TW202202525A - 抗b7h4抗體及其雙抗和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示了一種標靶B7H4的抗體或其變體，及包含標靶B7H4的抗體的雙特異性抗體，其中所述標靶B7H4的抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述變體在所述抗體的輕鏈可變區或重鏈可變區上發生胺基酸突變，並能維持所述抗體的功能。本發明的標靶B7H4的抗體具有與人B7H4和食蟹猴B7H4結合的活性，與其它B7家族成員沒有交叉反應；體內外實驗呈現很好的抗腫瘤活性、T細胞活化活性和內化活性，更適合做ADC藥物。本發明的雙特異性抗體，具有較長的半衰期，保留了很好的穩定性和親水性，在保證藥效的前提下降低了毒性。

Description

抗B7H4抗體及其雙抗和應用
本申請要求申請日為2020/6/30的中國專利申請202010618159.5的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及生物醫藥領域，尤其是一種抗B7H4抗體及其雙抗和應用。
乳癌、卵巢癌和子宮內膜瘤為女性常見的惡性腫瘤，其中乳癌發病居女性癌症發病的首位，2018年國際癌症研究機構IARC的資料顯示，乳癌在全球女性癌症中的發病率為24.2%。對於這些癌症的治療，免疫治療和標靶治療是目前的熱點。比如標靶Her2的赫賽汀在Her2陽性的乳癌上有很好的療效。對於三陰性乳癌(TNBC)，由於缺乏對應的標的，目前少有治療手段，主要以化療為主。2019年3月美國FDA批准PD-L1抑制劑Atezolizumab聯合白蛋白結合型紫杉醇用於轉移性三陰性乳癌(TNBC)的治療，但PD-L1在三陰性乳癌上的表現並不高。
免疫檢查點抑制劑是乳癌中研究最多的免疫治療形式。在腫瘤微環境中免疫檢查點分子往往被高度表現，透過抑制T細胞活化以及誘導T細胞耗竭，從而腫瘤可以逃避免疫系統的攻擊。B7家族與TNF家族是兩類主要的共刺激分子家族，B7家族目前有10個分子，分別為CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、B7H1 (PD-L1/CD274)、B7-DC (PD-L2/CD273)、B7H2 (ICOSL)、B7H3 (CD276)、B7H4 (B7S1/B7x/Vtcn1)、B7H5 (VISTA)、B7H6以及B7H7 (HHLA2)。B7家族的多個成員及其受體已經被證明是免疫檢查點，如PD-L1/PD1、CTLA4和VISTA等。
B7H4是比較新的B7家族成員，雖然在mRNA位準在身體細胞內廣泛表現，但其蛋白位準的表現非常有限，僅在身體的部分導管上皮細胞上如乳腺導管和小葉、輸卵管上皮、子宮內膜等組織有低位準表現。相反，B7H4在多種腫瘤組織中大量表現，比如在乳癌特別是三陰性乳癌、卵巢癌和子宮內膜瘤等腫瘤細胞上。從表現圖譜這一點上來講，B7H4可以被認為是一個高特異性的腫瘤相關抗原。另一方面，B7H4是一種新的免疫檢查點分子，體外實驗證明B7H4透過與其未知的T細胞表面受體相互作用，抑制T細胞的增殖、活化以及細胞激素的產生。腫瘤細胞透過高度表現B7H4分子，以及腫瘤微環境裡高度表現B7H4分子的抑制性巨噬細胞，抑制T細胞的活化從而實現免疫逃脫。B7H4在腫瘤上的表現圖譜與PD-L1不重疊。透過抗體標靶B7H4的治療，以及阻斷B7H4的負調控作用重新活化免疫系統，是一種有前景的治療B7H4表現陽性腫瘤的手段。
目前有多家製藥公司在研發針對B7-H4的單株抗體，或與藥物偶聯物，或雙特異性抗體。Genentech、BMS、Jounce，江蘇豪森等都處於臨床前開發，目前進展最快的是FivePrime的抗B7H4單株抗體，目前處在臨床I期，其機制主要透過ADCC以及阻斷免疫檢查點活化T細胞。然而，臨床上尚未有一種高親和力、高選擇性和高生物活性的人源抗B7H4抗體。
為解決本領域缺乏一種高親和力、高選擇性和高生物活性的人源抗B7H4抗體的技術問題，本發明利用特有的和鉑人源小鼠平臺，提供一種全人源的高親和力、高選擇性，高生物活性抗B7H4抗體，以及基於該抗體建構的anti-B7H4 × CD3的雙特異性抗體，以應用於B7H4陽性腫瘤的治療。
本發明的技術方案之一為：提供一種標靶B7H4的抗體或其變體，其中，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中：
所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
所述變體在所述抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區上發生胺基酸突變，並能維持所述抗體的功能。在本發明中，所述胺基酸突變可以為在原胺基酸序列例如CDR上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加。優選地，所述胺基酸突變為胺基酸替換，所述胺基酸替換的數目為1-3個。且所述突變的胺基酸序列與原胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體與目標抗原的結合；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%、96%、97%或98%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。所述標靶B7H4的抗體在本發明中又稱為抗B7H4的抗體。
在具體的一些實施例中，如上所述的抗體或其變體，其中，所述變體為在所述抗體的重鏈可變區的HCDR2的第3或4位，HCDR3的第3位發生胺基酸替換，和/或，在所述抗體的輕鏈可變區的LCDR3的第4位發生胺基酸替換。
優選地，所述HCDR2的第3位的D替換為G或E，和/或，第4位的G替換為A，和/或，所述HCDR3的第3位由G替換為A；所述LCDR3的第4位由N替換為S、R或Q。即，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、55和66所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和69所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和38所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在具體的一些實施例中，如上所述的抗體或其變體，其中，所述重鏈可變區還包括重鏈可變區框架區HFWR，和/或，所述輕鏈可變區還包括輕鏈可變區框架區LFWR，其中，所述HFWR為人抗體的重鏈可變區框架區，所述LFWR為人抗體的輕鏈可變區框架區。
較佳地， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在本發明中，所述胺基酸突變還可以為在原胺基酸序列例如FWR上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加。優選地，所述胺基酸突變為胺基酸替換，所述胺基酸替換的數目為1-3個。且所述突變的胺基酸序列與原胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體與目標抗原的結合；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%、96%、97%或98%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。
在具體的一些實施例中，如上所述的抗體或其變體，其中，所述抗體還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區。優選地，所述抗體的重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈；更優選地，所述變體在所述抗體的Fc的第239位和/或332位發生胺基酸替換，優選所述胺基酸替換為S239D和/或I332E。
在具體的一些實施例中，如上所述的抗體或其變體，其中，所述抗體是全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2 、Fv、scFv或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
在具體的一些實施例中，如上所述的抗體，其中，所述抗體包括(1)重鏈和輕鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列；輕鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或，所述重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；或， 所述重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， (2)其包括重鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列。
術語“抗體”可以包括免疫球蛋白，其是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈透過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其對應的重鏈分別為µ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其樞紐區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞型，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈透過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中的每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，所述的輕鏈恆定區包含人源的κ、λ鏈或其變體。在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恆定區包含人源的IgG1、2、3、4或其變體。
在輕鏈和重鏈內，可變區和恆定區透過大約12或更多個胺基酸的“J”區連接，重鏈還包含大約3個或更多個胺基酸的“D”區。各重鏈由重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域(CH1、CH2和CH3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。抗體的恆定區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(C1q)的結合。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高度變異區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FWR)。3個高度變異區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FWR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之二為：提供一種標靶B7H4的雙特異性抗體，其中，其包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，其中，所述A蛋白功能區為如上所述的標靶B7H4的抗體；所述B蛋白功能區為非標靶B7H4的抗體；優選地，所述非標靶B7H4的抗體為標靶CD3的抗體；更優選地，所述標靶CD3的抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；進一步更優選地，所述標靶CD3的抗體中，所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；或，輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；或，輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
在具體的一些實施例中，如上所述的雙特異性抗體，其中，所述B蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區，所述A蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其中，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本發明的雙特異性抗體中，所述B蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區，所述A蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其中，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或，
所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
在具體的一些實施例中，如上所述的雙特異性抗體，其中，所述雙特異性抗體選自以下組： (1)結構為n’-[VL]-CL-c’的多肽鏈-1、n’-[VH]-CH1 -h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-2，和，n’-{VH-L-VL}-h-CH2-CH3-c’或n’-{VL-L-VH}-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-3；其中，所述多肽鏈-1和多肽鏈-2為A蛋白功能區，所述多肽鏈-3為B蛋白功能區，或，所述多肽鏈-1和多肽鏈-2為B蛋白功能區，所述多肽鏈-3為A蛋白功能區； (2)結構為n’-[VL]-CL-c’的多肽鏈-1、n’-[VH]-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-2，n’-{VH}-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-3和n’-{VL}-CL-c’的多肽鏈-4，或，結構為n’-[VH]-CH-c’的多肽鏈-1、n’-[VL]-CL-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-2，n’-{VH}-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-3和n’-{VL}-CL-c’的多肽鏈-4；其中，所述多肽鏈-1和多肽鏈-2為A蛋白功能區，所述多肽鏈-3和多肽鏈-4為B蛋白功能區，或，所述多肽鏈-1和多肽鏈-2為B蛋白功能區，所述多肽鏈-3和多肽鏈-4為A蛋白功能區； (3)結構為n’-[VH]-CH1-c’的多肽鏈-1、n’-{VH}-CH1-L-[VL]-CL-h-CH2-CH3-c’或n’-{VH}-CH1-h-CH2-CH3-L-[VL]-CL-c’的多肽鏈-2，n’-{VH}-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-3和n’-{VL}-CL-c’的多肽鏈-4；其中，所述多肽鏈-1為A功能區，所述多肽鏈-2從n’至c’依次包括A蛋白功能區和B蛋白功能區或從n’至c’依次包括B蛋白功能區和A蛋白功能區，所述多肽鏈-3和多肽鏈-4為B功能區；或，所述多肽鏈-1為B功能區，所述多肽鏈-2從n’至c’依次包括B蛋白功能區和A蛋白功能區或從n’至c’依次包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，所述多肽鏈-3和多肽鏈-4為A功能區； (4)結構為n’-[VH]-CH1-L1-{VL-L2-VH}-h-CH2-CH3-c’或n’-[VH]-CH1-L1-{VH-L2-VL}-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-1、n’-[VH]-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-2和n’-[VL]-CL-c’的多肽鏈-3；其中，所述多肽鏈-1包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，所述多肽鏈-2和3為B蛋白功能區，或，所述多肽鏈-1包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，所述多肽鏈-2和3為A蛋白功能區；優選地，所述多肽鏈-1從n’至c’依次為B功能區和A功能區，或，從n’至c’依次為A功能區和B功能區； (5)結構為n’-[VH]-CH1-h-CH2-CH3-L1-{VL-L2-VH}-c’或n’-[VH]-CH1-h-CH2-CH3-L1-{VH-L2-VL}-c’的多肽鏈-1，n’-[VH]-CH1-h-CH2-CH3-c’的多肽鏈-2和n’-[VL]-CL-c’的多肽鏈-3；其中，所述多肽鏈-1包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，所述多肽鏈-2和3為B蛋白功能區，或，所述多肽鏈-1包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，所述多肽鏈-2和3為A蛋白功能區。
