TW202112808A - 抗體切斷部位結合分子 - Google Patents

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井川智之
小森靖則
玉田耕治
佐古田幸美
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Abstract

根據本揭示，提供一種醫藥組合物，其為包含用於和標靶抗原結合的抗原結合分子的投予組合使用之具有ADCC活性的抗體、T細胞重定向抗體（T cell redirecting antibody）、或表現嵌合受體的細胞之醫藥組合物，初級分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，連接子被切斷的抗原結合分子對標靶抗原具有結合能力，具有ADCC活性的抗體或T細胞重定向抗體的可變區、及嵌合受體的細胞外結合域，透過和切斷連接子被切斷後所產生的連接子被切斷的抗原結合分子的結合，和表現標靶抗原的細胞結合。

Description

抗體切斷部位結合分子
本揭示是關於具有ADCC活性的抗體、T細胞重定向抗體、嵌合受體、表現嵌合受體的細胞、及利用該細胞或抗體的疾病處置方法，特別是，利用抗體的ADCC活性的療法、利用該細胞的CAR-T療法以及T細胞重定向抗體療法。
抗體藥物是以活體具有的免疫系統的一部分的免疫球蛋白或其類似物為主要成分之藥物（非專利文獻1及非專利文獻2）。抗體藥物和習知的小分子化合物相比，分子量大，可辨識複雜分子，因此標靶辨識的特異性高，預料外的副作用小。又，血中的異物一般經由內噬作用被攝入細胞而分解，但是由於抗體存在由特異的受體FcRn及抗體Fc區媒介的抗體回收機制，因此抗體的血中滯留性長，有1次投予可得長時間藥效的特徵。再者，抗體藥物可應用調製重組蛋白質用的遺傳工程而改變功能。
例如，抗體的恆定區透過和NK細胞或巨噬細胞的FcγR結合所誘導的抗體依賴性細胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC），已知當使用具有加上對FcγR的結合增強的變異的恆定區的抗體時，會誘導更強的細胞毒性（非專利文獻3）。
又，一般抗體只會辨識、結合抗原的1個抗原決定位（epitope），但是經由改良天然型的IgG型抗體，開發以1分子和2種類以上的抗原結合的抗體（稱為Bispecific antibody或雙特異性抗體）（非專利文獻11），可和在T細胞表現的蛋白質（CD3ε或TCR）及在癌細胞表現的蛋白質（癌抗原）結合。從1980年代就已知，雙特異性抗體的其中之一為，以T細胞作為效應細胞（effector cell）而召集的以細胞毒性作為其抗腫瘤效果的機制之抗體的T細胞重定向抗體（T cell-redirecting antibody）（非專利文獻12、13、14）。和以NK細胞或巨噬細胞為效應細胞而召集的以ADCC作為其抗腫瘤效果的機制之抗體不同，T細胞重定向抗體可使對T細胞受體（TCR）複合體的任一個構成次單元的結合域（binding domain），特別是鍵結於CD3ε鏈的區域，和標靶的癌細胞上的抗原結合，使T細胞和癌抗原表現細胞形成細胞間交聯，以T細胞作為效應細胞，對癌抗原表現細胞誘導強細胞毒性作用（T-cell dependent cellular cytotoxicity；TDCC）（非專利文獻4、12、13、14）。
再者，近年開發將抗體所具的高特異性利用於效應細胞的抗原辨識之抗腫瘤療法，在一些癌腫瘤中顯示顯著的藥效。在稱此嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor；以下也稱「CAR」）養子免疫療法（adoptive immunotherapy）的療法中，在具有以來自抗體的scFv為首的抗原結合能力的細胞外域，和細胞內訊息傳導域人工融合，形成CAR，在T細胞等的效應細胞表現。將此CAR表現T細胞（以下也稱「CAR-T細胞」）移入癌患者，當腫瘤抗原被CAR辨識時，使細胞內區域活性化，誘導效應細胞的細胞毒性，經由毒殺腫瘤細胞而發揮藥效（非專利文獻5）。
對於以CAR-T細胞的投予的癌免疫療法進行臨床試驗（非專利文獻10），獲得以CAR-T細胞的投予的癌免疫療法在白血病或淋巴瘤等的造血器官惡性腫瘤等中顯示有效性的結果。在2017年，以CD19為抗原的CAR-T之Kymriah（註冊商標）（Novartis，tisagenlecleucel，CTL-019，CD3ζ-CD137）及Yescarta（註冊商標）（KiTE，axicabtagene ciloleucel，CD3ζ-CD28）在美國、2019年在日本，被認可為藥物。
除此之外，利用來自駱駝科動物的單域抗體、以多樣的抗原為標靶、再簡化抗體的調製等的方法也被提出。總而言之，抗體藥物有多個優點，因此適用腫瘤或自體免疫疾病、感染症等的廣泛疾病（非專利文獻6）。
另一方面抗體藥物的限制也被指摘。其中之一是抗原的病變部位特異性的問題。成為抗體標靶的表面抗原也有在病變部位以外的正常組織中表現的情形，雖然抗原的表現量較病變部位低，但對於表現該抗原的正常組織而言，抗體作用產生副作用。
關於這個問題，可解決的方法為，將病變部位特異性的蛋白酶活性作為標靶的病變部位的鑑定。例如，對在病變部位含有活化的蛋白酶的切點的合成胜肽鏈，投予加上螢光色素的蛋白酶基質，量測伴隨切斷的螢光變化，經由蛋白酶活性可鑑別病變部位（非專利文獻7）。
已有報告指出，以抗體辨識在病變部位所生成的蛋白酶切斷產物而檢測出病變部位的研究（非專利文獻8）。此處研究中報導，使用經由放射菌表現的IdeS蛋白酶的切斷產物和該切斷產物特異性結合的抗體，可在活體內（in vivo）特異性辨識（非專利文獻8）。
在慢性疾病領域中，也有以開發檢測退化性膝關節炎的病變的試劑為目的，開發在退化性膝關節炎的病變部位中，辨識被活化的MMP（matrix metalloproteinase）切斷的第II型膠原蛋白的抗體（非專利文獻9）。
將已知的蛋白酶活化抗體技術應用在治療上的例子，例如透過對抗體提供對在如癌組織或發炎組織的病變部位表現或活化的程度增加的蛋白酶的敏感性，擴大組織特異性及治療劑量區間（therapeutic window）的「Probody（註冊商標）技術」（圖1）。
「Probody（註冊商標）技術」為，經由在病變部位表現的蛋白酶而切斷的切斷胜肽序列，連接抗體、和覆蓋抗體的抗原結合部位的覆蓋胜肽（mask peptide）的分子（非專利文獻15）。抗體的抗原結合部位在胜肽序列未切斷的狀態下，被覆蓋胜肽覆蓋，無法和抗原結合。透過Probody（註冊商標）的切斷胜肽序列被在標靶的病態部位表現的蛋白酶切斷，使覆蓋胜肽解離，生成具有抗原結合活性的抗體分子，可和標靶的病態組織特異性抗原結合。Probody（註冊商標）在蛋白酶不存在的非病變部位中，由於抗原抗體的結合受到阻礙，可較一般的抗體更大量投予，期待可擴大治療劑量區間。
［先前技術文獻］ ［專利文獻］ ［專利文獻1］WO2009/025846 ［專利文獻2］WO2017/143094 ［專利文獻3］WO2018/097307 ［非專利文獻］ ［非專利文獻1］Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden &amp； Matthew C Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic., Nat. Biotechnol.　（2005）23, 1073 - 1078 ［非專利文獻2］Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm.　（2005） 59（3）, 389-396 ［非專利文獻3］The impact of Fc engineering on an anti-CD19 antibody： increased Fcgamma receptor affinity enhances B-cell clearing in nonhuman primates. Zalevsky J, Leung IW, Karki S, Chu SY, Zhukovsky EA, Desjarlais JR, Carmichael DF, Lawrence CE. Blood. 2009 Apr 16；113（16）：3735-43. ［非專利文獻4］Advances in bispecific biotherapeutics for the treatment of cancer Biochem Pharmacol. 2012 Nov 1；84（9）：1105-12 ［非專利文獻5］Chimeric Antigen Receptor Therapy N Engl J Med 2018； 379：64-73 ［非專利文獻6］Single-domain antibodies for biomedical applications. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2016；38（1）：21-8 ［非專利文獻7］Shedding light onto live molecular targets Nat Med. 2003 Jan；9（1）：123-8 ［非專利文獻8］Structure and specificity of an antibody targeting a proteolytically cleaved IgG hinge　Malia TJ1, Teplyakov A, Brezski RJ, Luo J, Kinder M, Sweet RW, Almagro JC, Jordan RE, Gilliland GL.　Proteins. 2014 Aug；82（8）：1656-67 ［非專利文獻9］Development of a novel immunoassay for the measurement of type II collagen neoepitope generated by collagenase cleavage Clin Chim Acta. 2012 Oct 9；413（19-20）：1591-9. ［非專利文獻10］Grupp et al. 2013 N Engl J Med 368（16）： 1509- 18. ［非專利文獻11］Kontermann, mAbs 2012；4：182-197. ［非專利文獻12］Mezzanzanica et al., International journal of cancer 1988；41：609-615. ［非專利文獻13］Staerz and Bevan, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986；83：1453-1457. ［非專利文獻14］Staerz et al., Nature 1985；314：628-631. ［非專利文獻15］Desnoyers LR et al., Sci Transl Med. 2013 Oct 16；5（207）：207ra144.
［發明所欲解決的課題］
Probody（註冊商標）是因為活化的Probody（註冊商標）的高血中滯留性、及即使在不經蛋白酶切斷的非活化狀態也具有抗原結合活性，在正常組織中也發揮細胞毒性。又，已知T細胞重定向抗體療法，即使在CAR-T療法中，在獲得高細胞毒性的另一方面，其活性在正常細胞中也會發生，引起嚴重的副作用，有關這些療法的安全性被要求改善。
又，單一腫瘤抗原在所有癌中並不是普遍的表現，因此這些療法有必要為每個作為標靶的腫瘤抗原構築抗原辨識部位，伴隨操作上的經濟成本及勞動作業成為大的課題。再者，作為標靶的腫瘤抗原因應治療而有如表現量降低或突然變異等，引起免疫逃避（immune evasion），導致治療效果降低或消失。
對於因應治療階段而改變辨識的腫瘤抗原，研究可能的CAR-T細胞及T細胞重定向抗體、利用這些的治療方法，期待經由投予患者時具有充足的治療效果、且具有高安全性的治療方法及可廣泛利用的技術之開發，有更安全且廉價的治療。 ［解決課題之手段］
為了解決這些課題，發明人等反覆研究，發現和經蛋白酶而被切斷、新生成的抗原結合域結合的具有ADCC活性的抗體、T細胞重定向抗體或CAR-T細胞，對於治療目標細胞選擇性作用，在治療中有效，遂完成本發明。在本揭示的一面向，揭示包含經蛋白酶所生成的抗原結合域的分子的血中半衰期短，因蛋白酶的切斷不發生時，則不發揮藥理作用的分子群，且有廣用性的治療分子群。
例如，根據本揭示提供，包含具有抗原結合能力的分子的醫藥組合物及包含效應物（effector）活性能力的分子的醫藥組合物；透過目標組織特異性表現的蛋白酶而被切斷，使2個締合（association），使表現抗原的目標細胞和效應細胞之間形成交聯，使效應細胞活化用的醫藥組合物；起因於目標組織的疾病治療用的醫藥組合物；以及作為該醫藥組合物的有效成分使用、具有抗原結合能力的分子及具有效應物活性能力的分子。進一步提供，該醫藥組合物、作為該有效成分使用的具有抗原結合能力的分子及具有效應物活性能力的分子之製造方法。
再者，根據本揭示，以和腫瘤抗原結合的分子為共通的，從CAR-T療法、雙特異性抗體療法及具有ADCC活性的抗體療法之複數種療法，以符合患者的治療適合性選擇最適療法，或者視治療狀況改變或增加療法。
再者，根據本揭示，使用複數個和腫瘤抗原結合的分子，以該等為共通，從CAR-T療法、雙特異性抗體療法及具有ADCC活性的抗體療法之複數種療法，以符合患者的治療適合性選擇最適療法，或者視治療狀況改變或增加療法。
本揭示一面向為，對表現標靶抗原的目標細胞具有ADCC活性的抗體、雙特異性抗體或CAR-T細胞，CAR-T細胞、或雙特異性抗體或具有ADCC活性的抗體透過和抗原結合分子的結合而和目標細胞結合。抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子（linker），在經蛋白酶使連接子切斷後，對標靶抗原具有結合能力。本揭示關於上述CAR-T細胞、或雙特異性抗體或具有ADCC活性的抗體。
本揭示再一面向關於，編碼可使用於使表現作為對象的標靶抗原的細胞標靶化之具有ADCC活性的抗體、雙特異性抗體及/或CAR之分離的核酸分子。
本揭示再一面向關於，包含編碼可使用於使表現作為對象的標靶抗原的細胞標靶化之具有ADCC活性的抗體、雙特異性抗體及/或CAR之分離的核酸分子的載體（vector）。
本揭示再一面向關於，使本揭示之CAR表現的細胞、或本揭示的核酸分子或以載體轉染（transfection）或轉導（transduction）的細胞。
更具體地說，本揭示的一面向提供以下發明。
［1］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含表現嵌合受體的細胞之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［2］一種醫藥組合物，其為用於和表現嵌合受體的細胞的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［3］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含雙特異性抗體之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
［4］一種醫藥組合物，其為用於和雙特異性抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
［5］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含以抗體依賴性細胞毒性作用被增強為特徵的IgG抗體之醫藥組合物， 上述抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， 上述IgG抗體包含對經蛋白酶的上述連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區， 上述IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［6］一種醫藥組合物，其為用於和以抗體依賴性細胞毒性作用被增強為特徵的IgG抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， IgG抗體包含對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區， IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［7］如［1］至［6］任一項所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子對抗原的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子對抗原的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1或0.01以下。
［8］如［1］至［7］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為IgG抗體、類IgG抗體分子（IgG-like antibody molecule）、重鏈抗體（heavy-chain antibody）或單域抗體（single-domain antibody）。
［9］如［1］至［8］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，其中，上述抗體選自IgG抗體、類IgG抗體分子或重鏈抗體，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含抗原結合域及部分被切斷的連接子。
［10］如［1］至［9］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子的經蛋白酶而被切斷的連接子位於可變區和恆定區的交界附近或上述恆定區內的CH1和CH2的交界附近。
［11］如［1］至［10］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子的抗體或類IgG抗體分子，連接子切斷後的抗原結合分子為該抗體的VL、VH、VHH或其抗原結合片段。
［12］如［1］至［11］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子的單域抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該單域抗體的抗原結合域及部分的連接子。
［13］如［1］至［12］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
［14］如［1］至［12］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［15］如［1］至［14］任一項所載之醫藥組合物，其用於在癌的治療或預防中使用。
［A1-1］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含表現嵌合受體的細胞之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［A1-2］一種醫藥組合物，其為用於和表現嵌合受體的細胞的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［A1-3］如［A1-1］或［A1-2］所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子對抗原的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子對抗原的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1以下或0.01以下。
［A1-4］如［A1-1］至［A1-3］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為IgG抗體、類IgG抗體分子、重鏈抗體或單域抗體。
［A1-5］如［A1-1］至［A1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，其中，上述抗體選自IgG抗體、類IgG抗體分子或重鏈抗體，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含抗原結合域及部分被切斷的連接子。
［A1-6］如［A1-1］至［A1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含單域抗體的VHH及經蛋白酶而被切斷的連接子，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含抗原結合域及部分被切斷的連接子。
［A1-7］如［A1-1］至［A1-6］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子之經蛋白酶而被切斷的連接子位於可變區和恆定區的交界附近或上述恆定區內的CH1和CH2的交界附近。
［A1-8］如［A1-1］至［A1-7］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子之經蛋白酶而被切斷的連接子位於樞紐區（hinge region）附近。
［A1-9］如［A1-1］至［A1-8］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗體或類IgG抗體分子，連接子切斷後的抗原結合分子為該抗體的VL、VH、VHH或其抗原結合片段。
［A1-10］如［A1-1］至［A1-9］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之重鏈抗體或單域抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為包含該抗原結合分子的VHH或抗原結合域的其一部份。
［A1-11］如［A1-1］至［A1-10］任一項所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子為scFv、Fv、Fab、Fab’、F（ab’）2 、VH或VHH。
［A1-12］如［A1-1］至［A1-11］任一項所載之醫藥組合物，其中，嵌合受體的細胞外結合域辨識切斷的連接子、該連接子的一部分、或包含該連接子的部分。
［A1-13］如［A1-1］至［A1-12］任一項所載之醫藥組合物，其中，嵌合受體的細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1以下或0.01以下。
［A1-14］如［A1-1］至［A1-13］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
［A1-15］如［A1-1］至［A1-14］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［A1-16］如［A1-1］至［A1-15］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子更包含撓性連接子（flexible linker）。
［A1-17］如［A1-1］至［A1-16］任一項所載之醫藥組合物，其中，蛋白酶為在目標組織特異性表現的蛋白酶。
［A1-18］如［A1-1］至［A1-17］任一項所載之醫藥組合物，其中，目標細胞為腫瘤細胞，且蛋白酶為腫瘤蛋白酶。
［A1-19］如［A1-1］至［A1-18］任一項所載之醫藥組合物，其用於在癌的治療或預防中使用。
［A1-20］如［A1-19］所載之醫藥組合物，其中，癌選自癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚細胞瘤及白血病所組成之群。
［A1-21］如［A1-19］所載之醫藥組合物，其中，癌選自B細胞譜系急性淋巴球白血病、B細胞慢性淋巴球白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤（B-cell non-Hodgkin’s lymphoma）、乳癌、胃癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、白血病及何杰金氏淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma）所組成之群。
［A1-22］如［A1-1］至［A1-21］任一項所載之醫藥組合物，其用於在CAR-T療法中使用。
［A2-1］一種嵌合受體，其為包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域的嵌合受體，在包含經蛋白酶而被切斷的連接子的抗原結合分子中，該連接子經蛋白酶而被切斷的抗原結合分子和細胞外結合域結合，透過細胞外結合域和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，和表現抗原的細胞結合。
［A2-2］如［A2-1］所載之嵌合受體，其中，細胞外結合域辨識經蛋白酶而被切斷的連接子、該連接子的一部分、或包含該連接子的部分。
［A2-3］如［A2-1］或［A2-2］所載之嵌合受體，其中，穿膜域包含CD28。
［A2-4］如［A2-1］至［A2-3］任一項所載之嵌合受體，更包含位於穿膜域和細胞內訊息傳導域之間的1個以上的共刺激分子（costimulatory molecule）。
［A2-5］如［A2-4］所載之嵌合受體，其中，該共刺激分子為CD3 ζ、CD28、4-1BB、4-1BBL、ICOS或 OX40。
［A2-6］如［A2-1］至［A2-5］任一項所載之嵌合受體，其中，該細胞內訊息傳導域包含CD3 ζ。
［A2-7］如［A2-1］至［A2-6］任一項所載之嵌合受體，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［A2-8］一種核酸，其編碼［A2-1］至［A2-7］任一項所載之嵌合受體。
［A2-9］一種載體，包含［A2-8］所載之核酸。
［A2-10］一種細胞，包含［A2-8］所載之載體。
［A2-11］如［A2-9］所載之細胞，其中，該細胞為T細胞。
［A2-12］如［A2-11］所載之細胞，其中，該T細胞為CD4+ 或CD8+ T細胞。
［A2-13］如［A2-11］所載之細胞，其中，該T細胞為調節性T細胞（Treg）或濾泡調節性T細胞（TFR）。
［A3-1］一種抗原結合分子，其為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗原結合分子， 連接子切斷後的抗原結合分子對抗原具有結合能力，透過嵌合受體的細胞外結合域和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現抗原的目標細胞結合。
［A3-2］如［A3-1］所載之抗原結合分子，其中，該經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［B1-1］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含雙特異性抗體之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
［B1-2］一種醫藥組合物，其為用於和雙特異性抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
［B1-3］如［B1-1］或［B1-2］所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子對抗原的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子對抗原的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1以下或0.01以下。
［B1-4］如［B1-1］至［B1-3］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為IgG抗體或重鏈抗體。
［B1-5］如［B1-1］至［B1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含上述可變區或其抗原結合片段。
［B1-6］如［B1-1］至［B1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，該連接子位於可變區和恆定區的交界附近或上述恆定區內的CH1和CH2的交界附近。
［B1-7］如［B1-1］至［B1-6］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該抗體的VL、VH或其抗原結合片段。
［B1-8］如［B1-1］至［B1-6］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之重鏈抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該重鏈抗體的VHH。
［B1-9］如［B1-1］至［B1-8］任一項所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子為scFv、Fv、Fab、Fab’、F（ab’）2 、VH或VHH。
［B1-10］如［B1-1］至［B1-9］任一項所載之醫藥組合物，其中，雙特異性抗體辨識切斷的連接子、該連接子的一部分、或包含該連接子的部分。
［B1-11］如［B1-1］至［B1-10］任一項所載之醫藥組合物，其中，雙特異性抗體對連接子切斷後的抗原結合分子的KD 值，相對於雙特異性抗體對連接子切斷前的抗原結合分子的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1以下或0.01以下。
［B1-12］如［B1-1］至［B1-11］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
［B1-13］如［B1-1］至［B1-12］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［B1-14］如［B1-1］至［B1-13］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子更包含撓性連接子。
［B1-15］如［B1-1］至［B1-14］任一項所載之醫藥組合物，其中，蛋白酶為在目標組織特異性表現的蛋白酶。
［B1-16］如［B1-1］至［B1-15］任一項所載之醫藥組合物，其中，目標細胞為腫瘤細胞，且蛋白酶為腫瘤蛋白酶。
［B1-17］如［B1-1］至［B1-16］任一項所載之醫藥組合物，其用於在癌的治療或預防中使用。
［B1-18］如［B1-17］所載之醫藥組合物，其中，癌選自癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚細胞瘤及白血病所組成之群。
［B1-19］如［B1-17］所載之醫藥組合物，其中，癌選自B細胞譜系急性淋巴球白血病、B細胞慢性淋巴球白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤、乳癌、胃癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、白血病及何杰金氏淋巴瘤所組成之群。
［B1-20］如［B1-1］至［B1-19］任一項所載之醫藥組合物，其用於在雙特異性抗體療法中使用。
［B2-1］一種雙特異性抗體，包含1）對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之第1抗體可變區；及2）對在包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗原結合分子中，對經蛋白酶的連接子切斷後的該抗原結合分子具有結合活性之第2抗體可變區； 抗原結合分子在經蛋白酶的連接子切斷後，對在目標細胞表面表現的抗原具有結合活性，雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［B2-2］如［B2-1］所載之雙特異性抗體，其中，在T細胞表面表現的分子為CD3。
［B2-3］如［B2-1］所載之雙特異性抗體，其中，對在T細胞表面表現的分子具有結合活性的抗體可變區，和CD3 ε結合。
［B2-4］如［B2-1］至［B2-3］任一項所載之雙特異性抗體，其辨識該經蛋白酶而被切斷的連接子、該連接子的一部分、或包含該連接子的部分。
［B2-5］如［B2-1］至［B2-4］任一項所載之雙特異性抗體，其包含對Fcγ受體的結合活性低的Fc區。
［B2-6］如［B1-1］至［B1-5］任一項所載之雙特異性抗體，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［B2-7］如［B1-1］至［B1-5］任一項所載之雙特異性抗體，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［B2-8］如［B1-1］至［B1-7］任一項所載之雙特異性抗體，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子更包含撓性連接子。
［B2-9］如［B2-1］至［B2-8］任一項所載之雙特異性抗體，其為IgG抗體。
［B3-1］一種核酸，編碼如［B2-1］至［B2-9］任一項所載之雙特異性抗體。
［B3-2］一種載體，包含如［B3-1］所載之核酸。
［B3-3］一種細胞，包含如［B3-2］所載之載體。
［B3-4］一種雙特異性抗體之製造方法，包含培養如［B3-3］所載之細胞，從培養上清液收集雙特異性抗體。
［C1-1］一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含以抗體依賴性細胞毒性作用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC）被增強為特徵的IgG抗體之醫藥組合物， 上述抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， 上述IgG抗體包含對經蛋白酶的上述連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區， 上述IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［C1-2］一種醫藥組合物，其為用於和以抗體依賴性細胞毒性作用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC）被增強為特徵的IgG抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物， 抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， IgG包含對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區， 上述IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［C1-3］如［C1-1］或［C1-2］所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子對抗原的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子對抗原的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1或0.01以下。
［C1-4］如［C1-1］至［C1-3］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為IgG抗體、類IgG抗體分子、重鏈抗體或單域抗體。
［C1-5］如［C1-1］至［C1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含上述可變區及其抗原結合片段。
［C1-6］如［C1-1］至［C1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，該連接子位於該恆定區內的CH1和CH2的交界附近。
［C1-7］如［C1-1］至［C1-6］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該抗體的VL、VH或其抗原結合片段。
［C1-8］如［C1-1］至［C1-6］任一項所載之醫藥組合物，其中，上述抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之重鏈抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該重鏈抗體的VHH。
［C1-9］如［C1-1］至［C1-8］任一項所載之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子為scFv、Fv、Fab、Fab’、F（ab’）2 、VH或VHH。
［C1-10］如［C1-1］至［C1-9］任一項所載之醫藥組合物，其中，IgG抗體辨識切斷的連接子、該連接子的一部分、或包含該連接子的部分。
［C1-11］如［C1-1］至［C1-10］任一項所載之醫藥組合物，其中，IgG抗體對連接子切斷後的抗原結合分子的KD 值，相對於IgG抗體對連接子切斷前的抗原結合分子的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1或0.01以下。
［C1-12］如［C1-1］至［C1-11］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
［C1-13］如［C1-1］至［C1-12］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［C1-14］如［C1-1］至［C1-13］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子更包含撓性連接子。
［C1-14］如［C1-1］至［C1-13］任一項所載之醫藥組合物，其中，蛋白酶為在目標組織特異性表現的蛋白酶。
［C1-15］如［C1-1］至［C1-14］任一項所載之醫藥組合物，其中，目標細胞為腫瘤細胞，且蛋白酶為腫瘤蛋白酶。
［C1-16］如［C1-1］至［C1-15］任一項所載之醫藥組合物，其用於在利用抗體依賴性細胞毒性作用（ADCC）、抗體依賴性細胞吞噬能力（ADCP）的治療或預防中使用。
［C1-17］如［C1-1］至［C1-16］任一項所載之醫藥組合物，其用於在癌的治療或預防中使用。
［C1-18］如［C1-17］所載之醫藥組合物，其中，癌選自癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚細胞瘤及白血病所組成之群。
［C1-19］如［C1-17］所載之醫藥組合物，其中，癌選自B細胞譜系急性淋巴球白血病、B細胞慢性淋巴球白血病、B細胞非何杰金氏淋巴瘤 、乳癌、胃癌、神經母細胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結腸癌、腎細胞癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、白血病及何杰金氏淋巴瘤所組成之群。
［C1-20］如［C1-1］至［C1-19］任一項所載之醫藥組合物，其用於在IgG抗體療法中使用。
［C2-1］一種IgG抗體，其為包含對在包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗原結合分子中，對經蛋白酶的連接子切斷後的該抗原結合分子具有結合活性的抗體可變區之IgG抗體， 抗原結合分子在經蛋白酶的連接子切斷後、對在目標細胞表面表現的抗原具有結合活性，IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
［C2-2］如［C2-1］所載之IgG抗體，其抗體依賴性細胞毒性作用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC）被增強。
［C2-3］如［C2-1］或［C2-2］所載之IgG抗體，其包含對Fcγ受體的結合活性增加的Fc區。
［C2-4］如［C1-1］至［C1-3］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
［C2-5］如［C1-1］至［C1-4］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列任一個的胜肽。
［C2-6］如［C1-1］至［C1-5］任一項所載之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子更包含撓性連接子。
［C3-1］一種核酸，其編碼［C2-1］至［C2-6］任一項所載之IgG抗體。
［C3-2］一種載體，包含如［C3-1］所載之核酸。
［C3-3］一種細胞，包含如［C3-2］所載之載體。
［C3-4］一種IgG抗體之製造方法，包含培養如［C3-3］所載之細胞，從培養上清液收集IgG抗體。
［D1-1］一種醫藥組合物，其為用於和初級分子的投予組合使用之包含次級分子之醫藥組合物， 初級分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 次級分子對連接子切斷後的初級分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的初級分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［D1-2］一種醫藥組合物，其為用於和次級分子的投予組合使用之包含初級分子之醫藥組合物， 初級分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 次級分子對連接子切斷後的初級分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的初級分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
［D1-3］如［D1-1］或［D1-2］所載之醫藥組合物，其中，初級分子為抗原結合分子，次級分子為雙特異性抗體、嵌合受體、或以抗體依賴性細胞毒性作用被增強為特徵的IgG抗體。
［D1-4］如［D1-1］至［D1-3］任一項所載之醫藥組合物，其為［A1-1］～［A1-21］、［B1-1］～［B1-20］、及［C1-1］～［C1-20］任一項所載之醫藥組合物。
［用以實施發明之型態］
可由下列詳細說明而明白本揭示之其他特徵及優點。然而，從此詳細說明此技術領域之人士當然可在本揭示之旨趣及範圍內有各種的變更及改變，因此應該理解顯示本揭示之較佳實施態樣的詳細說明及具體例僅用於說明目的。
以下，參酌圖式說明本揭示之實施態樣。
用語「實質上」、「約」及「大約」表示不顯著地改變最終結果的被修飾語的合理偏差量，亦即，由此技術領域之人士確定的特定值被容許的誤差範圍內。例如，約，根據該領域的實務，表示可容許的標準偏差。或者，「約」可表示某值的最大±20%，宜為最大±10%，較佳最大±5%，更佳最大±1%。或者，在生物學系統或過程中，本用語表示從某值的一位數，宜為2倍以內。當特定的值記載於本說明書及申請專利範圍時，除非另有說明，用語「約」被暗示在其文脈表示對特定值的容許誤差範圍內。
在本說明書及申請專利範圍的英文翻譯中被使用時，單數「一個（a）」、「一個（an）」及「其（the）」，除非內容有明示，包含複數的指示語。又，用語「或」，除非內容有明示，也應該注意，一般在包含「及/或」的意思範圍內使用。
本揭示中以端點的數值範圍的列舉，包含該範圍內所包含的所有的數及分數（例如，1～5包含1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、及5）。又，也應該理解所有的數及分數也有以用語「約」修飾。但是，在了解數值範圍所顯示的數值表示整數的情形時，可理解數值範圍限定列舉範圍所包含的整數。如此的情形，例如1～5、或1至5理解為限定列舉1、2、3、4、及5。
再者，特定段落所記載的定義及實施態樣，如此技術領域之人士所理解，旨在應用以該等為適宜所記載的本說明書的其他實施態樣。例如，在接下來的下述，更詳細定義本揭示的各種面向。如此定義的各面向，除非有明確說明，也可以和其他任何1個或複數個面向組合。特別是，作為較佳或有利所示的任何特徵也都可以和作為較佳或有利所示的其他任何1個或複數個特徵組合。
本揭示中，有將包含和目標細胞表現的抗原結合的區域（「抗原結合域」）及經蛋白酶而被切斷的連接子之抗原結合分子，稱為「初級分子」的情形。初級分子經蛋白酶而連接子被切斷，釋放出和目標細胞或病變細胞所表現的抗原（「標靶抗原」）結合的抗原結合片段。經蛋白酶而連接子被切斷所產生的抗原結合分子之一，稱為「連接子被切斷的抗原結合分子」或「連接子切斷後的抗原結合分子」，包含抗原結合域和切斷的連接子的一部分。使目標細胞和效應細胞（effector cell）交聯、誘導細胞毒性的多胜肽，有稱為「次級分子」的情形。次級分子例如，具有可和連接子被切斷的抗原結合分子結合的抗體可變區的具有ADCC活性之抗體、具有可和連接子被切斷的抗原結合分子結合的抗體可變區及可和T細胞受體複合體結合的抗體可變區之T細胞重定向抗體、或者具有可和連接子被切斷的抗原結合分子結合的細胞外域之嵌合受體。抗原結合分子所含的連接子包含蛋白酶切斷序列，具有經蛋白酶切斷的切點（cleavage site）。由具有蛋白酶切斷序列的胜肽所形成的連接子，有稱為蛋白酶切斷連接子的情形。
在一態樣中，包含經蛋白酶而被切斷的連接子之抗原結合分子（初級分子），為抗體，更具體能夠列舉為包含經蛋白酶而被切斷的連接子之IgG抗體或重鏈抗體，更佳例如IgG1抗體、駱駝科的重鏈抗體（hcIgG）或鯊魚的重鏈抗體（IgNAR）。
在一態樣中，經蛋白酶而連接子被切斷所產生的抗原結合分子，例如Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2 、迷你抗體（minibody）、單鏈抗體分子（例如scFv）、VHH、VH，更具體例如Fab、scFv、VHH、VH。
本發明中的多胜肽是指通常有約4個胺基酸以上的長度的胜肽及蛋白質。又，本發明中的多胜肽通常是由人為設計的序列所形成的多胜肽，但沒有特別限定，例如也可以是來自生物的多胜肽。又，也可以是天然多胜肽、或合成多胜肽、重組多胜肽等的任一種。再者，上述多胜肽的片段也包含於本發明之多胜肽。
本說明書中，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示的，胺基酸以一字編碼或三字編碼、或以兩種表記。在特定位置表現某胺基酸時，可適當使用共同記載表示特定位置的數字和胺基酸的一字編碼或三字編碼的表現。例如，在單域抗體所包含的所謂的胺基酸37V的胺基酸，表示在以Kabat編號表示的37位的位置的Val。
為了抗體等的多胜肽之胺基酸序列中的胺基酸變異，可適當採用定點突變法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1985）82, 488-492））或重疊延伸PCR（Overlap extension PCR）等的公知方法。又取代為天然胺基酸以外的胺基酸之胺基酸變異方法也可採用複數個公知方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.（2006） 35, 225-249, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（2003） 100（11）, 6353-6357）。例如，也可較佳使用包含在終止密碼子之一的UAG密碼子（琥珀密碼子）的互補的琥珀抑制子（amber suppressor）tRNA結合的非天然胺基酸的tRNA之無細胞轉譯系統（Clover Direct（Protein Express））等。本說明書中，變異列舉有取代，但不限於此。
本說明書中，在表示胺基酸變異位置時所使用的「及/或」的用語的意義，包含「及」和「或」適宜組合的任何組合。具體例如「第37號、第45號、及/或第47號的胺基酸被取代」包含以下的胺基酸變異位置的變化：（a）第37號、（b）第45號、（c）第47號、（d）第37號及第45號、（e）第37號及第47號、（f）第45號及第47號、（g）第37號及第45號及第47號。
本說明書中，表示胺基酸變異的表現可適宜使用在表示特定位置的數字前後共同記載變異前和變異後的胺基酸一字編碼或三字編碼的表現。例如，增加在抗體可變區或單域抗體所含的胺基酸取代時所用的F37V或Phe37Val的變異，表示Kabat編號的第37位的Phe取代為Val。亦即，數字表示Kabat編號所表的胺基酸位置，記載在前的胺基酸一字編碼或三字編碼表示取代前的胺基酸，記載在後的胺基酸一字編碼或三字編碼表示取代後的胺基酸。相同地，增加在抗體恆定區所含的Fc區的胺基酸的取代時所用的P238A或Pro238Ala的變異，表示EU編號的第238位的Pro取代為Ala。亦即，數字表示EU編號所表的胺基酸位置，記載在前的胺基酸一字編碼或三字編碼表示取代前的胺基酸，記載在後的胺基酸一字編碼或三字編碼表示取代後的胺基酸。
在本說明書，用語「抗體」以最廣的定義使用，只要是顯示所期望的抗原結合活性，不限於該等，包括含有單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、單域抗體、及抗體片段之各種抗體結構。
「抗體片段」是指包含和完全抗體結合的抗原結合的該完全抗體的一部分之該完全抗體以外的分子。抗體片段的例子雖不限於此，但包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2 、微型雙功能抗體（diabody）、線狀抗體、單鏈抗體分子（如scFv）、及由抗體片段所形成的多特異性抗體。
用語「全長抗體」、「完全抗體」、及「全部抗體」在本說明書可交替使用，是指具有實質上和天然型抗體結構類似的結構，或本說明書所定義之具有包含Fc區的重鏈之抗體。
用語「可變區」或「可變區域」是指參與抗體對抗原的結合的抗體的重鏈或輕鏈的結構域（domain）。抗體的重鏈及輕鏈的可變域（分別為VH及VL）通常具有各域包含4個保留框架區（FR）及3個互補決定區（CDR）的類似結構。（例如參考，Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007））在1個VH或VL域充分提供抗原結合特異性。
本說明書所使用的用語「互補決定區」或「CDR」是指，在序列中為超可變，及/或形成結構上固定的環（「超可變環」），及/或抗原接觸殘基（「抗原接觸」）、抗體的可變域的各區域。通常，抗體包含6個CDR：3個在VH（H1、H2、H3）、及3個在VL（L1、L2、L3）。本說明書舉例的CDR包含下列： （a）在胺基酸殘基26-32（L1）、50-52（L2）、91-96（L3）、26-32（H1）、53-55（H2）、及96-101（H3）處產生的超可變環（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196：901-917（1987））； （b）在胺基酸殘基24-34（L1）、50-56（L2）、89-97（L3）、31-35b（H1）、50-65（H2）、 及95-102（H3） 處產生的CDR （Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））； （c）在胺基酸殘基27c-36（L1）、46-55（L2）、89-96（L3）、30-35b（H1）、47-58（H2）、及93-101（H3） 處產生的抗原接觸（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262： 732-745（1996））；以及 （d）包含HVR胺基酸殘基46-56（L2）、47-56（L2）、48-56（L2）、49-56（L2）、26-35（H1）、26-35b（H1）、49-65（H2）、93-102（H3）、及94-102（H3）之（a）、（b）、及/或（c）的組合。
如果沒有另外明記，CDR殘基及可變域中的其他殘基（例如FR殘基）在本說明書根據上列Kabat等編號。
「框架」或「FR」是指互補決定區（CDR）殘基以外的可變域殘基。可變域的FR通常由4個FR域：FR1、FR2、FR3、及FR4所形成。相對應地，CDR及FR的序列通常以下列順序在VH（或VL）出現：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。
在本說明書，用語「恆定區」或「恆定域」是指，抗體的可變區域以外的部分。例如，IgG抗體為由雙硫鍵連結的2個相同的輕鏈和2個相同的重鏈所構成的約150,000道爾頓的雜四倍體醣蛋白，從N端向C端，各重鏈具有稱為可變重鏈域或重鏈可變域的可變域（VH），接著為包含CH1域、樞紐區、CH2域、CH3域的重鏈恆定區（CH）。相同地，從N端向C端，各輕鏈具有稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域的可變域（VL），接著為恆定輕鏈（CL）域。天然型抗體的輕鏈，也可基於其恆定域的胺基酸序列，歸屬於稱為kappa（κ）或lamda（λ）的2型的其中1型。
在本說明書，用語「Fc區」用於定義至少包含恆定區一部分的免疫球蛋白重鏈的C端區域。此用語包含天然型序列的Fc區及變異體Fc區。在一實施形態，在人類IgG1的情形，重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羧基端。但是，Fc區的C端的離胺酸（Lys447）或甘胺酸-離胺酸（Gly446-Lys447）可以存在或不存在。在本說明書除非有特別限制，Fc區或恆定區中的胺基酸殘基的編號根據Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991記載之EU編號系統（也稱為EU index）。
抗體的「群(class)」是指抗體重鏈所具的恆定域或恆定區的型態。抗體有5個主要群：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。其中一些也可以再分為次群（subclass）（isotype；同型）。例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。對應不同的群的免疫球蛋白之重鏈恆定域，分別稱為α、δ、ε、γ、及μ。
在本說明書，「抗原結合域」只限於和目標抗原結合者。抗原結合域也可使用和目標抗原結合的任何結構的區域。如此區域的例子，不限於該等，例如抗體的重鏈可變區（VH）及抗體的輕鏈可變區（VL）、單域抗體（sdAb）、存在活體內的細胞膜蛋白Avimer所含的約35個胺基酸之稱為A域（A domain）的模組（國際專利公開案WO2004/044011、WO2005/040229）、包含和細胞膜表現的醣蛋白之纖維接合素（fibronectin）中的蛋白質結合的域（domain）之10Fn3域的Adnectin（國際專利公開案WO2002/032925）、使構成由蛋白質A的58個胺基酸所形成的3個螺旋束（bundle）的IgG結合域支架化（scaffold）的Affibody（國際專利公開案WO1995/001937）、在具有包含33個胺基酸殘基的轉折和2個逆向並行的螺旋及環的次單元重複累積的結構之錨蛋白重複序列（ankyrin repeat：AR）的分子表面露出的區域DARPins（Designed Ankyrin Repeat proteins）（國際專利公開案WO2002/020565）、嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等的脂質運載蛋白分子中高度保留的8個逆向並行股在中央方向支持扭曲的桶狀結構的一側的4個環區域之Anticalin等（國際專利公開案WO2003/029462）、在八目鰻、盲鰻等的無顎類的後天免疫系統之不具有免疫球蛋白結構的可變性淋巴球受體（variable lymphocyte receptor（VLR））的富含白胺酸殘基的重複序列（leucine-rich-repeat（LRR））模組重複累積的馬蹄型結構的內部的並行型片狀結構的凹陷區域（國際專利公開案WO2008/016854）。
本發明之抗原結合域的較佳例，例如只以該抗原結合域所構成的分子發揮抗原結合功能的抗原結合域、因為連結其他胜肽而游離後可單獨發揮抗原結合功能的抗原結合域等。如此的抗原結合域的例子，不只限於該等，例如單域抗體、scFv、Fv、Fab、Fab’、F（ab’）２ 等。
本發明之抗原結合域的較佳例之一，例如分子量60kDa以下的抗原結合域。如此的抗原結合域的例子，不只限於該等，例如單域抗體、scFv、Fab、Fab’等。分子量60kDa以下的抗原結合域通常以單體存在血中時，發生經腎臟而清除的可能性高（J Biol Chem, 1988 Oct 15；263（29）：15064-70）。
從另一方面看，本發明之抗原結合域的較佳例之一，例如血中半衰期為12小時以下的抗原結合域。如此的抗原結合域的例子，不只限於該等，例如單域抗體、scFv、Fab、Fab’等。
本發明之抗原結合域的較佳例之一，例如單域抗體（sdAb）。
在本說明書，用語「單域抗體」只要是可以單獨以其結構域發揮抗原結合活性者，不限其結構。相對於以IgG抗體等列舉的一般抗體，經由VH和VL配對形成可變區的狀態顯示抗原結合活性者，已知單域抗體不和其他結構域配對，單域抗體以本身的結構域的構造可單獨發揮抗原結合活性。單域抗體通常具有較低分子量，以單體形態存在。
單域抗體的例子不只限於該等，例如像駱駝科動物的VHH、鯊魚的VNAR般的先天缺乏輕鏈的抗原結合分子、或包含抗體的VH域全部或一部分或VL域全部或一部分的抗體片段。包含抗體的VH/VL域全部或一部分的抗體片段之單域抗體的例子，不只限於該等，例如美國專利第6,248,516 B1號等記載之由人類抗體VH或人類抗體VL起始、人為製作的單域抗體。本發明之一些實施態樣中，1個單域抗體具有3個CDR（CDR1、CDR2、及CDR3）。
當單域抗體為VHH或單域VH抗體時，單域抗體的CDR包含以下例子： （a）在胺基酸殘基26-32（CDR1）、53-55（CDR2）、及96-101（CDR3）處產生的超可變環（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196：901-917 （1987））； （b）在胺基酸殘基31-35b（CDR1）、50-65（CDR2）、及95-102（CDR3）處產生的CDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））； （c）在胺基酸殘基30-35b（CDR1）、47-58（CDR2）、及93-101（CDR3）處產生的抗原接觸（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262： 732-745 （1996））；以及 （d）包含CDR胺基酸殘基26-35（CDR1）、26-35b（CDR1）、49-65（CDR2）、93-102（CDR3）、或94-102（CDR3）之（a）、（b）、及/或（c）的組合。
當單域抗體為單域VL抗體時，單域抗體的CDR包含以下例子： （a）在胺基酸殘基26-32（CDR1）、50-52（CDR2）、及91-96（CDR3）處產生的超可變環（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196：901-917 （1987））； （b）在胺基酸殘基24-34（CDR1）、50-56（CDR2）、及89-97（CDR3）處產生的CDR（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））； （c）在胺基酸殘基27c-36（CDR1）、46-55（CDR2）、及89-96（CDR3）處產生的抗原接觸（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262： 732-745 （1996））；以及 （d）包含CDR胺基酸殘基46-56（CDR2）、47-56（CDR2）、48-56（CDR2）之（a）、（b）、及/或（c）的組合。除有另外記載，CDR殘基及可變區域中的其他殘基（例如FR殘基）在本說明書根據上列的Kabat編號。
單域抗體可從可產生單域抗體的動物，或經由可產生單域抗體的動物使其免疫而獲得。可產生單域抗體的動物的例子，不只限於該等，例如駱駝科動物、導入可產生單域抗體的基因的轉殖基因動物（transgenic animals）。駱駝科動物包含駱駝、駱馬、羊駝、單峰駱駝、及原駝（guanaco）等。導入可產生單域抗體的基因之轉殖基因動物的例子，不只限於該等，例如國際專利公開案WO2015/143414、美國專利公開案US2011/0123527A1所記載的轉殖基因動物。透過從動物取得的單域抗體的框架序列作為人類生殖細胞序列或類似該等的序列，也可獲得人源化單域抗體。人源化單域抗體（例如人源化VHH）為本發明之單域抗體的一實施態樣。
又，單域抗體可從包含單域抗體的多胜肽資料庫經ELISA、淘選（panning）等獲得。包含單域抗體的多胜肽資料庫的例子，不只限於該等，例如從各種動物或人類獲得的天然抗體資料庫（例如：Methods in Molecular Biology 2012 911 （65-78）、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764：8 （1307-1319））、使各種動物免疫而獲得的抗體資料庫（例如：Journal of Applied Microbiology 2014 117：2 （528-536））、或經由各種動物或人類的抗體基因所製作的合成抗體資料庫（例如：Journal of Biomolecular Screening 2016 21：1 （35-43）、Journal of Biological Chemistry 2016 291：24 （12641-12657）、AIDS 2016 30：11 （1691-1701））。
本說明書中，「抗原」只限於包含和抗原結合域結合的抗原決定位者。抗原的較佳例子不只限於該等，例如來自動物或人類的胜肽、多胜肽、蛋白質。本發明中，標靶抗原為用於治療起因於目標組織的疾病用的抗原，較佳例子不只限於該等，例如在目標細胞（如癌細胞、發炎細胞）的表面表現的分子、或在包含目標細胞的組織中的其他細胞表面表現的分子、在對目標細胞和包含目標細胞的組織具有免疫作用的細胞的表面表現的分子、存在於包含目標細胞的組織的間質中的大分子等。下列所示的抗原可列舉為標靶抗原之例。
