TW474810B

TW474810B - Pharmaceutical pyrazole compositions useful as inhibitors of protein kinases

Info

Publication number: TW474810B
Application number: TW084111931A
Authority: TW
Inventors: Neill A Giese; Nathalie Lokker; Alan L Laibelman; Robert M Scarborough
Original assignee: Cor Therapeutics Inc
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1995-11-10
Publication date: 2002-02-01
Also published as: MY113208A; EP0788358A2; EP0788358B1; WO1996014843A2; DE69532817T2; WO1996014843A3; CA2203517A1; AU700964B2; US5916908A; JPH10509708A; DE69532817D1; MX9703488A; CN1165482A; KR970706813A; AU4156196A; ES2219670T3; ATE262902T1

Description

474810 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（1 ) 發明說明發明笳圔本發明係關於吡唑類及新發現用吡唑類作爲蛋白激酶尤其是酪胺酸激酶之抑制劑、作爲分析激酶及其基質之藥劑、以及作爲藥用組成物供抑制劑發生與激酶相關之病症例如細胞生長。背景酪胺酸一特定蛋白激酶（酪胺酸激酶）代表一種觸媒種類，其可催化將終端的三磷酸腺替轉移至蛋白基質之酪胺酸殘留物，其中需確認的第一類爲與可以進行細胞轉變之病毒基因（稱爲致瘤物質）結合之酪胺酸激酶（即 PP60v-src 與 pp98v— fps)，其次爲這些病毒基因產物之正常細胞抗衡部份（即p p 6 0 C _ src與pp98c — fps)，第三類需確認之酪胺酸激酶爲生長因子受體，其中包括胰島素、表皮生長因子（ E G F )、衍生自血小板之生長因子（PDGF)、纖維織母細胞生長因子（FGF)、及p 1 1 8 5HER—2 受體，咸信全部這些酪胺酸激酶經由基質之磷酸化作用，在多種細胞功能之訊號傳導上扮演重要的角色。雖然訊號傳導之確實機轉尙待解釋，酪胺酸激酶頃經證實在細胞增殖、致癌及細胞分化上爲重大之導致因素。將細胞暴露於一或多種生長因子例如FGF、EGF 、及P D G F可引發細胞複製，此種生長因子特定地與其 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 .續本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210\297公釐）一 4 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __________B7五、發明説明（2 ) 相對應之受體作用’此類受體包括具有酪胺酸激酶催化活性之細胞外部份、透膜部份及胞質部份，咸信細胞增殖之引發係當生長因子與其受體在細胞素面之細胞外部份結合所致’此種生長因子-受體之結合，引發受體之二聚合化而導致受體之自動磷酸化作用，並增加受體之催化活性及基質之磷酸化作用，最近頃經確認訊號從細胞表面到細胞核之一般通道，並證實可被酪胺酸激酶生長因子受體所使用，此通道與生長因子調和r a s蛋白之活性相關，可引發蛋白激酶級聯而導致轉錄因子之磷酸化作用，因而影響相關於細胞分裂基因之傳達。受體之自動磷酸化作用與細胞內基質之磷酸化作用係生物化學結果，並爲生長因子訊號傳送與細胞增殖所需，此可經由用側面導向突變基因消除多種受體包括E G F受體（EGFR) 、FGF 受體（FGFR)、及 PDGF 受體（PDGFR)之蛋白酪胺酸激酶活性，導玫完全喪失受體生物活性而證實，而且蛋白激酶抑制劑例如星狀孢子酶、K 2 5 2 a 、及太富士丁（tyrphostins)可抑制受體酪胺酸激酶催化活性而阻止細胞內訊號傳導及細胞增殖，這些研究證實生長因子受體之酪胺酸激酶化作用在訊號傳導之基本角色，並證實抑制酪胺酸活性之化合物可作爲調節細胞增殖之用途。許多疾病狀態之特徵爲細胞增殖之失控，這些疾病包含多種細胞型態並包括例如癌症、牛皮癬、肺纖維化症、絲球體性腎炎、動脈硬化及血管成形術後之再狹窄症，使 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 訂本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -5 - 474810 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（3 ) 用酪胺酸激酶抑制劑治療這類疾病頃經在許多活體內研究證實，對E G F R類具有選擇性之酪胺酸激酶抑制劑頃經證實可阻止動物體內腫瘤之形成，因此顯示其在治療人體癌症尤其是乳癌上，有直接抑制腫瘤細胞生長之潛在用途。同樣地，移轉性瘤及其相關之血管成形症頃經證實可由阻止內皮脈管生長因子受體酪胺酸激酶之活性而加以抑制，顯示酪胺酸激酶抑制劑具有阻止癌症過程中發生的不同結果之用途。在絲球體性腎炎之實驗模體中，隨著腎小球細胞之增殖，PDGFR也顯示增加20倍，將PDGF中和化，可阻止其酪胺酸激酶受體之活性，因此限制通常會產生之腎變性量，這些研究證實可阻止P D G F R之酪胺酸激酶抑制劑具有治療人體絲球體性腎炎之潛在用途。插入性心臟學中一個主要尙未解決之問題爲冠狀血管成形術後之再狹窄症，目前在美國每年實施將近 4 0 0，0 0 0次血管成形術，其中由於再狹窄症而在第一年內有3 0 - 4 0%失敗，再狹窄症之過程包含動脈硬化性動脈之再度閉合，其在許多情形下係由於平滑肌細胞受到例如PDGF及FGF生長因子之控制而增殖，再狹窄症之動物模體中，阻止PDGF及FGF受體酪胺酸激酶活性之抗體可防止平滑細胞增殖及形成新因地馬（ne-ointima)，這些研究證實可阻止PDGF及FGF受體功能之酪胺酸激酶抑制劑可用於治療人體之再狹窄症。目前癌症之化學療法係利用抑制劑如D N A合成酶（ (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) -£n m · 項再填‘ 裝. 訂 .4. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 474810 經濟、邺中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 如阿酶素、氟尿嘧啶）與可瓦解細胞受架之化合物（長春花鹼），這些化合物含有高度毒性，因爲其抑制活性並不僅限於癌細胞，但因爲腫瘤細胞之分裂較快速且其DN A 代謝更具活性，因此更容易受到上述抑制劑之攻撃而消滅 ’少數型態之癌症係用特定的荷爾蒙衍生物治療，但這些情形係屬例外，大部分不同型態癌症之化學療法爲非特定型。在1 9 8 0年代早期，了解2 0至3 0%癌症可顯示特徵性之生瘤產物，其係生長因子受體或其變種之同系物，並顯現蛋白酪胺酸激酶（ρ Τ K )活性，P T K活性爲受體或其生瘤同系物之本質，並經由其p TK部份而影響細胞增殖，而且每個此類受體（正常或變種）顯現一種獨特基質特性之特徵P TK活性，其中一體此類受體爲 EGFR及其生瘤同系物V — ERB — B。由於上述關於生長因子受體P TK活性之發展結果，頃經提出使用可抑制E G F之Ρ TK活性的不同化學物質以治療癌症，參見例如日本專利6 2 - 3 9 5 2 3、6 2 -39558、62-42923 及 62-42995，例如上述日本公開專利S Η ◦ 6 2 - 3 9 5 5 8揭示在組成物中用α —氰基一 2，5 —二羥基桂皮醯胺作爲活性化合物，可有效地作爲Ρ Τ Κ抑制劑。使用肉桂基丙二睛及不同的苯亞甲基丙二睛化合物作爲腫瘤生長抑制劑係揭示在Gal et al.，Studies on the Biological Action of Malononitriles. I. The Effect 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^^^1 vm ml —^ϋ Bli^l nn' 19 ^^1 f^il ttn^i -訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 __B7 五、發明説明（5 ) of Substituted Ma1ononitri1es on the Growth of Transplanted Tumors in Mice, Cancer Research, 12:565 -72,1952。

Yoshida，et al.，曰本專利申請案4 9 1 0 0 0 8 0揭示3 -胺基吡唑衍生物類，並宣稱具有消炎及止痛效應。發明概述據此，本發明之目的係提供新且有效的吡唑類調配物作爲激酶抑制劑。本發明之另一目的係提供舊組成物之額外用途，及提供可充作蛋白激酶抑制劑之新吡唑類。本發明係經由提供一種抑制蛋白激酶之方法而達成這些及其他目的，其中包括使含該激酶之組成物與下列式（ Ϊ)化合物接觸： Ν’