其中n’表示多肽鏈的胺基端(也可寫為N末端)，c’表示多肽鏈的羧基端(也可寫為C末端)，h表示樞紐區，L、L1或L2表示連接子(或接頭)，合適的現有技術連接子(L)由重複的G4 S胺基酸序列或其變體組成。例如，可使用具有胺基酸序列(G4 S)4 或(G4 S)3 連接子，但也可使用其變體，例如所述G4 S的G的其中之一替換為Q，例如第二個或第三個G替換為Q，本發明優選的連接子序列如SEQ ID NO:133-135所示。“-”代表聯結不同結構區的多肽鍵或用來分隔不同結構區。
本發明中，“[ ]”、“{ }”分別代表不同的功能區或結構；例如{VL-L-VH}、{VH-L-VL}代表scFv結構，而[VH]/{VH}、[VL]/{VL}分別為Fab結構的重鏈可變區和輕鏈可變區。當VH分別為A、B蛋白功能區時，又可分別表示為VH_A (即重鏈可變區為A蛋白功能區)或VH_B (即重鏈可變區為B蛋白功能區)；同樣地，當VL分別為A、B蛋白功能區時，又可分別表示為VL_A (即輕鏈可變區為A蛋白功能區)或VL_B (即輕鏈可變區為B蛋白功能區)。在圖28中，為繪圖方便去除了“[ ]”“{ }”，因此VL_B-L-VH_A (輕鏈可變區為B蛋白功能區，重鏈可變區為A蛋白功能區，L為連接子，連接VL_B和VH_A)、VH_B-L-VL_A (重鏈可變區為B蛋白功能區，輕鏈可變區為A蛋白功能區，L為連接子，連接VH_B和VL_A，參見例如結構(1)的多肽鏈-3)等同樣代表scFv結構，而單獨的VL_B或VH_A (參見例如結構(1)的多肽鏈-1或多肽鏈-2)仍分別代表Fab結構中的B蛋白功能區的輕鏈可變區和A蛋白功能區的重鏈可變區。本發明中，多肽鏈-1、-2、-3或-4僅表示多肽鏈的種類，在實際由多肽鏈構成雙特異性抗體時，每種多肽鏈的數目可以為1或2條，例如在結構(5)和(6)中，多肽鏈-1、-2、-3的數目為1條，多肽鏈-4的數目為2條；在結構(7)、(8)(9)和(10)中，多肽鏈-1、-2的數目為1條，多肽鏈-3的數目為2條。本發明中，多肽鏈-1又稱第一多肽鏈，多肽鏈-2又稱第二多肽鏈，多肽鏈-3又稱第三多肽鏈，多肽鏈-4又稱第四多肽鏈。
在一些優選的實施例中，所述雙特異性抗體選自以下組： (1)所述雙特異性抗體包含三種多肽鏈：其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：120所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：126所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：128所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列； (2)所述雙特異性抗體包含四種多肽鏈：其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：120所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
本發明的蛋白功能區在一些情況中可以為Fab、scFv或VH，在另一些情況中也可以為F(ab)2或全長抗體，在某些情況中也稱為抗體或抗原結合蛋白或結合蛋白。本發明中，“Fab結構”或“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab片段的重鏈不能與另一個Fab重鏈分子形成二硫鍵。“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段；兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並透過CH3結構域的疏水作用保持在一起。“Fab’片段”則含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2片段。所述的“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此F(ab’)2片段由透過兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。術語“Fv”意指向抗體的單臂的VL和VH結構域組成的抗體片段，但缺少恆定區。
本發明中，所述的scFv (single chain antibody fragment，單鏈抗體)可為本領域常規的單鏈抗體，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區和15~20個胺基酸的短鏈胜肽。其中VL和VH結構域透過使其能夠產生為單個多肽鏈的連接體配對形成單價分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH，或表示為n’-VL-L-VH-c’或n’-VH-L-VL-c’。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之三為：提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包含如本發明技術方案之一所述的抗體或技術方案之二所述的雙特異性抗體。
本申請中，所述的抗體或雙特異性抗體可以用於製備成嵌合抗原受體(CAR)等從而將其修飾在例如T細胞或NK細胞等細胞上面。所述嵌合抗原受體可為本領域常規的嵌合抗原受體，包括例如利用上述抗體以scFv的形式作為胞外抗原結合結構域的嵌合抗原受體。
因此，為解決上述技術問題，本發明技術方案之四為：提供一種基因修飾的細胞，其包含如本發明技術方案之一所述的抗體；所述細胞優選為真核細胞，更優選為分離的人細胞，進一步更優選為免疫細胞如T細胞(例如以CAR-T的形式)，或NK細胞如NK92細胞株。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之五為：提供一種分離的核酸，其編碼如上所述的抗體或如上所述的雙特異性抗體或如本發明技術方案之三所述的嵌合抗原受體。
所述核酸的製備方法為本領域常規的製備方法，較佳地，包括以下的步驟：透過基因轉殖技術獲得編碼上述抗體的核酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述抗體的核酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述抗體的胺基酸序列的鹼基序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該抗體序列基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之六為：提供一種表現載體，其包含如上所述的分離的核酸。
所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得，即：將本申請所述的核酸分子連接於各種表現載體上建構而成。所述的表現載體為本領域常規的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。
優選地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之七為：提供一種轉形株，其包含如上所述的分離的核酸或表現載體。
所述轉形株的製備方法可為本領域常規的製備方法，例如為：將上述重組表現載體轉形至宿主細胞中製得。所述轉形株的宿主細胞為本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。優選地，所述宿主細胞為原核細胞/或真核細胞，所述原核細胞優選E. coli 細胞如TG1、BL21 (表現單鏈抗體或Fab抗體)，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞(表現全長IgG抗體)。將前述重組表現質體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形株。其中所述轉形方法為本領域常規轉形方法，較佳地為化學轉形法，熱休克法或電穿孔法。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之八為：提供一種標靶B7H4的抗體或雙特異性抗體的製備方法，其中，所述製備方法包括以下步驟：培養如本發明技術方案之七所述的轉形株，從培養物中獲得所述標靶B7H4的抗體或雙特異性抗體。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之九為：提供一種抗體藥物偶聯物，所述的抗體藥物偶聯物包括抗體部分和偶聯部分，所述抗體部分包含如本發明技術方案之一所述的抗體、如本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體，所述偶聯部分包括但不限於可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酵素、或其組合，所述抗體部分和偶聯部分通過化學鍵或連接子進行偶聯。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十為：提供一種藥物組成物，其中，所述藥物組成物包含如本發明技術方案之一所述的抗體或如本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體以及任選地藥學上可接受的載劑。優選還包括藥學上可接受的載劑。
更優選地，所述藥物組成物還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分。
所述的藥學上可接受的載劑可為本領域常規的載劑，所述的載劑可以為任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物佐劑。所述的藥物佐劑為本領域常規的藥物佐劑，優選地包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更優選地，所述的藥物組成物包括0.01~99.99%的上述抗體和/或上述的雙特異性抗體，和0.01~99.99%的藥用載劑，所述百分比為占所述藥物組成物的品質百分比。
本發明所述的藥物組成物的給藥途徑優選地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述注射給藥優選地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物為本領域常規的各種劑型，較佳地為固體、半固體或液體的形式，即可以為水溶液、非水溶液或懸浮液，更佳的為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更優選地為經由血管內、皮下、腹膜內或肌內施用。較佳地，所述藥物組成物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑施用，即經鼻施用；或者，鞘內、髓內或心室內施用。更優選地，所述的藥物組成物還可以透皮、經皮、局部、腸內、陰道內、舌下或經直腸施用。本發明的藥物組成物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可以採用注射或其它治療方式。
本發明所述的藥物組成物的給藥劑量位準可以根據達到所需診斷或治療結果的組成物量而調整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進行調整。所選擇的劑量位準和方案依賴於包括所述藥物組成物的活性和穩定性(即，半衰期)、製劑、施用途徑、與其他藥物或治療的組合、待檢測和/或治療的疾病或病症、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫療史等各種因素而進行合理地調整。
對於本發明的所述藥物組成物的治療有效劑量可以最初在細胞培養實驗或動物模型例如齧齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進行估計。動物模型也可以用於測定合適的施用濃度範圍和途徑。隨後可以用於確定在人中施用的有用劑量和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調整以及何時和如何進行此類調整的評估為本領域技術人員已知。
對於組合療法，上述抗體、雙特異性抗體和/或另外的治療或診斷劑可以各自作為單一藥劑，在適合於執行預期治療或診斷的任何時間範圍內進行使用。因此，這些單一藥劑可以基本上同時(即作為單一製劑或在數分鐘或數小時內)或以按順序連續施用。
關於製劑、劑量、施用方案和可測量的治療結果的另外指導，參見Berkow等人(2000) The Merck Manual of Medical Information (Merck醫學資訊手冊)和Merck&Co.Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology (臨床藥理學手冊)等著作。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案之十一為：提供一種如本發明技術方案之一所述的抗體，如上本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體，如本發明技術方案之三所述的嵌合抗原受體，如本發明技術方案之四所述的基因修飾的細胞，如本發明技術方案之九所述的抗體藥物偶聯物或本發明技術方案之十所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物、套組和/或給藥裝置中的應用。
優選地，所述癌症為B7H4陽性表現的腫瘤；所述腫瘤優選為乳癌、卵巢癌和子宮內膜瘤，所述乳癌更優選為三陰性乳癌。
為解決上述技術問題，本發明技術方案之十二為：提供一種檢測樣品中B7H4的方法，其包括使用如上所述的抗體或雙特異性抗體進行檢測。優選地，所述檢測方法為非診斷目的。
本發明非診斷目的的治療或檢測方法包括但不限於：實驗室藥物篩選、預防醫學研究和公共衛生政策的制定、使用套組進行檢測等。本領域技術人員知曉，現代醫學分為兩部分：預防醫學和臨床醫學。本發明的“非診斷目的的檢測方法”，在預防醫學中可以對環境中採集的樣本(包括人體分泌物)進行檢測，對環境是否被抗原污染進行判斷。在實驗室中，實驗人員也可利用本發明的抗體或雙特異性抗體對實驗室試劑進行檢測，以確保用於實驗的抗原未受到B7H4以外的抗原污染，以進一步用於新的抗體篩選或作為藥物標的篩選小分子化合物等。
為解決上述技術問題，本發明技術方案之十三為：提供一種套組，其特徵在於，所述的套組包括如本發明技術方案之一所述的抗體，如本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體、如本發明技術方案之三所述的嵌合抗原受體、如本發明技術方案之四所述的基因修飾的細胞、如本發明技術方案之九所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明技術方案之十所述的藥物組成物，及任選地，說明書。
為解決上述技術問題，本發明技術方案之十四為：提供一種給藥裝置，其特徵在於，所述的給藥裝置包含：(1)用於對有需要的受試者施用本發明技術方案之十所述的藥物組成物的輸注模組，以及(2)任選的藥效監控模組。
為解決上述技術問題，本發明技術方案之十五為：提供一種如本發明技術方案之一所述的抗體，如本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體、如本發明技術方案之三所述的嵌合抗原受體、如本發明技術方案之四所述的基因修飾的細胞、如本發明技術方案之九所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明技術方案之十所述的藥物組成物在診斷、預防和/或治療腫瘤中的應用。優選地，所述腫瘤如本發明技術方案之八所述。
為解決上述技術問題，本發明技術方案之十六為：提供一種套裝藥盒，其包含藥盒A和藥盒B，所述的藥盒A為如本發明技術方案之一所述的抗體，如本發明技術方案之二所述的雙特異性抗體、如本發明技術方案之三所述的嵌合抗原受體、如本發明技術方案之四所述的基因修飾的細胞、如本發明技術方案之九所述的抗體藥物偶聯物和/或如本發明技術方案之十所述的藥物組成物，所述的藥盒B為其他抗腫瘤抗體或者包含所述其他抗腫瘤抗體的藥物組成物。所述的藥盒A和藥盒B可以同時使用，也可以先使用藥盒A再使用藥盒B，還可以先使用藥盒B再使用藥盒A，可以根據具體應用時的實際需求而定。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如本領域技術人員知曉，或J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)中所述。如本文使用的，術語“包括”或“包含”旨在表示組成物和方法包括所述的元素但不排除其他元素，但根據上下文的理解，也包括“由……組成”的情況。除非內容明確提示，否則術語“或”在本發明中用來意指術語“和/或”並且與之互換使用。“約”和“大約”應當通常意指鑒於測量的性質或精準度，所測量的量的可接受誤差程度。例示性誤差程度一般在其10%範圍內和更一般在其5%範圍內甚至在其2%或1%內。如本文中所使用的，術語EC50 是指半最大效應濃度(concentration for 50% of maximal effect)，即能引起50%最大效應的濃度。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於： 1、本發明的標靶B7H4的單株抗體是一種天然產生的全人抗體，具有與人B7H4和食蟹猴B7H4結合的活性，與其它B7家族成員沒有交叉反應。經Fc改造後具有更強的ADCC效應，體內實驗呈現很好的抗腫瘤活性。其中PR003369經過親和力成熟改造後，具有更高的T細胞活化活性，具有更高的內化活性，更適合做ADC藥物。 2、本發明的B7H4×CD3雙特異性抗體，帶有人Fc片段的雙特異性抗體結構，保留了Fc與FcRn的結合作用，從而具有較長的半衰期。B7H4端採用ScFv的形式，簡化了輕重鏈的錯配，同時還保留了很好的穩定性和親水性。最適化了CD3端的活性，採用中等強度的抗CD3抗體，保證藥效的前提下降低了毒性。B7H4端和CD3端抗體具有良好的結合食蟹猴的活性。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例 1. 抗 B7H4 抗體分子的獲得
