KR20120082896A

KR20120082896A - 유사분열 억제제 내성 암의 치료에 사용하기 위한 ｎ-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민

Info

Publication number: KR20120082896A
Application number: KR1020127009226A
Authority: KR
Inventors: 마크 페이톤; 리차드 켄달
Original assignee: 암젠 인크
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2012-07-24
Also published as: TN2012000110A1; CN102869361A; ZA201202472B; AU2010292225C1; MA33658B1; IL218569A0; EP2818170A1; CL2012000640A1; AU2010292225A1; HUE024568T2; EA201270383A1; CR20120171A; SMT201500028B; PT2475368E; MX2012003041A; SG179102A1; SI2475368T1; JP5851403B2; DK2475368T3; JP2013504582A

Abstract

본 발명은 화학요법제, 예컨대 탁산과 같은 유사분열 억제제 및/또는 오로라 키나제 억제제를 포함하는 다른 항암제에 의한 치료에 대하여 내성이 된, 고형 종양을 포함하는 암을 치료하기 위한 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물을 포함하는 제약 조성물을 암 대상체에 투여함으로써 그러한 치료에 대하여 난치성인 암의 치료 방법을 포함한다.

Description

유사분열 억제제 내성 암의 치료에 사용하기 위한 Ｎ-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 {N-(4-((3-(2-AMINO-4-PYRIMIDINYL)-2-PYRIDINYL)OXY)PHENYL)-4-(4-METHYL-2-THIENYL)-1-PHTHALAZINAMINE FOR USE IN THE TREATMENT OF ANTIMITOTIC AGENT RESISTANT CANCER}

<관련 출원>

본 출원은 2009년 9월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 61/241,527을 우선권 주장하며, 그의 명세서는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

<기술 분야>

본 발명은 유사분열 억제제 및/또는 다른 화학요법제에 의한 치료에 대하여 내성이 된, 고형 종양을 포함하는 암의 치료에 있어서의 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민의 용도에 관한 것이다.

암은 인류를 괴롭히는 가장 흔한 질환 중 하나로, 전세계적으로 사망의 주요 원인이다. 미국에서만, 암은 심장 질환에 이어서 두번째 주요 사망 원인이다. 암은 종종 정상적인 세포성 과정의 탈조절 또는 조절되지 않는 세포 증식을 특징으로 한다. 암성 세포로 형질전환된 세포는 통제되지 않고 조절되지 않는 방식으로 증식하여, 일부 경우에는 전이 또는 암의 확산을 유도하는 경향이 있다. 세포 증식의 탈조절은 세포 주기 진행을 통제하는 세포 경로를 책임지고 있는 하나 이상의 유전자에 대한 변이로부터 초래될 수 있다. 또는 세포 증식의 탈조절은, 세포가 세포 주기의 한 단계에서 또 다른 미점검 단계로 이동하게 하는 하나 이상의 세포 주기 확인점 조절인자에서의 DNA 변이 (돌연변이, 증폭, 재배열, 결실 및 후성적 유전자 침묵을 포함하나, 이들로 제한되지는 않음)로부터 초래될 수 있다. 또 다른 방식은 세포 기작 자체에서의 변이가 적절하게 발견되거나 복구되지 않는 유사분열 에러를 초래할 수 있고, 세포는 점검되지 않은 세포 주기를 통해 이동할 수 있게 되는 것이다.

유사분열은 진핵 세포가 그의 중복 염색체를 2개의 동일한 딸핵으로 분리하는 과정이다. 일반적으로 그 직후에 세포질분열이 이어지고, 이는 핵, 세포질, 소기관 및 세포막을 대략 동일한 할당량의 이들 세포 성분을 함유하는 2개의 딸세포로 분열시킨다. 유사분열 및 세포질분열은 함께 세포 주기의 유사분열기 (M)를 한정한다 - 모 세포의, 서로에 대하여 그리고 그들의 친세포에 대하여 유전학적으로 동일한 2개의 딸세포로의 분열.

유사분열 과정은 복잡하고 고도로 조절된다. 일련의 사건들은 한 세트의 활동의 완료 및 다음 활동의 개시에 상응하는, 구별되는 단계로 나누어진다. 이들 단계는 전기, 전중기, 중기, 후기 및 종기이다. 유사분열 과정 동안에, 중복 염색체는 응축되어 자매 염색분체를 세포의 반대쪽으로 당기는 섬유에 부착된다. 이어서 세포는 세포질분열에서 분열하여, 2개의 동일한 딸세포를 생성한다. 유사분열에서의 에러는 아폽토시스를 통해 세포를 사멸시키거나 또는 암을 유도할 수 있는 염색체의 잘못된 분리를 초래할 수 있다.

보통, 세포 주기 확인점은 DNA 에러가 발견된다면 (예를 들어, DNA 손상) 활성화된다. 게놈에서의 이러한 에러가 고쳐질 수 없다면, 세포는 보통 아폽토시스를 진행한다. 그러나, 세포가 그의 세포 주기를 통해 이동하고 미점검 상태로 진행하게 된다면, 시간이 경과함에 따라 돌연변이가 더욱 축적될 수 있다. 이러한 유전자 변이는 누적되어, 결국 적합화를 통해 전암성 또는 악성 신생물 특징 (예를 들어, 비통제 증식)을 갖는 세포 자손을 초래할 수 있다.

유사분열 억제제는 미세소관의 기능을 억제하는 항암제이다. 미세소관은 유사분열 방추 장치의 형성 및 유사분열 말기의 세포질분열에서 중요한 역할을 하는 α-튜불린 및 β-튜불린 이종이량체에 의해 형성된 단백질 중합체이다. 미세소관을 표적으로 하는 항암제는 암 세포의 증식을 중재하는 입증된 접근법을 대표한다.

여러 부류의 유사분열 억제제가 항암제로서 개발되었다. 탁산은 파클리탁셀 (탁솔) 및 도세탁셀 (탁소텔)을 포함하는 가장 중요한 부류의 유사분열 억제제이다. 빈카 알칼로이드는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하는 미세소관 탈안정화제 부류이다. 다른 신종 부류에는 에포틸론 (익사베필론)이 포함된다. 이들 유사분열 억제제는 안정화 또는 탈안정화 미세소관에 의해 암 세포의 증식을 방지하는 작용을 한다. 이러한 직접적인 미세소관 억제는 세포 휴지 및 아폽토시스 또는 유사분열 대변동(mitotic catastrophe)을 통한 사멸을 초래한다. 파클리탁셀은 발견되는 탁산 계열의 최초 화합물이었다. 파클리탁셀의 구조적 유사체인 도세탁셀은 후에 발견되었다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 통상적으로 난소암, 유방암, 두경부암, 폐암, 위암(gastric cancer), 식도암, 전립선암 및 AIDS 관련 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)을 포함하는 다양한 인간 악성종양을 치료하는 데에 사용된다. 탁산의 주요 부작용은 골수억제, 일차성 호중구감소증이며, 다른 부작용으로는 말초 부종 및 신경독성 (말초신경병증)이 있다.

탁산에 대한 내성은 성공적인 암 치료를 까다롭게 만드는 요인이고 종종 mdr-1 코딩 유전자 및 그의 산물인 P-당단백질 (P-gp)의 발현 증가와 관련있다. 탁산에 대한 후천적인 내성의 다른 입증된 메카니즘은 튜불린 돌연변이, 과발현, 증폭 및 이소형 전환(isotype switching)을 포함한다. α- 또는 β-튜불린에서의 돌연변이는 탁산이 미세소관의 정위치에 결합하는 것을 억제한다; 이는 약물을 비효과적으로 만든다. 또한, 일부 내성 세포는 또한 유사분열의 완료를 촉진하는 효소인 오로라 키나제의 증가를 보인다.

빈카 알칼로이드 (빈카(Vincas); 식물 알칼로이드라고도 함)는 미세소관의 β-튜불린 소단위체에 결합하여, 완전한 미세소관을 형성하기 위해 α-튜불린 소단위체와 중합하는 그의 능력을 차단할 수 있다. 온전한 유사분열 방추의 부재하에서는 중복 염색체가 분열판을 따라 정렬될 수 없기 때문에, 이는 세포 주기를 중기에서 휴지시켜 아폽토시스 세포 사멸을 유도한다. 비대칭성 이량체 빈카 알칼로이드: 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 및 빈데신이 연구에 의해 확인되었고, 이들은 각각 방광암 및 고환암, 카포시 육종, 신경모세포종 및 호지킨병(Hodgkin's disease), 및 폐 암종 및 유방암을 포함하는 암의 치료에 유용하다. 빈카 알칼로이드의 주요 부작용은 이들이 환자에게서 신경독성 및 골수억제를 초래할 수 있다는 점이다.

빈카 알칼로이드에 대한 내성은 실험 모델에서 급속히 발생할 수 있다. 빈카 알칼로이드의 항종양 효과는 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송인자 매개형 약물 유출물 수송인자, 예컨대 P-gp 및 MRP1을 과발현하는 다중약물 내성 세포주에서 차단될 수 있다. 다른 형태의 내성은 억제제가 그의 표적에 결합하는 것을 방해하는 β-튜불린에서의 돌연변이로부터 유래한다.

다른 화학요법제로는 토포이소머라제 억제제, 예컨대 이리노테칸 및 토포테칸 (제I형 억제제) 및 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테노포시드 (제II형 억제제)가 포함된다. 토포이소머라제 억제제는 DNA 합성에 영향을 미치고, 특히 DNA의 전사 및 복제를 방해함으로써 작용한다.

또 다른 부류의 화학요법제는 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신 및 미톡산트론을 포함하는 안트라시클린 항생제 부류이다. 현재, 안트라시클린은 림프종, 백혈병, 및 자궁암, 난소암, 폐암 및 유방암을 포함하는 수많은 암을 치료하는 데에 사용된다. 안트라시클린은 DNA 가닥을 파괴하는 유리 산소 라디칼을 형성하고 그에 의해 DNA 합성 및 기능을 억제함으로써 작용한다. 안트라시클린의 주요 부작용 중 하나는 이들이 심근 세포를 손상시켜 심장 독성을 유도할 수 있다는 점이다.

비제한적으로 화학요법제 및 유사분열 억제제를 포함하는 항암제에 대한 내성은 암의 치료에서 주요 결점이 되었다. 이러한 내성은 환자가 여러 상이한 약물의 효과에 대하여 교차 내성이 되도록 한다. 보다 특히, 다중약물 내성이 문제가 된다. 추가로, 항암 치료법(들)에 대한 이러한 내성은 필연적으로 환자 사망을 초래한다. 결론적으로, 약물 내성의 발달은 모든 항암 요법에서 문제가 되고, 따라서 규제기관의 승인을 위해 임상 시험 중인 항암제, 및 탁산 및 빈카 알칼로이드와 같은 화학요법제에 의한 전통적인 치료법을 포함하는 암 치료법에 대하여 반응성이지 않거나, 또는 단지 미약하게 효과적인 암의 치료법을 발견할 필요가 있다.

<도면의 간단한 설명>

도 1은 AMG 900 및 탁솔이 MES-SA 및 MES-SA Dx5 세포주에 미치는 영향 (p-히스톤 H3 EC₅₀ 값)을 도시한 그래프이다.

도 2는 AMG 900 및 탁솔이 NCI-H460 모 세포주 및 NCI-H460 탁솔 내성 세포주에 미치는 영향 (세포 주기 DNA 함량 EC₅₀ 값)을 도시한 그래프이다.

도 3은 AMG 900 및 탁솔이 MDA-MB-231 및 MDA-MB-231 탁솔 내성 세포주에 미치는 영향 (세포 주기 DNA 함량 EC₅₀ 값)을 도시한 그래프이다.

도 4는 AMG 900이 확립된 MES-SA Dx5 이종이식편 종양의 성장을 어떻게 억제하는지를 설명하는 그래프이다.

도 5는 AMG 900 및 탁솔 처리가 확립된 NCI-H460-탁솔 내성 이종이식편의 성장에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.

