CN113905757A

CN113905757A - 抗体切割位点结合分子

Info

Publication number: CN113905757A
Application number: CN202080040523.2A
Authority: CN
Inventors: 樱井实香; 井川智之; 小森靖则; 玉田耕治; 佐古田幸美
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Yamaguchi University NUC
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; Yamaguchi University NUC
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2022-01-07
Also published as: EP4023230A4; TW202112808A; WO2020246563A1; MX2021014433A; KR20220017430A; IL288557A; CA3142676A1; BR112021023735A2; EP4023230A1; US20220324975A1; JPWO2020246563A1; AU2020288499A1

Abstract

本公开提供药物组合物，所述药物组合物包含具有ADCC活性的抗体、T细胞重定向抗体或表达嵌合受体的细胞，用于与能结合靶标抗原的抗原结合分子的施用组合使用，其中一级分子包含蛋白酶可切割接头，切割了接头的抗原结合分子对靶标抗原具有结合能力，具有ADCC活性的抗体或T细胞重定向抗体的可变区以及嵌合受体的细胞外结合结构域通过与可切割接头被切割后所产生的切割了接头的抗原结合分子结合而与表达靶标抗原的细胞结合。

Description

抗体切割位点结合分子

技术领域

本公开涉及具有ADCC活性的抗体、T细胞重定向抗体、嵌合受体、表达嵌合受体的细胞、及利用该细胞或抗体的疾病处理方法，特别地，涉及利用抗体的ADCC活性的疗法、利用该细胞的CAR-T疗法以及T细胞重定向抗体疗法。

背景技术

抗体药物是以活体具有的免疫系统的一部分的免疫球蛋白或其类似物作为主要成分的药物(非专利文献1和非专利文献2)。与现有的小分子化合物相比较，抗体药物分子量大，可识别复杂分子，因此靶标识别的特异性高，出现预料外的副作用小。另外，血液中的异物一般经由内吞作用被摄入细胞而分解，但是由于抗体存在通过特异的受体FcRn及抗体Fc区回收抗体的机制，因此抗体在血液中滞留性长，通过单次施用可获得长时间药效的特征。进一步地，由于抗体药物是作为重组蛋白制备的，因此可以应用基因工程来改变其功能。

例如，抗体的恒定区通过与NK细胞或巨噬细胞的FcγR结合所诱导的抗体依赖性细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity；ADCC)，当使用具有这样的恒定区的抗体时，所述恒定区添加了增强对FcγR的结合的改变，已知诱导更强的细胞毒性(非专利文献3)。

另外，通常的抗体只识别、结合抗原的一个表位，但是通过改良天然型的IgG型抗体，开发以一分子抗体结合两种以上抗原的抗体(称为Bispecific抗体或双特异性抗体)(非专利文献11)，可以与T细胞表达的蛋白质(CD3ε或TCR)和癌细胞表达的蛋白质(癌抗原)结合。作为双特异性抗体中的一种，从1980年代就已知T细胞重定向抗体(T cell-redirecting抗体)，其是以T细胞作为效应细胞，动员以细胞毒作为其抗肿瘤效果的机制的抗体(非专利文献12、13、14)。与以NK细胞或巨噬细胞作为效应细胞，动员以ADCC作为其抗肿瘤效果的机制的抗体不同，T细胞重定向抗体具有针对T细胞受体(TCR)复合体的任一构成亚单位的结合结构域，特别是结合CD3ε链的结构域，并与作为靶标的癌细胞上的抗原结合，使T细胞和癌抗原表达细胞形成细胞间桥连，以T细胞作为效应细胞，对癌抗原表达细胞诱导强细胞毒作用(T-cell dependent cellular cytotoxicity；TDCC)(非专利文献4、12、13、14)。

进一步地，近年开发将抗体所具有的高特异性利用于效应细胞的抗原识别的抗肿瘤疗法，在一些癌肿瘤中显示显著的药效。在该称为嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor；以下也称为“CAR”)过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)的疗法中，将具有以来自抗体的scFv为首的抗原结合能力的细胞外结构域人工融合细胞内信号传导结构域，形成CAR，在T细胞等的效应细胞表达。将此CAR表达T细胞(以下也称“CAR-T细胞”)移入癌患者，当肿瘤抗原被CAR识别时，细胞内结构域活化，诱导效应细胞的细胞毒性，通过毒杀肿瘤细胞而发挥药效(非专利文献5)。

对于以CAR-T细胞的施用的癌免疫疗法进行临床试验(非专利文献10)，获得以CAR-T细胞的施用的癌免疫疗法在白血病或淋巴瘤等的造血器官恶性肿瘤等中显示有效性的结果。2017年以CD19为抗原的CAR-T的Kymriah(注册商标)(Novartis，tisagenlecleucel，CTL-019，CD3ζ-CD137)及Yescarta(注册商标)(KiTE，axicabtageneciloleucel，CD3ζ-CD28)在美国、2019年在日本认可为药物。

除此之外，也提出了利用来自骆驼科动物的单结构域抗体，以多样的抗原为靶标，再简化抗体的制备等的方法。总而言之，抗体药物有多个优点，因此适用于肿瘤或自身免疫疾病、感染症等广泛疾病(非专利文献6)。

另一方面，也指出了抗体药物的局限性。其中之一是抗原的病变部位特异性的问题。成为抗体靶标的表面抗原也有在病变部位以外的正常组织中表达的情形，虽然抗原的表达量较病变部位低，但对于表达该抗原的正常组织而言，抗体作用产生副作用。

关于这个问题，能够成为解决的对策为：鉴定以病变部位特异性的蛋白酶活性作为靶标的病变部位。例如，施用对含有在病变部位活化的蛋白酶的切割位点的合成肽链添加有荧光色素的蛋白酶底物，测定伴随切割的荧光变化，显示了经由蛋白酶活性可鉴定病变部位(非专利文献7)。

报导了用抗体识别在病变部位所生成的蛋白酶切割产物而检测出病变部位的研究(非专利文献8)。在该研究中报导，对经由放线菌表达的IdeS蛋白酶的切割产物，使用特异性结合该切割物的抗体可在体内(in vivo)特异性识别该切割物(非专利文献8)。

在慢性疾病领域中，也有以开发检测退化性膝关节炎的病变的试剂为目的，开发在退化性膝关节炎的病变部位中，识别活化的MMP(matrix metalloproteinase)切割的II型胶原蛋白的抗体(非专利文献9)。

作为将现有的蛋白酶活化抗体技术应用在治疗上的例子，可以例举通过对抗体赋予对在如癌组织或炎症组织的病变部位表达或活化的程度增加的蛋白酶的敏感性，扩大组织特异性和治疗窗口(therapeutic window)的”Probody(注册商标)技术”(图1)。

“Probody(注册商标)”是：抗体和掩蔽抗体的抗原结合部位的掩蔽肽用在病变部位表达的蛋白酶切割的切割肽序列连接而成的分子(非专利文献15)。抗体的抗原结合部位在肽序列未切割的状态下，被掩蔽肽掩蔽，因此不能与抗原结合。Probody(注册商标)的切割肽序列被靶标病变部位表达的蛋白酶切割，由此掩蔽肽解离，生成具有抗原结合活性的抗体分子，使得与靶标病态组织特异性抗原结合成为可能。Probody(注册商标)在蛋白酶不存在的非病变部位中，由于抗原抗体的结合受到抑制，能够比常规的抗体以更大量施用，期待可扩大治疗窗口。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2009/025846

专利文献2：WO2017/143094

专利文献3：WO2018/097307

非专利文献

非专利文献1：Janice M Reichert，Clark J Rosensweig，Laura B Faden&amp；Matthew C Dewitz，Monoclonal antibody successes in the clinic.，Nat.Biotechnol.(2005)23，1073-1078

非专利文献2：Pavlou AK，Belsey MJ.，The therapeutic antibodies market to2008.，Eur J Pharm Biopharm.(2005)59(3)，389-396

非专利文献3：The impact of Fc engineering on an anti-CD19 antibody：increased Fcgamma receptor affinity enhances B-cell clearing in nonhumanprimates.Zalevsky J，Leung IW，Karki S，Chu SY，Zhukovsky EA，Desjarlais JR，Carmichael DF，Lawrence CE.Blood.2009Apr 16；113(16)：3735-43.

