TW202385B - - Google Patents

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A6 B6 202385 五、發明説明（/ ) 現今此項發明是闞於核苷類似物在治療病毒感染上的用 途。更明確地說，它關（系著藥物1,3 -晖噻喃核苷類似物於 治療肝炎一尤其是B型肝炎一之用途。 B型肝炎是一種病毒性疾病，它藉由口腔、或在胃腸之 外由被污染的物質；如血液和血液之產物、或污染過的針 頭、或性行為及縱向式地首被感染或帶原的母親傳播給後 代。在世界上B型肝炎常見的地區，發生於早龄的縱向式 傳播使得高比例之感染個體成為慢性B型肝炎的帶原者。 全球已估計有280,000,000位B型肝炎的帶原者。目前尚 沒有有效之化學治療藥劑用K S療B型肝炎感染。 有許交核苷衍生物已被敘述為具有抵抗B型肝炎病毒之 藥物活性。 £卩40206497敘述若干2',3’-二去氧喋呤和嘧啶核苷具有 抗病毒一包括型炎病毒一之藥物活性。 £?60302760敘述2’，3’-二去氧喋呤核苷在治療6型肝炎 感染上之用途。 W090 / 14079敘述施用槩物2’，3’-二去氧胞嘧啶核苷於B 型肝炎之豁療。 1»/090/14091敘述豳用藥物2’，3'-二去氧鳥喋呤核苷、 2'3’-二去氧腺嘌呤核苷或2',3’-二去氧肌苷於B型肝炎 之豁療。 歐洲專利申請出版物第0382526號敘述一系列具有抗病 毒之藥性的1,3-晖噻喃核苷類似物，這些類似物尤其具有 抵抗「人類免疫不全病毒」（HIV)-亦即専致「後天性免疫 甲 4(210X 297公角） {請先閲讀背面之注竞事項再填寫本頁) •裝· •線· A6 B6 202385 五、發明說明（> ) 不全症候群」（AIDS)之媒介一之藥物活性。 P C T專利申請出版物第W 0 9 1 / 1 7 1 5 9敘述化合物（2 R ，_ >-4-氨基-1-(2-羥甲基-1,37嗶噻喃基喋呤-2_ ( 亦稱3TC丨及其於治療HIV感染上之用途。3TC是在 EPA 0 3 82526述及的數種化合物（BCH-189)之一的左旋光鏡 像物。我們現已發現BCH-189及其個別之鏡像物一包括 3TC—在活體外和活體内均具有抵抗B型肝炎病毒之藥物 •活性。 這項發明於是，在第一方面，提供了一種治療已被或可 被B型肝炎病毒感染之動物一包括人類一的方法；該方法. 包括施用有效量之一種具化學结構式（I )的化合物， {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) nh2

或它的一種醫藥上可接受之衍生物3 在進層式或另一方面，此項發明提供了如上所定義具化 學结構式（I 1的化合物或它的一種醫藥上可接受之衍生物 ;用以製造一種治療B型肝炎之藥物。 諳於這方固技術者，將辨知此處提到的治療乃擴及疾病 -4- 甲 4(210X 297公沒） 202385 A6 B6 五、發明説明（孑） 之預防；Μ及對已確定的感染或症狀之S療。 諳於這方面技術者*將辨知具化學结搆式（I >之化合物 是一画順式化合物，並含有兩個對掌性中心（如化學结構 式（1>所示丨。由是，此化合物存在兩種鏡像物一各別具 结構式I I a )與（I b )的化合物。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本页) .装· 具化學结構式（I >之化合物以「外消旋混合物J或它的 「左旋光鏡像物」之形式較佳•然而這項發明採用具结構 式（I a >與（I b >的化合物；二者以任何比例相混之混合物。 •綠· 具化學结構式（I丨之化合物之化學名稱叫作腯式-4 -氨 基-1-(2-羥甲基-1,3-曙噻喃-5-基嘧啶-2-嗣。此 化合物亦以B C Η - 1 8 9見知。其反旋光鏡像物之化學名稱為 左旋光-順-4-氨基-卜（2-羥甲基-1.3 -晖噻喃-5-基 >-(1Η> -嘧啶-2-嗣，且具有结構式（lb)之化合物的絕對立 體化學；结構式（I b >之化合物名為（2 R ，順> -4 -氨基 -1-(2 -羥甲基-1.3 -晖噻喃-5-基-嘧啶-2-酮。此化 合物又i乂 3TC見知。 -5- 甲 4(210X 297 公潑） 202385 A6 B6 五、發明說明（0) 較好是當該左旋光鏡像物被採用時•幾乎完全不含其所 對應之右旋光鏡像物；亦即是不多於大約5¾重量比；較好 是不多於2：«;尤以存在少於.1¾重量比之右旋光鏡像物為佳 「醫藥上可接受之衍生物J 一詞意指任何在醫藥上可被 接受具化學结構式（I丨之化合物其鹽類、酯類、或該鹽之 酯；或任何其他化合物，在被施用於接受者後，可（直接 .或間接地 > 提供具化學結構式（I)的化合物；或者其一種 具抗病毒活性之代謝物或殘餘物。 諸於此方面技術者將辨知具化學结構式（I )之化合物可 於其鹼基上之官能性基團和晖噻喃環上之羥甲基修飾後產 生醫藥上可接受之衍生物。在所有這些官能基團上所作的 化學修飾乃包含於本發明之範_中。然而對於經修飾晖噻 喃環上之羥甲基後所得之醫藥上可接受之衍生物尤具興趣 所得到具结構式（I )化合物之酯類包括：其0 Η (羥 0