抗原例如下列分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-keto-PGF1a、8-iso-PGF2a、8-oxo-dG、A1腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、活化素（activin）、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、位址素（addressins）、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗劑、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯（Artemin）、抗Id、ASPARTIC、心房利尿鈉因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3 成骨素（Osteogenin）、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、鈴蟾素（Bombesin）、骨源性神經營養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補體因子3（C3）、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降鈣素（Calcitonin）、cAMP、癌胚抗原（CEA）、癌相關抗原、組織蛋白酶A（Cathepsin A）、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶O、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67蛋白質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒桿菌毒素、產氣莢膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳糖凝集素-9（galectin-9）、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細胞角蛋白（cytokeratin）腫瘤相關抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補體調控因子（complement control factor）、des（1-3）-IGF-I（腦IGF-1）、Dhh、長業毛地黃苷（digoxin）、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、內皮素（endothelin）受體、腦啡胜肽酶（enkephalinase）、eNOS、Eot、伊紅趨素（eotaxin 1）、EpCAM、蝶素（ephrin）B2/EphB4、EPO、ERCC、E-選擇素（E-selectin）、ET-1、第IIa凝血因子、第VII凝血因子、第VIIIc凝血因子、第IX凝血因子、纖維母細胞活化蛋白質（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、鐵蛋白（Ferritin）、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白（fibrin）、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激激素、趨化因子配體（fractalkine）、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（肌肉生長抑制素（myostatin））、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、昇糖素（glucagon）、Glut4、醣蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生長激素釋放因子、半抗原（NP-cap或NIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gB外膜醣蛋白（envelope glycoprotein）、HCMV gH外膜醣蛋白、HCMV UL、造血生長因子（HGF）、Hep B gp120、肝素酶（heparanase）、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、單純皰疹病毒（HSV） gB醣蛋白、HSV gD醣蛋白、HGFA、高分子黑色素腫瘤相關抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3環、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人類心臓肌凝蛋白、人類巨細胞病毒 （HCMV）、人類生長激素 （HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受體、IgE、IGF、IGF結合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干擾素（INF）-α、INF-β、INF-γ、抑制素（inhibin）、iNOS、胰島素A鏈、胰島素B鏈、類胰島素生長因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5（αV）、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干擾素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放素（kallikrein） 2、激肽釋放素5、激肽釋放素6、激肽釋放素11、激肽釋放素12、激肽釋放素14、激肽釋放素15、激肽釋放素L1、激肽釋放素L2、激肽釋放素L3、激肽釋放素L4、KC、KDR、角質細胞生長因子（KGF）、層連結蛋白（laminin）5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潛在性TGF-1、潛在性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis -Y相關抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-選擇素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄體生長激素、淋巴毒素β受體、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受體、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白 （Muc1）、MUC18、穆勒氏管抑制物質（mullerian inhibiting substance）、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C黏著素（N-C adherin）、NCA 90、NCAM、NCAM、腦啡肽酶（neprilysin）、神經營養因子-3、-4、或-6、Neurturin、神經生長因子（NGF）、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲狀腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-鈣黏蛋白（P-cadherin）、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤鹼性磷酸酶（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、胰島素原、鬆弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、鬆弛素A鏈、鬆弛素B鏈、腎素、呼吸道融合病毒（RSV）F、RSV Fgp、Ret、類風濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72（腫瘤相關醣蛋白-72）、TARC、TCA-3、T細胞受體（例如T細胞受體α/β）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、類睪丸PLAP鹼性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β Pan Specific、TGF-βRI（ALK-5）、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲狀腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2 ligand、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANK ligand ODF、OPG ligand）、TNFSF12（TWEAK Apo-3 ligand、DR3 ligand）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHT HVEM ligand、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITR ligand AITR ligand、TL6）、TNFSF1A（TNF-a Conectin、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40 ligand gp34、TXGP1）、TNFSF5（CD40 ligand CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fas ligand Apo-1 ligand、APT1 ligand）、TNFSF7（CD27 ligand CD70）、TNFSF8（CD30 ligand CD153）、TNFSF9（4-1BB ligand CD137 ligand）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉鐵蛋白受體、TRF、Trk、TROP-2、TLR（Toll-like receptor）1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘤相關抗原CA125、腫瘤相關抗原表現lewis Y相關碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶（Urokinase）、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-鈣黏蛋白（VE-Cadherin）、VE-鈣黏蛋白-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、溫韋伯氏因子（von Willebrand factor）、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽釋放酶（prekallikrein）、RON、TMEM16F、SOD1、染色顆粒素（Chromogranin） A、染色顆粒素 B、tau、VAP1、高分子激肽原（high molecular weightkininogen）、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b, C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子 B、因子 D、因子 H、備解素（properdin）、硬化蛋白（sclerostin）、纖維蛋白原（fibrinogen）、纖維蛋白（fibrin）、凝血酶原（prothrombin）、凝血酶（thrombin）、組織因子、第V凝血因子、第Va凝血因子、第VII凝血因子、第VIIa凝血因子、第VIII凝血因子、第VIIIa凝血因子、第IX凝血因子、第IXa凝血因子、第X凝血因子、第Xa凝血因子、第XI凝血因子、第XIa凝血因子、第XII凝血因子、第XIIa凝血因子、第XIII凝血因子、第XIIIa凝血因子、TFPI、抗凝血酶（antithrombin） III、EPCR、凝血調節蛋白（thrombomodulin）、TAPI、tPA、血纖維蛋白溶解酶原（plasminogen）、血纖維蛋白溶解酶（Plasmin）、PAI-1、PAI-2、GPC3、肝素硫酸蛋白醣-1（Syndecan-1）、肝素硫酸蛋白醣-2（Syndecan-2）、肝素硫酸蛋白醣-3（Syndecan-3）、肝素硫酸蛋白醣-4（Syndecan-4）、LPA、S1P、以及激素及生長因子用的受體。
上述抗原的例子中，雖然也記載受體，但這些受體即使在活體液中以可溶型存在的情形時，也可作為和本發明之抗原結合域結合的抗原使用。作為如此的可溶型受體的一非限定態樣，可例如Mullberg等（J. Immunol. （1994） 152 （10）, 4958-4968）所記載之可溶型IL-6R之蛋白質。
在上述抗原的例子中，包含在細胞膜表現的膜型分子以及從細胞分泌至細胞外的可溶型分子。當本發明之抗原結合域和從細胞分泌的可溶型分子結合的情形時，該抗原結合域宜具有中和活性。
可溶型分子存在的溶液沒有限制，活體液、亦即充滿活體內的血管或組織、細胞之間的所有液體，可溶型分子可存在。在一非限定態樣，和本發明之抗原結合域結合的可溶型分子可存在細胞外液。細胞外液是指在脊椎動物的血漿、組織間液、淋巴液、緻密結締組織、腦脊髓液、骨髓液、穿刺液、或關節液等的骨及軟骨中的成分、肺泡液（支氣管肺泡洗淨液）、腹水、胸水、心囊水、囊胞液、或水樣液（眼房液）等的細胞透過液（細胞的主動運輸、分泌活動的結果所產生的各種腺腔內的液體，及消化管腔其他體腔內液體）之總稱。
用語「腫瘤抗原」是指在癌細胞表現的抗原，其表現和細胞的惡性變化相關而被辨識之具有抗原性的生物體分子。本揭示之腫瘤抗原，包含腫瘤特異性抗原（只存在腫瘤細胞，在其他正常細胞未被發現的抗原）、及腫瘤相關抗原（在其他器官及組織或異種及同種異體的正常細胞皆存在的抗原，或在發生及/或分化時表現的抗原）。又，細胞癌化時在細胞表面或蛋白質分子上出現的異常醣鏈也是腫瘤抗原，也稱為癌醣鏈抗原。本發明之一態樣，標靶抗原為腫瘤抗原。
腫瘤抗原的例子，例如作為上述受體，屬於GPI錨型受體家族但在以肝癌為首的幾種癌中表現的GPC3（Int J Cancer. （2003） 103 （4）, 455-65）、在以肺癌為首的複數個癌表現的EpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. （1989） 86 （1）, 27-31）（其多核苷酸序列記載為RefSeq編號 NM_002354.2、多胜肽序列記載為RefSeq編號NP_002345.2。）、EGFR、CA19-9、CA15-3、唾液酸（sialyl） SSEA-1（SLX）、Her2、前列腺幹細胞抗原（PSCA）、α胎兒蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、腫瘤抗原-125（CA-125）、鈣結合蛋白（calreticulin）、MUC-1、MUC-16、上皮性膜蛋白（EMA）、上皮性腫瘤抗原（ETA）、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原（MAGE）、染色顆粒素（chromogranin）、細胞角蛋白（cytokeratin）、肌間線蛋白（desmin）、神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、嚢胞性疾病液體蛋白質（gross cystic disease fluid protein）（GCDFP-15）、HMB-45抗原、蛋白Melan -A（被T淋巴球所辨識的黑色素瘤抗原；MART-1）、myo-D1、肌肉特異性肌動蛋白（MSA）、神經纖維絲（neurofilament）、神經特異性烯醇化酶（NSE）、胎盤鹼性磷酸酶、突觸素（synaptophysin）、甲狀腺球蛋白（thyroglobulin）、甲狀腺轉錄因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚體形（腫瘤M2-PK）、GD2（Ganglioside G2）、EGFRvIII（表皮生長因子受體突變體第III型）、精子蛋白質17（Sp17）、間質素（mesothelin）、PAP（前列腺酸性磷酸酶）、prostein、TARP（T細胞受體γ可變閱讀框架蛋白）、Trp-p8、STEAP1（前列腺1的6次穿膜型上皮抗原）、TROP-2、Claudin6、RNF43a、異常ras蛋白、或異常p53蛋白、整合素αvβ3（CD61）、半乳糖凝集素（galectin）、K-Ras（V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）、或Ral-B等。
再者，也例如促甲狀腺激素受體 （TSHR）；CD171；CS-1（CD2 subset 1、CRACC、SLAMF7、CD319及19A24）；類C型凝集素分子-1（CLL-1）； 神經節苷脂（gangliosides）GD3（aNeu5Ac（2-8）aNeu5Ac（2-3）bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer）；Tn抗原（Tn Ag）；T抗原（T Ag）；類Fms酪胺酸激酶3（FLT3）；CD38；CD44v6；B7H3（CD276）；KIT（CD117）；介白素-13受體次單元α-2（IL-13Ra2）；介白素11受體α（IL-11Ra）；介白素2受體α（IL-2Ra）；前列腺幹細胞抗原（PSCA）；蛋白酶絲胺酸21（PRSS21）；血管内皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）；Lewis（Y）抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β（PDGFR-β）；階段特異性胚胎抗原-4（SSEA-4）；神經元接著分子（NCAM）；碳酸酐酶IX（CAIX）；蛋白酶體（Prosome，Macropain）次單元、β型、9（LMP2）；蝶素A型受體2（EphA2）；岩藻醣基GM1（fucosylGM1）；唾液酸化Lewis接著分子（sLe）；神經節苷脂GM3（aNeu5Ac（2-3）bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer；TGS5；高分子量黑色素瘤相關抗原（HMWMAA）；o-乙醯基-GD2神經節苷脂（OAcGD2）；葉酸受體β；腫瘤内皮標記物1（TEM1/CD248）；腫瘤内皮標記物7相關（TEM7R）；密連蛋白(Claudin)6（CLDN6）；G蛋白共軛受體C族第5群、成員D（GPRC5D）；染色體X開放閱讀框架61（CXORF61）；CD97；CD179a；未分化淋巴瘤激酶（ALK）；聚唾液酸；胎盤特異性1（PLAC1）；globoH醣神經醯胺（GloboH）的六碳糖部分；乳腺分化抗原（NY-BR-1）；Uroplakin 2（UPK2）；A型肝炎病毒細胞受體1（HAVCR1）；腎上腺素受體β3（ADRB3）；泛連接蛋白（Pannexin）3（PANX3）；G蛋白共軛受體20（GPR20）；淋巴球抗原6複合體、座位K9（LY6K）；嗅覺受體51E2（OR51E2）；TCRγ選擇性閱讀框架蛋白（TARP）；威爾姆氏腫瘤（Wilms’s tumor）蛋白質（WT1）；位於染色體12p的ETS轉位變異體基因6（ETV6-AML）；精子蛋白質17（SPA17）；X抗原家族、成員1A（XAGE1）；結合血管生成素的細胞表面受體2（Tie 2）；黑色素瘤癌睪丸抗原-1（MAD-CT-1）；黑色素瘤癌睪丸抗原-2（MAD-CT-2）；Fos相關抗原1；p53變異體；人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）；肉瘤轉位切點；細胞凋亡的黑色素瘤抑制劑（ML-IAP）；ERG（穿膜型蛋白酶、絲胺酸2（TMPRSS2）ETS融合基因）；N-乙醯基葡萄糖胺轉移酶V（NA17）；Paired Box 蛋白質Pax-3（PAX3）；雄激素受體；週期素B1；v-myc禽類骨髓細胞瘤病毒癌基因神經母細胞瘤衍生同系物（MYCN）；Ras同系物家族成員C（RhoC）；細胞色素P450 1B1（CYP1B1）；CCCTC結合因子（鋅指蛋白）類（BORIS）；T細胞3辨識的扁平上皮細胞腫瘤抗原（SART3）；Paired Box 蛋白質Pax-5（PAX5）；前頂體素（proacrosin）結合蛋白p32（OY-TES1）；淋巴球特異性蛋白質酪胺酸激酶（LCK）；A激酶錨蛋白4（AKAP-4）；滑膜肉瘤、X切點2（SSX2）；CD79a；CD79b；CD72；類白血球相關免疫球蛋白受體1（LAIR1）；IgA受體的Fc片段（FCAR）；類白血球免疫球蛋白受體次家族成員Aｰ2（LILRA2）；類CD300分子家族成員f（CD300LF）；C型凝集素結構域家族12成員A（CLEC12A）；骨髓間質細胞抗原2（BST2）；含有類EGF模式的類黏液素類激素受體2（EMR2）；淋巴球抗原75（LY75）；磷脂肌醇聚糖-3（GPC3）；類Fc受體5（FCRL5）；及類免疫球蛋白λ多胜肽1（IGLL1）等。
「MHC抗原」為主要組織相容性複合體（MHC）的基因產物，其中，在細胞膜表現的醣蛋白主要分類為第I型MHC抗原（MHC class I antigen）和第II型MHC抗原（MHC class II antigen）。第I型MHC抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，第II型MHC抗原包含HLA-DR、-DQ、-DP。又，也包含由這些MHC抗原呈現的來自腫瘤抗原的胜肽。對於呈現GP100、MART-1、MAGE-1等的腫瘤抗原、或RAS或p53等的變異部分之MHC的複合體，也被視為是腫瘤抗原之一。
「分化抗原」是巨噬細胞、T細胞、B細胞等伴隨從骨髓幹細胞的分化而消長的細胞表面分子的總稱。分化抗原可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD70、CD71、CD73、CD95、CD99、CD102、CD106、CD117、CD122、CD126、CDw130。
用語「腫瘤」一般是指在身體表面或體內、觸感為團塊或具有顏色不同的部分等的總稱。腫瘤中有，具有自律性增生、浸潤或轉移、惡病質的3個特徵的惡性，以及只有自律性增生為特徵的良性，惡性腫瘤「癌」指異常細胞無法控制生長為特徵的疾病。癌細胞有局部地或透過血流及淋巴系統，蔓延至身體的其他部分的可能性。在本揭示說明了各種例子，不限於這些，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎臟癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及同種者。用語「腫瘤」及「癌」包含本揭示中同義使用，例如任何用語包含固體及液性、如瀰漫性或循環性的腫瘤。用語「癌」或「腫瘤」在本揭示使用時，包含癌前期的同樣惡性的癌及腫瘤。
本揭示之抗癌劑或後述的癌治療方法中的癌，可例如腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頭頸癌、子宮癌、肝癌、腎臟癌、胰臟癌、脾臟癌、肺癌、氣管癌、支氣管癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌等的癌，或骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織的癌以外，還有軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤（Ewing's Sarcoma）、惡性血管內皮細胞瘤、惡性許旺細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等的肉瘤，或肝胚細胞瘤(hepatoblastoma)、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、腎胚細胞瘤、神經母細胞瘤、胰胚細胞瘤、胸膜肺胚細胞瘤(pleuropulmonary blastoma)、視網膜胚細胞瘤(retinoblastoma)等的胚細胞瘤，胚胎細胞腫瘤(germ cell tumor)、淋巴瘤、或白血病。
在一實施形態，和癌症種類關聯的腫瘤抗原為經由正常細胞和癌細胞雙方表現的標記物（marker），例如系統性標記物，如B細胞上的CD19。在某特定態樣中，本揭示之腫瘤抗原來自原發性或轉移性黑色素腫瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臟癌、及腺癌，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及同種者，但不限於此等之癌。一實施態樣中，腫瘤抗原是特定的增殖性障礙共通的抗原。一實施態樣中，癌相關抗原為，相較於正常細胞，在癌細胞中過度表現，例如，和正常細胞相比，為1倍的表現、2倍的過度表現、3倍的過度表現或以上之細胞表面分子。一部份的實施態樣中，癌相關抗原為在癌細胞不適當地合成的細胞表面分子，例如和在正常細胞表現的分子相比，含有缺失、加成、或突變的分子。一實施態樣中，癌相關抗原的全部或片段（如MHC/胜肽）排他性在癌細胞表面表現、但在正常細胞表面未合成也未表現。一部份的實施態樣中，本揭示之嵌合受體及TRAB包含含有和經MHC呈現的胜肽結合的抗原結合域（例如抗體或抗體片段）之CAR及TRAB。通常，來自內因性蛋白質的胜肽填充主要組織相容性複合體（MHC）第I型分子的凹槽（pocket），經CD8+ T淋巴球上的T細胞受體（TCR）所辨識。MHC第I型複合體全部經由有核細胞結構性被表現。在癌中，病毒特異性及/或腫瘤特異性胜肽/MHC複合體為免疫療法用的細胞表面標靶的特有型的代表。在人類白血球抗原（HLA）-A1或HLA-A2的狀況，以來自病毒或腫瘤抗原的胜肽為標靶的類TCR抗體已被說明（例如Sastry et al., J Virol. 2011 85（5）：1935-1942；Sergeeva et al., Bood, 2011 117（16）：4262-4272；Verma et al., J Immunol 2010 184（4）：2156-2165；Willemsen et al., Gene Ther 2001 8（21）：1601-1608；Dao et al., Sci Transl Med 2013 5（176）：176ra33；Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19（2）：84-100）。例如，類TCR抗體可經由篩選人類scFv噬菌體展示資料庫等的資料庫而鑑定。
表示存在抗原中的抗原決定基之抗原決定位（epitope），是指和本說明書中揭示之抗原結合域結合的抗原上的部位。因此，例如抗原決定位可根據其結構而定義。又，根據對辨識該抗原決定位的抗原結合域中的抗原的結合活性，也可定義該抗原決定位。當抗原為胜肽或多胜肽的情形時，根據構成抗原決定位的胺基酸殘基，也可確定抗原決定位。又，當抗原決定位為糖鏈時，根據特定的糖鏈結構也可確定抗原決定位。
線狀抗原決定位為包含胺基酸一級序列被辨識的抗原決定位之抗原決定位。線狀抗原決定位典型在固有序列中包含至少3個、最普通至少5個，例如約8到10個、6到20個胺基酸。
立體抗原決定位，對照線狀抗原決定位，不是包含抗原決定位的胺基酸一級序列被辨識的抗原決定位的單一限定成分的抗原決定位（例如，胺基酸的一級序列不一定經特定的抗原決定位的抗體所辨識之抗原決定位）。立體抗原決定位，相對於線狀抗原決定位，可包含增大數目的胺基酸。關於立體抗原決定位的辨識，抗原結合域辨識胜肽或蛋白質的三級結構。例如，當蛋白質分子折疊形成三級結構時，形成立體抗原決定位的胺基酸及/或多胜肽主鏈並列，抗體可辨識抗原決定位。確定抗原決定位的立體結構的方法，包含例如X光結晶學、二維核磁共振光譜學及部位特異性自旋標籤及電磁順磁共振光譜學，但不限於此。例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology （1996），第66卷，Morris（編）。
和抗原決定位結合的抗原結合域的結構稱為互補位（paratope）。透過作用在抗原決定位和互補位之間的氫鍵、靜電力、凡得瓦力、疏水鍵等，使抗原決定位和互補位穩定結合。此抗原決定位和互補位之間的結合力稱為親和力（affinity）。複數個抗原和複數個抗原結合域結合時的結合力的總和稱為總結合力（avidity）。在包含複數個抗原結合域（即多價的）的抗體等和複數個抗原決定位結合時，由於親和力（affinity）加成作用，因此總結和力高於親和力。
在特定的實施態樣中，本說明書所提供之抗原結合域有≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM或≦0.001nM（例如，10-8 M以下，例如10-8 M～10-13 M，例如10-9 M～10-13 M）的解離常數（Kd）。
抗原結合域對抗原、或經含有抗原結合域的抗原結合分子對抗原決定位的結合的確認方法，可根據下列例子適宜實施。
例如，對某抗原的抗原結合域辨識存在某抗原分子中的線狀抗原決定位之事，例如可以如下確認。為了上述目的，合成由構成某抗原的細胞外域的胺基酸序列所形成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或者，利用某抗原的cDNA中、編碼相當於細胞外域的胺基酸序列的區域，經基因工程方法獲得。接著，評估由構成細胞外域的胺基酸序列所形成的線狀胜肽、和對某抗原的抗原結合域的結合活性。例如，經由以固定的線狀胜肽作為抗原的ELISA，可評估該抗原結合域對該胜肽的結合活性。或者，基於該抗原結合域對某抗原表現細胞的結合中、因線狀胜肽的抑制水平，可得知對線狀胜肽的結合活性。經由這些試驗，可得知該抗原結合域對線狀胜肽的結合活性。
又，對某抗原的抗原結合域辨識立體抗原決定位之事，可如下述確認。為了上述目的，調製表現某抗原的細胞。例如，對某抗原、抗原結合域和某抗原表現細胞接觸之時，和該細胞強力結合，另一方面，該抗原結合域對由固定的構成某抗原的細胞外域之胺基酸序列所形成的線狀胜肽，或者該抗原結合域對使用胍等的一般變性劑而變性的構成某抗原的細胞外域之胺基酸序列所形成的線狀胜肽，實質上不結合時等。此述實質上不結合是指對人類的某抗原表現細胞的結合活性的80%以下，通常為50%以下，較佳為30%以下，特佳為15%以下的結合活性。
又，確認抗原結合域的抗原結合活性的方法，例如經由放射性標記抗原結合分析法（radiolabeled antigen binding assay；RIA）測量Kd值的方法。一實施態樣中，RIA使用目標抗原結合域及其抗原來進行。例如，對抗原的抗原結合域在溶液中的親和性可經由在非標記抗體的漸增量系列存在下經最小濃度的（125I）標記抗原使抗原結合域平衡化，接著以塗佈抗原結合域的盤捕捉結合的抗原來測量（例如Chen et al., J. Mol. Biol. 293：865-881（1999））。
根據另一實施態樣，Kd使用BIACORE（註冊商標）的表面電漿共振法測量。例如使用BIACORE（註冊商標）-2000或 BIACORE（註冊商標）-3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）的測量法，使用固定約10反應單位（response unit： RU）的抗原的CM5晶片在25℃實施。在一實施態樣，羧甲基化右旋糖苷（dextran）生物感測晶片（CM5、BIACORE, Inc.），根據供應商的指南，使用N-乙基-N’-（3-二甲基胺基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）及N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）而活化。抗原在以5μl/分的流速注入以達到和約10反應單位（RU）的蛋白質結合之前，使用10mM醋酸鈉、pH4.8，稀釋成5μg/ml（約0.2μM）。抗原注入後，為了阻斷未反應基，注入1M乙醇胺。為了動態測量，在25℃、約25μl/分的流速注入含有0.05%聚山梨醇酯20 （TWEEN-20（商標））界面活性劑的PBS（PBST）中的抗原結合域的2倍系列稀釋物（0.78nM～500nM）。結合速度 （kon） 及解離速度 （koff）以使用單純1對1朗繆耳（Langmuir ）結合模型（BIACORE（註冊商標）評估軟體3.2版），同時符合結合及解離的感測柱來計算。平衡解離常數（Kd） 以koff/kon的比來計算。再者，透過使用平衡法分析，也可求得表觀解離常數（Kd）。這些方法參考BIACORE（註冊商標）附屬的操作手冊。例如參考Chen et al., J. Mol. Biol. 293：865-881 （1999） 或Methods Enzymol. 2000；323：325-40。又在表面電漿共振分析法中，固定的蛋白質質量或用於反應的蛋白質質量、溫度、溶液組成也可根據此技術領域之人士變更。在根據上述表面電漿共振分析法，離子速度超過106 M-1 s-1 時，離子速度可使用在分光計（例如停流式分光光度計（Aviv Instruments）或使用攪拌比色管的系列8000的SLM-AMINCO（註冊商標）分光光度計 （ThermoSpectronic））中所測量的、在漸增濃度的抗原存在下，測量在PBS、pH7.2中20nM的抗原結合域在25℃的螢光發光強度（激發=295nm；發光=340nm、帶通16nm）的增加或減少的螢光消光技術而確定。
再者，抗原結合域的抗原結合活性也能夠以電化學發光法等之已知的分子間交互作用的測量方法來測量。
測量對某抗原的抗原結合域對某抗原的表現細胞的結合活性的方法，例如Antibodies A Laboratory Manual記載之方法（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory （1988） 359-420）。亦即，以某抗原的表現細胞作為抗原的ELISA或FACS（fluorescence activated cell sorting；螢光流式細胞分選法）的原理而可評估。
在ELISA型式中，對某抗原的抗原結合域對該抗原的表現細胞的結合活性，根據比較經酵素反應所生成的訊號水平而定量評估。亦即，在固定有某抗原的表現細胞的ELISA盤加入受檢的抗原結合域，利用辨識受檢抗原結合域之酵素標記抗體，檢測出和細胞結合的受檢抗原結合域。或者，在FACS中，將受檢抗原結合域系列稀釋，確定對某抗原的表現細胞的抗體結合力價（titer），可比較受檢抗原結合域對某抗原的表現細胞的結合活性。
受檢的抗原結合域對懸浮於緩衝液等的細胞的表面上所表現的抗原的結合，可經由流式細胞儀檢測。流式細胞儀已知有例如以下的裝置。 FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM （皆為BD Biosciences社的商品名） EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（皆為Beckman Coulter社的商品名）。
例如，對某抗原的抗原結合域對抗原的結合活性的較佳測量方法之一例，如下列方法。首先，以辨識和表現某抗原的細胞反應的受檢抗原結合域的FITC標記的次級抗體染色。以適當較佳的緩衝液稀釋受檢抗原結合域，將該抗原結合域調製為所欲濃度而使用。例如，可在10μg/ml到10 ng/ml之間的任一濃度使用。接著，以FACSCalibur（BD社）測量螢光強度和細胞數。抗原結合域對該細胞的結合量可以CELL QUEST Software（BD社）分析所得的螢光強度，亦即反映為幾何平均值（Geometric Mean）。即，經由獲得該幾何平均值，可根據受檢抗原結合域的結合量，測量所表示的受檢抗原結合域的結合活性。
對某抗原的抗原結合域具有和某抗原結合域共有的抗原決定位之事，可經由兩者對相同抗原決定位的競爭來確認。抗原結合域之間的競爭經由交叉阻斷分析法等檢測。例如，競爭性ELISA分析法為較佳的交叉阻斷分析法。
具體為，在交叉阻斷分析法中，塗佈在微滴定盤的孔上的某抗原蛋白質，在候補的競爭抗原結合域的存在下、或不存在下預培養後，添加受檢抗原結合域。和孔中的某抗原蛋白質結合的受檢抗原結合域的量，和對相同抗原決定位結合競爭的候補的競爭抗原結合域的結合能力間接相關。亦即，對同一抗原決定位的競爭抗原結合域的親和性越大，受檢抗原結合域對塗佈某抗原蛋白質的孔的結合活性越低。
透過某抗原蛋白質而和孔結合的受檢抗原結合域的量，可經由事先標記抗原結合域而容易測量。例如，經生物素標記的抗原結合域，經由使用抗生物素蛋白（avidin）過氧化酶共軛物和適當的基質而測量。利用過氧化酶等的酵素標記之交叉阻斷分析法，特別稱為競爭性ELISA分析法。抗原結合域能夠以可檢測或測量的其他標記物質標記，具體為，放射性標記或螢光標記等為公知。
在候補的競爭抗原結合域締和體不存在下所實施的控制組試驗中，和所得的結合活性相比，如果競爭抗原結合域可阻斷對某抗原的抗原結合域的結合至少20%、較佳為至少20-50%、更佳為至少50%，則該受檢抗原結合域和競爭抗原結合域實質上和同一抗原決定位結合，或對同一抗原決定位的結合競爭之抗原結合域。
在鑑定和對某抗原的抗原結合域結合的抗原決定位的結構的情形時，受檢抗原結合域和對照抗原結合域共有抗原決定位者，可經由比較抗原結合域對於在構成該抗原決定位的胜肽導入胺基酸變異的胜肽或多胜肽之兩者的結合活性而評估。
測量如此結合活性之方法，例如在上述ELISA型式中，比較受檢抗原結合域及對照抗原結合域對導入變異的線狀胜肽的結合活性而測量。ELISA以外的方法，也可經由使受檢抗原結合域和對照抗原結合域流下後，定量溶出液中所溶出的抗原結合域，測量對結合於管柱的該變異胜肽的結合活性。使變異胜肽和例如GST的融合胜肽吸附管柱的方法為公知。
又，當已鑑定的抗原決定位為立體抗原決定位的情形時，受檢抗原結合域和對照抗原結合域共有抗原決定位者，可以下列方法評估。首先，調製在表現某抗原的細胞和抗原決定位導入變異的表現某抗原的細胞。對這些細胞懸浮在PBS等的適當緩衝液的細胞懸浮液，添加受檢抗原結合域和對照抗原結合域。接著，對於以適當緩衝液洗淨的細胞懸浮液，添加可辨識受檢抗原結合域和對照抗原結合域的FITC標記抗體。經標記抗體染色的細胞的螢光強度和細胞數以FACSCalibur（BD社）測量。受檢抗原結合域和對照抗原結合域的濃度以適當的緩衝液適當稀釋，調製成所欲濃度使用。例如，在10μg/ml至10 ng/ml之間的任一濃度使用。標記抗體對該細胞的結合量經由使用CELL QUEST Software（BD社）分析所得的螢光強度，亦即，反映為幾何平均值。即，經由獲得該幾何平均值，根據標記抗體的結合量，可測得所表的受檢抗原結合域和對照抗原結合域的結合活性。
再者，抗原結合域對和其他抗原結合域相同的抗原決定位的競爭之確認，除上述ELISA或FACS以外，也可利用放射性標記抗原結合測定法 （radiolabeled antigen binding assay： RIA）、BIACORE（註冊商標）表面電漿共振分析法、電化學發光法等。
將反映分析所得的受檢抗原結合域對變異的某抗原的表現細胞的結合量之幾何平均值的比較值（變異的某抗原的分子ΔGeo-Mean値），和反映受檢抗原結合域對某抗原的表現細胞的結合量之ΔGeo-Mean値，進行比較。在此情形，在求得對變異的某抗原的表現細胞及某抗原的表現細胞之ΔGeo-Mean値時所使用的受檢抗原結合域的濃度，以相同或實質上相同的濃度調製者特別良好。利用事先確認辨識某抗原中的抗原決定位的抗原結合域作為對照抗原結合域。
受檢抗原結合域對變異的某抗原的表現細胞的ΔGeo-Mean比較値，如果小於受檢抗原結合域對某抗原的表現細胞的ΔGeo-Mean比較値的至少80%、較佳為50%、更佳為30%、特佳為15%，則為「和變異的某抗原的表現細胞實質上不結合」。計算ΔGeo-Mean値（Geometric Mean）的算式記載於CELL QUEST Software User's Guide（BD biosciences社）。經由比較比較值，如果為實質上可視為相同的程度，則可評估受檢抗原結合域和對照抗原結合域的抗原決定位相同。
本說明書中用語「搬運部分」是指抗原結合分子中的抗原結合域以外的部分。本發明之搬運部分通常為由胺基酸所構成的胜肽或多胜肽，一具體實施態樣為，抗原結合分子中的搬運部分透過切點和抗原結合域連結。本發明之搬運部分可以是透過醯胺鍵連結一連串的胜肽或多胜肽，也可以是複數個胜肽或多胜肽經雙硫鍵等的共價鍵結或氫鍵、疏水性交互作用等的非共價鍵結所形成的複合體。
本發明一些實施態樣中，和連接子切斷前的抗原結合分子相比，連接子切斷後的抗原結合分子的抗原結合活性變得更高。換言之，經由連接子的切斷而去除的部分，抗原結合分子的抗原結合域的抗原結合活性為經抑制域而受到抑制的狀態。確認抗原結合域的抗原結合活性經抑制域而受到抑制的方法，有FACS（fluorescence activated cell sorting；螢光流式細胞分選法）、ELISA（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；酵素連結免疫吸附分析法）、ECL（electrogenerated chemiluminescence；電化學發光法）、SPR（Surface Plasmon Resonance；表面電漿共振）法（Biacore）、BLI（Bio-Layer Interferometry；生物膜干涉技術）法（Octet）等的方法。本發明一些實施態樣中，和連接子切斷前的抗原結合分子的結合活性相比，連接子切斷後的抗原結合分子的結合活性成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的值。本發明更具體的一些實施態樣中，游離前的抗原結合域在以上列方法擇一方法進行抗原結合域的抗原結合活性的測量時，未發現抗原結合域和抗原的結合。
本發明一些實施態樣中，抗原結合活性的比較，可經由比較連接子切斷前後的抗原結合活性來進行。亦即，和使用連接子切斷前的抗原結合分子所測量的抗原結合活性相比，使用連接子切斷後的抗原結合分子所測量的抗原結合活性成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的値。在更具體的一些實施態樣中，連接子切斷前的抗原結合分子在以上列方法擇一方法進行抗原結合活性的測量時，未發現抗原結合域和抗原的結合。
本發明一些實施態樣中，由於抗原結合分子具有的連接子經蛋白酶而被切斷，在如此態樣的抗原結合活性的比較，可經由比較抗原結合分子在蛋白酶處理前後的抗原結合活性來進行。亦即，和使用未進行蛋白酶處理的抗原結合分子測量的抗原結合活性相比，使用蛋白酶處理後的抗原結合分子所測量的抗原結合活性成為2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的値。在更具體的一些實施態樣中，未進行蛋白酶處理的抗原結合分子在以上列方法擇一方法進行抗原結合活性的測量時，未發現抗原結合域和抗原的結合。
本發明中，連接子切斷前的抗原結合分子，和連接子切斷後的抗原結合分子相比，具有較長的血中半衰期。為了使抗原結合分子的半衰期變得更長，本發明之一些實施態樣中，連接子切斷前的抗原結合分子設計為具有較長的血中半衰期。延長血中半衰期的實施態樣不限於該等，例如連接子切斷前的抗原結合分子的分子量大者、或具有FcRn結合性者、或具有白蛋白結合性者、或PEG化者。
本發明中，半衰期的比較以比較在人類的血中半衰期者為佳。在測量在人類的血中半衰期有困難的情形，可根據在小鼠（例如，正常小鼠、表現人類抗原的轉殖基因鼠、表現人類FcRn的轉殖基因鼠等）或猴（例如食蟹猴等）的血中半衰期來預測在人類的血中半衰期。
延長抗原結合分子的血中半衰期之一實施態樣，例如對連接子被切斷前的抗原結合分子提供FcRn結合性。對於具有FcRn結合性，通常有在連接子被切斷前的抗原結合分子設置FcRn結合區的方法。FcRn結合區，是指具有和FcRn的結合性的區域，只要是具有和FcRn的結合性，任何結構皆可使用。
經由包含FcRn結合區者，可透過FcRn的補救合成路徑（salvage pathway）被攝入細胞內後，再度回到血將中。例如IgG分子的血漿中滯留性較長（消失慢），就是因為已知的FcRn作為IgG分子的補救受體（salvage receptor）作用的緣故。經由胞飲作用被攝入胞內體（endosome）的IgG分子，在胞內體內的酸性條件下，和在胞內體內表現的FcRn結合。不能和FcRn結合的IgG分子雖然進入溶酶體（lysosome）在該處被分解，但和FcRn結合的IgG分子向細胞表面移動，在血漿中的中性條件下，從FcRn解離，再度回到血漿中。
FcRn結合區較佳為直接和FcRn結合的區域。FcRn結合區的較佳例，如抗體的FcRn區。但是，可和具有白蛋白或IgG等和FcRn的結合能力的多胜肽結合的區域可透過白蛋白或IgG等間接和FcRn結合，因此本發明之FcRn結合區也可為和具有如此FcRn的結合能力的多胜肽結合的區域。
本發明之FcRn結合區的FcRn，特別是對人類FcRn的結合活性，如前述結合活性的段落所述，可根據此技術領域之人士以公知方法測量，條件可由此技術領域之人士適宜決定。對人類FcRn的結合活性能夠以KD（Dissociation constant：解離常數）、表觀KD（Apparent dissociation constant：外觀解離常數）、解離速度之kd（Dissociation rate：解離速度）、或表觀kd（Apparent dissociation：表觀解離速度）等來評估。這些可根據此技術領域之人士以公知方法測量。可使用例如Biacore（GE healthcare）、斯卡查德圖（Scatchard plot）、流式細胞儀等。
測量FcRn結合區對FcRn的結合活性時的條件可由此技術領域之人士適宜選擇，沒有特別限定。例如可如WO2009/125825記載在MES緩衝液、37℃的條件測量。又，本發明之FcRn結合區對FcRn的結合活性的測量可以此技術領域之人士的公知方法進行，可使用例如Biacore（GE Healthcare）等而測量。
測量條件所使用之pH，FcRn結合區和FcRn的結合親和力可在pH4.0～pH6.5的任意pH評估。較佳為，為了確定FcRn結合區和人類的FcRn的結合親和性，使用接近活體內的早期胞內體內的pH之pH5.8～pH6.0的pH。測量條件所使用的溫度，FcRn結合區和FcRn的結合親和力也可在10℃～50℃的任意溫度評估。較佳為，為了確定FcRn結合區和人類FcRn的結合親和性，使用15℃～40℃的溫度。較佳為，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、及35℃任一個之20℃至35℃的任意溫度，同樣的也可用於確定FcRn結合區和FcRn的結合親和性使用。所謂25℃的溫度為本發明態樣之非限定一例。
FcRn結合區之一例，不限於該等，例如IgG抗體Fc區。使用IgG抗體Fc區時，不限定其種類，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的Fc區。
又，天然型IgG抗體的FcRn區只要具有FcRn結合性，當然也可使用一個或以上的胺基酸被取代的變異FcRn區。例如，可使用包含選自IgG抗體Fc區中EU編號第237位、第238位、第239位、第248位、第250位、第252位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第265位、第270位、第286位、第289位、第297位、第298位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第312位、第314位、第315位、第317位、第325位、第332位、第334位、第360位、第376位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第424位、第428位、第433位、第434位及第436位之至少1個胺基酸被取代為其他胺基酸的變異Fc區。
更具體為，可使用包含選自IgG抗體Fc區中EU編號： 第237位Gly取代為Met的胺基酸取代； 第238位Pro取代為Ala的胺基酸取代； 第239位Ser取代為Lys的胺基酸取代； 第248位Lys取代為Ile的胺基酸取代； 第250位Thr取代為Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr的胺基酸取代； 第252位Met取代為Phe、Trp、或Tyr的胺基酸取代； 第254位Ser取代為Thr的胺基酸取代； 第255位Arg取代為Glu的胺基酸取代； 第256位Thr取代為Asp、Glu、或Gln的胺基酸取代； 第257位Pro取代為Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val的胺基酸取代； 第258位Glu取代為His的胺基酸取代； 第265位Asp取代為Ala的胺基酸取代； 第270位Asp取代為Phe的胺基酸取代； 第286位Asn取代為Ala或Glu的胺基酸取代； 第289位Thr取代為His的胺基酸取代； 第297位Asn取代為Ala的胺基酸取代； 第298位Ser取代為Gly的胺基酸取代； 第303位Val取代為Ala的胺基酸取代； 第305位Val取代為Ala的胺基酸取代； 第307位Thr取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr的胺基酸取代； 第308位Val取代為Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr的胺基酸取代； 第309位Leu或Val取代為Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg的胺基酸取代； 第311位Gln取代為Ala、His、或Ile的胺基酸取代； 第312位Asp取代為Ala或His的胺基酸取代； 第314位Leu取代為Lys或Arg的胺基酸取代； 第315位Asn取代為Ala或His的胺基酸取代； 第317位Lys取代為Ala的胺基酸取代； 第325位Asn取代為Gly的胺基酸取代； 第332位Ile取代為Val的胺基酸取代； 第334位Lys取代為Leu的胺基酸取代； 第360位Lys取代為His的胺基酸取代； 第376位Asp取代為Ala的胺基酸取代； 第380位Glu取代為Ala的胺基酸取代； 第382位Glu取代為Ala的胺基酸取代； 第384位Asn或Ser取代為Ala的胺基酸取代； 第385位Gly取代為Asp或His的胺基酸取代； 第386位Gln取代為Pro的胺基酸取代； 第387位Pro取代為Glu的胺基酸取代； 第389位Asn取代為Ala或Ser的胺基酸取代； 第424位Ser取代為Ala的胺基酸取代； 第428位Met取代為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr的胺基酸取代； 第433位His取代為Lys的胺基酸取代； 第434位Asn取代為Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr的胺基酸取代；以及 第436位Tyr或Phe取代為His的胺基酸取代； 之至少1個胺基酸被取代為其他胺基酸的變異Fc區。
從另一方面看，可使用包含選自IgG抗體Fc區中EU編號： 第237位的胺基酸的Met； 第238位的胺基酸的Ala； 第239位的胺基酸的Lys； 第248位的胺基酸的Ile； 第250位的胺基酸的Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr； 第252位的胺基酸的Phe、Trp、或Tyr； 第254位的胺基酸的Thr； 第255位的胺基酸的Glu； 第256位的胺基酸的Asp、Glu、或Gln； 第257位的胺基酸的Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val； 第258位的胺基酸的His； 第265位的胺基酸的Ala； 第270位的胺基酸的Phe； 第286位的胺基酸的Ala或Glu； 第289位的胺基酸的His； 第297位的胺基酸的Ala； 第298位的胺基酸的Gly； 第303位的胺基酸的Ala； 第305位的胺基酸的Ala； 第307位的胺基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr； 第308位的胺基酸的Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr； 第309位的胺基酸的Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg； 第311位的胺基酸的Ala、His、或Ile； 第312位的胺基酸的Ala或His； 第314位的胺基酸的Lys或Arg； 第315位的胺基酸的Ala或His； 第317位的胺基酸的Ala； 第325位的胺基酸的Gly； 第332位的胺基酸的Val； 第334位的胺基酸的Leu； 第360位的胺基酸的His； 第376位的胺基酸的Ala； 第380位的胺基酸的Ala； 第382位的胺基酸的Ala； 第384位的胺基酸的Ala； 第385位的胺基酸的Asp或His； 第386位的胺基酸的Pro； 第387位的胺基酸的Glu； 第389位的胺基酸的Ala或Ser； 第424位的胺基酸的Ala； 第428位的胺基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr； 第433位的胺基酸的Lys； 第434位的胺基酸的Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr；以及 第436位的胺基酸的His； 之至少1個胺基酸的Fc區。
抗原結合分子亦可為在抗原結合域具有FcRn結合性。使連接子切斷前的抗原結合分子的血中半衰期較抗原結合域的血中半衰期更長的實施態樣，當然可為抗原結合域不具有FcRn結合性者，亦可為即使抗原結合域具有FcRn結合性，也是具有較連接子切斷前的抗原結合分子弱的FcRn結合性。
又，延長血中半衰期的一實施態樣，有使連接子切斷前的抗原結合分子和白蛋白結合的方法。白蛋白不被腎排泄且具有FcRn結合性，因此血中半衰期長至17～19日（J Clin Invest. 1953 Aug； 32（8）： 746-768.）。因此被報導，和白蛋白結合的蛋白質體積增大，且可間接和FcRn結合，因而使血中半衰期增加（Antibodies 2015, 4（3）, 141-156）。
再者，延長血中半衰期的一實施態樣，有使連接子切斷前的抗原結合分子PEG化的方法。被認為透過使蛋白質PEG化，蛋白質的體積增大，同時透過抑制經血中的蛋白酶的分解，而延長蛋白質的血中半衰期（J Pharm Sci. 2008 Oct；97（10）：4167-83.）。
在本發明一些實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含抗體Fc區。具體的實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含人類IgG抗體之CH2域及CH3域。具體的一實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含從人類IgG1抗體重鏈Cys226、或從Pro230延伸至重鏈的羧基端的部分。但是，Fc區的C端的離胺酸（Lys447）或甘胺酸-離胺酸（Gly446-Lys447）可以存在也可以不存在。
在本發明一些實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含抗體恆定區。在較佳實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含IgG抗體恆定區。在較佳實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含人類IgG抗體恆定區。
在本發明再一些實施態樣，連接子切斷前的抗原結合分子包含具有實質上類似抗體重鏈恆定區的結構的區域，及具有實質上類似和該區域以雙硫鍵等的共價鍵或氫鍵、疏水性交互作用等的非共價鍵而結合的實質上類似抗體輕鏈的結構的區域。
抗原結合分子具有的連接子經蛋白酶以約0.001～1500×104 M-1 S-1 或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500×104 M-1 S-1 的速度特異性切斷。
本說明書中，用語「蛋白酶」是指使胜肽鍵水解的肽鏈內切酶（endopeptidase）或肽鏈端切酶（exopeptidase）等的酵素，通常指肽鏈內切酶。本揭示所使用之蛋白酶只限於可切斷蛋白酶切斷序列者，其種類沒有特別限制。在一些實施態樣，使用目標組織特異性蛋白酶。目標組織特異性蛋白酶可指下列任一個，例如： （1） 在目標組織以較正常組織高水平表現之蛋白酶， （2） 在目標組織具有較正常組織高的活性之蛋白酶， （3） 在目標細胞以較正常細胞高水平表現之蛋白酶， （4） 在目標細胞具有較正常細胞高的活性之蛋白酶。
在更具體的實施態樣中，可使用癌組織特異性蛋白酶或發炎組織特異性蛋白酶。
本說明書用語「目標組織」是指包含至少1個目標細胞的組織。在本發明之一些實施態樣中，目標組織為癌組織。在本發明之一些實施態樣中，目標組織為發炎組織。
用語「癌組織」是指包含至少1個癌細胞的組織。因此，可謂例如癌組織包含癌細胞和血管、參與包含癌細胞及內皮細胞之腫瘤（tumor mass）的形成之所有細胞型。本說明書中，腫瘤稱為腫瘤組織病兆（a foci of tumor tissue）。所謂「腫瘤」用語一般用於表示良性贅生物或惡性贅生物。
本說明書中，「發炎組織」例如以下例子。 ‧風濕性關節炎或退化性關節炎的關節 ‧支氣管氣喘或COPD的肺（肺泡） ‧發炎性腸道疾病或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的消化器官 ‧肝臟、腎臟、肺的纖維化的纖維化組織 ‧器官移植中引起排斥反應的組織 ‧動脈硬化或心臟衰竭的血管、心臟（心肌） ‧代謝症候群的內臟脂肪 ‧異位性皮膚炎或其他皮膚炎的皮膚組織 ‧椎間盤突出或慢性腰痛的脊髓神經。
在一些種類的目標組織中，已知被認為和特異性表現或特異性活化的蛋白酶或目標組織的疾病狀態相關的蛋白酶（目標組織特異性蛋白酶）。例如國際專利公開案WO2013/128194號、國際專利公開案WO2010/081173號、國際專利公開案WO2009/025846號等揭示在癌組織特異性表現的蛋白酶。又在J Inflamm （Lond）. 2010； 7： 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul；6（7）：541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec；13（12）：904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4；17：23.、Dis Model Mech. 2014 Feb；7（2）：193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan；1824（1）：133-45.揭示認為和發炎相關的蛋白酶。
除了在目標組織特異性表現的蛋白酶外，也存在在目標組織特異性活化的蛋白酶。例如，有蛋白酶以不活化型表現、之後成為活化型的情形，在多個組織存在抑制活化型蛋白酶的物質，經由活化的過程和抑制劑的存在而控制活性（Nat Rev Cancer. 2003 Jul；3（7）：489-501.）。在目標組織中，有活化型蛋白酶脫離抑制而特異性活化者。活化型蛋白酶的測量方法可使用以辨識活化型蛋白酶的抗體之方法（PNAS 2013 Jan 2； 110（1）： 93-98.），或者將蛋白酶辨識的胜肽以螢光標記，在切斷前消光（quench）但切斷後發光之方法（Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep；9（9）：690-701. doi： 10.1038/nrd3053.）來測量。
從一觀點，用語「目標組織特異性蛋白酶」可指以下任一種： （i） 在目標組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在目標組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在目標細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶， （iv） 在目標細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。
不限制解釋，但具體的蛋白酶例如半胱胺酸蛋白酶（包含組織蛋白酶家族B、L、S等）、天冬醯胺酸蛋白酶（組織蛋白酶（Cathepsin） D、E、K、O等）、絲胺酸蛋白酶（包含Matriptase （包含MT-SP1）、組織蛋白酶 A及G、凝血酶（thrombin）、血纖維蛋白溶解酶（plasmin）、尿激酶（uPA）、組織型蛋白酶原活化因子（tPA）、彈性蛋白酶（elastase）、蛋白酶3、凝血酶、激酞釋放素（kallikrein）、中性蛋白酶（       tryptase）、凝乳酶（chymase））、金屬蛋白酶（包含膜結合型（MMP14-17及MMP24-25）及分泌型（MMP1-13及MMP18-23及MMP26-28）兩者的金屬蛋白酶 （MMP1-28）、蛋白酶的A去整合素及金屬蛋白酶 （A disintegrin and metalloproteinase；ADAM）、具有A去整合素或血小板反應素模體的金屬蛋白酶（ADAM proteases with thrombospondin motif；ADAMTS）、穿膜肽酶（穿膜肽酶α（meprin α）、穿膜肽酶β（meprin β）））、CD10（CALLA）、以及前列腺特異性抗原（PSA）、天冬門胺酸内肽酶（legumain）、TMPRSS3、TMPRSS4、嗜中性球彈性蛋白酶 （HNE）、β分泌酶（BACE）、纖維母細胞活化蛋白α（FAP）、顆粒酶B（Granzyme B）、 鳥糞嘌呤苯酶（GB）、肝素、腦啡肽酶（neprilysin）、NS3/4A、HCV-NS3/4、鈣蛋白酶（calpain）、ADAMDEC1、腎素、組織蛋白酶 C、組織蛋白酶 V/L2、組織蛋白酶 X/Z/P、Cruzipain、Otubain 2、激肽釋放素（kallikrein）相關肽酶 （KLKs（KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14））、骨塑型蛋白1（BMP-1）、活性蛋白C、血液凝固相關蛋白酶（第VIIa凝血因子、第IXa凝血因子、第Xa凝血因子、第XIa凝血因子、第XIIa凝血因子）、HtrA1、乳鐵蛋白（lactoferrin）、Marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4（DPP-4）、TMPRSS2、組織蛋白酶 F、組織蛋白酶 H、組織蛋白酶 L2、組織蛋白酶 O、組織蛋白酶 S、顆粒酶A、Gepsin calpain 2、麩胺酸羧基肽酶2、類AMSH-蛋白酶（AMSH-Like Proteases）、AMSH、γ分泌酶（γsecretase）、A抗血纖維蛋白溶解酶切斷酵素（APCE）、Decysin 1、N-乙醯化α連接酸性二肽基肽酶類1（N-Acetylated Alpha-Linked Acidic Dipeptidase-Like 1；NAALADL1）、弗林蛋白酶（furin）等。