도 6은 AMG 900이 HCT116 모 세포주, AZD1152 내성 HCT116 세포주 및 파클리탁셀 내성 세포주에 미치는 영향을 도시한 그래프이다.

본 발명은 표준 치료(standard-of-care)로서 정부 승인된 유사분열 억제제, 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 탁산 및 다른 화학요법제, 예를 들어 독소루비신 및 암의 치료에 대한 임상 실험에서 투여되고 있는 다른 작용제에 대하여 난치성(refractory)인, 고형 종양 및 암 세포를 포함하는 진행암의 치료에 있어서의 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 (본원에서, "AMG 900" 또는 "화합물"이라고도 함) 및 그의 제약상 허용되는 염 형태의 용도를 제공한다. AMG 900은 하기의 화학 구조를 갖는다.

본 발명은 추가로 유사분열 억제제를 포함하는 화학요법제로 이전에 치료된 바 있는 환자에서의 암 및 암 세포에 대한 치료학적, 예방학적, 단기 또는 장기 치료에 있어서의 상기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염 형태를 포함하는 제약 조성물의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 유사분열 방추 억제제 및 항미세소관제를 포함하는 유사분열 억제제, 또는 독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 콜히친, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 에토포시드 및 미톡산트론을 포함하는 항암 화학요법에서 사용되는 다른 약물 (본원에서, 화학요법제라고도 함)로 이전에 치료된 바 있는 대상체에서의 암의 치료 방법을 위한 약제 및 제약 조성물의 제조에서의 AMG 900의 용도를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은, 탁산 내성 종양을 치료하는 유효 투여량의 AMG 900 또는 그의 제약상 허용되는 염을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 비소세포 폐암, 유방암 및 호르몬 불응성 전립선암을 포함하는 탁산 내성 종양 유형의 치료 방법을 제공한다.

AMG 900은 오로라 키나제 억제제로서, 인간 임상 실험에서, 튜불린을 표적으로 하는 통용되는 표준 치료 암 치료제 (예컨대, 파클리탁셀, 익사베필론 및 빈카 알칼로이드) 및 AZD1152를 포함하는 다른 화학요법제 (예컨대, 독소루비신)에 비해 놀라운 예상밖의 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 특히, AMG 900은, 예를 들어 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송인자 매개형 약물 유출, 튜불린 유전자 증폭 또는 변형, 또는 α 또는 β 튜불린 단백질의 구조 변화를 포함하는 다양한 제안된 메카니즘을 통해 유사분열 억제제에 대하여 교차 내성이 된 종양의 진행 또는 성장을 억제하거나 또는 지연시키는 효능을 전달한다. 또한, AMG 900은 세포 주기의 G₂M기에서 증식하는 세포를 표적으로 하고, 따라서 미세소관을 표적으로 하는 유사분열 억제제에 의해 관찰되는 말초 신경병증을 초래할 가능성이 낮다.

정의

하기 정의는 본원에 기재된 본 발명의 범주를 이해하는 데에 추가로 도움이 될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "암" 및 "암성"은, 통상적으로 탈조절된 세포 성장을 특징으로 하는 대상체의 생리학적 상태를 말하거나 또는 그러한 생리학적 상태를 설명한다. 암의 예는, 비제한적으로 암종, 림프종, 육종, 아세포종 및 백혈병을 포함한다. 이러한 암의 보다 특정한 예는 편평 세포 암종, 폐암, 췌장암, 자궁경부암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장 암종 및 두경부암을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "암"은 어느 하나의 특정한 형태의 질환으로 제한되지 않지만, 본 발명의 방법은 대상체에서, 비제한적으로 화학요법제, 유사분열 억제제, 안트라시클린 등을 포함하는 항암제에 의한 치료에 대하여 어느 정도 내성이 된 암, 및 이들 항암제에 의한 치료 후에 재발한 암에 특히 효과적일 것이라고 여겨진다.

본원에서 사용되는 용어 "화학요법제"는 암성 세포를 사멸시킴으로써 암을 치료하는 것을 말한다. 상기 용어는 또한 암을 치료하는 데에 사용되는 항신생물약 또는 이들 약물의 표준화된 치료 요법과의 병용을 말한다. 화학요법제의 예는, 비제한적으로 알킬화제, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴; 알칼로이드, 예컨대 빈카 알칼로이드 (예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신이 포함됨) 및 탁산 (예를 들면, 파클리탁셀 (탁솔) 및 도세탁셀이 포함됨); 토포이소머라제 억제제, 예컨대 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드; 및 다양한 항신생물제, 예컨대 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 블레오마이신 등을 포함한다.

용어 "포함하는"은 지시된 성분(들)을 포함하나, 다른 요소를 배제하지는 않는 개방형이도록 한다.

본원에서 사용되는 용어 "다중약물 내성"은 상이한 화학 구조의 다수의 약물에 대하여 내성이고/이거나 상이한 표적을 갖는 약물에 대하여 내성인 암 세포를 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "난치성"은 다수의 치료학적 치유제에 대하여 내성인 것을 비롯하여, 치료, 자극 (요법) 또는 치유에 의하여 좋아지지 않거나, 이들에 대하여 내성이거나 또는 비반응성인 것을 말하고자 한다. "난치성"은, 본원에서 암 또는 종양을 특징화하는 문맥에 사용될 경우에 1종 이상의 항암제에 의한 치료에 대하여 비반응성이거나 또는 이들에 대하여 내성 또는 감소된 반응을 나타내는 암 또는 종양을 말하고자 한다. 치료는 통상적으로 소정의 기간에 걸쳐서 연속적, 장기적 및/또는 반복적이어서 그와 동일한 치료에 대하여 내성을 발달시키거나 또는 난치성이 되는 암 또는 종양을 초래한다.

본원에서 사용되는 용어 "대상체"는 인간 및 동물을 포함하는 임의의 포유동물, 예컨대 소, 말, 개 및 고양이를 말한다. 따라서, 본 발명은 인간 환자 및 수의학적 대상체 및 병에 걸린 동물에게 사용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

"치료학적으로 유효한"이라는 어구는 통상의 유사분열 억제 항암 요법에 의한 암의 치료 동안에 암 또는 종양의 크기 또는 중증도 감소를 달성함과 동시에 통상의 유사분열 억제 항암 요법과 통상적으로 관련있는 유해한 부작용을 줄이거나 또는 회피할, 화합물 (AMG 900)의 양을 정량화하기 위한 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 비제한적으로 치유 요법, 예방 요법 및 방지 요법을 포함하는 요법을 말한다. 예방학적 치료는 일반적으로 개체에서 장애의 개시를 완전히 방지하거나 또는 장애의 임상전의 명백한 단계의 개시를 지연시키는 것을 말한다.

용어 "제약상 허용되는 염"은 알칼리 금속염을 형성하기 위해, 또한 유리 산 또는 유리 염기의 부가염을 형성하기 위해 통상 사용되는 염을 포괄한다. 염의 성질은 중요하지 않으나, 단 제약상 허용되는 것이다. 화합물의 적합한 제약상 허용되는 산 부가염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조할 수 있다. 이러한 무기산의 예는 비제한적으로 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 질산, 탄산, 황산 및 인산을 포함한다. 유기산의 예는 비제한적으로 지방족, 지환족, 방향족, 아릴지방족, 헤테로시클릭, 카르복실계 및 술폰계 부류의 유기산을 포함하며, 상기 유기산의 예로는 포름산, 아세트산, 아디프산, 부티르산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피루브산, 아스파르트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 메실산, 4-히드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산 (파모인산), 메탄술폰산, 에탄술폰산, 에탄디술폰산, 벤젠술폰산, 판토텐산, 2-히드록시에탄술폰산, 톨루엔술폰산, 술파닐산, 시클로헥실아미노술폰산, 캄포르산, 캄포르술폰산, 디글루콘산, 시클로펜탄프로피온산, 도데실술폰산, 글루코헵탄산, 글리세로포스폰산, 헵탄산, 헥산산, 2-히드록시-에탄술폰산, 니코틴산, 2-나프탈렌술폰산, 옥살산, 팔모인산, 펙틴산, 과황산, 2-페닐프로피온산, 피크르산, 피발 프로피온산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, 메실산, 운데칸산, 스테아르산, 알겐산, β-히드록시부티르산, 살리실산, 갈락타르산 및 갈락투론산이 있다.

화합물의 적합한 제약상 허용되는 염기 부가염은 비제한적으로 금속염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연으로부터 제조된 염, 또는 1급, 2급, 3급 아민 및 시클릭 아민을 포함하는 치환된 아민, 예컨대 카페인, 아르기닌, 디에틸아민, N-에틸 피페리딘, 아이스티딘, 글루카민, 이소프로필아민, 리신, 모르폴린, N-에틸 모르폴린, 피페라진, 피페리딘, 트리에틸아민, 트리메틸아민을 포함하는 유기 염기로부터 제조된 염을 포함한다. 본원에서 고려되는 모든 염은, 예를 들어 적절한 산 또는 염기를 화합물과 반응시킴으로써 상응하는 화합물로부터 통상의 수단에 의해 제조할 수 있다.

AMG 900, N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민은 PCT 공보 WO2007087276의 실시예 15 (제50면), 실시예 25 (제55면) 및 실시예 30 (제59면)과 함께, 출발 물질로서 1-클로로-4-(4-메틸-2-티에닐)프탈라진을 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 방법 A1 또는 A2 (제70면)에 개시된 것과 유사한 절차로 제조할 수 있다. 이들 절차는 또한 미국 특허 번호 7,560,551에 기재되어 있으며, 그의 명세서는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 구체적으로, AMG 900은 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

실시예 1

N-(4-((3-(2-아미노-4- 피리미디닐 )-2- 피리디닐 ) 옥시 ) 페닐 )-4-(4- 메틸 -2- 티에닐 )-1- 프탈라진아민 ( AMG 900)의 합성

단계 1: 4-(2- 클로로피리딘 -3-일) 피리디민 -2-아민

이소프로판올조에 넣어둔 아르곤 퍼징된 500 mL 둥근바닥 플라스크에서, 나트륨 금속 (3.40 g, 148 mmol)을 메탄올 (180 mL)에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 실온 (RT)에서 약 30분 동안 교반하였다. 여기에 구아니딘 히드로클로라이드 (12.0 mL, 182 mmol)를 첨가하고 혼합물을 RT에서 30분 동안 교반한 후에, (E)-1-(2-클로로피리딘-3-일)-3-(디메틸아미노)프로프-2-엔-1-온 (12.0 g, 57.0 mmol)을 첨가하고, 공기 응축기를 부착하고, 반응물을 오일조로 옮겨 24시간 동안 약 50℃로 가열하였다. 메탄올의 대략 절반을 감압하에 증발시키고 고체를 진공하에 여과한 다음, 포화 중탄산나트륨 (NaHCO₃) 및 H₂O로 세척하고, 공기 건조시켜, 4-(2-클로로피리딘-3-일)피리디민-2-아민을 회백색 고체로서 수득하였다.

단계 2: 4-(2-(4- 아미노페녹시 )피리딘-3-일) 피리디민 -2-아민

재밀봉가능한 튜브에 4-아미노페놀 (1.3 g, 12 mmol), 탄산세슘 (7.8 g, 24 mmol) 및 DMSO (16 ml, 0.75 M)를 첨가하였다. 혼합물을 5분 동안 100℃로 가열한 다음, 4-(2-클로로피리딘-3-일)피리디민-2-아민 (2.5 g, 12 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 130℃로 밤새 가열하였다. LCMS에 의해 판단하여 완료되었으면, 반응 혼합물을 RT로 냉각시키고 물로 희석하였다. 생성 침전물을 여과하고, 고체를 물 및 디에틸 에테르로 세척하였다. 이어서 고체를 9:1의 CH₂Cl₂:MeOH에 녹이고 용리액으로서 9:1의 CH₂Cl₂:MeOH를 사용하면서 실리카겔 패드를 통해 통과시켰다. 용매를 진공 하에 농축시켜 목적하는 생성물 4-(2-(4-아미노페녹시)피리딘-3-일)피리디민-2-아민을 생성하였다.