非专利文献4：Advances in bispecific biotherapeutics for the treatmentof cancer Biochem Pharmacol.2012Nov 1；84(9)：1105-12

非专利文献5：Chimeric Antigen Receptor Therapy N Engl J Med 2018；379：64-73

非专利文献6：Single-domain antibodies for biomedicalapplications.Immunopharmacol Immunotoxicol.2016；38(1)：21-8

非专利文献7：Shedding light onto live molecular targets NatMed.2003Jan；9(1)：123-8

非专利文献8：Structure and specificity of an antibody targeting aproteolytically cleaved IgG hinge Malia TJ1，Teplyakov A，Brezski RJ，Luo J，Kinder M，Sweet RW，Almagro JC，Jordan RE，Gilliland GL.Proteins.2014Aug；82(8)：1656-67

非专利文献9：Development of a novel immunoassay for the measurement oftype II collagen neoepitope generated by collagenase cleavage Clin ChimActa.2012Oct 9；413(19-20)：1591-9.

非专利文献10：Grupp等人，2013N Engl J Med368(16)：1509-18.

非专利文献11：Kontermann，mAbs 2012；4：182-197.

非专利文献12：Mezzanzanica等人，International journal of cancer 1988；41：609-615.

非专利文献13：Staerz和Bevan，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 1986；83：1453-1457.

非专利文献14：Staerz等人，Nature 1985；314：628-631.

非专利文献15：Desnoyers LR等人，Sci Transl Med.2013Oct 16；5(207)：207ra144.

发明概述

发明要解决的课题

Probody(注册商标)是因为活化的Probody(注册商标)的高血液中滞留性、以及即使在不经蛋白酶切割的非活化状态也具有抗原结合活性，在正常组织中也发挥细胞毒性。另外，已知即使在T细胞重定向抗体疗法、CAR-T疗法中，获得高的细胞毒性；另一方面，其活性在正常细胞中也会发生，引起严重的副作用，存在改善有关这些疗法的安全性的需求。

另外，单一肿瘤抗原在所有癌中并不是普遍的表达，因此这些疗法有必要为每个作为靶标的肿瘤抗原构建抗原识别部位，伴随这个操作的经济成本及劳动作业成为大的课题。进一步地，作为靶标的肿瘤抗原响应于治疗而有如表达量降低、突然变异等，引起免疫逃逸，导致治疗效果降低或消失。

对响应于治疗阶段而改变识别的肿瘤抗原，研究了可能的CAR-T细胞及T细胞重定向抗体、利用它们的治疗方法，期待通过施用于患者时具有充足的治疗效果、且具有高安全性的治疗方法及可广泛利用的技术的开发，有更安全且廉价的治疗。

用于解决课题的方法

为了解决这些课题，本发明人们反复研究，发现与经蛋白酶切割而新生成的抗原结合结构域结合的具有ADCC活性的抗体、T细胞重定向抗体或CAR-T细胞，对于治疗靶标细胞选择性作用，在治疗中有效，从而完成本发明。在本公开的一个方面，公开了具有泛用性的治疗分子群，其是下述分子群：包含经蛋白酶作用生成的抗原结合结构域的分子的血液中半寿期短，并且在不发生经蛋白酶切割的情况下不发挥药理作用。

本公开提供例如，包含具有抗原结合能力的分子的药物组合物和包含具有效应物活化能力的分子的药物组合物，其中所述药物组合物用于通过靶标组织特异性表达的蛋白酶切割、两者一起使表达抗原的靶标细胞和效应细胞之间桥连而活化效应细胞，用于治疗起因于靶标组织的疾病的药物组合物，以及作为所述药物组合物的有效成分使用的、具有抗原结合能力的分子和具有效应物活化能力的分子。进一步地，提供该药物组合物、及作为该有效成分使用的具有抗原结合能力的分子和具有效应物活化能力的分子的制造方法。

进一步地，根据本公开，通过使用共同的结合肿瘤抗原的分子，能够从CAR-T疗法、双特异性抗体疗法和具有ADCC活性的抗体疗法的多种疗法中根据符合患者的治疗适合性选择最适疗法，或者视治疗状况改变或增加疗法。

进一步地，根据本公开，使用多个共同的与肿瘤抗原结合的分子，能够从CAR-T疗法、双特异性抗体疗法和具有ADCC活性的抗体疗法的多种疗法中根据符合患者的治疗适合性选择最适疗法，或者视治疗状况改变或增加疗法。

本公开的一个方面是对表达靶标抗原的靶标细胞具有ADCC活性的抗体、双特异性抗体或CAR-T细胞，所述CAR-T细胞或双特异性抗体或具有ADCC活性的抗体通过与抗原结合分子的结合而与靶标细胞结合。抗原结合分子包含蛋白酶可切割接头，在经蛋白酶切割接头后，对靶标抗原具有结合能力。本公开涉及上述CAR-T细胞或双特异性抗体或具有ADCC活性的抗体。

本公开的再一方面涉及分离的核酸分子，所述分离的核酸分子是可用于靶向表达目的靶标抗原的细胞的、具有ADCC活性的抗体、双特异性抗体和/或CAR的编码核酸分子。

本公开的再一方面涉及包含分离的核酸分子的载体，所述载体是可用于靶向表达目的靶标抗原的细胞的、具有ADCC活性的抗体、双特异性抗体和/或CAR的编码核酸分子的载体。

本公开的再一方面涉及表达本公开的CAR的细胞、或用本公开的核酸分子或载体转染或转导的细胞。

更具体地，本公开的一个方面提供了以下发明。

[1]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含表达嵌合受体的细胞的药物组合物，其中

抗原结合分子包含蛋白酶可切割接头，在接头切割后对靶标抗原具有结合能力，

嵌合受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，细胞外结合结构域对接头切割后的抗原结合分子具有结合能力，通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与表达上述靶标抗原的细胞结合。

[2]药物组合物，其是用于与表达嵌合受体的细胞的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，其中

[3]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含双特异性抗体的药物组合物，其中

双特异性抗体包含对经蛋白酶切割接头后的抗原结合分子具有结合活性的抗体可变区和对在T细胞表面表达的分子具有结合活性的抗体可变区，

双特异性抗体通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与表达靶标抗原的细胞结合。

[4]药物组合物，其是用于与双特异性抗体的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，其中

[5]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含以抗体依赖性细胞毒作用被增强为特征的IgG抗体的药物组合物，其中

上述抗原结合分子包含蛋白酶可切割接头，在经蛋白酶切割接头后，对靶标细胞表面表达的抗原具有结合活性，

上述IgG抗体包含对经蛋白酶切割上述接头后的抗原结合分子具有结合活性的抗体可变区，

上述IgG抗体通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与靶标细胞结合。

[6]药物组合物，其是用于与以抗体依赖性细胞毒作用被增强为特征的IgG抗体的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，其中

抗原结合分子包含蛋白酶可切割接头，在经蛋白酶切割接头后，对靶标细胞表面表达的抗原具有结合活性，

IgG包含对经蛋白酶切割接头后的抗原结合分子具有结合活性的抗体可变区，

IgG抗体通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与靶标细胞结合。

[7]根据[1]～[6]中任一项所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子对抗原的K_D值，相对于接头切割前的抗原结合分子对抗原的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1或0.01以下。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是IgG抗体、IgG抗体样分子、重链抗体或单结构域抗体。

[9]根据[1]～[8]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，其中，上述抗体选自IgG抗体、IgG抗体样分子或重链抗体，经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子包含抗原结合结构域和被切割了的接头的一部分。

[10]根据[1]～[9]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子的蛋白酶可切割接头位于可变区与恒定区的边界附近或上述恒定区内的CH1与CH2的边界附近。