可以利用B7H4重組蛋白或過度表現B7H4的細胞對實驗動物進行免疫以獲得針對B7H4特異性結合的抗體分子，該實驗動物可以是小鼠、大鼠、兔、羊、駱駝等。通常，其得到的抗體分子是非人源的。在獲得非人源抗體後，需要對這些分子利用抗體工程技術進行人源化改造，以降低免疫原性並提高成藥性。然而，抗體的人源化過程有其技術複雜性，經過人源化改造的分子往往會降低對抗原的親和力。另一方面，基因轉殖技術的進步使得可以培育出基因工程化小鼠，其攜帶人免疫球蛋白免疫庫並使其內源的鼠的免疫庫缺失。Harbour H2L2小鼠(Harbour Antibodies BV)是一種攜帶人免疫球蛋白免疫庫的基因轉殖小鼠，這種基因轉殖小鼠產生的抗體具有全人源的序列，因而無需再進一步做人源化改造，大大提高了治療性抗體開發的效率。1.1. 小鼠免疫
用可溶的重組人B7H4-ECD-mFc融合蛋白(Sino Biological，#10738-H05H)作為抗原對Harbour H2L2小鼠進行多輪免疫。抗原蛋白與免疫佐劑混合成免疫原試劑，然後透過皮下經腹股溝注射或透過腹腔注射。在每一輪免疫中，每隻小鼠接受的總注射劑量是100微升。在首輪免疫中，每隻小鼠接受用50微克抗原蛋白與完全弗氏佐劑(Sigma，#F5881)以體積比1:1混合配製的免疫原試劑的免疫。在隨後的每輪增強免疫中，每隻小鼠接受用25微克抗原蛋白與Sigma Adjuvant System佐劑(Sigma，#S6322)混合配製的免疫原試劑的免疫。每輪增強免疫的間隔時間至少為兩周，通常為6到7輪增強免疫。免疫時間為第0、14、28、42、56、70、84、98天；並且在第49、77天，檢測小鼠血清抗體效價。在進行H2L2小鼠脾B細胞分離前5天，以每隻小鼠25微克抗原蛋白的劑量進行最後一次增強免疫。
或者用過度表現人B7H4的CHO-K1細胞(CHO-K1/hu B7H4，和鉑醫藥)轉染編碼小鼠CD40L的質體後，與免疫佐劑混合成免疫原試劑後免疫小鼠，每隻小鼠每次免疫5×106 細胞，免疫過程同蛋白免疫。1.2. 血清效價檢測
在特定的時間點，收取小鼠血清，用ELISA方法檢測血清中抗體結合B7H4蛋白的效價以及用FACS方法檢測血清中抗體結合過度表現B7H4的細胞的效價。
在ELISA方法中，用1 µg/mL的hB7H4-ECD-his蛋白(Sino Biological，#10738-H08H) 100µL/孔塗覆ELISA盤(corning，9018)，4℃培育過夜；洗滌2次後，用含1% BSA的PBST在37℃阻斷2小時；加入100 µL/孔梯度稀釋的血清37℃培育1小時；洗滌3次後，加入100 µL/孔1：5000稀釋的anti-rat-HRP (sigma，#A5795)，37℃培育30分鐘。洗滌3次後，加入100 µL/孔TMB基質培育約10分鐘，加入50 µL/孔1N HCl終止顯色，讀450 nm的吸光度(Molecular Devices, Plus 384)。
在FACS方法中，梯度稀釋的鼠血清與HEK293-B7H4細胞4°C培育1小時；細胞洗2次後，加入二抗anti rat IgG (H+L) (Life technologies, A11006) 4°C培育1小時，洗2次後，重新懸浮細胞用流式細胞儀檢測(BD, Flibur)。HEK293細胞作為背景值對照。1.3. 透過融合瘤技術篩選抗 B7H4 的抗體
選擇血清效價高的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞(ATCC, CRL-1581)進行電融合，細胞比例為4：1，電融合參數為V1：50V，t1：15s，V2：600V，t2：20 µs，t3：0.5s，n：1，t4：7s，V+/-：+，fade：on。細胞重新懸浮於含20% FBS和HT的DMEM的培養液中平盤培養1×105 /100 µL/孔，24小時後再加100 µL/孔含20% FBS和2×HT的DMEM繼續培養。後續取上清液檢測抗體效價。一般在融合後9-15天，蛋白免疫的小鼠取上清液用Acumen進行初篩，檢測與CHO-K1/huB7H4細胞的結合；細胞免疫的小鼠取上清液用Mirrorball (SPT Labtech, mirrorball® fluorescence cytometer)進行初篩，檢測與HEK-293/huB7H4細胞的結合。陽性的選殖株然後用ELISA和FACS進一步確認，檢測與過度表現人B7H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/huB7H4)、過度表現食蟹猴B7H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/cynoB7H4)、過度表現小鼠B7H4的CHO-K1細胞株(CHO-K1/mB7H4)的結合能力。陽性的孔用極限稀釋法進一步次選殖，再進一步用ELISA與FACS方法篩選。對人和猴B7H4結合較好的選殖株被挑選出來進行定序。1.4. 透過 B 細胞體外轉殖技術篩選抗 B7H4 的抗體
將小鼠的脾臟取出，研磨後用200目濾網進行過濾，單細胞懸浮液按照小鼠記憶性B細胞分選套組(Miltenyi, #130-095-838)進行分選。分選得到的細胞進行免疫螢光染色。
在流式細胞分選儀S3e上對B200陽性(BioLegend，#103227)、IgM陰性(BioLegend，#406506)、B7H4特異性陽性細胞(BioLegend，#405207)進行分選。分選獲得的細胞按照每孔5個細胞的密度培養在細胞培養96孔盤上，細胞培養盤上預先舖好輻射照過的EL4細胞作為飼養層細胞。
培養14天後收取培養上清液進行ELISA檢測，對於B7H4蛋白有結合活性的孔，將細胞取出進行RT-PCR (SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing (#634892), I-5™ 2×High-Fidelity Master Mix (#I5HM-5000)。擴增獲得的輕、重鏈透過overlap PCR拼接成scFv，在E. coli 中進行表現，表現上清液進行ELISA檢測，將陽性的選殖株進行定序。1.5. 抗 B7H4 抗體的序列分析和序列最適化
利用常規的定序手段獲得編碼抗體分子可變結構域的核苷酸序列以及對應的胺基酸序列。獲得3個單選殖株序列。在本實施例中，從免疫的Harbour H2L2小鼠得到的抗B7H4單株抗體分子可變結構域的序列是人源抗體序列，表1-1列出其生殖系基因分析和轉譯後修飾位址(PTM)分析。
蛋白質或多肽胺基酸鏈在細胞中轉譯合成後有時會引入化學修飾，稱為轉譯後修飾(PTM)。對於抗體而言，一些PTM的位址是非常保守的，例如，在人的IgG1抗體的恆定結構域的第297位元(EU編號)的保守的胺基酸天冬醯胺Asn通常會發生醣基化修飾形成醣鏈，而該醣鏈結構對於抗體結構和相關的效應物功能是至關重要的。但是，如果在抗體的可變結構域尤其是抗原結合區域(如CDR)中存在PTM，那麼這些PTM的存在有可能會對抗原的結合有較大的影響，也可能對抗體的物理化學性質帶來變化。例如，醣基化、脫醯胺、異構化、氧化等都可能增加抗體分子的不穩定性或異質性，從而增加抗體開發的難度和風險。因而避免一些潛在的PTM對於治療性抗體的開發是非常重要的。隨著經驗的積累，人們發現一些PTM是和胺基酸序列的組成尤其是相鄰胺基酸組成的“模式”是高度相關的，這樣使得可以從蛋白質的一級胺基酸序列預測出潛在的PTM。例如，N-x-S/T (第一位是天冬醯胺，第二位是非脯胺酸以外的任意胺基酸，第三位是絲胺酸或者蘇胺酸)的序列模式預測出N-連接醣基化位址。引起PTM的胺基酸序列模式有可能來源於生殖系基因序列，例如人生殖系基因片段IGHV3-33天然地在FR3區域存在醣基化模式NST；也可能來源於體細胞超突變。
可以透過胺基酸突變來破壞PTM的胺基酸序列模式，從而降低或者去除特定PTM的形成。根據抗體序列和PTM序列模式的不同，有不同的突變設計方法。一種方法是將“熱點”胺基酸(如NS模式中的N或S)替換成物理化學性質相似的胺基酸(如把N突變為Q)。如果PTM序列模式來源於體細胞超突變，而並不存在於生殖系基因序列中，那麼另一種方法可以是把該序列模式替換成對應的生殖系基因序列。實際操作中，對同一個PTM序列模式可能採用多種突變設計方法。
表1-2列出了對抗體PR001476和PR002037的序列進行胺基酸突變得到的新的抗體分子序列。表 1-1 抗 B7H4 抗體的生殖系基因分析和 PTM 位址分析
選殖株號 VH 生殖系 V 基因 VL 生殖系 V 基因 VH PTM VL PTM 重組抗體 重組抗體亞型
80C8-2E9 IGHV3-30 IGKV3-15 DG (HCDR2) NS (LCDR3) PR001476 人 IgG1
1025_B-1H11 IGHV1-69 IGKV3-15 C (LFR3) 無 PR002037 人 IgG1
1025_B-2A1 IGHV1-69 IGKV3-15 無 無 PR002038 人 IgG1
表 1-2 抗原結合蛋白序列的突變位址設計
初始抗體 變體 可變區突變 重組抗體亞型 Fc 突變
PR001476 PR002405 H:D54E; L:N92Q 人 IgG1
PR001476 PR002408 H:G55A; L:N92Q 人 IgG1
PR001476 PR002411 人 IgG1 S239D, I332E
PR001476 PR002418 H:G55A; L:N92Q 人 IgG1 S239D, I332E
PR001476 PR003369 H:G55A,G101A; L:N92R 人 IgG1 S239D, I332E
PR002037 PR002410 L:C87Y 人 IgG1
PR002037 PR002420 人 IgG1 S239D, I332E
PR002037 PR002421 L:C87Y 人 IgG1 S239D, I332E
1.6. PR001476 抗體親和力成熟
透過定點突變的方法對PR001476這個分子進行改造以提高其結合B7H4的親和力。此親和力成熟的方法分為兩輪。
第一輪，對PR001476這個分子的重鏈CDR3和輕鏈CDR3 (按照Chothia CDR定義)的胺基酸逐點掃描，建立多個胺基酸位置的單點飽和突變庫。對2飽和突變庫進行篩選，信號超過野生型2倍的陽性分子被挑出來定序，並對這些陽性分子進一步鑒定，根據其對人B7H4的結合能力，選出若干個突變熱點。
第二輪，將第一輪中飽和突變找到的熱點進行隨機組合，建立一個包含所有突變組合的序列庫。然後對組合庫進行篩選。陽性分子透過定序以及對人hB7H4的結合能力，選出若干個突變體。篩選出的突變體用對應的選殖株號來表示，例如：PR001476-R1-25B3、PR001476-R1-26D7等等。
突變體建構到哺乳動物表現載體進行蛋白的表現純化。然後運用FACS和Fortebio Octet測試突變體與B7H4的結合能力。表1-2中的PR003369為PR001476衍生出的優選的突變體。1.7. 重組抗體製備和理化性質特徵分析 1.7.1. 抗體的表現和純化
本實施例介紹了利用哺乳動物宿主細胞(例如，人胚腎細胞HEK293或中國倉鼠卵巢細胞CHO及其衍生細胞)、暫態轉染表現和親和捕捉分離等技術來製備抗體的一般方法。本方法適用於含有Fc區的目標抗體；目標抗體可以由一條或多條蛋白質多肽鏈組成；可以來源於一個或多個表現質體。
將抗體多肽鏈的胺基酸序列透過密碼子最適化方法轉換成核苷酸序列；合成編碼的核苷酸序列並選殖到與宿主細胞兼容的表現載體上。將編碼抗體多肽鏈的質體按照特定比例同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有正確折疊和多肽鏈組裝的重組抗體。具體地，將FreeStyle™ 293-F細胞(Thermo，#R79007)在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo，#A1383504)中擴大培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6-8×105 細胞/mL，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2×106 細胞/mL。準備30 mL培養的細胞。將編碼抗體多肽鏈的質體按照一定比例混合共計30 µg 質體(質體與細胞的比例為1 µg：1 mL)溶解於1.5 mL Opti-MEM減血清培養基(Thermo，#31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 mL Opti-MEM溶入1 mg/mL PEI (Polysciences，#23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS pH 7.4緩衝液平衡含有MabSelect™ (GE Healthcare，#71-5020-91)的重力管柱(Bio-Rad，#7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS緩衝液沖洗管柱，再用pH 3.5的0.1 M甘胺酸洗提目標蛋白，隨後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore，#UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液或者含有其他成分的緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo, NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。1.7.2. 利用 SEC-HPLC 分析蛋白純度和聚合體
本實施例使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚合體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm)連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS緩衝液將樣品以1.0 mL/分鐘的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。1.7.3. 利用 HIC-HPLC 分析蛋白純度和疏水性
使用分析型疏水性交互作用層析(HIC)來分析蛋白樣品的純度和疏水性。將分析型層析管柱TSKge1 Buty1-NPR (Tosoh Bioscience, 14947, 4.6 mm × 3.5 cm)連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。設定方法由16分鐘內從100%流動相A (20 mM組胺酸，1.8 M硫酸銨，pH 6.0)至100%流動相B (20 mM組胺酸，pH 6.0)的線性梯度，流速設定為0.7 mL/分鐘，蛋白樣品濃度1 mg/mL，進樣體積20 µl，檢測波長280 nm。採集後用ChemStation軟體對色譜圖進行積分並計算相關資料，生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。1.7.4. 利用 DSF 測定蛋白分子的熱穩定性
差示掃描螢光法(Differential Scanning Fluorimetry, DSF)是一種常用的高通量的測定蛋白質熱穩定性的方法。它使用即時螢光定量PCR儀器透過監測與去折疊的蛋白分子結合的染料的螢光強度的變化，來反應蛋白質的變性的過程，從而反應出蛋白分子的熱穩定性。本實施例利用DSF方法來測定蛋白分子熱變性溫度(Tm)。10 μg蛋白加入96-孔PCR盤(Thermo，#AB-0700/W)，接著加入2 μl 100×稀釋的染料SYPROTM (Invitrogen，#2008138)，然後加入緩衝液使得終體積為40 μl每孔。將PCR盤密封，放置於即時螢光定量PCR儀器(Bio-Rad CFX96 PCR System)，先於25℃培育5分鐘，然後以0.2℃/0.2分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃，在測試結束時將溫度降至25℃。使用FRET掃描模式並使用Bio-Rad CFX Maestro軟體進行資料分析並計算出樣品的Tm。1.8. 製備抗 B7H4 全人重組抗體
將1.3-1.6中得到的抗B7H4的全人源IgG抗體和最適化後抗體利用1.7.1所述方法進行製備並分析。表1-3和表1-4分別列出了小體積和大體積暫態表現純化的結果。另外，從現有文獻中得到抗B7H4抗體序列(表1-5)，在後續實驗中作為對照。表 1-3 抗 B7H4 抗體的表現
抗體 表現系統和體積 一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