Ri 其中：

Ri爲低碳烷基、低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、聚芳基、聚芳羰基、聚雜芳基或聚雜芳羰基；本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------------ί ，1Τ -8 - 474810 Α7 Β7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（6 ) R2爲低碳烷基、低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、低碳烴醯基、5 -或 6 —員雜環芳羰基、聚芳基或聚雜芳基； R3爲Η或低碳烷基；R5爲Η、低碳烷基、低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、鹵素、或氰基；且 R6爲Η或低碳烴醯基。這些化合物之烷基、烴基、芳烷基、雜芳烷基、烴羰基、雜芳基、聚芳基及聚雜芳基可經由不同的取代基取代，如下文之詳細說明。本發明也關於充作控制在哺乳動物中與激酶相關之疾病的藥用組成物，其中在藥學上可接受之載劑內含有激酶抑制量之式（I )化合物；以及與激酶相關之疾病的控制方法，其中包括與激酶相關疾病之控制量的上述式（I ) 化合物用藥至患有與激酶相關之疾病的哺乳動物，此處「哺乳動物」相同於一般之定義並包括人類以及其他哺乳動物。製藥用途係預定包括醫家畜疾病之用途，尤其是用在養馴動物例如牛、綿羊、豬、山羊、狗、貓、兔子、田鼠、沙鼠、大鼠、及小鼠。附圖之簡要說明經由參考下列詳細說明以及作爲本發明一部份之附圖 ’可更加了解本發明，其中：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） —4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 、1Τ -Li 474810 A7 B7 五、發明説明（7) 圖1顯示化合物1在HR — 5ySR細胞內，對磷酸化作用之抑制效應。圖2顯示化合物1在3 2D - aR細胞內，對絲狀分裂活性之效應。特定具體眚施例之說明本發明係關於經取代之吡唑類之新用途，其中部份爲先前已知之化合物，且部份爲新的化合物，這些吡唑類較宜爲3，5 -二取代化之吡唑類或3，4，5 —三取代化之吡唑類，適於在本發明方法中使用之較佳化合物中，在吡唑環之3位置含有一個苯基羰醯胺取代基，且在5位置含有一個苯取代基，許多這類化合物爲已知，但先前並不知道具有可作爲激酶抑制劑之活性。一般而言，可用於本發明方法之化合物具有式（I ) 之結構： r2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------^

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

N

其中： Ri爲低碳烷基、低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10 - 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 474810 A7 ___W__ 五、發明説明（8 ) 低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、聚芳基、聚芳羰基、聚雜芳基或聚雜芳羰基； R2爲低碳烷基 '低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、低碳烴醯基、5 -或 6 -員雜環芳羰基、聚芳基或聚雜芳基，· R3爲Η或低碳烷基；115爲11、低碳烷基、低碳烴基、芳基低碳烷基、雜芳基低碳烷基、5 -或6 -員雜環芳基、鹵素、或氰基；且 116爲9：或低碳烴醯基。包含在這些定義中之烷基、烴基、芳烷基、雜芳烷基、烴羰基、雜環芳基' 聚芳基及聚雜芳基可互爲獨立地經多至4個R4基（不超過3個較佳，不超過2個更佳，對於式中3個R基之任一個）取代（即氫原子或氫原子經取代），其中各基係獨立地代表_素、氰基、硝基、低碳烷基（其僅提供另一烴基）、羥基、烷氧基、羰基、羧基、胺基、烷胺基、二烷胺基、或烴醯胺基。目前頃發現這類化合物及含彼之藥用組成物可用於結合激酶部份並抑制激酶活性，這些用途將在下文中更詳細說明。名詞定義在前述以及整份揭示中所用之下列名詞，除非特別另外說明，必須了解係指下列意義：「烷基」係指飽和的脂族烴，其可爲含有約1至約6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' 一 -11 - ._裝丨丨 (請先閣讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 4 474810 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（9 ) 個碳原子之直鏈或分枝鏈。「低碳烷基」係指含有1至約4個碳原子之上述烷基，其可爲直鏈或分枝鏈，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基或第三丁基，鹵化之烷基，尤其是氟化之烷基，例如CF3、CH2CF3、及 c F2C F3也包含在烷基之定義中。「芳基低碳烷基」與「雜芳基低碳烷基」係指一個如同先前所述之「低碳烷基」分別與芳基或雜芳基連接，「芳基」係指未經取代或經取代之芳族環，可經一、二、三或四個R 4基取代，較佳的芳基包括苯基、鹵苯基、低碳烷苯基、菓基、聯苯基、菲基、菓甲基、及芳族雜環基，此處所用之「雜芳基」係指含1至4個選自包括氮、氧及硫雜原子之任何芳基。「烷氧基」係指烷基-氧基，其中「烷基」係相同於先前之敘述，以低碳烷氧基較佳，其實例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基及正丁氧基。「烴基」係指經由移除其中一個氫原子而衍生自烴分子之有機基，苯基，碳環芳基爲較佳的芳族烴基，「低碳烴基」係指6或更少之脂族碳原子或一個苯環。「烴羰基」係指經由移除其酸式羥基而衍生自有機酸如羧酸或磺酸之有機基，較佳的烴羰基爲低碳烷基羧酸基例如乙醯基及丙醯基，苯醯基也較佳，「低碳烴羰基」係指6或更少之脂族碳原子或一個苯環，但不計算將基團與分子其他部份連接之羰基的碳，在本發明之部份調配物中裝—I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 JM, V ALT— n·— nv^— · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（2!〇'〆297公釐） 12 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ Β7五、發明説明（ίο) 「φ」符號係用於代表苯基，由磺酸所形成之化合物較不宜，但也包括在烴羰基之定義內，在此情形下，基團之全部組份除了磺基外爲碳或氫，除非化合物爲經取代之烴羰基，如同他處之定義，其實例包括苯磺基。「經取代」烴基或烴羰基係指烴基或烴羰基中一或多個氫原子被取代基取代，使所得化合物在濃度爲〇. 01 Μ水中（必要時可含多至1 0%乙醇以增加溶解度）可安定歷時1小時（通常在3 7 °C，ρ Η 7 . 4下測量），較佳的取代基爲鹵素、低碳烷基（其僅提供另一烴基）、羥基、院氧基、裁基、胺基、院胺基、二院胺基、或烴醯胺基，額外的取代基包括硝基在芳族烴基或烴羰基較佳於在脂族。「鹵素」係指鹵素原子，較佳的鹵素原子包括氯、溴及氟。「雜環系芳族環」係指5 -或6 -員環其中含碳原子及一或多個N、0或S原子及6 —電子非定域化共轭π鍵系統，此種雜環系芳族環可取代任何一個本案敘述結構中之苯環’較佳的雜環系芳族環爲呋喃、卩塞吩、卩比咯、D比唑、三唑、咪唑、噚唑、異_哩、_唑、異_唑、吡啶、嘧啶、噠嗪、吡嗪、及三嗪；特別適宜爲呋喃、卩塞吩、吡咯、瞎唑、及吡啶，「雜環芳羰基」係指雜環芳族環與羰基連接’其連接較宜經由芳族環之碳，例如2 -呋喃羰基及 2 —噻吩羰基。「聚芳基」與「聚雜芳基」係指多環系統，以含兩個本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —^n —iim 裝· -9 • LI I _r · —13 - 474810 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（11 ) 環之系統較佳，此名詞係包括稠合環例如某基與睦啉基以及非稠合環基例如聯苯基。「聚芳羰基」與「聚雜芳羰基」係指「聚芳基」與「聚雜芳基」連接至羰基。式（I )較佳化合物夕結構一個較佳的式（I )化合物含有下列取代基：R 1爲低碳烷基、低碳烴基 '或5 -或6 -員雜環芳基；尺2爲低碳院基、低碳煙基、5 -或6 -員雜環方基、低煙擬基、或5 —或6 -員雜環芳羰基；R 3爲Η或低碳烷基； R5爲Η、低碳烷基、鹵素、或氰基；且尺6爲Η或低碳烴羰基。另一個較佳的式（I )化合物含有下列取代基：Ri 爲低碳烴基或5 -或6 -員雜環芳基；R2爲低碳烴羰基或5 -或6 —員雜環芳羰基；R3爲Η或低碳烷基；尺5爲 Η ;且R 6爲Η或低碳烴羰基。較佳的化合物包括其爲低碳烴基或5 -或6 -員雜環芳基，並視需要經多至4個R4基取代，更佳的化合物包括其中R i爲羧酸芳基例如苯基或輕取代之苯基或爲5 -員雜環芳基例如噻嗯基，最佳的R α基爲苯基或經取代之苯基。較佳的化合物包括其中R2爲低碳烴羰基或5 —或 6 -員雜環芳羰基，並視需要經多至4個R4基取代，更佳的化合物包括其中R 2爲低碳烴羰基例如碳環芳羰基，較宜爲苯醯基或經取代之苯醯基，較佳的取代基包括硝基 (請先閱讀背面之注意事 i - I 1Γ - - · .4 項再填· 裝-- :寫本頁) -s 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -14 - 474810 Α7 Β7 五、發明説明（12 ) 與胺基，同樣也較佳的化合物爲其中R 2爲6〜員雜環芳羰基例如菸鹼醯基或異菸鹼醯基，最佳的化合物其中R2 爲苯醯基或經取代之苯醯基，特別適宜的R2取代基爲含苯醯基或經一個電子供體或電中性取代基（相對於苯基之 Η)尤其是烷基或烷氧基取代之苯醯基。較佳的化合物包括其中113爲11。較佳的化合物包括其中115爲Η、低碳烷基、齒素、或氰基’並根據上述之取代限制，更佳的化合物包括其中 R 5爲 Η。較佳的化合物包括其中116爲只。式（I )化合物之結構實例陳述於下表中，化合物1 爲一個較佳的化合物其中Ri爲苯基、112爲苯醯基、且 R3'尺5及Re爲Η，用於實驗部份並詳細敘述於本專利說明案之實例部份。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -15 - 474810 A7 B7 五、發明説明（i3) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