[11]根据[1]～[10]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的抗体或IgG抗体样分子，接头切割后的抗原结合分子是该抗体的VL、VH、VHH或其抗原结合片段。

[12]根据[1]～[11]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的单结构域抗体，接头切割后的抗原结合分子是该单结构域抗体的抗原结合结构域和接头的一部分。

[13]根据[1]～[12]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶切割序列。

[14]根据[1]～[12]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[15]根据[1]～[14]中任一项所述的药物组合物，其用于在癌的治疗或预防中使用。

[A1-1]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含表达嵌合受体的细胞的药物组合物，

[A1-2]药物组合物，其是用于与表达嵌合受体的细胞的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，

[A1-3]根据[A1-1]或[A1-2]所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子对抗原的K_D值，相对于接头切割前的抗原结合分子对抗原的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1以下或0.01以下。

[A1-4]根据[A1-1]～[A1-3]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是IgG抗体、IgG抗体样分子、重链抗体或单结构域抗体。

[A1-5]根据[A1-1]～[A1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，其中，上述抗体选自IgG抗体、IgG抗体样分子或重链抗体，经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子包含抗原结合结构域和被切割了的接头的一部分。

[A1-6]根据[A1-1]～[A1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含单结构域抗体的VHH及蛋白酶可切割接头，经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子包含抗原结合结构域和被切割了的接头的一部分。

[A1-7]根据[A1-1]～[A1-6]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子的蛋白酶可切割接头位于可变区与恒定区的边界附近或上述恒定区内的CH1与CH2的边界附近。

[A1-8]根据[A1-1]～[A1-7]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子的蛋白酶可切割接头位于铰链区附近。

[A1-9]根据[A1-1]～[A1-8]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的抗体或IgG抗体样分子，接头切割后的抗原结合分子是该抗体的VL、VH、VHH或其抗原结合片段。

[A1-10]根据[A1-1]～[A1-9]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的重链抗体或单结构域抗体，接头切割后的抗原结合分子是包含该抗原结合分子的VHH或抗原结合结构域的其一部分。

[A1-11]根据[A1-1]～[A1-10]中任一项所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子是scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、VH或VHH。

[A1-12]根据[A1-1]～[A1-11]中任一项所述的药物组合物，其中，嵌合受体的细胞外结合结构域识别切割了的接头、该接头的一部分、或包含该接头的部分。

[A1-13]根据[A1-1]～[A1-12]中任一项所述的药物组合物，其中，嵌合受体的细胞外结合结构域对接头切割后的抗原结合分子的K_D值，相对于接头切割前的抗原结合分子的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1以下或0.01以下。

[A1-14]根据[A1-1]～[A1-13]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶切割序列。

[A1-15]根据[A1-1]～[A1-14]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[A1-16]根据[A1-1]～[A1-15]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头还包含柔性接头。

[A1-17]根据[A1-1]～[A1-16]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶是在靶标组织特异性表达的蛋白酶。

[A1-18]根据[A1-1]～[A1-17]中任一项所述的药物组合物，其中，靶标细胞是肿瘤细胞，且蛋白酶是肿瘤蛋白酶。

[A1-19]根据[A1-1]～[A1-18]中任一项所述的药物组合物，其用于在癌的治疗或预防中使用。

[A1-20]根据[A1-19]所述的药物组合物，其中，癌选自由癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病组成的组。

[A1-21]根据[A1-19]所述的药物组合物，其中，癌选自由B细胞谱系急性淋巴母细胞性白血病、B细胞慢性淋巴性白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤、乳癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤组成的组。

[A1-22]根据[A1-1]～[A1-21]中任一项所述的药物组合物，其用于在CAR-T疗法中使用。

[A2-1]嵌合受体，其是包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的嵌合受体，其中，在包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子中，该细胞外结合结构域与接头被蛋白酶切割了的抗原结合分子结合，该细胞外结合结构域通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，与表达抗原的细胞结合。

[A2-2]根据[A2-1]所述的嵌合受体，其中，细胞外结合结构域识别被蛋白酶切割了的接头、该接头的一部分、或包含该接头的部分。

[A2-3]根据[A2-1]或[A2-2]所述的嵌合受体，其中，跨膜结构域包含CD28。

[A2-4]根据[A2-1]～[A2-3]中任一项所述的嵌合受体，还包含位于跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间的1个以上的共刺激分子。

[A2-5]根据[A2-4]所述的嵌合受体，其中，上述共刺激分子是CD3ζ、CD28、4-1BB、4-1BBL、ICOS或OX40。

[A2-6]根据[A2-1]～[A2-5]中任一项所述的嵌合受体，其中，上述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ。

[A2-7]根据[A2-1]～[A2-6]中任一项所述的嵌合受体，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[A2-8]核酸，其编码[A2-1]～[A2-7]中任一项所述的嵌合受体。

[A2-9]载体，其包含[A2-8]所述的核酸。

[A2-10]细胞，其包含[A2-8]所述的载体。

[A2-11]根据[A2-9]所述的细胞，其中，上述细胞是T细胞。

[A2-12]根据[A2-11]所述的细胞，其中，上述T细胞是CD4⁺或CD8⁺T细胞。

[A2-13]根据[A2-11]所述的细胞，其中，上述T细胞是调节性T细胞(Treg)或滤泡调节性T细胞(TFR)。

[A3-1]抗原结合分子，其是包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子，

接头切割后的抗原结合分子对抗原具有结合能力，通过嵌合受体的细胞外结合结构域与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与表达抗原的靶标细胞结合。

[A3-2]根据[A3-1]所述的抗原结合分子，其中，该蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[B1-1]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含双特异性抗体的药物组合物，

[B1-2]药物组合物，其是用于与双特异性抗体的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，

[B1-3]根据[B1-1]或[B1-2]所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子对抗原的K_D值，相对于接头切割前的抗原结合分子对抗原的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1以下或0.01以下。

[B1-4]根据[B1-1]～[B1-3]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是IgG抗体或重链抗体。

[B1-5]根据[B1-1]～[B1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子包含上述可变区或其抗原结合片段。

[B1-6]根据[B1-1]～[B1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，该接头位于可变区与恒定区的边界附近或上述恒定区内的CH1与CH2的边界附近。

[B1-7]根据[B1-1]～[B1-6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的抗体，接头切割后的抗原结合分子是该抗体的VL、VH或其抗原结合片段。

[B1-8]根据[B1-1]～[B1-6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的重链抗体，接头切割后的抗原结合分子是该重链抗体的VHH。

[B1-9]根据[B1-1]～[B1-8]中任一项所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子是scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、VH或VHH。

[B1-10]根据[B1-1]～[B1-9]中任一项所述的药物组合物，其中，双特异性抗体识别切割了的接头、该接头的一部分、或包含该接头的部分。

[B1-11]根据[B1-1]～[B1-10]中任一项所述的药物组合物，其中，双特异性抗体对接头切割后的抗原结合分子的K_D值，相对于双特异性抗体对接头切割前的抗原结合分子的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1以下或0.01以下。

[B1-12]根据[B1-1]～[B1-11]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶切割序列。

[B1-13]根据[B1-1]～[B1-12]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[B1-14]根据[B1-1]～[B1-13]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头还包含柔性接头。

[B1-15]根据[B1-1]～[B1-14]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶是在靶标组织特异性表达的蛋白酶。

[B1-16]根据[B1-1]～[B1-15]中任一项所述的药物组合物，其中，靶标细胞是肿瘤细胞，且蛋白酶是肿瘤蛋白酶。

[B1-17]根据[B1-1]～[B1-16]中任一项所述的药物组合物，其用于在癌的治疗或预防中使用。

[B1-18]根据[B1-17]所述的药物组合物，其中，癌选自由癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病组成的组。

[B1-19]根据[B1-17]所述的药物组合物，其中，癌选自由B细胞谱系急性淋巴母细胞性白血病、B细胞慢性淋巴性白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤、乳癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤组成的组。