II 基I被一個羧基R - C - 0所置換之化合物，該酯之非羰基R 選自氫原子，直鏈或支鍵的烷基（例如：甲烷基，乙烷基 ，正丙烷基，三级丁基，正丁基），烷氧烷基（例如：甲烷 氧甲基 >，芳烷基（例如：苄基丨•芳香氧烷基（例如：苯氧 甲基），芳香基（例如：視需要而經由鹵素，含1至4画碳 之烷基|或含1至4個碳之烷氧基所取代之苯基）；被取 代之二氫吡啶基（例如：氮一甲基二氫吡啶基）；磺酸g旨類 -6- 甲4(210X 297公沒） (請先聞讀背面之注竟事項再填寫本頁) .裝. •訂· A6 B6 202385 五、發明説明（f) 如烷碲醯基或芳烷碲醯基（例如：甲烷硫醯基）；硫酸酯類 •胺基酸酯類（如：L -纈胺酸基或L -異亮胺酸基）以及一-、二-或三隣酸酯。 從多功能酸類所得之酯類亦包括於上述酯類的範_中； 該多功能酸類如含有多於一個羧基之羧酸類•例如：二羧 基酸類，H02C(CH2>„C02H，式中η為1 0(如：琥珀酸）或 磷酸類。製備此種酯類之方法已詳知。該方法可參讁例如 :哈等人，著"核苷酸二聚物作為抗人類免疫不全病毒 之藥物’，，核苷酸類似物，156-159頁（1989年>，（Hahn e t al. ."Nucleotide dimers as Anti Human Immunodeficiency Virus Agents’， N u c 1 ft o t. i d ft lD..a.lQ K-S., pp 156-159(1989) · M 及布宠等人著 Λ 核苷酸 二聚物抑制人'類免疫不全病毒於活體外之表達"，後壬桦 免疫不伞症候群阱究逛人類撖驄緙病輋,第四卷（第六期 1, 449-455頁（1988年 HBusso et al., "Nucleotide Dimers Suppress HIV Expression in Vitro", A T D S iLe_s_e..a.「—cit... _.a n d』_u. man Retrovirus. 4(6), p p . 449-4 5 5(1988"〇 關於以上所述之酯類•除非在其他情況下指出，否則任 间有利的烷酯可含1至16個碳原子，尤Μ含1至4個碳原 子並且可能含有1個或1 j® Μ上的雙鐽。任何有利而出現 於上述醏類之芳香酯則含有一苯基。 特別是該酯類可為一含1至16碳的烷g旨，一個未經取代 之笨甲醯醏；或是1個至少由一種鹵素（溴、氯、氟或碘 甲 4(210X 297公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· •綠· A6 B6 202385 五、發明説明（厶） >、含1至6碳的烷基、飽合或不飽合之烷氧基、硝基或 三氟甲基所取代的苯甲醯酯。 醫藥上可接受之具结構式.<1 )化合物的鹽類包括那些得 自醫藥上可接受之無機和有機的酸類及鹼類之鹽類。適用 之酸類舉例包括：氫氛酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸 、反-丁烯二酸、順-丁烯二酸、羥基乙酸、乳酸、柳酸、 琥珀酸、對-甲苯碘、醋酸、檸樣酸、甲基碘酸、甲酸、 苯甲酸、丙二酸、萘-2 -磺酸和苯磺酸。其他酸類如甲酸 •雖然它們本身並不為醫槩所接受，但也許在製備能用做 中間物之鹽類上有用；可用之以得到本項發明之化合物及 其醫藥上可接受之加酸鹽類。 得自於適當之鹼類的鹽（類）包括：鹼金靨（如納 >、鹼土 金屬（如im、銨與nr + 4(r為1至4碳的烷基丨之鹽類。 將於下文中提及依據本項發明之化合物包括结構式 (I >之化合物及其醫藥上可接受之衍生物二者。 具結構式（I )之化合物及其個別之鏡像物•可由製備類 似结構化合物的技術中任何已知方法製得；例如敘述於 EAP0382526或W091/17159之方法二者為參考起見遂併於此 處 以其外消旋混合物及個別之鏡像物形式存在之结構式 (I >化合物，已被發現該二種形式在活體内與活體外均可 抑制B型肝炎病毒。 應辨明本發明之化合物其醫療上需用量將不單因所擇之 持定fb合物；且因其拖藥途徑；醫療吠況的本質和病患的 -8- 甲 4(210X297 公沒） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .故. .訂· •線. 202385 A6 B6 經濟部中央標準局印裂 五、發明説明（7 ) 年龄及健康情形而異|最終則將因專责S生或獸B之自行 決定而異。就一般狀況，適當的劑量是在從約0 . 1到7 5 0 毫克/公斤體重/天之範圍内；較好是在0.5到60毫克/ 公斤體重/天的範圍内；最好是在1到2 0毫克/公斤體重 /天的範圍内。 < 欲腌用之劑量可Μ適當地呈於單——劑或以分別之數劑 施用於適當之時段；洌如每日二劑、三劑、四劑、或更多 劑。 該化合物宜Μ單位劑量之形式施用之；例如每單位劑量 形式含有活性成份10至1500毫克，W 20至1000毫克為匣利 •而W 5 0至7 0 0毫克為最便利。 理論上•該活性成份應被拖用Μ達到此活性化合物之尖 峰血漿濃度從約1至約75izM(微莫耳濃度>，Μ約2至約 5〇uM為佳，而約3至約3〇uM為最佳。舉例而言*此或可 由靜脈内注射一劑0.1至5%之活性成份溶液可視需要溶於 鹽水，或口服含有約1至約100毫克該活性成份之藥丸。 合意之血液（藥虽 > 水平可由連讀性注入約0.01至約5.0毫 克/公斤/小時或由間歆性注人含0 . 4至1 5毫克/公斤之 活性成份來維持。 為用於治療，本項發明之一化合物可Μ其粗製之化學物 被施用；然而較好是使有效成份呈藥物配方（之形式 一項藥物配方將包含结構式（I >之化合物或其一種於醫 藥上可接受之衍生物|並含一種或多種醫藥上可接受之帶 藥者（Carriers);因此視需要亦包含其他治療和（或）預防 -9- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _^. •訂. •線. 甲4(210X 297公沒) 202385