단계 3: 1- 클로로 -4-(4-메틸티오펜-2-일)프탈라진

1,4-디클로로프탈라진 (1.40 g, 7.03 mmol), 4-메틸티오펜-2-일보론산 (999 mg, 7.03 mmol) 및 PdCl₂(DPPF) (721 mg, 985 μmol)를 밀봉된 튜브에 첨가하였다. 튜브를 아르곤으로 퍼징하였다. 이어서 탄산나트륨 (수중 2.0 M) (7.74 ml, 15.5 mmol) 및 1,4-디옥산 (35.2 ml, 7.03 mmol)을 첨가하였다. 튜브를 밀봉하고, RT에서 5분 동안 교반하고, 110℃에서 예비가열한 오일조에 넣었다. 1시간 후에, LC-MS에 의해 생성물 및 부산물 (이중 커플링), 및 출발 물질 디클로로프탈라진이 확인되었다. 반응물을 RT로 냉각시키고, 에틸 아세테이트 (EtOAc)를 이용하여 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 농축시키고, 칼럼에 로딩하였다. 생성물을 상층 부분을 제거하기 위해 Hex를 사용한 후에, 생성물을 수집하기 위해 80:20의 헥산:EtOAc를 사용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물 1-클로로-4-(4-메틸티오펜-2-일)프탈라진을 황색 고체로서 수득하였다. LC-MS에 의해 생성물이 소량의 디클로로프탈라진 및 비스커플링 부산물로 오염되었음이 확인되었다.

단계 4: N-(4-((3-(2-아미노-4- 피리미디닐 )-2- 피리디닐 ) 옥시 ) 페닐 )-4-(4-메틸-2- 티에닐 )-1- 프탈라진아민

4-(2-(4-아미노페녹시)피리딘-3-일)피리디민-2-아민 및 1-클로로-4-(4-메틸-2-티에닐)프탈라진에 tBuOH를 첨가하였다. 생성 혼합물을 밀봉된 튜브에서 16시간 동안 100℃에서 가열하였다. 반응물을 디에틸 에테르 및 포화 탄산나트륨으로 희석하고 격렬하게 진탕시켰다. 생성 고체를 여과하고, 물, 디에틸 에테르로 세척하고, 공기 건조시켜, N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민을 회백색 고체로서 수득하였다.

LC - MS 방법:

샘플을 30℃에서 아질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies) XDB-C₈ (3.5 μ) 역상 칼럼 (4.6 x 75 mm)을 갖춘 아질런트 모델-1100 LC-MSD 시스템에 전개시켰다. 유량은 일정하였고 약 0.75 mL/분 내지 약 1.0 mL/분의 범위였다.

이동상은 용매 A (H₂O/0.1% HOAc)와 용매 B (AcCN/0.1% HOAc)의 혼합물을 9분의 기간으로 10% → 90% 용매 B의 구배로 사용하였다. 그 후에 구배는 0.5분 기간으로 10% 용매 B로 복귀하고 2.5분 기간으로 칼럼의 10% 용매 B 재평형화 (플러시)가 이어졌다.

AMG 900을 합성하는 다른 방법 또한 사용할 수 있다. AMG 900의 합성에 유용한, 수많은 합성 화학 전환법 및 보호기 방법론은 당업계에 공지되어 있다. 유용한 유기 화학 전환법 문헌은, 예를 들어 문헌 [R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989)]; [T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd edition, John Wiley and Sons (1999)]; [L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994)]; [A. Katritzky and A. Pozharski, Handbook of Heterocyclic Chemistry, 2^nd edition (2001)]; [M. Bodanszky, A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1984)]; [J. Seyden-Penne, Reductions by the Alumino- and Borohydrides in Organic Synthesis, 2^nd edition, Wiley-VCH, (1997)]; 및 [L. Paquette, editor, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995)]을 포함한다.

AMG 900은 다양한 세포주 (시험관내) 및 다수의 고형 종양 유형 (생체내)에서 종양 진행을 감소시키거나 또는 억제하는 그의 능력에 대하여 시험되었고, 상기 세포주 및 고형 종양 유형 중 일부는 탁산 및 빈카 알칼로이드를 포함하는 표준 치료 유사분열 억제제, 및 다른 화학요법제에 이전에 노출되었고 이들에 대하여 내성이 발달한 것이었다. 하기 실시예 및 그에 따른 데이타는, 유사분열 억제제, 예컨대 파클리탁셀, 및 화학요법과 함께 사용되는 다른 약물, 예컨대 독소루비신을 포함하는 현재의 표준 치료 요법에 대하여 내성인 암을 비롯한 암을 치료하는 AMG 900의 능력을 설명해 줄 것이다. 달리 지시하지 않는 한, 하기 기재된 실시예에서 AMG 900의 유리 염기 형태를 사용하였다.

실시예 2

오로라 키나제 A 및 B 활성의 AMG 900 유도된 억제가 세포 증식을 억제하는지를 조사하기 위해, AMG 900의 항증식 효과를 32종의 인간 종양 세포주를 사용하여 시험관내에서 평가하였다. 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, AMG 900은 고형 및 혈액 종양 세포주 둘 모두에서 항증식 활성을 나타냈다. 이러한 항증식 활성은 낮은 나노몰 범위 (EC₅₀ 값 1 내지 5 nM)의 AMG 900의 농도에서 관찰되었다. 중요한 것은, 이들 AMG 900 감수성 고형 종양 세포주 중 4종 (HCT15, MES-SA Dx5, 769P 및 SNU449)은 파클리탁셀 및 다른 화학요법제에 대하여 내성이라는 점이다. 상이한 화학 구조의 다수의 약물 및/또는 상이한 표적을 갖는 약물에 대하여 내성인 암 세포는 "다중약물 내성"이라고 명명한다. 암 세포에 의해 이용되는 다중약물 내성 (MDR)의 한 중요한 메카니즘은 ATP-결합 카세트 (ABC) 수송인자 패밀리, 예컨대 mdr -1 유전자 산물, P-당단백질 (P-gp)에 의해 매개되는 약물 유출이다. 예를 들어, 독소루비신 내성 인간 자궁 세포주 MES-SA Dx5는 P-gp를 발현하고 다우노루비신, 닥티노마이신, 콜히친, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 파클리탁셀, 에토포시드 및 미톡산트론을 포함하는 다수의 화학요법제에 대하여 내성이 된다 (모 세포주에 비해 30배 내지 1200배). 추가로 MDR 발현 세포에서의 AMG 900의 활성을 조사하기 위해, 3종의 탁솔 내성 종양 세포주를 시험하여 이들의 각각의 모 세포주와 비교하였다. 도 1 내지 도 3, 및 표 3에 나타낸 바와 같이, AMG 900은 3종의 모든 매칭 탁솔 내성 및 감수성 종양 세포주에서 효력을 유지하였고, 여기서 EC₅₀ 값은 2 nM 미만이었다. 탁솔은 모 세포주와 비교하여 P-gp 발현 종양 아세포주에서 효력의 상당한 손실 (10배 내지 100배)을 보였다. 이들 데이타를 종합하면, AMG 900이 히스톤 H3 (오로라 키나제 B의 기부 기질)의 인산화를 억제하고 파클리탁셀 및 다른 화학요법제에 대하여 내성인 종양 세포주의 세포 분열을 차단한다는 것이 시사된다.

물질 및 방법

시험 물질

시험 물품: AMG 900

제제: DMSO

공급원: 암젠 인크.(Amgen Inc.)

중요 시약

세척액 및 고정액

시약

실험실 장비, 자재, 소프트웨어

방법

AMG 900의 활성을 자궁, 유방 및 폐 조직으로부터 유래한 모 세포주 및 약물 내성 종양 세포주에 대하여 시험관내에서 평가하였다. 세포 주기 및 p-히스톤 H3 종점을 각각 유동 세포측정법 및 고효율 세포 이미지화에 의해 평가하였다.

인간 세포 및 세포 배양물

인간 종양 세포주는, 달리 지시하지 않는 한, ATCC(American Type Culture Collection; 미국 버지니아주 마나사스에 소재함)로부터 입수하였다. 모든 세포는 37℃에서 5% CO₂의 분위기하에 유지하였다. 유방 종양 유래 CAL51 (ACC 302) 세포주는 DSMZ (GmbH)로부터 입수하였다. 결장 종양 유래 HCT-116_JH (유전자형 p21 +/+) 및 HCT-116_JH (유전자형 p21 -/-) 세포주는 존 홉킨스 대학 유전자원 연구소(John Hopkins University Genetics Resources Core Facility)로부터 허가를 받고 입수하였다.

AMG 900으로 처리한 고형 종양 세포주의 패널: 항증식 검정 ( 어레이스캔 VTi)

종양 세포를 패커드 뷰 96-웰 플레이트에서, 적절한 완전 배지 100 μL 중에, 세포주 성장 속도론 (대략적으로 느린 속도 대 빠른 속도로 규정함)에 따라 3000 또는 5000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 모든 희석은 바이오멕(Biomek) FX 단말기를 사용하여 수행하였다. 다음 날에 세포를 AMG 900 (0.156 내지 0.0003 μM의 11시점 용량 범위)으로 처리하였고, 이때 배지 중 최종 DMSO 농도는 0.12%였다. 24시간 후에, 화합물을 함유하는 배지를 제거하고 세포를 완전 배지로 세척하였다. 이어서 세포를 새로운 완전 배지 (화합물 무함유) 100 μL 중에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 후에, 고정 완충제 100 μL를 완전 배지 100 μL에 첨가함으로써 세포를 고정시켰다. 세포를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 고정 완충제를 흡인 제거하고, 이어서 세포를 실온에서 30분 동안 세척 완충제 100 μL 중에서 투과화한 후에, DNA 염색 완충제 100 μL를 첨가하고, 실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 세척 완충제 100 μL로 세척하고, 분석할 때까지 4℃에서 1x PBS 100 μL 중에 보관하였다. 세포 데이타는 96-웰 플레이트를 어레이스캔 VTi 이미지화 시스템 (셀로믹스)에서 스캐닝함으로써 수득하였다. 개개 세포의 핵 영역 및 강도의 정량화는 훼히스트 33342 DNA 염료 형광성을 기반으로 수행하였다. DMSO 처리한 대조군 웰을 기준으로 하는 핵 영역에 대한 임계값을 배수성 세포 및 핵 파편으로부터의 정상 크기 핵의 수를 정량화하기 위해 설정하였다. 상기 임계값을 적용하여 10x의 배율을 사용하여 6개의 이미지 필드/웰에서 정상 핵의 수를 계수하였다. 용량-농도 곡선 및 EC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 계산하였다.