[B1-20]根据[B1-1]～[B1-19]中任一项所述的药物组合物，其用于在双特异性抗体疗法中使用。

[B2-1]双特异性抗体，其包含1)对在T细胞表面表达的分子具有结合活性的第1抗体可变区；以及2)对于包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子，对经蛋白酶切割接头后的该抗原结合分子具有结合活性的第2抗体可变区；

抗原结合分子在经蛋白酶切割接头后，对在靶标细胞表面表达的抗原具有结合活性，双特异性抗体通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与靶标细胞结合。

[B2-2]根据[B2-1]所述的双特异性抗体，其中，T细胞表面表达的分子是CD3。

[B2-3]根据[B2-1]所述的双特异性抗体，其中，对在T细胞表面表达的分子具有结合活性的抗体可变区与CD3ε结合。

[B2-4]根据[B2-1]～[B2-3]中任一项所述的双特异性抗体，其识别该被蛋白酶切割的接头、该接头的一部分、或包含该接头的部分。

[B2-5]根据[B2-1]～[B2-4]中任一项所述的双特异性抗体，其包含对Fcγ受体的结合活性低的Fc区。

[B2-6]根据[B1-1]～[B1-5]中任一项所述的双特异性抗体，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一蛋白酶切割序列的肽。

[B2-7]根据[B1-1]～[B1-5]中任一项所述的双特异性抗体，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[B2-8]根据[B1-1]～[B1-7]中任一项所述的双特异性抗体，其中，蛋白酶可切割接头还包含柔性接头。

[B2-9]根据[B2-1]～[B2-8]中任一项所述的双特异性抗体，其是IgG抗体。

[B3-1]核酸，编码根据[B2-1]～[B2-9]中任一项所述的双特异性抗体。

[B3-2]载体，包含根据[B3-1]所述的核酸。

[B3-3]细胞，包含根据[B3-2]所述的载体。

[B3-4]双特异性抗体的制造方法，包括培养根据[B3-3]所述的细胞，从培养上清液回收双特异性抗体。

[C1-1]药物组合物，其是用于与抗原结合分子的施用组合使用的、包含以抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC)被增强为特征的IgG抗体的药物组合物，

[C1-2]药物组合物，其是用于与以抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-DependentCellular Cytotoxicity；ADCC)被增强为特征的IgG抗体的施用组合使用的、包含抗原结合分子的药物组合物，

[C1-3]根据[C1-1]或[C1-2]所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子对抗原的K_D值，相对于接头切割前的抗原结合分子对抗原的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1或0.01以下。

[C1-4]根据[C1-1]～[C1-3]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是IgG抗体、IgG抗体样分子、重链抗体或单结构域抗体。

[C1-5]根据[C1-1]～[C1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子包含上述可变区或其抗原结合片段。

[C1-6]根据[C1-1]～[C1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，抗原结合分子包含抗体的可变区和恒定区、以及蛋白酶可切割接头，该接头位于上述恒定区内的CH1与CH2的边界附近。

[C1-7]根据[C1-1]～[C1-6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的抗体，接头切割后的抗原结合分子是该抗体的VL、VH或其抗原结合片段。

[C1-8]根据[C1-1]～[C1-6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子是包含蛋白酶可切割接头的重链抗体，接头切割后的抗原结合分子是该重链抗体的VHH。

[C1-9]根据[C1-1]～[C1-8]中任一项所述的药物组合物，其中，接头切割后的抗原结合分子是scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂、VH或VHH。

[C1-10]根据[C1-1]～[C1-9]中任一项所述的药物组合物，其中，IgG抗体识别切割了的接头、该接头的一部分、或包含该接头的部分。

[C1-11]根据[C1-1]～[C1-10]中任一项所述的药物组合物，其中，IgG抗体对接头切割后的抗原结合分子的K_D值，相对于IgG抗体对接头切割前的抗原结合分子的K_D值的比(K_D(切割后)/K_D(切割前))是0.1或0.01以下。

[C1-12]根据[C1-1]～[C1-11]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶切割序列。

[C1-13]根据[C1-1]～[C1-12]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[C1-14]根据[C1-1]～[C1-13]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头还包含柔性接头。

[C1-14]根据[C1-1]～[C1-13]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶是在靶标组织特异性表达的蛋白酶。

[C1-15]根据[C1-1]～[C1-14]中任一项所述的药物组合物，其中，靶标细胞是肿瘤细胞，且蛋白酶是肿瘤蛋白酶。

[C1-16]根据[C1-1]～[C1-15]中任一项所述的药物组合物，其用于在利用抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬能力(ADCP)的治疗或预防中使用。

[C1-17]根据[C1-1]～[C1-16]中任一项所述的药物组合物，其用于在癌的治疗或预防中使用。

[C1-18]根据[C1-17]所述的药物组合物，其中，癌选自由癌瘤、淋巴瘤、肉瘤、胚细胞瘤和白血病组成的组。

[C1-19]根据[C1-17]所述的药物组合物，其中，癌选自由B细胞谱系急性淋巴母细胞性白血病、B细胞慢性淋巴性白血病、B细胞非霍奇金淋巴瘤、乳癌、胃癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、肺癌、黑素瘤、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、卵巢癌、横纹肌肉瘤、白血病和霍奇金淋巴瘤组成的组。

[C1-20]根据[C1-1]～[C1-19]中任一项所述的药物组合物，其用于在IgG抗体疗法中使用。

[C2-1]IgG抗体，其是包含对于包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子，对经蛋白酶切割接头后的该抗原结合分子具有结合活性的抗体可变区的IgG抗体，

抗原结合分子在经蛋白酶切割接头后、对在靶标细胞表面表达的抗原具有结合活性，IgG抗体通过与接头切割后的抗原结合分子的结合，能够与靶标细胞结合。

[C2-2]根据[C2-1]所述的IgG抗体，其抗体依赖性细胞毒作用(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity；ADCC)被增强。

[C2-3]根据[C2-1]或[C2-2]所述的IgG抗体，其包含对Fcγ受体的结合活性增加的Fc区。

[C2-4]根据[C1-1]～[C1-3]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含蛋白酶切割序列。

[C2-5]根据[C1-1]～[C1-4]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头包含具有任一序列编号1～725的蛋白酶切割序列的肽。

[C2-6]根据[C1-1]～[C1-5]中任一项所述的药物组合物，其中，蛋白酶可切割接头还包含柔性接头。

[C3-1]核酸，其编码[C2-1]～[C2-6]中任一项所述的IgG抗体。

[C3-2]载体，包含根据[C3-1]所述的核酸。

[C3-3]细胞，包含根据[C3-2]所述的载体。

[C3-4]IgG抗体的制造方法，包括培养根据[C3-3]所述的细胞，从培养上清液回收IgG抗体。

[D1-1]药物组合物，其是用于与一级分子的施用组合使用的、包含二级分子的药物组合物，

一级分子包含蛋白酶可切割接头，在接头切割后对靶标抗原具有结合能力，

二级分子对接头切割后的一级分子具有结合能力，通过与接头切割后的一级分子的结合，能够与表达上述靶标抗原的细胞结合。

[D1-2]药物组合物，其是用于与二级分子的施用组合使用的、包含一级分子的药物组合物，

[D1-3]根据[D1-1]或[D1-2]所述的药物组合物，其中，一级分子为抗原结合分子，二级分子为双特异性抗体、嵌合受体、或以抗体依赖性细胞毒作用被增强为特征的IgG抗体。

[D1-4]根据[D1-1]～[D1-3]中任一项所述的药物组合物，其是[A1-1]～[A1-21]、[B1-1]～[B1-20]、及[C1-1]～[C1-20]中任一项所述的药物组合物。

附图简述

[图1]图1显示通过对抗体赋予对在如癌组织或炎症组织的病变部位表达量上升的蛋白酶的敏感性，扩大组织特异性和治疗剂量区间(治疗窗口；therapeutic window)的抗体技术(Probody(注册商标))的概念。