A B 經濟部中央標準局印裝 五、發明説明（彳） 的成份。此帶藥者必須在與該配方之其他成份相容，旦對 其受藥者無害之意義上方可接受。 藥物配方包括那些適合於口的、直腸的、》的、陰道的 、或腸胃Μ外的（包括肌肉内的、皮下的及靜哌内的 > 授藥 或那些具一個適合於用吸入法或吹入法授藥之形式者。該 配方可Μ在適當的情況方便的呈於各刖的劑量單位中；並 且可由任何製槩技術中熟知的方法製備。所有的方法，包 括使該活性化合物與液體帶藥物或精密分割之固體帶藥者 或將此二者结合之步驟；而後若必要可將產物製形Μ成為 欲得之配方。 適合口服之藥物配方可方便地圼以分開之數個單位，如 每單位含預定量之活性成份的膠囊、扁囊或藥Η ;如粉末 或顆粒；如一劑溶液、懸浮液或乳化液。該活性成份亦可 呈Μ藥丸、舐劑、或糊狀之形式。用於口眼之藥物及膠囊 可含傳統之賦形藥•如凝結劑、《充劑、潤滑劑、解裂劑 (disintegrants)或溼潤劑。藥Η可依技術上已詳知的方 法外加包依。口服液之製備形式，舉例而言，有水液狀或 油吠懸浮液、溶液、乳化液、糖漿或芳香酒劑|或可呈乾 燥產品；於使用前與水其他適當之調和劑姐成口服溶液。 此類液體製備可含傳統之添加物如懸浮劑、乳化劑、非水 調和劑（其可包括可食性油類），或保存劑。 根據本發明，該化合物亦可經配方Μ便腸胃外授槩（如 :藉由注射；例如點滴注射或連續注入 >，並可圼單位劑 之形式於壺腹波管、預填針管、微體積注人物或在添加保 -10- {請先閱讀背面之注意事項再填寫本页) •裝. •打· •線· 甲 4(210Χ 297公潑） 202385 A6 B6 經濟部中央標準局印¾ 五、發明説明（^ ) 存劑之多劑容器中。其構成可採如懸浮液、溶液或在油狀 或水吠調和劑中的乳化液之形式，並可含處方添劑如懸浮 劑、穩定劑和（或）分散劑。另一方面，此活性成份可圼以 粉末之形式，由無毒法分離滅菌固體或將溶液經冷凍乾燥 法獲得，在使用前與一適當之調和劑；如經滅菌之不含致 熱物質的水，姐成可授服之形式。 適於直腸式授藥之藥物處方；其中之帶藥者為一固體， 此類處方Μ圼單位栓劑之形成者為最佳。合適之帶藥者包 括可可奶油及經常用於此門技術之其他材質，且該栓劑可 方便地由活性化合物混以軟化或融化之帶藥者；再缅由冷 卻及壓模成形而製得。 適合於陰道式授藥之配方可呈形式為：子宮套、止血棉 塞、乳霜、膠、糊、泡末或噴霧，該數種形式除其活性成 份之外，亦含有於技巧方面已知並適用之帶藥者。 至於廨内授藥，根據本發明該化合物可採一種液體噴霧 或可散佈之粉末，或液滴之形式使用。 液滴可採用一水相或非水相之基質，並包括一種或一種 Μ上之分.散劑、溶解劑或懸浮劑。液體噴霧可方便地自加 壓之包装物釋出。 至於藉吸人法授藥，根據本發明該化合物可由一吹人器 、嗔霧器、或一壓力包裝或其他適用於遞送一種氣態溶膠 咱霧之工具•方便地遞送（藥物 >。壓力包装可包含一種適 當之推進物，如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷、二氯四氟乙 烷、二氧化碳或其他適當氣體：當其為一種加壓之氣態溶 -11- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝. .打· •線. 甲 4(210X297 公沒） 202385 A6 B6 五、發明說明（β ) 嘐之情況下，該劑量單位可由提供一活門而決定；該活門 乃甩K遞送經（量器）計量過之藥量。 此外，關於吸入或吹入法授藥•根據本發明該化合物可 K呈乾燥粉末姐成之形式；例如該化合物與一適當之基質 一如乳糖或澱粉一之混合物。該粉末姐成可呈單位劑量之 形成包含於如膠囊或彈吠藥粒中；或如明膠或起泡劑包装 中•則粉末可由此類包装藉吸入器或吹入器之輔肋施用於 _病人。 若必要則可採用適合於持續釋出活性成份之上述配方。 用於本項發明之藥物姐成亦可含有其他活性成份，如： 抗微生物劑或-保存劑。 