表1A , Cmp d R, R. Re 1 Φ 冶CO Η H H 2 Φ 4-C1 公 CO Η H H 3 Φ 2-F<i>CO Η H H 4 φ 2-CWCO Η H H 5 iPr 4>CO Η II H 6 αΡη 4-C10 Η H H 7 Φ uPr Η Me H 8 HCO(CH2)4 4-NH:<^CO Η Me H 9 φ Φ Η Me H 10 φ 2-硫苯基CO Η Me H 11 環己基1 · 4-Me^CO Η Cl H 12 2,4-diMe^. HCO Η Cl H 13 Φ <t>co Me F H 14 4-CF3<p 2,4-diMe^CO Me F H 15 3,5-<ϋΝ〇2ψ nBuCO Et F H 16 2-呋喃基 4>S〇2 Me CN H 17 i£u ΦΟΟ iPr CN H IS Φ 0CO Y-羥丁基 CN H 19 2 - ( 5 -甲呋晡基） 0CO Me H H 20 Φ Φ^〇2 H H H 21 ηΡη 2,4-diF^.SO, H Me H 22 2Α,β-ΐήαφ <i>co H CN H 23 Φ 4-(^>CONH)<^CO H H H 24 HOCO(CH2)j i-[5-(二甲胺| ί基）戊塞] H H H 5 4-甲環己基 4- (2-甲吡皖基 )CC Me Cl H 26 2,4-diMe<^ 環戊基C0 > El F H 27 φ 4-OBu 必 CO Et Et H (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .4 裝· 訂 .4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - 474810 Α7 Β7 五、發明説明（Η ) 下列縮寫係用於表1A中：Me_甲基；E t —乙基 ;nPr —正丙基；iPr -異丙基；nBu_正丁基； tBu —第三丁基；nPn—新戊基（2 ，2_二甲丙基 )；iBu —異丁基；MeCO—乙醯基（其他醯基衍生物以相同方式稱呼）；Φ_苯基。下表列出使用類似於實例3敘述之方法所合成之本發明化合物，這些化合物中之Ri_ Re取代基係用於說明適於在本發明中使用之取代基而非將其限定在此範圍內。根據類似於實例1陳述之方法評估彼等之活性，這些化合物全部都可抑制aPDGFR與ySPDGFR之蛋白激酶活性，以芳族及雜芳族醯胺基吡唑類，不論是經取代或未經取代，其中R3，R5及Re爲Η，可顯示最佳的活性：化合物37 — 42、45及46。 --------.4^! (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、tT .嫌經濟部中央標準局員工消費合作杜印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -17 - 474810 A7 B7 五、發明説明（l5) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表1B Cmpd R, & r3 Rs 28 Φ MeCO Η Η MeCO 29 Φ MeCO Η Η Η 30 4-tBu0 4-Cl^C0 Η Η Η 31 Φ <1>C0 Η Η <j>CO 32 Φ i-PrCO Η Η i-PrCO 33 Φ QHuCO Η Η QHnCO 34 Φ t-PtCO Η Η Η 35 Φ 4-Me«i)CO Η Η 4-Me^CO 36 Φ 4-NO^CO Η Η 4-N〇2(^CO 37 Φ 4-MeO</>CO Η Η Η 38 Φ 4-Me<pC.〇 Η Η Η 39 φ 4-NO^CO Η Η Η 40 φ 菸碱醯基 Η Η Η 41 Φ 4-NH,>CO Η Η Η 42 Φ 異菸碱醢基 Η Η Η 43 2 -皤嗯基1 (J>C〇 Η Η φΟΟ 44 4-αφ ΦΟΟ Η Η <j>CO 45 4-εΐΦ ΦΟΟ Η Η Η 46 2-¾ ® ^ ΦΟΟ Η Η Η 47 Φ 0CH2 Η Η Η (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) nn m. ml —..