[图2]图2为显示经蛋白酶切割接头所产生的特异性识别抗原的抗体诱导TDCC活性的示意图。

[图3]图3为显示经蛋白酶切割接头所产生的特异性识别抗原的抗体诱导ADCC活性的示意图。

[图4]图4为显示经蛋白酶切割接头所产生的特异性识别抗原的抗体诱导TDCC活性的示意图。

[图5]图5为显示经蛋白酶切割接头所产生的特异性识别抗原的抗体诱导ADCC活性的示意图。

[图6-1]图6-1为显示通过特异性识别经蛋白酶切割的抗原结合分子的CAR-T诱导细胞毒性的示意图。

[图6-2]图6-2为显示通过特异性识别因蛋白酶切割而露出的抗原的CAR-T诱导细胞毒性的示意图。

[图7]图7显示插入蛋白酶切割序列(II型胶原蛋白的部分序列)的抗体经蛋白酶(MMP13)体外(in vitro)切割的结果。从左边泳道开始，对应孔1～5，孔1显示MWM，孔2及孔3分别显示不含切割序列的抗原结合分子的反应前和反应后，孔4及孔5分别显示包含切割序列的抗原结合分子添加MMP13的情形的反应前和反应后。

[图8]图8显示识别肿瘤抗原的抗体经蛋白酶(IdeS)体外(in vitro)切割的结果。从左边泳道开始，对应孔6～10，孔6显示MWM，孔7及孔8分别显示不含切割序列的抗原结合分子的反应前和反应后，孔9及孔10分别显示在包含切割序列的抗原结合分子添加IdeS的情形的反应前和反应后。

[图9]图9(左)显示插入蛋白酶切割序列(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子(抗体)经肿瘤细胞株处理的结果。图9(右)显示未插入蛋白酶切割序列(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子经肿瘤细胞株处理的结果。

[图10]图10显示经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子与抗切割接头抗CD3双特异性抗体结合的Biacore测定结果。

[图11]图11显示经蛋白酶切割的抗原结合分子(IgG1)与抗切割接头抗CD3双特异性抗体结合的Biacore测定结果。

[图12]图12显示经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子与ADCC活性增强抗体结合的Biacore测定结果。

[图13]图13显示经蛋白酶切割的抗原结合分子(IgG1)与ADCC活性增强抗体结合的Biacore测定结果。

[图14]图14为使用经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子(抗GPC3抗体，IgG1)和抗接头抗CD3双特异性抗体的Jurkat报导基因分析结果。

[图15]图15为使用经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子(抗GPC3抗体，IgG1)和抗接头抗CD3双特异性抗体的Jurkat报导基因分析结果。

[图16]图16为使用对经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子的ADCC活性增强的Jurkat报导基因分析结果。

[图17]图17为使用对经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子的ADCC活性增强的Jurkat报导基因分析结果。

[图18]图18为通过使用识别经蛋白酶切割了接头(II型胶原蛋白的部分序列)的抗原结合分子的抗接头抗CD3双特异性抗体和插入蛋白酶切割序列的抗GPC3抗体，经由人PBMC进行细胞毒性分析的结果。

[图19]图19为显示载体构建体及5’端到3’端的构架单位的构成元件的配置顺序的示意图。

[图20]图20为可切割MMP切割接头的PC-10细胞毒性的评估结果。残存癌细胞的比例以活细胞中的CD45-级分细胞的比例计算。横轴表示添加的抗原结合分子的浓度。

[图21]图21为几乎不能切割MMP切割接头的KYSE70细胞毒性的评估结果。残存癌细胞的比例以活细胞中的CD45-级分细胞的比例计算。横轴表示添加的抗原结合分子的浓度。

具体实施方式

本公开的其他特征及优点通过下列详细说明而明了。但是，从此详细说明出发，本领域技术人员当然可在本公开的主旨及范围内进行各种变更及改变，因此应该理解显示本公开的优选实施方案的详细说明及具体例仅用于说明目的。

以下，参照附图说明本公开的实施方案。

术语“实质上”、“约”或“大约”表示不显著地改变最终结果的被修饰语的合理偏差量，即，由本领域技术人员确定的特定值被容许的误差范围内。例如，约，根据该领域的实务，表示可容许的标准偏差。或者，“约”可表示某值的最大±20％，优选地为最大±10％，更优选地为最大±5％，进一步优选地为最大±1％。或者，特别地，在生物学系统或过程中，本术语表示从某值开始的一位数以内，优选地为2倍以内。当特定的值记载于本说明书及权利要求的范围时，除非另有说明，术语“约”隐含地意指在此上下文中对特定值的容许误差范围内。

在本说明书及权利要求的范围的英文翻译中使用时，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”及“该(the)”，除非有明示指出内容并非如此，则包含复数的指示语。另外，术语”或”，除非有明示指出内容并非如此，也应该注意，一般在包含“和/或”的意思范围内使用。

本公开中用端点列举的数值范围包含该范围内所包含的所有的数及分数(例如，1～5包含1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。另外，也应该理解所有的数及分数也可以术语“约”修饰。但是，在明确了数值范围所示的数值表示整数的情形时，可理解数值范围是限定性列举在范围中所包含的整数。这样的情形，例如1～5或1至5理解为限定性列举1、2、3、4和5。

进一步地，特定段落所记载的定义及实施方案，如本领域技术人员所理解，它们合适的话，旨在应用于记载的本说明书的其他实施方案。例如，在以下的下述中，更详细定义本公开的各个方面。如此定义的各个方面，除非有明确说明并非如此，则也可以与其他任何1个或多个方面组合。特别地，作为优选或有利所示的任何特征也都可以与作为优选或有利所示的其他任何1个或多个特征组合。

本公开中，存在将包含与靶标细胞表达的抗原结合的区域(“抗原结合结构域”)和蛋白酶可切割接头的抗原结合分子称为“一级分子”的情形。一级分子经蛋白酶切割接头，释放出与靶标细胞或病变细胞所表达的抗原(“靶标抗原”)结合的抗原结合片段。经蛋白酶切割接头所产生的抗原结合分子之一，称为“切割了接头的抗原结合分子”或“接头切割后的抗原结合分子”，包含抗原结合结构域和被切割的接头的一部分。存在将靶标细胞和效应细胞桥连、诱导细胞毒性的多肽称为“二级分子”的情形。作为二级分子，可以例举例如，具有可结合切割了接头的抗原结合分子的抗体可变区的具有ADCC活性的抗体、具有可结合切割了接头的抗原结合分子的抗体可变区和可结合T细胞受体复合体的抗体可变区的T细胞重定向抗体、或者具有可结合切割了接头的抗原结合分子的细胞外结构域的嵌合受体。抗原结合分子中包含的接头包含蛋白酶切割序列，具有被蛋白酶切割的切割位点。存在将由具有蛋白酶切割序列的肽组成的接头称为蛋白酶切割接头的情形。

在一个实施方案中，包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子(一级分子)是抗体，更具体地，可以例举包含蛋白酶可切割接头的IgG抗体或重链抗体，进一步优选地，可以例举IgG1抗体、骆驼科的重链抗体(hcIgG)或鲨鱼的重链抗体(IgNAR)。

在一个实施方案中，经蛋白酶切割了接头所产生的抗原结合分子可以例举Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、迷你抗体(minibody)、单链抗体分子(例如scFv)、VHH、VH，更具体地，Fab、scFv、VHH、VH。

本发明中的多肽通常是指有约4个氨基酸以上的长度的肽和蛋白质。另外，本发明中的多肽通常是由人为设计的序列所形成的多肽，但没有特别限定，例如也可以是来自生物的多肽。另外，也可以是天然多肽、或者是合成多肽、重组多肽等的任一种。进一步地，上述多肽的片段也包含于本发明的多肽中。

在本说明书中，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V所表示的，氨基酸以单字母编码或三字母编码、或以这两种表示。在表示特定位置处的某氨基酸时，合适地使用共同记载表示特定位置的数字和氨基酸的单字母编码或三字母编码的表述。例如，在单结构域抗体中包含的所谓的氨基酸37V的氨基酸表示在以Kabat编号表示的37位的位置处的Val。