用於本項發明之適當配方則W E P A 0 3 8 2 5 2 6及 W091/17159内文為例敘述之。 本發明之化合物亦可與其他治療劑；例如其他抗感染劑 *姐合使用之。尤其可同時併用本項發明之化合物與抗病 毒藥劑。 以上提及之姐合藥物可方便地以藥物配方之形式使用之 ，因而含有如上定義之姐合的藥物配方；連同一項發藥上 可接受之帶藥者便涵括了本發明之另一方面。 此種姐合藥物之個別成份可連缅或同時地K分開或姐合 之式 用構 拖結 式具 形當 之 物 生 衍 I 之 受 接 可 上 0 醫 或 物 合 化 之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. •訂· •線· 經濟部中央標準局印裝 每用 ’ 使 時獨 用單 使物 合 合 姐化 劑該 療各 治當 的於 性異 活相 毒或 病同 之相 同可 相， 抗數 抵劑 具之 種物 二合 第化 與 一 甲 4(210X297 公尨) 202385 A6 B6 經濟部中央標準局印裝 五、發明説明（"） 時之劑數◊適當之劑數將容易地為諳於此方面技術者所辨 知？ 本發明由以下之實例說明.；然此例不應被視為本發明之 限制。 奮例一 牛物活忡 ㈧新生鴨群|受鴨類B型肝炎病毒（DHBV)之感染。被感染 後五至七日*血液樣品自鴨隻抽出並檢驗該鴨類B型肝炎 病毒之去氧核糖核酸（DNA);本項檢驗係K —將定之DNA探 I十作點的配對（hybridization)。I.麥森等人作1 _國國家 學術科學記提7 9期，3997至4001頁Π982年）。（ί. e. Mason e t a 1 , P r o c Natl Acad. S c i . II . S . A . 7 9 · 3997-4001，（1982Π。肝臟由 ''點一墨點结果為正" (dot - blot positive)的鴨隻取出，然後用之於生產初步 之肝细胞培養；該培養如前所述受鴨類B型肝炎之感染。 (齓整_曼等人作，病羞學期刊，第5 8期，1 7 - 2 5頁，i . e . Tuttleman e t a 1 , .1 . of___Virology，58，7-25)0 經過兩 天之培養後•抗病毒之藥劑即加入該培養基中。該培養每 兩日即更換；並在設定之時間移取妞胞及油取其全部之 DNA(去氧核糖核酸>。 該D N A根據Μ下步驟被點注於硝化孅維素紙上並Μ 3 2 P (磷-3 2 )標記之D H Β V的D H Α探針偵測之。該D Ν Α由被D Η Β V感 染之肝细胞中抽出並點注於磚化纖維素滅紙上：.上述3 2 Ρ ―缺口移位一D Η Β V之D N A ( p D Η - 01 0 = D Η Β V >探針被使甩（於偵 -13- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) .裝. •訂· •線· 甲 4(21〇Χ 297公发） A6 B6 202385 五、發明説明（Λ>) 測>。D Ν Α在平碟培養後不同的時間自6公分之细胞培養 m中抽取出來。在VC姐中，细胞在第二、六、八、十、十 四、十八及二十日（之培養天數）後收獲。重複之樣品於十 四、十八及二十日後點注（於硝化纖维素紙 >。在藥物治療 之組群中，綑胞於第十四、十八、二十日收稽。藥物在平 碟培養兩日後加人細胞培養中並保持每兩天更換培養基。 全部胞内DNA Μ標準之酚抽取法自妞胞中抽出。在直徑6 '公分之北德利氏皿（Petri dishes丨中的細胞被溶解 Uyzed)於一溶解緩衝液（lysis buffter丨中；此溶解液含 有 0 . 2 % S D S，1 5 0 u m T r i s - H C 1 pH 8 · 0，1 0 m Μ E D T A， 5mM EGTA，及150mM Nacl。