AMG 900으로 처리한 혈액 세포주의 패널: 다중파라미터 세포 주기 DNA 함량 검정 (유동 세포측정법)

종양 세포를 300 μL 딥 96-웰 플레이트에서, 적절한 완전 배지 150 μL 중에, 100,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 AMG 900 (0.156 내지 0.0003 μM의 10시점 용량 범위)으로 처리하였고, 이때 배지 중 최종 DMSO 농도는 0.2%였다. 수거 시간 2시간 전에, 세포를 배지에서 1:100의 최종 농도로 BrdU로 펄싱하였다. 48시간 후에, 멀티웰 피페터(multi-well pipetter)를 사용하여 배지 100 μL를 각각의 웰로부터 제거하였다. 이어서 세포를 배지 200 μL 중에서 PCR 튜브 스트립으로 옮겼다. 세포를 18℃에서 4분 동안 2000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 흡인 제거하였다. 이어서 세포를 빙냉 90% 메탄올 200 μL 중에서 고정시키고 항체 및 DNA 염색하기 전 적어도 24시간 동안 -20℃에서 보관하였다. 고정된 세포를 4분 동안 2000 rpm으로 원심분리하여 90% 메탄올을 제거하였다. 세포를 세척 완충제 200 μL로 세척한 다음, 실온의 암실에서 1시간 동안 산 완충제 100 μL로 처리하였다. 세포를 세척 완충제 200 μL로 2회 세척하였다 (pH 시험지로 확인하여 pH가 7.0일 때까지). 세포를 실온의 암실에서 2시간 동안 세척 완충제 중에서 항-BrdU-알렉사 647 (3 μg/mL) 및 항-카스파제 3-FITC (20 μL/웰) 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 염색된 세포를 원심분리하고 세척 완충제 200 μL로 세척하였다. 세포를 프로피듐 아이오다이드 (PI) 200 μL로 4℃ 암실에서 밤새 대비염색하였다. 데이타를 입수하여 유동 세포측정기 (LSRII)로 분석하였다. 임계값 게이트를 DMSO 대조군 및 저함량/고함량 약물 처리군에 기초하여 DNA 함량, BrdU, 및 카스파제-3 양성/음성 모집단에 따라 적용하였다. 데이타는 SubG1 DNA 함량, 4 N+ DNA 함량, BrdU, 및 카스파제-3 절단 양성 모집단의 백분율로서 나타냈다. 농도-반응 곡선 및 EC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 계산하였다.

AMG 900 또는 파클리탁셀 ( 탁솔 )로 처리한 MES - SA Dx5 및 MES - SA 세포주: p-히스톤 H3 검정 ( 어레이스캔 VTi )

MES-SA Dx5 및 MES-SA 세포를 96-웰 플레이트에서, 완전 배지 중에, 10,000개 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 24시간 동안 배양하였다. 다음 날에 세포를 AMG 900 또는 탁솔로 10시점 농도 범위 (1.25 μM 내지 0.0024 μM)에 걸쳐서 24시간 동안 처리하였고, 이때 배지 중 최종 DMSO 농도는 0.1%였다. 세포를 세척하고, 2x 포름알데히드 고정 완충제 100 μL를 10분 동안 실온에서 첨가함으로써 고정시켰다. 세포를 세척 완충제 100 μL로 15분 동안 세척 및 투과화하였다. 세포를 p-히스톤 H3 항체 (5 μg/mL)로 면역염색하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척 완충제 100 μL로 세척하였다. 이어서, 세포를 훼히스트 DNA 염료 (1 μg/mL)가 보충된 세척 완충제 중에서 염소 항-토끼 알렉사-488 콘주게이팅 항체 (1.5 μg/mL)와 함께 인큐베이션하고 실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척 완충제 100 μL로 2회 세척하였다. 96-웰 플레이트를 바이오어플리케이션 알고리즘 (TargetActivation.V2)을 사용하여 어레이스캔 VTi (셀로믹스)에서 분석하였다. p-히스톤 H3+ 목표물의 백분율 (10x 대물렌즈에 의한 6개 이미지 필드/웰의 누계)은 4-파라미터 방정식을 사용하여 농도-반응 곡선 및 EC₅₀ 값을 얻는 데에 사용하였다.

AMG 900 또는 파클리탁셀 ( 탁솔 )로 처리한 NCI - H460 모 세포주 및 탁솔 내성 세포주: 세포 주기 DNA 함량 검정 (유동 세포측정법)

NCI-H460 모 세포 및 NCI-H460 탁솔 내성 세포를 6-웰 플레이트에서, 적절한 완전 배지 2 mL 중에, 500,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음 날에 세포를 6시점 농도 범위에 걸쳐서 AMG 900 또는 탁솔로 처리하였고, 이때 배지 중 최종 DMSO 농도는 0.05%였다. 24시간 후에, 세포를 BrdU (1:100 희석)로 펄싱하고 수거하였다. 세포를 4분 동안 1600 rpm으로 원심분리하고 상청액을 흡인 제거하였다. 세포를 1x PBS 중에서 세척하고 빙냉 90% 메탄올 900 μL 중에서 고정시키고 -20℃에서 보관하였다. 고정된 세포를 4분 동안 2000 rpm으로 원심분리하여 90% 메탄올을 제거하였다. 세포를 세척 완충제 200 μL로 세척하고 프로피듐 아이오다이드 (PI) 200 μL로 4℃ 암실에서 밤새 염색하였다. 데이타를 입수하여 유동 세포측정법 (LSRII)으로 분석하였다. 임계값 게이트를 DMSO 처리 대조군 및 저함량/고함량 약물 처리군에 기초하여 +4 N (4 N 이상과 동일함) DNA 함량 및 SubG1 양성 모집단에 따라 적용하였다. 데이타는 +4 N DNA 및 SubG1 양성 부분모집단의 백분율로서 나타냈다. +4 N (4 N 이상과 동일함) DNA 함량 또는 SubG1 세포 EC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 계산하였다.

AMG 900 또는 파클리탁셀 ( 탁솔 )로 처리한 MDA - MB -231 (F11)- luc 모 세포주 및 탁솔 내성 세포주: 세포 주기 DNA 함량 검정 (유동 세포측정법)

이중으로, MDA-MB-231 (F11)-luc 모 세포 및 탁솔 내성 세포를 12-웰 플레이트에서, 적절한 배지 1 mL 중에, 250,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 다음 날에 세포를 10시점 농도 범위에 걸쳐서 AMG 900 또는 탁솔로 처리하였고, 이때 탁솔 무함유 배지 중 최종 DMSO 농도는 0.1%였다. 24시간 후에, 세포를 1x 트립신-EDTA를 사용하여 수거하고 PCR 튜브로 옮겼다. 세포를 4분 동안 2000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 흡인 제거하였다. 세포를 빙냉 90% 메탄올 200 μL 중에서 고정시키고 -20℃에서 적어도 24시간 동안 보관하였다. 고정된 세포를 4분 동안 2000 rpm으로 원심분리하여 90% 메탄올을 제거하였다. 세포를 세척 완충제로 세척하고 프로피듐 아이오다이드 (PI) 200 μL로 30분 동안 4℃ 암실에서 염색하였다. 데이타 획득 전에 추가의 PI 400 μL를 첨가하였다. 데이타를 획득하고 유동 세포측정법 (LSRII)으로 분석하였다. 임계값 게이트를 DMSO 대조군 및 저함량/고함량 약물 처리군에 기초하여 +4 N (4 N 이상과 동일함) DNA 함량에 따라 적용하였다. 데이타는 +4 N DNA 함량 양성 모집단의 대조군에 대한 백분율로서 나타냈다. +4 N DNA 함량 세포 EC₅₀ 값은 4-파라미터 방정식을 사용하여 정하였다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

<도 1>

자궁 종양 세포주를 DMSO (대조군), AMG 900 또는 파클리탁셀 (탁솔)로 10시점 용량 범위 (0.0024 내지 1.25 μM)에 걸쳐서 24시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 고정시키고, p-히스톤 H3 항체로 염색하며 DNA 염료 (훼히스트)로 대비염색하였다. 이미지화 기반 분석 (어레이스캔 VTi)을 수행하여 p-히스톤 H3 양성 세포의 백분율을 측정하였다. 용량-반응 곡선은 DMSO 처리 대조군에 대한 백분율 (POC)로서 p-히스톤 H3 양성 세포에 대하여 플롯팅된 AMG 900 또는 탁솔 농도를 나타낸다. EC₅₀ 값은 4-파라미터 맞춤 모델에 의해 계산하였다.

<도 2>

폐 종양 세포주를 DMSO (대조군), AMG 900 또는 탁솔로 6시점 용량 범위에 걸쳐서 24시간 동안 처리하였다. 유동 세포측정법 기반 세포 주기 분석을 수행하여 4 N 이상의 DNA 함량 또는 SubG1 DNA 함량 양성 세포의 백분율을 측정하였다. AMG 900에 대한 용량-반응 곡선은 4 N 이상의 DNA 함량 양성 세포의 백분율에 대하여 플롯팅된 약물 농도를 나타낸다. 탁솔에 대한 용량-반응 곡선은 SubG1 DNA 함량 양성 세포의 백분율에 대하여 플롯팅된 약물 농도를 나타낸다. EC₅₀ 값은 4-파라미터 맞춤 모델에 의해 계산하였다.

<도 3>

유방 종양 세포주를 DMSO (대조군), AMG 900 또는 탁솔로 10시점 용량 범위에 걸쳐서 24시간 동안 처리하였다. 유동 세포측정법 기반 세포 주기 분석을 수행하여 4 N 이상의 DNA 함량 또는 SubG1 DNA 함량 양성 세포의 백분율을 측정하였다. AMG 900에 대한 용량-반응 곡선은 4 N 이상의 DNA 함량 양성 세포의 백분율에 대하여 플롯팅된 약물 농도를 나타낸다. 탁솔에 대한 용량-반응 곡선은 SubG1 DNA 함량 양성 세포의 백분율에 대하여 플롯팅된 약물 농도를 나타낸다. EC₅₀ 값은 4-파라미터 맞춤 모델에 의해 계산하였다.

실시예 3

오로라 키나제 활성의 AMG 900 유도된 억제가 세포 증식을 억제하는지를 조사하기 위해, AMG 900의 항증식 효능을, 무흉선 누드 마우스에서 성장시킨, 유방암, 결장암, 백혈병, 폐암, 췌장암 및 자궁암 모델을 포함하는 다수의 인간 암 이종이식편 모델에서 생체내에서 평가하였다. AMG 900을, 종양이 확립되었을 때 시작하여 연구 기간 동안에 매일 3 mg/kg BID 또는 1주일마다 연속 2일간 3.75, 7.5 또는 15 mg/kg BID로 마우스에 경구 투여하였다. 시약, 용액, 장비, AMG 900의 제제, 종양 부피 측정 및 계산은 일반적으로 하기 실시예 4에 기재된 바와 같다. AMG 900은 비히클 대조군과 비교하여, 시험한 모든 이종이식편 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하는 것으로 밝혀졌다 (표 4).

[표 4]

종양 이종이식편으로서 생체내에서 성장시킨 다중약물 내성 세포주 MES-SA Dx5에서 AMG 900의 효과를 시험하였다. AMG 900을 연구 기간 동안에 매일 3.0 mg/kg BID 또는 1주일마다 연속 2일간 15 mg/kg BID로 마우스에 경구 투여하였다. 투여는 종양이 확립되었을 때 (종양 이식 10일 후) 개시하였다. AMG 900 처리는 비히클 대조군과 비교하여, AMG 900의 용량 및 투여계획에 의해 통계학적으로 유의한 종양 성장 억제를 초래하였다 (도 4; p < 0.0001, 던넷(Dunnett) 사후 검정). 놀랍게도 유사한 종양 성장 억제가 또한 유사한 처리 계획을 사용하는 2개의 다른 약물 내성 모델 (HCT15 및 NCI-H460-탁솔-r [내성])에서도 달성되었다 (표 4 참조).

<도 4>

다중약물 내성인 MES-SA Dx5 세포 (2 x 10⁶개)를 암컷 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에서 피하 주입하였다. 종양은 주 2회 측정하였다. 처리는 종양이 약 100 mm³이 된 10일 째에 개시하였다. 마우스에 AMG 900 (BID)을 간헐적으로 또는 연속적으로 PO 투여하였다. 체중을 유지하기 위해 모든 군에 연구 전체 기간 동안 매일 영양 보충제를 제공하였다. 데이타는 각 군 (1군 당 n = 10)에 대하여 평균 ± SEM으로 나타낸다. P값은 RMANOVA 및 후속 던넷 사후 검정에 의해 결정된, 비히클 및 AMG 900으로 처리한 군 사이의 통계학적 차이에 상응한다. 화살표는 투여 개시를 나타낸다.