为了改变抗体等多肽的氨基酸序列中的氨基酸，可适当采用定点诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR(Overlap extensionPCR)等公知方法。另外，作为置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多个公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35，225-249，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11)，6353-6357)。例如，也可合适地使用无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等，其终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制子tRNA包含与非天然氨基酸结合的tRNA。在本说明书中，作为改变可以例举置换，但不限于此。

本说明书中，在表示氨基酸的改变位置时使用的“和/或”的术语的意义，包含“和”和“或”适宜组合的所有组合。具体地，例如“置换第37位、第45位、和/或第47位的氨基酸”包含以下的氨基酸改变位置的变化：(a)第37位、(b)第45位、(c)第47位、(d)第37位及第45位、(e)第37位及第47位、(f)第45位及第47位、(g)第37位及第45位及第47位。

在本说明书中，作为表示氨基酸改变的表述，可合适地使用在表示特定位置的数字前后一同记载改变前和改变后的氨基酸单字母编码或三字母编码的表述。例如，增加在抗体可变区或单结构域抗体中包含的氨基酸置换时所用的称为F37V或Phe37Val的改变，表示用Kabat编号所示的第37位Phe置换为Val。即，数字表示Kabat编号所示的氨基酸位置，记载在其前的氨基酸单字母编码或三字母编码表示置换前的氨基酸，记载在其后的氨基酸单字母编码或三字母编码表示置换后的氨基酸。同样地，增加在抗体恒定区中包含的Fc区的氨基酸的置换时所用的称为P238A或Pro238Ala的改变表示EU编号所示的第238位的Pro置换为Ala。即，数字表示EU编号所示的氨基酸位置，记载在其前的氨基酸单字母编码或三字母编码表示置换前的氨基酸，记载在其后的氨基酸单字母编码或三字母编码表示置换后的氨基酸。

在本说明书中，术语“抗体”以最广泛的意义使用，只要是显示所期望的抗原结合活性即可，包括含有单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、单结构域抗体及抗体片段的各种抗体结构，但不限于此。

“抗体片段”是指包含与完全抗体结合的抗原结合的该完全抗体的一部分的、该完全抗体以外的分子。抗体片段的例子包括Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)₂、双体(diabody)、线状抗体、单链抗体分子(如scFv)、及由抗体片段形成的多特异性抗体，但不限于此。

术语“全长抗体”、“完全抗体”及“全部抗体”在本说明书可相互交换使用，是指具有实质上与天然抗体结构类似的结构，或本说明书所定义的具有包含Fc区的重链的抗体。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体对抗原的结合的抗体的重链或轻链的结构域。抗体的重链及轻链的可变结构域(分别为VH及VL)通常具有各可变结构域包含4个保守的构架区(FR)及3个互补决定区(CDR)的类似结构。(例如参考，Kindt等人，KubyImmunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.，page 91(2007))一个VH或VL结构域可能充分提供抗原结合特异性。

本说明书所使用的术语“互补决定区”或“CDR”是指，在序列中为超可变，和/或形成结构上固定的环(“超可变环”)，和/或抗原接触残基(“抗原接触”)、抗体的可变结构域的各区域。通常，抗体包含6个CDR：3个在VH(H1、H2、H3)、及3个在VL(L1、L2、L3)。本说明书例示的CDR包含下列：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)处产生的超可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)处产生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，Naional Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；

(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及93-101(H3)处产生的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及

(d)包含HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、及94-102(H3)的(a)、(b)、和/或(c)的组合。

如果没有另外明记，CDR残基及可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在本说明书根据上数Kabat等人的编号。

“构架”或”FR”是指互补决定区(CDR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由4个FR结构域：FR1、FR2、FR3、及FR4组成。相对应地，CDR及FR的序列通常以下列顺序在VH(或VL)出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

在本说明书中，术语“恒定区”或“恒定结构域”是指，抗体的可变区以外的部分。例如，IgG抗体为由二硫键连接的2个相同的轻链和2个相同的重链所构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，从N端向C端，各重链具有称为可变重链结构域或重链可变结构域的可变区(VH)，接下来为包含CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域的重链恒定区(CH)。同样地，从N端向C端，各轻链具有称为可变轻链结构域或轻链可变结构域的可变区(VL)，接下来为恒定轻链(CL)结构域。天然抗体的轻链，也可基于其恒定结构域的氨基酸序列，归属于称为kappa(κ)或lamda(λ)的2型的其中1型。

在本说明书中，术语“Fc区”用于定义至少包含恒定区一部分的免疫球蛋白重链的C端区。此术语包含天然序列的Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，在人IgG1的情形，重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基末端。但是，Fc区的C末端的赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(Gly446-Lys447)可以存在或不存在。在本说明书除非有特别限定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD 1991记载的EU编号系统(也称为EU Index)。

抗体的“类”是指抗体重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。抗体有5个主要类：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM。其中一些也可以再分为亚类(同种型)。例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2。对应不同类的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。

在本说明书中，“抗原结合结构域”只限于与目标抗原结合的区域。抗原结合结构域也可使用与目标抗原结合的任何结构的结构域。作为这样的结构域的例子，例如抗体的重链可变区(VH)及抗体的轻链可变区(VL)、单结构域抗体(sdAb)、存在于生物体内的细胞膜蛋白Avimer所含的约35个氨基酸的称为A结构域的模块(国际公开WO2004/044011、WO2005/040229)、包含与细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白质结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin(国际公开WO2002/032925)、使构成由蛋白质A的58个氨基酸组成的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域支架化(scaffold)的Affibody(国际公开WO1995/001937)、在具有包含33个氨基酸残基的转角和2个反平行的螺旋及环的亚单元重复累积的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(DesignedAnkyrin Repeat proteins)(国际公开WO2002/020565)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等的脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反平行链在中央方向支持扭曲的桶状结构的一侧的4个环区域的Anticalin等(国际公开WO2003/029462)、在七鳃鳗、盲鳗等无颚类的作为后天免疫系统的不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富含亮氨酸残基的重复序列(leucine-rich-repeat(LRR))模块重复累积的马蹄型结构内部的平行片层结构的凹陷区域(国际公开WO2008/016854)，但不限于此。

作为本发明的抗原结合结构域的合适例子，可以例举只以该抗原结合结构域所构成的分子发挥抗原结合功能的抗原结合结构域、自连接的其他肽游离后可单独发挥抗原结合功能的抗原结合结构域等。作为这样的抗原结合结构域的例子，可以例举单结构域抗体、scFv、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)₂等，但不限于此。

作为本发明的抗原结合结构域的合适例子之一，可以例举分子量60kDa以下的抗原结合结构域。作为这样的抗原结合结构域的例子，可以例举单结构域抗体、scFv、Fab、Fab’，但不限于此。分子量60kDa以下的抗原结合结构域通常作为单体存在于血液中时，发生经肾脏清除的可能性高(参见J Biol Chem，1988Oct 15；263(29)：15064-70)。

从另一方面来看，作为本发明的抗原结合结构域的合适例子之一，可以例举血液中半寿期为12小时以下的抗原结合结构域。作为这样的抗原结合结构域的例子，可以例举单结构域抗体、scFv、Fab、Fab’等，但不限于此。

作为本发明的抗原结合结构域的合适例子之一，可以例举单结构域抗体(sdAb)。

在本说明书中，术语“单结构域抗体”只要是可以单独以其结构域发挥抗原结合活性的抗体即可，不限定其结构。相对于以IgG抗体等例示的常规抗体经由VH和VL配对形成可变区的状态显示抗原结合活性，已知单结构域抗体不与其他结构域配对，单结构域抗体以本身的结构域构造可单独发挥抗原结合活性。单结构域抗体通常具有较低分子量，以单体形式存在。

作为单结构域抗体的例子，可以例举例如像骆驼科动物的VHH、鲨鱼的VNAR这样的先天缺乏轻链的抗原结合分子、或包含抗体的VH结构域全部或一部分或VL结构域全部或一部分的抗体片段，但不限于此。作为包含抗体的VH/VL结构域全部或一部分的抗体片段的单结构域抗体的例子，可以例举例如美国专利第6,248,516号B1等记载的从人抗体VH或人抗体VL起始、人为制备的单结构域抗体，但不限于此。在本发明的一些实施方案中，1个单结构域抗体具有3个CDR(CDR1、CDR2、及CDR3)。