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 18 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（！6) 下列縮寫係用於表1B中：Me —甲基；iPr —異丙基 ;Me CO -乙醯基（其他醯基衍生物以相同方式稱呼） ;tBu —第三丁基及Φ—苯基。製備及牛.產化合物多種可在本發明中使用之胺基吡唑類化合物已廣爲熟悉，其中多種化合物之合成已經在科學文獻中敘述超過 3 0年，在文獻中關於命名有些許程度之混淆，但不會對熟悉此藝者造成問題，其起因係由於吡唑環之對稱本質，因爲同時兩個氮原子都可作爲計數環原子之起點，在上式以及整份申請案中，係以胺取代基所在之碳原子定爲吡唑環之"3"位置而一致性地命名化合物，但是也可從相反方向計數環原子，使得胺取代基出現在碳5而另一取代基出現在碳3 ，因此有些科學文獻稱其爲3 -胺基吡哩類而也些則稱爲5 -胺基吡唑類，雖然都是指同樣的化合物或化合物類，但在單一公告中所用之命名係一致，因此只要知道此命名之問題就不會在文獻中造成混淆。在本發明方法中使用之3 -胺基吡唑類可經由已知技術加以製備及改良，許多這類化合物之其他用途已經廣爲熟悉，3 -胺基吡唑本身可得自商業化供應，例如從 A-ldrich Chemical Company,Inc..Milwaukee, Wisconsin, Missouri, USA(目錄編號1 6，0 6 4 - 4 )，吡唑類可經由重氮甲烷與丙炔之反應而輕易地合成，吡唑類之此種合成途徑已經有幾乎1 0 0年歷史並已非常完備，參見例本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --------- 訂 -19 - 474810 A7 B7 經濟部中央標率局員工消費合作社印製五、發明説明（π) 如 von Pechmann， Ber，Deut_Chem.Ges·,31:2950(1898)，及 Hueckel et al.，Z.Phys.Chem.，A,186:159(1940)，經由選擇具有所需取代型態之起始炔類及重氮化合物，可以輕易地製備成不同取代型態之所需吡唑。存在其他合途徑供製備3 —胺基吡唑類，例如經取代之3 —胺基吡唑類的一般合成方法揭示在美國專利4，6 22，3 3 0 ’其中係使式Ri— NHNH2之烷基胼與式 A 1 kOCR4=C (CN) 2之化合物進行縮合反應而得到產生1 — Ri — 3 — R4— 4 - CN - 5 -胺基吡唑，此反應可輕易地修改以製備本發明之化合物，經由用肼取代烷基阱且（必要時）從產物吡唑移除氰基而轉化成烷基，或者是選用只有一個氰基之起始物質，例如化合物3 —苯甲醯胺基一 5 _苯吡唑之合成，其係表1 A之化合物1 ，可參見 Huenig，Chem.Ber.，95 :937-943(1962)及 Checchi et al.，Gazz.Chim· Ital·，85:1558-1568(1955)，兩者都併於本文供參考。特別有興趣之數種化合物可商業化地得自May bridge Chemical Co.Ltd. ,Trevi11e11, Tintagel, Cornwall PL -340HW，United Kingdom,尤其是 3 —〔 2 / —氟苯醯胺基〕_5 —苯吡唑、3_〔2 〃一氯苯醯胺基〕一 5 —苯吡唑、3_苯醯胺基一 5 -苯吡唑、及3 -〔4 /一氯苯醯胺基〕一 5 —苯吡唑，此處必須注意的是上述名稱並不嚴格根據I U P A C命名原則，但係使吡唑類化合物之命名在本申請案中能保持一致性，3 _苯醯胺基-5 -苯吡唑 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) I m· nn ml n^i' .^1^1 I. 1— 訂 .4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -20 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（is) (化合物1)之另一替代名稱爲N -（5 _苯基一 1 (2 )11—吡唑-3-基）一苯醯胺，後者係66 11316丨11“6-ilstein Reg.No.22573;CAS Reg.No.9 7620- 1 7-2 )所用之名稱。在3 -胺基或在吡唑環上之不同取代基可存在於起始物質，或者是在縮合產物形成後，經由此項技藝中已知方法用取代或將一個基轉化成另一個基之方式將其加入，若取代基本身具反應性，則可根據此項技藝中已知技術將其保護，可以使用此項技藝中已知的多種保護基，多種這些可用之基團可見於 'Protective Groups in Organic Synthesis^ T.W.Green,John Wiley and Sons, 1981 ，一級醇類可用此項技藝已知的氧化劑氧化成羧酸或醛類，且二級醇類可氧化成酮類，因此可用取代或轉化反應而提供起始物質、中間體或最終產物之分子有不同的取代基，其中尤其重要的可用合成途徑係將現存之碳醯胺基水解並經由簡單的醯胺化反應而用其他基取代。其他實例之科學公告其串提供詳細合成技術供製備本發明化合物、以及先前已知用途之討論，包括下列，全部都併於本文供參考：5&1^61；31.,：[.(：1^111.3〇£：.?64丨111'-rans. I, 1990,pp. 809-810 ' Hamraouda et a 1. , J. Hetero-cycl. Chem., 21:945-947(1984)、及 Sawali e t a 1. , J. Heterocycl_Chem_，17:877-880(1980)。作爲激酶抑制劑之用途本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） ^n- tn m HI ml ml fm tn n^i ^^^1 «^^^1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 — 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（ig) 本發明之化合物都可作爲充作治療用途之激酶抑制劑 ’使在哺乳動物中控制與激酶相關之疾病，尤其是與酪胺酸激酶相關之疾病，其中特別合適的化合物其I C 5。值範圍爲1 Ο nM - 1 VM，吡唑酸式衍生物對三種型態蛋白激酶之其中一種的特定抑制能力，係用於決定需使用何種特定化合物之其中一個因素，與酪胺酸激酶相關之疾病包括高增殖性疾病，係因爲酪胺酸激酶酵素活性錯亂而引發 /保持，其實例包括癌症、動脈硬化、及抗血管形成症（如腫瘤生長糖尿病視網膜病），雖然其他種類的激酶與特定疾病之關係仍缺乏資料，此項技藝中已知可用於治療之 P T K抑制化合物較宜有選擇性，其他種類之激酶也是如此，P TK抑制劑如櫟精、金雀異黃素及星狀孢子酶除了可抑制酪胺酸激酶外，還可抑制多種其他蛋白激酶，但由於缺乏特異性而具有高細胞毒性，因此測定細胞毒性之一般分析可用於確認P τ K抑制劑（或其他種類激酶之抑制劑）是否由於缺乏選擇性而產生不要之副作用。三種一般種類之蛋白激酶頃經由以作爲其基質之胺基酸爲基準而加以確認：磷酸化酪胺酸之激酶、磷酸化酪胺酸與蘇胺酸之激酶、及磷酸化絲胺酸與蘇胺酸之激酶，在選擇性之更精細測試中，必須測試化合物對這些蛋白激酶酵素活性範圍之抑制能力，酪胺酸特定蛋白激酶係揭示於本發明之背景部份。可磷酸化絲胺酸與蘇胺酸之激酶（最普遍之種類）實例包括RAF、蛋白激酶A，蛋白激酶C ，及轉變生長因子；S受體，ME K激酶爲磷酸化酪胺酸與本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉Μ規格（210><297公釐〉 ---------------.4^—. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -22 - 474810 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製五、發明説明（2〇) 蘇胺酸之激酶實例。在下列激酶抑制劑用途之討論中，係集中在酪胺酸激酶之討論，因爲其爲最容易用藥物控制之激酶，但是必須了解在此用化合物作爲酪胺酸激酶抑制劑之任何討論’同樣適用於使用一化合物其係特定於其中一種其他激酶種類，只要其特異性之作用爲已知。吡唑化合物是否特定適用於某種激酶，可以很容易地用實例中所陳述的激酶活性分析（或其他相同方法其係以不同激酶取代實例中所討論之激酶）而測定，爲了避免過度重複，係以下列討論酪胺酸激酶之實例作爲其他種類激酶效應之討論，因此對於特定用途或在特定狀況下之「酪胺酸激酶，除非在文中特別說明或澄清，必須視爲一種化合物用於任何激酶種類之實例。化合物要能抑制Ρ τ K或其中一種激酶而具有治療用途，必須可在完整的細胞中有活性，已知ρ τ κ抑制劑如果以其抑制分離的酶製劑之能力作爲辨識基準，通常微弱或無法有效地抑制天然的Ρ Τ K s ’其缺少活性係由於 P τ K抑制劑無法穿過細胞膜而到達其作用位置或因爲細胞內三磷酸腺苷（A Τ P )濃度高及其他相關因素而使得其無法抑制Ρ TK s ，有多種方法可容易地測定Ρ TK抑制劑對完整細胞生長因子受體酪胺酸激酶之活性，生長因子處理之細胞導致相關受體之快速自動磷酸化作用以及受體基質之磷酸化作用’這些現象並可用抗磷酸化酪胺酸酶抗體測定，而且，額外的細胞內顯示現象之測定包括鈴流 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 蚌 •項再填_ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 474810 A7 B7_ 五、發明説明（2l) 出、磷酸肌醇酯代謝、及細胞DNA合成》最後’具有治療用途之P T K抑制劑必須能阻止生長因子活性所引起不要的細胞增殖並且可容易地監視。理論上，本發明化合物在水中以及在溫和的疏水性溶劑中之溶解度，可促進其穿透細胞膜之可能性，但多種不溶性化合物在活體內之試驗中頃顯示明顯的激酶抑制性。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 合適使用之本發明化合物可爲自由酸或鹼（如果存在羧基、酚系羥基、或胺基）、鹽類或水合物之形式，全部形式都包含在本發明之範圍內，可以形成更容易使用之鹼式鹽類形式，實際上，使用鹽類形式時都有使用先天量之酸式形式，可用於製備鹽類之酸或鹼較宜包括當其與自由酸或鹼結合時，能產生藥學上可接受性鹽類者，即在藥學劑量下，鹽類之陽離子或陰離子對動物器官沒有毒性，所以自由酸或鹼之天生的有利性質，不會由於起因於陽離子之副作用而損害。雖然以酸或鹼化合物之藥學上可接受性鹽類較佳，全部的鹽類都可作爲自由酸形式之來源，即使特定鹽類本身只是需要作爲中間產物，例如當鹽類之形成只是供純化及辨識之目的，或當其係作爲用離子交換法製備藥學上可接受性鹽類之中間物使用。含有活性可作爲特定抑制劑如蛋白酪胺酸激酶抑制劑之本發明範圍內的化合物，具有治療價值如作爲細胞抗增 '殖劑可供治療部份病症包括例如牛皮癖及再狹窄症，預期本發明將特別適於治療動脈硬化症，關於治療某些病症例如動脈硬化症，某些人可區分爲高風險群，例如由於遺傳本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) -24 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（22) 、環境或歷史因素，本發明範圍內的化合物可用於預防或延遲發生或再發生此種病症或治療此種病症。本發明範圍之化合物可用不同形式用藥至哺乳動物宿主，即取決於選擇之用藥途徑如口服或非經腸道，以片劑 '膠囊劑、錠劑、糖錠劑、硬糖果劑、粉劑、噴霧劑、酏劑、糖槳、注射或點眼溶液等形式與各種藥學上可接受之惰性載劑結合，在非經腸道用藥方面包括用下列途徑用藥 •’靜脈內、肌肉內、皮下、眼內、滑膜內、透過上皮（包括透過皮膚、眼睛、舌下及頰）、局部（包括眼睛、皮膚、眼部、直腸、經由吸入劑及氣溶膠之鼻子吸入）、及直腸系統。據此，本發明之另一方面爲一種可在哺乳動物身上控制與激酶相關疾病之藥用組成物，其係在藥學上可接受之載劑中含有激酶抑制量之式（I )化合物，如上所述，可以藉由抑制激酶之活性而控制與激酶相關之疾病，雖然可在本發明中使用之胺吡唑類的多種化合物已爲熟知，但沒有一個已知具有抑制激酶之活性且很少知其具有治療用途，含式（I )化合物之較佳藥用組成物，其條件係Ri. 苯基或經低碳烷基、低碳烷氧基或鹵素取代之苯基；及R 6爲Η ;且R 5爲低碳烷基、芳基或經低碳烷基、低破烷氧基或鹵素取代之芳基’ R2不能爲低碳烷基。該活性化合物可經由口服方式用藥’例如與惰性稀釋劑或與可食用之載劑，或包含在硬或軟殼膠囊中，或壓成片劑，或直接與飲食食物混合。對於口服治療用藥’該活本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -9 -25 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（23) 性化合物可與賦形劑混合並以咽片劑、頰片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙劑等形式使用，此種組成物及製劑需含至少〇. 1 %活性化合物，組成物及製劑之百分比當然可加以變化，且可方便地爲約2至約6單位重量％，活性化合物在此有有治療用途組成物中之含量係使可得到合適的劑量，製備根據本發明之較佳組成物或製劑，係使每單位劑量口服劑含約1至1 〇〇〇毫克活性化合物。該片劑、錠劑、丸劑、膠囊等也可含有下列物質：黏合劑例如聚乙烯吡唑啶酮、西黃耆膠、阿拉伯膠、蔗糖、玉米澱粉或明膠；賦形劑例如磷酸鈣、檸檬酸鈉及碳酸鈣 ;崩解劑例如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、木薯澱粉、部份絡合矽酸鹽類、藻酸等；潤滑劑例如硫酸月桂酯鈉、滑石及硬脂酸鎂；甜化劑例如蔗糖、乳糖或糖精；或矯味劑例如薄荷、白珠樹油或櫻桃香料。類似形式之固態組成物也可作爲軟或硬質膠囊之填充劑使用；這方面之較佳物質也包括乳糖以及高分子量聚乙二醇類。當單位劑量爲膠囊形式時，除了上述型態之物質外，還可含液體載劑，多種其他物質也可存在爲包衣或改變單位劑量之外觀形式，例如片劑、丸劑或膠囊可塗上蟲膠、糖或兩者，糖漿或酏劑可含活性化合物、作爲甜化劑之蔗糖、作爲防腐劑之對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、染料、香料例如櫻桃或柳橙香料、乳化劑及/或懸浮劑、以及稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇、甘油及其各種組合物。當然，用於製備任何形本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐）