실시예 4

오로라 키나제 활성의 AMG 900 유도된 억제가 세포 증식을 억제하는지를 조사하기 위하여, AMG 900의 항종양 효능을 무흉선 누드 마우스에서의 NCI-H460-탁솔 내성 종양 이종이식편에 대하여 생체내에서 평가하였다. 마우스에 AMG 900 (BID)을 간헐적으로 또는 연속적으로 PO 투여하였다. 마우스에 파클리탁셀 (탁솔)을 5일/1주일로 IP 투여하였다. 본 연구에서 암젠의 내부 화합물을 양성 대조군으로서 사용하였다 (데이타 도시하지 않음). 종양을 주 2회 측정하였다. 처리는 종양이 확립된 12일 째에 개시하였다. 체중을 유지하기 위해 모든 군에 연구 전체 기간 동안 매일 영양 보충제를 제공하였다.

동물 및 조직

종/계통: 무흉선 누드

마리수/성별: 125마리/암컷

평균 체중: 무작위 추출한 날에 20 내지 30 g

조직 유형: NCI-H460 탁솔 내성

공급원: 암젠 암 약리학 세포 은행

(Amgen Cancer Pharmacology Cell Bank)

대상체의 질환 상태: 종양이 있는 마우스

동물 관리: AMALAR 관리소

시험 물질

시험 물품: AMG 900

제조사: 암젠 인크.

시험 물품: 탁솔

제조사: 브리스톨-마이어스 스큅

(Bristol-Myers Squibb)

중요 시약 제제

시험 화합물: AMG 900

스톡 농도: 1.5, 0.3 mg/mL

제제화: 매주, 7일 내에 사용함

비히클: 2% HPMC/1% TW80 pH 2.2

용량 (10 mL/개체 체중 1 kg): 용량 범위: 0.20 내지 0.30 mL

투여 경로: PO

시험 화합물: 탁솔

스톡 농도: 6 mg/mL

제제화: 버트 파마시(Burt's Pharmacy)로부터 구입

제조사: 브리스톨-마이어스 스큅

비히클: 염수

용량 (10 mL/개체 체중 1 kg): 용량 범위: 0.20 내지 0.30 mL

투여 경로: IP

제제화

AMG 900 (유리 염기)을 1.5 및 0.3 mg/mL의 농도로 현탁물로 제제화하였다. 투여된 부피는 10 mL/kg에 상응하였다. 탁솔 (브리스톨 마이어스 스큅)을 버트 파마시 (미국 캘리포니아주 뉴베리 파크에 소재함)로부터 구입하여 6 mg/mL의 스톡 농도를 1.25 mg/mL의 작업 용액으로 매일 희석하였다.

처리 프로토콜

AMG 900의 투여기 기간은 3주일이고, 탁솔군의 경우에는 2주일이었다. 종양을 디지털 캘리퍼로 측정하고 마우스의 체중을 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피 (mm³) = [(W² X L)/2] (여기서, 너비 (W)는 2개의 측정치 중 작은 값으로 정의되고 길이 (L)은 2개의 측정치 중 큰 값으로 정의됨). 종양 억제율은 다음과 같이 계산하였다: 먼저, 대조군 및 모든 처리군의 [최초 종양 부피 - 최종 종양 부피]를 얻고; 둘째, 처리 종양 부피의 변화를 대조군 종양 부피로 나누고 1을 뺀 다음 100을 곱한다. 하기 표 5 및 도 5는 종양 부피 및 종양 성장 억제율 결과를 설명한다.

[표 5]

<도 5>

도 5는 AMG 900 및 탁솔 처리가 확립된 H460-탁솔 내성 종양의 성장에 미치는 영향을 도해한다. 세포 (동물 1마리 당 2 x 10⁶개)를 암컷 누드 마우스 (1군 당 n = 10)의 오른쪽 옆구리에서 피하 주입하였다. 종양은 주 2회 측정하였다. 처리는 종양이 대략 170 mm³이 된 종양 이식 후 12일 째에 (화살표) 개시하였다. 마우스에 3주일 동안 매일 1회 또는 2회 PO 또는 IP 투여하였다. 데이타는 각 군에 대하여 평균 ± SE로 나타낸다. ^*P값 (도시하지 않음)은 STATview를 사용하여 시간 경과에 따라 쉐페(Sheffe)의 반복 측정 ANOVA로 분석된, 비히클 및 AMG 900 또는 탁솔로 처리한 군 사이의 통계학적 차이에 상응한다. 범례에 나열한 투여계획 일수는 일수/1주일을 나타낸다. 모든 군에 연구 전체 기간 동안 영양 보충제를 제공하였다.

상기 도 5에 도해된 바와 같이, 종양이 있는 마우스의 AMG 900에 의한 처리는 연속적으로 (7일 동안 3 mg/kg BID (억제율 60%, p = 0.0003)) 또는 간헐적으로 (2일 투여/5일 비투여/1주일로 15 mg/kg BID (억제율 66%, p < 0.0001)) 투여하였을 때 종양 성장을 유의하게 억제하였다. 탁솔은 본 실험에서 2 투여 사이클 동안 5일/1주일로 12.5 mg/kg IP 투여하였을 때 종양 성장을 유의하게 억제하지 못했다 (억제율 20%, p = 0.5399).

놀랍게도 AMG 900은 3종의 잘 특징화된 오로라 키나제 억제제: AZD1152; VX-680 (통상적으로 MK-0457이라고도 함); 및 PHA-739358 (다누서티브(Danusertib))에 대하여 내성인 종양 세포주에서 활성을 유지한다는 사실이 예상밖으로 밝혀졌다. 상기 실험을 위해 사용된 억제제는 공개되었고 문헌에서 특징화된 화합물이다. 예를 들어, 문헌 [Expert Opinion Investigational Drugs (2009) 18 (4) pg 379-398]; [Expert Opinion Therapeutic Patents, (2009) 19 (3), pg 321-356]을 참조한다. 진행성 또는 전이성 고형 종양을 갖는 I기 환자에서의 다누서티브 (PHA-739358)의, 화학 구조를 포함하는 상세한 안전성, 내약성 및 pK 프로파일은 문헌 [Steeghs et al., Journal of Clinical Oncology, 27, 2009]에서 찾아볼 수 있다.

하기 제공되는 데이타는 탁솔 내성 세포주에서의 AMG 900의 활성을, 상기 언급된 3종의 널리 공지된 오로라 키나제 억제제가 동일한 탁솔 내성 세포에서 히스톤 H3의 인산화를 억제하는 능력과 비교하여 나타낸다.

실시예 5

3종의 오로라 키나제 억제제 (AZD1152, MK-0457 및 PHA-739358)를 P-gp 또는 BCRP 약물 유출 수송인자를 발현하는 MDR 종양 세포주의 부분집합군에서 평가하였다. 예상밖으로, AMG 900은, P-gp 또는 BCRP 상태와 상관없이 시험한 모든 세포주에서 일관된 IC₅₀ 또는 EC₅₀ 값 (2 내지 3 nmol/L)으로 p-히스톤 H3을 억제하거나 또는 배수성을 유도하였다. 이와 달리, 다른 오로라 키나제 억제제는 하기 표 6에 나타낸 바와 같이, 매칭된 감수성 종양 세포주와 비교하여 1종 이상의 MDR 세포주에서 덜 효과적이었다.

물질 및 방법

화합물 물질: 이하의 화합물: 파클리탁셀 및 도세탁셀, MLN8054, MK-0457, AZD1152 및 PHA-739358에 대한 분자 구조는 공유되어 있어 이용가능하다. 상기 물질은 시중의 공급원으로부터 필요에 따라 구입하였고, 탁산도 마찬가지였다.

세포주: 종양 세포주는, 달리 명시하지 않는 한, ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수하였다. MDA-MB-231-PTX 및 NCI-H460-PTX 세포주는, 세포를 6개월의 기간 동안 증가하는 농도의 파클리탁셀의 존재하에 성장시켜 확립하였다. HCT116 AZD1152 내성 세포주는, 세포를 80 nmol/L의 AZD1152의 존재하에 성장시켜 확립하였다.

동물: 모든 실험 절차는 동물실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 및 미국 농무부 규정에 따라 수행하였다. 4주 내지 6주령 암컷 무흉선 누드 마우스 (하란 스프래그 돌리(Harlan Sprague Dawley))를 멸균된 우리에 수용하고 무균 상태하에 유지하였다. 동물을 수용하고 있는 실험실에는 교차하는 명기 및 암기 사이클 (각각 12시간)이 제공되었고 국제 실험동물 관리 평가 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 규약의 수준을 만족시켰다. 사료, 물 및 영양 보충제는 자유 급이하였다. 모든 약물은 각각의 마우스의 개별 체중을 기준으로 투여하였다.

형광 기반 세포 이미지화 검정: 모든 고효율 세포 검정은 어레이스캔 VTi HCS 리더 (셀로믹스)에서 수행하였다. 종양 세포주를 AMG 900, AZD1152, MK-0457 또는 PHA-739358로 처리하였다 (농도 범위는 효력에 따라 달라짐). 세포를 상기 기재된 바와 같이 항-p-히스톤 H3 Ser¹⁰ 항체로의 세포내 염색을 위해 준비하였다 (1). 검출은 항-토끼 IgG-알렉사-568 항체 및 DAPI를 사용하여 수행하였다. p-히스톤 H3의 세포 수준을 타겟 액티베이션(Target Activation) V2 알고리즘 (셀로믹스)을 사용하여 분석함으로써 양성 세포의 백분율을 측정하였다. 이미지화 검정에서, 농도-반응 곡선 및 상응하는 IC₅₀ 및 EC₅₀ 값은 DMSO 대조군에 대한 영향을 받은 세포의 백분율을 사용하여 계산하였다.

콜로니 형성 검정: 종양 세포를 48시간 동안 AMG 900, 파클리탁셀 또는 AZD1152 (0.5, 5, 50 nmol/L)로 처리하고, 완전 배지로 2회 세척한 다음, 세포를 약물 무함유 완전 배지 중에 5000개 세포/웰의 밀도로 재플레이팅하였다. DMSO 대조군 웰이 컨플루언스(confluence) 상태가 될 때까지 세포를 성장시켰다. 세포를 크리스탈 바이올렛 염료 (시그마)로 염색하고, 증류수로 세척한 다음, 디지털 스캐너 (휴렛-패커드(Hewlett-Packard))를 사용하여 이미지화하였다.

4 N 이상의 DNA 함량 검정: 종양 세포를 24시간 동안 AMG 900, AZD1152, MK-0457 또는 PHA-739358 (농도 범위는 효력에 따라 달라짐)로 처리하고 상기 기재된 바와 같이 세포 주기 분석 (단지 DNA 염색)을 위해 가공하였다 (1). 세포를 BD FACS 디바(Diva) 소프트웨어를 사용하여 LSRII 유동 세포측정기에서 분석하였다. 농도-반응 곡선 및 상응하는 EC₅₀ 값은 DMSO 대조군에 대한 4 N 이상의 DNA 함량을 갖는 세포의 백분율을 사용하여 계산하였다.

P- gp 및 BCRP 세포 표면 염색: P-gp (ABCB1) 및 BCRP (ABCG2)의 세포 표면 발현은, 생 세포를 얼음 상에서 30분 동안 FITC-콘주게이팅 P-gp (BD 바이오사이언스) 또는 APC-콘주게이팅 BCRP (밀리포어(Millipore)) 항체로 염색함으로써 측정하였다. 매칭 이소형 항체 (BD 바이오사이언스)를 대조군으로서 사용하였고, 또한 사멸 세포를 제외시키기 위해 7-아미노악티노마이신 D (BD 바이오사이언시즈) 생존력 염색을 사용하였다. 세포를 BD FACS 디바 소프트웨어를 사용하여 LSRII 유동 세포측정기에서 분석하였다.