從別的觀點，目標組織特異性蛋白酶可指癌組織特異性蛋白酶或發炎組織特異性蛋白酶。
癌組織特異性蛋白酶例如國際專利公開案WO2013/128194號、國際專利公開案WO2010/081173號、國際專利公開案WO2009/025846號等揭示之在癌組織特異性表現的蛋白酶。
癌組織特異性蛋白酶的種類，在治療對象的癌組織的表現的特異性越高，得到副作用減少效果。癌組織特異性蛋白酶宜為在癌組織的濃度高於在正常組織的濃度的5倍以上，較佳為高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。又，癌組織特異性蛋白酶宜為在癌組織的活性高於在正常組織的活性的2倍以上，較佳為高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。
又，癌組織特異性蛋白酶也可和癌細胞的細胞膜結合，也可不和細胞膜結合而分泌於細胞外。在癌組織特異性蛋白酶不和癌細胞的細胞膜結合的情形，為了使經免疫細胞的細胞毒性在癌細胞為特異性，癌組織特異性蛋白酶較佳存在癌組織的內部或附近。本說明書之「癌組織附近」是指在癌組織特異性蛋白酶切斷序列被切斷、抗原結合域發揮抗原結合活性的範圍內。但是，儘可能不傷害正常細胞的範圍為佳。
從別的觀點，癌組織特異性蛋白酶為以下任一種： （i） 在癌組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在癌組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在癌細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶， （iv） 在癌細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。
癌組織特異性蛋白酶可為1種單獨，也可組合2種以上。癌組織特異性蛋白酶的種類，可考慮治療對象的癌種類，由此技術領域之人士適當設定。
從上述觀點，癌組織特異性蛋白酶，在上列舉例之蛋白酶中，以絲胺酸蛋白酶和金屬蛋白酶為佳，更佳為Matriptase（包含MT-SP1）、尿激酶（uPA）及金屬蛋白酶，更佳為MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9。
發炎組織特異性蛋白酶的種類，在治療對象的發炎組織的表現的特異性越高，得到副作用減少效果。發炎組織特異性蛋白酶宜為在發炎組織的濃度高於在正常組織的濃度的5倍以上，較佳為高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。又，發炎組織特異性蛋白酶宜為在發炎組織的活性高於在正常組織的活性的2倍以上，較佳為高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。
又，發炎組織特異性蛋白酶也可和發炎細胞的細胞膜結合，也可不和細胞膜結合而分泌於細胞外。在發炎組織特異性蛋白酶不和發炎細胞的細胞膜結合的情形，為了使經免疫細胞的細胞毒性在發炎細胞為特異性，發炎組織特異性蛋白酶較佳存在發炎組織的內部或附近。本說明書之「發炎組織附近」是指在發炎組織特異性蛋白酶切斷序列被切斷、抗原結合域發揮抗原結合活性的範圍內。但是，儘可能不傷害正常細胞的範圍為佳。
從別的觀點，發炎組織特異性蛋白酶為以下任一種： （i） 在發炎組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在發炎組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在發炎細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶， （iv） 在發炎細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。
發炎組織特異性蛋白酶可為1種單獨，也可組合2種以上。發炎組織特異性蛋白酶的種類，可考慮治療對象的病狀，由此技術領域之人士適當設定。
從上述觀點，發炎組織特異性蛋白酶，在上列舉例之蛋白酶中，以金屬蛋白酶為佳，在金屬蛋白酶中，以ADAMTS5、MMP2、MMP7、MMP9、MMP13較佳。
蛋白酶切斷序列為在水溶液中抗原結合分子經目標組織特異性蛋白酶而水解之時，經由該目標組織特異性蛋白酶特異性辨識的特定胺基酸序列。
從降低副作用的觀點，蛋白酶切斷序列較佳為經由在治療對象的目標組織/細胞中更特異性表現、或在治療對象的目標組織/細胞中更特異性活化的目標組織特異性蛋白酶，以高特異性水解的胺基酸序列。
具體的蛋白酶切斷序列例如國際專利公開案WO2013/128194號、國際專利公開案WO2010/081173號、國際專利公開案WO2009/025846號等揭示之經由上列舉例之在癌組織特異性表現的蛋白酶、發炎組織特異性蛋白酶等而特異性被水解的標靶序列。也可使用經由已知的蛋白酶，在特異性被水解的標靶序列導入適當的胺基酸變異等的人為變異的序列。又，蛋白酶切斷序列也可使用如Nature Biotechnology 19, 661-667 （2001）所記載之此技術領域之人士公知方法而鑑定之物。
再者，也可使用天然存在的蛋白酶切斷序列。例如，如TGFβ透過蛋白酶的切斷而變化為潛在型，也可使用以蛋白酶的切斷而改變分子形式的蛋白質中的受蛋白酶切斷的序列。
蛋白酶切斷序列之例，雖不限於該等，但可使用國際專利公開案WO2015/116933號、國際專利公開案WO2015/048329號、國際專利公開案WO2016/118629號、國際專利公開案WO2016/179257號、國際專利公開案WO2016/179285號、國際專利公開案WO2016/179335號、國際專利公開案WO2016/179003號、國際專利公開案WO2016/046778號、國際專利公開案WO2016/014974號、日本專利申請案2019-105464號、美國專利公開案US2016/0289324號、美國專利公開案US2016/0311903號、PNAS （2000） 97： 7754-7759.、Biochemical Journal （2010） 426： 219-228.、Beilstein J Nanotechnol. （2016） 7： 364-373.中所示之序列。
蛋白酶切斷序列，如上述，較佳為由適當的目標組織特異性蛋白酶特異性被水解的胺基酸序列。經目標組織特異性蛋白酶特異性被水解的胺基酸序列中，以包含下列胺基酸序列的序列為佳。 LSGRSDNH（可經MT-SP1、uPA切斷） PLALAG（可經MMP2、MMP9切斷） VPLSLTMG（可經MMP7切斷）
蛋白酶切斷序列也可使用下列序列。 TSTSGRSANPRG（可經由MT-SP1、uPA切斷） ISSGLLSGRSDNH（可經由MT-SP1、uPA切斷） AVGLLAPPGGLSGRSDNH（可經由MT-SP1、uPA切斷） GAGVPMSMRGGAG（可經由MMP1切斷） GAGIPVSLRSGAG（可經由MMP2切斷） GPLGIAGQ（可經由MMP2切斷） GGPLGMLSQS（可經由MMP2切斷） PLGLWA（可經由MMP2切斷） GAGRPFSMIMGAG（可經由MMP3切斷） GAGVPLSLTMGAG（可經由MMP7切斷） GAGVPLSLYSGAG（可經由MMP9切斷） AANLRN（可經由MMP11切斷） AQAYVK（可經由MMP11切斷） AANYMR（可經由MMP11切斷） AAALTR（可經由MMP11切斷） AQNLMR（可經由MMP11切斷） AANYTK（可經由MMP11切斷） GAGPQGLAGQRGIVAG（可經由MMP13切斷） PRFKIIGG（可經由原尿激酶（pro-urokinase）切斷） PRFRIIGG（可經由原尿激酶切斷） GAGSGRSAG（可經由uPA切斷） SGRSA（可經由uPA切斷） GSGRSA（可經由uPA切斷） SGKSA（可經由uPA切斷） SGRSS（可經由uPA切斷） SGRRA（可經由uPA切斷） SGRNA（可經由uPA切斷） SGRKA（可經由uPA切斷） QRGRSA（可經由tPA切斷） GAGSLLKSRMVPNFNAG（可經由組織蛋白酶B切斷） TQGAAA（可經由組織蛋白酶B切斷） GAAAAA（可經由組織蛋白酶B切斷） GAGAAG（可經由組織蛋白酶B切斷） AAAAAG（可經由組織蛋白酶B切斷） LCGAAI（可經由組織蛋白酶B切斷） FAQALG（可經由組織蛋白酶B切斷） LLQANP（可經由組織蛋白酶B切斷） LAAANP（可經由組織蛋白酶B切斷） LYGAQF（可經由組織蛋白酶B切斷） LSQAQG（可經由組織蛋白酶B切斷） ASAASG（可經由組織蛋白酶B切斷） FLGASL（可經由組織蛋白酶B切斷） AYGATG（可經由組織蛋白酶B切斷） LAQATG（可經由組織蛋白酶B切斷） GAGSGVVIATVIVITAG（可經由組織蛋白酶L切斷） APMAEGGG（可經由穿膜肽酶（meprin）α、穿膜肽酶β切斷） EAQGDKII（可經由穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切斷） LAFSDAGP（可經由穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切斷） YVADAPK（可經由穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切斷） RRRRR（可經由弗林蛋白酶（furin）切斷） RRRRRR（可經由弗林蛋白酶（furin）切斷） GQSSRHRRAL（可經由弗林蛋白酶（furin）切斷） SSRHRRALD（可經由TGFβ切斷） RKSSIIIRMRDVVL（可經由血纖維蛋白溶酶原（Plasminogen）切斷） SSSFDKGKYKKGDDA（可經由Staphylokinase切斷） SSSFDKGKYKRGDDA（可經由Staphylokinase切斷） IEGR（可經由第Xa凝血因子切斷） IDGR（可經由第Xa凝血因子切斷） GGSIDGR（可經由第Xa凝血因子切斷） GPQGIAGQ（可經由膠原蛋白酶（Collagenase）切斷） GPQGLLGA（可經由膠原蛋白酶切斷） GIAGQ（可經由膠原蛋白酶切斷） GPLGIAG（可經由膠原蛋白酶切斷） GPEGLRVG（可經由膠原蛋白酶切斷） YGAGLGVV（可經由膠原蛋白酶切斷） AGLGVVER（可經由膠原蛋白酶切斷） AGLGISST（可經由膠原蛋白酶切斷） EPQALAMS（可經由膠原蛋白酶切斷） QALAMSAI（可經由膠原蛋白酶切斷） AAYHLVSQ（可經由膠原蛋白酶切斷） MDAFLESS（可經由膠原蛋白酶切斷） ESLPVVAV（可經由膠原蛋白酶切斷） SAPAVESE（可經由膠原蛋白酶切斷） DVAQFVLT（可經由膠原蛋白酶切斷） VAQFVLTE（可經由膠原蛋白酶切斷） AQFVLTEG（可經由膠原蛋白酶切斷） PVQPIGPQ（可經由膠原蛋白酶切斷） LVPRGS（可經由凝血酶（Thrombin）切斷）。
在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由半胱胺酸蛋白酶切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由金屬蛋白酶切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由Matriptase切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由MT-SP1切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由uPA切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由Matriptase及uPA切斷。在一些實施態樣中，蛋白酶切斷序列至少可經由MT-SP1及uPA切斷。
在一態樣中，蛋白酶切斷序列選自由可經MMP切斷的PLALAG、VPLSLTMG、GAGVPMSMRGGAG、GAGIPVSLRSGAG、GPLGIAGQ、GGPLGMLSQS、PLGLWA、GAGRPFSMIMGAG、GAGVPLSLTMGAG、GAGVPLSLYSGAG、AANLRN、AQAYVK、AANYMR、AAALTR、AQNLMR、AANYTK、GAGPQGLAGQRGIVAG所組成的群。
在一態樣中，蛋白酶切斷序列選自由可經膠原蛋白酶切斷的GPQGIAGQ、GPQGLLGA、GIAGQ、GPLGIAG、GPEGLRVG、YGAGLGVV、AGLGVVER、AGLGISST、 EPQALAMS、 QALAMSAI、 AAYHLVSQ、MDAFLESS、ESLPVVAV、SAPAVESE、DVAQFVLT、VAQFVLTE、AQFVLTEG、PVQPIGPQ所組成的群。
蛋白酶切斷序列也可使用序列識別號1～725所示的序列。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自 A、 D、 E、 F 、G、H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 E 、F 、G、 H、 K、 M、 N、 P、 Q、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 F、 L、 M、 P、 Q、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M 、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸；X4 為R；X5為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸；X6 為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自 A、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5 為選自A、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自 E、 F、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S及W的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸；X4 為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 F 、G、 L、 M、 P、 Q、 V及W的胺基酸；X8為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8為選自 A、 D、 E、 F 、G、 I、 K、 N、T及W的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 G、 I、 P、 Q、 S及Y的胺基酸；X2為選自K或T的胺基酸；X3為G；X4為R；Ｘ5為Ｓ；X6為A；X7為選自 H、 I及V的胺基酸；X8為選自H、 V及Ｙ的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 其中，X1到X8各別表示1個胺基酸，X1為Y；X2為選自S及Ｔ的胺基酸；X3為G；X4為R；X5為S；X6為選自Ａ及E的胺基酸；X8為選自H、P、V及Y的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1 為選自 A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸；X6為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自A、 E 、F 、G、 H、 K、 M、 N、 P、 Q、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自 A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2為選自  A、 D、 F、 L、 M、 P、 Q、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自  A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自  A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自  A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自 R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自 A、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4 為R；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自 A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4為R；X5 為選自A、 D、 E、 G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 Q、 R、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1 為選自  A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自  A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4為R；X5 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自  E、 F、 K、 M、 N、 P、 Q、 R、 S及W的胺基酸；X7 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8為選自  A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1 為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自 A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3 為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X4為R；X5為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6 為選自A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 F 、G、 L、 M、 P、 Q、 V及W的胺基酸；X8為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自A、 D、 E 、F 、G、 H、 I、 K、 M、 N、 P、 Q、 S、 T、 W 及Y的胺基酸；X2 為選自A、 D、 E 、F、 H、 K、 L、 M、 P、 Q、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X3為選自 A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X5 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X6為選自 A、 D、 E、 F、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X7 為選自A、 D、 E、 F 、G、 H、 I、 K、 L、 M、 N、 P、 Q、 R、 S、 T、 V、 W 及Y的胺基酸；X8 為選自A、 D、 E、 F 、G、 I、 K、 N、 T及W的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為選自A、 G、 I、 P、 Q、 S及Y的胺基酸；X2為選自K或T的胺基酸；X3為G；X4為R；Ｘ5為S；X6為A；X7為選自H、 I及V的胺基酸；X8為選自H、 V及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
蛋白酶切斷序列也可使用下列所示者： X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 其中，X1到X9各別表示1個胺基酸，X1為Y；X2為選自S及Ｔ的胺基酸；X3為G；X4為R；X5為S；X6為選自Ａ及E的胺基酸；X8為選自H、 P、 V及Y的胺基酸；X9為選自R及G的胺基酸。
除使用上述蛋白酶切斷序列外，也可經由新的篩選獲得蛋白酶切斷序列。例如，從已知的蛋白酶切斷序列的結晶結構分析結果，改變切斷序列和酵素的活性殘基、辨識殘基的交互作用，可探索新的蛋白酶切斷序列。又，在已知的蛋白酶切斷序列中的胺基酸加入變異，經由確認和蛋白酶的交互作用，可探索新的蛋白酶切斷序列。另一例，使用噬菌體展示法、微脂體展示法等的活體外（in vitro）展示法，展示胜肽資料庫，或使用晶片或固定在珠的胜肽晶片（peptide array），經由確認和蛋白酶的交互作用，可探索以蛋白酶切斷的序列。確認蛋白酶切斷序列和蛋白酶的交互作用之方法，可經由活體外（in vitro）或活體內（in vivo）確認蛋白酶切斷來進行。
本揭示之蛋白酶切斷序列可經由蛋白酶以約0.001～1500×104 M-1 S-1 或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500×104 M-1 S-1 的速度特異性修飾（切斷）。
確認經蛋白酶切斷的方法 評估經由本說明書記載之蛋白酶基質或蛋白酶切斷序列的蛋白酶切斷之方法，例如Mol Cell Proteomics. 2014 Jun；13（6）：1585-97. doi：  10.1074/mcp.M113.033308. Epub 2014 Apr 4.所載之方法。
用於評估的蛋白酶的種類或濃度、處理溫度或處理時間可適宜選擇，例如可使用1000 nM含人類uPA的PBS、1000 nM含小鼠uPA的PBS、500 nM含人類MT-SP1的PBS、或500 nM含小鼠MT-SP1的PBS，在37℃進行1小時處理。
又，也可使用血清（包含人類血清、小鼠血清）代替使用含有蛋白酶的溶液，處理胜肽晶片，使用從晶片所測量的螢光值。
用於評估的血清的種類或濃度、處理溫度或處理時間可適宜選擇，例如可使用稀釋至80%濃度的人類血清作為處理液，在37℃處理一晚。
定性確認多胜肽中所含的蛋白酶切斷序列是否經蛋白酶切斷的方法，可經由使含有含蛋白酶切斷序列的多胜肽之溶液進行SDS-PAGE（聚丙烯醯胺凝膠電泳），測量斷片的分子量而確認。又，可經由比較未經蛋白酶處理的多胜肽和蛋白酶處理後多胜肽的分子量來確認。
本說明書中，用語「被切斷」是指蛋白酶切斷序列經蛋白酶的改變及/或蛋白酶切斷序列的半胱胺酸-半胱胺酸雙硫鍵還原後、多胜肽斷裂的狀態。本說明書中，用語「未被切斷」是指在蛋白酶切斷序列經蛋白酶的切斷不存在下及/或蛋白酶切斷序列的半胱胺酸-半胱胺酸雙硫鍵的還原不存在下、多胜肽中的蛋白酶切斷序列的兩側的部分仍連結的狀態。
經定量由SDS-PAGE等的電泳法分離的蛋白酶處理後的切斷片段量，可進行蛋白酶切斷序列的評估、及導入蛋白酶切斷序列的分子的切斷率的評估。評估導入蛋白酶切斷序列的分子的切斷率之方法的非限定一態樣，例如下列方法。例如，使用重組人類u- 血纖維蛋白溶解酶原活化物/尿激酶（u-Plasminogen Activator/Urokinase）（human uPA, huPA）（R&D Systems；1310-SE-010）或重組人類Matriptase/ST14 催化域（Matriptase/ST14 Catalytic Domain）（human MT-SP1, hMT-SP1） （R&D Systems； 3946-SE-010）評估導入蛋白酶切斷序列的抗體變異體的切斷率的情形，使huPA 40nM或hMT-SP1 3nM、抗體變異體100μg/mL、PBS，在37℃的條件下反應1小時後，進行毛細管電泳免疫分析法。毛細管電泳免疫分析法可使用Wes （Protein Simple），但不限於此，代替毛細管電泳免疫分析法的方法，也可以經由SDS-PAGE等分離後，以西方墨點法（Western Blotting）檢測，但不限於這些方法。切斷前後的輕鏈的檢測，可使用人類λ鏈HRP標記抗體（abcam； ab9007），但可檢測切斷片段的抗體也可使用任何抗體。透過蛋白酶處理後所得的各峰（peak）的面積使用Wes專用軟體（Compass for SW； Protein Simple）輸出，根據（切斷輕鏈峰面積）×100/ （切斷輕鏈峰面積+未切斷輕鏈峰面積）的算式，可算出抗體變異體的切斷率（%）。經由以上述方法計算切斷率，例如可比較導入不同的切斷序列的抗體變異體在活體內的切斷率，又也可比較在正常小鼠模式或腫瘤移植模式等的不同動物模式之間的相同抗體變異體的切斷率。
例如，在連接子包含序列識別號1～725列舉之蛋白酶切斷序列的抗原結合分子，任一皆為作為經蛋白酶作用而水解的蛋白酶基質是有用的。亦即，在本發明中，可使用成為本說明書所舉例的蛋白酶基質的連接子。該連接子，例如在組入抗原結合分子時，可活用作為選擇具有因應目的之性狀用的資料庫。具體的說，為了使抗原結合分子以局部存在於病灶的蛋白酶選擇性切斷，可評估該蛋白酶的敏感性。含有連接子的抗原結合分子在投予至活體後，經過和各種蛋白酶的接觸，有到達病灶的可能性。因此，期望對於局部存在病灶的蛋白酶具有敏感性，而對於該等以外的蛋白酶具有儘可能高的耐受性。為了視目的選擇所欲的蛋白酶切斷序列，如果事先對於各蛋白酶基質網羅性地分析因各種蛋白酶的敏感性，可得知蛋白酶的耐受性。基於所得的蛋白酶的耐受性光譜（spectrum），可發現具備必要的敏感性和耐受性的蛋白酶切斷序列。
或者，組入蛋白酶切斷序列的抗原結合分子，不僅經蛋白酶的酵素作用，還經過pH的變化、溫度、氧化還原壓力等的各種環境負荷，到達病灶。也可對這些外部因素，根據比較各蛋白酶基質的耐受性的資訊，選擇具備因應目的之所欲性狀的蛋白酶切斷序列。
在本發明一實施態樣，進一步在蛋白酶切斷序列的任一端或兩端加上撓性連接子。蛋白酶切斷序列的一端的撓性連接子可稱為第一撓性連接子，另一端的撓性連接子可稱為第二撓性連接子。在特定實施形態，蛋白酶切斷序列和撓性連接子包含下式之一。 （蛋白酶切斷序列） （第一撓性連接子）- （蛋白酶切斷序列） （蛋白酶切斷序列）- （第二撓性連接子） （第一撓性連接子）- （蛋白酶切斷序列）- （第二撓性連接子）
本實施態樣之撓性連接子較佳為胜肽連接子。第一撓性連接子和第二撓性連接子各自獨立且任意存在，為包含至少1個可撓的胺基酸（Gly等）的相同或不同的撓性連接子。例如，蛋白酶切斷序列包含獲得所欲蛋白酶可接近性的程度的充分數量的殘基（任意選自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等的胺基酸，特別是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，更特別是 Gly及Ser，特別是Gly等）。
適合在蛋白酶切斷序列的兩端使用的撓性連接子，通常提升蛋白酶切斷序列的蛋白酶可接近性、提升蛋白酶的切斷效率。較佳的撓性連接子可容易選擇，可始自從1個胺基酸（Gly等）至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、或4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸， 3個胺基酸至12個胺基酸等，從不同長度中選擇較佳者。本發明一些實施態樣，撓性連接子為1至7個胺基酸的胜肽連接子。
撓性連接子之例，不限於這些，例如甘胺酸聚合物（G）n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物（例如包含（GS）n 、（GSGGS）n 及（GGGS）n ，n為至少1的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、習知技術中周知的其他的撓性連接子。
這些之中，甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物受到注意，理由是這些胺基酸沒有比較性結構化，容易作用作為成分間的中性連繫。
由甘胺酸-絲胺酸聚合物所形成的撓性連接子之例，不限於該等，例如 Ser Gly・Ser（GS） Ser・Gly（SG） Gly・Gly・Ser（GGS） Gly・Ser・Gly（GSG） Ser・Gly・Gly（SGG） Gly・Ser・Ser（GSS） Ser・Ser・Gly（SSG） Ser・Gly・Ser（SGS） Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS） Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG） Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG） Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG） Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG） Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS） Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG） Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG） Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG） Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG） Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG） Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG） Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG） Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG） Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG） Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS） Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG） （Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS））ｎ （Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG））ｎ 等。
本說明書中「締合」可換言指例如2個以上的多胜肽區交互作用的狀態。一般而言，在對象的多胜肽區之間，形成由疏水鍵、氫鍵、離子鍵等作成的締合體。常見的締合一例，已知為在代表天然型抗體的抗體中，經由重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）兩者間的非共價鍵等而維持配對結構。
本說明書中的「交界面」，通常指進行締合（交互作用）時的締合面，形成交界面的胺基酸殘基通常為提供該締合的多胜肽區所含的1個或複數個胺基酸殘基，較佳是指，參與締合時接近而交互作用的胺基酸殘基。該交互作用具體包含在締合時接近的胺基酸殘基彼此形成氫鍵、靜電性交互作用、鹽橋的情形等的非共價鍵。
本說明書中「形成交界面的胺基酸殘基」，如果詳述的話，是指在構成交界面的多胜肽區中，該多胜肽區所含的胺基酸殘基。構成交界面的多胜肽區，如果舉一例顯示，是指在抗體、配體、受體、基質等中，在其分子內或分子間擔任選擇性結合的多胜肽區。形成交界面的胺基酸殘基的例子，不限於該等，例如締合時的接近胺基酸殘基。締合時的接近胺基酸殘基可經由例如分析多胜肽的立體結構，調查在該多胜肽締合時形成交界面的多胜肽區的胺基酸序列得以發現。
在本發明一些實施態樣中，抗原結合域VHH和抑制域VL締合。VHH中、和VL的締合相關的胺基酸殘基之例，可指形成VHH和VL的交界面的胺基酸殘基。又，VHH中、和VL的締合相關的胺基酸殘基之例，不限於該等，例如第37位、第44位、第45位、第47位的胺基酸殘基（J. Mol. Biol. （2005） 350, 112-125.）。經由促進VHH和VL的締合，抑制VHH的活性。同時，VL中、和VHH的締合相關的胺基酸殘基之例，可指形成VHH和VL的交界面的胺基酸殘基。
為了促進VHH和VL的締合，可改變VHH中、和VL的締合相關的胺基酸殘基。如此的胺基酸取代之例，不限於該等，例如F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、或/及S47W。再者，也可對VHH中的各殘基不進行改變，使用具有來自最初的37V、44G、45L、或/及47W的胺基酸殘基的VHH。
再者，只要可達到促進VHH和VL締合的目的，可不改變VHH中的胺基酸，而改變VL中、和VHH締合相關的胺基酸殘基，更可在VHH和VL兩者都導入胺基酸變異。
為了多胜肽的胺基酸序列中的胺基酸變異，可適宜採用定點突變法（Kunkel等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1985） 82, 488-492））或重疊延伸PCR等的公知方法。又，取代為天然胺基酸以外的胺基酸之胺基酸變異方法也可採用複數個公知方法（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. （2006） 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （2003） 100 （11）, 6353-6357）。例如，終止密碼子之一的UAG密碼子（琥珀密碼子）的互補性琥珀抑制子tRNA包含和非天然胺基酸結合的tRNA之無細胞轉譯系統（Clover Direct（Protein Express））等也可較佳使用。
本發明另一些實施態樣中，使用VHH作為抗原結合域，使用VH或VHH作為抑制域，可使抗原結合域和抑制域締合。為了促進抗原結合域VHH、和抑制域VH或VHH的締合，能夠鑑定抗原結合域的VHH中、和抑制域VH或VHH締合相關的胺基酸殘基，改變該等胺基酸殘基。又，能夠鑑定抑制域VH或VHH中、和抗原結合域VHH中的締合相關的胺基酸殘基，改變該等胺基酸殘基。
又，使用VHH以外的單域抗體作為抗原結合域時，也可相同地使抗原結合域或抑制域中、鑑定和締合相關的胺基酸殘基，可對該等胺基酸殘基進行改變。
在特定的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於抗原結合分子內的抗體恆定區。在此情形，蛋白酶切斷序列在受到蛋白酶的切斷時，以使抗原結合域游離的方式位於抗體恆定區內為佳。在具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於抗原結合分子所包含的抗體重鏈恆定區內，更具體為，位於從抗體重鏈恆定區中的第140位（EU編號）胺基酸的抗原結合域側，較佳為，位於從抗體重鏈恆定區中的第122位（EU編號）胺基酸的抗原結合域側。在其他具體實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於抗原結合分子所包含的抗體輕鏈恆定區內，更具體為，位於從抗體輕鏈恆定區中的第130位（Kabat編號）胺基酸的抗原結合域側，較佳為，位於從抗體輕鏈恆定區中的第113位（Kabat編號）胺基酸的抗原結合域側。
在特定的實施態樣中，經蛋白酶而被切斷的連接子位於可變區和恆定區的交界附近或恆定區內的CH1和CH2的交界附近。可變區和恆定區的交界附近是指在連結VH和CH1的部位的前後，或在連結VL和CL的部位的前後，不大幅影響抗原結合域的二級結構的部位，包含肘狀（elbow）-樞紐（hinge）區（從第109位（EU編號）到第140位（EU編號））。CH1和CH2的交界附近是指在連結CH1和CH2的部位的前後，不大幅影響抗原結合域的二級結構的部位，包含上樞紐（upper hinge）區（從第215位（EU編號）到第220位（EU編號））、下樞紐（lower hinge）區（從第221位（EU編號）到第230位（EU編號））。
在更具體的實施態樣中，經蛋白酶而被切斷的連接子位於抗原結合分子內的抗原結合域和抗體恆定區的交界附近。抗原結合域和抗體恆定區的交界附近可指抗原結合域和抗體重鏈恆定區的交界附近、或抗原結合域和抗體輕鏈恆定區的交界附近。在抗原結合域為由VH所作成的單域抗體或VHH、和抗體重鏈恆定區相連的情形時，抗原結合域和抗體恆定區的交界附近可指從單域抗體第101位（Kabat編號）的胺基酸到抗體重鏈恆定區第140位（EU編號）的胺基酸之間，較佳為，從單域抗體第109位（Kabat編號）的胺基酸到抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間。在抗原結合域為由VH所作成的單域抗體或VHH、和抗體輕鏈恆定區相連的情形時，抗原結合域和抗體輕鏈恆定區的交界附近可指從單域抗體第101位（Kabat編號）的胺基酸到抗體輕鏈恆定區第130位（Kabat編號）的胺基酸之間，較佳為，從單域抗體第109位（Kabat編號）的胺基酸到抗體輕鏈恆定區第113位（Kabat編號）的胺基酸之間。在抗原結合域為由VL所作成的單域抗體的情形時，抗原結合域和抗體恆定區的交界附近是指在連結VHH和CH2的部位的前後、不大幅影響抗原結合域的二級結構的部位，包含樞紐（lower hinge）區，從單域抗體第96位（Kabat編號）、較佳從單域抗體第104號（Kabat編號）。
本發明其他實施態樣中，切點/蛋白酶切斷序列位於從抗體重鏈恆定區中的第140位（EU編號）胺基酸的可變區側，較佳為從抗體重鏈恆定區中的第122位（EU編號）胺基酸的可變區側。在一些具體實施態樣中，切點/蛋白酶切斷序列被導入從抗體重鏈恆定區第118位胺基酸（EU編號）到抗體重鏈恆定區第140位胺基酸（EU編號）的序列中的任意位置。在其他更具體實施態樣中，切點/蛋白酶切斷序列位於從抗體輕鏈恆定區中的第130位（Kabat編號）胺基酸的可變區側，較佳為從抗體輕鏈恆定區中的第113位（Kabat編號）胺基酸的可變區側、從抗體輕鏈恆定區中的第112位（Kabat編號）胺基酸的可變區側。在一些具體實施態樣中，切點/蛋白酶切斷序列被導入從抗體輕鏈恆定區第108位胺基酸（Kabat編號）到抗體輕鏈恆定區第131位胺基酸（Kabat編號）的序列中的任意位置。
在一實施態樣，切點/蛋白酶切斷序列位於抗體VL和抗體恆定區的交界附近。抗體VL和抗體輕鏈恆定區的交界附近可指從抗體VL第96位（Kabat編號）的胺基酸到抗體輕鏈恆定區第130位（EU編號）（Kabat編號第130位）的胺基酸之間，較佳為，從抗體VL第104位（Kabat編號）的胺基酸到抗體輕鏈恆定區第113位（EU編號）（Kabat編號第113位）的胺基酸之間，或從抗體VL第105位（Kabat編號）的胺基酸到抗體輕鏈恆定區第112位（EU編號）（Kabat編號第112位）的胺基酸之間。在抗體VL和抗體重鏈恆定區連結的情形時，抗體VL和抗體重鏈恆定區的交界附近可指從抗體VL第96位（Kabat編號）的胺基酸到抗體重鏈恆定區第140位（EU編號）的胺基酸之間，較佳為，從抗體VL第104位（Kabat編號）的胺基酸到抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間，或從抗體VL第105位（Kabat編號）的胺基酸到抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間。
在一實施態樣，切點/蛋白酶切斷序列導入於抗體重鏈恆定區的CH2/CH3交界面附近。此處，CH2/CH3交界面附近為第335位（EU編號）到第345位（EU編號）的區域。
切點/蛋白酶切斷序列可複數個設置在配體結合分子中，例如可設置在選自抗體恆定區內、抗體VH內、抗體VL內、抗體VH和抗體恆定區的交界附近、抗體VL和抗體恆定區的交界附近之複數個處所。又，如果接觸本發明之此技術領域之人士，能夠替換抗體VH和抗體VL等、改變包含抗體VH和抗體VL和抗體恆定區的分子形態，該分子形態不超脫本發明之範圍。
本說明書所使用之用語「類IgG抗體分子」是用於定義具有實質類似如IgG抗體的恆定域或恆定區的結構的部分、和具有實質類似如IgG抗體的可變域或可變區的結構的部分、具有和IgG抗體實質上類似的立體結構之分子。但是，本說明書之「類IgG抗體分子」不限於維持和IgG抗體類似結構而發揮抗原結合活性者。
當抗原結合分子為類IgG抗體分子的情形，在相當於IgG抗體的2個可變區的部分分別設有抗原結合域的實施態樣，對接觸本發明的技術領域之人士是可理解的實施態樣。組入其雙臂的抗原結合域，即使具有相同的抗原結合特異性，或具有不同的抗原結合特異性，對接觸本發明的技術領域之人士也是可理解的實施態樣，可知不超脫本發明之範圍。
本說明書中，用語「特異性」是指特異性結合的分子的一方的分子對其一或複數個結合的對象方的分子以外的分子，實質上不結合的性質。也用於抗原結合域在特定的抗原中所含的抗原決定位具有特異性的情形。又，也用於抗原結合域在某抗原中所含的複數個抗原決定位之中，對特定的抗原決定位具有特異性的情形。此處，實質上不結合可根據在結合活性段落所記載之方法確認，對於上述對象方以外的分子之特異性結合分子的結合活性，是指顯示對上述對象方的分子的結合活性的80%以下，通常為50%以下，較佳為30%以下、特佳為15%以下的結合活性。
本說明書使用的「治療」（以及其文法上的衍生字，例如「進行治療」、「進行治療者」等）表示企圖改變被治療的個體的自然經過的臨床性介入，為了預防也可在臨床的疾病過程期間實施。治療的希望效果雖不限於該等，但包含疾病的發生或復發的防止、症狀的減輕、因疾病的任意的直接或間接的病理性影響的減弱、轉移的防止、疾病的進展速度的減慢、疾病狀態的恢復或緩和、及經緩解或改善的預後。在一些實施態樣中，本發明之醫藥組合物用於延遲疾病的發病、或延緩疾病的進展。
本發明中，醫藥組合物通常是指疾病的治療或預防、或檢查、診斷用的藥劑。本發明中，在組合醫藥組合物和其他成分的投予使用時，醫藥組合物可和其他成分的投予同時、各別、或連續投予。本發明之醫藥組合物也可含有其他成分作為成分。
本發明之醫藥組合物可使用此技術領域之人士公知方法製劑化。例如以和水或其以外的藥學上可容許的液體之無菌性溶液、或懸浮液劑的注射劑的形式，非經口使用。例如，可和藥學上容許的載劑或溶劑，具體為滅菌水或生理食鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、安定劑、香味劑、賦形劑、載體（vehicle）、防腐劑、黏結劑等，適當組合，以一般認為的製藥實施所要求的單位用量形態混合而製劑化。這些製劑中的有效成分量被設定以獲得被指示的範圍的適當容量。
注射用的無菌組合物可使用如注射用蒸餾水的載體根據一般製劑方法獲得調配。注射用的水溶液例如包括生理食鹽水、葡萄糖或其他的輔劑（例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉）的等張液體。適當的助溶劑可併用例如醇類（乙醇等）、多元醇（丙二醇、聚乙二醇等）、非離子界面活性劑（聚山梨糖醇80（TM）、HCO-50等）。
油性液體例如麻油、大豆油，也可併用苯甲酸苄酯及/或苯甲醇做為助溶劑。又，也可和緩衝劑（例如磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液）、止痛劑（例如普魯卡因鹽酸鹽（procaine hydrochloride））、安定劑（例如苯甲醇及苯酚）、抗氧化劑調配。經調配的注射液通常填充於適當的安瓿。
本發明之醫藥組合物較佳非經口投予而投藥。投予例如注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型的組合物。可經由例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等全身或局部投予。
投予方法可根據患者年齡、症狀適當選擇。本發明之醫藥組合物的投予量可設定為例如每一次每1kg體重0.0001mg到1000mg的範圍。或者，可設定例如每位患者0.001～100000mg的投予量，但本發明不一定限於此等數值。投予量及投予方法根據患者的體重、年齡、症狀等而變動，可由此技術領域之人士考慮該等條件而設定適當的投予量及投予方法。
本發明中的多核苷酸通常被擔載（插入）於適當的載體（vector）而導入宿主細胞。該載體只要是穩定維持插入的核酸，即沒有特別限制，例如使用大腸桿菌為宿主的話，選殖用的載體較佳為pBluescript載體（Stratagene社製）等，但可利用市售的各種載體。本發明之實施中，在生產所使用的多胜肽（例如嵌合受體、IgG抗體、雙特異性抗體、抗原結合分子等）的目的中使用載體的情形，特別以表現載體為有用。表現載體為在試管內、大腸桿菌內、培養細胞內、生物個體內表現多胜肽的載體，沒有特別限制，例如在試管內表現的話，以pBEST載體（Promega社製）為佳，在大腸桿菌的話，以pET載體（Invitrogen社製）為佳，在培養細胞的話，以pME18S-FL3載體（GenBank Accession No. AB009864）為佳，在生物個體的話，以pME18S載體（Mol Cell Biol. 8：466-472（1988））等為佳。本發明之DNA對載體的插入可根據常法，例如經由使用限制酶切點的連接酶（ ligase ）反應進行（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. （1987） Publish. John Wiley &amp； Sons．Section 11.4-11.11）。
上述的宿主細胞沒有特別限制，視目的使用各種宿主細胞。用於表現多胜肽的細胞可例如細菌細胞（如鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus ）、大腸桿菌、鏈黴菌（Streptomyces）、枯草桿菌）、真菌細胞（如酵母菌、麴菌（Aspergillus）、昆蟲細胞（如果蠅S2、夜盜蛾SF9）、動物細胞（如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細胞）及植物細胞。對宿主細胞的載體導入可以例如磷酸鈣沉澱法、電脈衝穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. （1987） Publish. John Wiley &amp； Sons．Section 9.1-9.9）、脂轉染法（GIBCO-BRL社製）、顯微注射法等的公知方法進行。
為了使在宿主細胞表現的多胜肽分泌到內質網的內腔、細胞周圍腔、或細胞外環境，可將適當的分泌訊號移入目標多胜肽。這些訊號對目標多胜肽可以是內因性，也可以是異種訊號。
在上述製造方法中的多胜肽的收集，在本發明之多胜肽分泌到培養基的情形，收集培養基。在本發明之多胜肽產生於細胞內的情形，首先溶解該細胞，之後收集多胜肽。
對於從重組的細胞培養物收集本發明之多胜肽而純化，可使用包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水性交互作用層析法、親和性層析法、羥磷灰石層析法及凝集素層析法之公知方法。
又，本發明一些實施態樣所使用的抗原結合域例如單域抗體，在該等實施態樣中，該單域抗體透過和特定的VL締合、或和特定的VH締合、或和特定的VHH締合，而抑制抗原結合活性。本發明也關於篩選如此單域抗體之方法。
作為抑制單域抗體的抗原結合活性的VL/VH/VHH，可使用序列已知的VL/VH/VHH，例如序列登載於IMGT或Kabat資料庫者。又，也可使用從人類抗體資料庫等鑑定的新的VL/VH/VHH的序列。組合這些序列調製蛋白質，透過使用上述方法測量結合方法，可選定抑制單域抗體的結合活性的VL/VH/VHH。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VL締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之篩選方法，包含以下步驟： （a） 取得具有標靶抗原結合活性之單域抗體的步驟； （b） 使（a）步驟取得的單域抗體和特定的VL締合的步驟； （c） 確認在（b） 步驟和特定的VL締合的該單域抗體對該抗原的結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不論減少的程度。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之篩選方法，包含以下步驟： （a） 取得具有標靶抗原結合活性之單域抗體的步驟； （b） 使（a）步驟取得的單域抗體和特定的VH締合的步驟； （c） 確認在（b） 步驟和特定的VH締合的該單域抗體對該抗原的結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不論減少的程度。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VHH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之篩選方法，包含以下步驟： （a） 取得具有標靶抗原結合活性之單域抗體的步驟； （b） 使（a）步驟取得的單域抗體和特定的VHH締合的步驟； （c） 確認在（b） 步驟和特定的VHH締合的該單域抗體對該抗原的結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不論減少的程度。
單域抗體和特定的VL/VH/VHH締合的方法之例，例如設計在完全抗體、Fab、Fab'、（Fab）2 等包含VH和VL兩者的抗體或抗體片段中，使用單域抗體的序列代替VH和VL其中之一的序列的分子，使具有該序列的多胜肽表現的方法。
又，本發明除了篩選透過和特定的VL締合、或和特定的VH締合、或和特定的VHH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體以外，也關於製造透過促進單域抗體和特定的VL/VH/VHH的締合、促進和特定的VL締合、或促進和特定的VH締合、或促進和特定的VHH締合，而抑制抗原結合活性的單域抗體的方法。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VL締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，包含以下步驟： （a） 製作取代在單域抗體中的、和抗體VL的締合相關的胺基酸殘基，維持該單域抗體對標靶抗原的結合活性之變異的單域抗體之步驟。
在特定的實施態樣中，提供透過和特定VL締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，更包含以下步驟： （b） 使（a）步驟製作的變異單域抗體和特定的VL締合的步驟； （c） 確認和該VL締合的該變異單域抗體的抗原結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不問減少的程度。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，包含以下步驟： （a） 製作取代在單域抗體中的、和抗體VH的締合相關的胺基酸殘基，維持該單域抗體對標靶抗原的結合活性之變異的單域抗體之步驟。
在特定的實施態樣中，提供透過和特定VH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，更包含以下步驟： （b） 使（a）步驟製作的變異單域抗體和特定的VH締合的步驟； （c） 確認和該VH締合的該變異單域抗體的抗原結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不問減少的程度。
本發明一實施態樣中，提供透過和特定VHH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，包含以下步驟： （a） 製作取代在單域抗體中的、和抗體VHH的締合相關的胺基酸殘基，維持該單域抗體對標靶抗原的結合活性之變異的單域抗體之步驟。
在特定的實施態樣中，提供透過和特定VHH締合而抑制抗原結合活性的單域抗體之製造方法，更包含以下步驟： （b） 使（a）步驟製作的變異單域抗體和特定的VHH締合的步驟； （c） 確認和該VHH締合的該變異單域抗體的抗原結合活性減弱或喪失的步驟。 本發明中所謂「結合活性減弱」是指和締合前相比，對標靶抗原的結合活性減少，不問減少的程度。
使單域抗體和特定的VL/VH/VHH締合的步驟，可經由設計在完全抗體、Fab、Fab'、（Fab）2 等包含VH和VL兩者的抗體或抗體片段中，使用單域抗體的序列代替VH和VL其中之一的序列，表現具有該序列的多胜肽的方法來進行。
根據本發明某一實施態樣，透過和本發明之特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體，可從含有複數個使單域抗體和第1締合支持域連結的融合多胜肽的資料庫取得。
本說明書中的「資料庫」的實施態樣為，可提供可有效取得透過和特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的資料庫。
本說明書中，「資料庫」是指分別具有不同序列的複數個融合多胜肽、或編碼這些融合多胜肽的核酸或多核苷酸的組。資料庫中所含的複數個融合多胜肽不是單一序列，而是彼此序列不同的融合多胜肽。
本說明書中，所謂彼此序列不同的複數個融合多胜肽中所記載的「彼此序列不同」，是指資料庫中各個融合多胜肽的序列彼此不同。較佳表示，資料庫中各個融合多胜肽中的單域抗體部分的序列不同。亦即，資料庫中彼此不同序列的數量反映出資料庫中的序列不同的獨立選殖株的數量，也稱為「資料庫尺寸」。在一般的噬菌體展示資料庫為106 到1012 ，經由適用微脂體展示法等的公知技術可擴大資料庫尺寸至1014。然而，在噬菌體展示法的淘選（panning）選擇時所使用的噬菌體粒子的實際數量通常較資料庫尺寸大10至10,000倍。此過剩倍數也稱為「資料庫當量數」，表示具有相同胺基酸序列的各個選殖株可存在10至10,000倍。因此，本發明中的「彼此序列不同」表示除了資料庫當量數以外的資料庫中各個多胜肽的序列彼此不同，更具體為彼此序列不同的多胜肽存在106 至1014 個分子、較佳為107 至1012 個分子。
又，本發明之所謂由複數個融合多胜肽為主形成的資料庫所載之「複數個」是指，例如本發明之多胜肽、多核苷酸分子、載體或病毒，通常該物質的2個以上的種類的集合。例如，如果某2個以上的物質在關於特定的形質上彼此不同的話，表示該物質存在2種類以上。可例如，在胺基酸序列中的特定胺基酸位置觀察到的變異體胺基酸。例如，在表面露出的非常多樣的胺基酸位置的特定變異體胺基酸以外，有實質上相同、較佳為相同序列的本發明之2個以上的多胜肽的情形，本發明之多胜肽存在複數個。在另一例，如果編碼在表面露出的非常多樣的胺基酸位置的特定變異體胺基酸的鹼基以外，有實質上相同、較佳為相同序列的本發明之2個以上的多核苷酸分子的話，則本發明之多核苷酸分子存在複數個。
將結合活性作為指標的融合多胜肽的篩選方法，也可較佳使用利用噬菌體載體的淘選法。編碼單域抗體的基因、和編碼IgG抗體CH1域或輕鏈恆定區的基因，可經由以適當的實施態樣連結而形成融合多胜肽。經由將編碼融合多胜肽的基因插入噬菌體載體，可取得在表面表現融合多胜肽的噬菌體。經由使此噬菌體和所欲的抗原接觸後、收集和抗原結合的噬菌體，可收集、獲得編碼具有目標結合活性的融合多胜肽之DNA。此操作視需要重複進行，可濃縮具有所欲結合活性的融合多胜肽。
噬菌體展示法以外，也可以使用資料庫、經淘選獲得融合多胜肽的技術，已知使用無細胞轉譯系統的技術、在細胞或病毒表面呈現融合多胜肽的技術、使用乳化的技術等。例如，使用無細胞轉譯系統的技術，可使用經由去除終止密碼子等，透過微脂體，形成mRNA和轉譯的蛋白質的複合體的微脂體展示法、使用嘌呤黴素（puromycin）等的化合物，使基因序列和轉譯的蛋白質共價鍵結的cDNA展示法、mRNA展示法、使用對核酸的結合蛋白質而形成基因和轉譯的蛋白質的複合體的CIS展示法等。又，在細胞或病毒表面呈現融合多胜肽的技術，除噬菌體展示法以外，也可使用E. coli展示法、革蘭氏陽性菌展示法、酵母菌展示法、哺乳動物細胞展示法、病毒展示法等。使用乳化的技術，可使用經由在乳劑中包含基因及轉譯相關分子的體外病毒展示法等。這些方法已為公知（Nat Biotechnol. 2000 Dec；18（12）：1287-92、Nucleic Acids Res. 2006；34（19）：e127、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2；101（9）：2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jun 22；101（25）：9193-8、Protein Eng Des Sel. 2008 Apr；21（4）：247-55、Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 26；97（20）：10701-5、MAbs. 2010 Sep-Oct；2（5）：508-18、Methods Mol Biol. 2012；911：183-98）。
本發明之其他實施態樣中，提供包含複數個使單域抗體和IgG抗體輕鏈恆定區連結的融合多胜肽的資料庫，該單域抗體中包含透過和特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的資料庫，以及從該資料庫篩選透過和特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體之方法。
「抗原結合活性在一定值以下」可指，例如以本案說明書舉例的方法測量抗原結合活性時，低於一定基準的抗原結合活性。「抗原結合活性在一定值以上」同樣地，可指例如以本案說明書舉例的方法測量抗原結合活性時，高於一定基準的抗原結合活性。抗原結合活性在一定值以上的融合多胜肽，較抗原結合活性在一定值以下的融合多胜肽，和抗原結合較強。
以下，對於使用IgG抗體CH1域作為第1締合支持域、使用IgG抗體CL作為第2締合支持域的一些實施態樣，進行說明。
可從包含複數個使單域抗體和IgG抗體CH1域連結的融合多胜肽的資料庫，篩選包含目標單域抗體的融合多胜肽。
本發明一些實施態樣中提供，包含複數個使單域抗體和IgG抗體CH1域連結的融合多胜肽的資料庫，對於該單域抗體中，包含透過和特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的資料庫，以及從該資料庫篩選包含透過和特定的VL/VH/VHH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的融合多胜肽之方法。
在特定實施態樣中，提供從包含複數個使單域抗體和IgG抗體CH1域連結的融合多胜肽的資料庫，篩選包含透過和特定的VL締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的融合多胜肽之方法。具體為，提供單域抗體的篩選方法，包含以下步驟： （a）使本發明中的資料庫的融合多胜肽進行體外展示（in vitro display）之步驟； （b）準備使特定VL和IgG抗體輕鏈恆定區融合的締合夥伴之步驟； （c）使在（a）步驟展示的融合多胜肽和在（b）步驟準備的締合夥伴進行締合，選擇在單域抗體和該VL締合的狀態下不和抗原結合、或者抗原結合活性在一定值以下的融合多胜肽之步驟； （d）選擇在（c）步驟所選擇的融合多胜肽所含的單域抗體在不和該VL締合的狀態下和抗原結合、或者抗原結合活性在一定值以上的融合多胜肽之步驟。
在上述（b）步驟準備的締合夥伴更包含蛋白酶切斷序列，在上述（d）步驟，可經蛋白酶處理而消除上述單域抗體和上述VL的締合，確認在單域抗體和VL不締合的狀態下單域抗體的抗原結合活性。締合夥伴中的蛋白酶切斷序列，只要是切斷時消除單域抗體和VL的締合，其位置沒有限定。蛋白酶切斷序列的位置之例，如可位於締合夥伴的VL和IgG抗體輕鏈恆定區的交界附近，較佳為從VL的第96位（Kabat編號）胺基酸到抗體輕鏈恆定區第130位（EU編號） （Kabat編號第130位）胺基酸之間，更佳為從VL的第104位（Kabat編號）胺基酸到抗體輕鏈恆定區第113位（EU編號） （Kabat編號第113位）胺基酸之間。
又，也可在資料庫中的融合多胜肽導入蛋白酶切斷序列，代替使用包含蛋白酶切斷序列的締合夥伴，透過融合多胜肽經蛋白酶切斷，消除單域抗體和VL的締合。融合多胜肽中的蛋白酶切斷序列，只要是在切斷時消除單域抗體和VL的締合、且切斷後也維持單域抗體的抗原結合活性，其位置沒有限制。蛋白酶切斷序列的位置之例，如可位於融合多胜肽中的單域抗體和IgG抗體CH1域的交界附近。