PR001476 HEK293-F (50mL) 80.6 99.18
PR002037 HEK293-F (30mL) 17.3 100
PR002038 HEK293-F (30mL) 34.0 100
PR002408 HEK293-6E (40mL) 37.0 99.03
PR002411 HEK293-6E (40mL) 64.8 99.3
PR002418 HEK293-F (1.5mL) 26.7 未測
PR003369 HEK293-F (30mL) 6.6 100
PR002410 HEK293-6E (40mL) 173.5 98.65
PR002420 HEK293-6E (40mL) 5.7 99.16
PR002421 HEK293-F (1.5mL) 73.3 未測
表 1-4 抗 B7H4 抗體的表現
抗體 表現系統和體積 二步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
PR002418 Expi-CHOs (1000 mL) 229 99.45%
PR002421 Expi-CHOs (1000 mL) 276.9 99.01%
PR003369 Expi-CHOs (1000 mL) 111.7 99.09%
對照抗體2 Expi-CHOs (1000 mL) 180.8 95.17%
表 1-5 對照抗體相關資訊
對照抗體 抗體編號 說明
對照抗體1 PR000157 抗B7H4 IgG1抗體(來自專利WO2016040724A1)，又稱1D11.v1.9varC2
對照抗體2 PR002962 抗B7H4 IgG1抗體(來自專利WO2019040780A1)。在PR002961的基礎上在Fc區域做了位址突變以增強ADCC。
對照抗體3 PR002961 抗B7H4 IgG1抗體(來自專利WO2019040780A1)
1.9. 抗 B7H4 抗體序列與編號
在本發明中，上述所列CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見J Mol Biol 273:927-48,1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見表1-6。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。表 1-6 本申請抗體 CDR 定義方法
  Kabat Chothia Combined
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24-L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50-L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89-L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H35可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第35位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位址的情況(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)。
表1-7列出了本發明的抗B7H4抗體以及對照抗體分子的序列所對應的CDR、可變區和輕重鏈的序列編號。PR003366是利用PR002410的可變區序列建構的單鏈可變區(scFv)同源二聚體分子(scFv-Fc結構)。表 1-7 抗 B7H4 抗體的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000157 108 94 85 75 45 52 62 7 19 33
PR002961 116 104 92 82 48 54 68 12 25 37
PR002962 116 105 92 82 48 54 68 12 25 37
PR001476 109 95 87 77 47 54 64 9 21 35
PR002037 112 98 88 79 48 54 65 11 22 36
PR002038 113 98 89 79 48 55 66 11 22 36
PR002405 114 99 90 80 47 54 67 9 23 35
PR002408 114 100 90 81 47 54 67 9 24 35
PR002411 109 101 87 77 47 54 64 9 21 35
PR002418 114 102 90 81 47 54 67 9 24 35
PR003369 117 106 93 83 47 54 69 9 24 38
PR002410 115 98 91 79 48 54 65 11 22 36
PR002420 112 103 88 79 48 54 65 11 22 36
PR002421 115 103 91 79 48 54 65 11 22 36
PR003366   132 91 79 48 54 65 11 22 36
表1-8列出了本發明的抗B7H4抗體以及對照抗體分子的序列所對應框架區、Fv的序列編號。表 1-8 抗 B7H4 抗體的框架區和 Fv 序列編號表
抗體編號 鏈類型 Fv FWR1 FWR2 FWR3 FWR4
PR000157 重鏈 75 1 13 26 39
輕鏈 85 40 49 56 70
PR002961 重鏈 82 6 18 31 39
輕鏈 92 42 51 58 72
PR002962 重鏈 82 6 18 31 39
輕鏈 92 42 51 58 72
PR001476 重鏈 77 3 15 28 39
輕鏈 87 42 51 58 72
PR002037 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 88 43 51 59 73
PR002038 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 89 44 51 60 74
PR002405 重鏈 80 3 15 28 39
輕鏈 90 42 51 58 72
PR002408 重鏈 81 3 15 28 39
輕鏈 90 42 51 58 72
PR002411 重鏈 77 3 15 28 39
輕鏈 87 42 51 58 72
PR002418 重鏈 81 3 15 28 39
輕鏈 90 42 51 58 72
PR003369 重鏈 83 3 15 28 39
輕鏈 93 42 51 58 72
PR002410 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 91 43 51 61 73
PR002420 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 88 43 51 59 73
PR002421 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 91 43 51 61 73
PR003366 重鏈 79 5 17 30 39
輕鏈 91 43 51 61 73
PR000627 重鏈 76 2 14 27 39
輕鏈 86 41 50 57 71
PR001924 重鏈 78 4 16 29 39
輕鏈 86 41 50 57 71
PR001848 重鏈 78 4 16 29 39
輕鏈 86 41 50 57 71
PR003886 重鏈 84 2 14 32 39
輕鏈 86 41 50 57 71
表1-9列出了本發明的抗B7H4抗體以及對照抗體分子的序列所對應的CDR序列。表 1-9 抗 B7H4 抗體的 CDR 序列
編號 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
PR000157 GYTFTSY YPGGGY LAGSSYRGAMDS KASQGFNKYVA YTSTLQP LQYGDLLYA
PR002961 GGSIKSGSY YYSGS EGSYPNQFDP RASQSVSSNLA GASTRAT QQYHSFPFT
PR002962 GGSIKSGSY YYSGS EGSYPNQFDP RASQSVSSNLA GASTRAT QQYHSFPFT
PR001476 GFTFRSF SYDGSN GGGLRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYNSWPPLT
PR002037 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT
PR002038 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GDYIRAT QQYVDLPIT
PR002405 GFTFRSF SYEGSN GGGLRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYQSWPPLT
PR002408 GFTFRSF SYDASN GGGLRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYQSWPPLT
PR002411 GFTFRSF SYDGSN GGGLRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYNSWPPLT
PR002418 GFTFRSF SYDASN GGGLRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYQSWPPLT
PR003369 GFTFRSF SYDASN GGALRWYFAY RASQSISSNLG GASTRAT QQYRSWPPLT
PR002410 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT
PR002420 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT
PR002421 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT
PR003366 EDTFSSY APIFGT GGPYFDY RASQSVSSNLA GASTRAT QQYKNWPFT
PR000627 GFTFNTY RSKYNNYA HGNFGNSYVSWFAY RSSTGAVTTSNYAN GTNKRAP ALWYSNLWV
PR001924 GFTFSTY RSKYNNYA HGNFGNSYVSWFAY RSSTGAVTTSNYAN GTNKRAP ALWYSNLWV
PR001848 GFTFSTY RSKYNNYA HGNFGNSYVSWFAY RSSTGAVTTSNYAN GTNKRAP ALWYSNLWV
PR003886 GFTFSTY RSKYNNYA HGNFGNSYVSWFAY RSSTGAVTTSNYAN GTNKRAP ALWYSNLWV
實施例 2. FACS 檢測抗 B7H4 抗體結合 B7H4 的能力
本實施例是為了研究抗人B7H4的H2L2單抗體外結合人/食蟹猴/小鼠B7H4的活性。採用過度表現人B7H4的CHOK1細胞株(CHOK1/hu B7H4，和鉑醫藥)、過度表現食蟹猴B7H4的CHOK1細胞株(CHOK1/cyno B7H4，和鉑醫藥)、過度表現小鼠B7H4的CHOK1細胞株(CHOK1/m B7H4，和鉑醫藥)和高度表現人B7H4的細胞株SK-BR-3 (ATCC ® HTB-30)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化酶處理CHOK1/hu B7H4細胞、CHOK1/cyno B7H4細胞、CHOK1/m B7H4細胞或SK-BR-3細胞，並用含2% BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning，#3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-098, 1：500稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2%BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2%BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
抗體結合細胞表面的人B7H4、食蟹猴B7H4和小鼠B7H4，以及結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的匯總如下(表2-1、表2-2、表2-3)。其中親和力成熟變體PR003369與PR002418相比在腫瘤細胞的結合上有了明顯的提高(表2-3)。表 2-1 抗 B7H4 抗體 ( 初始抗體 ) 結合細胞表面的人 B7H4 、食蟹猴 B7H4 、小鼠 B7H4 以及結合腫瘤細胞 SK-BR-3 表面的 B7H4
CHOK1/hu B7H4 CHOK1/cyno B7H4 CHOK1/m B7H4 SK-BR-3
抗體 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM)
PR002037 1677000 3.196 1207000 3.301 750723 2.698 290692 3.527
PR002038 1146000 20.04 677326 24.76 ~ ~ 82832 85.62
PR001476 1412000 0.7552 971785 0.8861 230031 3.018 277576 0.4706
對照抗體1 1839000 1.943 1317000 2.057 857700 1.381 316232 1.175
表 2-2 抗 B7H4 抗體 ( 變體分子 ) 結合細胞表面的食蟹猴 B7H4 、小鼠 B7H4 以及結合腫瘤細胞 SK-BR-3 表面的 B7H4
CHOK1/cyno B7H4 CHOK1/m B7H4 SK-BR-3
抗體 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM) 最大 MFI EC50 (nM)
RP001476 1822000 1.097 353378 3.614 238962 0.367
PR002408 1852000 1.029 398460 1.678 248060 0.3531
PR002418 1790000 0.7985 398407 1.306 251781 0.3112
PR002037 1922000 2.382 1686000 2.57 256727 2.22
PR002410 1862000 2.077 1554000 2.385 245482 1.872
PR002421 1873000 2.048 1465000 1.988 242474 1.92
對照抗體1 1986000 2.095 1749000 1.728 265713 1.199
表 2-3 PR003369 與 PR002418 與腫瘤細胞的結合
  SK-BR-3
抗體 EC50 (nM) MFI 最大值
PR002418 1.116 162162
PR003369 0.4342 170835
初始抗體結合細胞表面的人B7H4的結果見圖1，結果顯示，PR001476、PR002037有較好的人B7H4結合活性，PR002038結合活性較差；PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體表現上清液結合細胞表面的人B7H4的結果見圖2，結果顯示，PR002037、PR001476的PTM變體/DE突變沒有明顯影響抗體與人B7H4的結合活性。初始抗體結合細胞表面的食蟹猴B7H4的結果見圖3，結果顯示，PR002037、PR001476有較好的食蟹猴B7H4交叉結合活性，PR002038交叉結合活性較差；PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合細胞表面的食蟹猴B7H4的結果見圖4，結果顯示，PR002037、PR001476的PTM變體/DE突變沒有明顯影響抗體與食蟹猴B7H4的交叉結合活性。初始抗體結合細胞表面的小鼠B7H4的結果見圖5，結果顯示，PR002037有較好的小鼠B7H4交叉結合活性，PR001476有較弱的小鼠B7H4交叉結合活性，PR002038無小鼠B7H4交叉結合活性；PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合細胞表面的小鼠B7H4的結果見圖6，結果顯示，PR002037、PR001476的PTM變體/DE突變抗體與其母代相比保持了相似的小鼠B7H4交叉結合活性。初始抗體結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果見圖7，結果顯示，PR002037、PR001476與腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4有較好的結合活性，PR002038結合活性較差；PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體上清液結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果見圖8，結果顯示，PR002037、PR001476的PTM變體/DE突變沒有明顯影響抗體與腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結合活性；PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果見圖9，結果顯示，PR002037、PR001476的PTM變體/DE突變抗體保持了與腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結合活性。其中PR001476的PTM變體/DE突變抗體與對照抗體1相比，有更強的結合活性(更低的EC50)；PR002418與PR001476的親和力成熟/DE突變抗體PR003369結合腫瘤細胞MDA-MB-468表面的B7H4的結果見圖10，結果顯示，親和力成熟變體PR003369與PTM變體PR002418相比與腫瘤細胞MDA-MB-468表面的B7H4的結合有明顯提高。實施例 3. ADCC 活性檢測