오로라 키나제 유전자 분석: 냉동된 HCT116 세포 펠렛 (3개의 AZD1152 내성 세포 서브클론(subclone) 및 1개의 모 세포 대조군)으로부터 표준 핵산 추출 방법을 사용하여 총 RNA 및 게놈 DNA를 단리하였다. 총 RNA를 사용하여 cDNA를 생성하였다 (어드밴티지(Advantage) RT-PCR 키트, 클론테크(Clontech)). 전장 오로라-A 및 -B 유전자 전사체를 익스팬드-폴리머라제-롱-템플레이트(Expand-polymerase-long-template) 키트 (로슈(Roche))를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 프라이머쌍은 다음을 포함한다:

상기 기재된 것과 동일한 PCR 키트를 사용하여, 게놈 DNA로부터, 5' 및 3' 플랭킹(flanking) 인트론을 기반으로 하는 7개의 프라이머 세트

를 사용하여 오로라-C의 7개의 엑손을 증폭시켰다. PCR DNA 산물을 제조사의 권장 프로토콜 (인비트로젠)에 따라 pCR2.1 벡터로 서브클로닝하였다. 오로라-A, -B, 및 -C 유전자 산물을 함유하는 정제된 플라스미드를 플랭킹 벡터 프라이머를 사용하여 디데옥시 사이클 서열분석하였다. 서열분석 반응은 3730x1 DNA 분석장치 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 진행하였고, 출력 서열은 시켄처(Sequencher) 소프트웨어 (진 코즈 코포레이션(Gene Codes Corporation))를 사용하여 분석하였다.

표 6은 어떻게 AMG 900이 다중약물 내성 종양 세포주에서 일관된 효력을 나타내는지를 도해한다.

[표 6-A]

하기 표 6-B에서 나타낸 바와 같이 추가의 세포주를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다.

[표 6-B]

실시예 6

또한, AMG 900을 오로라 키나제 B의 선택적 억제제인 AZD1152의 존재하에 성장하도록 적합화된 HCT-116 세포에 대하여 생체내에서 평가하였다. 본 실험 역시 오로라 키나제 억제제에 대한 내성의 가능한 대체 메카니즘에 대해 말해준다. 따라서, HCT116 세포를 AZD1152의 존재하에 성장하도록 적합화하였다. 그 후에 AMG 900의 활성을 HCT116 모 세포주 및 AZD1152 내성 세포주에서 평가하였다.

AMG 900은 놀랍게도, AZD1152의 존재하에 성장하도록 적합화된 HCT116 아세포주의 배수성을 유도하고 콜로니 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. AMG 900의 4 N 이상의 세포 DNA 함량 EC₅₀ 값은 2 및 5 nmol/L였고, 이에 반해 AZD1152의 경우에는 각각 34 및 672 nmol/L였다 (도 6-A). AMG 900은 두 HCT116 세포주 모두에서 5 nmol/L 이상의 농도에서 콜로니 형성을 억제하였고, 반면에 변이 아세포주는 50 nmol/L에서 AZD1152에 대하여 비감수성이었다 (도 6-B). HCT116 세포주는 둘다 동등하게 파클리탁셀에 대하여 감수성이었고 P-gp 및 BCRP 발현에 대해서 음성이었다 (도 6-C). 흥미로운 것은, HCT116 변이 아세포주는 오로라-B 유전자의 한 대립유전자에서 미스센스(missense) 돌연변이 (TGG → TTG; W221L)를 지닌 반면, 오로라-A 및 -C 유전자에서는 돌연변이가 관찰되지 않았다는 점이다. 이러한 결과는 AMG 900이 AZD1152에 대하여 내성인 종양 세포, 보다 구체적으로는 AZD1152에 대한 내성의 원인이 될 수 있는 오로라-B에서의 이형접합성 돌연변이가 일어난 종양 세포에서 활성을 유지함을 시사한다. 따라서, 이러한 예상밖의 긍정적인 데이타는 AZD1152에 대하여 내성이 된 종양 세포를 치료하는데 있어서 효과적인 상태를 유지하는 AMG 900의 놀라운 능력을 보여준다.

<도 6>

방법:

도 6-A: HCT116 세포주를 24시간 동안 증가하는 농도의 AMG 900 또는 AZD1152로 처리하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 DMSO 처리 대조군에 대한 백분율 (POC)로서 표시된 4 N 이상의 DNA 함량을 갖는 세포의 축적을 평가하였다. 농도-반응 곡선 및 EC₅₀ 값 계산치는 2개의 독립 실험으로부터 결정되었다 (막대, ±SD).

도 6-B: HCT116 세포주 (모 세포주 및 AZD1152 내성)를 사용하여 콜로니 형성 검정을 수행하였다. 세포를 48시간 동안 지시된 농도의 DMSO, AMG 900, AZD1152 또는 파클리탁셀로 처리하고 억제제가 함유되지 않은 완전 배지에 재플레이팅하였다. DMSO 처리 세포가 컨플루언스에 도달한 후에, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 이미지화하였다 (2벌의 웰).

도 6-C: 피코에리트린 (PE) 콘주게이팅 P-gp 및 알로피코시아닌 (APC) 콘주게이팅 BCRP 항체로 동시염색된 HCT116 세포주 (모 세포주 및 AZD1152 내성)의 세포 표면 상에서의 P-gp 및 BCRP의 발현 정도를 유동 세포측정법에 의해 평가하고 분석하였다. 백그라운드 형광을 정하기 위해 각각의 세포주에 대하여 이소형 대조군을 사용하였다. MES-SA-Dx5 및 RPMI 8226 세포주는 각각 P-gp 및 BCRP 발현에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다.

동물:

5주 내지 6주령 암컷 무흉선 누드 마우스 (하란 스프래그 돌리)를 입수하여 멸균된 우리에 수용하였다. 역삼투 정제수 및 오토클레이빙 사료를 자유 급이하였다. 모든 동물 연구는 내부 IACUC 프로토콜에 따라 수행하였고 모든 AAALAC 규약을 만족시켰다.

약력학적 검정 ( 포스포 - 히스톤 H3 의 검출):

인간 HCT 116 또는 Colo 205 이종이식편 종양이 확립된 마우스에 1회 경구 용량의 대조군 (비히클 단독) 또는 AMG 900을 지시된 투여량으로 투여하였다 (1군 당 n = 동물 3마리). 3시간 또는 6시간째에, 종양, 골수 또는 피부 조직을 약력학적 평가 (p-히스톤 H3 수준)를 위해 수집하였다. 혈장도 또한 약동학적 분석을 위해 수집하였다.

유동 세포측정법 ( FCM ): 종양을 단일 세포 현탁물로 해리시키고 -20℃에서 적어도 24시간 동안 90% 메탄올 중에서 고정시켰다. 이어서 세포를 항-p-히스톤 H3 (ser-10) 및 항-시토케라틴 항체로 염색하고 프로피듐 아이오다이드로 대비염색하였다. 데이타를 FACS디바 소프트웨어를 운용하는 LSRII 유동 세포측정기에서 입수하였다. 세포 주기의 G2M기의 골수 및 시토케라틴 양성 종양 세포를 p-히스톤 H3에 대하여 평가하였다. 종양 및 골수 세포를 비히클 처리 마우스로부터 수집하여 p-히스톤 H3 기본 대조군으로서 사용하였다. 통계학적 유의성은 일원배치 ANOVA 분석에 의해 결정하였다.

레이저 스캐닝 세포측정법 ( LSC ): FFPE 조직 샘플 (피부 및 종양)로부터의 3벌의 절편을 항-p-히스톤 H3 항체, 이어서 알렉사-633 콘주게이팅 염소 항-토끼 IgG를 사용하여 염색하였다. 슬라이드에 DNA 염료 훼히스트33342를 포함하는 프로롱 골드 안티페이드(Prolong Gold antifade)를 적재하였다. 이미지를 40x 대물렌즈를 사용하여 LSC에서 포착하였다 (0.5 μ 픽셀 해상도에서). p-히스톤 H3 사건수는 규정된 적색 형광 임계값을 기준으로 하여 결정하였다. 20 ㎛²보다 큰 사건만을 계수하였다. 콘투어링(contoured) 사건을 이미지 갤러리에 재배치하여 분할의 정확도를 확인하였다. 데이타는 SAS V9.3을 사용하여 분석하였고 던넷 검정법을 적용하였다. 모든 통계학적 검정은 알파 = 0.05 유의성 수준에서 평가하였다.

미세 바늘 흡인 ( FNA ): 25 게이지의 바늘을 예정된 일정한 패턴 (3x)으로 종양 주변의 피부에서 작은 절개부를 통해 삽입함으로써 종양 흡인물을 수집한 후에, 2% 파라포름알데히드 내로 배출하였다. 세포를 현미경 슬라이드 상으로 세포도말하고 EpCAM (상피 종양 마커, 알렉사 플라우어 488) 및 pHH3 (유사분열 마커, 알렉사 플라우어 647)에 특이적인 항체로 염색하고 DAPI (DNA 함량)로 대비염색하였다. iCyte LSC (레이저 405 nm, 488 nm, 633 nm, PMT 필터: 450/40, 530/30, 650/LP)를 사용하여 40x 배율 필드 이미지를 포착하고 EpCAM, pHH3 및 DNA 함량을 정량화하였다. 세포의 이미지를 갤러리에 재배치함으로써 모집단의 무결성을 확인하였다. G2M에서의 EpCAM, pHH3 양성 세포의 수를 기록하였다. 데이타는 평균 +/- 평균의 표준 오차 (SEM)로서 나타냈다. 통계학적 유의성은 ANOVA, 이어서 본페로니(Bonferroni) 던넷 사후 검정 분석을 사용하여 결정하였다.

혈장 중 AMG 900의 농도 (약동학적 검정):

용매 혼합물 (90% 메탄올, 10% 물 및 0.01% 트리플루오로아세트산)을 첨가하여 분석물을 단리하고 혈장 단백질을 침전시킴으로써 혈장 샘플 (50 μL)을 추출하였다. 추출된 샘플 중의 AMG 900 농도는 수중의 0.1% 포름산 (이동상 A) 및 0.1% 포름산이 함유된 아세토니트릴 (이동상 B)을 사용하는 배리안 퍼수트(Varian Pursuit) PFP 분석용 칼럼 (2.0 x 30 mm, 5 마이크로미터) 상에서의 역상 액체 크로마토그래피를 사용하는 LC-MS/MS에 의해 측정하였다.

이종이식편 모델:

마우스에 2 x 10⁶개의 인간 HCT 116 결장 종양 세포를 피하 주입하였다. 종양이 확립되었을 때 (대략 200 mm³), 마우스를 무작위 추출하여 실험 처리군 (n = 10)으로 하고 AMG 900을 실험 기간 동안 간헐적으로 3.75, 7.5 또는 15 mg/kg, 또는 매일 1.5, 2.25 또는 3 mg/kg으로 경구 처리하였다. 마우스에 매일 영양 보충제를 제공하였다. 종양 부피 및 체중을 각각 캘리퍼 및 분석용 디지털 저울을 사용하여 주 2회 기록하였다. 종양 데이타는 평균 종양 부피 +/- SEM으로 나타냈다. 종양 성장 억제율에 대한 통계학적 유의성은 반복 측정 ANOVA (RMANOVA), 이어서 쉐페 사후 검정 분석에 의해 결정하였다.

실시예 7

AMG 900이 종양 성장에 미치는 생체내 영향을 3개의 MDR 이종이식편 모델을 포함하는, 5종의 상이한 종양 유형 (유방, 결장, 폐, 췌장 및 자궁)으로부터의 인간 이종이식편의 패널에서 추가로 평가하였다. 확립된 종양이 있는 마우스에 AMG 900을 1주일에 연속적으로 2일씩 15 mg/kg b.i.d.로 3주일 동안, 또는 3주일 동안 매일 3 mg/kg b.i.d.로 경구 투여하였다. 각각의 이종이식편 모델에 대하여 종양 성장 억제율 (TGI)의 최고 백분율을 하기 표 7에 기록하였다. TGI의 백분율은 연구 기간 동안에 비히클 처리 대조군 및 AMG 900 처리된 종양 부피에서의 변화의 차이로서 계산하였다. 비히클 처리 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 종양 성장 억제율은 RMANOVA, 이어서 쉐페 또는 던넷 사후 검정법에 의해 결정하였고 별표로 표시하였다 (^* P < 0.005, ^** P < 0.0005).