In— ι· ml ml —^r— >ll^i ^^^^1 ml· ^^^^1 ^^^^1 ^^—^1 ^^^^1 1 1 ^H9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 26 - 474810 A7 B7 五、發明説明（24) 式單位劑量之任何物質必須是製藥上純的且本質上所用的量不具毒性，此外，活性化合物中可混入緩釋製劑及調配物。該活性化合物也可不經腸道或腹膜內用藥，對於不經腸道用藥之目的，可使用在芝麻油或花生油或丙二醇水溶液中之溶液，以及先前列舉相對應水溶液鹼金屬或鹼土金屬鹽類之水溶液酏劑，必要時，此種水溶液必須經適當地緩衝化，並先用足夠的鹽水或芍葡萄糖將液體稀釋劑溶解等滲化。自由鹼或藥學上可接受性鹽類之活性化合物溶液可在水中製備，並適宜與例如羥丙基纖維素之表面活性劑混合，也可在甘油、液態聚乙二醇類及其混合物及油中製備成分散劑，在一般貯存及使用情形下，這些製劑含防腐劑以避免微生物之成長，這些特別的水溶液尤其適於供靜脈內、肌肉內、皮下及腹膜內注射使用，在這方面，熟悉此項技藝者對所使用的酏劑水溶液介質可經由熟知的標準技術輕易地獲得。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 適於供注射使用之藥劑形式包括無菌水溶液或分散液及供臨場製備無菌注射水溶液或分散液之無菌粉劑，在全部情形下必須爲無菌且必須有足夠流動性以便容易注射，在製造及貯存情形下必須安定，而且必須可防止微生物例如細菌及霉菌之污染，其載劑可爲溶劑或分散液介質含例如水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等）、其合適的混合物及植物油類。維持適當的流動性可經由例如使用卵磷脂之塗料、在分散液之情形下保持所需本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27 - 474810 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（25) 的粒子大小、及經由使用表面活性劑。防止微生物之作用可經由不同的抗菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、酚、山梨酸、乙基汞硫水楊酸鈉等。在許多情形下，較宜含有等滲劑例如糖類或氯化鈉，延長注射組成物之吸收可經由使用可延長吸收之藥劑例如單硬脂酸鋁及明膠。製備無菌注射溶液係在適當溶劑中將所需量之活性化合物與不同的其他上述所需成份混合，然後再無菌過濾，通常製備分散液係將無菌的活性成份混入含主要分散介質及其他上述所需成份之無菌媒劑，在製備無菌注射溶液之無菌粉劑情形下，較佳的方法係用真空乾燥及冷凍乾燥技術，產生含活性成份及來自先前其無菌過濾溶液之任何額外所需成份的粉劑。對於局部用藥之目的，係在容器中製備成稀釋無菌水溶液（通常濃度爲約0. 1%至5%)或者是類似於上述注射溶液，以便適於供眼眼之逐滴用藥。本發明之藥用化合物可單獨或與製藥上可接受之載劑結合而用藥至哺乳動物，如上所述，活性成份及載劑之相對比例係由化合物之溶解度及化學性質、選擇的用藥途徑、及標準的製藥實務而決定。本藥用藥劑之最佳預防及治療劑量，隨著用藥方式，選擇的特定化合物及接受治療之病人生理特性而變化，通常開始時用少量劑量，且必要時微量增加至達到最佳效應之情形爲止。以使用大鼠之生理研究爲基準，人體之治療 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

--- —I - - - - - - I 裝- 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -28 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（26) 劑量一般爲每天約0. 01毫克至約100毫克/公斤體重，或約0 · 4毫克至約1 0克及更高，且每天可一次至多次以數種不同的劑量單位用藥，口服用藥需要較高的劑量。本化合物可口服或不經腸道、或眼滴液之局部方式用藥，單次或分開劑量之劑量範圍爲每天約0.1至10毫克/公斤體重，當然在特殊情形下，根據看護醫生的判斷，可以使用此範圍外之劑量。在含式（I )化合物之藥用組成物或其製藥學上可接受的鹽類中，載劑對活性成份之重量比例範圍通常爲1: 4至4 : 1 ，以1 : 2至2 : 1較佳，但是在任何情形下，所選用之比例係決定於活性成份之溶解度、預期劑量及用藥之確實途徑等因素。本發明之化合物也可用於測定體液如血液或部份血液中酪胺酸激酶或酪胺酸激酶基質之存在，組成物之酪胺酸激酶活性係將沒有本發明下之測定值與在此化合物存在下之測定值比較’然後這些測定之激酶活性差異係相關於組成物中酪胺酸激酶或酪胺酸激酶基質之濃度。以上頃一般性地敘述本發明，參照下列詳細敘述之實例將可更加了解，除非特別註明，這些實例係只供說明之用途’而非視爲本發明之限制範圍。實例1 吡化合物對蛋白激醅活性之抑制性本紙張尺度適财關家鮮（（：叫44祕（21(^297公釐） ·~ -29 - ^^1- I i 1^1 nn m· i ^ϋ« \Jnn I nn 1^1 an— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 474810 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（27) 在此及以下實例中所使用的吡唑化合物係得自Mayb-ridge Chemical Co.Ltd.,Trevillett,Tintagel, Cornw-all PL340HW,United Kingdom。受生長因子例如PDGF、FGF及EGF刺激之細胞增殖係決定於其各自受體之酪胺酸激酶引發之自動磷酸化作用，因此，P T K抑制劑對於受這些生長因子所引發的細胞增殖之阻止能力，係直接相關於其阻止受體自動磷酸化作用之能力，爲了測定α P D G F R之自動磷酸化作用，係使用設計可過度分泌人體aPDGFR之前述老鼠的造血細胞線3 2D - aR，如前所述這些細胞係在懸浮液中生長至106細胞/毫升於RPMI (GibcoBRL)介質其中含1 〇%牛胎兒血清及5%WEH I經調適之介質 (可得自ATCC用WEHI調適之組織培養介質），用低速離心法使細胞成爲小球狀並再度將其懸浮於無血清之 RPMI ，然後在500，000細胞/槽下將其分配至 9 6槽圓錐底微滴定盤（Falcon)，添加PDGFAA ( 1 5毫微克/毫升）之前1 5分鐘，在室溫下將化合物（ .01 — 30)微莫耳濃度）加至槽中，在最終培育體積爲1 0 0微升下，在冰上繼續培育歷時9 0分鐘，在4°C 及2 0 0 0 r pm下歷時1 0分鐘使細胞成爲小球狀，將新配製的溶胞緩衝液（PH7. 3之20毫莫耳濃度