再者，在上述（d）步驟，也可使在（c）步驟所選擇的融合多胜肽的全長或包含單域抗體的部分再度展示，確認在單域抗體和VL不締合的狀態下單域抗體的抗原結合活性。
在特定實施態樣中，提供從包含複數個使單域抗體和IgG抗體輕鏈恆定區連結的融合多胜肽的資料庫，篩選包含透過和特定的VH締合而抑制或喪失抗原結合活性的單域抗體的融合多胜肽之方法。具體為，提供包含單域抗體的融合多胜肽的篩選方法，包含以下步驟： （a） 使本發明中的資料庫的融合多胜肽進行體外展示之步驟； （b） 準備使特定VH和IgG抗體CH1域融合的締合夥伴之步驟； （c） 使在（a）步驟展示的融合多胜肽和在（b）步驟準備的締合夥伴進行締合，選擇在單域抗體和該VH締合的狀態下不和抗原結合、或者抗原結合活性在一定值以下的融合多胜肽之步驟； （d） 選擇在（c）步驟所選擇的融合多胜肽所含的單域抗體在不和該VH締合的狀態下和抗原結合、或者抗原結合活性在一定值以上的融合多胜肽之步驟。
在上述（b）步驟準備的締合夥伴更包含蛋白酶切斷序列，在上述（d）步驟，可經蛋白酶處理而消除上述單域抗體和上述VH的締合，確認在單域抗體和VH不締合的狀態下單域抗體的抗原結合活性。締合夥伴中的蛋白酶切斷序列，只要是切斷時消除單域抗體和VH的締合，其位置沒有限定。蛋白酶切斷序列的位置之例，如可位於締合夥伴的VH和IgG抗體CH1域的交界附近，較佳為從VH的第101位（Kabat編號）胺基酸到抗體重鏈恆定區第140位（EU編號）胺基酸之間，更佳為從VH的第109位（Kabat編號）胺基酸到抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）胺基酸之間。
又，也可在資料庫中的融合多胜肽導入蛋白酶切斷序列，代替使用包含蛋白酶切斷序列的締合夥伴，透過融合多胜肽經蛋白酶切斷，消除單域抗體和VH的締合。融合多胜肽中的蛋白酶切斷序列，只要是在切斷時消除單域抗體和VH的締合、且切斷後也維持單域抗體的抗原結合活性，其位置沒有限制。蛋白酶切斷序列的位置之例，如可位於融合多胜肽中的單域抗體和IgG抗體輕鏈恆定區的交界附近。
再者，在上述（d）步驟，也可使在（c）步驟所選擇的融合多胜肽的全長或包含單域抗體的部分再度展示，確認在單域抗體和VH不締合的狀態下單域抗體的抗原結合活性。
本發明所記載之胺基酸序列所含的胺基酸也有轉譯後修飾（例如N端的麩醯胺酸經焦麩胺酸化（pyroglutamylation）為焦麩胺酸的修飾為此技術領域之人士周知的修飾）的情形，如此胺基酸轉譯後修飾的情形也當然包含於本發明記載之胺基酸序列。
製作具有所欲結合活性的抗體的方法為此技術領域人士公知。本發明中，可使用在目標細胞（病變細胞）表面表現的分子作為抗原（標靶抗原）的抗原結合分子。當目標細胞為腫瘤細胞或癌細胞時，該抗原為腫瘤抗原，例如本說明書下述舉例製作和腫瘤抗原結合的抗體的方法。
和腫瘤抗原結合的抗體可使用公知手段取得多株抗體或單株抗體。該抗體可較佳製作來自哺乳動物的單株抗體。來自哺乳動物的單株抗體包含經融合瘤所產生者、以及經基因工程的方法以包含抗體基因的表現載體轉形的宿主細胞所產生者等。
產生單株抗體的融合瘤可經由使用公知技術，例如下述而製作。亦即，使用腫瘤抗原蛋白作為致敏性抗原（sensitized antigen），根據一般的免疫方法使哺乳動物免疫。所得的免疫細胞經一般的細胞融合法和公知的親代細胞融合。之後，經由一般的篩選法，篩選單株抗體產生細胞，可選出產生抗腫瘤抗原抗體的融合瘤。
具體為，單株抗體的製作如下述進行。首先，使腫瘤抗原基因表現，可取得作為取得抗體的致敏性抗原使用的腫瘤抗原蛋白。亦即，將編碼腫瘤抗原的基因序列插入公知的表現載體，轉形適當的宿主細胞。從該宿主細胞中或培養上清液中以公知方法純化所欲的人類腫瘤抗原蛋白。為了從培養上清液取得可溶型腫瘤抗原，可使用例如在腫瘤抗原多胜肽序列中缺少構成疏水性區域的部分的蛋白質。又純化的天然GPC3蛋白質也同樣可作為致敏性抗原使用。
可使用該純化的腫瘤抗原蛋白作為用於對哺乳動物免疫的致敏性抗原。也可使用腫瘤抗原的部分胜肽作為致敏性抗原。此時，該部分胜肽也可由人類腫瘤抗原的胺基酸序列經化學合成而取得。又，將部分的腫瘤抗原基因插入表現載體而表現也可獲得。再者，使用蛋白質分解酵素分解腫瘤抗原蛋白也可獲得，但作為部分胜肽使用的腫瘤抗原胜肽的區域及大小在特別態樣中不特別限定。構成作為致敏性抗原的胜肽的胺基酸的數目較佳至少5個以上、例如6個以上、或7個以上。更具體可為8～50個，較佳為10～30個殘基的胜肽作為致敏性抗原使用。
又，可利用和腫瘤抗原蛋白的所欲的部分的多胜肽或胜肽不同的多胜肽融合的融合蛋白作為致敏性抗原。為了製造作為致敏性抗原使用的融合蛋白，例如可較佳利用抗體的Fc片段或胜肽標籤（peptide tag）等。表現融合蛋白的載體和編碼所欲的二種或以上的多胜肽片段的基因以框架內（inframe）融合，該融合基因如前述插入表現載體而可被製作。融合蛋白的製作方法記載於Molecular Cloning 2nd ed. （Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989）Cold Spring Harbor Lab. press）。一例為，作為致敏性抗原使用的GPC3的取得方法及使用其的免疫方法也具體記載在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等。
以該致敏性抗原免疫的哺乳動物不限於特定動物，但考慮和細胞融合所使用的親代細胞的適合性來選擇者為佳。一般較佳使用齧齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠，或兔、猴等。
根據公知方法使上列動物經致敏性抗原而免疫。例如經由在哺乳動物的腹腔內或皮下注射投予致敏性抗原的一般方法實施免疫。具體為，以PBS（Phosphate-Buffered Saline）或生理食鹽水等以適當的稀釋倍率稀釋的致敏性抗原，視需要和一般的佐劑，例如完全弗氏佐劑（Freund's complete adjuvant）混合、乳化之後，以每4至21日數次投予哺乳動物該致敏性抗原。又在致敏性抗原免疫時可使用適當載體。特別是使用分子量小的部分胜肽作為致敏性抗原時，也有希望以和白蛋白、鑰孔蟲戚血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin）等的載體蛋白結合的該致敏性抗原胜肽進行免疫的情形。
又，產生所欲的抗體的融合瘤可使用DNA免疫，如下述製作。DNA免疫為在免疫動物中投予以可表現編碼抗原蛋白質的基因的態樣所構築的載體DNA的該免疫動物中，使致敏性抗原在該免疫動物的體內表現，提供免疫刺激的免疫方法。和投予免疫動物蛋白質抗原的一般免疫方法相比，DNA免疫被期待下述的優勢。 -可維持膜蛋白的結構、提供免疫刺激。 -不必純化免疫抗原。
為了經DNA免疫獲得本發明之單株抗體，首先投予免疫動物表現腫瘤抗原蛋白的DNA。編碼腫瘤抗原的DNA可經由PCR等的公知方法合成。將所得的DNA插入適當的表現載體，投予免疫動物。表現載體可較佳利用例如pcDNA3.1等的市售的表現載體。將載體投予活體的方法可利用一般使用的方法。例如，吸附表現載體的金粒子以基因槍（gene gun）導入免疫動物個體的細胞內，進行DNA免疫。再者，辨識腫瘤抗原的抗體的製作也可使用國際專利公開案WO2003/104453所記載之方法製作。
如此使哺乳動物免疫，確認和血清中的腫瘤抗原結合的抗體力價上升後，從哺乳動物採集免疫細胞，提供細胞融合。較佳的免疫細胞特別可使用脾細胞。
和上述免疫細胞融合的細胞使用哺乳動物的骨髓瘤（myeloma）細胞。骨髓瘤細胞較佳具有篩選用的適當篩選標誌（marker）。篩選標誌是指在特定培養條件下可存活（或不能存活）的形質。篩選標誌如次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase）缺失（以下簡稱HGPRT缺失）、或胸腺激酶（thymidine kinase） 缺失（以下簡稱TK缺失）等為公知。具有HGPRT或TK缺失的細胞具有次黃嘌呤-胺喋呤-胸苷（hypoxanthine-aminopterin-thymidine）敏感性（以下簡稱HAT敏感性）。HAT敏感性的細胞在HAT篩選培養基中無法進行DNA合成而死亡，但當和正常細胞融合時，利用正常細胞的補救途徑（salvage pathway）可繼續DNA的合成，因此即使在HAT篩選培養基中也能增殖。
HGPRT缺失或TK缺失的細胞可各別在含有6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine）、8-氮鳥嘌呤（ 8-azaguanine）（以下簡稱8AG）、或5’溴化去氧尿苷（5-bromo-2'-deoxyuridine）的培養基中篩選。DNA中攝入這些嘧啶類似物的正常細胞會死亡。另一方面，不攝入這些嘧啶類似物的缺少這些酵素的細胞，可在篩選培養基中生存。其他稱為G418抗性的篩選標誌，經新黴素抗性基因提供對2-脫氧鏈黴胺（2-deoxystreptamine）系抗生物質（慶大黴素（Gentamycin）類似物）的抗性。適合細胞融合的各種骨髓瘤細胞為公知。
如此的骨髓瘤細胞可較佳使用例如P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123 （4）, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 （7）, 511-519）、MPC-11（Cell（1976）8 （3）, 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 （5685）, 269-270）、FO（J. Immunol. Methods（1980）35 （1-2）, 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）148 （1）, 313-323）、R210（Nature（1979）277 （5692）, 131-133）等。
基本上，根據公知方法，例如Köhler和Milstein等人的方法（Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等，進行上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
更具體為，例如在細胞融合促進劑的存在下、在一般營養培養基中，可實施上述細胞融合。融合促進劑使用例如聚乙二醇（PEG）、仙台病毒 （HVJ）等，為了更提高融合效率，可視需要添加二甲基碸等的輔助劑使用。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例可任意設定。例如較佳將免疫細胞對骨髓瘤細胞為1至10倍。用於上述細胞融合的培養基，例如使用適合上述骨髓瘤細胞株增殖的RPMI1640培養基、MEM培養基、其他、此種的細胞培養基所使用的一般培養基，再者，可較佳添加胎牛血清（FCS）等的血清補液。
細胞融合將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的特定量在上述培養基中均勻混合，一般以30至60%（w/v）的濃度添加於事先加熱到約37℃的PEG溶液（例如平均分子量約1000至6000）。經由將混合液緩慢混合，形成所欲的融合細胞（融合瘤）。接著，逐次添加如上舉例的適當培養基，重複離心、去除上清液的操作，可去除不利融合瘤生長的細胞融合劑等。
如此所得的融合瘤可經由培養在一般的篩選培養基，例如HAT培養基（包含次黃嘌呤、胺喋呤、胸苷的培養基）培養而被篩選。繼續使用上述HAT培養基培養至使所欲的融合瘤以外的細胞（非融合細胞）死亡的充足時間（通常，充足的時間為數日至數週）。接著，經由一般的限制稀釋法，實施產生所欲抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
如此所得的融合瘤，可利用根據用於細胞融合的骨髓瘤具有的篩選標誌的篩選培養基來進行篩選。例如具有HGPRT或TK缺失的細胞，在HAT培養基（包含次黃嘌呤、胺喋呤、胸苷的培養基）培養而進行篩選。亦即，在將HAT敏感性的骨髓瘤細胞用於細胞融合的情形時，在HAT培養基中可使和正常細胞成功細胞融合的細胞選擇性地增殖。繼續使用上述HAT培養基的培養至所欲的融合瘤以外的細胞（非融合細胞）死亡的充足時間。具體為，一般經由數日至數週的培養，可篩選所欲的融合瘤。接著，經由一般的限制稀釋法，可實施產生所欲抗體的融合瘤的篩選及單一選殖。
所欲抗體的篩選及單一選殖可基於公知的抗原抗體反應經由篩選方法適當實施。例如，和GPC3結合的單株抗體可和細胞表面表現的GPC3結合。如此的單株抗體可例如經由FACS（fluorescence activated cell sorting；螢光流式細胞分選法）篩選。FACS為以雷射光分析和螢光抗體接觸的細胞，經由測量各個細胞發出的螢光，可測量抗體對細胞表面的結合的系統。
為了經FACS篩選產生本發明單株抗體的融合瘤，首先調製表現GPC3的細胞。篩選用的較佳細胞為強制表現所用的腫瘤抗原的哺乳動物細胞。經由將作為宿主細胞使用的不轉形的哺乳動物細胞作為對照使用，可選擇性地檢測出抗體對細胞表面的腫瘤抗原的結合活性。亦即，經由選擇產生不和宿主細胞結合、而和GPC3強制表現細胞結合的抗體的融合瘤，可獲得產生腫瘤抗原單株抗體的融合瘤。
或者，抗體對固定的腫瘤抗原表現細胞的結合活性可根據ELISA原理而評估。例如，在ELISA盤的孔固定GPC3表現細胞。使融合瘤培養上清液和孔內的固定細胞接觸，檢測和固定細胞結合的抗體。當單株抗體來自小鼠的情形時，和細胞結合的抗體經抗小鼠免疫球蛋白抗體可被檢出。經由此等的篩選所選擇的、產生具有對抗原的結合能力的所欲抗體的融合瘤，可經由限制稀釋法等篩選。
如此所製作的產生單株抗體的融合瘤可在一般培養基中繼代培養。又，該融合瘤可在液態氮中長期保存。
該融合瘤根據一般方法培養，可從該培養上清液獲得所欲的單株抗體。或者，將融合瘤投予適合其的哺乳動物而增殖，從其腹水獲得單株抗體。前者方法獲得高純度抗體為佳。
也可較佳利用經由從該融合瘤等的抗體產生細胞被選殖的抗體基因所編碼的抗體。經選殖的抗體基因透過插入適當的載體而導入宿主，表現經該基因所編碼的抗體。抗體基因的分離、和對載體的導入、及宿主細胞的轉形用的方法，例如Vandamme等人已確立（Eur.J. Biochem.（1990）192 （3）, 767-775）。如下述重組抗體的製造方法也為公知。
例如，從產生和腫瘤抗原結合的抗體的融合瘤細胞，獲得編碼該抗體可變區（V區）的cDNA。為此，通常先從融合瘤萃取全長RNA。從細胞萃取mRNA的方法可利用例如下列方法：-胍超離心法（Biochemistry （1979） 18 （24）, 5294-5299） -AGPC法（Anal. Biochem. （1987） 162 （1）, 156-159）。
萃取的mRNA可使用mRNA純化套組（GE Healthcare BioSciences製）等純化。或者，如QuickPrep mRNA純化套組（GE Healthcare BioSciences製）等的從細胞直接萃取全長mRNA用的套組也有販售。使用如此套組，從融合瘤獲得mRNA。使用反轉錄酶，從所得的mRNA合成編碼抗體V區的cDNA。cDNA可經由AMV反轉錄酶第一股cDNA合成套組（生化學工業社製）等合成。又cDNA的合成及擴增可適宜使用SMART RACE cDNA 擴增套組（Clontech製）及使用PCR的5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1988） 85 （23）, 8998-9002、Nucleic Acids Res. （1989） 17 （8）, 2919-2932）。再者，在如此的cDNA合成過程中，可在cDNA的兩端導入後述的適當的限制酶切點。
從所得的PCR產物純化目標cDNA片段，之後和載體DNA連結。如此製作重組載體，篩選導入大腸桿菌等的菌落後，可從形成該菌落的大腸桿菌製備所欲的重組載體。之後，以公知方法，例如雙脫氧核苷酸鏈終止法（dideoxy-ribonucleotide chain termination  method）等確認該重組載體是否具有目標cDNA的鹼基序列。
為了獲得編碼可變區的基因，利用使用可變區基因擴增用的引子的5’-RACE法者是簡便的。首先，從融合瘤細胞萃取的RNA作為鑄模，合成cDNA，獲得5’-RACE cDNA資料庫。對於5’-RACE cDNA資料庫的合成可適當使用SMART RACE cDNA擴增套組等的市售套組。
將所得的5’-RACE cDNA資料庫做為鑄模，經PCR法擴增抗體基因。可基於公知的抗體基因序列，設計小鼠抗體基因擴增用的引子。此等的引子是每個免疫球蛋白的次家族（subclass）都不同的鹼基序列。因此，希望事先使用Iso Strip小鼠單株抗體同型套組（Roche Diagnostics）等的市售套組來決定次家族。
具體為，例如在以獲得編碼小鼠IgG的基因為目標時，編碼重鏈為γ1、γ2a、γ2b、γ3、輕鏈為κ鏈和λ鏈的基因的擴增可利用可能的引子。為了擴增IgG可變區基因，一般對於3’端的引子，利用黏合於相當於靠近可變區的恆定區的部分的引子。另一方面，對於5’端的引子，利用5’-RACE cDNA資料庫製作套組附屬的引子。
利用如此擴增的PCR產物，可再構成由重鏈和輕鏈的組合而成的免疫球蛋白。以再構成的免疫球蛋白對抗原的結合活性作為指標，可篩選所欲的抗體。例如，在以獲得對GPC3的抗體為目的時，抗體對GPC3的結合為特異性者更佳。本發明中所使用的抗體可經由例如下述的篩選： （1） 使包含經由融合瘤所獲得的cDNA所編碼的V區的抗體和抗原表現細胞接觸之步驟； （2） 檢測抗原表現細胞和抗體結合之步驟；以及 （3） 篩選和抗原表現細胞結合的抗體之步驟。
檢測抗體和腫瘤抗原表現細胞的結合的方法為公知。具體為，如前述經FACS等的方法可檢測出抗體和腫瘤抗原表現細胞的結合。可適當利用腫瘤抗原表現細胞的固定標本來評估抗體的結合活性。
以結合活性作為指標的抗體篩選方法，也可較佳使用利用噬菌體載體的淘選（panning）法。在從多株的抗體表現細胞群獲得以抗體基因作為重鏈和輕鏈的次家族的資料庫的情形時，利用噬菌體載體的篩選方法是有利的。編碼重鏈和輕鏈的可變區的基因可經由適當的連接子序列連結形成單鏈Fv（scFv）。經由將編碼scFv的基因插入噬菌體載體，可獲得在表面表現scFv的噬菌體。此噬菌體和所欲的抗原接觸後，經由收集和抗原結合的噬菌體，可收集編碼具有目標結合活性的scFv的DNA。視需要重複此操作，可濃縮具有所欲結合活性的scFv。
在獲得編碼和目標腫瘤抗原結合的抗體的V區的cDNA後，經由辨識插入該cDNA的兩端的限制酶切點的限制酶，分解該cDNA。較佳的限制酶辨識、分解在構成抗體基因的鹼基序列出現頻率低的鹼基序列。更者，為了將1份分解片段以正確方向插入載體，以具有黏狀末端的限制酶的插入為佳。經由將如上述分解的編碼抗GPC3抗體的V區的cDNA插入適當表現載體，可獲得抗體表現載體。此時，如果將編碼抗體恆定區（C區）的基因、和編碼上述V區的基因以框架內融合，獲得嵌合抗體（chimera antibody）。此處，嵌合抗體是指恆定區和可變區的來源不同者。因此，除了小鼠-人類等的異種嵌合抗體以外，人類-人類的同種嵌合抗體也包含於本發明的嵌合抗體。經由事先在具有恆定區的表現載體插入上述V區基因，可構築嵌合抗體表現載體。具體為，例如在保有編碼所欲抗體恆定區（C區）的DNA的表現載體的5’端，可適當配置分解上述V區基因的限制酶的限制酶辨識序列。以相同組合的限制酶分解的兩者以框架內融合，構築嵌合抗體表現載體。
為了製造單株抗體，將抗體基因插入表現載體以在表現控制區域的控制下表現。表現抗體用的表現控制區域包含例如促進子（enhancer）或啟動子（promoter）。又可在胺基端加上適當的訊號序列以使表現的抗體分泌到細胞外。在後述記載的實施例，訊號序列使用例如具有胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS的胜肽等，但除這些以外，也可加上適當的訊號序列。被表現的多胜肽在上述序列的羧基端部分被切斷，被切斷的多胜肽為成熟多胜肽，可分泌到細胞外。之後，經由此表現載體使適當宿主細胞轉形，可獲得表現編碼和目標的腫瘤抗原結合的抗體的DNA的重組細胞。
為了抗體基因的表現，編碼抗體重鏈（H鏈）及輕鏈（L鏈）的DNA，分別插入其他表現載體。經由插入H鏈和L鏈的載體使同一宿主細胞同時轉形（co-transfect），可表現具有H鏈和L鏈的抗體分子。或者可將編碼H鏈和L鏈的DNA插入單一的表現載體，使宿主細胞轉形（國際專利公開案WO 94/11523）。
經由將分離的抗體基因導入適當宿主而製作抗體用的宿主細胞和表現載體的多種組合為公知。這些表現系統可應用於分離任何包含本發明的抗體可變區的域（domain）。在以真核細胞作為宿主細胞使用時，可適當使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞。具體為，動物細胞可例如下列細胞。 （1） 哺乳動物細胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK（幼豚鼠腎細胞；baby hamster kidney）、Hela、Vero等 （2） 兩生類細胞：非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母細胞等 （3） 昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者來自植物細胞如菸草（Nicotiana tabacum）等的煙草屬（Nicotiana）的細胞的抗體基因表現系統為公知。植物細胞的轉形可適當利用癒傷組織（calluses）培養的細胞。
再者，真菌細胞可利用如下列細胞。 -酵母菌：釀酒酵母（Saccharomyces serevisiae）等的酵母屬（Saccharomyces）、嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）等的畢赤酵母屬（Pichia） -絲狀菌：黑麴黴（Aspergillus niger）等的麴黴屬（Aspergillus）。
又，利用原核細胞的抗體基因的表現系統也是公知。例如，使用細菌細胞時，可適當利用大腸桿菌（E. coli）、枯草桿菌等的細菌細胞。包含目標抗體基因的表現載體經轉形導入這些細胞中。經轉形的細胞在活體外（in vitro）培養，從該轉形細胞的培養物可獲得所欲抗體。
重組抗體的產生，除了上述宿主細胞，也可利用轉殖基因動物。亦即，可從導入編碼所欲抗體的基因的動物獲得該抗體。例如，將抗體基因經由框架內插入編碼本來產生於乳汁中的蛋白質的基因的內部，做為融合基因而被構築。可利用例如羊β酪蛋白等作為分泌在乳汁中的蛋白質。將包含插入抗體基因的融合基因的DNA片段注入羊胚胎，將該注入的胚胎導入母羊。由接受胚胎的羊所生的轉殖基因羊（或其子代）所產生的乳汁，可獲得所欲抗體和乳汁蛋白質的融合蛋白質。又為了使轉殖基因羊所產生的含有所欲抗體的乳汁量增加，可對轉殖基因羊投予激素（Bio/Technology （1994）, 12 （7）, 699-702）。
在投予人類本說明書所載的抗原結合分子的情形時，該抗原結合分子中包含抗體可變區的域，使對人類的異種抗原性降低等作為目的，適宜採用來自人為變異的基因重組型抗體的域。基因重組型抗體包含例如人源化（humanized）抗體等。這些的變異抗體可使用公知方法適當製造。
製作包含本說明書所載的抗原結合分子的抗體可變區的域所使用的抗體的可變區，通常由4個框架區（FR）所夾的3個互補性決定區（complementarity-determining region ； CDR）所構成。CDR為實質上決定抗體的結合特異性的區域。CDR的胺基酸序列富有多樣性。一方面，構成FR的胺基酸序列常常在具有不同結合特異性的抗體之間也顯示高的相同性。因此，一般經由CDR的移植，可將某抗體的結合特異性移植到其他抗體。
人源化抗體也稱為重構（reshaped）人類抗體。具體為，將人類以外的動物，例如小鼠抗體的CDR移植到人類抗體的人源化抗體等為公知。用於得到人源化抗體的一般基因重組方法也是已知。具體為，將小鼠抗體CDR移植到人類FR的方法，例如重疊延伸PCR（Overlap Extension PCR）為公知。在重疊延伸PCR中，將編碼應移植的小鼠抗體CDR的鹼基序列加到合成人類抗體的FR用的引子。對4個FR分別準備引子。一般而言，在小鼠CDR移植到人類FR的移植中，選擇和小鼠FR相同性高的人類FR，被認為在維持CDR的功能上是有利的。亦即，一般利用由和鄰接於應移植的小鼠CDR的FR的胺基酸序列相同性高的胺基酸序列所形成的人類FR為佳。
又，連結的鹼基序列設計為彼此框架內連接。經由各自的引子，各別合成人類FR。結果獲得各FR加上編碼小鼠CDR的DNA的產物。各產物的編碼小鼠CDR的鹼基序列設計為彼此重疊。接著，以人類抗體基因為鑄模，使合成的產物重疊的CDR部分彼此黏合（anneal），進行互補股合成反應。經由此反應，透過小鼠CDR的序列連結人類FR。
最後，連結3個CDR和4個FR的V區基因，經由黏合於其5’端和3’端、加上適當的限制酶辨識序列的引子，擴增其全長。如上述所得的DNA和編碼人類抗體C區的DNA以框架內融合、插入表現載體中，可做成人源化抗體表現用載體。將該重組載體導入宿主、建立重組細胞後，培養該重組細胞，使編碼該人源化抗體的DNA表現，該人源化抗體在該培養細胞的培養物中產生（歐洲專利公開案EP 239400、國際專利公開案WO1996/002576）。
定性或定量測量如上述製作的人源化抗體對抗原的結合活性，經評估可較佳選擇透過CDR連結時該CDR形成良好抗原結合部位的人類抗體的FR。視需要，可取代FR的胺基酸殘基使重構人類抗體的CDR形成適當的抗原結合部位。例如，應用小鼠CDR移植到人類FR所用的PCR法，可在FR導入胺基酸序列的變異。具體為，可在黏合於FR的引子導入部分的鹼基序列的變異。在經如此引子合成的FR，導入鹼基序列的變異。經取代胺基酸的變異型抗體對抗原的結合活性經上述方法測量評估，可選擇具有所欲性質的變異FR序列（Sato, K.et al., Cancer Res, 1993, 53, 851-856）。
又，可以具有人類抗體基因全部的基因庫（repertory）的轉殖基因動物（國際專利公開案WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735）作為免疫動物，經DNA免疫而獲得所欲的人類抗體。
再者，使用人類抗體資料庫經淘選獲得人類抗體的技術也是已知。例如，人類抗體的V區作為單鏈抗體（scFv）經噬菌體展示法而在噬菌體表面表現。可選擇表現和抗原結合的scFv的噬菌體。經由分析所選擇的噬菌體基因，可決定編碼和抗原結合的人類抗體的V區的DNA序列。決定和抗原結合的scFv的DNA序列後，使該V區序列和所欲的人類抗體C區序列以框架內融合後，插入適當的表現載體，可製作表現載體。將該表現載體導入如上舉例較佳的表現細胞中，使編碼該人類抗體的基因表現而獲得該人類抗體。此等方法已為公知（國際專利公開案WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388）。
包含具有T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區的域 本說明書中，「包含具有T細胞受體複合體結合活性的抗體可變區的域」是指包含和T細胞受體複合體的一部分或全部特異性結合且互補的區域而成的T細胞受體複合體抗體的一部分。T細胞受體複合體可以是T細胞受體本身，也可以是T細胞受體和構成T細胞受體複合體的接合體分子（ adaptor molecule）。接合體（adaptor）較佳者為CD3。
包含具有T細胞受體結合活性的抗體可變區的域 本說明書中，「包含具有T細胞受體結合活性的抗體可變區的域」是指包含和T細胞受體的一部分或全部特異性結合且互補的區域而成的T細胞受體抗體的一部分。本發明之域結合的T細胞受體的一部分可以是可變區，也可以是恆定區，較佳為存在恆定區的抗原決定位。恆定區的序列可例如RefSeq登錄編號CAA26636.1的T細胞受體α鏈、RefSeq登錄編號C25777的T細胞受體β鏈、RefSeq登錄編號A26659的T細胞受體γ1鏈、RefSeq登錄編號AAB63312.1的T細胞受體γ2鏈、RefSeq登錄編號AAA61033.1的T細胞受體δ鏈的序列。
包含具有CD3結合活性的抗體可變區的域 本說明書中，「包含具有CD3結合活性的抗體可變區的域」是指包含和CD3的一部分或全部特異性結合且互補的區域而成的CD3抗體的一部分。較佳為，該域包含抗CD3抗體的輕鏈可變區（VL）和抗CD3抗體的重鏈可變區（VH）。
本發明之包含具有CD3結合活性的抗體可變區的域，如果有存在於構成人類CD3的γ鏈、δ鏈、或ε鏈序列的抗原決定位，也可為和任何抗原決定位結合者。本發明中，較佳為，包含和存在於人類CD3複合體的ε鏈的細胞外域的抗原決定位結合的抗CD3抗體的輕鏈可變區（VL）和抗CD3抗體的重鏈可變區（VH）的區域被較佳使用。如此的域，除了實施例記載的抗CD3抗體的輕鏈可變區（VL）和抗CD3抗體的重鏈可變區（VH）以外，也可較佳使用OKT3抗體（Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1980） 77, 4914-4917）或各種包含抗CD3抗體的輕鏈可變區（VL）和抗CD3抗體的重鏈可變區（VH）的CD3結合域。又，經上述方法，以構成人類CD3的γ鏈、δ鏈、或ε鏈使所欲動物免疫，所獲得的包含具有所欲性質的抗CD3抗體作為起源的抗體可變區的域可適當使用。包含具有CD3結合活性的抗體可變區的域成為起源的抗CD3抗體，如前述，可適宜使用適當的人源化抗體或人類抗體。構成CD3的γ鏈、δ鏈、或ε鏈的結構，其多核苷酸序列記載於RefSeq登錄編號NM_000073.2、NM_000732.4及NM_000733.3，其多胜肽序列記載於RefSeq登錄編號NP_000064.1、NP_000723.1及NP_000724.1。
特異性 特異性是指特異性結合的分子的一方的分子，對於其一或複數個結合的對象的分子以外的分子，沒有顯示任何有意義的結合的狀態。又，包含抗體可變區的域也可用於對某抗原所含的複數個抗原決定位中特定的抗原決定位為特異性的情形。又，和包含抗體可變區的域結合的抗原決定位被包含於複數個不同的抗原時，具有包含該抗體可變區的域的抗原結合分子可和包含該抗原決定位的多種抗原結合。
抗原決定位（epitope） 表示存在抗原中的抗原決定基的抗原決定位，是指和本說明書所揭示的抗原結合分子中包含抗體可變區的域結合的抗原上的部位。因此，例如抗原決定位可根據其結構定義。又，根據對辨識該抗原決定位的抗原結合分子中的抗原的結合活性，也可定義該抗原決定位。當抗原為胜肽或多胜肽的情形時，也可根據構成抗原決定位的胺基酸殘基而確定抗原決定位。又當抗原決定位為醣鏈的情形時，也可根據特定的醣鏈結構而確定抗原決定位。
直線狀抗原決定位為包含辨識胺基酸一級序列的抗原決定位之抗原決定位。直線狀抗原決定位典型在固有序列中包含至少3個、及最普通包含至少5個，例如約8～約10個、6～20個的胺基酸。
立體結構抗原決定位為，相對於直線狀抗原決定位，含有抗原決定位的胺基酸的一級序列不是被辨識的抗原決定位的單一指定成分的抗原決定位（例如，胺基酸的一級序列不必被指定抗原決定位的抗體所辨識的抗原決定位）。立體結構抗原決定位，相對於直線狀抗原決定位，可包含增大數量的胺基酸。關於立體結構抗原決定位的辨識，抗體辨識胜肽或蛋白質的三級結構。例如，在蛋白質折疊形成三級結構的情形時，形成立體結構抗原決定位的某胺基酸及/或多胜肽主鏈並排，抗體可辨識抗原決定位。確定抗原決定位的立體結構的方法，包含例如X光結晶學、二維核磁共振光譜學及部位特異性自旋標籤及電磁順磁共振光譜學，但不限於此。例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology （1996），第66卷，Morris（編）。
以下舉例經由和腫瘤抗原結合的抗原結合分子對抗原決定位的結合的確認方法。
例如，和腫瘤抗原結合的抗原結合分子辨識存在腫瘤抗原的分子中的線狀抗原決定位之事，可如下確認。為了上述目的，合成由構成腫瘤抗原的細胞外域的胺基酸序列所形成的線狀胜肽。該胜肽可化學合成。或者，利用腫瘤抗原的cDNA中、編碼相當於細胞外域的胺基酸序列的區域，經基因工程方法獲得。接著，評估由構成細胞外域的胺基酸序列所形成的線狀胜肽、和具有包含對腫瘤抗原具有結合活性的抗體可變區的域的受檢抗原結合分子之結合活性。例如，經由已固定的線狀胜肽作為抗原的ELISA，可評估該抗原結合分子對該胜肽的結合活性。或者，基於在該抗原結合分子對腫瘤抗原表現細胞的結合中、因線狀胜肽抑制的水平，可得知對線狀胜肽的結合活性。經由這些試驗，可得知該抗原結合分子對線狀胜肽的結合活性。
又，具有包含有腫瘤抗原具有結合活性的抗體可變區的域之受檢抗原結合分子辨識立體結構抗原決定位之事，可由下述確認。為了上述目的，調製表現腫瘤抗原的細胞。例如，具有包含有對腫瘤抗原具有結合活性的抗體可變區的域之受檢抗原結合分子在接觸腫瘤抗原表現細胞時，和該細胞強結合，另一方面，該抗原結合分子對經固定的構成腫瘤抗原的細胞外域的胺基酸序列所形成的線狀胜肽，實質上不結合時等。此處，所謂實質上不結合是指對人類腫瘤抗原表現細胞的結合活性為80%以下，通常為50%以下，較佳為30%以下，特佳為15%以下的結合特性。
測量包含對腫瘤抗原的抗原結合域的受檢抗原結合分子對腫瘤抗原表現細胞的結合活性的方法，例如Antibodies A Laboratory Manual記載的方法（Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory （1988） 359-420）。亦即，可經由將GPC3表現細胞作為抗原的ELISA或FACS（fluorescence activated cell sorting；螢光流式細胞分選法）的原理而評估。
在ELISA型式中，含有對目標的腫瘤抗原的抗原結合域的受檢抗原結合分子對該腫瘤抗原表現細胞的結合活性，經由比較因酵素反應所生成的訊號水平而定量評估。亦即，在固定腫瘤抗原表現細胞的ELISA盤加入受檢抗原結合分子，利用辨識受檢抗原結合分子的酵素標記抗體，檢測出和細胞結合的受檢抗原結合分子。或者，在FACS中，製作受檢抗原結合分子的系列稀釋，確定對腫瘤抗原表現細胞的抗體結合力價（titer），可比較受檢抗原結合分子對腫瘤抗原表現細胞的結合活性。
受檢抗原結合分子對懸浮於緩衝液等的細胞表面上表現的抗原的結合，可經由流式細胞儀檢測。流式細胞儀已知例如以下裝置。 FACSCanto TM II FACSAria TM FACSArray TM FACSVantage TM SE FACSCalibur TM （皆為BD Biosciences社的商品名） EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta / Cell Lab Quanta SC（皆為Beckman Coulter社的商品名）
例如，受檢抗原結合分子對抗原的結合活性的較佳測量方法一例，如以下方法。首先，以辨識和表現目標腫瘤抗原的細胞反應的受檢抗原結合分子的FITC標記次級抗體染色。受檢抗原結合分子經適當較佳的緩衝液稀釋，該締合體調製成所欲濃度使用。例如，可在10μg/ml至10 ng/ml之間的任何濃度使用。接著，以FACSCalibur（BD社）測量螢光強度和細胞數。對該細胞的抗體結合量，反映在使用CELL QUEST Software（BD社）分析所得的螢光強度，亦即幾何平均值。即，經由獲得該幾何平均值，可測量經受檢抗原結合分子的結合量所表示的受檢抗原結合分子的結合活性。
受檢抗原結合分子共有某抗原結合分子和抗原決定位者，可經由兩者對相同的抗原決定位的競爭而確認。抗原結合分子之間的競爭可經由交叉阻斷分析法等檢測。例如競爭性ELISA分析法，為較佳的交叉阻斷分析法。
具體為，在交叉阻斷分析法中，塗佈在微滴定盤的孔上的腫瘤抗原蛋白，在成為候補的競爭抗原結合分子的存在下，或不存在下預培養後，添加受檢抗原結合分子。和孔中的腫瘤抗原蛋白結合的受檢抗原結合分子的量，和對相同抗原決定位的結合競爭、成為候補的競爭抗原結合分子的結合能力間接相關。亦即，對相同抗原決定位的競爭抗原結合分子的親和性越大，受驗抗原結合分子對塗佈腫瘤抗原蛋白的孔的結合活性越低。
透過腫瘤抗原蛋白而結合於孔的受檢抗原結合分子的量，經由事先標記抗原結合分子，可容易測量。例如，經生物素（biotin）標記的抗原結合分子，可經由使用卵白素過氧化酶共軛物（avidin peroxidase conjugate）和適當的基質而測量。利用過氧化酶等的酵素標記的交叉阻斷分析法，特別稱為競爭性ELISA分析法。抗原結合分子的檢測或測量可以可能的其他標記物質來標記。具體為，放射性標記或螢光標記等為公知。
和候補的競爭抗原結合分子不存在下所實施的控制組試驗所得的結合活性相比，競爭抗原結合分子如果可阻斷包含對腫瘤抗原的抗原結合域的受檢抗原結合分子的結合至少20%、較佳至少20-50%、更佳至少50%的話，該受檢抗原結合分子是和競爭抗原結合分子實質上和相同的抗原決定位結合，或為對相同的抗原決定位的結合競爭的抗原結合分子。
在鑑定含有對目標腫瘤抗原的抗原結合域的受檢抗原結合分子結合的抗原決定位的結構的情形時，受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子共有抗原決定位者，可比較兩者抗原結合分子對在構成該抗原決定位的胜肽導入胺基酸變異的胜肽的結合活性來進行評估。
測量如此結合活性的方法，例如可在上述ELISA型式中，比較受檢抗原結合分子及對照抗原結合分子對導入變異的線狀胜肽的結合活性來測量。ELISA以外的方法，對結合於管柱的該變異胜肽的結合活性，也可經由定量在該管柱中流出受檢抗原結合分子及對照抗原結合分子後的溶出液中所溶出的抗原結合分子而測量。變異胜肽例如和GST的融合胜肽、吸附於管柱的方法為公知。
又，在鑑定的抗原決定位為立體抗原決定位的情形時，受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子共有抗原決定位者，可以下列方法評估。首先，調製表現腫瘤抗原的細胞和在抗原決定位導入變異的表現腫瘤的細胞。對這些細胞懸浮於PBS等的適當緩衝液的細胞懸浮液，添加受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子。接著，對以適當緩衝液洗淨的細胞懸浮液，添加可辨識受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子的FITC標記抗體。經標記抗體染色的細胞的螢光強度和細胞數以FACSCalibur（BD社）測量。受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子的濃度經適當緩衝液適當稀釋，調製為所欲濃度使用。例如在10μg/ml至10 ng/ml之間的任何濃度使用。標記抗體對該細胞的結合量，反映在使用CELL QUEST Software（BD社）分析所得的螢光強度、亦即幾何平均值。亦即，可經由獲得該幾何平均值，測量標記抗體的結合量所表的受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子的結合活性。
本方法中，和含有變異的腫瘤抗原表現細胞實質上不結合者，可經下列方法判斷。首先，將結合於表現變異腫瘤抗原的細胞的受檢抗原結合分子和對照抗原結合分子，以標記抗體染色。接著，檢測細胞的螢光強度。在螢光檢測上使用FACSCalibur作為流式細胞儀的情形，所得的螢光強度可使用CELL QUEST Software分析。從抗原結合分子存在下及不存在下的幾何平均值，根據下列算式計算出此比較值（ΔGeo-Mean），可求得因抗原結合分子的結合之螢光強度的增加比例。 ΔGeo-Mean＝Geo-Mean（抗原結合分子存在下）/Geo-Mean（抗原結合分子不存在下）
Fv（可變區片段） 本說明書中，所謂「Fv（可變區片段（variable fragment））」是指由抗體的輕鏈可變區（VL（light chain variable region））和抗體的重鏈可變區（VH（heavy chain variable region））的配對所形成的來自抗體的抗原結合域的最小單位。1988年Skerra和Pluckthun發現在細菌的訊號序列的下游插入抗體基因的大腸桿菌中，經誘導該基因表現，可在均勻且維持活性的狀態下，從大腸桿菌的周質（periplasm）分層調製（Science （1988） 240 （4855）, 1038-1041）。從周質分層所調製的Fv，以具有對抗原的結合的態樣，使VH和VL締合。
本說明書中，Fv也較佳包含例如下列抗原結合分子： 包含在二價的scFv中，一價的scFv透過構成CD3結合域的重鏈Fv片段、在構成Fc區的1個多胜肽，及在另一個一價的scFv透過構成CD3結合域的輕鏈Fv片段、在構成Fc區的另一個多胜肽，所連結的二價抗原結合域為二價scFv之（1）二價的抗原結合區域、（2）構成IgG1、IgG2a、IgG3或IgG4的Fc區的胺基酸中、包含對Fcγ受體不具有結合活性的Fc區的域，及（3）包含至少一價的CD3結合域之抗原結合分子等中，輕鏈Fv片段及重鏈Fv片段在具有對抗原之CD3的結合的態樣下締合，構成CD3結合域的一組Fv。
scFv、單鏈抗體、或sc（Fv）2 本說明書中，所謂「scFv」、「單鏈抗體」、或「sc（Fv）2 」是指在單一多胜肽鏈內包含來自重鏈及輕鏈兩者的可變區，但缺乏恆定區的抗體片段。一般來說，單鏈抗體更包含能夠形成據信能抗原結合的所期望的結構之VH區域和VL區域之間的多胜肽連接子。單鏈抗體可根據The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113卷, Rosenburg，及Moore編，Springer-Verlag, New York, 269～315（1994）中的Pluckthun詳細考察。同樣地，可參照國際專利公開案WO1988/001649及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。在特定態樣中，單鏈抗體可為雙特異性、且/或人源化。
scFv為構成Fv的VH和VL經胜肽連接子連結的抗原結合域（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. （1988） 85 （16）, 5879-5883）。經由該胜肽連接子可維持VH和VL接近的狀態。
sc（Fv）2 為2個VL和2個VH之4個可變區經胜肽連接子等的連接子連結，構成單鏈的單鏈抗體（J Immunol. Methods （1999） 231 （1-2）, 177-189）。這2個VH和VL也可來自不同的單株抗體。也可較佳舉例如Journal of Immunology （1994） 152 （11）, 5368-5374所揭示的辨識存在同一抗原中的二種抗原決定位的雙特異性（bispecific sc（Fv）2 ）。sc（Fv）2 可經此技術領域之人士以公知方法製作。例如可以胜肽連接子等的連接子連結scFv而製作。
本說明書中構成sc（Fv）2 的抗原結合域的構成，例如2個VH及2個VL以單鏈多胜肽的N端為基點依序排列VH、VL、VH、VL（［VH］連接子［VL］連接子［VH］連接子［VL］）為特徵的抗體，但2個VH和2個VL的順序不特別限定上列構成，可以任何順序排列。例如也可舉例如下的順序構成。 ［VL］連接子［VH］連接子［VH］連接子［VL］ ［VH］連接子［VL］連接子［VL］連接子［VH］ ［VH］連接子［VH］連接子［VL］連接子［VL］ ［VL］連接子［VL］連接子［VH］連接子［VH］ ［VL］連接子［VH］連接子［VL］連接子［VH］
對於sc（Fv）2 的分子形態也詳細記載於WO2006/132352，此技術領域之人士根據此等記載可製作本說明書所揭示的抗原結合分子的製作用的適當的所期望的sc（Fv）2 。
又，本發明之抗原結合分子也可和PEG等的載體高分子或抗癌劑等的有機化合物共軛。又，可插入醣鏈加成序列，以醣鏈獲得所欲效果為目的可適當添加。
結合抗體可變區的連接子可使用經遺傳工程可導入的任意胜肽連接子、或合成化合物連接子（例如Protein Engineering, 9 （3）, 299-305, 1996）所揭示之連接子等，但本發明中以胜肽連接子為佳。胜肽連接子的長度沒有特別限定，可視目的由此技術領域之人士適當選擇，較佳長度為5個胺基酸以上（上限沒有特別限定，通常為30個胺基酸以下，較佳20個胺基酸以下），特佳為15個胺基酸。在sc（Fv）2 包含3個胜肽連接子的情形，可全部使用相同長度的胜肽連接子，也可使用不同長度的胜肽連接子。
例如，胜肽連接子可例如： Ser Gly・Ser Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly Gly・Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly・Gly Gly・Gly・Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly・Gly・Gly Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly （Gly・Gly・Gly・Gly・Ser）n （Ser・Gly・Gly・Gly・Gly）n ［n為1以上的整數］等。但胜肽連接子的長度或序列可視目的由此技術領域之人士適當選擇。
合成化合物連接子（化學交聯劑）為通常用於胜肽的交聯的交聯劑，例如N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）、二琥珀醯亞胺辛二酯（DSS）、雙（琥珀醯亞胺）辛二酯（BS3）、二巰基雙（琥珀醯亞胺丙酯）（DSP）、二巰基雙（磺基琥珀醯亞胺丙酯）（DTSSP）、乙二醇雙（琥珀醯亞胺琥珀酸酯）（EGS）、乙二醇雙（磺基琥珀醯亞胺琥珀酸酯）（sulfo-EGS）、二琥珀醯亞胺酒石酸酯（DST）、二磺基琥珀醯亞胺酒石酸酯（sulfo-DST）、雙［2-（琥珀醯亞胺氧基羰氧基）乙基］ 碸 （BSOCOES）、雙［2-（磺基琥珀醯亞胺氧基羰氧基）乙基］ 碸（sulfo-BSOCOES）等，這些交聯劑為市售。
在結合4個抗體可變區的情形，通常必須要3個連接子，可全部使用相同的連接子，也可以使用不同的連接子。
「Fab」由一個輕鏈及一個重鏈的CH1區及可變區所構成。Fab分子的重鏈不能和其他重鏈分子形成雙硫鍵。
「F（ab’）2 」及「Fab’」是指以蛋白分解酶之胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等處理免疫球蛋白（單株抗體）所製造，在存在於樞紐區中的2個H鏈間的雙硫鍵的前後被分解所生成的抗體片段。例如，經由將IgG以木瓜蛋白酶處理，在存在於樞紐區中的2個H鏈間的雙硫鍵的上游被切斷，可製造由VL（L鏈可變區）和CL（L鏈恆定區）所形成的L鏈、及VH（H鏈可變區）和CHγ1（H鏈恆定區中的γ1區）所形成的H鏈片段在C端區經雙硫鍵結合的相同的2個抗體片段。這些2個相同的抗體片段各自稱為Fab’。
「F（ab’）2 」包含2個輕鏈，及能夠在2個重鏈間形成鏈間的雙硫鍵之含有CH1域及部分的CH2域的恆定區的2個重鏈。構成本說明書中所揭示的抗原結合分子的F（ab’）2 可在具有所欲的抗原結合域的全長單株抗體等經胃蛋白酶等的蛋白分解酵素部分分解後，經由使Fc片段吸附於蛋白質A柱而去除，可較佳取得。如此的蛋白分解酵素可經由適當設定pH等的酵素反應條件，以限制性產生F（ab’）2 的方式分解全長抗體，則沒有特別限制，例如可舉例胃蛋白酶或無花果蛋白酶（ficin）等。
構成本說明書中所揭示的抗原結合分子的Fc區，可在胃蛋白酶等的蛋白分解酵素部分分解單株抗體等的抗體後，經由使片段吸附於蛋白質A柱或蛋白質G柱後，經由適當的溶出緩衝液溶出而可較佳取得。如此的蛋白分解酵素可經由適當設定pH等的酵素反應條件，分解單株抗體等的抗體，沒有特別限制，例如可舉例胃蛋白酶或無花果蛋白酶（ficin）等。
本說明書所記載的抗原結合分子，包含構成IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區的胺基酸中對於Fcγ受體的結合活性降低的Fcγ區。
抗體的同型體（isotype）根據恆定區的結構而決定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各同型體的恆定區分別稱為Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。
Fc區是扣除包含2個輕鏈，及在2個重鏈間形成鏈間的雙硫鍵之含有CH1域及部分CH2域的恆定區域的2個重鏈的F（ab’）2 以外的區。構成本說明書中所揭示的抗原結合分子的Fc區可在經胃蛋白酶等的蛋白分解酵素部分分解IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體等後，使吸附於蛋白質A柱的分層再溶出，可較佳取得。如此的蛋白分解酵素可經由適當設定pH等的酵素反應條件，分解全長抗體以限制性產生F（ab’）2 ，沒有特別限制，例如可舉例胃蛋白酶或無花果蛋白酶（ficin）等。
Fcγ受體是指可和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體的Fc區結合的受體，也表示實質上Fcγ受體基因所編碼的蛋白質家族的所有成員。以人類來說，該家族包括包含同功型（isoform）FcγRIa、FcγRIb及FcγRIc的FcγRI（CD64）；包含同功型FcγRIIa（包含同種異體的（allotype）H131及R131）、FcγRIIb（包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2）及FcγRIIc的FcγRII（CD32）；以及包含同功型FcγRIIIa（包含同種異體的V158及F158）及FcγRIIIb（包含同種異體的FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2）的FcγRIII（CD16），以及至今未發現的類人類FcγR或FcγR同功型或同種異體，但不限於此等。FcγR包含來自人類、小鼠、大鼠、兔及猴，但不限於此等，也可以來自任何生物。小鼠FcγR類包含FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）及FcγRIII-2（CD16-2），以及至今未發現的類小鼠FcγR或FcγR同功型或同種異體，但不限於此等。如此的Fcγ受體的較佳例，例如人類FcγRI（CD64）、FcγRIIA（CD32）、FcγRIIB（CD32）、FcγRIIIA（CD16）及/或FcγRIIIB（CD16）。FcγRI的多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載為RefSeq登錄編號NM_000566.3及NP_000557.1，FcγRIIA的多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載為RefSeq登錄編號BC020823.1及30AAH20823.1，FcγRIIB的多核苷酸序列及胺基酸序列分別為RefSeq登錄編號BC146678.1及AAI46679.1，FcγRIIIA的多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載為RefSeq登錄編號BC033678.1及AAH33678.1，及FcγRIIIB的多核苷酸序列及胺基酸序列分別記載為BC128562.1及AAI28563.1。Fcγ受體是否和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體的Fc區具有結合活性，除了上述記載的FACS或ELISA型式以外，也可經由利用ALPHA篩選法（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）或表面電漿共振（SPR）現象的BIACORE法等而確認（Proc.Natl.Acad.Sci.USA （2006） 103 （11）, 4005-4010）。
又，「Fc配體」或「效應配體」（effector ligand）表示和抗體的Fc區結合，形成Fc/Fc配體複合體之來自任意生物的分子，較佳為多胜肽。Fc配體和Fc的結合較佳誘導1個或以上的效應功能（effector function）。Fc配體包含Fc受體、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、C1q、C3、甘露糖結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌屬的蛋白質A、葡萄球菌屬的蛋白G及病毒的FcγR，但不限於此等。Fc配體也包含和FcγR相同的Fc受體家族的Fc受體相同體（FcRH）（Davis et al.,（2002）Immunological Reviews 190, 123-136）。Fc配體也可包含和Fc結合的未發現分子。
Fc區對FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及/或FcγIIIB的任一個Fcγ受體的結合活性降低之事，除了上述記載的FACS或ELISA型式以外，也可經由利用ALPHA篩選法（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）或表面電漿共振（SPR）現象的BIACORE法等而確認（Proc.Natl.Acad.Sci.USA （2006） 103 （11）, 4005-4010）。
ALPHA篩選法是經由使用提供者和接受者的2種珠子的ALPHA技術根據下列原理實施。和提供者珠子結合的分子、及和接受者珠子結合的分子進行生物學上交互作用，只有在2種珠子接近的狀態時，可檢測出發光訊號。因雷射激發的提供者珠子內的光感應器使周邊的氧轉變為激發態的單重態氧（singlet oxygen）。單重態氧向提供者珠子周圍擴散，到達接近的接受者珠子時，引起珠內的化學發光反應，最後放出光。和提供者珠子結合的分子及和接受者珠子結合的分子不進行交互作用時，提供者珠子產生的單重態氧未到達接受者珠子，因此不發生化學發光反應。
例如，生物素標記的抗原結合分子和提供者珠子結合，以麩胱甘肽S-轉移酶（GST）標籤（tag）化的Fcγ受體和接受者珠子結合。在競爭的具有變異Fc區的抗原結合分子不存在下，使具有野生型Fc區的抗原結合分子和Fcγ受體交互作用，產生520-620nm的訊號。沒有標籤化的具有變異Fc區的抗原結合分子，和具有野生型Fc區的抗原結合分子和Fcγ受體之間的交互作用競爭。將競爭結果所表示的螢光的減少定量，可確定相對的結合親和性。使用Sulfo-NHS-生物素等使抗體等的抗原結合分子生物素化為公知。使Fcγ受體以GST標籤化的方法，可適當採用將編碼Fcγ受體的多核苷酸和編碼GST的多核苷酸以框架內融合的融合基因，在維持在可表現的載體的細胞等中，使其表現，使用麩胱甘肽柱純化的方法等。所得的訊號使用例如GRAPHPAD PRISM（GraphPad社，San Diego）等的軟體，經由適合利用非線性迴歸分析的一站式競爭（one-site competition）模式，可較佳分析。
將觀察交互作用的物質的一方（配體）固定在感應晶片的金薄膜上，當從感應晶片的背面照光，使金薄膜和玻璃的交界面上全反射，形成部分反射光的反射強度降低的部分（SPR訊號）。當使觀察交互作用的物質的另一方（分析物）流向感應晶片的表面，使配體和分析物結合，則固定的配體分子的質量增加，感應晶片表面的溶劑的折射率改變。根據此折射率的改變，SPR訊號的位置偏移（相反地，當結合解離則回到訊號的位置）。Biacore系統以上述的偏移量，亦即在感應晶片的表面的質量變化作為縱軸，以質量的時間變化作為測量數據來表示（感應柱）。從感應柱的曲線，以動力學：結合速度常數（Ka）和解離速度常數（kd），從該常數的比求得親和力（KD）。在Biacore法也可較佳使用抑制測量法。抑制測量法的例子記載於Proc.Natl.Acad.Sci.USA （2006） 103 （11）, 4005-4010。
顯示抗腫瘤效果的複數個治療用抗體，經由在癌細胞的增殖上的必要訊號的抑制、細胞死亡訊號的誘發、或者ADCC（Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity；抗體依賴性細胞毒性作用）、CDC（Complement Dependent Cytotoxicity；補體依賴性細胞毒性作用），發揮對癌細胞的抗腫瘤效果。經由抗體的Fc區和存在於NK細胞或巨噬細胞等的效應細胞上的Fc受體結合，對抗體所結合的目標癌細胞，這些效應細胞發揮的細胞毒性為ADCC。在存在抗體的結構中的補體結合部位，結合補體複合體。經由在抗體所結合的細胞的細胞膜上，存在該複合體中的補體成分形成孔，促進水或離子向細胞內流入，破壞細胞，所引起的細胞傷害為CDC。Fc受體中，Fcγ受體是指可和IgG1、IgG2、IgG3、IgG4單株抗體的Fc區結合的受體，在對Fcγ受體的結合活性低的情形，非癌抗原依賴性地在T細胞和NK細胞或巨噬細胞等表現的受體不被交聯。因此，不會發生非癌抗原依賴性的細胞激素的誘導。Fc區對FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA及/或FcγIIIB的任一Fcγ受體的結合活性降低的抗體，是期望的初級分子的抗體或類IgG抗體分子，及期望的作為二級分子的雙特異性抗體。
本說明書中，對Fcγ受體的結合活性降低是指，例如基於上述分析方法，和對照的抗原結合分子的競爭活性相比，受檢抗原結合分子的競爭活性顯示50%以下，較佳為45%以下、40%以下、35%以下、30%以下、20%以下、15%以下，特佳為10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下的結合活性。
作為對照的抗原結合分子可適當使用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體之具有Fc區的抗原結合分子。該Fc區的結構例如RefSeq登錄編號AAC82527.1的N端加上A的序列、RefSeq登錄編號AAB59393.1的N端加上A的序列、RefSeq登錄編號CAA27268.1的N端加上A的序列、RefSeq登錄編號AAB59394.1N端加上A的序列。又，在具有某特定的同型體的抗體的Fc區變異體的抗原結合分子作為受檢物質使用的情形時，經由使用具有該特定同型體的抗體的Fc區的抗原結合分子作為對照，因該變異體具有的變異對Fcγ受體的結合活性的效果受到驗證。如上述，對Fcγ受體的結合活性降低之事，可適宜製作具有被驗證的Fc區的變異體的抗原結合分子。
如此的變異體之例，為根據EU編號所指定的胺基酸之231A-238S的缺失（WO 2009/011941）、C226S、C229S、P238S（C220S）（J.Rheumatol （2007） 34, 11）、C226S、C229S（Hum. Antibod. Hybridomas （1990） 1（1）, 47-54）、C226S、C229S、E233P、L234V、L235A（Blood （2007） 109, 1185-1192）等的變異體為公知。
亦即，在構成特定的同型體的抗體的Fc區的胺基酸中，較佳例如具有根據EU編號所指定的下列任一胺基酸被取代的Fc區的抗原結合分子：第220位、第226位、第229位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第264位、第265位、第266位、267位、第269位、第270位、第295位、第296位、第297位、第298位、第299位、第300位、第325位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位、第332位。為Fc區的起源的抗體的同型體，沒有特別限定，可適當利用以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體作為起源的Fc區，但較佳利用以IgG1抗體作為起源的Fc區。
例如，也可適宜使用具有在構成IgG1抗體的Fc區的胺基酸之中，具有根據EU編號所指定的下列的任一個的取代（數字各別表示根據EU編號所指定的胺基酸殘基的位置，位於數字之前的單字胺基酸記號表示取代前的胺基酸殘基，位於數字之後的單字胺基酸記號表示取代後的胺基酸殘基）的Fc區，或在第231位至第238位的胺基酸序列有缺失的Fc區的抗原結合分子： （a）L234F、L235E、P331S、 （b）C226S、C229S、P238S、 （c）C226S、C229S、 （d）C226S、C229S、E233P、L234V、L235A （e）L234A、L235A或L235R、N297A （f）L235A或L235R、S239K、N297A。
也可適宜使用具有在構成IgG2抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個的取代（數字各別表示根據EU編號所指定的胺基酸殘基的位置，位於數字之前的單字胺基酸記號表示取代前的胺基酸殘基，位於數字之後的單字胺基酸記號表示取代後的胺基酸殘基）的Fc區的抗原結合分子： （g）H268Q、V309L、A330S、P331S （h）V234A （i）G237A （j）V234A、G237A （k）A235E、G237A （l）V234A、A235E、G237A。
也可適宜使用具有在構成IgG3抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個的取代（數字各別表示根據EU編號所指定的胺基酸殘基的位置，位於數字之前的單字胺基酸記號表示取代前的胺基酸殘基，位於數字之後的單字胺基酸記號表示取代後的胺基酸殘基）的Fc區的抗原結合分子： （m）F241A （n）D265A （o）V264A。
也可適宜使用具有在構成IgG4抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個的取代（數字各別表示根據EU編號所指定的胺基酸殘基的位置，位於數字之前的單字胺基酸記號表示取代前的胺基酸殘基，位於數字之後的單字胺基酸記號表示取代後的胺基酸殘基）的Fc區的抗原結合分子： （p）L235A、G237A、E318A （q）L235E （r）F234A、L235A。
其他的較佳例，如具有在構成IgG1抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個胺基酸：第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第327位、第330位、第331位，取代為對應的IgG2或IgG4中其EU編號對應的胺基酸的Fc區的抗原結合分子。
其他的較佳例，如具有在構成IgG1抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個或以上的胺基酸：第234位、第235位、第297位，取代為其他胺基酸的Fc區的抗原結合分子。取代後存在的胺基酸種類沒有特別限制，特佳以具有在第234位、第235位、第297位的任一個或以上的胺基酸取代為丙胺酸的Fc區的抗原結合分子。