在单结构域抗体为VHH或单结构域VH抗体的情形，单结构域抗体的CDR例示地包含以下：

(a)在氨基酸残基26-32(CDR1)、53-55(CDR2)、及96-101(CDR3)处产生的超可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基31-35b(CDR1)、50-65(CDR2)、及95-102(CDR3)处产生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；

(c)在氨基酸残基30-35b(CDR1)、47-58(CDR2)、及93-101(CDR3)处产生的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及

(d)包含CDR氨基酸残基26-35(CDR1)、26-35b(CDR1)、49-65(CDR2)、93-102(CDR3)、或94-102(CDR3)的(a)、(b)、和/或(c)的组合。

在单结构域抗体为单结构域VL抗体的情形，单结构域抗体的CDR例示地包含以下：

(a)在氨基酸残基26-32(CDR1)、50-52(CDR2)、及91-96(CDR3)处产生的超可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；

(b)在氨基酸残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)、及89-97(CDR3)处产生的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))；

(c)在氨基酸残基27c-36(CDR1)、46-55(CDR2)、及89-96(CDR3)处产生的抗原接触(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；以及

(d)包含CDR氨基酸残基46-56(CDR2)、47-56(CDR2)、48-56(CDR2)的(a)、(b)、和/或(c)的组合。除有另外记载，CDR残基及可变结构域中的其他残基(例如FR残基)在本说明书根据上述Kabat等人的编号。

单结构域抗体可以从可产生单结构域抗体的动物，或通过免疫可产生单结构域抗体的动物而获得。作为可产生单结构域抗体的动物的例子，可以例举例如骆驼科动物、导入了可产生单结构域抗体的基因的转基因动物(transgenic animals)。骆驼科动物包含骆驼、骆马、羊驼、单峰骆驼、及原驼(guanaco)等，但不限于此。作为导入了可产生单结构域抗体的基因的转基因动物的例子，可以例举国际公开WO2015/143414号、美国专利公开US2011/0123527号A1所记载的转基因动物，但不限于此。通过将从动物取得的单结构域抗体的构架序列替换为人种系序列或类似序列，也可获得人源化单结构域抗体。人源化单结构域抗体(例如人源化VHH)也是本发明的单结构域抗体的一个实施方案。

另外，单结构域抗体可从包含单结构域抗体的多肽文库经ELISA、淘选(panning)等获得。包含单结构域抗体的多肽文库的例子，可以例举例如从各种动物或人获得的天然抗体文库(例如：Methods in Molecular Biology 2012 911(65-78)、Biochimica etBiophysica Acta-Proteins and Proteomics 2006 1764：8(1307-1319))、通过免疫各种动物而获得的抗体文库(例如：Journal of Applied Microbiology 2014 117：2(528-536))、或自各种动物或人的抗体基因制备的合成抗体文库(例如：Journal ofBiomolecular Screening 2016 21：1(35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016291：24(12641-12657)、AIDS 2016 30：11(1691-1701))，但不限于此。

在本说明书中，“抗原”只限于包含与抗原结合结构域结合的表位的那些。抗原的合适例子可以例举例如来自动物或人的肽、多肽、蛋白质，但不限于此。在本发明中，靶标抗原为用于治疗起因于靶标组织的疾病用的抗原，作为其合适的优选例子，可以例举例如在靶标细胞(如癌细胞、发炎细胞)的表面表达的分子、或在包含靶标细胞的组织中的其他细胞表面表达的分子、在对靶标细胞和包含靶标细胞的组织具有免疫作用的细胞的表面表达的分子、存在于包含靶标细胞的组织的间质中的大分子等，但不限于此。下列所示的抗原可列举为靶标抗原的例子。

作为抗原，为如下所述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、活化素(activin)、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、青蒿琥酯(Artemin)、抗Id、ASPARTIC、心房性钠利尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMIP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾素(Bombesin)、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素(Calcitonin)、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A(Cathepsin A)、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白质)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳糖凝集素-9(galectin-9)、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白(cytokeratin)肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体调控因子(衰变加速因子(Decay acceleratingfactor))、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛(digoxin)、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素(endothelin)受体、脑啡肽酶(enkephalinase)、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin 1)、EpCAM、蝶素(ephrin)B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素(E-selectin)、ET-1、凝血因子IIa、凝血因子VII、凝血因子VIIIc、凝血因子IX、纤维母细胞活化蛋白质(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白(Ferritin)、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白(fibrin)、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激激素、趋化因子配体(fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素(myostatin))、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、升糖素(glucagon)、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白(envelope glycoprotein)、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMVUL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、肝素酶(heparanase)、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子黑色素肿瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心脏肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素(inhibin)、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶(kallikrein)2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白(laminin)5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在性TGF-1、潜在性TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体生长激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、黏蛋白(Muc1)、MUC18、穆勒氏抑制物质(mullerianinhibiting substance)、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘着蛋白(N-Cadherin)、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶(neprilysin)、神经营养因子-3、-4、或-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘着蛋白(P-cadherin)、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异的(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RI(ALK-5)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、甲状腺刺激激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFFR)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RICD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbRTNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(FasApo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAILR1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHTHVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll样受体)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达lewis Y相关碳水化合物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶(Urokinase)、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘着蛋白(VE-Cadherin)、VE-钙粘着蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、温韦伯氏因子(von Willebrand factor)、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽释放酶(prekallikrein)、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白(Chromogranin)A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原(high molecular weightkininogen)、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b，C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素(properdin)、硬化蛋白(sclerostin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、纤维蛋白(fibrin)、凝血酶原(prothrombin)、凝血酶(thrombin)、组织因子、凝血因子V、凝血因子Va、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子VIIIa、凝血因子IX、凝血因子IXa、凝血因子X、凝血因子Xa、凝血因子XI、凝血因子XIa、凝血因子XII、凝血因子XIIa、凝血因子XIII、凝血因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶(antithrombin)III、EPCR、凝血调节蛋白(thrombomodulin)、TAPI、tPA、纤溶酶原(plasminogen)、纤溶酶(Plasmin)、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体聚糖-1(Syndecan-1)、多配体聚糖-2(Syndecan-2)、多配体聚糖-3(Syndecan-3)、多配体聚糖-4(Syndecan-4)、LPA、S1P、以及激素及生长因子用的受体。

在上述抗原的例子中，虽然也记载了受体，但这些受体即使在生物体液中以可溶型存在的情形，也可作为与本发明的抗原结合结构域结合的抗原使用。作为这样的可溶型受体的一个非限定方案，可例示例如Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10)，4958-4968)所记载的可溶型IL-6R的蛋白质。

在上述抗原的例子中，包含在细胞膜表达的膜型分子以及从细胞分泌至细胞外的可溶型分子。在本发明的抗原结合结构域与从细胞分泌的可溶型分子结合的情形，作为该抗原结合结构域，其具有中和活性时合适的。

对可溶型分子存在的溶液没有限制，可溶型分子可存在于生物体液，即充满活体内的血管或组织、细胞之间的所有液体。在一个非限定方案中，与本发明的抗原结合结构域结合的可溶型分子可存在于细胞外液。细胞外液是指在脊椎动物的血浆、组织间液、淋巴液、致密结缔组织、脑脊髓液、骨髓液、穿刺液或关节液等的骨及软骨中的成分、肺泡液(支气管肺泡洗净液)、腹水、胸水、心囊水、囊胞液、或眼房水(房水)等的细胞透过液(细胞的主动运输、分泌活动的结果所产生的各种腺腔内的液体，及消化管腔其他体腔内液体)的总称。