該细胞溶解產物以0.5毫克/ 毫升之pronase E(可得自Sigma公sj )在攝氏37度經兩小時 消化後，再將之以等體積飽合20mM TrU-HCl，PH7.5， 0.5mM EDTA及0.1¾ 8 -羥基喹啉之酚溶液蛋白化。加入濃 乙酸銨鹽（pH7.0(2.5M ))於該水液相以得0.25M之乙酸銨 溶液，且Μ二倍體積之100¾乙醇將核酸沉澱下來。此核酸 小粒經乙酵冲洗並予乾燥。將其D N A溶於含有1 2 · 5 in Μ Tris-HCl，ΡΗ7.5，10mM EDTA，3096 甘油及 0.01% 溴酚藍 之溶液中。其中十二分之一的樣品被點樣於硝化纖維紙上 以行「點一墨點（dot-bloU分析。 諸藥物在0 (無活性 >至+ + + + (高活性 >之等级間予Μ 評分。 被採試之化合物為順2 -氨基-1 ( - 2 -羥甲基1 , 3 -晖唾喃 -5-基嘧啶-2- _(具化學结構式（I >之化合物， -14- 甲4(210X 297公沒） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· .線· 經濟部中央標準局印- A6 B6 202385 五、發明説明（G ) 兼採其外消旋混合物及左旋光鏡像物）及兩種已知的B型 肝炎抑制劑，2’，3’ -二去氧-鳥喋呤核苷（ddG)及2,6 -二氨 基喟呤- 9- /9 -D-2’，3’-二去氧呋喃核苷（ddDAPR)-(歐洲 專利申請出版物第0 3 0 2 7 6 0號>。 结果示於表1 。 (BL1 類—铝 J— 山羥B型肝炎病毒DNA殖人（transtected)之單層Hep G2 细胞在六孔皿中，於補充Μ 380微克/毫升 GeneUcin(GIBCO 第 860-1811J 號，G4182硫酸酯）及 10% 幼牛血清之MEM中製得，且當此單層细胞之濃度為75% ( 於上述之MEM中丨時採用之。 藥物之備用溶液MPBS配製為1毫克/毫升之濃度。對 不溶於此範圍之藥物，或可將其懸浮液溫熱至攝氐42度並 加人乙醇，或可將該藥物溶至較低之最终濃度。 藥物之備用溶液Μ (上述經過補充之）MEM稀釋至最终濃 度為1毫克/毫升。 自细胞單層將培養基移除並換Μ含藥物2毫升/孔之培 養基|並於每一測試使用其中三孔。 該培養基在十四天中每隔兩天則移除之，並換以含藥物 之新鲜培養基（亦即更換t次該藥物溶液>， 自各孔中將培養基移去並K 1毫升P B S洗滌該细胞。待 加人2毫升/孔R I P A緩充液U >後*闬橡皮刮刀以刮取方 式將细胞自孔中移出·'再將該细胞移人試管中-· -15- 甲 4(210X 297公沒） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •訂· ，線· A6 B6 202385 五、發明説明（/鈐） 將1毫升氯仿加至各該試管中，並以振動混合器 (Vortex mUe「）將之（與细胞）混合。而後將1毫升酚（飽 合以20〇^1'「丨5,1|!^££>丁6及0.1%8-羥基喹啉>加人各試 管·於各該管離心後將ΐ毫升之水液層移出。 將0.2Μ乙酸銨鹽加人（該水液層），再與2.5倍體積之冰 冷乙醇混合、此混合物置於攝氐-2 0度隔夜Μ使D Ν Α沉澱。 D Η A經離心後呈小粒*以冷乙醇冲洗一次後乾燥之。 該沉澱之小粒於200微升之Tris UOkiM), EDTA (lmM> 緩充溶液中；經置於攝氏4度隔夜後，Μ超音波輕振（20 秒）後溶解。將2 0微升之各画樣品點注於一尼隆（H y 1 ο η > _上並使之與一 HBV DNA探針配對。 * RIPA緩衝液：0.15 M Nacl, 1¾ deoxycholate, 1¾ Triton X 100. 0.1¾ SDS, 0.01M Tris-HCl, PH7.5- 结果不於表2 a 01 (ii >本試驗所用之方法詳述於Korba et. al.