其他的較佳例，如具有在構成IgG1抗體的Fc區的胺基酸之中，根據EU編號所指定的下列的任一個的胺基酸：第265位經其他胺基酸取代的Fc區的抗原結合分子為較佳例。取代後存在的胺基酸種類沒有特別限制，特佳以具有在第265位的胺基酸取代為丙胺酸的Fc區的抗原結合分子。
IgG族的抗體的效應功能之抗體依賴性細胞毒性作用（ADCC）、補體依賴性細胞毒性作用（CDC）的研究，至今為數眾多，在人類IgG族之中，以IgG1次族（subclass）的抗體具有最高的ADCC活性、CDC活性。又，透過IgG族的抗體的目標細胞的吞噬作用的抗體依賴性細胞媒介吞噬作用（ADCP）也被暗示作為抗體的效應功能之一。IgG1次族的抗體由於對腫瘤可發揮這些效應功能，因此對癌抗原的大多數抗體藥物使用IgG1次族的抗體。
另一方面，IgG抗體為了媒介抗體的效應功能的ADCC、ADCP，或目標細胞的吞噬作用之抗體依賴性細胞媒介吞噬作用（ADCP）活性，IgG抗體的Fc區、和存在殺手細胞、自然殺手細胞、活化的巨噬細胞等的效應細胞表面上的Fcγ受體（FcγR）的結合是必要的。
ADCC和ADCP等的細胞毒性的作用功能的增強，是增強抗癌抗體的抗腫瘤效果用的期望手段。對Fcγ受體的結合具有最佳化的Fc區的抗體，被暗示媒介更強力的效應功能，因此發揮更有效果的抗腫瘤效果。因此，使對癌抗原的抗體藥物的抗腫瘤活性增強或提升的抗體工程的方法，有各式各樣的報導（如WO2013047752等）。
對於Fc區和Fcγ受體的結合，顯示加成在抗體的樞紐區和CH2域內的一些胺基酸殘基及和CH2域結合的EU編號第297位的Asn上的醣鏈是重要的（Clark, M., Chemical Immunology （1997） 65, 88-110、Greenwood J, Clark M, Waldmann H., Eur. J. Immunol. （1993） 23, 1098-1104、Morgan A, Jones ND, Nesbitt AM, Chaplin L, Bodmer MW, Emtage JS., Immunology （1995） 86, 319-324）。以此結合處為中心，研究至此具有多樣的Fcγ受體結合特性的Fc區的變異體，獲得具有對更高活性Fcγ受體的親和性的Fc區變異體（WO2000/042072、WO2006/019447）。
如此，在以膜抗原為標靶的抗體中，對Fcγ受體的結合活性，由於在細胞毒性上扮演重要的角色，因此在必須要細胞毒性的情形時，使用對FcγR的結合活性高的人類IgG1的同型體，再經由增強對Fcγ受體的結合活性而增強細胞毒性之事，為廣泛使用的技術。又，在以可溶型抗原作為標靶的抗體中，也可嘗試增強對Fcγ受體的結合活性（WO2013047752）。
以具有Fc區包含選自如下的Fc區的EU編號所表的部位之中的至少1個以上的胺基酸的Fc區的IgG抗體、或類IgG抗體分子具有為次級分子的ADCC活性的抗體為佳： 第221位的胺基酸為Lys或Tyr任一個； 第222位的胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr任一個； 第223位的胺基酸為Phe、Trp、Glu或Lys任一個； 第224位的胺基酸為Phe、Trp、Glu或Tyr任一個； 第225位的胺基酸為Glu、Lys或Trp任一個； 第227位的胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr任一個； 第228位的胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr任一個； 第230位的胺基酸為Ala、Glu、Gly或Tyr任一個； 第231位的胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr任一個； 第232位的胺基酸為Glu、Gly、Lys或Tyr任一個； 第233位的胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第234位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第235位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第236位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第237位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第238位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第239位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第240位的胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr任一個； 第241位的胺基酸為Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr任一個； 第243位的胺基酸為Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr任一個； 第244位的胺基酸為His； 第245位的胺基酸為Ala； 第246位的胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr任一個； 第247位的胺基酸為Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr任一個； 第249位的胺基酸為Glu、His、Gln或Tyr任一個； 第250位的胺基酸為Glu或Gln任一個； 第251位的胺基酸為Phe； 第254位的胺基酸為Phe、Met或Tyr任一個； 第255位的胺基酸為Glu、Leu或Tyr任一個； 第256位的胺基酸為Ala、Met或Pro任一個； 第258位的胺基酸為Asp、Glu、His、Ser或Tyr任一個； 第260位的胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr任一個； 第262位的胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile或Thr任一個； 第263位的胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr任一個； 第264位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr任一個； 第265位的胺基酸為Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第266位的胺基酸為Ala、Ile、Met或Thr任一個； 第267位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第268位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp任一個； 第269位的胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第270位的胺基酸為Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr任一個； 第271位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第272位的胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第273位的胺基酸為Phe或Ile任一個； 第274位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第275位的胺基酸為Leu或Trp任一個； 第276位的胺基酸為、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第278位的胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp任一個； 第279位的胺基酸為Ala； 第280位的胺基酸為Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr任一個； 第281位的胺基酸為Asp、Lys、Pro或Tyr任一個； 第282位的胺基酸為Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr任一個； 第283位的胺基酸為Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr任一個； 第284位的胺基酸為Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr任一個； 第285位的胺基酸為Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr任一個； 第286位的胺基酸為Glu、Gly、Pro或Tyr任一個； 第288位的胺基酸為Asn、Asp、Glu或Tyr任一個； 第290位的胺基酸為Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr任一個、291位的胺基酸為Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr任一個； 第292位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr任一個； 第293位的胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第294位的胺基酸為Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第295位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第296位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val任一個； 第297位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第298位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第299位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr任一個； 第300位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp任一個； 第301位的胺基酸為Asp、Glu、His或Tyr任一個； 第302位的胺基酸為Ile； 第303位的胺基酸為Asp、Gly或Tyr任一個； 第304位的胺基酸為Asp、His、Leu、Asn或Thr任一個； 第305位的胺基酸為Glu、Ile、Thr或Tyr任一個； 第311位的胺基酸為Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr任一個； 第313位的胺基酸為Phe； 第315位的胺基酸為Leu； 第317位的胺基酸為Glu或Gln； 第318位的胺基酸為His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr任一個； 第320位的胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第322位的胺基酸為Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第323位的胺基酸為Ile； 第324位的胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第325位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第326位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第327位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第328位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第329位的胺基酸為Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第330位的胺基酸為Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第331位的胺基酸為Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第332位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr任一個； 第333位的胺基酸為Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr任一個； 第334位的胺基酸為Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr任一個； 第335位的胺基酸為Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr任一個； 第336位的胺基酸為Glu、Lys或Tyr任一個； 第337位的胺基酸為Glu、His或Asn任一個； 第339位的胺基酸為Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr任一個； 第376位的胺基酸為Ala或Val任一個； 第377位的胺基酸為Gly或Lys任一個； 第378位的胺基酸為Asp； 第379位的胺基酸為Asn； 第380位的胺基酸為Ala、Asn或Ser任一個； 第382位的胺基酸為Ala或Ile任一個； 第385位的胺基酸為Glu； 第392位的胺基酸為Thr； 第396位的胺基酸為Leu； 第421位的胺基酸為Lys； 第427位的胺基酸為Asn； 第428位的胺基酸為Phe或Leu任一個； 第429位的胺基酸為Met； 第434位的胺基酸為Trp； 第436位的胺基酸為Ile；以及 第440位的胺基酸為Gly、His、Ile、Leu或Tyr任一個。
初級分子的製作 初級分子為和病變細胞表現的抗原結合，且包含經蛋白酶而被切斷的連接子的抗原結合分子，一例為，製作對於根據上述順序所得的（1）對和病變細胞表現的抗原結合的抗體，插入因蛋白酶而被切斷的連接子。
更具體為，製作在編碼部分或全部的連接子的DNA序列附加插入連接子的抗體的部分序列之3’方向及5’方向的PCR引子，再以應插入連接子的抗體的重鏈或輕鏈的鹼基序列作為鑄模，在DNA的5’端及3’端進行PCR反應。接著，將所得的PCR產物利用In-Fusion（R） HD Cloning Kit（Clontec）等，插入公知的表現載體。所得的表現載體經由成對的輕鏈或重鏈的質體及公知方法，轉染培養細胞。抗體表現後，使用蛋白質A柱等的公知方法純化，獲得插入連接子的抗體。
本揭示之「結合」是指通常經由靜電、凡得瓦力、氫鍵等的非共價鍵為主的交互作用的結合。本揭示之結合態樣的較佳例，不限定於此，例如抗原結合區、抗原結合分子、抗體、及抗體片段等和抗原結合的抗原抗體反應。
本揭示之初級分子只限於和病變細胞表現的抗原結合者，只要是在未切斷或切斷後的狀態下可和病變細胞表現的抗原結合者，任何結構的分子皆可使用。初級分子之例，沒有特別限定，例如抗體、單域抗體（sdAb）、存在活體內的細胞膜蛋白Avimer所含的約35個胺基酸稱為A域的模組（國際專利公開案WO2004/044011、WO2005/040229）、包含和在細胞膜表現的醣蛋白之纖維接合素（fibronectin）中的蛋白結合的域之10Fn3域的Adnectin（國際專利公開案WO2002/032925）、使構成由蛋白質A的58個胺基酸所形成的3個螺旋束（bundle）的IgG結合域支架化（scaffold）的Affibody（國際專利公開案WO1995/001937）、在具有包含33個胺基酸殘基的轉折和2個逆向並行的螺旋及環的次單元重複累積的結構之錨蛋白重複序列（ankyrin repeat：AR）的分子表面露出的區域DARPins（國際專利公開案WO2002/020565）、嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL））等的脂質運載蛋白分子中高度保留的8個逆向並行股在中央方向支持扭曲的桶狀結構的一側的4個環區域Anticalin等（國際專利公開案WO2003/029462）、在八目鰻、盲鰻等的無顎類的後天免疫系統之不具有免疫球蛋白結構的可變性淋巴球受體（variable lymphocyte receptor（VLR））的富含白胺酸殘基的重複序列（leucine-rich-repeat（LRR））模組重複累積的馬蹄型結構的內部的並行型片狀結構的凹陷區域（國際專利公開案WO2008/016854）。
在本發明一實施態樣，進一步在蛋白酶切斷序列的任一端或兩端加上撓性連接子。蛋白酶切斷序列的一端的撓性連接子可稱為第一撓性連接子，另一端的撓性連接子可稱為第二撓性連接子。在特定實施形態，蛋白酶切斷序列和撓性連接子包含下式之一。 （蛋白酶切斷序列） （第一撓性連接子）- （蛋白酶切斷序列） （蛋白酶切斷序列）- （第二撓性連接子） （第一撓性連接子）- （蛋白酶切斷序列） - （第二撓性連接子）
本實施態樣之撓性連接子較佳為胜肽連接子。第一撓性連接子和第二撓性連接子各自獨立且任意存在，為包含至少1個可撓的胺基酸（Gly等）的相同或不同的撓性連接子。例如，蛋白酶切斷序列包含獲得所欲蛋白酶可接近性的程度的充分數量的殘基（任意選自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等的胺基酸，特別是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，更為Gly及Ser，特別為Gly等）。
適合在蛋白酶切斷序列的兩端使用的撓性連接子，通常增加蛋白酶切斷序列的蛋白酶可接近性、增加蛋白酶的切斷效率。較佳的撓性連接子可容易選擇，可始自從1個胺基酸（Gly等）至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、或4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸， 3個胺基酸至12個胺基酸等，從不同長度中選擇較佳者。本發明一些實施態樣，撓性連接子為1至7個胺基酸的胜肽連接子。
撓性連接子之例，不限於這些，例如甘胺酸聚合物（G）n 、甘胺酸-絲胺酸聚合物（例如，包含（GS）n 、（GSGGS）n 及（GGGS）n ，n為至少1的整數）、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、在習知技術中周知的其他撓性連接子。
這些之中，以甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物受到注意，理由是這些胺基酸沒有比較性結構化，容易作用作為成分間的中性連繫。
由甘胺酸-絲胺酸聚合物所形成的撓性連接子的例子，不限於該等，例如 Ser； Gly・Ser（GS）； Ser・Gly（SG）； Gly・Gly・Ser（GGS）； Gly・Ser・Gly（GSG）； Ser・Gly・Gly（SGG）； Gly・Ser・Ser（GSS）； Ser・Ser・Gly（SSG）； Ser・Gly・Ser（SGS）； Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS）； Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG）； Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG）； Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG）； Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG）； Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS）； Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG）； Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG）； Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG）； Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS）； Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG）； Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG）； Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG）； Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG）； Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG）； Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS）； Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG）； Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS）； Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG）； （Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS））n ；及 （Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG））n ［n為１以上的整數］等。但胜肽連接子的長度或序列視目的可由此技術領域之人士適當選擇。
本揭示的抗原結合分子為包含切斷序列的多胜肽。切斷序列經蛋白酶而被切斷。切斷序列只要是切斷後所產生的抗原結合片段可和目標細胞（病變細胞）表現的抗原結合，也可以配置在多胜肽中的任何位置。又，多胜肽中所包含的切斷序列可為1個也可為複數個。
本發明一實施態樣中，本發明之抗原結合分子經切斷序列被切斷，產生抗原結合片段，此為連接子切斷後的抗原結合分子，具有和抗原的結合活性。
檢測抗原結合分子的連接子切斷後的抗原結合片段的發生之方法，有以辨識該片段的檢測用抗體等檢測方法。使用抗原結合片段檢測用抗體的檢測，例如FACS、ELISA型式、利用ALPHA篩選法（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay）或表面電漿共振 （SPR）現象的BIACORE法、BLI（Bio-Layer Interferometry；生物膜干涉技術）法（Octet）等，經周知方法確認 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA （2006） 103 （11）, 4005-4010）。例如，在使用Octet檢測抗原結合片段的情形，將辨識抗原結合片段的檢測用抗體進行生物素化，在和生物感應器接觸之後，測量樣本中對抗原結合片段的結合，可檢測抗原結合片段的發生。具體為，對於含有蛋白酶處理前的抗原結合分子和蛋白酶處理後的抗原結合片段之樣本，使用檢測抗體測量抗原結合片段的量，比較蛋白酶處理前後的樣本中的抗原結合片段的檢測量，可檢測出抗原結合片段的發生。又，對於含有蛋白酶和連接子切斷前的抗原結合分子和連接子切斷後的抗原結合片段之樣本、以及不含蛋白酶而含有連接子切斷前的抗原結合分子和連接子切斷後的抗原結合片段之樣本，使用檢測抗體，測量抗原結合片段的量，比較有無蛋白酶的樣本中的檢測量，可檢測出抗原結合片段的發生。更具體為，根據本案實施例之方法，可檢測抗原結合片段的發生。在連結子切斷前的抗原結合分子形成融合蛋白的情形，對於含有蛋白酶處理前或蛋白酶處理後的融合蛋白的樣本，使用抗原結合片段檢測抗體，測量抗原結合片段的量，比較蛋白酶處理前後的樣本中的抗原結合片段檢測量，可檢測抗原結合片段的發生。又，對於含有蛋白酶和融合蛋白的樣本、及不含蛋白酶而含有融合蛋白的樣本，使用抗原結合片段檢測抗體，測量抗原結合片段的量，比較有無蛋白酶的樣本中的抗原結合片段檢測量，可檢測抗原結合片段的發生。更具體為，根據本案實施例之方法，可檢測抗原結合片段的發生。
本發明一實施態樣中，切斷序列包含蛋白酶切斷序列，經蛋白酶切斷。
本說明書中，用語「蛋白酶」是指水解胜肽鍵的內切胜肽酶或肽鏈端解酶（exopeptidase）等的酵素，通常是指內切胜肽酶。本發明所使用的蛋白酶只限定為可切斷蛋白酶切斷序列，其種類沒有特別限定。在一些實施態樣中，使用目標組織特異性蛋白酶。目標組織特異性蛋白酶可指例如下列任一者： （1） 在目標組織以較正常組織高水平表現之蛋白酶， （2） 在目標組織具有較正常組織高的活性之蛋白酶， （3） 在目標細胞以較正常細胞高水平表現之蛋白酶， （4） 在目標細胞具有較正常細胞高的活性之蛋白酶。 在更具體的實施態樣，使用癌組織特異性蛋白酶或發炎組織特異性蛋白酶。
本說明書中，用語「目標組織」表示包含至少一個目標細胞的組織。在本發明一些實施態樣中，目標組織為癌組織。在本發明一些實施態樣中，目標組織為發炎組織。
用語「癌組織」是指包含至少1個癌細胞的組織。因此，可謂例如癌組織包含癌細胞和血管、參與包含癌細胞及內皮細胞之腫瘤（tumor mass）的形成之所有細胞型。本說明書中，腫瘤稱為腫瘤組織病兆（a foci of tumor tissue）。所謂「腫瘤」用語一般用於表示良性贅生物或惡性贅生物。
本說明書中，「發炎組織」例如以下例子。 ‧風濕性關節炎或退化性關節炎的關節 ‧支氣管氣喘或COPD的肺（肺泡） ‧發炎性腸道疾病或克隆氏症或潰瘍性大腸炎的消化器官 ‧肝臟、腎臟、肺的纖維化的纖維化組織 ‧器官移植中引起排斥反應的組織 ‧動脈硬化或心臟衰竭的血管、心臟（心肌） ‧代謝症候群的內臟脂肪 ‧異位性皮膚炎或其他皮膚炎的皮膚組織，以及 ‧椎間盤突出或慢性腰痛的脊髓神經。
在一些種類的目標組織中，已知被認為和特異性表現或特異性活化的蛋白酶或目標組織的疾病狀態相關的蛋白酶（目標組織特異性蛋白酶）。例如國際專利公開案WO2013/128194號、國際專利公開案WO2010/081173號、國際專利公開案WO2009/025846號等揭示在癌組織特異性表現的蛋白酶。又在J Inflamm （Lond）. 2010； 7： 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul；6（7）：541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec；13（12）：904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4；17：23.、Dis Model Mech. 2014 Feb；7（2）：193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan；1824（1）：133-45.揭示認為和發炎相關的蛋白酶。
除了在目標組織特異性表現的蛋白酶外，也存在在目標組織特異性活化的蛋白酶。例如，有蛋白酶以不活化型表現、之後成為活化型的情形，在多個組織存在抑制活化型蛋白酶的物質，經由活化的過程和抑制劑的存在而控制活性（Nat Rev Cancer. 2003 Jul；3（7）：489-501.）。在目標組織中，有活化型蛋白酶脫離抑制而特異性活化者。活化型蛋白酶的測量方法可使用以辨識活化型蛋白酶的抗體之方法（PNAS 2013 Jan 2； 110（1）： 93-98.），或者將蛋白酶辨識的胜肽以螢光標記，在切斷前消光（quench）但切斷後發光之方法（Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep；9（9）：690-701. doi： 10.1038/nrd3053.）來測量。
從一觀點，在目標組織特異性表現的蛋白酶（「目標組織特異性蛋白酶」）可指以下任一種： （i） 在目標組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在目標組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在目標細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶，以及 （iv） 在目標細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。
不限制解釋，但具體的蛋白酶例如半胱胺酸蛋白酶（包含組織蛋白酶家族B、L、S等）、天冬醯胺酸蛋白酶（組織蛋白酶 D、E、K、O等）、絲胺酸蛋白酶（包含Matriptase （包含MT-SP1）、組織蛋白酶 A及G、凝血酶（thrombin）、血纖維蛋白溶解酶（plasmin）、尿激酶（uPA）、組織型蛋白酶原活化因子（tPA）、彈性蛋白酶（elastase）、蛋白酶3、凝血酶、激酞釋放素（kallikrein）、中性蛋白酶、凝乳酶（chymase））、金屬蛋白酶（包含膜結合型（MMP14-17及MMP24-25）及分泌型（MMP1-13及MMP18-23及MMP26-28）兩者的金屬蛋白酶 （MMP1-28）、蛋白酶的A去整合素及金屬蛋白酶 （ADAM）、具有A去整合素或謝小板反應素模體的金屬蛋白酶（ADAMTS）、穿膜肽酶（穿膜肽酶α（meprin alpha）、穿膜肽酶β（meprin beta）））、CD10（CALLA）、以及前列腺特異性抗原（PSA）、天冬門胺酸内肽酶（legumain）、TMPRSS3、TMPRSS4、嗜中性球彈性蛋白酶 （HNE）、β分泌酶（BACE）、纖維母細胞活化蛋白α（FAP）、顆粒酶B（granzyme  B）、 鳥糞嘌呤苯酶（GB）、肝素、腦啡肽酶（neprilysin）、NS3/4A、HCV-NS3/4、鈣蛋白酶（calpain）、ADAMDEC1、腎素、組織蛋白酶 C、組織蛋白酶 V/L2、組織蛋白酶 X/Z/P、Cruzipain、Otubain 2、激肽釋放素（kallikrein）相關肽酶 （KLKs（KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14））、骨塑型蛋白1（BMP-1）、活性蛋白C、血液凝固相關蛋白酶（第VIIa凝血因子、第IXa凝血因子、第Xa凝血因子、第XIa凝血因子、第XIIa凝血因子）、HtrA1、乳鐵蛋白（lactoferrin）、Marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4（DPP-4）、TMPRSS2、組織蛋白酶 F、組織蛋白酶 H、組織蛋白酶 L2、組織蛋白酶 O、組織蛋白酶 S、顆粒酶A、Gepsin calpain 2、麩胺酸羧基肽酶2、AMSH-類蛋白酶、AMSH、γ分泌酶（γsecretase）、A抗血纖維蛋白溶解酶切斷酵素（APCE）、Decysin 1、N-乙醯化α連接酸性二肽基肽酶類1（NAALADL1）、弗林蛋白酶（furin）等。
從別的觀點，目標組織特異性蛋白酶可指癌組織特異性蛋白酶或發炎組織特異性蛋白酶。
癌組織特異性蛋白酶例如國際專利公開案WO2013/128194號、國際專利公開案WO2010/081173號、國際專利公開案WO2009/025846號等揭示之在癌組織特異性表現的蛋白酶。
癌組織特異性蛋白酶的種類，在治療對象的癌組織的表現的特異性越高，得到副作用減少效果。癌組織特異性蛋白酶宜為在癌組織的濃度高於在正常組織的濃度的5倍以上，較佳為高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。又，癌組織特異性蛋白酶宜為在癌組織的活性高於在正常組織的活性的2倍以上，較佳為高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。
又，癌組織特異性蛋白酶也可和癌細胞的細胞膜結合，也可不和細胞膜結合而分泌於細胞外。在癌組織特異性蛋白酶不和癌細胞的細胞膜結合的情形，為了使經免疫細胞的細胞毒性在癌細胞為特異性，癌組織特異性蛋白酶較佳存在癌組織的內部或附近。但是，以儘可能不傷害正常細胞的範圍為佳。
從別的觀點，在癌組織特異性表現的蛋白酶（「癌組織特異性蛋白酶」）為以下任一種： （i） 在癌組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在癌組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在癌細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶， （iv） 在癌細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。 癌組織特異性蛋白酶可為1種單獨，也可組合2種以上。癌組織特異性蛋白酶的種類數，可考慮治療對象的癌種類，由此技術領域之人士適當設定。
從上述觀點，癌組織特異性蛋白酶，在上列舉例之蛋白酶中，以絲胺酸蛋白酶和金屬蛋白酶為佳，更佳為Matriptase（包含MT-SP1）、尿激酶（uPA）及金屬蛋白酶，更佳為MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9。
發炎組織特異性蛋白酶的種類，在治療對象的發炎組織的表現的特異性越高，得到副作用減少效果。發炎組織特異性蛋白酶宜為在發炎組織的濃度高於在正常組織的濃度的5倍以上，較佳為高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。又，發炎組織特異性蛋白酶宜為在發炎組織的活性高於在正常組織的活性的2倍以上，較佳為高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，更佳為高100倍以上，特佳為高500倍以上，最佳為高1000倍以上。
又，發炎組織特異性蛋白酶也可和發炎細胞的細胞膜結合，也可不和細胞膜結合而分泌於細胞外。在發炎組織特異性蛋白酶不和發炎細胞的細胞膜結合的情形，為了使經免疫細胞的細胞毒性在發炎細胞為特異性，發炎組織特異性蛋白酶較佳存在發炎組織的內部或附近。以儘可能不傷害正常細胞的範圍為佳。
從別的觀點，發炎組織特異性蛋白酶為以下任一種： （i） 在發炎組織以較正常組織高水平表現的蛋白酶， （ii） 在發炎組織具有較正常組織高的活性的蛋白酶， （iii） 在發炎細胞以較正常細胞高水平表現的蛋白酶， （iv）在發炎細胞具有較正常細胞高的活性的蛋白酶。 發炎組織特異性蛋白酶可為1種單獨，也可組合2種以上。發炎組織特異性蛋白酶的種類數，可考慮治療對象的病症，由此技術領域之人士適當設定。
從上述觀點，發炎組織特異性蛋白酶，在上列舉例之蛋白酶中，以金屬蛋白酶為佳，在金屬蛋白酶中，以ADAMTS5、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13較佳。
在本發明更具體的一些實施態樣中，抗原結合分子（初級分子）為抗體。在使用抗體作為抗原結合分子的情形時，連接子切斷後的抗原結合分子可包含含有全部或部分的可變區的抗原結合片段及部分的切斷連接子。在更具體的一些實施態樣中，抗原結合分子為IgG抗體。在使用IgG抗體做為抗原結合分子的情形時，其種類不限定，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。即使在使用IgG抗體做為抗原結合分子的情形時，對目標細胞或病變細胞表現的抗原的結合也可經由包含全部或部分的可變區的抗原結合片段來實現。
在本發明一些實施態樣中，透過抗原結合分子中的切斷序列/蛋白酶切斷序列被切斷，使抗原結合分子中、對病變細胞表現的抗原具有結合活性的結構域斷裂，而可和病變細胞表現的抗原結合。例如，在使用IgG抗體做為抗原結合分子的情形時，在抗體可變區中設置切斷序列/蛋白酶切斷序列，在切斷狀態中，雖然不能形成完全的抗體可變區，但可和病變細胞表現的抗原結合。
在本發明一些實施態樣中，使抗原結合分子所含的VH和VL締合。又，抗體VH和抗體VL的締合可經由，例如抗原結合分子所含的連接子的蛋白酶切斷序列的切斷而可消除。締合的消除，可換言為例如2個以上的多胜肽區的交互作用狀態的全部或部分被消除。VH和VL的締合消除可以是VH和VL的交互作用全部被消除，也可以是VH和VL的交互作用中的一部分被消除。
對於本發明之抗原結合分子，抗原結合分子中的抗體VL或其一部分和抗體VH或其一部分的締合包含經連接子被切斷而被消除的抗原結合分子。
在本發明一些實施態樣中，抗原結合分子包含抗體VH和抗體VL，在抗原結合分子的連接子的蛋白酶切斷序列未被切斷的狀態下，抗原結合分子中的抗體VH和抗體VL締合，而經由連接子的蛋白酶切斷序列的切斷，抗原結合分子中的抗體VH和抗體VL的締合被消除。抗原結合分子中的連接子的蛋白酶切斷序列只要是即使被切斷也能使抗原結合分子和病變細胞表現的抗原結合，配置在抗原結合分子的哪個位置皆可。
在本發明更進一步的一些實施態樣中，抗原結合分子包含抗體VH和抗體VL和抗體恆定區。
如Rothlisberger等人（J Mol Biol. 2005 Apr 8；347（4）：773-89.）所述，已知抗體的VH和VL、CH和CL在結構域間透過多個胺基酸側鏈進行交互作用。已知VH-CH1和VL-CL作為Fab域可形成穩定的結構，但如已報導的，VH和VL之間的胺基酸側鏈一般在10-5 到10-8 範圍的解離常數進行交互作用，被認為在只有VH域和VL域存在的情形下，形成締合狀態的比例少。
本發明一些實施態樣中，設計如下的抗原結合分子：在含有抗體VH和抗體VL的抗原結合分子設置含有蛋白酶切斷序列的連接子，切斷前，Fab結構中重鏈-輕鏈交互作用全部存在於2個胜肽之間，相對的，在切斷蛋白酶切斷序列時，含有VH（或部分VH）的胜肽和含有VL（或部分VL）的胜肽之間的交互作用減弱，VH和VL的締合被消除。
在本發明一實施態樣，含有蛋白酶切斷序列的連接子，位於抗體恆定區內。更具體的實施態樣中，含有蛋白酶切斷序列的連接子位於比抗體重鏈恆定區中的第140位（EU編號）胺基酸更可變區側，較佳為位於比抗體重鏈恆定區中的第122位（EU編號）胺基酸更可變區側。在一些具體實施態樣中，蛋白酶切斷序列被導入抗體重鏈恆定區第118位胺基酸（EU編號）至抗體重鏈恆定區第140位胺基酸（EU編號）的序列中的任意位置。在另外更具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於比抗體輕鏈恆定區中的第130位胺基酸（Kabat編號）胺基酸更可變區側，較佳為位於比抗體輕鏈恆定區中的第113位胺基酸（Kabat編號）胺基酸更可變區側，位於比抗體輕鏈恆定區中的第112位胺基酸（Kabat編號）胺基酸更可變區側。在一些具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列被導入抗體輕鏈恆定區第108位胺基酸（Kabat編號）至抗體輕鏈恆定區第131位胺基酸（Kabat編號）的序列中的任意位置。
在本發明一實施態樣，含有蛋白酶切斷序列的連接子位於抗原結合分子的抗體VH內或抗體VL內。更具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於比抗體VH的第7位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，較佳位於比抗體VH的第40位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，更佳位於比抗體VH的第101位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，再更佳位於比抗體VH的第109位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，位於比抗體VH的第111位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側。更具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於比抗體VL的第7位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，較佳位於比抗體VL的第39位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，更佳位於比抗體VL的第96位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，再更佳位於比抗體VL的第104位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側，位於比抗體VL的第105位（Kabat編號）胺基酸更抗體恆定區側。
在一些更具體的實施態樣中，蛋白酶切斷序列被導入形成抗體VH或抗體VL中的環結構的殘基及接近環結構的殘基的位置。抗體VH或抗體VL中的環結構是指在抗體VH或抗體VL中，不形成α-螺旋、β-摺版等的二級結構的部分。形成環結構的殘基及接近環結構的殘基的位置具體可指：抗體從VH第7位胺基酸（Kabat編號）至第16位胺基酸（Kabat編號）、第40位胺基酸（Kabat編號）至第47位胺基酸（Kabat編號）、第55位胺基酸（Kabat編號）至第69位胺基酸（Kabat編號）、第73位胺基酸（Kabat編號）至第79位胺基酸（Kabat編號）、第83位胺基酸（Kabat編號）至第89位胺基酸（Kabat編號）、第95位胺基酸（Kabat編號）至第99位胺基酸（Kabat編號）、第101位胺基酸（Kabat編號）至第113位胺基酸（Kabat編號）、抗體第VL7位胺基酸（Kabat編號）至第19位胺基酸（Kabat編號）、第39位胺基酸（Kabat編號）至第46位胺基酸（Kabat編號）、第49位胺基酸（Kabat編號）至第62位胺基酸（Kabat編號）、第96位胺基酸（Kabat編號）至第107位胺基酸（Kabat編號）的範圍。
當抗原結合分子為抗體的情形時，在其他態樣中，連接子導入抗體重鏈恆定區的CH2/CH3交界面附近。此處，CH2/CH3交界面附近為EU編號335-345的區域。
在本發明一實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於抗體VH和抗體恆定區的交界附近。抗體VH和抗體重鏈恆定區的交界附近可指從抗體VH第101位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第140位（EU編號）的胺基酸之間，較佳為從抗體VH第109位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間，或從抗體VH第111位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間。又，在連結抗體VH和抗體輕鏈恆定區的情形，在抗體VH和抗體輕鏈恆定區的交界附近可指從抗體VH第101位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第130位（Kabat編號）的胺基酸之間，較佳從抗體VH第109位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第113位（Kabat編號）的胺基酸之間，或者從抗體VH第111位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第112位（Kabat編號）的胺基酸之間。
在一實施態樣中，蛋白酶切斷序列位於抗體VL和抗體恆定區的交界附近。抗體VL和抗體輕鏈恆定區的交界附近可指從抗體VL第96位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第130位（Kabat編號）的胺基酸之間，較佳從抗體VL第104位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第113位（Kabat編號）的胺基酸之間，或者從抗體VL第105位（Kabat編號）的胺基酸至抗體輕鏈恆定區第112位（Kabat編號）的胺基酸之間。在連結抗體VL和抗體重鏈恆定區的情形，在抗體VL和抗體重鏈恆定區的交界附近可指從抗體VL第96位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第140位（EU編號）的胺基酸之間，較佳從抗體VL第104位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間，或者從抗體VL第105位（Kabat編號）的胺基酸至抗體重鏈恆定區第122位（EU編號）的胺基酸之間。
蛋白酶切斷序列可在初級分子中設置複數個，例如可設置在選自抗體恆定區內、抗體VH內、抗體VL內、抗體VH和抗體恆定區的交界附近、抗體VL和抗體恆定區的交界附近之複數個位置。又如果接觸本發明的此技術領域之人士，可更換抗體VH和抗體VL等、變更含有抗體VH和抗體VL和抗體恆定區的分子形態，該分子形態不超出本發明範圍。
次級分子（T細胞重定向抗體）的製作 次級分子為具有和T細胞受體複合體結合的抗體可變區、及和連接子切斷後的抗原結合分子結合的抗體可變區之T細胞重定向抗體；或具有和連接子切斷後的抗原結合分子結合的細胞外域的嵌合受體，一例為，使用經由上述步驟所獲得的（2）抗CD3抗體、（3）和連接子切斷後的抗原結合分子結合的抗體，製作T細胞重定向抗體。
雙特異性抗體 本發明之T細胞重定向抗體的較佳態樣之一，例如雙特異性抗體。此處，雙特異性抗體為具有二個不同特異性的抗體。IgG型的雙特異性抗體可經由融合二種產生IgG抗體的融合瘤所產生的雜交融合瘤（hybrid hybridoma（quadroma））而分泌（Milstein C et al.Nature （1983） 305, 537-540）。雙特異性抗體的Fc區，在使用對Fcγ受體的結合活性低的Fc區的情形時，以雙特異性抗體為起源的Fc區也被適宜使用。
又，IgG型的雙特異性抗體經由將構成目標的2種IgG的L鏈和H鏈的基因、總計4種基因，導入細胞，使該等共同表現而被分泌。然而，以此等方法所產生的IgG的H鏈和L鏈的組合理論上總共10種。從10種IgG純化由目標組合的H鏈L鏈所形成的IgG是困難的。而且，目標組合者的分泌量理論上也是顯著的低，因此必須有大的培養規模，製造成本更為增加。
因此，本發明之雙特異性抗體可應用於促進目標組合的H鏈間及L鏈H鏈間的締合用的技術。
例如，多特異性抗體的締合化可適用在抗體H鏈的第二恆定區（CH2）或H鏈的第三恆定區（CH3）的交界面導入電荷排斥而抑制非目標的H鏈彼此的締合的技術（WO2006/106905）。
在CH2或CH3的交界面導入電荷排斥而抑制非所欲的H鏈彼此締合的技術中，在H鏈的其他恆定區的交界面接觸的胺基酸殘基，可例如相對於CH3區的EU編號第356位的殘基、EU編號第439位的殘基、EU編號第357位的殘基、EU編號第370位的殘基、EU編號第399位的殘基、EU編號第409位的殘基的區域。更具體地，例如，在含有2種H鏈CH3區的抗體中，可選自在第一H鏈CH3區中的下列（1）～（3）所示胺基酸殘基組的1組至3組胺基酸殘基可作為具有同種電荷的抗體：（1） 為H鏈CH3區所含的胺基酸殘基，EU編號第356位及第439位的胺基酸殘基；（2） 為H鏈CH3區所含的胺基酸殘基，EU編號第357位及第370位的胺基酸殘基；（3） 為H鏈CH3區所含的胺基酸殘基，EU編號第399位及第409位的胺基酸殘基。
再者，為選自和上述第1的H鏈CH3區不同的第二H鏈CH3區中的上列（1）～（3）所示胺基酸殘基組的胺基酸殘基組，對應在上述第一H鏈CH3區中具有相同電荷的上列（1）～（3）所示胺基酸殘基組的1組至3組的胺基酸殘基，可作為具有和對應上述第一H鏈CH3區的胺基酸殘基相反電荷的抗體。
上述（1）～（3）所載的各個胺基酸殘基在締合時彼此接近。如果是此技術領域之人士，對於所欲的H鏈CH3區或H鏈恆定區，可經由使用市售軟體的同源性模擬法等，可發現對應上述（1）～（3）所載的胺基酸殘基的部位，適宜的對該部位的胺基酸殘基進行改變。
上述抗體中，「具有電荷的胺基酸殘基」較佳例如選自下列（a）或（b）任一群所含的胺基酸殘基： （a） 麩胺酸（E）、天冬胺酸（D）， （b） 離胺酸（K）、精胺酸（R）、組胺酸（H）。 上述抗體中，「具有同種的電荷」表示例如2個以上的胺基酸殘基的任一個皆具有上述（a）或（b）任一群所包含的胺基酸殘基。「具有相反的電荷」表示例如2個以上的胺基酸殘基之中的至少一個胺基酸殘基，具有上述（a）或（b）任一群所包含的胺基酸殘基的情形時，其餘的胺基酸殘基具有不同群所含的胺基酸殘基。
在較佳態樣中，上述抗體也可經由雙硫鍵使第一H鏈CH3區和第二H鏈CH3區交聯。
本發明中進行改變的胺基酸殘基不限於上述抗體的可變區或抗體的恆定區的胺基酸殘基。如果是此技術領域之人士，對於多胜肽變異體或異種多聚體，可經由使用市售軟體的同源性模擬法等，可發現形成交界面的胺基酸殘基，可將該部位的胺基酸殘基進行改變以控制締合。
又，本發明的雙特異性的締合化也可進一步使用其他公知技術。經由將存在於抗體的一H鏈的Fc區的胺基酸側鏈取代為較大的側鏈（knob； 突起），存在於另一個H鏈的相對的Fc區的胺基酸側鏈取代為較小的側鏈（hole； 空隙），透過可將突起配置在空隙內，可有效率的發生具有Fc區的不同胺基酸的多胜肽彼此的締合化（WO1996/027011、Ridgway JB et al., Protein Engineering （1996） 9, 617-621、Merchant AM et al. Nature Biotechnology （1998） 16, 677-681、US20130336973）。
除此之外，對於本發明的雙特異性抗體的形成，也可進一步使用其他公知技術。透過使用抗體的一H鏈的CH3區的一部分為對應該部分的來自IgA的序列、另一個H鏈的CH3區的互補部分使用導入對應該部分的來自IgA的序列之股交換工程域CH3（strand-exchange engineered domain CH3），可經由CH3的互補性締合化，有效率的引起具有不同序列的多胜肽的締合化（Protein Engineering Design &amp； Selection, 23； 195-202, 2010）。也可使用此公知技術，有效率的形成目標雙特異性抗體。
其他的雙特異性抗體的形成也可利用WO2011/028952或WO2014/018572或Nat Biotechnol. 2014 Feb；32（2）：191-8.所記載的抗體的CH1和CL的締合化、利用VH、VL的締合化的抗體製作技術；WO2008/119353或WO2011/131746所記載的使用各別調製的單株抗體彼此，製作雙特異性抗體的技術（Fab 臂交換；Fab Arm Exchange）；WO2012/058768或WO2013/063702記載的控制抗體重鏈的CH3間的締合的技術；WO2012/023053記載的製作由二種的輕鏈和一種的重鏈所構成的雙特異性抗體的技術；Christoph等（Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 （2013）記載的利用各別表現由1股H鏈和1股L鏈所形成的抗體的一鏈的2個細菌細胞株製造特異性抗體的技術等。
又，即使是不能有效率的形成目標雙特異性抗體的情形，也可經由從所產生的抗體中分離、純化目標的雙特異性抗體，得到本發明的雙特異性抗體。例如已有報導透過在2種的H鏈可變區導入胺基酸取代、提供等電點（pI）差，以離子交換層析法純化2種同源體和目標的異源抗體（WO2007114325）。又，純化異源體的方法，至今已有報導由和蛋白質A結合的小鼠IgG2a的H鏈及不和蛋白質A結合的大鼠IgG2b的H鏈所形成的異源二聚化抗體，以蛋白質A純化的方法（WO98050431、WO95033844）。再者，也可透過使用將IgG和蛋白質A的結合部位之EU編號第435位及第436位的胺基酸殘基取代為Tyr、His等對蛋白質A的結合力不同的胺基酸之H鏈，或者根據參考實施例5記載的方法獲得對蛋白質A的結合力不同的H鏈，使各H鏈和蛋白質A的交互作用變化，透過使用蛋白質A柱，有效的純化只有異源二聚化抗體。
又，獲得使不同的複數個H鏈具有結合能力的共通L鏈，也可作為雙特異性抗體的共通L鏈。經由將如此的共通L鏈和不同的複數個H鏈基因導入細胞，透過使IgG表現，可效率良好的使雙特異性IgG表現（Nature Biotechnology （1998） 16, 677-681）。在選擇共通H鏈之時，也可利用選擇對應任意不同的H鏈顯示高結合能力的共通L鏈的方法（WO2004/065611）。
又，本發明之Fc區可適宜使用Fc區C端的異質性改良的Fc區。更具體的說，在構成以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4作為起源的Fc區的2個多胜肽的胺基酸序列之中，提供根據EU編號所指定的第446位的甘胺酸、及第447位的離胺酸缺失的Fc區。
這些技術也可組合複數個、例如2個以上使用。又，這些技術也可適宜的各別適合於希望締合的2個H鏈。再者，這些技術也可組合上述對Fcγ受體的結合活性降低的Fc區使用。又，本發明之抗原結合分子，也可以增加上述變化者為基礎，以其他方法製作具有相同胺基酸序列的抗原結合分子。
本發明中，「功能上相同」的抗體可變區為滿足上述條件的抗體H鏈可變區及/或抗體L鏈可變區，沒有特別限定。如此的抗體可變區也可為例如上述表1～3所記載的可變區的胺基酸序列有1個或複數個胺基酸（例如1、2、3、4、5或10個胺基酸）被取代、缺失、加成及/或插入。在胺基酸序列中，用於1個或複數個胺基酸被取代、缺失、加成及/或插入之此技術領域之人士已知的方法，已知有蛋白質導入變異的方法。例如，如果是此技術領域之人士，使用定點突變法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. （1995） An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.（1983） Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ（1984） The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ（1987） Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA（1985） Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）等，在胺基酸序列導入適當變異，可調製和具有上述功能的抗體可變區功能上相同的可變區。
在改變胺基酸序列的情形，希望變異為保留胺基酸側鏈性質的其他胺基酸。例如，胺基酸側鏈的性質可例如疏水性胺基酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性胺基酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、具有脂肪族側鏈的胺基酸（G、A、V、L、I、P）、具有含羥基的側鏈的胺基酸（S、T、Y）、具有含硫原子的側鏈的胺基酸（C、M）、具有含羧酸和醯胺的側鏈的胺基酸（D、N、E、Q）、具有含鹼性的側鏈的胺基酸（R、K、H）、及具有含芳香族的側鏈的胺基酸（H、F、Y、W）（括號內的任一胺基酸以單字母標記）。這些各群內的胺基酸的取代稱為保留性取代。已知具有對某胺基酸序列的1個或複數個胺基酸殘基的缺失、加成及/或經其他胺基酸取代而修飾的胺基酸序列的多胜肽，可維持其生物學活性（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1984）81：5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.（1982）10：6487-500； Wang, A. et al., Science（1984）224：1431-3； Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA （1982）79：6409-13）。包含如此胺基酸變異的本發明之可變區，具有和變異前的可變區的CDR序列、FR序列或可變區全部的胺基酸序列的至少70%、較佳至少75%、更佳至少80%、更佳至少85%、再更佳至少90%、最佳至少95%的胺基酸序列相似性。本說明書中，序列的相似性定義為，視需要排列序列以使序列相似性成為最大，導入適當的間隔（gap）後，和原始的H鏈可變區或L鏈可變區的胺基酸序列的殘基相同的殘基比例。胺基酸序列的相似性可經後述方法確定。
又，「功能上相同的抗體可變區」也可從例如由編碼上述表1～3所記載的可變區的胺基酸序列的鹼基序列所形成的核酸在嚴格條件下雜交的核酸而獲得。用於分離由編碼可變區的胺基酸序列的鹼基序列所形成的核酸在嚴格條件下雜交的核酸，嚴格的雜交條件可例如6M尿素、0.4% SDS、0.5 × SSC、37℃的條件或和此相等的嚴格雜交條件。更嚴格的條件例如使用6M尿素、0.4% SDS、0.1 × SSC、42℃的條件，可期待相似性更高的核酸的分離。雜交後的洗淨條件例如0.5×SSC（1×SSC為0.15M NaCL、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0）、及在0.1% SDS、60℃洗淨，較佳為0.2×SSC、及在0.1% SDS、60℃洗淨，較佳為0.2×SSC、及在0.1% SDS、62℃洗淨，較佳為0.2×SSC、及在0.1% SDS、65℃洗淨，較佳為0.1×SSC、及在0.1% SDS、65℃洗淨。分離的核酸序列的確定可經由後述的公知方法進行。分離的核酸的相似性具有全部鹼基序列的至少50%以上、較佳70%以上、更佳90%以上（例如95%、96%、97%、98%、99%以上）的序列相似性。
除了利用上述雜交技術的方法，也可利用使用基於編碼可變區的胺基酸序列的鹼基序列資訊合成的引子的基因擴增法，例如聚合酶連鎖反應（PCR）法，分離和由編碼可變區的胺基酸序列的鹼基序列所形成的核酸在嚴格條件下雜交的核酸。
鹼基序列及胺基酸序列的相似性可根據Karlin and Altschul的演算法BLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1993）90：5873-7）而確定。基於此演算法，開發稱為BLASTN或BLASTX的程式（Altschul et al., J. Mol. Biol.（1990）215：403-10）。在基於BLAST、經BLASTN分析鹼基序列的情形時，參數設為例如score = 100、wordlength = 12。又在基於BLAST、經BLASTX分析胺基酸序列的情形時，參數設為例如score = 50、wordlength = 3。在使用BLAST和Gapped BLAST程式的情形時，使用各程式的預設參數。如此的分析方法的具體方法為公知（參照NCBI （National Center for Biotechnology Information）的 BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）的網站；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。
本發明之雙特異性抗體所含的Fc區，只要是對Fcγ受體的結合活性降低的Fc區，沒有特別限制，但本發明之較佳Fc區可例如WO2016/047722A1記載的 E22Hh的Fc區部分和E22Hk的Fc區部分的組合、E2702GsKsc的Fc區部分和E2704sEpsc的Fc區部分的組合、E2702sKsc的Fc區部分和E2704sEpsc的Fc區部分的組合。
本發明可視需要將本發明之醫藥組合物封入微膠囊（羥甲基纖維素、明膠、聚［甲基丙烯酸甲酯］等的微膠囊），作為膠體藥物遞送系統（微脂體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊等） （Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition, Oslo Ed. （1980）等）。再者，將藥劑作為緩釋型藥劑的方法也為公知，該方法可適用於本發明之雙特異性抗原結合分子（J. Biomed. Mater. Res. （1981） 15, 267-277、Chemtech. （1982） 12, 98-105、美國專利第3773719號、歐洲專利公開案EP58481號・EP133988號、Biopolymers （1983） 22, 547-556）。
本發明之醫藥組合物、或細胞毒性誘導劑及細胞增殖抑制劑，可經口、非經口投予任一種而投予患者。較佳為非經口投予。該投予方法具體為例如注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。例如經注射投予，本發明之醫藥組合物、或細胞毒性誘導劑及細胞增殖抑制劑可全身性或局部性投予。又，根據患者年齡、症狀可選擇適宜的投予方法。投予量可選擇例如每一次投予每1kg體重0.0001mg至1000mg的範圍的投予量。或者，例如可以每一患者0.001 mg/body至100000 mg/body的範圍的投予量。然而，本發明之醫藥組合物、或細胞毒性誘導劑及細胞增殖抑制劑不限於此等的投予量。
本發明之醫藥組合物、或細胞毒性誘導劑及細胞增殖抑制劑可根據常法製劑化（例如Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A），也可共同含有藥學上容許的載劑或添加物。例如界面活性劑、賦形劑、著色料、香料、防腐劑、安定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、流動促進劑、矯味劑等。再者，不限於此等，可適宜使用其他常用的載劑。具體可例如輕質無水矽酸、乳糖、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯縮醛二胺乙酸乙酯（polyvinyl acetal diethyl aminoacetate）、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、中鏈脂肪酸三酸甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米粉、無機鹽類等作為載劑。