Tr i s ，1 50 毫莫耳濃度 NaC 1 、l%Triton X- 100、1毫莫耳濃度苯甲基—磺醯氟（PMSF) 、1毫莫耳濃度原釩酸鈉、1〇毫克/毫升抑狀酶及1〇毫克/ 本紙張尺度適用侧家標準規格⑺公羡）_ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n —^n ml nn I— ^—1' ml ^^^1 ^nn 士 -s 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 B7 五、發明説明（28) 毫升亮肽素）直接加至各槽中’在冰上繼續培育歷時1 〇分鐘，經由在震動盤上之激烈震動而促進細胞溶解’分析前用2，0 0 0 r pm離心歷時1 0分鐘使細胞溶胞產物澄清。對於分析3PDGFR自動磷酸化作用，係使用設計可穩定過度分泌人體iSPDGFR之前述中國田鼠卵巢（ CHO)細胞線HR5 —泠R，這些細胞以10，000 細胞/槽植在微滴定盤（Falcon 9 6槽盤）並在3 7 °C下於含1 0%牛胎兒血清之RPM I中培育歷時3天在此時達到融合，將介質從槽中移除並取代以1 0 0微升無血清之RM I並在3 7 °C下繼續培育歷時1 8小時，添加 PDGF BB (100毫微克/毫升）之前15分鐘，將化合物（.01_30微莫耳濃度）加至槽中，並在 3 7 °C下繼續培育歷時1 0分鐘，將介質吸乾並將新配製的5 0微升溶胞縵衝液加至各槽，劇烈攪拌並以製備細胞溶胞產物，分析前用2，600rpm離心歷時1〇分鐘使細胞溶胞液澄清。在另一微滴定盤中，將可直接對抗細胞外部份 aPDGFR (Mab aRl〇)或）SPDGFR( M a b 1 B 5 B 1 1 )之單細胞系抗體（COR Therapeutics， Inc. 製備）固定，其係在 4 °C 下於 pH 8. 0 之 23毫莫耳濃度Tr i s、68毫莫耳濃度NaCl 、 14毫莫耳濃度碳酸氫銨及.0 1 %疊氮化鈉中在每槽中培育0. 5微克之抗體歷時18小時，移除未附著之抗體本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） " ------------裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 ____B7___ 五、發明説明（29 ) ，正要添加頃經在接合緩衝液（用0 . 3 %明膠凍結緩衝液）中稀釋成1 : 2之細胞溶胞液前，先將槽浸在pH 7. 6之25毫莫耳濃度N — (2 —羥乙基）哌嗪一（2 —乙磺酸）（HEPES) 、100毫莫耳濃度 NaCl 、及0. 2%Tween20中，在室溫下分別用固定之Mab aRl〇或Mab 1B5B11培育 3 2D — aR或HR5 — i8B細胞溶胞液歷時2小時，並用2 0 0微升清洗緩衝液（磷酸鹽緩衝化鹽水"P B S" ，.01%Tween20)將槽清洗3次，爲了測定 PDGFR磷酸化作用之程度，添加1. 25微克/毫升之兔子抗磷酸化酪胺酸酶抗體（Upstate Biotechnology, Inc., "ΙΙΒΓ )並在3 7°C下培育歷時1小時，移除未附著之抗磷酸化酪胺酸酶抗體後，在添加過氧化物酶基質（ ABTSTM)前，先用1 : 1 000稀釋量之山羊辣根共轭抗兔子I g G ( Boehringer Mannheim)培育盤子，用微滴定盤讀數器（Molecular Devices)以6 5 0毫微米監視產物之形成。用人體乳房腫瘤細胞線當作E G F R，測定 MDA MB468 細胞（ACCT#HTB132)之 E G F R自動磷酸化作用，這些細胞在6 —槽盤中生長至融合並在無血清之 Dulbecco’s Modified Eagle Medium( DMEM )中培育歷時1 8小時，在3 7 °C下將細胞暴露於不同濃度（.0 1 - 3.微莫耳濃度）之化合物歷時15分鐘然後在EGF (100毫微克/毫升）中歷時1〇分鐘本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~~ 4^------、1T----14. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 474810 A7 B7 _ 五、發明説明（3〇) ，用習知的SDS P A G E法進行分配然後用 Western 污點分析前，刮下細胞並在相同於3 2 D — a R細胞所述之緩衝溶液中配製溶胞液，針對此點，將蛋白質轉移至硝基纖維素並將細胞膜阻止在ΡΗ7. 0之Tris緩衝鹽水（TBS) 、0.1%丁贾66112〇、5%奶粉中，在室溫下於接合緩衝液（TBS、〇. 1 % T w e e η 20、1%奶粉）中將細胞膜吸取抗磷酸化酪胺酸酶抗體歷時2小時，用山羊抗兔子辣根過氧化物酶共轭IgG( Boehringer Mannheim)進_行偵測，用化學發光系統（ Amersham)顯像斑點。爲了測定FGFR — 1之自動磷酸化作用，用標準技術將FGFR-1 CDNA穩定過度分泌於CHO細胞，用10%牛胎兒血清使這些細胞在RPMI中生長至融合，先用無血清之RPM I取代介質並連續培育歷時1 8 小時，然後在37 °C及無或有濃度範圍爲〇. 1 — 30微莫耳濃度之PKT抑制劑存在下，用$FGF(75毫微克/毫升）刺激歷時1 〇分鐘，在上述EGFR部份之相同情形下製備細胞溶胞液’用直接對抗FGFR - 1細胞外部份之單細胞係抗體（在C OR製備之M a b 1 Η 9 D 3 )培育溶胞液，用4 G 1 0辣跟過氧化物酶共軛抗磷酸化酪胺酸酶抗體（U B I )將免疫性沉澱受體進行S D S — P A G E及Western斑點分析並用化學發光系統（Amersham)偵測。如圖1所示’ I C5()=2 2 0毫微莫耳濃度之化合物本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ ~ —.—-----裝------訂------ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -33 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 ___B7_ 五、發明説明（31) 1 (其結構參見表1A)可有效地在HR 5 — iSR細胞中阻止ySPDGFR之自動磷酸化作用，且在5微莫耳濃度時其抑制性最大，在這些情形下，與其他可能之P TK抑制劑比較，發現化合物1之功能與K 2 5 2 a相等且小於 (三倍）星狀孢子酶（參見下列表2 )，同樣地發現化合物1對α P DGFR自動磷酸化作用之抑制力相同於觀察到之/8受體濃度範圍，這些結果顯示化合物1在完整細胞中可作爲P D G F R自動磷酸化作用之抑制劑，表示此化合物可在活體內具有活性並可達到治療濃度。爲了測定化合物1是否選擇性地抑制P D G F R酪胺酸激酶，評估其在緊密關連之EGFR及FGFR — 1酪胺酸激酶之效應，很訝異地發現化合物1之濃度即使高至 3 0微莫耳濃度，沒有任何這些受體之自動磷酸化作用顯示可偵測之抑制性，E G F R之自動磷酸化作用可用 Κ 2 5 2 a ( I C 5。= 1微莫耳濃度）抑制’但無法用高至3 0微莫耳濃度之星狀孢子酶（表2 )抑制。 s r c P TK族之結構與P TK受體相關，其酪胺酸激酶部份有6 0 - 8 0%胺基酸次序相同，而且這些激酶之功能類似，兩者都可傳達細胞內之訊號而導致細胞增殖，不同於PTK受體，s r c蛋白質不包含細胞外或透膜部份，因此不能直接作爲細胞外刺激之受體’爲了進一步測試化合物1之特性’因此評估其對再合併c — s r c ( U B I目錄# 1 4 一 1 1 7 )活性之抑制能力’爲了適應 9 6 -槽微滴定盤之形式，將在2 3毫莫耳濃度P Η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-34 - 474810 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（32) 8. 0之Tr i s 、68毫莫耳濃度NaCl 、14毫莫耳濃度碳酸氫銨及0. 01%疊氮化鈉之0. 5微克 s r c —基質肽一2 (UBI目錄#12 — 110)加至各槽’肽經固定後，清洗槽後填入2 5毫莫耳濃度p Η 7. 6之HEPES、1〇〇毫莫耳濃度NaCl 、 0. 2%Tween20，在各槽中添加100毫升反應溶液其中含· 03-30微莫耳濃度測試化合物、50微莫耳濃度ATP及在50毫莫耳濃度Tr i s中之10單位c — s r c ; pH7之25毫莫耳濃度MnC 12; 0 _ 〇 5毫莫耳濃度Na3V04; ρΗ7之1 0 0毫莫耳濃度HEPES;5%甘油及0. 05%壬苯氧基聚乙氧基乙醇（NP - 40)，以便啓發激酶之反應，於37 °C 下培育歷時2 0分鐘後，經由添加1 〇微升5 0%醋酸而停止反應，相同於偵測磷酸化P D G F R時所敘述之情形，清洗槽並用抗磷酸化酪胺酸酶抗體偵測酪胺酸激酶磷酸化基質，如表2所示，IC5。= 8. 0微莫耳濃度之化合物1可抑制s r c激酶，此值係抑制PDGFR自動磷酸化作用所需之〜4 0倍濃度，反之，星狀孢子酶 K 2 5 2 a可分別以7 0毫微莫耳濃度及2 0毫微莫耳濃度之I C5D值阻止s r c激酶活性，這些結果顯示化合物 1可選擇性地抑制P D G F R激酶活性，星狀孢子酶及 K 2 5 2 a對抑制s r c激酶活性相等更甚於P D G F R 激酶活性，星狀孢子酶及K 2 5 2 a對抑制s r c激酶活性相等或更甚於P D G F R激酶活性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ^^1- m kru n^i —l·— —^ϋ nn ^^^1 a /^1 I— TJ t· nn I Hi (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -35 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（33) 已知星狀孢子酶可作爲受體酪胺酸激酶，s r C族酪胺酸激酶及更疏遠相關之絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑，關於星狀孢子酶及其他已知P TK抑制劑之缺乏特異性，大爲限制很作爲治療藥劑之可行性，爲了研究化合物1對於抑制絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶之可能性，在製造商所述之情形下（UB I目錄#17 — 1 12)使用UB I > s 非輻射性蛋白激酶進行蛋白激酶A ( P K A )及蛋白激酶 C(PKC)之研究，在濃度範圍爲.025 — 40微莫耳濃度下，對PKC或PKA活性之降低無法達5 0%，此係〜2 0 0倍高於抑制P D G F R激酶活性之所需濃度。頃發現K 2 5 2 a可作爲這些絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑，IC5。值對PKA爲7 0毫微莫耳濃度且對PKC 爲1 0 0毫微莫耳濃度，同時星狀孢子酶抑制兩種激酶之 1 C5Q = 7 0 _ 8 0毫微莫耳濃度，這些結果顯示雖然部份激酶抑制劑例如星狀孢子酶及K 2 5 2 a缺乏選擇性，化合物1對P D G F受體之選擇性比對其他受體酪胺酸激酶、s r c族酪胺酸激酶及絲胺酸/蘇胺酸激酶高4 0 - 2 0 0倍，此選擇性大爲提高化合物1對於治療其中 P D G F具重要角色之疾病例如動脈硬化、部份癌症，絲球體腎炎及血管成形術後再收縮症之可行性。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）丨~φ·裝！ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -36 - 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（34 ) 表2 蛋白激酶活性之抑制性 I C 5〇〔微莫耳濃度 ] 仆合物 a PDGFR β PDGFR EGFR F G F R - 1 s r c -激酶 P K A P K c 化合物1 ,17 0.22 >30 >30 8.0 >40 >40 K252a ND 0. 27 1 . 0 ND 0.02 0.07 0.10 星狀孢子酶 ND 0.07 >30 ND 0.07 0.07 0.08 N D =未測定實例2 用吡唑類化合物對細胞增殖之抑制性爲了測定P TK抑制劑可能醫療用途，證實抑制劑可阻止傳達增殖失調之生長因子所引起之細胞增殖很重要，因爲文獻中關於P D G F在疾病例如絲球體性腎炎、癌症、動脈硬化及再收縮症有許多報導，所以我們測試化合物 1對於PDGF引發之細胞增殖的阻止能力，基於此目的，係使用3 2D - aR細胞並遵循先前頃經發展用於測量 PDGF引發增殖之標準技術，簡要地說，使3 2D_ aR細胞在經白血球溶菌素3 ( I L — 3) _調適之 RPMI介質及10%牛胎兒血清中生長，並用含1〇% 牛胎兒血清之R PM I清洗兩次，在相同介質中再度懸浮成5 X 1 05細胞/毫升，然後分散於2 5 0微升/槽之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）~~~ I 1 m nn n^ii nn 1^11- nn ^^^^1 —ml Mtmmlw 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 474810 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（35) 24槽盤（Falcon)，在最終培育體積爲0. 5毫升及沒有或有化合物1 (. 04 - 40微莫耳濃度）存在下，添加30毫微克/毫升之？〇6?厶人，培育細胞歷時43 小時，然後用〔3H〕胸腺嘧啶核甙（10微C i /槽）進一步培育歷時3小時，用自動細胞收取器收取細胞，濾網放置在液態閃爍混合物中並用Θ計數器計數，如圖2所示，7 0 0毫微莫耳濃度之化合物可阻止5 0%PDGF 引發之胸腺嘧啶核甙混合，且在濃度> 1微莫耳濃度時可完全抑制絲狀分裂。測定化合物1是否具有非特異性抗增殖效應或細胞毒性，係在標準組織培育情形下測量其在人體細胞線（例如得自 ATCC 之 HS68、HS27、CCD18 及 WS 1)之增殖效應，在96 —槽微滴定盤（Fa Icon)中，於沒有或存在濃度範圍爲.01-30微莫耳濃度之化合物 1 、星狀孢子酶或K252a下，將細胞以3. 5 x 1 0 3細胞/槽稀疏地植入含1 0%牛胎兒血清之標準組織培育介質，然後使細胞在標準組織培育情形下生長歷時 96小時，用3. 3%戊二醛固定、用水清洗並用 0. 0 5%甲基藍（Sigma)著色，著色後，清洗細胞，用3 %H C 1洗提染料並用盤讀取機（Molecular Dev ices) 在 6 6 5 毫微莫耳濃度下監視吸收，測定抑制細胞增殖之百分比，係比較抑制劑存在下之吸收值與沒有抑制劑存在下之吸收值，如表3所示，沒有觀察到任何測試人體細胞線細胞生長降低，在.01微莫耳濃度下完全阻止全本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 _