本實施例是為了研究抗人B7H4的H2L2單抗體外透過ADCC效應媒介NK細胞毒殺標靶細胞的活性。本實驗採用人PBMC作為效應細胞，高度表現B7H4的細胞株SK-BR-3、MDA-MB-468以及中度表現B7H4的細胞株HCC-1954作為標靶細胞。使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標靶細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50 μl完全培養基平衡。消化酶處理SK-BR-3、MDA-MB-468或HCC-1954細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105 /mL，平盤培養50 μl/孔於e-plate 96盤中，即2×104 /孔，37°C培養過夜。次日每孔加入新鮮50 μl含2×105 PBMC的培養液，隨後加入50 μl 4×的濃度梯度稀釋的抗體，抗體最高終濃度為10 nM，每個抗體共8個濃度，設置兩個重複。即時檢測標靶細胞的電導率，一般情況取4小時時間點的數據計算標靶細胞毒殺效率 = (1- 樣品/空白對照) × 100%。
PR001476及其PTM變體/DE突變抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性見圖11，結果顯示，Fc端的DE突變(PR002418)能明顯增強抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性；PR002037及其PTM變體/DE突變抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性見圖12，結果顯示，Fc端的DE突變(PR002421)能明顯增強抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性。PR002418、PR002421與來自FivePrime的對照抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性比較見圖13 (其中A為供體1，B為供體2數據)，結果顯示，PR002418與來自FivePrime對照抗體相比有相似的SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性，PR002421毒殺活性稍弱。PR003369、PR002418、RP002421與來自FivePrime的對照抗體2對MDA-MB-468，HCC-1954腫瘤細胞的ADCC毒殺活性比較見圖14 (其中A為MDA-MB-468，B為HCC-1954數據)，結果顯示，PR003369、PR002418、RP002421對MDA-MB-468，HCC-1954腫瘤細胞都有ADCC毒殺活性，且毒殺活性與B7H4表現成正相關，即在高度表現B7H4的MDA-MB-468細胞上毒殺活性更強，在中度表現B7H4的HCC-1954細胞上毒殺活性較弱。親和力成熟變體PR003369與PR002418，PR002421相比，進一步提高了ADCC毒殺活性。實施例 4. T 細胞活化活性檢測
為了檢測抗B7H4抗體阻斷T細胞免疫檢查點從而活化T細胞的功能，本實驗在HEK293T細胞上過度表現全長B7H4以及scFv形式的抗人CD3抗體OKT3作為人工抗原呈現細胞(HEK293T/OS8/hB7H4，北京康源)，使用人T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離T細胞，將人工抗原呈現細胞與T細胞共培養，檢測抗B7H4抗體對T細胞活化的作用。具體地，將HEK293T-OS8-hB7H4按1×104 /孔的密度平盤培養，培養過夜。分離人原代T細胞，按2×105 /100 μl/孔的密度加入HEK293T/OS8/hB7H4細胞中。隨後加入100 µL/孔，2×終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體，其中抗體最高終濃度為10 nM，每個抗體共6個濃度，設置兩個重複。培養3天後，收上清液，ELISA方法檢測IFN-γ的濃度。結果顯示PR003369，PR002418，PR002421與對照抗體都可以促進T細胞活化，其中親和力成熟變體PR003369比PTM變體PR002418以及對照抗體2在有更強的T細胞活化活性，其作用機制可能是阻斷了B7H4與其在T細胞上的未知受體之間的作用。抗B7H4抗體阻斷B7H4的免疫抑制信號從而活化T細胞的結果見圖15 (其中A為供體1，B為供體2)。實施例 5. 抗體內化實驗
使用Zenon pHrodo iFL IgG Labeling Reagents套組(Invitrogen，#Z25611)檢測抗體的內化。該試劑是一種帶螢光染料的二抗，在中性pH時不發出螢光，當結合一抗並隨抗體被內化到溶酶體，內化後在酸性pH環境下可自動發出明亮的螢光，可用FACS方法檢測。具體方法如下：收集SK-BR-3細胞，離心棄上清液後，用培養基重新懸浮細胞，調整細胞濃度為3×106 /mL。向96孔盤內加入細胞懸浮液，50 μl/孔，然後放入37℃恆溫培養箱內培育過夜。準備4×的待測抗體，最高濃度為40 nM (4×)，3倍稀釋，共8個稀釋度。準備4×的Zenon 溶液，將25 μl的待測抗體和25 μl的4× Zenon標記溶液混合在一起，室溫放置5分鐘。然後將50 μl標記過的抗體加入到含有細胞的96孔盤內，37℃恆溫培養箱內培育24小時。消化酶處理細胞，在流式細胞儀上讀取螢光值。結果表明，與對照抗體RP000014和其它抗體相比，PR003369具有最高的內化活性。抗B7H4抗體在SK-BR-3細胞上的內化結果見圖16。
使用a-HFc-CL-MMAF試劑(Moradec，#AH-102-AF)檢測抗體的內化。該試劑是一種帶毒性基團MMAF的二抗，當結合一抗並隨抗體被內化後在細胞內釋放毒性基團殺死標靶細胞，其機理類似於ADC的作用。具體方法如下：收集SK-BR-3細胞，離心棄上清液後，用培養基重新懸浮細胞，調整細胞濃度為1×105 /mL。向96孔盤內加入細胞懸浮液，50 μl/孔，然後放入37℃恆溫培養箱內培育過夜。準備4×的待測抗體，最高濃度為40 nM (4×)，5倍稀釋，共8個稀釋度。準備4×的MMAF溶液(4 μg/mL)。分別向含有細胞的96孔盤內加入25 μl的4×待測抗體和25 μl的4× MMAF溶液，37℃恆溫培養箱內培育72小時。向實驗孔內加入100 μl的CTG溶液，用酵素標示讀取儀讀取CTG發光訊號。圖17結果表明，與對照抗體RP000014和其它抗體相比，PR003369具有最高的內化媒介的細胞毒性活性。實施例 6. 抗體藥物偶聯 (ADC)
本實施例使用ADC偶聯技術將一種毒性基團MMAE交聯到抗B7H4抗體(PR003369抗體或者對照抗體1)上製備成ADC。產品的純度參數如下，HPLC檢測方法同1.7.2。表 6-1 抗 B7H4 的 H2L2 抗體的 ADC 製備
抗體 ADC 濃度 (mg/mL) DAR 儲存溶液 SEC-HPLC 純度 % 內毒素 EU/mg
PR003369-MMAE 2.66 4.4 PBS, pH7.2 97.05 ＜0.06
對照抗體1-MMAE 2.65 4.1 PBS, pH7.2 97.42 0.1
為了研究抗體在MMAE基團交聯後是否影響其對B7H4標的的結合活性，採用高度表現人B7H4的細胞株MDA-MB-468進行細胞位準上的抗體結合實驗，方法同實施例2。圖18結果顯示MMAE基團交聯基本沒有影響抗體對腫瘤細胞表面的B7H4結合活性。
為了研究抗體在MMAE基團交聯後是否影響其內化活性，使用Zenon pHrodo iFL IgG Labeling Reagents套組(Invitrogen，#Z25611)檢測抗體的內化。實驗方法同實施列5。圖19結果顯示MMAE基團交聯基本沒有影響抗體在腫瘤細胞上的內化活性。
本實施例是為了研究抗體MMAE基團交聯ADC的細胞毒殺活性。採用高度表現B7H4的細胞株MDA-MB-468作為標靶細胞，使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標靶細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50 μl完全培養基平衡。消化酶處理MDA-MB-468細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至1×105 /mL，平盤培養50 μl/孔於e-plate 96孔盤中，即5×103 /孔，37°C培養過夜。次日每孔加入100 μl 2×的濃度梯度稀釋的抗體，抗體最高終濃度為50 nM，每個抗體共8個濃度，設置兩個重複。即時檢測標靶細胞的電導率，一般情況取96小時時間點的數據計算標靶細胞毒殺效率 = (1- 樣品/空白對照) × 100%。圖20結果顯示親和力成熟變體PR003369-ADC比對照抗體1-ADC有更高的腫瘤細胞毒殺效率。實施例 7. 抗 B7H4 抗體與人 B7H4 重組蛋白的親和力測定 7.1. 用 SPR 方法測定親和力
將10×HBS-EP+(GE Healthcare，#BR-1006-69) 10倍稀釋後，作為實驗緩衝液。設置流速10 μl/分鐘，在晶片CM5 (GE Healthcare，#BR-1005-30)的4個通道上偶聯protein A：1)設置注入時間800 s，將50 mM NHS和200 mM EDC以1：1體積比新鮮混合後注入4個通道；2)用pH4.5的醋酸鈉(GE Healthcare , #BR-1003-50)將protein A稀釋至20 μg/mL，注入各通道800 s；3)注入1M pH8.5乙醇胺800 s，以封阻晶片表面剩餘的活性羧基。封阻後繼續用1×HBS-EP+緩衝液平衡儀器兩小時，protein A最終偶聯量約為2000 RU。
在Biacore T200設置多迴圈動力學模式，每個迴圈包括抗體的捕捉、分析物的結合以及晶片的再生。將抗體PR002418、PR002421、對照抗體1、對照抗體2均稀釋至1 μg/mL，以10 μl/分鐘的流速注入2、3、4通道30 s，由預先偶聯的Protein A捕捉各抗體，捕捉量約為160 RU。將人B7-H4 (Sino biological，#10738-H08H)依次按照0 nM、1.5625 nM、3.125 nM、6.25 nM、12.5 nM、25 nM、50 nM的濃度梯度注入四個通道(對於對照抗體1，增加了一個最高濃度100 nM)，流速設置為30 μl/分鐘。對PR002418、PR002421、對照抗體2設置解離時間200 s，對對照抗體1設置解離時間500 s，注入時間均設為180 s。最後以同樣流速注入10 mM甘胺酸-鹽酸pH 1.5 (GE Healthcare，#BR-1003-54) 30 s，以再生晶片。
用Biacore T200分析軟體2.0對實驗結果進行分析，1通道作為參考通道扣除，分析模型選用1：1動力學擬合模型。結果見表7-1和圖21的A-D，結果顯示PR002421有最高的蛋白親和力。表 7-1 抗 B7H4 抗體結合人 B7H4 蛋白的親和力 (SPR 方法 )
抗體 抗原 抗體濃度 (nM) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
PR002418 人B7H4 (his tag) 50 - 1.5625 2.01E+05 4.75E-03 2.37E-08
PR002421 人B7H4 (his tag) 50 - 1.5625 3.50E+05 3.22E-04 9.21E-10
對照抗體2 人B7H4 (his tag) 50 - 1.5625 2.61E+05 1.16E-03 4.45E-09
對照抗體1 人B7H4 (his tag) 100 - 3.125 4.04E+04 1.89E-04 4.67E-09
7.2. 用 BLI 方法測定親和力
將10×動力學緩衝液(ForteBio，#18-1105)稀釋至1×，用於親和力測試以及抗原、抗體的稀釋。透過生物膜干涉(BLI)技術，使用Octet Red 96e (Fortebio)分子相互作用分析儀來進行抗原抗體之間的結合動力學分析。
測定抗原和抗體的親和力時，感測器轉動速度為1000 轉/分鐘。先將置於一列的AHC感測器(Fortebio，#18-5060)在測試緩衝液中平衡10分鐘，然後用AHC感測器捕捉B7-H4抗體，捕捉高度0.7 nm；AHC感測器在緩衝液中平衡120 s後與2倍梯度稀釋的人B7-H4 (濃度為50-3.125 nM以及0 nM)結合180 s，解離300 s。最後將AHC感測器浸入10 mM甘胺酸-鹽酸pH 1.5溶液進行再生，以洗提結合在感測器上的蛋白。
使用Octet Data Analysis軟體(Fortebio，版本11.0)進行數據分析時，以0 nM為參照孔，扣除參照信號(reference subtraction)，選擇“1：1 Global fitting”方法進行數據擬合，計算出抗原與抗原結合蛋白結合的動力學參數，得到kon (1/Ms)值、kdis (1/s)值和KD (M)值(見表7-2)，結果顯示，親和力成熟變體PR003369與PR002418相比在蛋白親和力上有明顯的提高。表 7-2 抗 B7H4 抗體結合人 B7H4 蛋白的親和力 (BLI 方法 )
抗體 濃度 (nM) KD (M) kon(1/Ms) kdis(1/s) Full R^2
PR002418 50-12.5 1.03E-08 2.75E+05 2.84E-03 0.9926
PR003369 50-12.5 1.39E-09 2.83E+05 3.94E-04 0.9981
實施例 8. 利用 BLI 方法測定抗 B7H4 抗體結合 B7H4 的表位競爭
使用ForteBio Octet Red96e平臺對B7-H4抗體PR002418、PR002421、對照抗體1、對照抗體2進行表位競爭實驗，實驗緩衝液與上述相同。第一步，獲取抗體的100%訊號：用SA感測器(Fortebio，#18-5019)捕捉B7-H4 (Acro Biosystems，#B74-H82E2-200μg)，捕捉高度為0.25 nm。將感測器在緩衝液中平衡120 s後浸入稀釋至100 nM的各抗體中，時間240 s，將抗體與B7-H4結合的最終訊號記錄為該抗體的100%訊號。第二步，表位競爭實驗：用SA感測器捕捉B7-H4，捕捉高度為0.25 nm。將感測器浸入第一抗體中(濃度為100 nM)，時間240 s，再將SA感測器浸入第一抗體和第二抗體的混合物中(兩種抗體的終濃度均為100 nM)，時間240 s，將感測器浸入抗體混合物後的訊號差，記錄為該抗體作為第二抗體的訊號。抑制率透過下式計算， 抑制率(%) = ( A - B ) / A * 100 A：某抗體的100%訊號(從第一步中獲得)，B：該抗體作為第二抗體的訊號(從第二步獲得)。
若得到的抑制率大於85 (%)，則意味著兩種抗體的表位完全重疊；若抑制率小於85 (%)，則意味著兩種抗體結合的表位不完全重疊。
表8-1結果顯示PR002418與PR002421與B7-H4的結合表位不同，且都與對照抗體1、對照抗體2的表位不同。其中PR002418結合一個獨特的表位(第一表位)，PR002421結合另一個表位(第二表位)，對照抗體1，對照抗體2結合相同的表位(第三表位)。表 8-1 抗體結合 B7H4 競爭性分析
競爭性抑制率 (%) 2nd Ab
PR002418 PR002421 對照抗體 2 對照抗體 1
1st Ab PR002418 94.91 7.23 8.15 11.19
PR002421 7.12 94.77 10.62 10.78
對照抗體2 4.49 6.32 95.75 96.57
對照抗體1 4.55 1.97 94.58 95.31
實施例 9. 與 B7 家族其它成員的交叉反應性