嵌合受體 也可使用具有和連接子切斷後的抗原結合分子結合的細胞外域的嵌合受體作為次級分子。一例為，使用經上述步驟所獲得的和連接子切斷後的抗原結合分子結合的抗體，製作嵌合受體。
用語「嵌合受體」是指至少包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，在免疫效應細胞表現時，對目標細胞例如癌細胞造成特異性及細胞內訊息產生的重組多胜肽。用語「嵌合抗原受體」或「CAR」表示細胞外結合域和抗原結合的嵌合受體。
用語「細胞外結合域」表示可和指定抗原等的分子特異性結合的任意蛋白質性的分子或其一部分，例如包含使腫瘤抗原等特異性單株抗體可變區的輕鏈（VL）和重鏈（VH）直列結合的單鏈抗體（scFv）。細胞外域也可稱為細胞外辨識域。
用語「穿膜域」包含位於該細胞外結合域和該細胞內訊息傳導域之間、具有貫穿細胞膜的功能的多胜肽。
用語「細胞內訊息傳導域」表示已知傳導在細胞內引起生物學過程的活化或抑制，例如T細胞或NK細胞等的免疫細胞的活化之訊息的動作之任意的寡胜肽域或多胜肽域，也包含如後述之來自至少1個T細胞的刺激分子的「刺激分子訊息傳導域」，也更包含如後述之來自至少1個T細胞的共刺激分子的「共刺激分子訊息傳導域」。
在本揭示使用時，「域（結構域，domain）」表示和其他區域獨立摺疊成特定結構、及/或具有特定功能的多胜肽的一區域。域可為例如分子的細胞質部分或其一部分。在本揭示使用時，分子的「細胞質域」表示全長的細胞質域、或在活化時傳遞細胞內訊息的其一部分。
在一實施態樣中，嵌合受體為包含下列定義的結構域之分子。
在一實施態樣中，嵌合受體包含細胞外結合域、細胞外樞紐域、穿膜域、和含有來自刺激分子的刺激分子訊息傳導域的細胞內訊息傳導域之嵌合融合蛋白。
在一實施態樣中，嵌合受體包含細胞外結合域、細胞外樞紐域、穿膜域、和含有來自共刺激分子的共刺激分子訊息傳導域及來自刺激分子的功能性訊息傳導域之細胞內訊息傳導域之嵌合融合蛋白。
在一實施態樣中，嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域、和含有1個或複數個來自共刺激分子的2個功能性訊息傳導域及來自刺激分子的功能性訊息傳導域之細胞內訊息傳導域之嵌合融合蛋白。
在一實施態樣中，嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域、和含有1個或複數個來自共刺激分子的至少2個共刺激分子訊息傳導域、來自刺激分子的刺激分子訊息傳導域、及其他功能性域及/或含有模體（motif）的細胞內訊息傳導域之嵌合融合蛋白。
在一實施態樣中，本說明書記載的嵌合受體可做為嵌合抗原受體（CAR）使用。
在一實施態樣中，揭示包含i）可和指定抗原結合的細胞外域、ii）穿膜域、及iii）包含含有選自細胞質共刺激域及/或介白素受體鏈的細胞質域的1個以上的細胞內訊息傳導域和外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段（此處，上述細胞內區段包含內因性或外因性JAK結合模體及STAT5相關模體而成）而成的嵌合受體。在某實施態樣中，這些結構域視情況從N端開始，以上述順序直接或間接融合。在某實施態樣中，細胞內區段的這些結構域以相反順序融合。
在一實施態樣中，在該細胞外結合域和該細胞內訊息傳導域之間也可包含細胞外樞紐域及穿膜域。用語「細胞外樞紐域」表示連結細胞外結合域及穿膜域的域。細胞外樞紐域只要是可連結細胞外結合域及穿膜域者，沒有特別限制。也可以是來自天然蛋白質者，也可以是人為設計者。細胞外樞紐域可以例如約10～300個的胺基酸、較佳約20～100個的胺基酸構成。細胞外樞紐域較佳不妨礙細胞外結合域和本揭示Fc區變異抗體的Fc區的結合能力，且不妨礙透過細胞內訊息傳導域的訊息傳導者。用語「穿膜域」位於該細胞外結合域和該細胞內訊息傳導域之間，為具有貫穿細胞膜的功能的多胜肽，沒有特別限定。穿膜域也可以是來自天然蛋白質者，也可以是人為設計者。來自天然蛋白質的穿膜域可從任意的膜結合蛋白或穿膜蛋白來取得。
在一實施態樣中，嵌合受體包含附加在嵌合受體融合蛋白的胺基末端（N端）的前導序列（leader sequence）。
在一實施態樣中，嵌合受體更包含在細胞外結合域的N端的前導序列，此處，該前導序列也可以在細胞處理及嵌合受體對細胞膜的局部化之間，從該抗原辨識區域（例如scFv）被切斷。
用語「scFv」表示包含含有輕鏈的可變區的至少1個抗體片段和含有重鏈的可變區的至少1個抗體片段之融合蛋白。在一實施態樣中，scFv可透過例如合成連接子、如短的可撓的多胜肽連接子，連續性連結輕鏈可變區及重鏈可變區，作為單鏈的多胜肽而表現，再者，scFv表示維持其原有的抗體特異性的融合蛋白。如果沒有特別規定，本揭示中，scFv也可以任何順序具有輕鏈可變區（VL）及重鏈可變區（VH），例如關於多胜肽的N端及C端的末端，scFv可含有VL-連接子-VH，或者也可含有VH-連接子-VL。用於調製scFv的各種方法為已知，包含美國專利第4694778号、Science, vol. 242, pp. 423-442 （1988）、Nature, vol. 334, p. 54454 （1989）、及Science, vol. 242, pp. 1038-1041 （1988）所記載的方法。
用語「可撓的多胜肽連接子」或「連接子」，在關於scFv使用的情形，是指為了一起連結可變重鏈區及可變輕鏈區，由單獨或組合使用的甘胺酸及/或絲胺酸殘基等的胺基酸所形成的胜肽連接子。在一實施態樣中，可撓的多胜肽連接子為Gly/Ser連接子，包含胺基酸序列（Gly-Gly-Gly-Ser）n ，式中n為1以上的整數。例如n=1、n=2、n=3、n=4、n=5、n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一實施態樣中，可撓的多胜肽連接子例如（Gly4 Ser）5 、（Gly4 Ser）4 或（Gly4 Ser）3 ，但不限於此等。在另一實施態樣中，連接子包含（Gly2 Ser）、（GlySer）或（Gly3 Ser）的複數個重複。因參照而併入本說明書的WO2012/138475所說明的連接子，也包含於本揭示之範圍內。
在一實施態樣中，細胞外樞紐域例如CD8α、CD8β、CD28、CD4、NKp30、NKp44、NKp46的細胞外樞紐域等。或者也可使用免疫球蛋白（例如IgG4等）的樞紐區。
在一實施態樣中，穿膜域來源的蛋白可例如T細胞受體的α鏈及β鏈、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、NKp30、NKp44、NKp46等。在一實施態樣中，穿膜域來源的蛋白可例如CD28或CD3ε。
用語「訊息傳導域」是指為了藉由生成第二訊息、或對如此訊息反應而作為效應子而功能化，透過規定的訊息傳導路徑調節細胞活性，經由傳遞細胞內資訊而作用的蛋白質的功能部分。
「細胞內訊息傳導域」，在本揭示中使用的情形，是指分子的細胞內部分。細胞內訊息傳導域可為生成促進含有CAR等的嵌合受體的細胞，例如CART細胞的免疫效應功能的訊息。例如，CART細胞中，免疫效應功能之例，如細胞溶解活性及輔助活性，例如細胞激素的分泌等。在實施態樣中，細胞內訊息傳導域為傳遞效應功能訊息，在細胞實施特殊化功能的蛋白質的部分。雖也有採用細胞內訊息傳導域全體的情形，但在多數情形，不一定要使用鏈全部。只要是使用細胞內訊息傳導域的被截斷部分，如此的被截斷部分若其傳遞效應功能，則可用於代替無損的鏈。因此，所謂細胞內訊息傳導域表示包含對傳遞效應功能訊息充分的細胞內訊息傳導域的所有被截斷部分。
在某實施態樣中，細胞內訊息傳導域也包含初級細胞內訊息傳導域。典型的初級細胞內訊息傳導域，例如來自初級刺激或抗原依賴性刺激（antigen dependent simulation）相關的分子者。在某實施態樣中，細胞內訊息傳導域也可包含共刺激細胞內域。典型的共刺激細胞內訊息傳導域，例如來自共刺激訊息、或抗原非依賴性刺激相關的分子者。例如在CART的情形，初級細胞內訊息傳導域也可包含T細胞受體的細胞質內序列，共刺激細胞內訊息傳導域也可包含來自輔助受體或共刺激分子的細胞質內序列。
用語「CD3ζ」，在本揭示使用時，表示所有的哺乳動物種類、較佳為人類的分化抗原群3（CD3）T細胞共受體。在哺乳動物，CD3包含CD3ζ鏈、CD3δ鏈及2個CD3ε鏈。CD3ζ鏈（例如NCBI RefSeq：NP_932170.1）包含為了操作嵌合受體可使用的細胞內訊息傳導域。在本揭示之特定的嵌合受體中，CD3ζ的初級訊息傳導序列為Genbank NM000734.3的細胞質區序列（核苷酸序列299～634）全長或一部分，或來自非人類種，例如小鼠、齧齒類、猴、類人猿及同種者的等價的殘基。
在一實施態樣中，細胞內訊息傳導域也可包含介白素受體鏈的細胞質域。在一實施態樣中，細胞內訊息傳導域也可使用CD28、4-1BB、ICOS、或聯繫複數個訊息傳導域的CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28-OX40。在一實施態樣中，穿膜域來源的蛋白質為CD28或CD3ε，且細胞內訊息傳導域也可為CD28、4-1BB、ICOS、或聯繫複數個訊息傳導域的CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28- OX40。
在一實施態樣中，揭示i）可和特定抗原結合的細胞外域、ii）穿膜域、及iii）包含含有選自細胞質共刺激域及/或介白素受體鏈的細胞質域的1個以上的細胞內訊息傳導域和外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段（此處，上述細胞內區段包含內因性或外因性JAK結合模體及STAT5相關模體而成）而成的嵌合受體。在某實施態樣中，這些區域視情況從N端開始，以上述順序直接或間接融合。在某實施態樣中，細胞內區段的這些區域以相反順序融合。
用語「CD3ζ」，在本揭示中使用的情形，表示所有的哺乳動物種類、較佳為人類的分化抗原群3（CD3）T細胞共受體。在哺乳動物，CD3包含CD3ζ鏈、CD3δ鏈及2個CD3ε鏈。CD3ζ鏈（例如NCBI RefSeq：NP_932170.1）包含為了操作本揭示之嵌合受體可使用的細胞內訊息傳導域。
用語「刺激」是指經由刺激分子（例如TCR/CD3複合體或CAR）和其相同起源的配體（或在CAR的情形為腫瘤抗原）的結合而被誘導的初級反應，經此，雖不限於此等，但透過TCR/CD3複合體訊息傳導、或透過CAR的適當的NK受體或訊息傳導域的訊息傳導等，媒介訊息傳導事項。刺激也媒介特定分子被變更的表現。
用語「刺激分子」是指關於免疫細胞訊息傳導路徑的至少一部分的態樣，經由具有以刺激的形態調節免疫細胞的活化的細胞質內訊息傳導序列之免疫細胞，例如T細胞、NK細胞或B細胞而被表現的分子。在一態樣中，訊息為例如、經由和呈現TCR/CD3複合體和胜肽的MHC分子的結合而啟動的初級訊息，經此，雖不限於此等，但發生增殖、活化、分化、及同種事等的T細胞反應的媒介。以刺激的形態作用的初級細胞質內訊息傳導序列（也稱為「初級訊息傳導域」）也可含有訊息傳導模體，此已知為免疫受體酪胺酸鹼基的活化模體或ITAM。 本揭示中，含有具特定用途的細胞質內訊息傳導序列的ITAM之例，不限於此等，例如來自CD3ζ、共通的FcRγ （FCER1G）、FcγRIIa、FcRβ（FcεR1b）、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278（「ICOS」）、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12、CLEC2、CLEC7A（Dectin1）、CLEC9A、EZRIN、RADIXIN及MOESIN者。在本揭示之特定的嵌合受體中，本揭示的任1個或複數個嵌合受體中的細胞內訊息傳導域包含細胞內訊息傳導序列，例如CD3ζ的初級訊息傳導序列。
用語「共刺激分子」是指經由和共刺激配體特異性結合，雖不限於此但媒介經由增殖等的T細胞的共刺激反應（次級訊息），在T細胞上的相同起源的結合夥伴。共刺激分子是成為效率的免疫反應的原因之一的、抗原受體以外的細胞表面分子或該等的配體。用語「共刺激細胞內訊息傳導域」是指共刺激分子的細胞內部分。細胞內訊息傳導域也可包含細胞內的部分全體、或其所得的分子的天然型細胞內訊息傳導域的全體、或該等功能性片段或衍生物。共刺激分子，不限於此，例如和MHC第I型分子、TNF受體蛋白、類免疫球蛋白蛋白質、細胞激素受體、整合素、訊息傳導淋巴球活化分子 （SLAM蛋白）、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、OX40（CD134）、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、4-1BB（CD137）、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS（CD278）、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM（LIGHTR）、KIRDS2、SLAMF7、NKp80（KLRF1）、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD5、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1（CD226）、SLAMF4（CD244、2B4）、CD84、CD96（Tactile）、CEACAM1、CRTAM、Ly9（CD229）、CD160（BY55）、PSGL1、CD100（SEMA4D）、CD69、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAM（SLAMF1、CD150、IPO-3）、BLAME（SLAMF8）、SELPLG（CD162）、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD154及CD83特異性結合的配體。
在一實施態樣中，共刺激分子例如選自4-1BB（即CD137）、CD27、CD28及/或OX40，增強T細胞受體的刺激。
用語「4-1BB」是指具有GenBank寄存編號AAA62478.2所提供的序列胺基酸序列的TNFR超家族的一員，或來自非人類種例如小鼠、嚙齒類、猴、類人猿及同種者的等價殘基，「4-1BB共刺激域」定義為GenBank寄存編號AAA62478.2的胺基酸殘基214～255，或來自非人類種例如小鼠、嚙齒類、猴、類人猿及同種者的等價殘基。在一態樣中，「4-1BB共刺激域」為GenBank寄存編號NM001561.5的核苷酸序列886～1026序列的全長、或一部分，或來自非人類種例如小鼠、嚙齒類、猴、類人猿及同種者的等價殘基。
用語「抗原」或「Ag」是指引發免疫反應的分子。此免疫反應可包含抗體的產生或特異性免疫活性細胞的活化之任一者或其兩者。實質上，有所有包含蛋白質或胜肽的高分子作為抗原是有用的可能性。再者，抗原也可來自重組的或基因體DNA。包含編碼引發免疫反應的蛋白質的核苷酸序列或部分的核苷酸序列之所有DNA，結果在本揭示中稱為抗原使用的情形時，編碼相同的「抗原」。再者，抗原不一定只經由基因的全長核苷酸序列編碼。本揭示，雖不限於此等，但可容易被理解包含較1個多的基因的部分核苷酸序列的使用，進而以編碼引發所欲的免疫反應的多胜肽的方式、使這些核苷酸序列以各種組合配置。再者，抗原也可不一定經由「基因」編碼。抗原可為生成或可為合成，或來自活體樣本，或為多胜肽以外的高分子。如此的活體樣本，不限於此，例如組織樣本、腫瘤樣本、細胞或包含其他生物學成分的流體。本揭示之嵌合受體在具有將來自抗體的胺基酸序列作為細胞外結合域的一部分的情形時，細胞外結合域所結合的分子也可稱為抗原。
本發明中使用的以抗體依賴性細胞傷害作用（Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC）被增強者為特徵的IgG抗體，可參照例如WO 2013/002362 A1、WO 2014/104165 A1、WO 2005/014651 A1、WO 2006/046751 A1等調製。
在一態樣中，上述IgG抗體為含有Fc區，Fc區由含有第一多胜肽及第二多胜肽的異源二聚體所構成為特徵的抗體，相較於該Fc區只由含有第一多胜肽的同源二聚體所構成為特徵的抗體及該Fc區只由含有第二多胜肽的同源二聚體所構成為特徵的抗體，其為對Fcγ受體的結合活性增強為特徵的抗體。上述IgG抗體也可在上述Fc區中導入至少1個以上的胺基酸變異。
在其他態樣中，上述IgG抗體在上述Fc區的CH2區中，在選自EU編號第231位的Ala、EU編號第232位的Pro、EU編號第233位的Glu、EU編號第234位的Leu、EU編號第235位的Leu、EU編號第236位的Gly、EU編號第237位的Gly、EU編號第238位的Pro、EU編號第239位的Ser、EU編號第240位的Val、EU編號第265位的Asp、EU編號第266位的Val、EU編號第267位的Ser、EU編號第268位的His、EU編號第269位的Glu、EU編號第270位的Asp、EU編號第271位的Pro、EU編號第295位的Gln、EU編號第296位的Tyr、EU編號第298位的Ser、EU編號第300位的Tyr、EU編號第324位的Ser、EU編號第325位的Asn、EU編號第326位的Lys、EU編號第327位的Ala、EU編號第328位的Leu、EU編號第329位的Pro、EU編號第330位的Ala、EU編號第331位的Pro、EU編號第332位的Ile、EU編號第333位的Glu、EU編號第334位的Lys、EU編號第335位的Thr、EU編號第336位的Ile、及EU編號第337位的Ser的胺基酸部位中，導入至少1個以上的胺基酸變異為特徵。
此處，上述Fcγ受體沒有特別限定，為例如選自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、及FcγRIIIa所形成的群組的受體。較佳為，上述Fcγ受體為FcγRIIIa。
在其他態樣中，上述IgG抗體在構成上述Fc區的第一多胜肽及/或第二多胜肽的胺基酸序列中，導入選自EU編號第234位的胺基酸L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸L取代為Y或Q、EU編號第236位的胺基酸G取代為W、EU編號第239位的胺基酸由S取代為M、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第270位的胺基酸由D取代為E、EU編號第298位的胺基酸S取代為A、EU編號第326位的胺基酸由K取代為D、EU編號第327位的胺基酸由A取代為D、EU編號第328位的胺基酸由L取代為W、EU編號第330位的胺基酸由A取代為M或K及EU編號第334位的胺基酸由K取代為E或L的至少1個以上的胺基酸變異為特徵。
在其他態樣中，上述IgG抗體在構成上述Fc區的第一多胜肽及/或第二多胜肽的胺基酸序列中，在選自EU編號第234位的Leu、第235位的Leu、第236位的Gly、第239位的Ser、第268位的His、第270位的Asp、第298位的Ser、EU編號第326位的Lys、第327位的Ala、第328位的Leu、第330位的Ala及第334位的Lys的至少1個胺基酸導入變異為特徵。
在其他態樣中，上述IgG抗體在構成上述Fc區的第一多胜肽或第二多胜肽的任一方的多胜肽的胺基酸序列中，在選自EU編號第234位的Leu、第235位的Leu、第236位的Gly、第239位的Ser、第268位的His、第270位的Asp、第298位的Ser、第327位的Ala、第328位的Leu及第334位的Lys的至少1個胺基酸導入變異，在另一方的多胜肽的胺基酸序列中，在選自EU編號第270位的Asp、EU編號第326位的Lys、第330位的Ala及第334位的Lys的至少1個胺基酸導入變異為特徵。
在其他態樣中，上述IgG抗體在構成上述Fc區的第一多胜肽或第二多胜肽的任一方的多胜肽的胺基酸序列中，導入選自EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y或Q、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第239位的胺基酸由S取代為M、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第270位的胺基酸由D取代為E、EU編號第298位的胺基酸由S取代為A及EU編號第327位的胺基酸由A取代為D、EU編號第328位的胺基酸由L取代為W及EU編號第334位的胺基酸由K取代為L的至少1個胺基酸變異，在另一方的多胜肽的胺基酸序列中，導入選自EU編號第270位的胺基酸由D取代為E、EU編號第326位的胺基酸由K取代為D、EU編號第330位的胺基酸由A取代為M或K、EU編號第334位的胺基酸由K取代為E的至少1個胺基酸變異為特徴。
在其他態樣中，上述IgG抗體在構成上述Fc區的第一多胜肽或第二多胜肽的任一方的多胜肽的胺基酸序列中，導入（i）至（vi）的任一個變異，在另一方的多胜肽的胺基酸序列中，導入（vii）至（ix）的任一個變異： （i） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D及EU編號第298位的胺基酸由S取代為A； （ii） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第270位的胺基酸由D取代為E及EU編號第298位的胺基酸由S取代為A； （iii） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Q、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第239位的胺基酸由S取代為M、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第270位的胺基酸由D取代為E及EU編號第298位的胺基酸由S取代為A； （iv） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第298位的胺基酸由S取代為A及EU編號第327位的胺基酸由A取代為D； （v） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第239位的胺基酸由S取代為M、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第298位的胺基酸由S取代為A及EU編號第327位的胺基酸由A取代為D； （vi） EU編號第234位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第235位的胺基酸由L取代為Y、EU編號第236位的胺基酸由G取代為W、EU編號第239位的胺基酸由S取代為M、EU編號第268位的胺基酸由H取代為D、EU編號第298位的胺基酸由S取代為A、EU編號第327位的胺基酸由A取代為D、EU編號328位的胺基酸由L取代為W及EU編號第334位的胺基酸由K取代為L； （vii） EU編號第326位的胺基酸由K取代為D、EU編號第330位的胺基酸由A取代為M及EU編號第334位的胺基酸由K取代為E； （viii） EU編號第270位的胺基酸由D取代為E、EU編號第326位的胺基酸由K取代為D、EU編號第330位的胺基酸由A取代為M及EU編號第334位的胺基酸由K取代為E； （ix） EU編號第270位的胺基酸由D取代為E、EU編號第326位的胺基酸由K取代為D、EU編號第330位的胺基酸由A取代為K及EU編號第334位的胺基酸由K取代為E。
本發明一實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為由含有第一多胜肽及第二多胜肽的異源二聚體所構成為特徵的多胜肽，以該第一多胜肽及第二多胜肽的任一方含有導入（i）或（ii）記載的變異的Fc區，和含有沒有導入變異的Fc區的多胜肽相比，Fc區的功能改變為特徵的多胜肽： （i）EU編號第234位的胺基酸為L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的胺基酸為Y或Q，第236位的胺基酸為W，第239位的胺基酸為M或I，第268位的胺基酸為D，及第298位的胺基酸為A； （ii）EU編號第270位的胺基酸為E，第326位的胺基酸為D，第330位的胺基酸為A、K、M、F、I、Y或H，及第334位的胺基酸為E。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為含有上述的第一多胜肽及第二多胜肽任一方導入（i）或（ii）記載的變異的Fc區，另一方導入（iii）記載的變異為特徵的多胜肽： （i） EU編號第234位的胺基酸為L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的胺基酸為Y或Q，第236位的胺基酸為W，第239位的胺基酸為M或I，第268位的胺基酸為D，第298位的胺基酸為A，及第327位為D； （ii） EU編號第234位的胺基酸為L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的胺基酸為Y或Q，第236位的胺基酸為W，第239位的胺基酸為M或I，第268位的胺基酸為D，第270位的胺基酸為E，及第298位的胺基酸為A； （iii） EU編號第270位的胺基酸為E，第326位的胺基酸為D，第330位的胺基酸為A、K、M、F、I、Y或H，及第334位的胺基酸為E。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為（i）的EU編號第234位的胺基酸為E、D、T或L的多胜肽。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為［4］上述［2］（ii）的EU編號第234位的胺基酸為L、F、E或D的［2］記載的多胜肽。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為［5］上述［2］（i）的EU編號第234位的胺基酸為V、I、T、M或L的［2］記載的多胜肽。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為［6］上述［2］（i）的EU編號第234位的胺基酸為V、E、D、T、I、L或F，及第239位的胺基酸為M或I， （iii） 的EU編號第330位的胺基酸為A或K的［2］記載的多胜肽。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為［7］上述［2］（ii）的EU編號第234位的胺基酸為F、E、D、S或L，及第239位的胺基酸為M或I， （iii） 的EU編號第330位的胺基酸為A、F或K的［2］記載的多胜肽。
本發明的其他實施態樣中，以ADCC活性被增強為特徵的IgG抗體為，經由上述Fc區的功能的改變，具有多胜肽對Fcγ受體的被增強的結合活性的增強的多胜肽。此處，該Fcγ受體選自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb 、FcγRIIIaF及FcγRIIIaV所組成的群組。
在一實施態樣，本發明中的標靶抗原較佳例如受體、腫瘤抗原、MHC抗原、分化抗原等。
受體之例，如屬於造血因子受體家族、細胞激素受體家族、酪胺酸激酶型受體家族、絲胺酸/蘇胺酸激酶型受體家族、TNF受體家族、G蛋白共軛型受體家族、GPI錨型受體家族、酪胺酸磷酸酶型受體家族、接著因子家族、賀爾蒙受體家族等的受體家族的受體等。關於屬於這些受體家族的受體及其特徵已記載於多篇文獻如Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B Hormones and their Actions Part IIpp.1-46 （1988） Elsevier Science Publishers BV.；或宮坂昌之監修, 細胞工學別冊HANDBOOK SERIES「接著因子HANDBOOK」（1994） （秀潤社, 東京, 日本）等的評論（Review）以外；Patthy（Cell （1990） 61 （1）, 13-14）；Ullrich等人（Cell （1990） 61 （2）, 203-212）；Massague（e有重音標記）（Cell （1992） 69 （6）, 1067-1070）；Miyajima等人（Annu. Rev. Immunol. （1992） 10, 295-331）；Taga等人（FASEB J. （1992） 6, 3387-3396）；Fantl等人（Annu. Rev. Biochem. （1993）, 62, 453-481）；Smith等人（Cell （1994） 76 （6） 959-962）；Flower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower（Biochim. Biophys. Acta （1999） 1422 （3） 207-234等。
屬於上述受體家族的具體受體較佳例如，人類或小鼠紅血球生成素（EPO）受體（Blood （1990） 76 （1）, 31-35、Cell （1989） 57 （2）, 277-285）、人類或小鼠顆粒性白血球群落刺激因子（G-CSF）受體（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. （1990） 87 （22）, 8702-8706、mG-CSFR、Cell （1990） 61 （2）, 341-350）、人類或小鼠促血小板生成素（TPO）受體（Proc Natl Acad Sci U S A. （1992） 89 （12）, 5640-5644、EMBO J. （1993） 12（7）, 2645-53）、人類或小鼠胰島素受體（Nature （1985） 313 （6005）, 756-761）、人類或小鼠Flt-3配體受體（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. （1994） 91 （2）, 459-463）、人類或小鼠血小板衍生生長因子（PDGF）受體（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. （1988） 85 （10） 3435-3439）、人類或小鼠干擾素 （IFN）-α、β受體（Cell （1990） 60 （2）, 225-234.及Cell （1994） 77 （3）, 391-400）、人類或小鼠瘦素 （leptin）受體、人類或小鼠生長激素（GH）受體、人類或小鼠介白素 （IL）-10受體、人類或小鼠類胰島素生長因子（IGF）-I受體、人類或小鼠白血病抑制因子（LIF）受體、人類或小鼠睫狀節神經營養因子（CNTF）受體等。
用語「腫瘤抗原」是指在癌細胞被表現的抗原，該表現和細胞的惡性變化相關而被辨識的具有抗原性的活體分子。在本揭示一態樣中，標靶抗原為腫瘤抗原。腫瘤抗原包含腫瘤特異性抗原（只存在腫瘤細胞，在其他正常細胞未被發現的抗原）、及腫瘤相關抗原（在其他器官及組織或異種及同種異體的正常細胞也存在的抗原，或在發生及/或分化時表現的抗原）。又，細胞在癌化時出現在細胞表面或蛋白分子上的異常醣鏈也是腫瘤抗原，也稱為癌醣鏈抗原。
腫瘤抗原之例，例如上述受體為，屬於GPI錨型受體家族、在肝癌為首的幾個癌中表現的GPC3（Int J Cancer. （2003） 103 （4）, 455-65）、在肺癌為首的複數個癌表現的EpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. （1989） 86 （1）, 27-31）（其多核苷酸序列記載於RefSeq登錄編號NM_002354.2、多胜肽序列記載於RefSeq登錄編號NP_002345.2）、EGFR、CA19-9、CA15-3、唾液酸（sialyl）SSEA-1（SLX）、Her2、前列腺幹細胞抗原（PSCA）、α胎兒蛋白 （AFP）、癌胚抗原（CEA）、腫瘤抗原-125（CA-125）、鈣結合蛋白（calretinin）、MUC-1、MUC-16、上皮性膜蛋白（EMA）、上皮腫瘤抗原（ETA）、酪胺酸酶、黑色素瘤相關抗原（MAGE）、染色顆粒素（Chromogranin）、細胞角質蛋白（cytokeratin）、肌間線蛋白（desmin）、神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、嚢胞性疾病液體蛋白質（gross cystic disease fluid protein）（GCDFP-15）、HMB-45抗原、蛋白melan -A（經T淋巴球辨識的黑色素瘤抗原；MART-1）、myo-D1、肌肉特異性肌動蛋白（MSA）、神經纖維絲（neurofilament）、神經特異性烯醇化酶（NSE）、胎盤鹼性磷酸酶、突觸素（Synaptophysin）、甲狀腺球蛋白（thyroglobulin）、甲狀腺轉錄因子-1、丙酮酸激酶異酵素型M2的二聚體形（腫瘤M2-PK）、GD2（神經節苷脂（gangliosides）G2）、EGFRvIII（表皮生長因子變異體III）、精子蛋白17（Sp17）、間皮素（mesothelin）、PAP（前列腺酸性磷酸酶）、Prostain、TARP（T細胞受體γ受體替代型閱讀框架蛋白）、Trp-p8、STEAP1（前列腺1的6次穿膜型上皮抗原）、TROP-2、Claudin6、RNF43a、異常ras蛋白、或異常p53蛋白、整合素αvβ3（CD61）、半乳糖凝集素（galectin）、K-Ras（V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene））、或Ral-B等。
又，也可列舉甲狀腺刺激激素受體 （TSHR）；CD171；CS-1（CD2 subset 1、CRACC、SLAMF7、CD319及19A24）；類C型凝集素分子-1（CLL-1）； 神經節苷脂GD3（aNeu5Ac（2-8）aNeu5Ac（2-3）bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer）；Tn抗原（Tn Ag）；T抗原（T Ag）；類Fms酪胺酸激酶3（FLT3）；CD38；CD44v6；B7H3（CD276）；KIT（CD117）；介白素-13受體次單元α-2（IL-13Ra2）； 介白素11受體α（IL-11Ra）； 介白素2受體α（IL-2Ra）；前列腺幹細胞抗原（PSCA）；蛋白酶絲胺酸21（PRSS21）；血管内皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）；Lewis（Y）抗原；CD24；血小板衍生生長因子受體β（PDGFR-β）； 階段特異性胚胎抗原-4（SSEA-4）；神經細胞接著分子（NCAM）； 碳酸酐酶IX（CAIX）； 蛋白酶體（prosome；macropain）次單元、β型、9（LMP2）； Ephrin A型受體2（EphA2）； 岩藻醣基GM1；唾液酸化（sialyl） Lewis接著分子（sLe）； 神經節苷脂GM3（aNeu5Ac（2-3）bDGalp（1-4）bDGlcp（1-1）Cer；TGS5；高分子量黑色素瘤相關抗原（HMWMAA）；o-乙醯基-GD2神經節苷脂（OAcGD2）；葉酸受體β；腫瘤內皮標記1（TEM1/CD248）； 腫瘤內皮標記7相關（TEM7R）；密連蛋白（Claudin） 6（CLDN6）；G蛋白共軛受體C族5群、成員D（GPRC5D）；染色體X開放閱讀框架61（CXORF61）；CD97；CD179a；未分化淋巴瘤激酶 （ALK）；聚唾液酸；胎盤特異性1（PLAC1）；globoH醣神經醯胺（GloboH）的六碳糖部分；乳腺分化抗原（NY-BR-1）； Uroplakin 2（UPK2）；A型肝炎病毒細胞性受體1（HAVCR1）； 腎上腺素受體β3（ADRB3）； 泛連接蛋白（Pannexin） 3（PANX3）；G蛋白共軛受體20（GPR20）；淋巴球抗原6複合體、座位K9（LY6K）；嗅覺受體51E2（OR51E2）；TCRγ選擇性閱讀框架蛋白（TARP）；威爾姆氏腫瘤蛋白質 （WT1）；位於染色體12p的ETS轉位變異體基因6（ETV6-AML）；精子蛋白質17（SPA17）；X抗原家族、成員1A（XAGE1）；血管生成素結合細胞表面受體2（Tie 2）；黑色素瘤睪丸抗原-1（MAD-CT-1）； 黑色素瘤睪丸抗原-2（MAD-CT-2）；Fos相關抗原1；p53變異體；人類端粒酶反轉錄酶 （hTERT）；肉瘤轉位切點；細胞凋亡的黑色素瘤抑制劑 （ML-IAP）；ERG（穿膜型蛋白酶、絲胺酸2（TMPRSS2）ETS融合基因）；N-乙醯基葡萄醣胺基轉移酶V（NA17）； Paired Box蛋白Pax-3（PAX3）；雄激素受體；週期素B1；v-myc禽類骨髓細胞瘤病毒致癌基因神經母細胞瘤衍生同質體（MYCN）；Ras同質體家族成員C（RhoC）；細胞色素P450 1B1（CYP1B1）；類CCCTC結合因子（鋅指蛋白）（BORIS）；經T細胞3辨識的扁平上皮細胞腫瘤抗原（SART3）； Paired Box蛋白Pax-5（PAX5）；前頂體素結合蛋白p32（OY-TES1）；淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶（LCK）；A激酶錨蛋白4（AKAP-4）；滑膜肉瘤、X切點2（SSX2）；CD79a；CD79b；CD72；類白血球相關免疫球蛋白受體1（LAIR1）；IgA受體的Fc片段（FCAR）；類白血球免疫球蛋白受體次家族A成員2（LILRA2）；類CD300分子家族成員f（CD300LF）；C型凝集素結構域家族12成員A（CLEC12A）；骨髓間質細胞抗原2（BST2）；含有類EGF組件的類黏液素類激素受體2（EMR2）；淋巴球抗原75（LY75）； 磷脂肌醇聚糖-3（GPC3）；類Fc受體5（FCRL5）；及類免疫球蛋白λ多胜肽1（IGLL1）等。
「MHC抗原」為主要組織相容性複合體（MHC）的基因產物，其中，在細胞膜表現的醣蛋白主要分類為MHC第I型抗原及MHC第II型抗原。MHC第I型抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC第II型抗原包含HLA-DR、-DQ、-DP。也包含這些MHC抗原呈現的來自腫瘤抗原的胜肽。對於GP100、MART-1、MAGE-1等的腫瘤抗原、或和呈現RAS或p53等的變異部分的MHC的複合體，也為腫瘤抗原之一。
「分化抗原」為巨噬細胞、T細胞、B細胞等的隨著從骨髓幹細胞的分化而消長的細胞表面分子的總稱。分化抗原可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD70、CD71、CD73、CD95、CD99、CD102、CD106、CD117、CD122、CD126、CDw130。
辨識連接子切斷後的抗原結合分子的域 本揭示之雙特異性抗體及嵌合受體具有辨識連接子切斷後的抗原結合分子的域。在一態樣中，和連接子切斷前的抗原結合分子相比，雙特異性抗體及嵌合受體和連接接子切斷後的抗原結合分子具有較高的結合活性。含有抗體可變區的域由一個或複數個抗體的可變域所提供，較佳為，含有抗體可變區的域包含抗體輕鏈可變區（VL）和抗體重鏈可變區（VH）。包含如此的抗體可變區的域之例，較佳如「scFv（single chain Fv）」、「單鏈抗體（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2 （single chain Fv2 ）」、「Fab」或「F（ab'）2 」等。
用語「特異性」是指，特異性結合的分子，對於其1個或複數個結合的對象方的分子以外的分子，不顯示相同的結合活性，或結合活性大幅降低的狀態。又，也可使用於含有抗體可變區的域對某抗原中所含的複數個抗原決定位之中的特定抗原決定位為特異性的情形。又，當含有抗體可變區的域結合的抗原決定位被包含於複數個不同抗原的情形時，具有含有該抗體可變區的域的抗原結合分子可和含有該抗原決定位的各種抗原結合。
用語「競爭」或「交叉競爭」是指抗體分子的能力，在本揭示同意義地使用。對結合的干涉可直接或間接（例如經由抗體分子或標靶的異位（allosteric）改變）。抗體分子可干涉其他抗體分子的標靶的結合的程度，及是否因此可說是競爭，可例如本揭示所說明的使用競爭結合分析來判別。在部分實施態樣中，競爭結合分析為定量的競爭分析。在部分實施態樣中，競爭結合分析（例如本揭示所說明之競爭分析法）中，第一抗體分子的對標靶的結合減少10%以上，例如20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上的情形，可謂第一抗體分子對標靶的結合和第二抗體分子競爭。
在本揭示使用時，用語「抗原決定位」是指和抗體分子特異性交互作用的抗原的成分。如此成分典型包含胺基酸側鏈或醣側鏈等的要件，或為如此的要件的一部分。抗原決定位可根據例如此技術領域之人士公知的或本揭示所揭示之方法，例如經由結晶學、或氫-重氫交換而定義。和抗原決定位特異性作用的抗體分子上的成分之至少1個或幾個典型位於CDR內。典型地，抗原決定位具有特異的三維結構的特徵。典型地，抗原決定位具有特異的電荷的特徵。也有為直線狀抗原決定位的抗原決定位，另一方面也有為立體結構抗原決定位的抗原決定位。
又可經由辨識該抗原決定位的抗體分子對抗原的結合活性，定義該抗原決定位。當抗原為胜肽或多胜肽的情形時，也可經由構成抗原決定位的胺基酸殘基而確定抗原決定位。又，當抗原決定位為醣鏈的情形時，可經由特定的醣鏈結構確定抗原決定位。
在本揭示之嵌合受體具有來自抗體的胺基酸序列為細胞外結合域的一部分的情形，細胞外結合域結合的分子的結合部位也可稱為抗原決定位。
直線狀抗原決定位為包含辨識胺基酸初級序列的抗原決定位的抗原決定位。直線狀抗原決定位在固有的序列中典型含有至少3個、及最普通至少5個，例如約8～約10個、6～20個的胺基酸。
立體結構抗原決定位為，相對於直線狀抗原決定位，含有抗原決定位的胺基酸的初級序列不是被辨識的抗原決定位的單一規定成分的抗原決定位（例如胺基酸的初級序列不一定被規定抗原決定位的抗體所辨識的抗原決定位）。立體結構抗原決定位，相對於直線狀抗原決定位，可包含增大數目的胺基酸。關於立體結構抗原決定位的辨識，抗體辨識胜肽或蛋白質的三級結構。例如，在蛋白分子經摺疊形成三級結構的情形時，形成立體結構抗原決定位的胺基酸及/或多胜肽主鏈形成並排，抗體可辨識抗原決定位。確定抗原決定位的立體結構之方法，包含例如X光結晶學、二維核磁共振光譜學及部位特異性自旋標籤及電磁順磁共振光譜學，但不限於此。例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology （1996），第66卷，Morris（編）。
用語「核酸」或「多核苷酸」是指去氧核醣核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）、及單股或雙股任一型態的該等聚合物。用語「核酸」包含基因、cDNA或mRNA。在一實施態樣，核酸分子為合成（例如化學合成的）核酸分子或重組核酸分子。不特別限定，此用語包含含有和參照品核酸具有類似的結合特性、以和天然存在的核苷酸類似的方式被代謝之天然核苷酸的類似體或衍生物的核酸。特別是，只要沒有其他限定，特定的核酸序列事實上也包含該等保留性被改變的變異體（例如簡併密碼子（degenerate codon）的取代）、對偶基因（allele）、直系同源基因（ortholog）、SNP、及互補序列、加上明確地被呈現的序列。具體而言，簡併密碼子（degenerate codon）的取代，有可能經由生成1個或複數個被選擇（或全部）的密碼子的第三位置以雜交的鹼基及/或脫氧肌苷（deoxyinosine）殘基取代的序列而達成［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19：5081 （1991）； Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260：2605-2608 （1985）； and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8：91-98 （1994）］。
用語「核酸序列」，在本揭示使用時，表示由天然的鹼基、醣、醣間（主鏈）鍵結所形成的核苷或核苷酸單體的序列。此用語也包含非天然的單體或包含其一部分而成的修飾或取代序列。本申請案之核酸序列可為去氧核醣核酸（DNA）或核醣核酸（RNA），包含含有腺嘌呤、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、及脲嘧啶的天然鹼基。這些序列也可含有修飾鹼基。如此的修飾鹼基之例包含氮雜（aza）及去氮雜（deaza）腺嘌呤、鳥糞嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、及脲嘧啶；以及黃嘌呤（xanthine）及次黃嘌呤（hypoxanthine）。
用語「分離的核酸」，在本揭示使用時，在經重組DNA技術生產的情形下表示實質上不包含細胞材料或培養基，或在化學合成的情形下表示實質上不包含化學前驅物或其他化學物質之核酸。分離的核酸也實質上不包含來自其核酸的、和核酸天然鄰接的序列（亦即，位在該核酸的5’端和3’端的序列）。用語「核酸」包含DNA及RNA，也為雙股或單股任一種，相當於順向股（sense）或反向股（antisense）。再者，用語「核酸」包含互補的核酸序列，例如cDNA。
用語「編碼」是指具有核苷酸（例如rRNA、tRNA及mRNA）之規定的序列或胺基酸的規定的序列任一者、在生物學過程中做為其他聚合物及高分子的合成用的鑄模有用的基因、cDNA、或mRNA等的多核苷酸中的核苷酸的特異性序列的固有特性、及因該等而產生的生物學特性。因此，在細胞或其他生物系統中，在經由對應基因的mRNA的轉錄及轉譯而產生蛋白質的情形，該基因、cDNA、或RNA編碼蛋白質。該核苷酸序列和mRNA序列相同，通常在序列表所示的編碼股、和做為基因或cDNA轉錄用的鑄模所使用的非編碼股，皆可稱為編碼該基因或cDNA的蛋白質或其他生成物。
除非有其他特別規定，「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包含互相為簡併型的核苷酸序列或編碼相同的胺基酸序列的核苷酸序列全部。又，所謂編碼蛋白質或RNA的核苷酸序列的句子，在一些情形下，編碼該蛋白質的核苷酸序列以可含有插入子（intron）的程度也可包含插入子。又，核酸分子可和嵌合受體的表現用的至少1個調節元件操作性連接。
用語「胜肽」、「多胜肽」、及「蛋白質」，同義被使用，表示經由胜肽鍵而以共價鍵連接的胺基酸殘基所構成的化合物。蛋白質或胜肽必須含有至少2個胺基酸，可構成蛋白質或胜肽的序列之胺基酸的最大數目沒有限制。多胜肽包含含有相互以胜肽鍵而合體的2個以上的胺基酸的所有胜肽或蛋白質。此用語，在本揭示使用時，是指此技術領域之人士一般也稱為例如胜肽、寡胜肽及寡聚物的短股，以及此技術領域之人士一般稱為多型態存在的蛋白質的較長股兩者。「多胜肽」例如尤其以生物學上活性的片段、實質上相同的多胜肽、寡胜肽、同源二聚體、異源二聚體、多胜肽的變異體、變異的多胜肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多胜肽例如天然胜肽、重組胜肽、或該等的組合。
本揭示中的多胜肽通常指具有約10個胺基酸以上的長度的胜肽及蛋白質。在從N端到C端以胜肽鍵連結的胺基酸的鏈為一連串的胜肽鏈的情形時，本揭示之多胜肽也可以是複數個一連串胜肽鏈由S-S鍵、疏水性交互作用、離子鍵等的交互作用所形成的複合體蛋白質。
用語「分離的多胜肽」也稱為「分離的蛋白質」，表示實質上不包含在經重組DNA技術生產的情形下的細胞材料或培養基，或在化學合成的情形下的化學前驅物或其他化學物質之多胜肽。
用語「胺基酸」包含天然胺酸及修飾胺基酸的總合。
「保留性胺基酸變異」，在本揭示使用時，為不損害該蛋白質所期望的特性、將某胺基酸殘基以其他胺基酸殘基取代者。
用語「保留性序列改變」指對含有該胺基酸序列的抗體或抗體片段的結合特徵不造成顯著的影響或不變更的胺基酸變異。如此的保留性改變，例如胺基酸的取代、加成及缺失。改變可經由定點突變（site-directed mutagenesis）及PCR媒介的突變等的此技術領域公知的標準技術，導入本揭示之抗體或抗體片段。保留性胺基酸取代是以具有類似側鏈的胺基酸殘基取代胺基酸殘基之置換。具有類似的側鏈的胺基酸殘基的家族，如此技術領域之人士所定義。此等家族包含具有鹼性側鏈的胺基酸（例如離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（如天門冬胺酸、麩胺酸）、非帶電性極性側鏈（如甘胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、非極性側鏈（如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、β分支側鏈（如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）及芳香族側鏈（如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。因此，本揭示之嵌合受體內的1個或複數個胺基酸殘基亦可以相同的側鏈家族的其他胺基酸殘基取代，被變更的嵌合受體可使用本揭示說明的功能分析進行測試。
用語「表現」指經啟動子驅動的特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
本揭示中的「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」彼此可交換使用，指導入外來核酸的細胞（包含如此細胞的子代）。宿主細胞包含「轉形體」及「轉形細胞」，此包含初代的轉形細胞及不論繼代數的來自該細胞的子代。子代和親代細胞在核酸的內容上，亦可不用完全相同，也可含有變異。具有和原始的轉形細胞用於篩選或選擇時相同的功能或生物學活性的變異體子代，也包含於本揭示。
本揭示中的「載體」指可使和其連接的再一個核酸增加的核酸分子。此用語包含自我複製核酸結構的載體、及進入導入其的宿主細胞的基因組中的載體。某載體能夠表現本身操作性連結的核酸。如此的載體在本揭示也稱為「表現載體」。
轉染（transfection）表示經由實際上不知道是否表現任意編碼的序列的宿主細胞的表現載體的進入。轉染的多個方法為具有通常技能的技術者所知，有例如CaPO4 沉降法及電穿孔法。一般成功的轉染在宿主細胞內該載體作用的徵兆顯現時被認出。
用語「啟動子」指在開始多核苷酸序列的特異性轉錄上經由必要的細胞的合成機制所辨識的DNA序列、或被導入的合成機制。
用語「慢病毒（Lentivirus）」指反轉錄病毒科的一屬。慢病毒在反轉錄病毒中可感染非分裂細胞是獨特的，這是因為可傳遞相當量的基因資訊至宿主細胞DNA，是基因傳遞載體最有效率的方法之一。HIV、SIV、及FIV是慢病毒的全部例。
用語「慢病毒載體」指來自慢病毒基因組的至少一部分的載體，特別是例如Milone et al., Mol. Ther. 17（8）： 1453-1464 （2009）所示之自體不活化的慢病毒載體。有可能在醫療設施使用的慢病毒載體的其他例，不限於此等，例如Oxford BioMedica製的LENTIVECTOR（註冊商標）基因傳遞技術、Lentigen製的LENTIMAX（商標）載體系及同種者。也可利用非臨床型的慢病毒載體，載體的選擇及製作可由此技術領域之人士適當進行。
用語「抗原呈現細胞」或「APC」指在其表面上呈現和主要組織相容性複合體（MHC）複合體化的外來抗原的輔助細胞（accessory cell）（例如B細胞、樹狀細胞、及同種者）等的免疫系統細胞。T細胞有可能使用該等的T細胞受體（TCR）而辨識此等複合體。APC加工抗原、使抗原呈現於T細胞。
「免疫效應細胞」，此用語在本說明書、本揭示使用的情形，指和免疫反應，例如免疫效應反應的促進相關的細胞。免疫效應細胞之例，如T細胞，例如α/βT細胞及γ/δT細胞、B細胞、自然殺手（NK）細胞、自然殺手T（NK-T）細胞、肥大細胞、及來自骨髓的吞噬細胞。
T細胞可例如來自人類的T細胞、或來自狗、貓、豬、小鼠等的非人類哺乳動物的T細胞。又，T細胞可從血液、骨髓液等的體液、或脾臟、胸腺、淋巴結等的組織、或浸潤於原發性腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等的癌組織的免疫細胞分離、純化。如此的T細胞可例如αβT細胞、γδT細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、初始T細胞、NKT細胞。
「免疫效應功能或免疫效應反應」，此用語在本說明書、本揭示使用的情形，指例如免疫效應細胞之增強或促進目標細胞的免疫攻擊的功能或反應。例如，免疫效應功能或反應指促進目標細胞的生長或增殖的死亡或抑制的T或NK細胞的特性。在T細胞的案例中，初次刺激及共刺激為免疫效應功能或反應之例。
用語「效應功能」指細胞的特殊化的功能。T細胞的效應功能可為例如細胞溶解活性或細胞激素分泌等的輔助活性。
用語「自體」指來自和之後再導入該等的個體相同的個體的所有材料。
用語「同種異體」指來自和導入材料的個體同種、不同動物的所有材料。2個以上的個體，在1個或複數個基因座中的基因不同時，彼此稱為同種異體。在一些態樣中，來自同種個體的同種異體材料，也可在和抗原的交互作用上有充分程度的基因學上的不同。
用語「異種」指來自不同種動物的移植片。
用語「對象」，在本揭示使用時，表示包含人類的動物界的所有成員。較佳態樣中，對象為人類。
在本揭示狀況中，只要是跟此處列記的任何疾病狀態有關，用語「處置」、「進行處置」等表示，伴隨如此狀態的至少1個症狀的緩和或減輕或如此狀態進展的延緩或逆轉。在本揭示之此表示意思的範圍內，用語「處置」也表示停止、發病（即至疾病的臨床上顯著化的期間）延緩及/或疾病發病或惡化的風險降低。例如，和癌相關，用語「處置」可表示患者的腫瘤負荷的排除或減輕或轉移的預防、延緩或阻止等。
在本揭示使用時，如此技術領域所充分了解的，「治療」包含臨床結果，為獲得有利或所欲結果的手段。有利或所欲的臨床結果，雖無限定但不問是否能檢測，可包含1個以上的症狀或病態的緩和或改善、疾病程度的減輕、疾病狀態的穩定化（亦即沒有惡化）、疾病擴散的防止、疾病進展的延遲或徐緩化、疾病狀態的改善或減輕、及緩解（部分或完全）。「治療」也可表示，在和未接受治療的情形的預測存活時間相比，存活時間延長者。所謂「減輕」疾病或障礙表示，和未治療障礙的情形相比，障礙或疾病狀態的程度及/或不欲的臨床表現變輕者，及/或進展的過程徐緩化或延長者。
用語「癌」指以異常細胞不能控制的生長為特徵之疾病。癌細胞可能局部地或透過血流及淋巴系統蔓延到身體的其他部分。多種癌的例子在本揭示說明，不限於此等，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎臟癌、肝臟癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及同種者。用語「腫瘤」及「癌」，在本說明書及本揭示同義使用，例如任何用語包含固體及體液性，例如瀰漫性或循環性的腫瘤。用語「癌」或「腫瘤」，在本揭示使用時，癌前期同樣包含惡性的癌及腫瘤。
本揭示之抗癌劑或在後述的癌的治療方法中的癌，可例如腺癌、扁平上皮細胞癌、腺扁平上皮細胞癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頭頸癌、子宮癌、肝癌、腎臟癌、胰臟癌、脾臟癌、肺癌、氣管癌、支氣管癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌等的癌，或硬骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織的癌以外，軟骨肉瘤、伊文氏肉瘤（Ewing sarcoma）、惡性血管內皮瘤、惡性許旺細胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等的肉瘤、或肝胚細胞瘤、髓母細胞瘤、腎胚細胞瘤、神經母細胞瘤、胰胚細胞瘤、胸膜肺胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤等的胚細胞瘤、或胚胎細胞腫瘤、淋巴瘤、或白血病。
在部分的實施態樣中，在和癌種類的關聯中，腫瘤抗原為經由正常細胞和癌細胞兩者表現的標記（marker），例如系統標記如B細胞上的CD19。在某實施態樣中，本揭示之腫瘤抗原來自癌，包含原發性或轉移性的黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非何杰金氏淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma）、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臟癌、及腺癌如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰臟癌及同種者，但不限於此。在部分的實施態樣中，腫瘤抗原為特定的增殖性障礙共通的抗原。在部分的實施態樣中，癌相關抗原為，和正常細胞相比，在癌細胞中過度表現，例如較正常細胞的1倍的表現、2倍的過度表現、3倍的過度表現或以上的細胞表面分子。在部分的實施態樣中，癌相關抗原為在癌細胞中不適當合成的細胞表面分子，例如和正常細胞表現的分子相比，含有缺失、加成或突變的分子。在部分的實施態樣中，癌相關抗原全部或片段（例如MHC/胜肽）排他性在癌細胞的細胞表面被表現，在正常細胞的表面不合成或表現。在部分的實施態樣中，本揭示之嵌合受體包含含有和經MHC呈現的胜肽結合的抗原結合域（如抗體或抗體片段）的CAR。通常，來自內因性蛋白的胜肽充滿主要組織相容性複合體（MHC）第I型分子的區域（pocket），經由CD8+ T淋巴球上的T細胞受體（TCR）所辨識。MHC第I型複合體由全部有核細胞結構性表現。在癌中，病毒特異性及/或腫瘤特異性胜肽/MHC複合體為免疫療法用的細胞表面標靶特有的族的代表。說明在人類白血球抗原（HLA）-A1或HLA-A2的狀況中，以來自病毒或腫瘤抗原的胜肽作為標靶的類TCR抗體［例如希望參考Sastry et al., J Virol.2011 85（5）：1935-1942；Sergeeva et al., Bood, 2011 117（16）：4262-4272；Verma et al., J Immunol 2010 184（4）：2156-2165；Willemsen et al., Gene Ther 2001 8（21）：1601-1608；Dao et al., Sci Transl Med 2013 5（176）：176ra33；Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19（2）：84-100］。例如，類TCR抗體可經由篩選人類scFv噬菌體展示資料庫等的資料庫而鑑定。
在本揭示使用的情形，所謂「治療或預防癌」表示抑制癌細胞的複製、提供抗腫瘤免疫、抑制癌擴散（轉移）、抑制腫瘤增殖、減少癌細胞數或腫瘤增殖、或改善癌相關症狀。在本揭示使用的情形，只要沒有其他特別限定，用語「進行預防」、「預防者」及「預防」指對象在前述狀態感到痛苦開始前或在上述狀態再復發前所進行的行為。預防不一定帶來上述狀態的完全預防，上述狀態或上述狀態的症狀的部分預防或減輕、或上述狀態發病的風險降低，皆包含於此用語。
用語「抗癌作用」，不限於此，指可經由例如腫瘤體積減少、癌細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、癌細胞增殖減少、癌細胞存活減少、或和癌性症狀相關的各種生理學症狀的改善等的各種手段證明的生物學作用。「抗癌作用」又可在最初處所的癌發生的預防中、經由本揭示說明之胜肽、多核苷酸、細胞及抗體的能力而證明。用語「抗腫瘤效果」，不限於此等，指可經由例如腫瘤體積的減少、腫瘤細胞數的減少、腫瘤細胞增殖的減少、或腫瘤細胞存活的減少等之各種手段證明的生物學作用。
此處使用的適用於用量或量的「治療上有效」的用語是指，在投予必須處置的對象時，產生所欲活性的充足的化合物或醫藥組合物（例如包含本揭示之嵌合受體，視需要更包含腫瘤特異性細胞毒性單株抗體或包含Fc部分的其他抗腫瘤分子（例如由和免疫球蛋白的Fc部分或含Fc的DNA或RNA組合的腫瘤表面受體結合的配體（如細胞激素、免疫細胞受體）所形成的混合分子）之包含T淋巴球（及/或NK細胞）的組合物、或包含本揭示之初級抗體的組合物）的量。在本揭示之狀況內，用語「治療上有效」是指對於經本揭示之方法有效地使所處置的障礙的至少1個症狀的顯著化延遲、進行停止、緩和或減輕的化合物或醫藥組合物的量。在以活性成分的組合投予時，應注意該組合的有效量有包含也有不包含各別投予時為有效的各成分的量的情形。
本揭示中，用語「藥學上容許」是指投予哺乳動物（例如人類）時，生理學上的耐受性，典型為不產生不希望的反應的如此的組合物的分子實體及其他成分。較佳為，本揭示之「藥學上容許」表示對於在哺乳動物、更具體為人類的使用，記載於聯邦政府或州政府的主管機關所承認的、或美國藥典或其他一般認可的藥典。
本揭示之嵌合受體 在一態樣中，本揭示之嵌合受體，除了此處記載的2個訊息傳導域，亦即，CD3ζ及4-1BB/CD137或CD3ζ以外，包含1個以上的訊息傳導域。在一特定態樣中，數個訊息傳導域為了相加或加成的作用而互相融合。有用的加成的訊息傳導域的不限定例，包含TCRζ鏈、CD27、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIy、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP-10及CD40的1個以上之部分或全部。
在本揭示，揭示一種嵌合受體，包含i）可透過連接子切斷後的抗原結合分子和特定抗原結合的細胞外域；ii）穿膜域；及iii）包含含有選自細胞質共刺激域及/或介白素受體鏈的細胞質域的1個以上的細胞內訊息傳導域、和外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段（此處，上述細胞內區段包含內因性的或外因性JAK結合模體及STAT5相關模體而成）。在某實施態樣，這些結構域視情況從N端開始以上述順序直接或間接融合。在某實施態樣，細胞內區段內的這些域以相反順序融合。
又在本揭示，也包含一種嵌合受體，含有i）可透過連接子切斷後的抗原結合分子而結合的細胞外域；ii）穿膜域；及iii）經由包含IL受體鏈的細胞質域及視情況含有至少1個補充的細胞質域之1個以上的細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段。在某實施態樣，這些域視情況從N端開始以上述順序直接或間接融合。在一實施態樣，細胞內區段內的這些域以相反順序融合。
