶基）氧基） 苯基）-4-(4-甲基-2-噻吩基）-1_呔畊胺或其醫藥上可接受 之鹽在製造藥劑中之用途，該藥劑用於縮小個體之實體 腫瘤尺寸’其中該個體之腫瘤先前曾接受過選自由下列 組成之群之化學治療劑治療：紫杉醇（paclitaxel)、多西 备、t醇、多柔比星及長春花生物驗（vinca aikai〇id)。 150546.doc 201121956 11. 一種治療個體癌症之醫藥組合物，其包含有效劑量的化 合物N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）-2-°比啶基）氧基）苯基）_4 (4-曱基-2-噻吩基）-1-呔畊胺或其醫藥上可接受之鹽，其 中該個體之癌症利用抗癌劑難以治療。 12. 如請求項11之醫藥組合物’其中該抗癌劑係選自由抗有 絲分裂劑及蒽環抗生素組成之群之化學治療劑。 13. 如請求項11之醫藥組合物，其中該抗癌劑係選自由下列 組成之群之化學治療劑：泰素、多西紫杉醇、長春新 驗、長春鹼、長春地辛、及長春瑞濱、柔紅黴素、多柔 比星 '伊達比星、表柔比星、及米托蒽醌。 14. 如請求項11之醫藥組合物’其中該抗癌劑係azd 11 52、 PHA-739358、MK-0457或其組合。 1 5 _如清求項1 〇之醫藥組合物，其中該化合物之有效劑量係 介於0.1 mg/公斤該個體體重至3〇 mg/公斤該個體體重之 間的量。 16. 如請求項10之醫藥組合物，其中該化合物之有效劑量係 介於1_0 mg/公斤該個體體重至2〇 mg/公斤該個體體重之 間的量。 17. —種縮小個體之實體腫瘤尺寸之醫藥組合物，其包含有 效劑量的化合物N-(4-((3-(2-胺基-4-嘧啶基）-2-吡啶基）氧 基）苯基）-4-(4-曱基-2-噻吩基）-1-呔畊胺或其醫藥上可接 受之鹽’其中該個體之腫瘤先前曾接受過選自由下列組 成之群之化學治療劑治療：紫杉醇、多西紫杉醇、多柔 比星及長春花生物驗。 150546.doc