將B7家族的蛋白(詳見表9-1)分別用PBS稀釋為1 μg/mL，加至96孔盤(Corning，#9018)中，每孔100 μl，4℃下培育過夜。棄去液體後用PBST緩衝液(pH 7.4，含0.05% tween-20)洗盤3次，加入250 μl 2% BSA封阻液，37℃條件下培育1小時。棄去封阻液，並用PBST緩衝液(pH7.4，含0.05%吐溫-20)洗盤3次，將待測抗原結合蛋白，稀釋成10 nM和1 nM 2個濃度，每個孔加入100 μl，37℃培育1小時，同型抗體作為對照。PBST緩衝液(pH7.4，含0.05% 吐溫-20)清洗3次後，加入稀釋5000倍的羊抗人F(ab')₂ HRP二抗(Jackson ImmunoResearch，109-035-097)，37℃條件下，避光培育1小時。PBST緩衝液(pH 7.4，含0.05% tween-20)清洗3次後，添加100 µl/孔TMB (Biopanda，#TMB-S-003)，室溫避光放置約30分鐘；每孔加入50µl/孔終止液(BBI life sciences，#E661006-0200)終止反應，置酵素標示讀取儀(PerkinElemer，#Enspire)中測定450 nm吸光度(OD450)值。圖22說明本發明的抗體不與B7家族其它成員蛋白發生交叉反應。表 9-1 本實施例所使用的 B7 家族蛋白的材料資訊
B7 家族其它成員 供應商 目錄號
Human B7-1 / CD80 Protein, Fc Tag (HPLC-verified) Acro B71-H5259
Human B7-2 / CD86 Protein, Fc Tag Acro CD6-H5257
Human B7-DC/PD-L2/CD273 Protein, Recombinant (Fc Tag) Sino Biological H10292-H02H
Human PD-L1 / B7-H1 Protein, His Tag (HPLC verified) Acro PD1-H5229
CD275/ICOS ligand Protein, Human, Recombinant (Fc Tag) Sino Biological 11559-H02H
B7-H3/CD276 Protein, Human, Recombinant (ECD, Fc Tag) Sino Biological 11188-H02H
Recombinant human B7H4 Fc Chimera R&D 8870-B7-050
Recombinant human VISTA/B7H5/PD-1H Fc Chimera R&D 7126-B7-050
B7-H6 /NCR3LG1 Protein, Human, Recombinant (Fc Tag) Sino Biological 16140-H02H
Recombinant human B7H7/HHLA2 Fc Chimera R&D 8084-B7-050
實施例 10. 血清穩定性分析
取30 μl抗體稀釋到270 μl正常人血清中(血清濃度90%)，抗體分成5份，分別放入37℃培育0，1，4，7，14天，取出用液態氮速凍後，保存於-80℃。流式方法檢測抗體對SK-BR-3細胞上的B7H4的結合。
消化酶處理SK-BR-3或CHOK1/h B7H4細胞，並用含2% BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning，#3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-098，1：500稀釋)，4℃，避光培育60分鐘。用100 µL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2% BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。圖23結果顯示抗B7H4抗體PR002418、PR002037、PR003369以及對照抗體1、對照抗體2在37°C人血清中14天具有很好的穩定性。實施例 11. 在 C57BL/6 小鼠體內的藥代動力學
選取體重18~22克的雌性Nu/Nu小鼠6隻，按20 mg/kg的劑量透過尾靜脈注射給與藥物；一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後在4℃下以2,000 rpm離心5分鐘並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。本實施例採用ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA Fc端總體檢測方法，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的融合蛋白，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)對血藥濃度數據進行分析以評估其藥代動力學。
表11-1為PR002418、PR002421和對照抗體2 (PR002962)的藥代動力學參數。圖24的結果表明，在Fc端總體檢測方法下，從前14天的數據計算，PR002418在小鼠體內的半衰期約為6.56天，PR002421在小鼠體內的半衰期約為6.64天，對照抗體2在小鼠體內的半衰期約為5.90天。該結果表明，PR002418和PR002421在小鼠體內的半衰期略長於對照抗體2。表 11-1 抗 B7H4 抗體的藥代動力學參數
PK 參數 PR002421 PR002418 PR002962
T1/2 (hr) 159.3 157.5 141.5
Vd (mL/kg) 93.3 89.3 93.3
AUCall (µg/mL hr) 36,710 37,786 33,913
Cl (mL/hr/kg) 0.42 0.41 0.48
C0 (µg/mL) 437.9 387.6 440.4
實施例 12. 抗 B7H4 抗體的抗腫瘤藥效 12.1. BALB/c nude 小鼠 MDA-MB-468 腫瘤模型
細胞接種當天每隻BALB/c nude小鼠皮下接種1×107 MDA-MB-468腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1：1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在135 mm3 進行分組，25隻小鼠被分為5組，給藥週期為每週2次，共進行了12次給藥，腹腔給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 ) = 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。給藥後第39天結束實驗，所有小鼠進行安樂處理。
BALB/c nude小鼠MDA-MB-468腫瘤模型的體內抗瘤效果參見圖25，具體地，溶媒對照組小鼠在給藥後第39天平均腫瘤體積為1054 mm3 。測試藥PR002418 (5 mg/kg)治療組在給藥後第39天平均腫瘤體積為606 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.015)，腫瘤抑制率TGI (%)為42.45%。測試藥PR002418 (15 mg/kg)治療組在給藥後第39天平均腫瘤體積為532 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.007)，腫瘤抑制率TGI (%)為49.47%。測試藥PR002421 (5 mg/kg)治療組在給藥後第39天平均腫瘤體積為665 mm3 ，相較溶媒對照組無顯著性差異(p值為0.07)，腫瘤抑制率TGI (%)為36.86%。測試藥PR002421 (15 mg/kg)治療組在給藥後第39天平均腫瘤體積為335 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.018)，腫瘤抑制率TGI (%)為68.23%。12.2. NSG 小鼠重建人 PBMC 免疫系統的 MDA-MB-468 腫瘤模型
細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5×106 MDA-MB-468腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1：1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在126 mm3 進行分組，30隻小鼠被分為5組，每隻小鼠靜脈接種5×106 人的PBMC，細胞重新懸浮在200 μl PBS中。次日開始給藥，給藥週期為一周兩次，共進行了8次給藥，腹腔給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 ) = 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。給藥後第36天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂死處理。
NSG小鼠重建人PBMC免疫系統的MDA-MB-468腫瘤模型的體內抗瘤效果參見圖26，具體地，溶媒對照組小鼠在給藥後第36天平均腫瘤體積為942 mm3 。測試藥PR002418 (15 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為585 mm3 ，相較溶媒對照組無顯著性差異(p值為0.073)，腫瘤抑制率TGI (%)為37.91%。測試藥PR002421 (15 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為670 mm3 ，相較溶媒對照組無顯著性差異(p值為0.200)，腫瘤抑制率TGI (%)為28.87%。測試藥PR003369 (15 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為354 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.008)，腫瘤抑制率TGI (%)為62.38%。測試藥對照抗體2 (15 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為533 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.028)，腫瘤抑制率TGI (%)為43.41%。實施例 13. 免疫組織化學染色 (IHC)
病理組織晶片購買自桂林泛譜生物技術有限公司。包括BRC1021乳癌組織晶片、EMC1021子宮內膜癌組織晶片、OVC1021卵巢癌組織晶片、MNO1021正常組織晶片。石蠟切片為4 μm厚度，帶上陽性對照組織。脫蠟，水洗；抗原修復：PH 6 (檸檬酸)，125℃加熱5分鐘，悶10分鐘，後在室溫冷卻30分鐘；水洗後用0.3%過氧化氫5分鐘，然後用TBST沖洗3次5分鐘；Dako封阻液直接使用，在室溫內用培養箱封阻20分鐘；甩去封阻液，上一抗，抗體稀釋液為Dako直接使用，在室溫內用培養箱培育60分鐘，Rabbit IgG替代對照；TBST洗三次，每次五分鐘；二抗，Anti-Rabbit (EnVision+System-HRP Labelled Polymer)，在室溫內用培養箱培育30分鐘；TBST洗三次，每次五分鐘；DAB顯色，0.85 mL蒸餾水，按照試劑ABC順序加入試劑各50 μl，在室溫內用培養箱培育5分鐘；蒸餾水清洗，用蘇木素複染。顯微鏡下觀察、封片、讀片。
圖27結果顯示，B7H4在正常組織的腎上腺、腎皮質、膀胱、乳腺、輸卵管、食道、輸尿管和子宮內膜有輕微的表現，在其它組織中未見表現(圖27，A)。相反，在乳癌、卵巢癌和子宮內膜瘤上高度表現(圖27，B)。比如在卵巢癌中，IHC評分在2-4分的占102個總樣品的67.65%，在子宮內膜瘤中，IHC評分在2-4分的占98個總樣品的62.24% (圖27，C)。實施例 14. B7H4 × CD3 雙特異性抗體的結構和設計
所選的抗B7H4抗體和抗CD3抗體用於製備雙特異性抗體。這種B7H4×CD3雙特異性抗體的製備雙抗可以同時結合兩個標的，其中一端可以辨識腫瘤細胞表面特異表現的B7H4，而另一端可以結合T細胞上的CD3分子。當B7H4×CD3雙抗分子結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並活化腫瘤細胞附近的T細胞，從而殺死腫瘤細胞。
圖28的A與B為“1+1” Fab-Fc-scFv非對稱結構分子；C與D為具有“1+1” Fab-Fc-crossFab非對稱結構的B7H4×CD3 雙抗分子。對於“1+1”非對稱結構分子，結構(1)和(2)涉及三條蛋白鏈，其分別包含對應抗B7H4抗體的重鏈及輕鏈，以及上述抗CD3抗體的scFv多肽鏈(見圖28，A和B)。對於“1+1”非對稱結構分子，結構(3)和(4)涉及四條蛋白鏈，其分別包含對應抗B7H4抗體的重鏈及輕鏈，以及上述抗CD3抗體的重鏈及輕鏈(見圖28，C和D)。
E與F、G與H、I與J為具有“2+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子。對於“2+1”非對稱結構分子，結構(5)和(6)涉及四條蛋白鏈，其分別包含對應抗B7H4抗體的重鏈及輕鏈，以及上述抗CD3抗體的重鏈及輕鏈(見圖28，E和F)。對於“2+1”非對稱結構分子，結構(7)(8)和(9)(10)涉及三條蛋白鏈，其分別包含對應抗B7H4抗體的重鏈及輕鏈，以及上述抗B7H4和CD3抗體的scFv的多肽鏈(見圖28，G、H、I和J)。
為了將具有錯配的重鏈(例如抗CD3抗體的兩條重鏈錯配)的副產物形成最小化，使用了突變的異源二聚體Fc區，其攜帶“knob-hole”突變和改造的二硫鍵，如WO2009080251和WO2009080252中所述。B7H4×CD3雙特異性抗體具有IgG1的Fc，並在Fc的CH3上攜帶L234A、L235A及P329G (根據EU索引編號)突變。透過同時共轉染三個或四個不同的哺乳動物表現載體產生每一個雙特異性抗體，分別編碼：1)對應的抗B7H4抗體的重鏈，其在Fc區攜帶“Hole”突變以產生異源二聚體抗體，Fc的CH3攜帶L234A、L235A和P329G突變。2)對應的抗CD3抗體的重鏈，其在Fc區攜帶“knob”突變以產生異源二聚體抗體，Fc的CH3攜帶L234A、L235A、P329G突變。3)對應的抗CD3抗體的輕鏈。4)對應的抗B7H4抗體的輕鏈。人IgG1 Fc區的“knob”突變由以下組成：T366W，“Hole”突變由以下組成：T366S、L368A、Y407V。此外，可以包括“knob” Fc區的S354C和“Hole” Y349C形成一對二硫鍵以增加穩定性和異源二聚體抗體產量。
表14-1、表14-2和表14-3列出了本實施例所建構的B7H4×CD3雙抗分子，表中的結構編號對應於圖28。表14-4為連接胜肽的序列。表14-5列出了CD3單抗分子所對應的序號。B7H4單抗分子來源於表1-7。表14-6列出了B7H4×CD3雙抗分子所對應的序號。表14-7列出了雙抗分子的第一和第二抗原結合結構域相應的CDR序列的序列編號。表 14-1 具有 “1+1” Fab-Fc-scFv 非對稱結構的 B7H4 × CD3 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體 B7H4 抗體 CD3 端結構 B7H4 端結構 連接胜肽 (VL_B 和 VH_B 之間 ) CD3 端的 Fc 類型 ( 突變 ) B7H4 端的 Fc 類型 ( 突變 )
1 PR002849 PR000627 PR001476 scFv(VL-VH) Fab GS_15 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
1 PR002850 PR000627 PR002405 scFv(VL-VH) Fab GS_15 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
1 PR002851 PR000627 PR002408 scFv(VL-VH) Fab GS_15 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
1 PR002852 PR000627 PR002410 scFv(VL-VH) Fab GS_15 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
1 PR003733 PR001848 PR002037 Fab scFv(VL-VH) GS_20 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
1 PR003899 PR003886 PR002037 Fab scFv(VL-VH) GS_20 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
表 14-2 具有 “1+1” Fab-Fc-crossFab 非對稱結構的 B7H4 × CD3 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體 B7H4 抗體 CD3 端結構 B7H4 端結構 CD3 端的 Fc 類型 ( 突變 ) B7H4 端的 Fc 類型 ( 突變 )
4 PR002855 PR001924 PR001476 Fab(cross Fd/LC) Fab 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
4 PR002856 PR001924 PR002405 Fab(cross Fd/LC) Fab 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
4 PR002857 PR001924 PR002408 Fab(cross Fd/LC) Fab 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