、1T _ 38 _ 474810 A7 ___B7_五、發明説明（36 ) 部人體細胞線之生長，K 2 5 2 a在1 一 12微莫耳濃度下可抑制5 0%之細胞生長且以C CD 1 8細胞最敏感（ IC5(J=1微莫耳濃度），這些化合物對正常細胞生長之效應也用HR 5 — ySR細胞加以評估，其係先前用於測定 )SPDGFR之自動磷酸化作用，需要高濃度（28微莫耳濃度）化合物1才可抑制5 0%之HR5 — ySR細胞生長，相反地，星狀孢子酶（I C5〇< 1 〇毫微莫耳濃度）及K252a (IC5O=130毫微莫耳濃度）可在較低於抑制P D G F R自動磷酸化作用所需之濃度下抑制 HR5_^SR細胞生長，這些結果顯示非特異性蛋白激酶抑制劑之星狀孢子酶在低於抑制激酶所需濃度下，也具有非特異性之抗增殖或細胞毒性，反之’在正常組織培育情形下，化合物1所需抑制細胞生長之濃度> 1 〇〇倍高於阻止P D G F R自動磷酸化作用所需之濃度，這些結果顯示化合物1抑制P D G F R激酶活性而有療效之濃度遠低於造成細胞毒性效應之濃度。 ---I — ----裝------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製表3 在正常組織培育情形下對細胞增殖之抑制性 I C 5。〔微莫耳濃度〕化合物 CCD1 8 HS27 WS1 HS68 HR5- ^ R 化合物1 >30 >30 >30 >30 28 星狀孢子酶 <0. 01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 K252a 1. 0 12 5. 0 5.0 .13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（2丨ox297公釐） -39 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 B7 五、發明説明（37) 實例3 一般說明：N M R 光圖譜係用 var ian Unity Plus 400M-HZ儀器記錄；I R光圖譜係用Perkin Elmer Model 1600FT-IR記錄；反相 HPLC 係用 Waters Model 600 控制器及 Model 965 PhotoDiodeArray 偵測器.，並用 Millenium 2020 軟體處理數據，使用 Vydac 4.5 毫米 x 2 5 公分C 1 8分析管柱或Vydac 2.5公分X 2 5公分C 1 8製備管柱；正相 HP L C 係用 Waters DeltaPrep Model 4000 控制器及 Model 965PhotoDiodeArray 偵測器，並用 Millenium 2 0 2 0軟體處理數據及用 Alltech Econosil 4. 5毫米x 2 5公分矽膠分析管柱或Alltech Econos- il 2 2毫米x 2 5公分矽膠半製備管柱；快速管柱色層分析係用E Merck Silica Gel GF進行；質譜係用Electron Impact 或 Direct Chemical Inoization 樣品引入法進行。 (A)製備3—书酿胺基—5 —苯基一 2—书醯社哩（化合物3 5 ) 在冰浴中攪拌及在氬氣壓下，將1. 4毫升（ 12. 1毫莫耳）苯醯氯加入0. 31克（2. 0毫莫耳 )5 —胺基—3 —节11 比唑（Maybridge或 Aldrich供應）溶解在5 . 0毫升吡啶之溶液中，在冰水溶中攪拌溶液歷時1小時，溫熱至室溫並再攪拌歷時3. 5小時，反應過程中，從溶液中將吡啶鹽酸鹽分離。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ~ : -40 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 ____B7_ 五、發明説明（38 ) 經由加入1 0毫升之1 0% (v/v )氫氯酸水溶液使反應終止，轉移至分離漏斗並用2 5毫升二氯甲烷細胞兩次，合併的有機萃取液依序用1 0毫升之1 0%氫氯酸及飽和的氯化鈉溶液清洗，經由硫酸鎂乾燥並在真空下濃縮後，得到白色固體。用 Waters DeltaPrep儀器，在矽膠半製備管柱中層析固體，溶離梯度爲從9 : 1之己烷：二氯甲烷至1 : 1 之己烷：二氯甲烷，在每分鐘1 0毫升之流率下歷時8 0 分鐘，得到0. 37克（1. 0毫莫耳，50%)白色固體之標題化合物。 TLC (二氯甲烷）：Rf=0_ 86 I R (nujol) : NH 於 3 3 1 7 公分 _1’ CO 於 1 6 8 9公分一1 N M R ( C D C 1 3 ) : 1 1 6 7 ( s > N Η )； 8 . 2 1/8. 23 ( d d > 2 A r Η ) ; 8 . 00/ 8. 〇 2 ( d d > 2 A r H ) ;7. 88/7. 90(