Antiviral. Research 15, 217-218， 1992)，並於下簡述 把經人類B型肝炎病毒（Η B \M基因之D N A殖人所得之H e p 02细胞（2、2、15細胞>予以培養並保持在|^卩^ 1640培養 基中，該培養基含有5¾胎牛血清，2mM毅胺醢胺與50微克 /毫升gentamicin sulfate，且例行地檢驗其G418之抵 抗性。_ 2，2、1 5细睢之掊養在2 4孔之姐織培養碟上長成细 甲 4(210Χ 297公沒） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .襄· .訂· •線. 202385 A6 B6 五、發明説明（AT ) 胞確聚之形式，並在藥物處理前之二至三日使之维持在該 狀況。 將藥物溶解於無菌水或無菌之50 %DMS0水溶液中；使此 藥物濃度丨00倍高於試驗漘度之較高者。諸溶液則依所需 稀釋於培養基中。 該匯集细胞上之培養基，在细睢曝於待測試化合物前 2 4小時更換之。於十天之藥物處理中*該培養基則每日更 換之。經十天處理後，收集該培養基並將之冷凍於-70度 K備HBV DNA之分析。 為分析细胞外之Η B V DNA，將0 . 2毫升培養基之樣品加人 1 M Na0H/10X SSC (IX SSC 為 0.15Μ HC1/0.015M槔檬酸 納鹽· PH7.2)，在攝氐25度保溫20分鐘，然後Sg樣在預 浸於20XSSC之硝化纖維素膜上，此過程使用一 「墨點法 (blotting)」之裝置。樣品經0.5毫升之1 M Tris，出 7.2/2^11^(：1洗滌二次，再以0.5毫升之20；<55{：洗一 次後呈中性。而後滅膜在2 X SSC中漂洗並於溫度80度之真 空吠態下烘烤一小時。 將已純化之3.2 Kb. EcoRl HBV DNA之片段經缺口移位 KI:32P]dCTP標記之•作為一探針|再經由DNA配對後在 「點一墨點 （d 〇 t - b 1 〇 t )」结果上偵得Η B V D N A。在冲洗後 ，使已配對之墨點（blot)结果乾燥·再用安比斯一 /3粒子 掃描器（Ambis beta scanner)定量 32P 。 结果示於表2 b 。 -17- 甲4(210X 297公沒） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) _装. •線· 202385 A6 B6 五、發明説明（/< ) 表_丄_ 活體外抗鴨類B塑肝炎病竃 化合物 IC50微克/毫升活性 具结構式（I ) 之化合物外消 旋物 於1 0微克/毫升 左旋光鏡像物 <1微克/毫升