4 PR002858 PR001924 PR002410 Fab(cross Fd/LC) Fab 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
表 14-3 具有 “2+1” 非對稱結構的 B7H4 × CD3 雙抗分子
結構編號 雙抗分子 CD3 抗體 B7H4 抗體 CD3 端結構 B7H4 端結構 B7H4 端在結構圖例中的代號 (A / B) CD3 端的 Fc 類型 ( 突變 ) B7H4 端的 Fc 類型 ( 突變 )
6 PR002994 PR001924 PR001476 Fab Fab B 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
5 PR002987 PR001924 PR001476 Fab(cross Fd/LC) Fab B 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
7 PR003001 PR000627 PR001476 scFv(VL-VH) Fab B 人 IgG1 (knob, AAG) 人 IgG1 (hole, AAG)
9 PR003008 PR000627 PR001476 scFv(VL-VH) Fab B 人 IgG1 (knob, LALA) 人 IgG1 (hole, LALA)
表 14-4 連接胜肽序列
連接胜肽名字 長度 序列  
GS_5 5 GGGGS SEQ ID NO：133
GS_15 15 GGGQSGQGGSGGGGS SEQ ID NO：134
GS_20 20 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO：135
表 14-5 本實施例的 CD3 抗體的序列編號表
抗體編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000627 131 86 76 46 53 63 8 20 34
PR001924 111 97 86 78 46 53 63 10 20 34
PR001848 110 96 86 78 46 53 63 10 20 34
PR003886 110 107 86 84 46 53 63 10 20 34
表 14-6 本實施例的 B7H4 × CD3 雙抗分子的序列編號表
抗體編號 多肽鏈 -1 多肽鏈 -2 多肽鏈 -3 多肽鏈 -4
PR002849 109 118 119
PR002850 114 120 119
PR002851 114 121 119
PR002852 115 122 119
PR002855 97 123 118 109
PR002856 97 123 120 114
PR002857 97 123 121 114
PR002858 97 123 122 115
PR002987 97 124 118 109
PR002994 97 125 118 109
PR003001 126 118 109
PR003008 127 118 109
PR003733 110 128 129
PR003899 110 130 129
表 14-7 B7H4 × CD3 雙抗分子的抗原結合結構域的 CDR 的序列編號表
結構編號 抗體編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
1 PR002849 #1 46 53 63 8 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
1 PR002850 #1 46 53 63 8 20 34
#2 47 54 67 9 23 35
1 PR002851 #1 46 53 63 8 20 34
#2 47 54 67 9 24 35
1 PR002852 #1 46 53 63 8 20 34
#2 48 54 65 11 22 36
1 PR003733 #1 46 53 63 10 20 34
#2 48 54 65 11 22 36
1 PR003899 #1 46 53 63 10 20 34
#2 48 54 65 11 22 36
4 PR002855 #1 46 53 63 10 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
4 PR002856 #1 46 53 63 10 20 34
#2 47 54 67 9 23 35
4 PR002857 #1 46 53 63 10 20 34
#2 47 54 67 9 24 35
4 PR002858 #1 46 53 63 10 20 34
#2 48 54 65 11 22 36
5 PR002987 #1 46 53 63 10 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
6 PR002994 #1 46 53 63 10 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
7 PR003001 #1 46 53 63 8 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
9 PR003008 #1 46 53 63 8 20 34
#2 47 54 64 9 21 35
表 14-8 B7H4 × CD3 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 一步純化後產量 (mg/L) SEC-HPLC 純度 (%)
1 PR002849 HEK293F (30mL) 32.5 84.69
1 PR002850 HEK293F (30mL) 19.7 84.1
1 PR002851 HEK293F (30mL) 23.1 83.56
1 PR002852 HEK293F (30mL) 20.7 86.73
1 PR003733 ExpiCHO (1000mL) 361 86.33
1 PR003899 ExpiCHO (1000mL) 375.4 80.94
4 PR002855 HEK293F (30mL) 52.2 73.08
4 PR002856 HEK293F (30mL) 28.8 72.03
4 PR002857 HEK293F (30mL) 27.2 78.06
4 PR002858 HEK293F (30mL) 57.5 91.2
6 PR002994 HEK293F (30mL) 20.1 51.76
5 PR002987 HEK293F (30mL) 17.7 81.48
7 PR003001 HEK293F (30mL) 21 90.49
9 PR003008 HEK293F (30mL) 17 86.17
實施例 15. FACS 檢測 B7H4 × CD3 雙抗結合 B7H4 的能力
消化酶處理SK-BR-3細胞。使用人T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離T細胞。用含2% BSA的PBS重新懸浮。將細胞密度分別調整為1×106 細胞/mL。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning，#3894)，隨後加入100 µL/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。之後，加入100 µL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µL/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson, #109-545-098, 1：500稀釋)，4℃，避光培育1小時。用100 µL/孔預冷含2% BSA的PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µL/孔預冷含2% BSA的PBS重新懸浮細胞，使用ACEA Novocyte3000流式細胞儀讀取螢光發光訊號值。
“1+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子結合SK-BR-3細胞的結果見圖29，A-C。結果顯示，雙抗分子與腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4有較好的結合活性。圖29A為抗B7H4端為Fab結構，抗CD3端為ScFv多肽鏈的雙抗分子的結合活性，其中抗B7H4端來源於PR001476及其PTM突變體抗體的ScFv多肽鏈的雙抗分子PR002849、PR002850和PR002851比抗B7H4端來源於PR002037 PTM突變體抗體的ScFv多肽鏈的雙抗分子PR002852有更強的結合活性；圖29B為抗B7H4端為Fab結構，抗CD3端為Cross Fab結構的雙抗分子的結合活性，其中抗B7H4端來源於PR001476及其PTM突變體抗體的雙抗分子PR002855、PR002856和PR002857比抗B7H4端來源於PR002037 PTM突變體抗體的雙抗分子PR002858有更強的結合活性；圖29C為抗B7H4端為ScFv多肽鏈，抗CD3端為Fab結構的雙抗分子的結合活性，由於PR003733與PR003899在抗B7H4端為相同的ScFv多肽鏈，其結合活性一致。“2+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子結合SK-BR-3細胞的結果見圖29，D。結果顯示，2價的抗B7H4端也有很高的結合活性。“1+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子結合人T細胞的結果見圖29，E-G；“2+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子結合人T細胞的結果見圖29，H。結果顯示，抗CD3端為Fab結構或ScFv多肽鏈都可以結合在T細胞表面，而弱抗CD3端的雙抗分子PR003899在FACS位準無法看到結合。實施例 16. T 細胞毒殺實驗
本實驗採用人原代T細胞作為效應細胞，高度表現B7H4的細胞株SK-BR-3，或MDA-MB-468，B7H4中表現的細胞株HCC-1954或B7H4陰性的細胞株MDA-MB-231作為標靶細胞。使用ACEA公司的RTCA儀器檢測標靶細胞的電導率反應毒殺效率。96孔盤e-plate先用50 μl完全培養基平衡。消化酶處理標靶細胞，重新懸浮於含10%胎牛血清的RPM1640完全培養基中，稀釋至4×105 /mL，平盤培養50 μl/孔於e-plate 96孔盤中，即2×104 /孔、37℃培養過夜。次日使用美天妮T細胞分離套組(Miltenyi，#130-096-535)按說明書的方法分離原代T細胞。每孔加入新鮮50 μl含2×105 T細胞的培養液，隨後加入50 μl 4×的濃度梯度稀釋的抗體，抗體最高終濃度為10 nM，每個抗體共8個濃度，設置兩個重複。即時檢測標靶細胞的電導率，一般情況取24小時時間點的數據計算標靶細胞毒殺效率 = (1- 樣品/空白對照) × 100%。24小時收上清液，ELISA方法檢測IFN-γ的濃度。ELISA檢測方法參照IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit (Thermo，#88-7316-77)套組操作說明。
其中，“1+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子活化T細胞並毒殺標靶細胞SK-BR-3的結果見圖30，A-K。圖30的A、B為抗B7H4端為Fab結構，抗CD3端為ScFv多肽鏈的雙抗分子的毒殺活性和細胞激素IFN-γ的產生，其中抗B7H4端來源於PR002037 PTM突變體抗體的ScFv多肽鏈的雙抗分子PR002852有最強的毒殺活性和細胞激素IFN-γ產生。圖30的C、D為抗B7H4端為Fab結構，抗CD3端為Cross Fab結構的雙抗分子的毒殺活性和細胞激素IFN-γ的產生，其中抗B7H4端來源於PR002037 PTM突變體抗體的雙抗分子PR002852有最強的毒殺活性和細胞激素IFN-γ產生。圖30的E、F為抗B7H4端為ScFv多肽鏈，抗CD3端為Fab結構的雙抗分子的毒殺活性和細胞激素IFN-γ的產生，具有強CD3端的雙抗分子PR003733與弱的CD3端雙抗分子PR003899相比，其毒殺活性和細胞激素IFN-γ的產生均高於後者。圖30的G-L為比較PR003733與PR003899在其它腫瘤細胞MDA-MB-468、HCC-1954和MDA-MB-231上的毒殺活性和細胞激素分泌，結果顯示PR003733在MDA-MB-468、HCC-1954細胞的體外毒殺以及細胞激素IFN-γ的產生上均高於PR003899；MDA-MB-231為不表現B7H4的陰性對照細胞，兩個抗體均沒有任何作用。“2+1”非對稱結構的B7H4×CD3雙抗分子活化T細胞並毒殺標靶細胞SK-BR-3的結果見圖30，M-N。“2+1”非對稱結構的雙抗分子均可以毒殺SK-BR-3細胞並產生細胞激素IFN-γ，且抗CD3端為Cross Fab結構的雙抗分子PR003001、PR003008比抗CD3端為ScFv多肽鏈的雙抗分子PR002987、PR002994有更強的毒殺活性和細胞激素IFN-γ產生。實施例 17. NSG 小鼠重建人 PBMC 免疫系統的腫瘤模型
細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5×106 MDA-MB-468腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1：1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在126 mm3 進行分組，18隻小鼠被分為3組，每隻小鼠靜脈接種5×106 人的PBMC，細胞重新懸浮在200 μl PBS中。次日開始給藥，給藥週期為一週一次，共進行了3次給藥，靜脈給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 ) = 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。給藥後第36天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂處理。
溶媒對照組小鼠在給藥後第36天平均腫瘤體積為942mm3 。測試藥PR003733 (2 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為590 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.048)，腫瘤抑制率TGI (%)為37.31%。測試藥PR003899 (2 mg/kg)治療組在給藥後第36天平均腫瘤體積為0 mm3 ，腫瘤完全消退，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0001)，腫瘤抑制率TGI (%)為100% (參見圖31，A)。
在HCC-1954模型中，細胞接種當天每隻NCG小鼠皮下接種5×106 HCC-1954腫瘤細胞，細胞重新懸浮在PBS與Matrigel (1：1)混合液中(0.1 mL/隻)，皮下接種。當小鼠平均瘤體積在102 mm3 進行分組，15隻小鼠被分為3組，每隻小鼠靜脈接種3×106 人的PBMC，細胞重新懸浮在200 μl PBS中。次日開始給藥，給藥週期為一週一次，共進行了2次給藥，靜脈給藥。開始給藥後，每週稱量體重及瘤體積兩次，瘤體積計算方式為：腫瘤體積(mm3 ) = 0.5 × 腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2 。給藥後第16天結束實驗觀察，隨後所有小鼠進行安樂處理。
溶媒對照組小鼠在給藥後第16天平均腫瘤體積為622 mm3。測試藥PR003733 (0.5 mg/kg)治療組在給藥後第16天平均腫瘤體積為450 mm3 ，相較溶媒對照組無顯著性差異(p值為0.1)，腫瘤抑制率TGI (%)為27.64%。測試藥PR003899 (0.5 mg/kg)治療組在給藥後第16天平均腫瘤體積為322 mm3 ，相較溶媒對照組有顯著性差異(p值為0.0028)，腫瘤抑制率TGI (%)為48.27% (參見圖31，B)。
兩個腫瘤模型的藥效實驗均顯示，PR003899的藥效要好於PR003733。