在一些實施態樣，IL受體鏈位於穿膜域的附近位置，及/或接近嵌合受體細胞內區段的N端，或形成N端。在其他實施態樣，IL受體鏈接近嵌合受體細胞內區段的C端，或形成C端。在一些實施形態，IL受體鏈位於包含外因性STAT3相關模體YXXQ而成的CD3ζ細胞內訊息傳導域的上游或N端側。
在細胞內區段只包含IL受體鏈的訊息傳導域而成的實施態樣，嵌合受體表現細胞可透過內因性TCR經由存在於MHC複合體內的指定抗原，及/或透過內因性CD28經由CD80/86分子，例如經由B細胞，而活化。
又本揭示也提供表現嵌合受體的細胞。如此的細胞，例如可具有高的增殖速度及/或高的存活率，產生大量的細胞激素，及/或和不表現嵌合受體的親代細胞相比，對在其表面具有嵌合受體結合的指定的/預選的抗原的細胞，可具有高的細胞毒性。例如，如實施例所示，本揭示之嵌合受體轉導T細胞具有初級抗體依賴性且癌抗原腫瘤抗原依賴性高的細胞分裂、增殖能力，在治療上，在接受上述細胞的小鼠中，提供抗腫瘤效果，且改善全存活率。因此也被期待在人類的抗腫瘤效果。
細胞外域 關於本揭示之嵌合受體所使用的細胞外域為，包含可和成為目標的連接子切斷後的抗原結合分子結合的蛋白質性分子或其一部分而成的域，例如包含抗體的抗原結合域及受體的配體結合域。此域和存在於細胞表面的抗原結合而交互作用，經此，賦予對表現嵌合受體的細胞的特異性。例如，關於本揭示之嵌合受體所使用的細胞外域可使用包含抗體（例如H鏈及L鏈）的可變區、單股及其結合片段或TCR（TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ）而成，例如抗體Fab片段、抗體可變區［H鏈的V區（VH）及L鏈（VL）的V區］或受體的細胞外配體結合域。特別是，在某實施形態，可使用單股可變片段（scFv）。
本揭示之嵌合受體的細胞外域可只和1個成為目標的連接子切斷後的抗原結合分子結合，也可以和2個以上成為目標的連接子切斷後的抗原結合分子結合。再加上，本揭示包含，含有1個細胞外域而成的嵌合受體及含有2個以上的細胞外域而成的嵌合受體兩者。
本揭示之嵌合受體的細胞外域結合的連接子切斷後的抗原結合分子結合的抗原之例，包含病毒抗原、細菌（特別是感染性細菌）抗原、寄生蟲抗原、和特定病態相關的目標細胞上的細胞表面標記（例如腫瘤抗原）、及產生自體免疫的免疫細胞的表面分子。
本揭示一面向提供，透過來自反轉錄病毒科（例如人類免疫不全病毒，例如HIV-1及HIV-LP）、小核糖核酸病毒科（picornaviridae）（例如多瘤性病毒（polyomavirus）、A型肝炎病毒、腸病毒、人類克沙奇病毒、鼻病毒、及伊科病毒（echovirus））、德國麻疹病毒、冠狀病毒、水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus）、狂犬病病毒、伊波拉病毒、副流行性感冒病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒、流行性感冒病毒、B型肝炎病毒、小病毒（parvovirus）、腺病毒科、皰疹病毒科［例如，第1型及第2型單純皰疹病毒（HSV）、水痘-帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒（CMV）、及皰疹病毒］、痘病毒科（例如，痘瘡病毒（Variola virus）、痘瘡病毒（vaccinia virus）、及痘病毒）、或C型肝炎病毒的抗原，和連接子切斷後的抗原結合分子而可結合的嵌合受體。
本揭示另一面向提供，透過來自葡萄球菌屬（Staphylococci）、鏈球菌屬（Streptococcus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、或沙門氏菌屬（Salmonella）的菌株的抗原，和連接子切斷後的抗原結合分子而可結合的嵌合受體。特別是，本揭示提供，透過來自感染性細菌，例如幽門螺旋桿菌（Helicobacter pyloris）、退伍軍人菌（Legionella pneumophilia）、分枝桿菌種的菌株（例如，結核菌（M. tuberculosis）、鳥結核菌（M. avium）、胞內分枝桿菌（M. intracellulare）、堪薩斯分枝桿菌（M. kansaii）、或戈登分枝桿菌（M. gordonea）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、腦膜炎雙球菌（Neisseria meningitides）、李斯特菌（Listeria monocytogenes）、化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）、Ａ群鏈球菌、B群鏈球菌（乙型鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、或破傷風桿菌（Clostridium tetani） 的抗原，和連接子切斷後的抗原結合分子而可結合的嵌合受體。
本揭示在另一面向，和嵌合受體的細胞外結合域結合的抗體可和5T4、α5β1-整合素、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-catenin/m、Bcr-abl、MN/C IX抗體、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT（或hTRT）、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、肌凝蛋白/m、MUC1、MUC-16、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190 minor bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、Survivin、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、NY-Eso-1或NY-Eso-B等的腫瘤抗原結合。本揭示中，該抗體又可和細胞表面黏著分子、自體免疫疾病中發現的發炎細胞的表面分子、或產生自體免疫的TCR結合。
細胞內區段 本揭示之嵌合受體的細胞內區段可包含1個以上的細胞內訊息傳導域，存在相同分子內的細胞外域在和其同源的抗體（cognate antigen）/配體結合（交互作用）時可傳導細胞訊息之蛋白質分子。
在某一面向，嵌合受體的細胞內區段包含含有外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內訊息傳導域而成。再加上，嵌合受體的細胞內區段包含選自IL受體鏈的細胞質域及/或細胞質共刺激域的1個以上的細胞內訊息傳導域而成，上述細胞內區段包含內因性或外因性JAK結合模體及STAT5相關模體而成。
第一細胞質訊息傳導序列調節TCR複合體的初級活性。例如，CD3ζ細胞內訊息傳導域提供第一細胞質訊息。第一細胞質訊息傳導序列也可包含已知為免疫受體酪胺酸活化模體（ITAM）［Nature, vol. 338, pp. 383-384 （1989）］的訊息傳導模體。另一方面，抑制性動作的第一細胞質訊息傳導序列也可包含已知為免疫受體酪胺酸抑制模體（ITIM）［J Immunol., vol. 162, No. 2, pp. 897-902 （1999）］ 的訊息傳導模體。在本揭示，可使用具有ITAM及/或ITIM的細胞內訊息傳導域。
本揭示中，CD3ζ的細胞內域包含免疫受體酪胺酸活化模體（ITAM）而成。具有可使用的ITAM的細胞內訊息傳導域之例，包含如取代CD3ζ或替換CD3ζ，具有來自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、及CD66d的ITAM的細胞內訊息傳導域。具體為，包含1個以上的ITAM而成的細胞內域之例，包含具有CD3ζ（NCBI RefSeq：NP_932170.1）的胺基酸編號52～164、FcεRIγ（NCBI RefSeq：NP_004097.1）的胺基酸編號45～86、FcεRIβ（NCBI RefSeq：NP_000130.1）的胺基酸編號201～244、CD3γ（NCBI RefSeq：NP_000064.1）的胺基酸編號139～182、CD3δ（NCBI RefSeq：NP_000723.1）的胺基酸編號128～171、CD3ε（NCBI RefSeq：NP_000724.1）的胺基酸編號153～207、CD5（NCBI RefSeq：NP_055022.2）的胺基酸編號402～495、CD22（NCBI RefSeq：NP_001762.2）的胺基酸編號707～847、CD79a（NCBI RefSeq：NP_001774.1）的胺基酸編號166～226、CD79b（NCBI RefSeq：NP_000617.1）的胺基酸編號182～229、及CD66d（NCBI RefSeq：NP_001806.2）的胺基酸編號177～252之序列的胜肽、以及和這些胜肽具有相同功能的該等變異體。根據本說明書所載之NCBI RefSeq ID或GenBank的胺基酸序列資訊的胺基酸編號是基於各蛋白質的前驅體（包含訊息胜肽序列等而成）的全長進行編號。
在某實施形態，在STAT3相關模體YXXQ中，「X」所表的胺基酸殘基可為也包含維持STAT3結合的任何的修飾天然胺基酸之任意的天然胺基酸。在一實施形態，胺基酸X獨立選自白胺酸、精胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、離胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、麩醯胺酸、蘇胺酸、天門冬胺酸。例如，胺基酸X為精胺酸。例如，胺基酸X為組胺酸。
在某實施形態，STAT3相關模體YXXQ的酪胺酸殘基相鄰的2個胺基酸殘基為精胺酸-組胺酸。在其他實施形態，外因性STAT3相關模體為YRHQ。
外因性STAT3相關模體YXXQ也可導入CD3ζ的細胞內域的任何部份，但在某實施形態，YXXQ相關模體插入C端區附近。雖然不希望被特定理論束縛，但認為多數的內因性YXXQ模體配置在從C端的100aa附近或以內。又，位於C端區附近的YXXQ模體經GP130及LIFR研究，顯示位於近位者功能性高（Schmitz J et al. J Immunol. 2000；164：848-54； Tomida M et al. Blood. 1999；93：1934-41）。
在某實施形態，外因性STAT3相關模體YXXQ導入位於嵌合受體從C端的200個胺基酸殘基內的CD3ζ的細胞內域的任意部份。例如，STAT3相關模體導入嵌合受體從C端的200個胺基酸殘基內、150個胺基酸殘基內、100個胺基酸殘基內、90個胺基酸殘基內、80個胺基酸殘基內、70個胺基酸殘基內、60個胺基酸殘基內、50個胺基酸殘基內、40個胺基酸殘基內、30個胺基酸殘基內、20個胺基酸殘基內、或10個胺基酸殘基內。在1個實施形態，外因性STAT3相關模體導入ITAM以外的處所。
在某實施態樣，包含外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內域，包含至少1個ITAM模體而成。在一實施態樣，包含外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內域，包含2個ITAM模體而成。在更一實施態樣，包含外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ細胞內域，包含3個ITAM模體而成。
此技術領域之人士了解可使用將STAT3相關模體導入CD3ζ的細胞內訊息傳導域用的幾個方法。例如，可經由CD3ζ的細胞內訊息傳導域的胺基酸殘基104～106的胺基酸殘基Leu-His-Met，在殘基第104位的酪胺酸及其酪胺酸殘基，以在第105位及第106位鄰接的任意其他2個胺基酸殘基取代，可導入外因性STAT3相關模體。CD3ζ的細胞內訊息傳導域的胺基酸殘基104-105-106相當於全長CD3ζ（例如NCBI RefSeq：NP_932170.1）的胺基酸殘基156-157-158。
如記載所述，在某實施形態的嵌合受體包含含有選自IL受體鏈及細胞質共刺激域的細胞質域之1個以上的細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段。
本揭示中，IL受體鏈的細胞質域可使用包含可選自IL受體的任意鏈，例如IL-2受體β鏈 （NCBI REFSEQ：NP_000869.1）（IL-21受體α鏈 （NCBI REFSEQ：NP_068570.1）的胺基酸編號256～538）的胺基酸編號266～551、共同IL-2受體γ鏈 （NCBI REFSEQ：NP_000197.1）的胺基酸編號284～369、IL-7Rα（NCBI REFSEQ：NP_002176.2）的胺基酸編號265～459、IL-9Rα（NCBI REFSEQ：NP_002177.2）的胺基酸編號292～521或IL-4Rα（NCBI REFSEQ：NP_000409.1）的胺基酸編號257～825而成的細胞質域。可使用IL受體鏈的細胞質域的全區域。
或者，也可使用IL受體鏈的上述細胞質域的末端切斷片段。例如，末端切斷片段包含至ILR細胞質域的250個的胺基酸而成，或為50～200個胺基酸或80～150個胺基酸。
在某實施態樣，IL受體鏈的細胞質域，視情況，IL受體鏈的上述細胞質域的末端切斷片段包含至少STAT相關模體，視情況包含STAT5相關模體、和JAK結合模體（也已知為box-1模體）而成。在某實施形態，IL受體鏈的細胞質域或其末端切斷片段包含STAT5相關模體和JAK結合模體而成。
在某實施態樣，對於IL受體鏈的細胞質域及/或末端切斷片段，包含具有相同功能的變異體，例如STAT訊息傳導，視情況包含誘導STAT5訊息傳導及/或JAK訊息傳導的變異體。
本揭示之一面向，可使用IL-2受體（IL-2R）β鏈的細胞質域。本揭示可使用的IL-2Rβ鏈的細胞質域之例，包含IL-2Rβ鏈（NCBI RefSeq：NP_000869.1）的胺基酸編號266～551。在一實施態樣，包含具有胺基酸編號266～337及530～551的序列的任一者之胜肽。本揭示之一面向，可使用IL-2Rβ鏈的細胞質域的末端切斷片段。此末端切斷片段也可包含i）可和酪胺酸激酶JAK1締合、也稱為BOX-1模體的JAK結合模體（例如，NCBI RefSeq：NP_000869.1的胺基酸編號278～286）、及ii）STAT相關模體，視情況為STAT5或STAT3相關模體。IL受體鏈的其他部分可經由例如保留性的胺基酸變異而改變。
在某實施形態，細胞內區段也可包含外因性JAK結合模體、或包含JAK結合模體而成的訊息傳導分子。例如，JAK結合模體來自IL2Rγ（IL2RG）、紅血球生成素受體（EpoR）、促血小板生成素受體（TpoR）、顆粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子受體（GM-CSFR）、及生長激素受體 （GHR）。
IL-2Rβ鏈包含使用於STAT5締合的3個功能性的STAT5結合模體，YFFF、YCTF及YLSL而成。這些酪胺酸殘基的變異可使IL2Rβ鏈的IL-2反應性無效（Friedmann et al., 1996）。紅血球生成素受體（EpoR）包含媒介STAT5的活化的2個酪胺酸殘基，即Y343和Y401而成，已記載兩者皆具有YXXL模體（Klingmuller et al., 1996）。因此，YXXL在STAT5的動員上可為較佳的模體。例如，如以IL-2Rβ鏈STAT5結合模體所示，其他胺基酸殘基也是有功能的。在一實施形態，STAT5相關模體為IL-2Rβ鏈STAT5相關模體，包含酪胺酸殘基-510（酪胺酸殘基510為NCBI RefSeq：NP_000869.1的胺基酸編號536）。
在某實施形態，STAT5相關模體可來自IL2Rγ、EpoR、TpoR、GM-CSFR及GHR。
在某實施形態，IL-2Rβ鏈的STAT5相關模體包含胺基酸殘基YXXL而成。在某實施形態，STAT5相關模體中「X」所表的胺基酸殘基可為包含維持STAT5結合的任意的修飾天然胺基酸之任意的天然胺基酸。
同樣地，細胞內區段包含也可配置或導入細胞內訊息傳導域的任一個的1個以上的JAK結合模體。
本揭示一面向，可使用IL-21受體（IL-21R）α鏈的細胞質域。本揭示所使用之IL-21Rα鏈的細胞質域之例，包含含有例如IL-21Rα鏈的胺基酸編號256～538（NCBI RefSeq：NP_068570.1）而成的細胞內訊息傳導域。本揭示一面向，可使用IL-21Rα鏈的細胞質域的末端切斷片段。末端切斷片段包含和酪胺酸激酶JAK1的締合必要的box-1模體（NCBI RefSeq：NP_068570.1的胺基酸編號266～274），又，包含STAT相關模體。在某實施形態，STAT相關模體包含酪胺酸殘基-500（NCBI RefSeq：NP_000869.1的胺基酸編號519）及STAT1/3締合必要的酪胺酸殘基500，即鄰接YLRQ的C端側的3個殘基。
細胞內訊息傳導域的其他例，包含來自TCR複合體及/或共刺激分子的細胞質區、以及和該等序列具有相同功能的任意變異體。其他例包含經引用而作為本說明書之一部分的Sadelain et al 2009的表2所列舉的細胞質訊息傳導域。
天然T細胞的活化經由2個不同種類的細胞內訊息傳導域，亦即透過TCR複合體、經由誘導抗原依賴性第一活化（例如由CD3ζ所提供的，例如第一細胞質訊息）用的域及提供第二或共刺激訊息（第二細胞質訊息）用的抗原非依賴性作用之域所傳遞。
包含本揭示可使用的第二或共刺激細胞質訊息傳導域而成的細胞內域之例，包含來自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137（4-1BB）、ICOS、及CD154，例如來自包含訊息傳導模體而成的其末端切斷片段之序列。其具體例包含具有CD2（NCBI RefSeq：NP_001758.2）的胺基酸編號236～351、CD4（NCBI RefSeq：NP_000607.1）的胺基酸編號421～458、CD5（NCBI RefSeq：NP_055022.2）的胺基酸編號402～495、CD8α（NCBI RefSeq：NP_001759.3）的胺基酸編號207～235、CD8β（GenBank：AAA35664.1）的胺基酸編號196～210、CD28（NCBI RefSeq：NP_006130.1）的胺基酸編號180～220、CD137（4-1BB、NCBI RefSeq：NP_001552.2）的胺基酸編號214～255、CD134（OX40、NCBI RefSeq：NP_003318.1）的胺基酸編號241～277、及ICOS（NCBI RefSeq：NP_036224.1）的胺基酸編號166～199的任一個序列的胜肽、及和具有這些胜肽者具有相同功能的該等變異體。
較佳揭示，在一面向，包含除了包含外因性STAT3相關模體而成的CD3ζ的細胞內訊息傳導域以外，含有具1個以上、例如2或3個的細胞內訊息傳導域的細胞內區段而成的嵌合受體。
本揭示又包含含有具直列的2個以上相同的細胞內訊息傳導域的細胞內區段而成的嵌合受體。在一面向，本揭示提供IL受體的細胞質域位於CD3ζ的細胞內訊息傳導域的N端側之嵌合受體，亦即，包含IL受體的細胞質域和CD3ζ的細胞內訊息傳導域從N端側以此順序連結而成的嵌合受體。本揭示也包含上述嵌合受體再加成CD28（例如CD28的細胞質共刺激域）的細胞內域而得的嵌合受體，亦即，包含CD28的細胞內訊息傳導域、IL受體的細胞質域、和外因性STAT3模體而成的CD3ζ的細胞內訊息傳導域從N端側以此順序連結而成的嵌合受體。
在某實施形態，嵌合受體包含含有選自外因性STAT3模體、介白素受體鏈的細胞質域及細胞質共刺激域的細胞內訊息傳導域而成的、含有CD3ζ的細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段，此處，細胞內訊息傳導域的至少1個包含內因性或外因性的JAK結合模體及STAT5相關模體。
在一實施形態，嵌合受體包含具有外因性STAT3模體的CD3ζ細胞內訊息傳導域、和含有內因性或外因性的JAK結合模體及STAT5相關模體而成的IL受體鏈片段的細胞質域、和CD28的細胞質共刺激域。
本揭示之嵌合受體可在細胞內區段的域間，插入寡胜肽連接子或多胜肽連結子，以在該處連結域、及/或使該等和其他域連結。例如可使用具有2～10個胺基酸長度的連接子。特別是，可使用具有甘胺酸-絲胺酸序列的連接子。例如，可在CD28細胞質域和部分的細胞質IL-2受體β域之間插入連接子IDGGGGSGGGGSGGGGS。例如，可在部分的細胞質IL-2受體β域及CD3ζ鏈的細胞內域之間插入連接子KLGGSGP。
在其他面向，提供包含i）可和特定的抗原結合的細胞外域、ii）穿膜域、及iii）包含含有介白素受體鏈的細胞質域及視需要包含補充的細胞質域的1個以上的細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段，而成的嵌合受體。
IL受體鏈的細胞質域也可選自本說明書記載之IL受體的任一鏈。可使用IL受體鏈的細胞質域的全區域。或者，也可使用IL受體鏈的上述細胞質域的末端切斷片段。全長及其末端切斷片段之例顯示於本說明書。
在某實施形態，末端切斷片段也可包含本說明書記載之至少1個酪胺酸激酶相關模體（也已知為box-1模體）及STAT（訊息傳導轉錄活化因子）相關模體。例如，末端切斷片段包含至多ILR細胞質域的250個的胺基酸而成，或為50～200個胺基酸或80～150個胺基酸。
IL-2Rβ鏈的STAT相關模體包含酪胺酸殘基-510（酪胺酸殘基510為NCBI RefSeq：NP_000869.1的胺基酸編號536）。在某實施形態，STAT相關模體包含酪胺酸殘基510、和鄰接酪胺酸殘基510的C端側的4個殘基，即YLSLQ。
其他的STAT相關模體也為已知，包括例如IL-6的YXXQ、視情況的YXPQ、IL-10的YXXQ、IL-12的YLPSNID、IL-2的YLSLQ、YCTFP、YFFFH、IL-7的YVTMS、IL-9的YLPQE、以及IL-4的YKAFS及YKPFQ。也可使用任何的STAT訊息傳導域，及/或導入ILR鏈。
在某實施形態，除了IL受體的細胞質域外，嵌合受體細胞內區段包含存在於IL受體內者以外的至少1個補充的訊息傳導域。細胞內訊息傳導域之例包含來自TCR複合體的細胞質域及/或共刺激分子、及和該序列具有相同功能的任意變異體。其他例包含經引用而作為本說明書一部分的Sadelain et al 2009的表2所列舉的細胞質訊息傳導域。
本揭示包含，除IL受體的細胞質域外，含有1個以上、例如2或3個的細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段之嵌合受體。例如，嵌合受體包含IL受體的細胞質域及CD3ζ的細胞內訊息傳導域。例如，嵌合受體包含IL受體的細胞質域、CD3ζ的細胞內訊息傳導域、及CD28的細胞質共刺激域而成。
在某實施形態，嵌合受體包含含有CD3ζ細胞內訊息傳導域而成的細胞內區段、1個以上的細胞質共刺激域而成，此處，上述細胞內區段包含JAK結合模體、STAT5及/或STAT3相關模體。
穿膜域及間隔域（spacer domain） 本揭示的嵌合受體包含穿膜域。穿膜域可來自天然多胜肽，也可為人工設計。來自天然多胜肽的穿膜域可獲自膜結合或穿膜蛋白。可使用例如T細胞受體α或β鏈、CD3ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、或GITR的穿膜域。人工設計的穿膜域主要為包含白胺酸及纈胺酸等的疏水性殘基而成的多胜肽。例如，可在合成的穿膜域的各末端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體（triplet）。視情況，可配置短鏈的寡胜肽連接子或多胜肽連接子，例如2～10個胺基酸長度的連接子，在本說明書記載之穿膜域及細胞內區段之間。特別是，可使用具有甘胺酸-絲胺酸連續序列的連接子序列。
例如，可使用具有CD28（NCBI RefSeq：NP_006130.1）的胺基酸編號153～179的序列的任一個穿膜域作為穿膜域。
本揭示之嵌合受體可在細胞外域和穿膜域之間、或細胞外區段和穿膜域之間，配置間隔域（spacer domain）。間隔域也表示作用為連結穿膜域和細胞外域、及/或穿膜域和細胞內區段的任何寡胜肽或多胜肽。間隔域包含至多300個胺基酸，例如約10～100個胺基酸，或約25～50個胺基酸。
間隔域較佳具有藉由連接子切斷後的抗原結合分子促進嵌合受體和抗原的結合、且增強對細胞的訊息傳導的序列。被期待促進結合的胺基酸之例，包含半胱胺酸、帶電胺基酸、以及潛在的醣基化部位內的絲胺酸及蘇胺酸，這些胺基酸可作為構成間隔域的胺基酸使用。
在某實施態樣，間隔域包含CD8α（NCBI RefSeq：NP_001759.3）的胺基酸編號118～178，亦即CD8α的樞紐區、CD8β（GenBank：AAA35664.1）的胺基酸編號135～195、CD4（NCBI RefSeq：NP_000607.1）的胺基酸編號315～396、CD28（NCBI RefSeq：NP_006130.1）的胺基酸編號114～152、或該等的一部分，或者由該等所形成的多胜肽。再者，間隔域也可為人工合成序列。
本揭示之嵌合受體可設計如形成聚合物、特別是二聚體。例如為了藉由雙硫鍵而使嵌合受體聚合（二聚體化），在間隔域及/或穿膜域插入半胱胺酸。
再者，本揭示之嵌合受體可在N端連結訊息胜肽序列。訊息胜肽序列多存在於分泌蛋白質及膜蛋白的N端，具有15～30個胺基酸長度。本說明書記載之具有細胞內域的蛋白質分子多為膜蛋白，具有訊息胜肽序列。來自如此的分泌蛋白質及膜蛋白的訊息胜肽，可做為本揭示之嵌合受體的訊息胜肽使用。任何的訊息胜肽皆可使用。例如，訊息胜肽可為抑癌素M（oncostatin M）訊息胜肽。訊息胜肽可來自人類，也可來自非人類例如昆蟲細胞或病毒。在某實施形態，訊息胜肽為人類訊息胜肽。
（2）編碼嵌合受體的核酸 本揭示提供編碼本說明書記載之嵌合受體的核酸。編碼嵌合受體的核酸可從所示的嵌合受體的胺基酸序列經常規方法而容易製作。編碼胺基酸序列的核酸序列可從各域的胺基酸序列相關的上述NCBI RefSeq ID或GenBank的寄存編號取得，使用標準的分子生物學及/或化學的步驟可以製作本揭示之核酸。例如，可基於核苷酸序列合成核酸，組合從cDNA資料庫使用聚合酶連鎖反應（PCR）所獲得的DNA片段，可製作本揭示之核酸。
本揭示之核酸可和其他核酸連結以在較佳啟動子的控制下表現。啟動子之例包含結構性促進基因或可操作性連接的構築物的表現之啟動子、經藥物等（例如四環黴素或阿黴素（doxorubicin））的作用而誘導基因或可操作性連接的構築物的表現之啟動子。本揭示之核酸也可為了獲得核酸的效率轉錄，和包含與啟動子或轉錄開始部位協動的其他調節元件、例如增強子（enhancer）序列或終止子（terminator）序列而成的核酸連接。除了本揭示之核酸，也可加入成為確認核酸表現用的標記物所得的基因（例如抗藥性基因、編碼報導酵素的基因、或編碼螢光蛋白的基因）。
在某實施形態，核酸為在特定宿主表現用而使密碼子最佳化的核酸。
本揭示提供包含作為有效成分的本揭示之核酸及藥學上可容許的賦形劑之組合物。較佳的藥學上可容許的賦形劑為此技術領域之人士所周知。藥學上可容許的賦形劑之例包括，含有磷酸緩衝生理食鹽水（例如0.01M磷酸鹽、0.138M的NaCl、0.0027M的KCl、pH7.4）、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、或硫酸鹽等的無機酸鹽之水溶液、生理食鹽水、乙二醇或乙醇之溶液、及乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或苯甲酸鹽等的有機酸鹽。也可使用濕潤劑或乳化劑、及pH緩衝劑等的佐劑。藥學上可容許的賦形劑可適切使用Remington’s Pharmaceutical Sciences （Mack Pub. Co., N.J. 1991） （引用作為本說明之一部分）所記載之賦形劑。本揭示之組合物可以非經口投予例如注射或注入之較佳的已知形態進行處方。再者，本揭示之組合物也可包含懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑等的製劑添加劑、及延長保存中的有效性用的防腐劑。本組合物也可為使用前在適當的無菌液體再形成用的乾燥形態。為了透過微粒投予，可將顯微鏡可見大小的金粒子等的粒子以DNA塗佈。
在本揭示之核酸以離體（ex vivo）導入細胞的情形，除了促進核酸向細胞移動的物質例如上述賦形劑外，本揭示之核酸也可和微脂體或陽離子脂質等、導入核酸用的試劑組合。或者，如後述，運送本揭示之核酸的載體也是有用。特別是，含有經由較佳的載體運送的本揭示之核酸、投予活體的較佳形態之組合物，適合於活體內（in vivo）基因療法。
含有本揭示之核酸作為有效成分而成的組合物，經由該核酸編碼的嵌合受體透過連接子切斷後的抗原結合分子而結合的抗原，可投予用於例如癌［血液癌（白血病）、固態腫瘤等］、發炎疾病/自體免疫疾病（氣喘、濕疹）、肝炎、及原因為流行性感冒及HIV等的病毒、細菌、或真菌之感染性疾病、例如結核病、MRSA、VRE、或深層黴菌病等的疾病的治療。含有本揭示之核酸作為有效成分而成的組合物可在皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻腔内、動脈内、靜脈内、腫瘤内、或傳入淋巴管，經由非經口投予，例如注射或注入而投予，或可為了該等投予而適當調配處方，但投予路徑沒有特別限定。
產生表現嵌合受體的細胞之方法 本揭示之產生表現嵌合受體的細胞之方法，包含將編碼本說明書記載之嵌合受體的核酸導入細胞的步驟。此步驟離體（ex vivo）進行。例如，可將細胞離體（ex vivo）以運送本揭示之核酸的病毒載體或非病毒載體進行轉形，以產生表現本揭示之嵌合受體的細胞。
本揭示之方法可使用來自哺乳動物之細胞，例如人類細胞、或來自猴、小鼠、大鼠、豬、馬、或狗等的非人類哺乳動物的細胞。
在一實施形態，哺乳動物為人類。
根據本揭示，提供嵌合受體、編碼上述嵌合受體之核酸、表現上述嵌合受體之細胞、及包含上述任一者而成的組合物。在某實施形態，可使用上述1個以上在以腫瘤抗原等的抗原作為標靶的養子免疫基因療法的領域，及/或在篩選或其他的活體外（in vitro）分析法。將本揭示之嵌合抗原受體導入細胞，例如可得到在該細胞中嵌合抗原受體的表現量增強或上升。如此的細胞對表現標靶抗原的細胞，可發揮細胞毒性。
在一面向，提供表現本揭示之嵌合受體的細胞之製作方法，包括： a）從哺乳動物分離免疫細胞（視情況，上述免疫細胞為T細胞）； b）將分離的免疫細胞（視情況，為T細胞），以編碼本說明書記載之嵌合受體的核酸進行轉染或轉導；以及 c）視情況，在轉染或轉導後，分離嵌合受體表現細胞（視情況，為嵌合受體表現T細胞），及/或擴大培養。
在一實施態樣，在對對象再導入前，使自體T淋巴球或自體NK細胞、自體巨噬細胞離體（ex vivo）活化及/或增殖。在一實施態樣，T淋巴球或NK細胞為同種異體的T淋巴球或同種異體的NK細胞。在一實施態樣，同種異體的T淋巴球為內在性T細胞受體的表現受到抑制或排除的T淋巴球。在一實施態樣，在對對象導入前，使同種異體的T淋巴球或同種異體的NK細胞離體（ex vivo）活化及/或增殖。在一實施態樣，經由選自由反轉錄病毒轉導、慢病毒轉導、DNA電穿孔法及RNA電穿孔法、經DNA或RNA轉染或基因編輯的基因改變所組成之群的方法，使嵌合受體導入T淋巴球或NK細胞或巨噬細胞。
本揭示之方法中所使用之NK細胞，缺乏或幾乎不表現主要組織相容性抗原第I及/或II型分子，經由暴露於以表現膜結合IL-15及4-1BB配體（CDI37L）而基因修飾之細胞，可優先增殖。如此的細胞株包含K562［ATCC、CCL 243； Lozzio et al., Blood 45（3）： 321-334 （1975）； Klein et al., Int. J. Cancer 18： 421-431 （1976）］及病毒腫瘤細胞株HFWT［Fehniger T A, Caligiuri M A. Int Rev Immunol 20（3-4）：503-534 （2001）； Harada H, et al., Exp Hematol 32（7）：614-621 （2004）］、子宮内膜腫瘤細胞株HHUA、黑色素腫瘤細胞株HMV-II、肝胚細胞腫瘤細胞株HuH-6、肺小細胞癌細胞株Lu-130及Lu-134-A、神經母細胞腫瘤細胞株NB 19及N1369、來自睪丸NEC 14的胚胎癌細胞株、頭頸癌細胞株TCO-2及骨髓轉移神經母細胞腫瘤細胞株TNB 1［Harada H., et al., Jpn. J. Cancer Res 93： 313-319 （2002）］，但不一定限於此等。較佳使用的細胞株如K562及HFWT細胞株，缺乏或幾乎不表現MHC 第I及II型分子兩者。可使用固體支持體代替細胞株。如此的支持體較佳和NK細胞結合，可誘發初期活化事項及/或增殖性反應或和具有如此作用的分子的結合，經此作為立足處而作用的至少1個分子在該表面結合。支持體可在該表面和CD137配體蛋白質、CD137抗體、IL-15蛋白質或IL-15受體抗體結合。較佳為，支持體具有結合於該表面的IL-15受體抗體及CD137抗體。
在一實施態樣，在包含T淋巴球活化的任一本揭示之方法中，T淋巴球在選自由抗CD3/CD28、IL-2及植物血凝素（phytohaemagglutinin）所組成的群組的1種以上的藥劑存在下可活化。在包含NK細胞活化的任一本揭示之方法中，NK細胞在選自由CD137配體蛋白質、CD137抗體、IL-15蛋白質、IL-15受體抗體、IL-2蛋白質、IL-12蛋白質、IL-21蛋白質及K562細胞株所組成的群組的1種以上的藥劑存在下可活化。
在本揭示之方法所使用的細胞沒有特別限定，可使用任何細胞。例如，可使用從體液、組織或器官，例如血液（周邊血液、臍帶血等）或骨髓採集、分離、或純化的細胞，或使上述細胞分化、或為了製作誘導性多能幹細胞（iPSC）而經由初期化所得到的細胞（例如Themeli et al 2013）。可使用周邊血液單核細胞（PBMC）、免疫細胞［例如T細胞、樹狀細胞、B細胞、造血幹細胞、巨噬細胞、單核球、NK細胞或造血細胞（包含嗜中性球、嗜鹼性球）］、臍帶血單核細胞、纖維母細胞、脂肪細胞前驅體、肝細胞、皮膚角質細胞、間葉幹細胞、脂肪幹細胞、各種癌細胞株、或神經幹細胞。例如，可使用NK細胞或T細胞、T細胞的前驅細胞（造血幹細胞、淋巴球前驅細胞等）或含有該等的細胞集團。T細胞之例包含CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、調控性T細胞、細胞毒性T細胞、及腫瘤浸潤淋巴球。包含T細胞和T細胞的前驅細胞之細胞集團包含PBMC。上述細胞可從活體採集，也可經由從活體採集的細胞擴大培養而獲得，或者也可建立細胞株。在希望所產生的嵌合受體表現細胞或從所產生的嵌合受體表現細胞分化的細胞移植活體的情形時，可將從該活體本身或該同種活體採集的細胞導入核酸。
和多核苷酸一起，本揭示也提供包含如此多核苷酸的載體（如此的多核苷酸包含和嵌合受體表現用的至少1個調節元件可操作性連接的載體）。本揭示之有用的載體的非限定例，包含例如反轉錄病毒載體及慢病毒載體之病毒載體。
在一特定態樣中，如此的載體包含自殺基因。此處使用的自殺基因表示使表現自殺基因的細胞致死的基因。自殺基因可為對表現該基因的細胞提供對藥劑例如醫藥的敏感性，使該細胞和該藥劑接觸時或暴露於該藥劑時，使細胞致死的基因。自殺基因為此技術領域已知（例如Suicide Gene Therapy： Methods and Reviews, Springer, Caroline J. （Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK）, Humana Press, 2004），例如包含單純皰疹病毒（HSV）胸苷激酶（TK）基因、胞嘧啶去胺酶、嘌呤核苷酸酸化酶、硝基還原酶及凋亡蛋白酶8（caspases8）的凋亡蛋白酶。
可將編碼本揭示之嵌合受體的核酸導入載體，將該載體導入細胞。例如，可使用反轉錄病毒載體（包含致癌反轉錄病毒載體（oncoretrovirus vector）、慢病毒載體、及假型載體（pseudotype vector））、腺病毒載體、腺相關病毒（AAV）載體、猿猴病毒載體、痘瘡病毒載體或仙台病毒載體、Epstein-Barr二氏病毒（EBV）載體、及HSV載體等的病毒載體。例如，可使用在感染細胞內不自行複製、缺乏複製能力的病毒載體。
除此之外，非病毒載體也可如本揭示中WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170及WO97/31934（引用作為本說明書之一部分）所記載，和微脂體或陽離子脂質等的縮合劑組合使用。本揭示之核酸也可經由磷酸鈣轉導、DEAE-類糊精、電穿孔法、或粒子撞擊而導入細胞。
例如，在使用反轉錄病毒載體的情形時，本揭示之方法可基於LTR序列選擇經由較佳包裹細胞和載體加工的包裹訊息序列，及使用包裹細胞製作反轉錄病毒粒而進行。包裹細胞之例，包括PG13（ATCC CRL-10686）、PA317（ATCC CRL-9078）、GP+E-86及GP+envAm-12（美國專利第5,278,056號）、及Psi-Crip［Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 85, pp. 6460-6464 （1988）］。反轉錄病毒粒也可使用293細胞或具有高轉染效率的293T細胞來製作。基於可使用於反轉錄病毒及反轉錄病毒載體的包裹之包裹細胞所產生的多種類的病毒載體，由多數公司廣為販售。
本揭示又提供包含上述嵌合受體的宿主細胞。有用的宿主細胞的非限定例，包含T淋巴球及NK細胞，可為自體的或為同種異體的（內因性T細胞受體被去除或維持）。在某特定的實施態樣，宿主細胞為從患有癌的患者分離的自體T淋巴球。在一特定態樣中，離體（ex vivo）使此種的自體T淋巴球活化及增殖。
本揭示之嵌合受體可經由此技術領域已知的任意方法導入宿主細胞。特別是，有用的方法之非限定例，包括反轉錄病毒的轉導、慢病毒的轉導及DNA及mRNA電穿孔法。如下列實施例所示，mRNA電穿孔法使在T淋巴球中本揭示之嵌合受體的有效表現產生。記載反轉錄病毒轉導的參考文獻之例包括Anderson et al.、美國專利5,399,346號； Mann et al., Cell 33：153 （1983）； Temin et al., U.S. Pat. No. 4,650,764； Temin et al.、美國專利5,124,263號；Dougherty et al.的國際專利公開案WO95/07358號（1995年3月16日公開）；及Kuo et al., Blood 82：845 （1993）。國際專利公開案WO95/07358號記載初代B淋巴球的高效率轉導。例如，對於可使用的反轉錄病毒轉導及mRNA電穿孔法的具體技術，也可參照下列實施例之章節。
使用宿主細胞的活化及增殖，使一般病毒載體的對基因組的移入及編碼本揭示之嵌合受體的基因的表現成為可能。然而，如果使用mRNA電穿孔法，則活化及增殖不是必要（但電穿孔法在活化細胞上實施時更有效的）。病毒轉導的結果，宿主細胞（T淋巴球或NKT細胞）有較該受體一次性（典型為3～5日）表現時的mRNA電穿孔法產生更強效果的可能性，長時間表現本揭示之嵌合受體。然而，病毒轉導複雜、昂貴、實施困難，但另一方面，mRNA電穿孔法單純的多，容易實施的多。再者，如果有毒性的可能性則一次性表現有用，在副作用的可能性的臨床試驗的初期應該有助益。
在一面向，包含以本說明書記載之核酸或載體轉染或轉導細胞之本說明書所揭示之細胞的製作方法。
在一實施形態，分離的免疫細胞為分離的T細胞。
在某實施形態，分離的細胞為CD3+ ，視情況在轉導或轉染前，視情況以可溶型或膜結合型的抗CD3抗體，例如OKT3或mOKT3、及/或APC刺激。在一實施形態，APC為人工APC（aAPC）。在其他實施形態，APC表現膜型的抗CD3單株抗體。
在一實施形態，重複轉染或轉導步驟。例如，轉染或轉導步驟可進行2次、或3次、4次，或例如達成充分的表現水平為止。例如轉染或轉導步驟可進行5次。
在一實施形態，細胞進行連續2日以上的轉染或轉導。例如，細胞進行連續2日、連續3日、或連續4日的轉染或轉導。
在一實施形態，以表現指定抗原的照射細胞刺激嵌合受體轉導細胞。例如，以效應物：目標比為100：1、75：1、50：1、25：1、20：1、15：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：15、1：20、1：25、1：50或1：100以照射細胞刺激嵌合受體轉導T細胞。較佳為1：1。
表現嵌合受體的細胞及其使用 本揭示之表現嵌合受體的細胞為編碼本說明書所記載之嵌合受體的核酸經本說明書記載之生產方法導入及表現之細胞。
本揭示之細胞透過嵌合受體和指定的抗原結合，經此將訊息傳導給細胞，結果使細胞活化。表現嵌合受體的細胞的活化，根據宿主細胞的種類及嵌合受體的細胞內域而異，可基於例如細胞激素的釋放、細胞增殖速度的增加、或細胞表面分子的變化等做為指標而確認。例如，從活化細胞的細胞毒性細胞激素（腫瘤壞死因子、淋巴毒素等的）的釋放，引發表現抗原的目標細胞的破壞。再加上，細胞激素的釋放或細胞表面分子的變化刺激其他免疫細胞，例如B細胞、樹狀細胞、NK細胞、及巨噬細胞。
本揭示之方法中使用的T淋巴球最好是先從血液樣本分離，較佳使用例如抗CD3/CD28珠、IL-2或植物血凝素（phytohaemagglutinin）之標準法，離體（ex vivo）活化及增殖（例如3～5日）之患者本身的細胞（亦即自體細胞）。或者，可使用同種異體的T淋巴球（較佳為內因性T細胞受體的表現受到抑制或排除的同種異體的T淋巴球）。參照Torikai et al., Blood, 2012 119： 5697-5705。分離（及根據需要活化及/或增殖）後，將編碼本揭示之嵌合受體的多核苷酸（或包含像這樣的多核苷酸的載體），轉導（或電穿孔）至來自患者的T淋巴球及NK細胞，之後使嵌合受體在T淋巴球及NK細胞的細胞表面表現。可在之後投予患者修飾細胞（例如治療用抗體點滴1日後）。
在一面向，提供治療疾病用的本說明書記載之嵌合受體表現細胞、核酸、載體、細胞或組合物之使用。
另一面向為，在哺乳動物治療或預防疾病的方法，包含對有該必要之哺乳動物投予有效量之本說明書揭示的細胞或組合物而成的方法。
包含嵌合受體表現細胞作為有效成分而成的治療藥，可經由皮内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻腔内、動脈内、靜脈内、腫瘤内、或傳入淋巴管，經由非經口投予，例如注射或注入而投予，但投予路徑沒有特別限定。
在更一面向，例如使用病毒載體等，使編碼本揭示之嵌合受體的核酸進入活體內，使該嵌合受體直接表現之方法。病毒載體例如腺病毒，但不限於此。又，不使用病毒載體，經由電穿孔法或直接投予核酸的方法等，使編碼該嵌合受體的核酸直接進入活體內也是可能，透過將以使該嵌合受體分泌表現的方式進行基因改變的細胞投予至活體，也可使該嵌合受體繼續在活體內分泌。
根據本揭示，患者可經由約105 ～1010 以上的細胞/體重公斤（細胞/Kg）的範圍的治療上有效投予量之包含本揭示之嵌合受體的T淋巴球及NK細胞的注入而處置。注入只要是達到所欲的反應、患者顯示耐受性即可，可儘量頻繁且多次、反覆進行。適當的注入用量及時程根據每個患者而異，但對特定患者處置醫師可以決定。典型為，初次投予量注入約106 個細胞/Kg，增加至108 個以上的細胞/Kg。可併用IL-2用於使注入細胞進行注入後增殖。IL-2的量可為約1～5×106 國際單位/體表面積平方公尺。
治療藥作為有效成分，包含表現嵌合受體的細胞而成，也可進一步包含較佳賦形劑。賦形劑的例子包括，含有作為有效成分之本揭示之核酸而成的組合物用的上述藥學上可容許賦形劑、各種細胞培養基、及等張性氯化鈉。
本揭示之醫藥組合物 本揭示更一面向提供醫藥組合物。在一態樣中，本揭示提供包含i）含有編碼本揭示之嵌合受體的多核苷酸或如此的多核苷酸之載體、及ii）藥學上容許的載劑或添加物，之醫藥組合物。
在本揭示之醫藥組合物所使用的適當添加物為此技術領域之人士所周知，例如可包含組織培養基（例如，使細胞離體（ex vivo）存活用）或食鹽水溶液（例如注射患者細胞時）。藥學上容許的添加物的詳細記載可從Remington’s Pharmaceutical Sciences （Mack Pub. Co., N.J. 1991）獲得。
投予本發明之醫藥組合物的疾病只要是該患者對使用的療法顯示敏感性，沒有特別限定。在一實施形態，疾病為癌。在一實施形態，對象為疑似患有癌、或患有癌。
例如，癌為血液癌或固態腫瘤。例如，血癌為白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。例如，固態腫瘤為腺癌、扁平上皮癌、腺體扁平上皮癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頭頸癌、子宮癌、肝癌、腎臓癌、胰臓癌、脾臓癌、肺癌、氣管癌、支氣癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽囊癌、睪丸癌、卵巢癌等的癌，或骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織的癌以外，軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤（Ewing's Sarcoma）、悪性血管内皮細胞瘤、惡性許旺細胞瘤、骨肉瘤、軟部組織肉瘤等的肉瘤，或肝胚細胞瘤、骨髓胚細胞瘤、腎胚細胞瘤、髓母細胞瘤、胰胚細胞瘤、胸膜肺胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤等的胚細胞瘤，或胚胎細胞瘤。
在某實施形態，疾病為發炎性疾病/自體免疫疾病（氣喘、濕疹）、肝炎、及其原因為流行性感冒及HIV等的病毒、細菌、或真菌之感染性疾病、例如結核病、MRSA、VRE、或深層黴菌病。在一實施形態，對象為疑似患有此等發炎性疾病、或患有發炎性疾病。
為了治療而減輕或去除上述疾病之事，經由所欲細胞，和加工的抗原、亦即腫瘤抗原、病毒抗原、或細菌抗原等結合之本揭示之醫藥組合物，為了此等疾病的治療而投予。
因此，一面向為，減少在對象中表現指定抗原的細胞數之方法，包括含有對有此必要的對象投予有效量的本說明書記載的醫藥組合物而成之方法，此處，嵌合受體表現細胞透過和細胞外結合域結合的連接子切斷後的抗原結合分子，和指定的抗原特異性結合。
本揭示之細胞又可提供，以復發性白血病的緩解等為目的，進行骨髓移植或放射線照射、提供者淋巴球輸血後的感染性疾病的預防使用。
本揭示之嵌合受體提供T淋巴球抗體依賴性細胞毒性作用，增強NK細胞中的抗體依賴性細胞毒性作用（ADCC）。受體經由和腫瘤細胞結合的抗體（或包含Fc部分的其他抗腫瘤分子）而結合，誘發T細胞活化、持續增殖及該抗體（或包含Fc部分的其他抗腫瘤分子）對目標的癌細胞的特異性細胞毒性。
本揭示之嵌合受體促進對多樣的癌細胞型使用某1個受體之事成為可能的T細胞治療。考慮腫瘤利用的免疫逃避機制，可為最終有利的戰略，同時多樣的抗原標靶也成為可能（Grupp et al., N. Engl. J. Med. 2013； 368（16）：1509-1518）。抗體媒介的細胞毒性經由抗體投予的單純中止，任何時候使用都能停止。表現本揭示之嵌合受體的T細胞只經由和目標細胞結合的抗體而活化，因此未結合的免疫球蛋白在注入的T細胞內不發揮任何刺激。為了控制有某種可能性的某自體免疫反應，經由一次性表現嵌合受體用的mRNA電穿孔的使用，可更提高臨床上的安全性。
在上述方法的一態樣中，T淋巴球或NK細胞為從該對象分離的自體T淋巴球或NK細胞。在一特定態樣中，在對對象再導入前，離體（ex vivo）使自體T淋巴球或NK細胞活化及/或增殖。在其他態樣中，T淋巴球或NK細胞為同種異體的T淋巴球或NK細胞。在某特定態樣中，T淋巴球為內因性T細胞受體表現受到抑制或排除的同種異體的T淋巴球。在一特定態樣中，在對對象導入前，離體（ex vivo）使同種異體的T淋巴球活化及/或增殖。T淋巴球例如在抗CD3/CD28、IL-2及植物血凝素（phytohaemagglutinin）的存在下，可經由此技術領域已知的任意方法活化。NK細胞在選自CD137配體蛋白質、CD137抗體、IL-15蛋白質、IL-15受體抗體、IL-2蛋白質、IL-12蛋白質、IL-21蛋白質及K562細胞株所組成的群組的1個以上的藥劑存在下，可經由此技術領域已知的任意方法活化。例如增殖NK細胞的有效方法之記載，參考美國專利第7,435,596號及第8,026,097號。
在上述方法一態樣中，對對象導入T淋巴球或NK細胞（或再導入）之後，接著投予對象PD-1/PD-L1訊息抑制劑及/或VEGF訊息抑制劑之治療有效量。
本揭示之組合的處置 本說明書記載之組合物及方法可利用和如化學療法、外科手術、放射線、基因治療等的癌的其他型態的治療組合。如此的治療可和根據本揭示的免疫療法同時或逐次（以任意順序）的適用。
再進一步和治療劑併用時，各藥劑的適當的治療上有效投予量可因相加或加成作用而減少。
可將本揭示之處置和例如治療用疫苗（包含GVAX、DC疫苗等，但不限於此）、檢查點抑制劑（包含阻斷CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的藥劑，但不限於此）或激活因子（包含增強41BB、OX40等的藥劑，但不限於此）的其他免疫調節處置組合。
本揭示之醫藥組合物，根據處置的指定適應症，有必要的話，也可包含1個以上附加的活性化合物，較佳為互相沒有負影響、具有補充的活性者。可能附加的活性化合物的非限定例包含例如PD-1/PD-L1訊息抑制劑及VEGF訊息抑制劑。
在其他態樣中，本揭示之醫藥組合物更包含對癌細胞可發揮細胞毒性的單株抗體（例如，Rituximab、 ‎Trastuzumab、hu14.18K322A等）或包含Fc部分的其他抗腫瘤分子（例如由和免疫球蛋白的Fc部分或含有Fc的DNA或RNA組合、和腫瘤表面受體結合的配體（例如細胞激素、免疫細胞受體）所形成的混合分子）。
使用的抗體的適當投予量，根據處置的癌種類、疾病的嚴重度及經過、先前的治療、患者的臨床歷史及對抗體的反應及處置醫師的裁量。以一次或連續複數次處置，對患者投予抗體。根據本揭示之治療的進行可根據習知技術及分析容易監控。
抗體的投予包含全身投予及對疾病部位（例如原發性腫瘤）的直接投予，可經由任意的適當路徑實施。
和本揭示之免疫療法組合的有效的其他治療劑的限定例包含下述者。 （i）抗血管生成劑（例如TNP-470、血小板因子4、血小板反應素-1（thrombospondin-1）、基質金屬蛋白酶抑制物質（TIMP1及TIMP2）、泌乳素（16Kd片段）、血管抑制素（angiostatin）（纖維蛋白溶酶原（plasminogen）的38Kd片段）、內皮抑制素（endostatin）、bFGF可溶性受體、轉形生長因子β（transforming growth factor β）、干擾素α、可溶性KDR及FLT-1受體、胎盤的增殖蛋白（proliferin）相關蛋白以及Carmelie及Jain（2000）所記載者； （ii） 抗VEGF抗體、VEGF變異體、可溶性VEGF受體片段、VEGF或VEGFR可阻斷的適體（aptamer）、中和抗VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶的抑制劑及這些的任意組合的VEGF拮抗劑或VEGF受體拮抗劑； （iii）例如，嘧啶類似物（5-氟尿嘧啶、Floxuridine、凱希得平（Capecitabine）、吉西他濱（Gemcitabine）、及阿拉伯糖基胞嘧啶（Cytarabine））、嘌呤類似物、如葉酸拮抗劑及相關抑制劑（巰嘌呤（mercaptopurine）、硫鳥嘌呤（thioguanine）、Pentostatin、及2-氯去氧腺苷（‎Cladribine））之化療化合物；包含如長春花生物鹼（Vinca alkaloid）（長春花鹼（Vinblastine）、長春新鹼（Vincristine）及溫諾平（Vinorelbine））之天然產物、如紫杉烷（Taxane）（紫杉醇（Paclitaxel）、歐洲紫杉醇（Docetaxel）、長春新鹼、長春花鹼、諾考達唑（Nocodazole）、Epothilone類及Navelbine的微管攪亂因子、表鬼臼毒素（Epipodophyllotoxin）（依妥普賽（ Etoposide）、坦尼坡賽（Teniposide））、DNA傷害劑（放線菌素（Actinomycin）、Amsacrine、蒽環類（Anthracyclines）、博來黴素（Bleomycin）、二甲磺酸丁酯（Busulfan）、喜樹鹼（Camptothecin）、卡鉑定（Carboplatin）、氮芥苯丁酸（Chlorambucil）、順鉑（Cisplatin）、環磷醯胺（Cyclophosphamide）、環磷醯胺（商品名）（Cytoxan）、放線菌素（Dactinomycin）、道諾魯比辛（Daunorubicin）、阿黴素（doxorubicin）、泛艾黴素（Epirubicin）、六甲基三聚氰胺（Hexamethylmelamine）、奧沙利鉑（Oxaliplatin）、依弗邁（Ifosfamide）、氮芥苯丙胺酸（Melphalan）、甲氮芥（Mechlorethamine）、絲裂黴素（Mitomycin）、邁杜蔥酮（Mitoxantrone）、亞硝脲（nitrosourea）、Plicamycin、Procarbazine、紫杉醇（Taxol）、Taxotere、坦尼坡賽（Teniposide）、三乙烯硫代磷醯胺（triethylene thiophosphoramide）及依妥普賽（Etoposide）（VP16））的抗增殖性/有絲分裂抑制劑；如放線菌素（放線菌黴素（Actinomycin） D）、道諾魯比辛、Doxorubicin（Adriamycin）、艾達魯比辛（Idarubicin）、蒽環類（Anthracyclines）、邁杜蔥酮、博來黴素類、Plicamycin（Mithramycin）及絲裂黴素（Mitomycin）之抗生素；酵素（全身性代謝L-天冬醯胺、沒有能力自體合成天冬醯胺的細胞以外的L-天冬醯胺酶）；抗血小板劑；氮芥子氣類（nitrogen mustards）（甲氮芥（mechlorethamine）、環磷醯胺（cyclophosphamide）及類似物、氮芥苯丙胺酸、氮芥苯丁酸）、伸乙亞胺（ethylenimine）類及甲基三聚氰胺類（六甲基三聚氰胺及沙奧特帕（Thiotepa））、烷基磺酸類-二甲磺酸丁酯（alkyl sulfonates-Busulfan）、亞硝脲（nitrosourea）類（Carmustine（BCNU）及類似物、鏈球黴素（Streptozocin））、如Trazenta類-Dacarbazine（DTIC）的抗增殖性/抗有絲分裂烷化劑；如葉酸類似物（胺甲喋呤（Methotrexate）） 的抗增殖性/抗有絲分裂代謝拮抗劑；鉑配位錯合物類（順鉑（Cisplatin）、卡鉑定（Carboplatin））、Procarbazine、羥基尿素、Mitotane、Aminoglutethimide；賀爾蒙類、賀爾蒙類似物（雌激素、泰莫西芬（Tamoxifen）、Goserelin、Bicalutamide、Nilutamide）及芳香化酶抑制劑（aromatase inhibition）（利妥唑（Letrozole）、阿那曲唑（Anastrozole））；抗凝血劑（肝素、合成的肝素鹽類及其他的凝血酶（Thrombin）抑制劑）；纖維素溶解劑（例如組織纖維蛋白溶酶原活化因子（tissue plasminogen activator）、鏈激酶（Streptokinase）、及尿激酶（Urokinase））、阿斯匹林（Aspirin）、二吡待摩（Dipyridamole）、梯可匹定（Ticlopidine）、克洛平格（Clopidogrel）、Abciximab；抗趨化劑；抗分泌劑（Brefeldin）；免疫抑制劑（環孢素（Cyclosporin）、他克莫司（Tacrolimus）（FK-506）、西羅莫司（Sirolimus）（Rapamycin）、硫唑嘌呤（Azathioprine）、黴菌酚酸（Mycophenolate mofetil））；抗血管生成化合物（例如TNP-470、金雀異黃酮（Genistein）、貝伐單抗（Bevacizumab））及增殖因子抑制劑（例如纖維母細胞生長因子（FGF）抑制劑）；血管收縮素（angiotensin）受體阻斷劑；一氧化氮提供者；反股（anti-sense）寡核苷酸；抗體（‎Trastuzumab）；細胞週期抑制劑及分化誘導因子（Tretinoin）；mTOR抑制劑、拓撲異構酶（topoisomerase）抑制劑（Doxorubicin（Adriamycin）、Amsacrine、喜樹鹼（Camptothecin）、道諾魯比辛、放線菌素、坦尼坡賽、泛艾黴素、依妥普賽、艾達魯比辛及邁杜蔥酮、拓普替康（Topotecan）、伊立替康（Irinotecan））、皮質類固醇（可體松（Cortisone）、地塞米松（Dexamethasone）、氫化可體松（Hydrocortisone）、Methylprednisolone、強體松（Prednisone）及Prednisolone）；增殖因子訊息轉導激酶抑制劑；粒線體功能不全誘導因子及凋亡蛋白酶活化因子（caspase activator） ；以及染色質攪亂因子。
更有效的藥劑之例參照Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, （2005）, Thomson P D R, Montvale N.J.； Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, （2000）, Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.； Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, （2001）, McGraw Hill, NY； Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, （1992）, Merck Research Laboratories, Rahway N.J。
上述揭示整體地說明本申請案。可參照下列具體例更完全的了解。這些例子僅僅只是為了舉例而記載，非限定本申請案的範圍。如果暗示或顯示狀況合適者，也企圖有型態的變化及等價物的置換。在本揭示雖使用特定用語，但如此用語是意圖記載的意義，並非以限定為目的。 又，本說明書中所引用之全部先前技術文獻，作為參考併入本說明書中。 ［實施例］
以下藉由實施例更詳細說明本發明，但這些實施例非限制本發明之範圍者。
［實施例1］利用在病變部位特異性被切斷的抗體及辨識該切斷的抗體之抗體技術的概念 透過提供抗體對在如癌組織或發炎組織的病變部位表現增加的蛋白酶的敏感性，使組織特異性及治療劑量區間（therapeutic window）擴大的已知抗體技術（Probody（註冊商標）），如圖1所示。Probody（註冊商標）為連結抗體、覆蓋抗體的抗原結合部位的覆蓋胜肽（mask peptide）及以在病變部位表現的蛋白酶被切斷的胜肽序列之分子（Sci Transl Med. 2013 Oct 16；5（207）：207ra144）。抗體的抗原結合部位因胜肽序列為未切斷的狀態而被覆蓋胜肽所覆蓋，無法和抗原結合。透過Probody（註冊商標）的切斷胜肽序列經由在目標的病態部位表現的蛋白酶而被切斷，使覆蓋胜肽解離，生成有抗原結合活性的抗體分子，而可和目標的病態組織特異性抗原結合。另一方面，Probody（註冊商標）有國際專利公開案WO2018/097307、WO2018/097308中顯示的問題點。為了解決這些課題，提議使經蛋白酶而生成的活化抗體的血中半衰期縮短、當因蛋白酶的切斷不發生時則藥理作用完全不發揮的分子群、且有廣用性的分子群（圖2～圖5）。
這些分子群的製作方法，首先，獲得和標靶抗原結合的抗體（初級分子、抗原結合分子），以及T細胞重定向抗體及透過ADCC活性的抗體或嵌合受體等的使效應細胞活化的次級分子的2種分子群。和插入具有經病變部位特異性蛋白酶而被切斷的序列的蛋白酶切斷的連接子之標靶抗原結合的抗體，作為初級分子使用。另一方面，對使效應細胞活化的抗體或嵌合受體（次級分子），提供對經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子的結合能力。這2種分子在連接子未切斷的情況下，彼此不結合。因此，在正常組織中，效應細胞和標靶抗原不進行交聯，不發生活化。另一方面，連接子經蛋白酶而被切斷，則連接子被切斷的抗原結合分子和次級分子結合，形成複合體。複合體當抗原存在時，標靶抗原和效應細胞之間形成交聯，使效應細胞活化。經蛋白酶而被切斷的初級分子可為融合VHH等的單域抗體之變異抗體（例如類IgG抗體分子或重鏈抗體等），也可為插入切斷連接子的IgG抗體。又，次級分子和連接子被切斷的抗原結合分子的結合，可辨識因切斷而產生的胜肽末端，經切斷而露出的連接子也可為被切斷的抗原結合分子的分子交界面。此方式的應用例，考量依賴在病變部位高度表現的蛋白酶及標靶抗原雙方而發揮ADCC或TDCC活性的抗體、CAR-T細胞、ADC（抗體藥物共軛物；Antibody drug conjugate）、免疫細胞激素、溶瘤病毒 （Oncolytic virus）或基因治療用的病毒載體等的療法。
本發明中，在抗原結合分子為抗體或類IgG抗體分子的情形時，經蛋白酶切斷前的抗原結合分子有長的血中滯留性。另一方面，經由連接子的切斷，去除Fc，透過Fc-FcRn的交互作用的補救機制受到抑制，則連接子被切斷的抗原結合分子被快速代謝。實際上，相對於全長IgG的血中半衰期，抗體片段（Fab）的半衰期為一半以下（Toxicol Pathol 1999 Sep-Oct （5）： 536-44.），VHH的血中半衰期為80分（Br J Pharmacol. 2010 Jun；160（4）：1016-28）。因此，連接子被切斷的抗原結合分子滯留，和在正常組織表現的抗原作用，使效應細胞活化的可能性降低。又，對於未切斷的初級分子，不和進行效應細胞活化的次級分子結合，即使在高濃度投予時也沒有產生副作用的疑慮。
［實施例2］具有蛋白酶切斷連接子的抗體及和該抗體的連接子被切斷的抗原結合分子結合的抗體之調製 （2-1）插入經蛋白酶而被切斷的連接子之抗體的表現及純化 編碼插入經蛋白酶而被切斷的連接子的抗體的鹼基，使用編碼該連接子的引子以公知方法製作。更具體為，製作在編碼部分或全長的切斷連接子的DNA序列加上插入切斷連接子的抗體的部分序列的3’方向和5’方向的PCR引子，再以插入蛋白酶切斷連接子的抗體的鹼基序列為鑄模，在DNA的5’側及3’側進行PCR。接著，利用In-Fusion（註冊商標）HD Cloning Kit（Clontec）等，將所得的PCR產物插入公知的表現載體。以此技術領域之人士指定方法培養來自人類胎兒腎細胞的FreeStyle 293-F株或Expi293株（Invitrogen），經脂轉染法（lipofection）導入編碼上述鹼基序列的質體。在CO2 培養箱（37℃、8%CO2 , 90 rpm）培養4天，使用rProtein A SepharoseTM Fast Flow（Amersham Biosciences）以此技術領域之人士公知方法，從培養上清液純化含有Fc區的抗體。使用分光光度計，測量純化的抗體溶液在280nm的吸光度。使用從所得的測量值以PACE法算出的吸光係數，計算出純化後的抗體濃度（Protein Science （1995） 4, 2411-2423）。