AMG 900은 비히클 처리 대조군과 비교하여, 모든 9개의 이종이식편 모델에서 유의한 항종양 활성 (종양 성장 억제율 (TGI) 50 내지 97%)을 나타냈다. 중요한 것은, AMG 900이 각각의 최고 내약성 용량으로 투여된 도세탁셀 또는 파클리탁셀에 대하여 내성인 MES-SA-Dx5 (TGI 84%, P < 0.0001) 및 NCI-H460-PTX (TGI 66%, P < 0.0001) 이종이식편 모델에서 활성이었다는 점이다.

따라서, AMG 900은 다중약물 내성 모델 및 표준 치료 유사분열 억제 약물을 포함하는, 생체내 다수의 인간 종양 이종이식편의 성장을 억제한다. 구체적으로, AMG 900이 놀랍게도 HCT116 종양에서 오로라-B의 활성을 억제하고 다양한 종양 유형을 대표하는 다수의 이종이식편의 성장을 억제한다는 것이 상기 데이타에 의해 확인된다.

[표 7]

고찰

종양이 오로라 키나제 억제제에 대하여 내성을 발달시키는 메카니즘은 상이한 작용제에 대하여 상이할 것으로 예상된다. 암 표현형을 유도하는 분자력을 명확히 이해하는 것은 주어진 요법에 대한 확인가능한 유전적 또는 후생적 감수성을 이용할 수 있는 분자 단계에서 표적화되는 의약 또는 요법에 대한 근거를 제공할 것이지만, 요법에 대한 내성의 유전적 근거를 이해하는 것도 중요하다. 이러한 유전학적 이해는 잠재적인 환자 집단을 계층화하는 추가의 필터를 제공할 수 있다. 예를 들어, 공개된 유전학적 증거는 오로라 키나제 억제제로서 현재 임상 평가가 진행 중인 AZD1152 및 잠재적인 또 다른 임상 화합물 VX-680이 MDR1 또는 BCRP를 과발현하는 종양 세포에서는 비교적 비효과적일 수 있음을 시사한다. DNA 복구 결손 결장 암종 세포주 HCT116의 선별 동안에 출현하는 오로라 B 키나제 도메인 돌연변이는 내성을 초래할 수 있다. 이러한 촉매 도메인 돌연변이는 또한 세포가 AZD1152 및 VX-680에 대해서도 내성이도록 하기에 충분한 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들 작용제에 대한 내성이 MDR과 상관없이 발생할 수 있음을 시사한다 (문헌 [The Pharmacogenomics Journal, (2009) 9, pgs 90-102]).

본 발명은 유사분열 억제제, 예컨대 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀) 및 빈카 알칼로이드를 포함하는, 전통적인 표준 치료 화학요법제에 대하여 난치성이 된 암을 치료하는 능력을 갖는, 오로라 키나제 억제제 화합물 AMG 900을 제공한다. 또한, AMG 900은 AZD 1152, VX-680 및 PHA-739358을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 다른 오로라 키나제 억제제에 대하여 내성인 암을 치료하는 능력을 갖는다. 일반적으로, 이러한 종양은 항암제를 이용한 선행 및/또는 장기 치료의 결과로서 내성을 발달시킨다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 대상체에서의 암의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 대상체에 유효 투여량의 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민을 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체의 암은 항암제로 이전에 치료된 바 있는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 항암제는 화학요법제이다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 유사분열 억제제 또는 안트라시클린이다. 또 다른 실시양태에서, 화학요법제는 탁솔, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용제이다. 또 다른 실시양태에서, 항암제는 AZD1152, PHA-739358, MK-0457 또는 이들의 조합이다.

그러므로, AMG 900은 탁산 표준 치료 요법으로 이전에 치료된 바 있는, 통제되지 않는 세포 성장 및 비정상적인 세포 주기 조절을 포함하는 세포 증식 장애를 치료하는 데에 사용할 수 있다.

이러한 목적을 위해, AMG 900은 비제한적으로 암, 예를 들어 다양한 고형 종양 및 혈액학적으로 유래된 종양, 예컨대 비제한적으로 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암 (소세포 폐암 포함), 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암(stomach cancer), 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암, 자궁암 및 피부암 (편평 세포 암종 포함)을 포함하는 암종; 림프 계통의 조혈성 종양 (백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버켓 림프종(Burkett's lymphoma) 포함); 골수 계통의 조혈성 종양 (급성 및 만성 골수성 백혈병 (AML 및 CML), 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병 포함); 중간엽 기원의 종양 (섬유육종 및 횡문근육종, 및 다른 육종, 예를 들어 연조직 및 골 육종 포함); 중추신경계 및 말초신경계의 종양 (성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반세포종 포함); 및 다른 종양 (흑색종, 고환종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포암 및 카포시 육종 포함)의 예방 또는 치료에 유용하며, 여기서 상기 암은 재발되었거나 또는 난치성이 된 것들이다. 항암 치료, 예컨대 호르몬 치료에 대하여 난치성이 된, 암, 예컨대 전립선암, 난소암, 폐암, 유방암, 담관암종 또는 다른 유형의 암 또한 AMG 900으로 치료할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서의 자궁암, 유방암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 결장암, 전립선암, 피부암, 신장암, 간암, 전골수구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 T 세포 백혈병을 포함하는 백혈병, 다발성 골수종, 난소암 및 골수암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효 투여량의 AMG 900을 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체의 암은 독소루비신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 콜히친, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 에토포시드 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화학요법제로 이전에 치료되었으며 이들에 대하여 난치성이 된 암이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 식도암, 위암(gastric cancer), 난소암, 췌장암, 위암(stomach cancer), 자궁경부암, 갑상선암 및 전립선암 또는 림프종 또는 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암의 치료 방법을 제공한다. AMG 900은 또한 비제한적으로 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 비소세포 폐, 두경부, 식도, 위(gastric), 난소, 췌장, 위(stomach), 자궁경부, 갑상선 및 전립선의 종양을 포함하는 진행 고형 종양의 치료에도 유용하다.

본 발명은 또한 고형 종양, 육종 (특히 유윙 육종(Ewing's sarcoma) 육종 및 골육종), 망막모세포종, 횡문근육종, 신경모세포종, 백혈병 및 림프종을 포함하는 조혈성 악성종양, 종양 유도성 흉막 삼출 또는 심낭 삼출 및 악성 복수증의 치료 방법을 제공한다.

인간 치료에 유용할 뿐만 아니라, 본 화합물은 또한 포유동물, 설치류 등을 포함하는, 반려 동물, 외래 동물 및 가축의 수의학적 치료에도 유용하다. 예를 들어, 말, 개 및 고양이를 포함하는 동물의 표준 치료 항암 화학요법 치료에 대하여 난치성인 암을 AMG 900으로 유사하게 치료할 수 있다.

제제

AMG 900은 (본 발명의 활성 제약 성분 또는 API인) 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민을, 1종 이상의 비독성의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 보조제 (집합적으로 본원에서 "부형제" 물질이라 함)와 함께 포함하는 제약 조성물로서 암 대상체에 투여될 수 있다. AMG 900 또는 그의 제약상 허용되는 염 형태는 약제학의 통상의 방법에 따라 가공되어, 인간 및 다른 포유동물을 포함하는 환자에게 투여하기 위한 의약 및 제약 조성물을 제조할 수 있다.

제약 조성물은 임의의 적합한 경로에 의해, 그러한 경로에 적합화되어, 의도된 난치성 암의 치료에 효과적인 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 조성물 또는 API는 예를 들어 통상의 제약상 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 함유하는 투여 단위 제제로, 경구로, 점막으로, 국소로, 직장으로, 폐로, 예컨대 흡입 스프레이에 의해, 또는 비경구로, 예컨대 혈관내로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 근육내로, 흉골내로, 또한 주입 기법에 의해 투여될 수 있다.

경구 투여의 경우에, 제약 조성물은, 예를 들어 정제, 캡슐제, 현탁액제 또는 액제 형태일 수 있다. 제약 조성물은 바람직하게는 특정 양의 활성 성분을 함유하는 투여 단위 형태로 제조된다. 이러한 투여 단위의 예로는 정제 또는 캡슐제가 있다. 예를 들어, 이들은 약 1 내지 2000 mg, 통상적으로는 약 1 내지 500 mg 양의 활성 성분을 함유할 수 있다. 인간 또는 다른 포유동물을 위한 적합한 1일 용량은 환자 상태 및 다른 요인에 따라 폭넓게 달라질 수 있으나, 통상의 방법 및 지침을 사용하여 결정할 수 있다.

난치성 암 상태를 치료하기 위한 투여 계획 및 투여되는 API (AMG 900)의 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 질환 유형, 암의 중증도, 투여 경로 및 빈도, 및 AMG 900 또는 그의 특정 형태, 예컨대 특정 염 형태의 물리적 및 화학적 성질을 포함하는, 다양한 요인에 따라 달라진다. 따라서, 투여 계획은 다양할 수 있다. 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 500 mg, 유리하게는 약 0.01 내지 약 50 mg, 보다 유리하게는 약 0.1 내지 약 30 mg, 보다 더욱 유리하게는 약 0.1 mg 내지 약 25 mg의 1일 용량이 적절할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 AMG 900 또는 그의 제약상 허용되는 염을 약 0.5 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 범위의 유효 투여량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체의 암은 유사분열 억제제로의 치료에 대하여 난치성인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 AMG 900 또는 그의 제약상 허용되는 염을 약 1.0 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 범위의 유효 투여량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체의 암은 유사분열 억제제를 포함하는 표준 치료 화학요법제로의 치료에 대하여 난치성인 것이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서의 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 AMG 900 또는 그의 제약상 허용되는 염을 약 3.0 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 범위의 유효 투여량으로 상기 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 대상체의 암은 유사분열 억제제로의 치료에 난치성인 것이다. 1일 용량은 하루에 1 내지 4회의 용량으로 투여할 수 있다.

치료 목적으로, AMG 900은 지시된 투여 경로에 적절한 1종 이상의 보조제 또는 "부형제"와 조합될 수 있다. 1회 투여로 투여되는 경우에, AMG 900은 락토스, 수크로스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로스 에스테르, 셀룰로스 알킬 에스테르, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 젤라틴, 아카시아 고무, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및/또는 폴리비닐 알콜과 혼합되어 최종 제제를 형성할 수 있다. 예를 들어, AMG 900 및 부형제(들)는 편리한 투여를 위해 공지된 허용되는 방법으로 정제화 또는 캡슐화될 수 있다. 적합한 제제의 예는 비제한적으로 환제, 정제, 연질 및 경질 외피 겔 캡슐제, 트로키제, 경구 용해성 형태 및 이들의 지연 또는 조절 방출 제제를 포함한다. 특히, 캡슐제 또는 정제 제제는 API(들)와의 분산물로서, 1종 이상의 조절 방출 제제, 예컨대 히드록시프로필메틸 셀룰로스를 함유할 수 있다.

건선 및 다른 피부 병태의 경우에, AMG 900의 국소 제제를 병에 걸린 부위에 1일 2 내지 4회 적용하는 것이 바람직할 수 있다. 국소 투여에 적합한 제제는 피부를 통한 침투에 적합한 액상 또는 반액상 제제 (예를 들어, 도찰제, 로션, 연고, 크림, 페이스트, 현탁액제 등), 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다. 활성 성분의 적합한 국소 용량은 1일 1 내지 4회, 바람직하게는 1 또는 2회 투여되는 0.1 mg 내지 150 mg이다. 국소 투여의 경우에, API는 제제의 0.001 내지 10% w/w, 예를 들어 1 내지 2 중량%로 포함될 수 있지만, 10% w/w 정도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 제제의 5% w/w 이하, 보다 바람직하게는 0.1% 내지 1%로 포함될 수 있다.