圖1為初始抗體結合細胞表面的人B7H4的結果； 圖2為PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體表現上清液結合細胞表面的人B7H4的結果； 圖3為初始抗體結合細胞表面的食蟹猴B7H4的結果； 圖4為PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合細胞表面的食蟹猴B7H4的結果； 圖5為初始抗體結合細胞表面的小鼠B7H4的結果； 圖6為PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合細胞表面的小鼠B7H4的結果； 圖7為初始抗體結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果； 圖8為PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體上清液結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果； 圖9為PR001476與PR002037及其PTM變體/DE突變抗體結合腫瘤細胞SK-BR-3表面的B7H4的結果； 圖10為PR002418與PR001476親和力成熟/DE突變抗體PR003369結合腫瘤細胞MDA-MB-468表面的B7H4的結果； 圖11為PR001476及其PTM變體/DE突變抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性； 圖12為PR002037及其PTM變體/DE突變抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性； 圖13為PR002418、PR002421與來自FivePrime的對照抗體對SK-BR-3腫瘤細胞的ADCC毒殺活性比較； 圖14為PR003369、PR002418、RP002421與來自FivePrime的對照抗體2對MDA-MB-468，HCC-1954腫瘤細胞的ADCC毒殺活性比較； 圖15為抗B7H4抗體阻斷B7H4的免疫抑制信號從而活化T細胞的結果； 圖16為抗B7H4抗體在SK-BR-3細胞上的內化結果； 圖17為抗B7H4抗體內化媒介的細胞毒性的活性； 圖18為MMAE基團交聯對抗體在腫瘤細胞表面的B7H4結合活性的影響； 圖19為MMAE基團交聯對抗體在腫瘤細胞上的內化活性的影響； 圖20為親和力成熟變體PR003369-ADC和對照抗體PR000157-ADC的腫瘤細胞毒殺效率； 圖21為Biacore T200分析軟體2.0對抗體親和力數據的分析； 圖22為抗B7H4抗體與B7家族其它成員蛋白發生交叉反應的情況； 圖23為抗B7H4抗體PR002418、PR002037、PR003369以及對照抗體在37°C人血清中14天的穩定性； 圖24為PR002418和PR002421及對照抗體2在小鼠體內的半衰期； 圖25為抗B7H4單抗分子在BALB/c nude小鼠MDA-MB-468腫瘤模型的體內抗瘤效果； 圖26為抗B7H4單抗分子在NSG小鼠重建人PBMC免疫系統的MDA-MB-468腫瘤模型的體內抗瘤效果； 圖27為B7H4在正常組織(A)和腫瘤(B)中的表現及其IHC評分統計(C)； 圖28為B7H4×CD3雙抗分子的結構示意圖； 圖29為B7H4×CD3雙抗分子結合SK-BR-3細胞(A-D)和T細胞(E-H)的結果； 圖30為B7H4×CD3雙抗分子(A-L，“1+1”非對稱結構；M-N，“2+1”非對稱結構)活化T細胞並毒殺標靶細胞的結果； 圖31為B7H4×CD3雙抗分子在NSG小鼠重建人PBMC免疫系統的腫瘤模型(A，MDA-MB-468模型；B，HCC-1954模型)的腫瘤抑制率。

Claims (22)

  1. 一種標靶B7H4的抗體或其變體，其特徵在於，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中： 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； 所述變體在所述抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區上發生胺基酸突變，並能維持所述抗體的功能；優選地，所述胺基酸突變為胺基酸替換，所述胺基酸替換的數目為1-3個。
  2. 如請求項1所述的抗體或其變體，其特徵在於，所述變體為在所述抗體的重鏈可變區的HCDR2的第3或4位，HCDR3的第3位發生胺基酸替換，和/或，在所述抗體的輕鏈可變區的LCDR3的第4位發生胺基酸替換；優選地， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、55和66所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和69所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和38所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  3. 如請求項1或2所述的抗體或其變體，其特徵在於，所述重鏈可變區還包括重鏈可變區框架區HFWR，和/或，所述輕鏈可變區還包括輕鏈可變區框架區LFWR，其中，所述HFWR為人抗體的重鏈可變區框架區，所述LFWR為人抗體的輕鏈可變區框架區；優選地， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：93所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列；或 所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1-3任一項所述的抗體或其變體，其特徵在於，所述抗體還包括重鏈恆定區和/或輕鏈恆定區；優選地，所述抗體的重鏈恆定區選自hIgG1、hIgG2、hIgG3或hIgG4，所述輕鏈恆定區選自κ鏈或者λ鏈；更優選地，所述變體在所述抗體的Fc的第239位和/或332位發生胺基酸替換，優選所述胺基酸替換為S239D和/或I332E。
  5. 如請求項1-4任一項所述的抗體或其變體，其特徵在於，所述抗體是全長抗體、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv或由上述抗體製得的單株抗體或多株抗體。
  6. 如請求項5所述的抗體，其特徵在於，其包括 (1)重鏈和輕鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO：95所示的胺基酸序列；輕鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或，所述重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；或， 所述重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：113所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：99所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：100所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：101所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：117所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：98所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：112所示的胺基酸序列；或， 重鏈包括如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；所述輕鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， (2)其包括重鏈，所述重鏈包括如SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列。
  7. 一種標靶B7H4的雙特異性抗體，其特徵在於，其包括A蛋白功能區和B蛋白功能區，其中，所述A蛋白功能區為如請求項1-6任一項所述的標靶B7H4的抗體；所述B蛋白功能區為非標靶B7H4的抗體；優選地，所述非標靶B7H4的抗體為標靶CD3的抗體；更優選地，所述標靶CD3的抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，其中，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，所述輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；進一步更優選地，所述標靶CD3的抗體中，所述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；或，輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；或，輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列；所述重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列。
  8. 如請求項7所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述B蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區，所述A蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其中， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：8、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、21和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、23和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：47、54和67所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9、24和35所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：46、53和63所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：10、20和34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：48、54和65所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈可變區包含胺基酸序列分別由SEQ ID NO：11、22和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  9. 如請求項8所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述B蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區，所述A蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其中， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：90所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列；或， 所述B蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：84所示的胺基酸序列；所述A蛋白功能區中，輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：91所示的胺基酸序列，重鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項9所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述雙特異性抗體選自以下組： (1)所述雙特異性抗體包含三種多肽鏈：其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：120所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：119所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：126所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：127所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：128所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：110所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：129所示的胺基酸序列； (2)所述雙特異性抗體包含四種多肽鏈：其中，第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：120所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：121所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：123所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：122所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：115所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列；或， 第一多肽鏈包括如SEQ ID NO：97所示的胺基酸序列；第二多肽鏈包括如SEQ ID NO：125所示的胺基酸序列；第三多肽鏈包括如SEQ ID NO：118所示的胺基酸序列；第四多肽鏈包括如SEQ ID NO：109所示的胺基酸序列。
  11. 一種嵌合抗原受體，其特徵在於，其包含請求項1~6中任一項所述的抗體或如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體。
  12. 一種基因修飾的細胞，其特徵在於，其包含如請求項11所述的嵌合抗原受體；所述細胞優選為真核細胞，更優選為分離的人細胞，進一步更優選為免疫細胞如T細胞或NK細胞。
  13. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1~6中任一項所述的抗體、如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體或如請求項11所述的嵌合抗原受體。
  14. 一種表現載體，其包含根據請求項13所述的分離的核酸。
  15. 一種轉形株，其包含如請求項14所述的表現載體；所述轉形株的製備方法為將上述重組表現載體轉形至宿主細胞中製得，其中所述宿主細胞優選為原核細胞或真核細胞。
  16. 一種標靶B7H4的抗體或雙特異性抗體的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟：培養如請求項15中所述的轉形株，從培養物中獲得所述標靶B7H4的抗體或雙特異性抗體。
  17. 一種抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述的抗體藥物偶聯物包括抗體部分和偶聯部分，所述抗體部分包含如請求項1~6中任一項所述的抗體、如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體，所述偶聯部分包括但不限於可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酵素、或其組合，所述抗體部分和偶聯部分透過化學鍵或連接子進行偶聯。
  18. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含如請求項1~6中任一項所述的抗體或如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體以及任選地藥學上可接受的載劑。
  19. 如請求項1~6中任一項所述的抗體，如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體，如請求項11所述的嵌合抗原受體，如請求項12所述的免疫細胞，如請求項17所述的抗體藥物偶聯物或請求項18中所述的藥物組成物在製備治療和/或預防癌症的藥物、套組和/或給藥裝置中的應用；優選地，所述癌症為B7H4陽性表現的腫瘤；更優選為乳癌、卵巢癌和子宮內膜瘤，所述乳癌例如為三陰性乳癌。
  20. 一種檢測樣品中B7H4的方法，其特徵在於，其包括使用如請求項1~6中任一項所述的抗體，如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體進行檢測；優選地，所述檢測方法為非診斷目的。
  21. 一種套組，其特徵在於，所述的套組包括請求項1~6中任一項所述的抗體，如請求項7~10中任一項所述的雙特異性抗體、如請求項11所述的嵌合抗原受體、如請求項12所述的免疫細胞、如請求項17所述的抗體藥物偶聯物和/或如請求項18所述的藥物組成物，及任選地，說明書。
  22. 一種給藥裝置，其特徵在於，所述的給藥裝置包含：(1)用於對有需要的受試者施用請求項18所述的藥物組成物的輸注模組，以及(2)任選的藥效監控模組。
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