（2-2）經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子及人類CD3特異性結合的雙特異性抗體的表現及純化 製作和經MMP13等而被切斷的第II型膠原蛋白的胜肽末端結合的抗體臂（WO2011/034128）20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT，使組合輕鏈可變區20A10L（序列識別號728）及輕鏈恆定區k0MT （序列識別號729）的輕鏈20A10L-k0MT、對組合重鏈可變區20A10H（序列識別號726）及重鏈恆定區F760nN17（序列識別號727）的重鏈20A10H-F760nN17共同表現。
製作和經IdeS而被切斷的人類IgG1胜肽末端結合的抗體臂（WO2012/067624）20952H-F760nN17/20952L-k0MTC，使組合輕鏈可變區20952L（序列識別號731）及輕鏈恆定區k0MTC（序列識別號746）的輕鏈20952L-k0MTC、對組合重鏈可變區20952H （序列識別號730）及重鏈恆定區F760nN17（序列識別號727）的重鏈20952H-F760nN17共同表現。
再者，製作抗人類CD3抗體臂TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，使組合輕鏈可變區L0011（序列識別號734）及輕鏈恆定區k0a（序列識別號729）的輕鏈L0011-k0a、對組合重鏈可變區TR01H113 （序列識別號732）及重鏈恆定區F760nP17 （序列識別號733）的重鏈TR01H113-F760nP17共同表現。這些抗體臂的恆定區域F760nN17及F760nN17降低對Fcγ受體的結合，使用加入變異的恆定區使2個重鏈異源締合化。
20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT、20952H-F760nN17/20952L-k0MTC、TR01H113-F760nP17/L0011-k0a分別以實施例3-2所示方法表現、純化。各抗體以利用恆定區的電荷不同之此技術領域之人士公知方法（Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013）予以混合，製作對於經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子及人類CD3的雙特異性抗體（分別為20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a、20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a、H000-F760nN17/GL4-k0a//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a）。
又，本說明書中的抗體依下列規則命名。（重鏈可變區）- （重鏈恆定區）/（輕鏈可變區）-（輕鏈恆定區）。例如，所謂20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT的抗體名，表示本抗體的重鏈可變區為20A10H、重鏈恆定區為F760nN17、輕鏈可變區為20A10L、輕鏈恆定區為k0MT。又，由2種不同的抗體所構成的異源締合體在構成異源締合體的各抗體名之間插入//來表示。例如，20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a表示，包含一抗體臂包含20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT及另一抗體臂包含TR01H113-F760nP17/L0011-k0a之抗體。
（2-3） 和經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的ADCC活性增強抗體的表現及純化 製作辨識經MMP13等而被切斷的第II型膠原蛋白的胜肽末端的抗體20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT，使組合輕鏈可變區20A10L（序列識別號728）及輕鏈恆定區k0MT （序列識別號729）的輕鏈20A10L-k0MT、對組合重鏈可變區20A10H（序列識別號726）及重鏈恆定區Kn125 （序列識別號735）的重鏈20A10H-Kn125、及組合重鏈可變區20A10H（序列識別號726）及重鏈恆定區Hl076 （序列識別號736）的重鏈20A10H- Hl076共同表現。
製作辨識經IdeS而被切斷的人類IgG1胜肽末端的抗體20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC，使組合輕鏈可變區20952L（序列識別號731）及輕鏈恆定區k0MTC（序列識別號746）的輕鏈20952L-k0MTC、對組合重鏈可變區20952H （序列識別號730）及重鏈恆定區Hl076.G236E （序列識別號737）的重鏈20952H-F760nN17、及組合重鏈可變區20952H （序列識別號730）及重鏈恆定區Kn125 （序列識別號735）的重鏈20952H- Kn125共同表現。
編碼這些抗體的基因分別插入動物表現用質體，以（2-1）記載的方法表現及純化。這些抗體增強對人類FcγRIIIa的結合。
以下顯示製作的抗體結構的表。 ［表1］
抗體名 重鏈序列 輕鏈序列
可變區 恆定區 可變區 恆定區
20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT 序列識別號 726 序列識別號 727 序列識別號 728 序列識別號 729
20952H-F760nN17/20952L-k0MTC 序列識別號 730 序列識別號 727 序列識別號 731 序列識別號 746
TR01H113-F760nP17/L0011-k0 序列識別號 732 序列識別號 733 序列識別號 734 序列識別號 729
20A10H-Kn125/20A10L-k0MT 序列識別號 726 序列識別號 735 序列識別號 728 序列識別號 729
20A10H-Hl076/20A10L-k0MT 序列識別號 726 序列識別號 736 序列識別號 728 序列識別號 729
20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC 序列識別號 730 序列識別號 737 序列識別號 731 序列識別號 746
20952H-Kn125/20952L-k0MTC 序列識別號 730 序列識別號 735 序列識別號 731 序列識別號 746
［實施例3］經蛋白酶而被切斷的抗體在體外（in vitro）的切斷評估 （3-1）含有經蛋白酶而被切斷的連接子的抗體經重組蛋白酶的切斷評估 製作對插入經MMP而被切斷的連接子（第II型膠原蛋白的部分）的人類GPC3的人類IgG1抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a，使組合輕鏈可變區GL4（序列識別號740）及輕鏈恆定區k0a（序列識別號729）的輕鏈GL4-k0a、對重鏈可變區H0000 （序列識別號738）分別組合重鏈恆定區LK4.col2.LK4.G1T4 （序列識別號739）或LK4.col2.LK4.G1T0 （序列識別號745）的重鏈分別為H0000-LK4.col2.LK4.G1T4或H0000-LK4.col2.LK4.G1T0共同表現。
製作對不具有經MMP而被切斷的連接子的人類GPC3之人類IgG1抗體H0000-G1T4/GL4-k0a或H0000-G1T0/GL4-k0a，使組合輕鏈可變區GL4（序列識別號730）及輕鏈恆定區k0a（序列識別號729）組合的輕鏈GL4-k0a、對重鏈可變區H0000 （序列識別號738）組合重鏈恆定區G1T4 （序列識別號741）或重鏈恆定區G1T0 （序列識別號742）的重鏈分別為H0000- G1T4或重鏈H0000-G1T0共同表現。
H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a以實施例2-1的方法表現、純化。懸浮在TCNB（50 mM Tris，10 mM CaCl2 ，150 mM NaCl，0.05% Brij-35 （w/v）, pH 7.5）中的0.27mg/ml的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a，經由在含有1mM APMA的TCNB中、37℃活化2小時的終濃度為38nM的重組MMP13（R&amp；D systems，511-MM-010），在37℃處理20小時。處理後的抗體經還原SDS-PAGE展開，分析經MMP13的切斷。確認在H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a出現因MMP13切斷的帶（band），但在H0000-G1T4/GL4-k0a則未發現切斷（圖7）。此結果顯示，經蛋白酶的抗體的切斷是蛋白酶切斷連接子依賴性發生。
製作經IdeS而被切斷的抗人類GPC3的人類IgG1抗體H0000-G1T3/GL4-k0a，使組合輕鏈可變區GL4（序列識別號740）及輕鏈恆定區k0a（序列識別號729）的輕鏈GL4-k0a、對組合重鏈可變區H0000 （序列識別號738）及重鏈恆定區G1T3 （序列識別號743）的重鏈H0000-G1T3共同表現。
製作經IdeS不被切斷的抗人類GPC3的人類IgG1抗體H0000-dGG1T3/GL4-k0a，使組合輕鏈可變區GL4（序列識別號740）及輕鏈恆定區k0a（序列識別號729）的輕鏈GL4-k0a、對組合重鏈可變區H0000 （序列識別號738）及重鏈恆定區dGG1T3 （序列識別號744）的重鏈H0000-dGG1T3共同表現。
對在PBS中以0.27mg/ml懸浮的H0000-G1T3/GL4-k0a或H0000-dGG1T3/GL4-k0a，添加終濃度為0.1EU/μl的重組IdeS（Promega，V7511），在37℃處理0或20小時。蛋白酶處理後的抗體經還原SDS-PAGE展開，分析經IdeS的切斷（圖8）。發現在H0000-G1T3/GL4-k0a出現因IdeS切斷的帶。另一方面，在不含IdeS切點的H0000-dGG1T3/GL4-k0a未發現帶。此結果顯示，經蛋白酶的抗體的切斷是蛋白酶切斷連接子依賴性發生。
以下顯示提供確認經蛋白酶的切斷的試驗之抗體結構的表。 ［表2］
抗體名 重鏈序列 輕鏈序列
可變區 恆定區 可變區 恆定區
H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  739 序列識別號  740 序列識別號  729
H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  745 序列識別號  740 序列識別號  729
H0000-G1T4/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  741 序列識別號  740 序列識別號  729
H0000-G1T0/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  742 序列識別號  740 序列識別號  729
H0000-G1T3/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  743 序列識別號  740 序列識別號  729
H0000-dGG1T3/GL4-k0a 序列識別號  738 序列識別號  744 序列識別號  740 序列識別號  729
又，實施例記載的輕鏈恆定區k0a及k0MT為鹼基序列不同的相同胺基酸序列。
［實施例4］ 和經蛋白酶而被切斷的切斷連接子特異性結合的抗體及以蛋白酶切斷的抗體間的結合特異性之評估 （4-1）和經MMP而被切斷的胜肽及人類CD3結合的雙特異性抗體對MMP處理抗體的結合評估 以實施例2記載方法所調製的雙特異性抗體20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，和具有MMP切斷連接子的抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不具有MMP切斷連接子的抗體H0000-G1T4/GL4-k0a的結合評估使用Biacore T200（GE Healthcare）進行。H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a經MMP13的切斷以實施例3記載之方法進行。在感應晶片CM4上以胺偶聯（amine coupling）固定全長抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及其蛋白酶分解產物及作為陰性對照組的H0000-G1T4/GL4-k0a，以20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a作為分析物，以流速20μl/分交互作用180秒，解離180秒，定量其結合量的變化。使用HBS-EP+為泳動緩衝液，在37℃測量。測量結果的分析使用Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare），以1：1連接模式（binding model）的曲線擬合（curve fitting）計算結合速度常數ka （1/Ms）及解離速度常數kd （1/s），基於該值計算解離常數KD （M）。該結果可知，20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0對切斷的H0000-LK4.col2.LK4-G1T4/GL4-k0a結合，但對未切斷的H0000-LK4.col2.LK4-G1T4/GL4-k0a及不含切斷連接子的H0000-G1T4/GL4-k0a不結合（圖10、表3）。
［表3］
Figure 02_image001
（4-2） 和經IdeS而被切斷的胜肽及人類CD3結合的雙特異性抗體的對IdeS處理抗體的結合評估 以實施例2記載方法所調製的雙特異性抗體20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，和具有IdeS切斷連接子的抗體H0000-G1T3/GL4-k0a或不具有IdeS切斷連接子的抗體H0000-dGG1T3/GL4-k0a的結合評估使用Biacore T200（GE Healthcare）進行。H0000-G1T3/GL4-k0a的經IdeS的切斷以實施例3記載之方法進行。在感應晶片CM4上以胺偶聯固定全長抗體H0000-G1T3/GL4-k0a及其蛋白酶分解產物、及作為陰性對照組的H0000-dGG1T3/GL4-k0a，以20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a作為分析物，以流速20μl/分交互作用180秒，解離180秒，定量其結合量的變化。使用HBS-EP+（GE Healthcare）為泳動緩衝液，在37℃測量。測量結果的分析使用Biacore T200 Evaluation Software（GE Healthcare），以1：1連接模式（binding model）的曲線擬合（curve fitting）計算結合速度常數ka （1/Ms）及解離速度常數kd （1/s），基於該值計算解離常數KD （M）。該結果可知，20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a對切斷的H0000-G1T3/GL4-k0a結合，但對未切斷的H0000-G1T3/GL4-k0及不含切斷連接子的H0000-dGG1T3/GL4-k0a不結合（圖11、表4）。
［表4］
Figure 02_image003
（4-3）和經MMP而被切斷的胜肽特異性結合的ADCC增強抗體對MMP處理抗體的結合評估 以實施例2（2-3）記載方法所調製的ADCC增強抗體20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT，和具有MMP切斷連接子的抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不具有MMP切斷連接子的抗體H0000-G1T4/GL4-k0a的結合評估使用Biacore T200（GE Healthcare）進行。作為配體的已切斷抗體的調製以實施例3記載之方法進行。根據Biacore的測量以實施例4（4-1）記載之方法進行。該結果顯示，20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT對已切斷的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a結合，但對未切斷的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及不含切斷連接子的抗體H0000-G1T4/GL4-k0a不結合（圖12、表5）。
［表5］
Figure 02_image005
（4-4）和經IdeS而連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的ADCC增強抗體對IdeS處理抗體的結合評估 以實施例2記載方法所調製的ADCC增強抗體20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC和具有IdeS切斷連接子的H0000-G1T3/GL4-k0a或不具有IdeS切斷連接子的H0000-dGG1T3/GL4-k0a的結合評估使用Biacore T200（GE Healthcare）進行。作為配體的已切斷抗體的調製以實施例3記載之方法進行。根據Biacore的測量以實施例4（4-2）記載之方法進行。該結果顯示，20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC對已切斷的H0000-G1T3/GL4-k0a結合，但對未切斷的H0000-G1T3/GL4-k0a及不含切斷連接子的抗體H0000-dGG1T3/GL4-k0a不結合（圖13、表6）。
［表6］
Figure 02_image007
［實施例5］使用依賴CD3刺激、或FcγR刺激而誘導報導基因表現的Jurkat細胞之報導基因分析 （5-1）報導細胞的培養溶液的調製 將因CD3刺激而表現螢光酵素的Jurkat細胞株GloResponseTM NFAT-RE-luc2 Jurkat Cell Line（Promega）、或因FcγR刺激而表現螢光酵素的Jurkat細胞株ADCC Bioassay Effector Cells （Promega）在培養後，經包含10% FBS（HyClone，SH30070.03）、1mM 丙酮酸鈉（Invitrogen，11360）、MEM非必要胺基酸 （Invitrogen，11140）的RPMI-1640（Gibco，22400）（以下稱為分析緩衝液），以3 ×106 細胞/ml的細胞密度懸浮。該細胞分別稱為NFAT-RE-Luc2-Jurkat或Jurkat-hFcgR-luc，供後續實驗使用。
（5-2）目標細胞的調製 表現腫瘤抗原之人類GPC3的腫瘤細胞株PC-10（股份公司免疫生物研究所）、Hep3B（ATCC）及KYSE70（Health Science Research Resources Bank）或SK-pca-60 （參照EP3296395）以公知方法培養。將該細胞懸浮於分析緩衝液，作為目標細胞，供後續實驗使用。
（5-3）插入蛋白酶切斷連接子的抗體在目標細胞中的切斷評估 實施例5（5-2）所調製的5×106 細胞/ml的PC-10、Hep3B及KYSE70以每25μl 接種於96孔盤（corning）（1.25 ×105 細胞/孔）。接著，將插入經MMP的切斷連接子的人類GPC3抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及未插入的抗體H0000-G1T4/GL4-k0a，以分析緩衝液稀釋至終濃度為1nM，以50uL添加。將盤在37℃、5%CO2 存在下，培養0小時或24小時後，加入樣本緩衝液，作為還原SDS-PAGE的檢體。SDS-PAGE後，經使用羊抗人類IgG HRP （H+L） 共軛物（Invitrogen, cat no. 81-7120）的西方墨點法，檢測檢體中的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a之時，插入經MMP的切斷連接子的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a，發現伴隨著培養細胞中的抗體切斷的帶的出現。另一方面，在未插入切斷連接子的抗體H0000-G1T0/GL4-k0a未發現切斷（圖9）。此結果顯示H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a的切斷的發生是依賴蛋白酶切斷連接子。又，在KYSE70中，幾乎未發現因H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a伴隨著切斷的帶的移動，暗示KYSE70幾乎未切斷H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a。
（5-4）使用辨識具有MMP切斷連接子的抗體及該抗體的切斷產物和CD3的雙特異性抗體之報導基因分析 以NFAT-RE-Luc2-Jurkat細胞在TCR訊息下游被表現控制的螢光酵素的表現，評估因受檢抗體的CD3活化能力。首先，以實施例5（5-2）調製的4×106 細胞/ml 的PC-10、Hep3B及KYSE70以每孔接種25μl 接種於96孔平底盤（Coster, 3917）（1 ×105 細胞/孔）。接著，添加使用分析緩衝液調製成各濃度的含有MMP切斷連接子的抗人類GPC3抗體溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0或不含MMP切斷連接子的抗人類GPC3抗體H0000-G1T0/GL4-k0。接著，添加以分析緩衝液稀釋至終濃度為10nM的抗切斷連接子抗體//抗人類CD3雙特異性抗體20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760ｎP17/L0011-k0a。再添加實施例5（5-1）調製的NFAT-RE-Luc2-Jurkat溶液各25μl（7.5×104 細胞/孔）。將該盤在5%二氧化碳氣體培養箱中37℃靜置一晚，反應後添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液（Promega）75μl。以盤式分析儀（EnVision，PerkinElmer）定量因螢光酵素的發光。盤式分析儀的定量值以未添加受檢抗體的情況的測量值進行校正。結果確認，在具有使H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0切斷的蛋白酶活性的PC-10及Hep3B中，添加H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a和20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760ｎP17/L0011-k0a，則NFAT-RE-Luc2-Jurkat細胞活化，另一方面，在添加H0000-G1T0/GL4-k0a和20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的情形，或者在不具有使H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a切斷的蛋白酶活性的KYSE70中， 未確認到NFAT-RE-Luc2-Jurkat細胞的活化（圖14）。由此結果暗示，依賴經蛋白酶而被切斷的H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a而誘導TDCC活性。
（5-5）使用具有IdeS切斷連接子的抗體及和該抗體的連接子被切斷的抗原結合分子及CD3結合的雙特異性抗體之報導基因分析 以NFAT-RE-Luc2-Jurkat細胞在TCR訊息下游被表現控制的螢光酵素的表現，評估因受檢抗體的CD3活化能力。又IdeS為來自放射菌的蛋白酶，因為沒有表現IdeS的哺乳動物細胞，所以將蛋白酶添加於反應溶液。首先，以實施例（5-2）調製的5×105 細胞/ml的SK-pca60以每孔接種25μl 接種於96孔平底盤（Coster，3917）（1.25 ×104 細胞/孔）。接著，含有IdeS切斷連接子的抗人類GPC3抗體溶液H0000-G1T3/GL4-k0a或不含IdeS切斷連接子的抗人類GPC3抗體H0000-dGG1T3/GL4-k0a，使用分析緩衝液調製成各濃度，各添加12.5μl。接著，含有終濃度為10nM的抗切斷連接子抗體//抗人類CD3雙特異性抗體20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a及終濃度為0.2U/μl的IdeS的分析緩衝液，各添加12.5μl。再添加實施例5（5-1）調製的NFAT-RE-Luc2-Jurkat溶液各25μl（7.5×104 細胞/孔）。將該盤在5%二氧化碳氣體培養箱中37℃靜置一晚。反應後，添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液（Promega）75μl，以盤式分析儀（EnVision，PerkinElmer）定量因螢光酵素的發光。盤式分析儀的定量值以未添加受檢抗體的情況的測量值進行校正。結果確認，在添加經IdeS而被切斷的抗體H0000-G1T3/GL4-k0a及20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的細胞懸浮液，Jurkat細胞活化，但在添加不被IdeS切斷的H0000-dGG1T3/GL4-k0a及20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的情形，未發現NFAT-RE-Luc2-Jurkat細胞的反應（圖15）。由此結果暗示，依賴經IdeS而被切斷的H0000-G1T3/GL4-k0a而誘導TDCC活性。
（5-6） 使用和具有MMP13切斷連接子的抗體及和該抗體的連接子被切斷的抗原結合分子結合的ADCC活性增強抗體之報導基因分析 以Jurkat-hFcgR-luc細胞在FcγR訊息下游被表現控制的螢光酵素的表現，評估經受檢抗體的FcγR活化能力。首先，以實施例5（5-2）調製的3×106 細胞/ml 的目標細胞PC-10、Hep3B、KYSE70以每孔接種25μl 接種於96孔平底盤（Coster，3917）（7.5 ×104 細胞/孔）。接著，使用分析緩衝液調製成各濃度的含有MMP13切斷連接子的抗人類GPC3抗體溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含MMP13切斷連接子的抗人類GPC3抗體H0000-G1T4/GL4-k0a添加12.5μl。接著，以分析緩衝液稀釋至終濃度為3nM的和連接子被切斷的抗原結合分子結合的ADCC增強抗體20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT添加12.5μl。再添加實施例5（5-1）調製的Jurkat-hFcgR-luc溶液各25μl（7.5×104 細胞/孔）。將該盤在5%二氧化碳氣體培養箱中37℃靜置一晚，反應後添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液（Promega）75μl，以盤式分析儀（EnVision，PerkinElmer）定量因螢光酵素的發光。盤式分析儀的定量值以未添加受檢抗體的情況的測量值進行校正。結果顯示，在添加經MMP13而被切斷的抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT的細胞懸浮液中，Jurkat細胞的活化被確認，但在添加不被MMP切斷的H0000-G1T4/GL4-k0a及20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_Hl076/20A10L-k0MT的情形，未發現Jurkat-hFcgR-luc細胞的反應（圖16）。由此結果暗示，依賴經MMP13而被切斷的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a而誘導ADCC活性。
（5-7） 使用和具有IdeS切斷連接子的抗體及和該抗體的連接子被切斷的抗原結合分子結合的ADCC活性增強抗體之報導基因分析 以Jurkat-hFcgR-luc細胞在FcγR訊息下游被表現控制的螢光酵素的表現，評估經受檢抗體的FcγR活化能力。又IdeS為來自放射菌的蛋白酶，因為沒有表現IdeS的哺乳動物細胞，所以將蛋白酶添加於反應溶液。首先，以實施例5（5-2）調製的目標細胞SK-pca60以細胞密度為2.5×104 細胞/ml懸浮，在96孔平底盤（Coster，3917）每孔接種25μl 接種（2.5 ×105 細胞/孔）。接著，含有IdeS切斷連接子的抗人類GPC3抗體溶液H0000-G1T3/GL4-k0a或不含IdeS切斷連接子的抗人類GPC3抗體H0000-dGG1T3/GL4-k0a，使用分析緩衝液調製成各濃度，各添加12.5μl。接著，含有稀釋成終濃度為0.5nM的ADCC增強抗體20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MT的分析緩衝液，各添加12.5μl。再添加實施例5（5-1）調製的Jurkat-hFcgR-luc溶液各25μl（7.5×104 細胞/孔）。添加IdeS終濃度為0.033U/μl。將該盤在5%二氧化碳氣體培養箱中37℃靜置一晚。反應後，添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液（Promega）75μl，以盤式分析儀（EnVision，PerkinElmer）定量因螢光酵素的發光。盤式分析儀的定量值以未添加受檢抗體的情況的測量值進行校正。結果為，在添加經IdeS而被切斷的抗體H0000-G1T3/GL4-k0a及20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC的細胞懸浮液， Jurkat-hFcgR-luc細胞的活化被確認，但在添加不被IdeS切斷的H0000-dGG1T3/GL4-k0a及20952H-Hl076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC的情形，未發現ADCC生物分析效應細胞（ADCC Bioassay Effector cell）的反應（圖17）。由此結果暗示，依賴經IdeS而被切斷的H0000-G1T3/GL4-k0a而誘導ADCC活性。
［實施例6］ 使用具有MMP13切斷連接子的抗體及已切斷的該抗體及人類CD3雙特異性抗體在活體外（in vitro）的細胞毒性的確認 對健康人提供者進行肝素採血，在PBS （nacalai#14249-95）稀釋後，疊層於Ficoll-Paque Plus （GE healthcare）。以1000g離心30分鐘，分離周邊血液單核球（PBMC）的分層。所得的PBMC在RPMI 1640（Sigma R8758）+10% FBS（Sigma 172012-500ML）（培養基）調製。使用培養基調製成各濃度的含有MMP切斷連接子的抗人類GPC3抗體溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含切斷連接子的抗人類GPC3抗體H0000-G1T4/GL4-k0a，添加於96孔圓底盤（Corning），再添加稀釋成終濃度10nM的雙特異性抗體20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a。以實施例5（5-2）記載之方法調製的PC-10作為目標細胞，接種成1×105 細胞/孔。添加調製的PBMC成2×105 細胞/孔。在37℃、5%CO2 培養該盤。24小時後，使用Pierce LDH 細胞毒性分析套組（Thermo fisher scientific，88954），根據此技術領域之人士指定方法定量LDH量。結果顯示，在添加插入MMP13切斷連接子的抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a的檢體中，發現添加的抗體濃度依賴性的LDH的釋放，但在添加不具有MMP13切斷連接子的抗體H0000-G1T4/GL4-k0a的檢體中，未發現LDH的釋放。根據本討論，可知對表現腫瘤特異性蛋白酶的人類腫瘤細胞，顯示特異性細胞毒性。由此結果可期待，針對連接子被切斷的抗原結合分子和CD3的雙特異性抗體，即使在人體內也能發揮腫瘤特異性細胞毒性（圖18）。
［實施例7］作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子VHH被釋放的抗體藥物的製作 對標靶抗原顯示結合性的VHH可從駱駝科動物的PBMC等所製作的資料庫的篩選等，根據此技術領域之人士公知方法而獲得，根據WO/2018/097307、WO/2018/097308所示方法，使序列識別號1～725的蛋白酶切斷連接子的其中一個和人類IgG基因的部分序列進行基因融合。將所製作的鹼基序列插入哺乳動物細胞用表現載體，根據實施例2-1之方法，使具有標靶抗原結合活性的VHH之蛋白酶依賴性游離的抗體藥物表現、純化。
［實施例8］ 作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子的VHH被釋放的抗體藥物之、和連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合之抗體的取得 （8-1）和蛋白酶切斷連接子的切點特異性結合之抗體的取得 WO2018/097307及WO2018/097308所示之蛋白酶切斷連接子（序列識別號1～725）任一個（和實施例7所選擇的序列相同的序列）及該胜肽的連接子被切斷的抗原結合分子，胜肽的合成等以此技術領域之人士公知方法調製，為和KLH等的共軛物，以此技術領域之人士公知方法使兔免疫。從已免疫的兔血液或脾臟採集的細胞懸浮液，使用autoMACS Pro Separator和FACSAria（BD），篩選出具有和連接子被切斷的抗原結合分子的結合活性的候選細胞。接著，在細胞的培養上清液所分泌的抗體是否具有和連接子被切斷的抗原結合分子的結合活性，以ELISA評估。ELISA中，反應值超過對照值的檢體，挑選為和連接子被切斷的抗原結合分子結合的抗體（正向選擇）。另一方面，被選出的該抗體不和未切斷的胜肽序列結合者，從對未經蛋白酶處理的蛋白酶切斷連接子不結合者中篩選（負向選擇）。經由一連串的篩選，取得和連接子被切斷的抗原結合分子結合、和未切斷的蛋白酶切斷胜肽不結合的抗體。
（8-2） 和經蛋白酶切斷的連接子被切斷的抗原結合分子之VHH特異性結合的抗體之取得 將實施例7所獲得的、對標靶抗原具有結合性的VHH作為免疫原，以此技術領域之人士公知方法使兔免疫。從已免疫的兔血液或脾臟採集的細胞懸浮液，使用autoMACS Pro Separator和FACSAria（BD），篩選對VHH具有結合活性的候選細胞。接著，在細胞的培養上清液所分泌的抗體是否對連接子被切斷的抗原結合分子之VHH具有結合活性，以ELISA評估。ELISA中，反應值超過對照值的檢體，選為和VHH結合的抗體（正向選擇）。另一方面，被選出的該抗體無法辨識非游離的VHH者，從實施例7所調製的、對未經蛋白酶處理的抗標靶抗原VHH-蛋白酶切斷連接子-人類IgG融合蛋白不結合者篩選（負向選擇）。經由一連串的篩選，取得和經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子之VHH結合、和非游離的VHH不結合的抗體。
（8-3） 和經蛋白酶切斷的連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的抗體之製作 從表現實施例8-1或實施例8-2所獲得的抗體的B細胞，使用PCR取得重鏈可變區基因及輕鏈可變區基因。獲得的可變區基因以PCR等的此技術領域之人士公知方法，使人類IgG1重鏈恆定區、及人類輕鏈恆定區組合而表現、人源化，根據實施例2-1的方法表現、純化。對人類CD3及連接子被切斷的抗原結合分子的雙特異性抗體或辨識連接子被切斷的抗原結合分子的ADCC增強抗體，分別根據實施例2-2及實施例2-3記載之方法調製。
［實施例9］使用作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷的抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物和辨識該分子的連接子被切斷的抗原結合分子及人類CD3的雙特異性抗體的報導基因分析 使用實施例8所調製的對人類CD3及切斷的胜肽序列的雙特異性抗體，及實施例7所調製的作為連接子被切斷的抗原結合分子、蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物作為受檢檢體，確認受檢檢體的蛋白酶活性依賴的CD3活化能力。受檢檢體的報導基因分析根據實施例5-4記載之方法進行。對於表現蛋白酶及標靶抗原的目標細胞，添加作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷的抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物。檢體分子經蛋白酶而被切斷，連接子被切斷的抗原結合分子之VHH游離，和目標細胞結合。接著，經由辨識連接子被切斷的抗原結合分子及人類CD3的雙特異性抗體，透過連接子被切斷的抗原結合分子，使目標細胞和效應細胞的CD3交聯。此處，誘導效應細胞的螢光酵素表現，透過監視該螢光酵素的表現，確認效應細胞的活化。
［實施例10］使用作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物和特異性辨識從該分子游離的標靶抗原結合分子的ADCC活性增強抗體的報導基因分析 使用實施例8所調製的對切斷的胜肽序列的ADCC增強抗體，及實施例7所調製的作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷的抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物作為受檢檢體，確認受檢檢體的蛋白酶活性依賴的FcγR活化能力。ADCC增強抗體的報導基因分析根據實施例5-6記載之方法進行。對於表現蛋白酶及標靶抗原的目標細胞，添加作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷的抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物。檢體分子經蛋白酶而切斷，使具有標靶抗原結合活性的VHH游離，和目標細胞結合。接著，經由和連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的ADCC增強抗體，透過連接子被切斷的抗原結合分子，使目標細胞和效應細胞的FcγR交聯。此處，誘導效應細胞的螢光酵素表現，透過監視該螢光酵素的表現，確認效應細胞的活化。
［實施例11］使用辨識蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子和人類CD3的雙特異性抗體及作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物的細胞毒性的確認 使用實施例8所調製的對人類CD3及蛋白酶依賴性的連接子被切斷的抗原結合分子的雙特異性抗體，及實施例7所調製的作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物作為受檢檢體，確認受檢檢體的蛋白酶活性依賴的細胞毒性。對健康人提供者進行肝素採血，在PBS （nacalai#14249-95）稀釋後，疊層於Ficoll-Paque Plus （GE healthcare）。以1000g離心10分鐘，分離周邊血液單核球（PBMC）的分層。所得的PBMC在RPMI 1640 （Nacalai Tesque）培養基以2×105 細胞/孔接種於96孔圓底盤（Corning）。添加使用RPMI調製成各濃度的作為蛋白酶依賴性的連接子被切斷之抗原結合分子之VHH被釋放的抗體藥物，再添加連接子被切斷的抗原結合分子、VHH//抗人類CD3雙特異性抗體。接種表現標靶抗原及可切斷受檢檢體的蛋白酶切斷連接子的蛋白酶的細胞作為目標細胞。在37℃、5%CO2 培養該盤。24小時後，使用Pierce LDH 細胞毒性分析套組（Thermo fisher scientific，88954）根據此技術領域之人士指定方法定量LDH量。根據本討論，可知對表現腫瘤特異性蛋白酶的人類腫瘤細胞，顯示特異性的細胞毒性。
［實施例12］利用和連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的抗體之廣用的CAR-T的製作 利用實施例8-1或8-2所得的和連接子被切斷的抗原結合分子特異性結合的抗體，製作和連接子被切斷的抗原結合分子結合的嵌合受體。對實施例8-1或8-2所得的連接子被切斷的抗原結合分子的抗體的scFv，稱為抗連接子被切斷的抗原結合分子-scFv。使用實施例7所調製的VHH等的游離分子作為連接子被切斷的抗原結合分子。對於抗連接子被切斷的抗原結合分子-scFv，經PCR等和編碼穿膜區及細胞質區的鹼基序列連結。將此序列插入公知的病毒載體等，生成表現對連接子被切斷的抗原結合分子的CAR（稱為抗連接子被切斷的抗原結合分子-CAR）的病毒載體。再使用公知的病毒轉導方法，製作表現和連接子被切斷的抗原結合分子結合的抗連接子被切斷的抗原結合分子抗體的scFv之CAR-T。即使標靶抗原為任一種腫瘤抗原，該細胞也為可和連接子被切斷的抗原結合分子結合、透過連接子被切斷的抗原結合分子而活化的廣用CAR-T。
［實施例13］ 對連接子被切斷的抗原結合分子的廣用CAR-T在活體外（in vitro）的細胞毒性的評估 實施例12所製作的對VHH等的連接子被切斷的抗原結合分子之廣用CAR-T細胞（抗連接子被切斷的抗原結合分子-CAR）的細胞毒性，以使用LDH釋放分析、流式細胞術的分析法、或使用xCELLigence的分析法（WO2016/047722）等評估。準備SK-Hep1作為陰性對象，在SK-Hep1穩定表現人類GPC3的SK-pca60等作為目標細胞。將陰性對象及目標細胞接種於盤，開始xCELLigence即時細胞分析儀的測量。一晚培養後，抗連接子被切斷的抗原結合分子-CAR表現細胞作為效應細胞，予以混合。接著，添加仿效實施例7的方法所調製的抗GPC3連接子被切斷的抗原結合分子-蛋白酶切斷連接子-人類IgG融合蛋白。再將該盤設置於xCELLigence即時細胞分析儀，從5% CO2 、37℃培養72小時後的Index值，求得細胞增殖抑制率（%）。
細胞毒性以殘存癌細胞的比例而評估。殘存癌細胞的比例以活細胞中的CD45-分劃細胞的比例計算。
即使標靶抗原為GPC3以外的抗原，也同樣地使用標靶抗原表現細胞及具有對該抗原的抗原結合域的初級分子，在本廣用CAR-T中，可產生目標組織特異性的細胞毒性。
［實施例14］ 和MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子結合的廣用CAR-T的製作 （14-1）表現和MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子結合的嵌合受體之反轉錄病毒載體的構築 製作表現辨識MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子的抗體的scFv之嵌合受體的反轉錄病毒載體。使用pMSGV1-CD8-28BBZ（Hughes M.S. et al., Hum Gene Ther 2005 Apr；16（4）：457-72，由Richard Morgan博士（美國國立癌研究所）獲得）作為反轉錄病毒載體骨架，及使用pMSGV（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18：6436-6445（2002））做為小鼠幹細胞病毒基礎的splice-gag載體。圖19為載體構築物及從5’端到3’端的框架單位的構成要件的配置順序的概略圖。辨識MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子的人類scFv稱為20A10VH25VL-scFv。此scFv由接續重鏈可變區的25個胺基酸的連接子及輕鏈可變區所形成（序列識別號747）。在20A10VH25VL-scFv，連結人類CD8α鏈（核苷酸序列1271～1519，Genbank NM001768.6）的樞紐區及穿膜區、以及人類CD28分子（核苷酸序列760～882，Genbank NM006139.2）、 4-1BB分子（核苷酸序列886～1026，Genbank NM001561.5）、CD3ζ分子（核苷酸序列299～634，Genbank NM000734.3）的細胞質區、接續的2A胜肽（F2A）（來自口蹄疫病毒）和eGFP分子（核苷酸序列5521～6237bp，Genebank KF957646.1）。編碼20A10VH25VL-scFv-CAR（序列識別號：748）的基因以此技術領域之人士已知方法合成。使該序列和pMSGV1接合（ligate），生成20A10VH25VL-scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ-eGFP-CAR反轉錄病毒載體（稱為20A10VH25VL-scFv-CAR載體）。
（14-2）廣用CAR-T的製作 使用人類T細胞的反轉錄病毒轉導方法、使用（14-1）所構築的20A10VH25VL-scFv-CAR載體，製作辨識MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子的廣用CAR-T。
具體為，首先，經由Lipofectamine 2000或3000（Life Technologies ），使上述20A10VH25VL-scFv-CAR載體及pAmpho質體（Takara Bio）轉染至GP2-293包裹細胞株（Takara Bio），製作導入20A10VH25VL-scFv -CAR載體的反轉錄病毒。從轉染開始48小時後，收集含有上述反轉錄病毒的上清液，製作吸附於2個24孔盤的轉導用盤。
接著，為了人類T細胞的轉導，在固定有抗CD3單株抗體及RetroNectin（註冊商標：Takara Bio）的6孔盤上，IL-2存在下，培養每孔2×106 個人類周邊血液單核球72小時。收集培養後細胞，在IL-2存在下，在吸附有上述製作的20A10VH25VL-scFv-CAR反轉錄病毒的轉導用盤上培養一晚之後，隔天將細胞再移到另1個轉導用盤，再培養一晚，獲得導入20A10VH25VL-scFv-CAR載體的人類T細胞（20A10VH25VL-scFv-CAR表現T細胞）。
（14-3）CAR蛋白質表現率的確認 轉導後，在人類IL-2存在下維持細胞，從開始培養已轉導的周邊血液單核球的7～8日後用於實驗。以CD8及生物素標記的蛋白酶切斷胜肽（序列識別號749）染色細胞後，以流式細胞儀確定轉導的人類T細胞中20A10VH25VL-scFv-CAR的表面表現。確認全部T細胞的約60%表現20A10VH25VL-scFv-CAR。
［實施例15］對MMP切斷連接子被切斷的抗原結合分子的廣用CAR-T在活體外（in vitro）的細胞毒性的評估 以實施例15-1所製作的對切斷連接子被切斷的抗原結合分子之廣用CAR-T細胞（20A10VH25VL-scFv-CAR-T）的細胞毒性，以CytoFLEX S （BECKMAN COULTER）評估。準備KYSE70作為陰性對象，PC-10作為目標細胞。了解KYSE70、PC-10皆表現GPC3，但是根據實施例5（5-3）的結果，KYSE70幾乎無法切斷MMP切斷連接子，相對地，PC-10可切斷MMP切斷連接子。將陰性對象及目標細胞分別以1×105 個細胞和1×105 個細胞接種於24孔盤。20A10VH25VL-scFv-CAR-T作為效應細胞，以1×105 個細胞混合使效應細胞對目標細胞（E：T）的比例為1：1。接著，添加實施例2所調製的含有切斷連接子的抗GPC3抗體H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含切斷連接子的H0000-G1T4/GL4-k0a。從添加到48小時後，收集CAR-T細胞及目標細胞。收集的細胞使用Zombie YellowTM Fixable Viability Kit（BioLegend, 423104）染色死細胞，使用抗人類CD45抗體（BioLegend, 304039）染色CAR-T細胞。
細胞毒性以殘存癌細胞的比例而評估。殘存癌細胞的比例以活細胞中的CD45-分劃細胞的比例計算。該等結果顯示於圖20及21。
由此結果，顯示在活體外（in vitro）和切斷連接子被切斷的抗原結合分子結合的廣用CAR-T細胞的細胞毒性。
［表7］
序列識別號 名稱 胺基酸序列
序列識別號726 20A10H QIQLVQSGPELKEPGETVRISCKASGYTFTKYGINWVKQAPGKGLEWMAWINTYSGMTTYADDFKGRFAFSLETSANTAYLQINHLKNDDTATYFCARSLGYDYGGFAYWGQGTLVTVSA
序列識別號727 F760nN17 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELRGGPKVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPYLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQESLSLSP
序列識別號728 20A10L DVLLTQTPLSLPVSLGDQAFISCRSGQTLVHDNENTYFHWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEPEDLGIYFCSQNTHVPFTFGSGTKLEIK
序列識別號729 k0MT/k0a RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
序列識別號730 20952H QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYPMNWVRQAPGKGLEWIGGIGTSGNIWYASWAKGRFIISRASSTTVDLKVTSPTTEDTATYFCARGLYNDYTVWGPGTLVTVSS
序列識別號731 20952L AQVLTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQSVYNKNYLAWYQQKPGQPPKRLIYSASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDVQCDDVATYYCLGSYDCNRAECHAFGGGTKVVVEV
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序列識別號749   KSCDKTDGPSGAEGPPGPQG
［產業可利用性］
根據本發明，可提供經蛋白酶所生成的活化抗體的血中半衰期短，若不發生因蛋白酶的切斷則不發揮藥理作用的分子群或使用其的具有ADCC活性之抗體療法、雙特異性抗體療法及/或CAR-T療法。
亦即，根據本發明之分子群，依賴在病變部位高度表現的蛋白酶及標靶抗原兩者，使含有ADCC或TDCC活性的效應物作用特異性發揮，當切斷連接子被切斷，所產生的連接子被切斷的抗原結合分子加速被代謝，對於在正常組織表現的抗原，效應細胞作用的可能性降低，在高濃度投予時安全性也極高的理想治療成為可能。
無。
［圖1］圖1顯示透過對抗體提供對在如癌組織或發炎組織的病變部位表現量上升的蛋白酶的敏感性，擴大組織特異性及治療劑量區間（therapeutic window）的抗體技術（Probody（註冊商標））的概念。 ［圖2］圖2為顯示經由特異性辨識經蛋白酶而連接子切斷所產生的抗原之抗體的TDCC活性的誘導的示意圖。 ［圖3］圖3為顯示經由特異性辨識經蛋白酶而連接子切斷所產生的抗原之抗體的ADCC活性的誘導的示意圖。 ［圖4］圖4為顯示經由特異性辨識經蛋白酶而連接子切斷所產生的抗原之抗體的TDCC活性的誘導的示意圖。 ［圖5］圖5為顯示經由特異性辨識經蛋白酶而連接子切斷所產生的抗原之抗體的ADCC活性的誘導的示意圖。 ［圖6-1］圖6-1為顯示經由特異性辨識因蛋白酶而被切斷的抗原結合分子之CAR-T的細胞毒性的誘導的示意圖。 ［圖6-2］圖6-2為顯示經由特異性辨識因蛋白酶切斷所露出的抗原之CAR-T的細胞毒性的誘導的示意圖。 ［圖7］圖7顯示插入蛋白酶切斷序列（第II型膠原蛋白的部分序列）的抗體經蛋白酶（MMP13）體外（in vitro）切斷的結果。從左邊泳道（lane）開始，對應孔1～5，孔1顯示MWM，孔2及孔3分別顯示不含切斷序列的抗原結合分子的反應前和反應後，孔4及孔5分別顯示在含有切斷序列的抗原結合分子添加MMP13的情形的反應前和反應後。 ［圖8］圖8顯示辨識腫瘤抗原的抗體經蛋白酶（IdeS）體外（in vitro）切斷的結果。從左邊泳道（lane）開始，對應孔6～10，孔6顯示MWM，孔7及孔8分別顯示不含切斷序列的抗原結合分子的反應前和反應後，孔9及孔10分別顯示在含有切斷序列的抗原結合分子添加IdeS的情形的反應前和反應後。 ［圖9］圖9（左）顯示插入經蛋白酶而被切斷的序列（第II型膠原蛋白的部分序列）的抗原結合分子（抗體）的腫瘤細胞株的處理結果。圖9（右）顯示未插入經蛋白酶而被切斷的序列（第II型膠原蛋白的部分序列）的抗原結合分子的腫瘤細胞株的處理結果。 ［圖10］圖10顯示經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子和抗切斷連接子/抗CD3雙特異性抗體結合的Biacore測量結果。 ［圖11］圖11顯示經蛋白酶而被切斷的抗原結合分子（IgG1）和抗切斷連接子/抗CD3雙特異性抗體結合的Biacore測量結果。 ［圖12］圖12顯示經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子和ADCC活性增強抗體結合的Biacore測量結果。 ［圖13］圖13顯示經蛋白酶而被切斷的抗原結合分子（IgG1）和ADCC活性增強抗體結合的Biacore測量結果。 ［圖14］圖14為使用經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子（抗GPC3抗體，IgG1）及抗連接子抗CD3雙特異性抗體的Jurkat報導基因分析結果。 ［圖15］圖15為使用經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子（抗GPC3抗體，IgG1）及抗連接子抗CD3雙特異性抗體的Jurkat報導基因分析結果。 ［圖16］圖16為使用對經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子的ADCC活性增強的Jurkat報導基因分析結果。 ［圖17］圖17為使用對經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子的ADCC活性增強的Jurkat報導基因分析結果。 ［圖18］圖18為使用辨識經蛋白酶而連接子（第II型膠原蛋白的部分序列）被切斷的抗原結合分子之抗連接子抗CD3雙特異性抗體和插入蛋白酶切斷序列的抗GPC3抗體的經由人類PBMC的細胞毒性分析結果。 ［圖19］圖19為顯示載體構築物及5’端到3’端的框架（frame）單位的構成要件的配置順序之示意圖。 ［圖20］圖20為可切斷MMP切斷連接子的PC-10的細胞毒性的評估結果。殘存癌細胞的比例以原始細胞中的CD45-劃分細胞的比例計算。橫軸顯示添加的抗原結合分子的濃度。 ［圖21］圖21為幾乎無法切斷MMP切斷連接子的KYSE70的細胞毒性的評估結果。殘存癌細胞的比例以原始細胞中的CD45-劃分細胞的比例計算。橫軸顯示添加的抗原結合分子的濃度。
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Claims (15)

  1. 一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含表現嵌合受體的細胞之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 該嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，該細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
  2. 一種醫藥組合物，其為用於和表現嵌合受體的細胞的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 該嵌合受體包含細胞外結合域、穿膜域及細胞內訊息傳導域，該細胞外結合域對連接子切斷後的抗原結合分子具有結合能力，透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現上述標靶抗原的細胞結合。
  3. 一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含雙特異性抗體之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 該雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 該雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
  4. 一種醫藥組合物，其為用於和雙特異性抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在連接子切斷後對標靶抗原具有結合能力， 該雙特異性抗體包含，對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性之抗體可變區、及對在T細胞表面表現的分子具有結合活性之抗體可變區， 該雙特異性抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和表現標靶抗原的細胞結合。
  5. 一種醫藥組合物，其為用於和抗原結合分子的投予組合使用之包含以抗體依賴性細胞毒性作用被增強為特徵的IgG抗體之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， 該IgG抗體包含對經蛋白酶的上述連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性的抗體可變區， 該IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
  6. 一種醫藥組合物，其為用於和以抗體依賴性細胞毒性作用被增強為特徵的IgG抗體的投予組合使用之包含抗原結合分子之醫藥組合物，其中， 該抗原結合分子包含經蛋白酶而被切斷的連接子，在經蛋白酶的連接子切斷後，對目標細胞表面表現的抗原具有結合活性， 該IgG抗體包含對經蛋白酶的連接子切斷後的抗原結合分子具有結合活性的抗體可變區， 該IgG抗體透過和連接子切斷後的抗原結合分子的結合，可和目標細胞結合。
  7. 如請求項1至6任一項所述之醫藥組合物，其中，連接子切斷後的抗原結合分子對抗原的KD 值，相對於連接子切斷前的抗原結合分子對抗原的KD 值的比（KD （切斷後）/KD （切斷前））為0.1或0.01以下。
  8. 如請求項1至7任一項所述之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為IgG抗體、類IgG抗體分子、重鏈抗體或單域抗體。
  9. 如請求項1至8任一項所述之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子包含抗體的可變區和恆定區、以及經蛋白酶而被切斷的連接子，其中，上述抗體選自IgG抗體、類IgG抗體分子或重鏈抗體，經蛋白酶而連接子被切斷的抗原結合分子包含抗原結合域及部分被切斷的連接子。
  10. 如請求項1至9任一項所述之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子之經蛋白酶而被切斷的連接子，位於可變區和恆定區的交界附近或上述恆定區內的CH1和CH2的交界附近。
  11. 如請求項1至10任一項所述之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子的抗體或類IgG抗體分子，連接子切斷後的抗原結合分子為該抗體的VL、VH、VHH或其抗原結合片段。
  12. 如請求項1至11任一項所述之醫藥組合物，其中，該抗原結合分子為包含經蛋白酶而被切斷的連接子的單域抗體，連接子切斷後的抗原結合分子為該單域抗體的抗原結合域及部分的連接子。
  13. 如請求項1至12任一項所述之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含蛋白酶切斷序列。
  14. 如請求項1至12任一項所述之醫藥組合物，其中，經蛋白酶而被切斷的連接子包含具有序列識別號1～725之蛋白酶切斷序列之任一個的胜肽。
  15. 如請求項1至14任一項所述之醫藥組合物，其用於在癌的治療或預防中使用。
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