연고로 제제화된 경우에, AMG 900은 파라핀성 또는 수혼화성 연고 기재와 함께 사용될 수 있다. 별법으로, AMG 900은 수중유 크림 기재를 사용하여 크림으로 제제화될 수 있다. 필요한 경우, 크림 기재의 수성상은 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물과 같은 다가 알콜을 30% w/w 이상 포함할 수 있다. 국소 제제는 바람직하게는 피부 또는 다른 병에 걸린 부위를 통한 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증진시키는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 피부 침투 증진제의 예는 DMSO 및 관련 유사체를 포함한다.

AMG 900은 또한 경피 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, 경피 투여는 저장용기 및 다공성 막 유형의 패치 또는 고체 매트릭스 종류의 패치를 사용하여 달성될 것이다. 어느 경우에나, AMG 900은 저장용기 또는 마이크로캡슐로부터 수용자의 피부 또는 점막과 접촉된 활성제 투과성 접착제로 막을 통해 연속적으로 전달된다. AMG 900이 피부를 통해 흡수되는 경우에, 조절 및 예정된 유량의 AMG 900이 수용자에게 투여된다. 마이크로캡슐의 경우에, 캡슐화제는 또한 막으로서 기능할 수 있다.

에멀젼의 유성상은 공지된 방식으로 공지된 성분으로부터 구성될 수 있다. 상기 상이 유화제만을 포함할 수 있는 반면에, 이는 1종 이상의 유화제와 지방 또는 오일, 또는 지방과 오일 둘 모두와의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 친수성 유화제가 안정화제로서 작용하는 친유성 유화제와 함께 포함된다. 또한, 오일과 지방을 둘다 포함하는 것이 바람직하다. 유화제(들)는 안정화제(들)와 함께 또는 이들 없이 소위 유화성 왁스를 구성하고, 이러한 왁스는 오일 및 지방과 함께 소위 유화성 연고 기재를 구성하며, 이는 크림 제제의 유성 분산상을 형성한다. 제제에 사용하기에 적합한 유화제 및 에멀젼 안정화제는, 예를 들어 트윈 60, 스판(Span) 80, 세토스테아릴 알콜, 미리스틸 알콜, 글리세릴 모노스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 글리세릴 디스테아레이트 단독 또는 그의 왁스와의 조합물, 또는 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 포함한다.

에멀젼 제약 제제에 사용될 가능성이 높은 대부분의 오일 중에서의 API의 가용성은 매우 낮기 때문에, 제제에 적합한 오일 또는 지방의 선택은 목적하는 화장품 특성의 달성을 기준으로 한다. 따라서, 크림은 바람직하게는 비유지성, 비착색성이고, 튜브 또는 다른 용기로부터의 누출을 피하기 위해 점조도가 적합한 씻어낼 수 있는 제품이어야 한다. 직쇄 또는 분지쇄, 1염기성 또는 2염기성 알킬 에스테르, 예컨대 디-이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올레에이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔미테이트, 또는 분지쇄 에스테르의 블렌드가 사용될 수 있다. 이들은 요구되는 특성에 따라 조합하여 또는 단독으로 사용될 수 있다. 별법으로, 고융점 지질, 예컨대 백색 연질 파라핀 및/또는 액체 파라핀 또는 다른 광유가 사용될 수 있다.

눈에 국소 투여하기에 적합한 제제는 또한, 활성 성분이 적합한 담체, 특히 AMG 900을 위한 수성 용매 중에 용해되거나 현탁되어 있는 점안액을 포함한다. AMG 900은 바람직하게는 상기 제제 중에 0.5 내지 20%, 유리하게는 0.5 내지 10%, 특히 약 1.5% w/w의 농도로 존재한다.

비경구 투여용 제제는 수성 또는 비수성 등장성 멸균 주사 용액제 또는 현탁액제 형태일 수 있다. 이러한 용액제 및 현탁액제는 경구 투여용 제제에서 사용되는 것으로 언급된 담체 또는 희석제 중 1종 이상을 사용하거나, 또는 다른 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용함으로써 멸균 분말제 또는 과립제로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, AMG 900은 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 벤질 알콜, 염화나트륨, 트라가칸트 고무 및/또는 다양한 완충제 중에 용해될 수 있다. 다른 보조제 및 투여 방식은 제약 업계에 널리 포괄적으로 공지되어 있다. AMG 900은 또한, 염수, 덱스트로스 또는 물을 포함하는 적합한 담체를 함유하거나, 또는 시클로덱스트린 (즉, 캡티솔(Captisol)), 공용매 가용화제 (즉, 프로필렌 글리콜) 또는 미셀(micellar) 가용화제 (즉, 트윈 80)를 함유한 조성물로서 주사에 의해 투여될 수 있다.

멸균된 주사가능한 제제는 또한, 비경구적으로 허용되는 비독성 희석제 또는 용매 중의 멸균된 주사가능한 용액제 또는 현탁액제, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액제일 수 있다. 허용되는 비히클 및 용매 중에서, 물, 링거액(Ringer's solution) 및 등장성 염화나트륨 용액이 사용될 수 있다. 또한, 멸균된 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 무자극성 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능한 제제에서 사용된다.

폐로 투여하는 경우에, 제약 조성물은 에어로졸 형태로, 또는 건조 분말 에어로졸을 포함하는 흡입기를 사용하여 투여될 수 있다.

약물의 직장 투여용 좌제는 약물을 적합한 무자극성 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜과 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 이는 상온에서는 고체이지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 용융되어 약물을 방출시킬 것이다.

제약 조성물은 멸균화와 같은 통상의 제약학적 조작에 적용될 수 있고/거나 통상의 보조제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제 등을 함유할 수 있다. 정제 및 환제는 추가로, 장용 코팅물을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 습윤제, 감미제, 향미제 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

병용요법

AMG 900은 활성 제약 작용제 단독으로서 복용되거나 투여될 수 있지만, 이들은 또한 1종 이상의 화학요법제 및/또는 유사분열 억제제와 조합되어 사용될 수도 있다. 조합물로서 투여되는 경우에, AMG 900은 동시에 또는 상이한 시간에 순차적으로 투여되는 별개의 조성물로서 제제화될 수 있거나, 또는 AMG 900은 단일 조성물로서 제공될 수 있다.

본 발명의 AMG 900 및 또 다른 화학요법제의 사용을 정의할 때, "공동요법" (또는 "병용요법")이라는 어구는 약물 조합의 유리한 효과를 제공할 투여계획에서 순차적 방식으로 각각의 작용제를 투여하는 것을 포괄하고자 하며, 또한 이들 작용제를 실질적으로 동시 방식으로, 예컨대 고정된 비율의 상기 활성제를 갖는 단일 캡슐제, 또는 각각의 제제에 대한 복수의 별개의 캡슐제로 공동-투여하는 것을 포괄하고자 한다.

구체적으로, AMG 900의 투여는 암의 예방 또는 치료에서 당업자에게 공지된 추가의 화학요법제, 예컨대 유사분열 억제 요법과 함께 이루어질 수 있다. 본 발명은 투여 순서에 있어서 제한적이지 않는데, 즉 AMG 900은 공지된 항암제 또는 유사분열 억제제의 투여 이전에, 이들과 동시에 또는 이들의 투여 후에 투여될 수 있다.

상기는 단지 본 발명의 예시이며, 기재된 용도로 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 당업자에게 통상적인 변형 및 변화는 첨부된 특허청구범위에서 규정된, 본 발명의 범주 및 특징 내에 포함시키고자 한다. 모든 언급된 참고문헌, 특허, 출원 및 공개문헌은 본원에 기재된 것처럼 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Payton, Marc Kendall, Richard <120> Use of N-(4-((3-(2-Amino-4-Pyrimidinyl)-2-Pyridinyl)Oxy)Phenyl)-4-(4-Met hyl-2-Thienyl)-1-Phthalazinamine in the Treatment of Antimitotic Agent Resistant Cancer <130> A-1507-US-NP <140> 12/878,539 <141> 2011-09-09 <150> 61/241,527 <151> 2009-09-11 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gcttgttact tattacagct agaggcatca tg 32 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 tcaaggattt ctccccctgc acgattc 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tctcctcccc ctttctctct aaggatg 27 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 acccgagtga atgacaggga ccatc 25 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 aacagccatc cagagggttc aggaag 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ccacacaccc agtctgttct tcatcc 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 aaggggagca ttggcatccc tgactttc 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 gtatttgggg aaaatgctgg gctcagac 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 accaggcagt gacggtggca tcatatg 27 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 tgacagccac aaacagagct cccac 25 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 ggtaagtgtt ccacctcaga cggaaattg 29 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 cattaaactg ggtcattcct aactggtact cag 33 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 ctcaatgaaa gctggggaag gagaatttcc 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 agaggcattg atagtggaaa cctcacatc 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 acagtgagac ttacagacgc atcctcaag 29 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 aggagagctc cctgaacaca cacaaag 27

Claims

대상체의 암이 항암제로의 치료에 대하여 난치성(refractory)인, 상기 대상체에서의 암의 치료에 있어서 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
제1항에 있어서, 항암제가 화학요법제인, 화합물의 용도.
제2항에 있어서, 화학요법제가 유사분열 억제제 및 안트라시클린으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제인, 화합물의 용도.
제2항에 있어서, 화학요법제가 탁솔, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제인, 화합물의 용도.
제1항에 있어서, 항암제가 AZD1152, PHA-739358, MK-0457 또는 이들의 조합인, 화합물의 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 (a) 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 소세포 폐암, 식도암, 쓸개암, 난소암, 췌장암, 위암(stomach cancer), 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암 및 피부암으로부터 선택된 고형 종양 또는 혈액학적으로 유래된 종양, (b) 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 비호지킨 림프종, 모발상 세포 림프종 및 버켓 림프종(Burkett's lymphoma)으로부터 선택된 림프 계통의 조혈성 종양, (c) 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수구성 백혈병으로부터 선택된 골수 계통의 조혈성 종양, (d) 섬유육종 및 횡문근육종으로부터 선택된 중간엽 기원의 종양, (e) 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 슈반세포종으로부터 선택된 중추신경계 및 말초신경계의 종양, 또는 (f) 흑색종, 고환종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포암 또는 카포시 육종(Kaposi's sarcoma) 중 하나 이상인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 식도암, 위암(gastric cancer), 난소암, 췌장암, 위암(stomach cancer), 자궁경부암, 갑상선암 및 전립선암으로부터 선택된 고형 종양 또는 림프종 또는 백혈병 중 하나 이상인 용도.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 전립선암, 난소암, 유방암, 담관암종, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 또는 이들의 조합인 용도.
항암제로의 치료에 대하여 난치성인 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 화합물 N-(4-((3-(2-아미노-4-피리미디닐)-2-피리디닐)옥시)페닐)-4-(4-메틸-2-티에닐)-1-프탈라진아민 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
제9항에 있어서, 항암제로의 치료에 대하여 난치성인, 방광암, 유방암, 결장암, 신장암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 두경부암, 식도암, 위암(gastric cancer), 난소암, 췌장암, 위암(stomach cancer), 자궁경부암, 갑상선암, 전립선암, 림프종, 백혈병, 다발성 골수종 또는 이들의 조합으로부터 선택된 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 화합물의 용도.
제9항에 있어서, 대상체의 종양이 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신 및 빈카 알칼로이드로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제로 이전에 치료된 바 있는 것인, 상기 대상체에서의 고형 종양의 크기를 감소시킴에 있어서의 화합물의 용도.
제9항에 있어서, 항암제가 유사분열 억제제 및 안트라시클린으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제인, 화합물의 용도.
제9항에 있어서, 항암제가 탁솔, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 및 미톡산트론으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제인, 화합물의 용도.
제9항에 있어서, 항암제가 AZD1152, PHA-739358, MK-0457 또는 이들의 조합인, 화합물의 용도.