d d > 2 A r H ) ·，Ί _ 5 8 - 7. 66 (m> 2ArH );7 5 1 - 7- 56(m’5ArH) ; 7 . 38 — 7. 4 8 ( m ' 3 A r H ) MS (El) :M+=367 (B )製備？一每醅胳某—5 一苯卩比哗（化合物1 ) 將10 0毫克（〇· 2 7毫旲耳）5 -爷醯胺基—3 —苯基—1 一笮酿吡唑於4毫升1 0% (w/v )氫氧化本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ------4^ 裝. 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 474810 A7 B7 五、發明説明（39 ) 鉀水溶液中之懸浮液在保持於1 0 o°c之水浴中加熱歷時 5分鐘，其間反應混合物保持爲懸浮液，過濾冷卻後之懸浮液並用水清洗及空氣乾燥，得到4 8毫克（0 . 1 8毫莫耳，6 7%)白色固體之標題化合物。 TLC (二氯甲烷）：Rf=〇. 86 I R ( nu jol ) :NMM3 2 8 8& *_1，C〇M 1 6 5 6公分―1

NMR (DMS0-d6) :10. 80(s，NH )；7 . 97/7. 99(dd，2ArH) ； 7 . 71 / 7 . 7 3 ( d · 2 A r H ) ； 7 . 4 0 - 7. 5 6 ( m ，5ArH) ； 7 . 29 — 7. 33(t，ArH)； 7 _ 0 1 ( b s，吡唑 C H ) MS (El) ： M + = 2 6 3 (C )製備3 -芜胺某-5 -苯吡哗（化合物5 3 ) 將0. 17克（0. 66毫莫耳）5 -苄醯胺基一3 -苯吡唑轉移至配備有橡膠隔膜、玻璃塞、及含有氬氣入口迴流冷凝器之經乾燥3頸圓底燒瓶，經由注射器添加無水四氫呋喃（5毫升）並在室溫下攪拌產生清澈、無色溶液，在此溶液中加入0· 93毫升（1. 86毫莫耳）商業化供應（Aldrich)甲硼烷-二甲硫絡合物於四氫呋喃之2莫耳濃度溶液，溶液在油浴中迴流歷時1 7小時，將反應溶液冷卻至環境溫度並用2毫升之10%(v/v) 氬氯酸水溶液將反應終止。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ -42 - 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 474810 A7 ___B7 五、發明説明（4〇) 用Waters Model 600儀器以C18管柱層析粗混合物，用100%水（含0. 1%TFA)均勻清洗歷時10分鐘後，溶離梯度從100%水（含0. 1%三氟醋酸" TFA")至1 : 1之水：乙睛，在每分鐘1〇毫升之流率下歷時5 0分鐘，溶離份在C18分析管柱分析，用梯度自95 : 5之水：乙腈（含0. 1%TFA)至20 : 80之水：乙腈（含0. 1%TFA)，在每分鐘1. 5 毫升之流率下歷時3 0分鐘，將合適的溶離份（即3 8% —44%乙睛之溶離份）合併且親液化，產生72. 3毫克（0· 29毫莫耳，44%)白色粉狀之標題化合物。 HPLC(C18 管柱）：Rf=16. 9 分鐘 N M R ( C D 3 〇 D ) :7. 65 — 7. 68(m， 2 A r Η ) ; 7 . 4 4 - 7. 47(m，3ArH); 7. 3 1-7. 3 8 ( m > 4 A r Η ) ； 7 . 23-7. 27(m，ArH) ； 4 . 42(s，NCH2) MS (El) ： M + = 2 4 9 本文中所引用之全部公告及專利申請案係相同程度地合併供參考，就像各單獨公告或申請案係特定及個別地指出及合併供參考。必須明白本發明並不僅限於其中所示及敘述之特定具體實施例，可加以多種改變及修正而不會脫離下列申請專利範圍所定義之本新穎發明之精神及範圍。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. 訂 -43 -

Claims

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A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍附件（A): 第84 1 1 1 93 1號專利申請案中文申請專利範圍修正本民國90年8月修正 1 . 一種用於抑制血小板衍生之生長因子受體（ PDGFR)和s r c -酪胺酸激酶之藥學組成物，其包含有效含量之3 -苯醯基胺基- 5 -苯基吡唑及/或其藥學上可接受之鹽類* 3 2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該藥學組成物將與包含哺乳動物之體液的組成物相接觸。 3. 如申請專利範圍第2項之組成物，其中該體液係血液或血液部份。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製本紙張尺度逋用中國國家橾準（CNS)A4規格（ 210X297公釐）-1 -