ddG 0 . 0 7微克/牽升 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •装·

ddDAPR 0.07微克/毫升 活體外杭人類B型肝炎病羞之化合物活忡 表 HBV活性於10微克/毫升 •綠· 具结構式（I > 之化合物外消 旋物 18- 甲4(210X 297公发） 202385 五 '發明説明（/ 7 ) A6 B6

ddG

ddDAPR IC50微莫濃度（w M) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

3TC

ddC .034 .裝·

a r a AMP c d G ddC =2 ' , 3 ’-二去氧朐嘧啶核苷酸 cdG =碳環去氧鳥喋呤核苷 a r a AM P =腺苷基阿拉伯糖-5 ’ -單隣酸酯 .綠· 19- 甲 4(210X 297X 潑)

Claims (1)

1. A B c D L —種用於治療被或可被B型肝炎病籌感染的動物（包 括人）之醫藥姐合物，其包含有效最之式（I)化合物 NH2

   (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局印裝 其中式I化合物係埋自（±)_ 1-4-胺基-1-(2-羥甲基 -1,3 -吗唾喃-5 -基）-(1{1)-嘛陡-2-83 及（一）-順-4 -胺 基-1-(2-羥甲基-1,3-晖噻喃-5-基）-(1Η)-嘧啶-2-酮 或其蕖學上可接受鹽或酯。 2.根據申請専利範園第1項之姐合物·其中式（I)化合 物包括（士）-ϋ_-4-胺基-1-(2-羥甲基-1,3-嗶噻喃-5-基）-(1H)-嘧啶-2-酮，或其藥學上可接受鼸或酯。 a 根據申請專利範園第1項之姐合物，其中式（I)化合 物係大體上光學異構纯化之（一）-1-4-胺基-1-(2-羥 甲基-1,3-噚噻喃-5-基）-(1Η)-嘧啶-2-萌。 4.根據申請專利範園第1 、2或3項之姐合物，其中該 B型肝炎病毒係人類B型肝炎。 a 根據申請專利範園第1、2或3項之姐合物*其中該 化合物之含量為0. 1至750«克/公斤體重/每日。 f 4(210X297 公尨) .裝. •打. .練· A? 202385 C7 _D7_ 六、申請專利範圊 & 根據申請專利範圍第1、2或3項之姐合物，其中該 式（I )化合物適用於口眼。 7.根據申請專利範圍第1、2或3項之組合物，其中該 姐合物逋合於非經腸道施用。 a 根據申謅專利範圍第1、2或3項之姐合物，其中該 姐合物係呈單位劑量之形式。 ..................................一 ...............¾..............................ir........* ..................^ (請先聞讀背面之注意事項再填宵本頁) 經濟部中央搮準局印製 甲 4(210X297 公廣）