术语“肿瘤抗原”是指在癌细胞表达的抗原，其表达和细胞的恶性变化相关而被识别的具有抗原性的生物体分子。本公开的肿瘤抗原包含肿瘤特异性抗原(只存在于肿瘤细胞，在其他正常细胞未发现的抗原)、及肿瘤相关抗原(在其他器官及组织或异种及同种异型的正常细胞也存在的抗原，或在发生和/或分化时表达的抗原)。另外，细胞癌变时在细胞表面或蛋白质分子上出现的异常糖链也是肿瘤抗原，也称为癌糖链抗原。本发明的一个方案中，靶标抗原为肿瘤抗原。

作为肿瘤抗原的例子，可以合适地例举例如作为上述受体，属于GPI锚型受体家族但在以肝癌为首的几种癌中表达的GPC3(Int J Cancer.(2003)103(4)，455-65)、在以肺癌为首的多个癌表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A.(1989)86(1)，27-31)(分别地，其多核苷酸序列记载为RefSeq登录号NM_002354.2、多肽序列记载为RefSeq登录号NP_002345.2)、EGFR、CA19-9、CA15-3、唾液酸(sialyl)SSEA-1(SLX)、Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤抗原-125(CA-125)、钙网蛋白(calreticulin)、MUC-1、MUC-16、上皮性膜蛋白(EMA)、上皮性肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、嗜铬粒蛋白(chromogranin)、细胞角蛋白(cytokeratin)、肌间线蛋白(desmin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、肉眼囊胞性疾病液体蛋白质(巨囊性病的液状蛋白(gross cystic disease fluid protein))(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白Melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经纤维丝(neurofilament)、神经特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素(synaptophysin)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形(肿瘤M2-PK)、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、精子蛋白质17(Sp17)、间皮素(mesothelin)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺1的6次跨膜型上皮抗原)、TROP-2、Claudin6、RNF43a、异常ras蛋白、或异常p53蛋白、整合素αvβ3(CD61)、半乳糖凝集素(galectin)、K-Ras(V-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)或Ral-B等。

进一步地，也可以例举促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2亚组1、CRACC、SLAMF7、CD319及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；Tn抗原(Tn Ag)；T抗原(T Ag)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2)；白介素11受体α(IL-11Ra)；白介素2受体α(IL-2Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚性抗原-4(SSEA-4)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基β型9(LMP2)；蝶素A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1(fucosylGM1)；唾液酸化Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；密连蛋白(Claudin)6(CLDN6)；G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的六碳糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；Uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白(Pannexin)3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体、基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ选择性阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤(Wilms’stumor)蛋白质(WT1)；位于染色体12p的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白质17(SPA17)；X抗原家族、成员1A(XAGE1)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位切割位点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜型蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡萄糖胺转移酶V(NA17)；Paired Box蛋白质Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；T细胞3识别的扁平上皮细胞肿瘤抗原(SART3)；Paired Box蛋白质Pax-5(PAX5)；前顶体素(proacrosin)结合蛋白p32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤、X切割位点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白受体样亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓间质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模式的黏液素样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂肌醇聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)等。

“MHC抗原”为主要组织相容性复合体(MHC)的基因产物，其中，在细胞膜表达的糖蛋白主要分类为MHC I类抗原和MHC II类抗原。MHC I类抗原包含HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC II类抗原包含HLA-DR、-DQ、-DP。另外，也包含由这些MHC抗原呈递的来自肿瘤抗原的肽。对于呈递GP100、MART-1、MAGE-1等的肿瘤抗原、或RAS或p53等的变异部分的MHC的复合体，也被视为是肿瘤抗原之一。

“分化抗原”是巨噬细胞、T细胞、B细胞等伴随从骨髓干细胞的分化而消长的细胞表面分子的总称。分化抗原可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CDl4、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD70、CD71、CD73、CD95、CD99、CD102、CD106、CD117、CD122、CD126、CDw130。

术语“肿瘤”一般是指在身体表面或体内、触感为团块或具有颜色不同的部分等的总称。肿瘤中存在具有自律性增生、浸润或转移、恶病质这3个特征的恶性，以及只有自律性增生为特征的良性，恶性肿瘤“癌”指以异常细胞无法控制生长为特征的疾病。癌细胞有局部地或通过血流及淋巴系统，蔓延至身体的其他部分的可能性。在本公开中描述了多种癌的例子，可以例举例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰脏癌、结肠直肠癌、肾脏癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及同种的癌，但不限于此。术语“肿瘤”和“癌”在本公开中同义使用，例如任一术语均包含实体及液性、如弥漫性或循环性的肿瘤。术语“癌”或“肿瘤”在本公开使用时，包含癌前期的同样恶性的癌及肿瘤。

作为本公开的抗癌剂或后述的癌治疗方法中的癌，可例举腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈部癌、子宫癌、肝癌、肾脏癌、胰脏癌、脾脏癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌等的癌，或骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织及造血组织的癌以外，还有软骨肉瘤、尤文氏肉瘤(Ewing’s Sarcoma)、恶性血管内皮细胞瘤、恶性许旺细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等的肉瘤，或肝胚细胞瘤(hepatoblastoma)、髓母细胞瘤(medulloblastoma)、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、胰胚细胞瘤、胸膜肺胚细胞瘤(pleuropulmonary blastoma)、视网膜胚细胞瘤(retinoblastoma)等的母细胞瘤或胚细胞肿瘤、淋巴瘤、或白血病。

在一个实施方案中，与癌种类相关的肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如系统性标记物，如B细胞上的CD19。在某个特定实施方案中，本公开的肿瘤抗原来自癌，所述癌包含原发性或转移性黑色素肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾脏癌、及腺癌，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌及同种癌，但不限于它们。在一个实施方案中，肿瘤抗原是特定的增生性疾病共有的抗原。在一个实施方案中，癌相关抗原为，相较于正常细胞，在癌细胞中过度表达，例如，与正常细胞相比，为1倍的表达、2倍的过度表达、3倍的过度表达或以上的细胞表面分子。在一部分实施方案中，癌相关抗原为在癌细胞不适当地合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一个实施方案中，癌相关抗原以全长或片段(如MHC/肽)排他性在癌细胞的细胞表面表达、但在正常细胞表面未合成也未表达。在一部分实施方案中，本公开的嵌合受体及TRAB包含含有与经MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR及TRAB。通常，来自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的凹槽中，经CD8⁺T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。经所有有核细胞组成型表达MHC I类复合体。在癌中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体为免疫疗法用的细胞表面靶标的特有型的代表。在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形，已描述了以来自病毒或肿瘤抗原的肽为靶标的TCR样抗体(例如Sastry等人，J Virol.2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Bood，2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer GeneTher 2012 19(2)：84-100)。例如，TCR样抗体可通过筛选人scFv噬菌体展示文库等的文库而鉴定。

意指存在于抗原中的抗原决定基的表位是指与本说明书中公开的抗原结合结构域结合的抗原上的部位。因此，例如表位可根据其结构来定义。另外，根据识别该表位的抗原结合结构域对抗原的结合活性，也可定义该表位。在抗原为肽或多肽的情形，根据构成表位的氨基酸残基，也可确定表位。另外，在表位为糖链的情形，根据特定的糖链结构也可确定表位。

线性表位为这样的表位，其包含氨基酸一级序列被识别的表位。线性表位典型地包含在固有序列中的至少3个、最普通至少5个，例如约8到10个、6到20个氨基酸。

与线性表位相反，立体表位不是包含表位的氨基酸一级序列为被识别的表位的单一定义成分的表位(例如，氨基酸的一级序列不一定是被特定表位的抗体所识别的表位)。立体表位，相对于线性表位，可包含增大数目的氨基酸。关于立体表位的识别，抗原结合结构域识别肽或蛋白质的三级结构。例如，当蛋白质分子折叠形成三级结构时，形成立体表位的氨基酸和/或多肽主链并列，抗体可识别表位。确定表位的立体结构的方法，包括例如X光结晶学、二维核磁共振光谱学及部位特异性自旋标签及电磁顺磁共振光谱学，但不限于此。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)，第66卷，Morris(编)。

与表位结合的抗原结合结构域的结构称为互补位。通过作用在表位和互补位之间的氢键、静电力、范德华力、疏水键等，使表位和互补位稳定结合。该表位和互补位之间的结合力称为亲和力。多个抗原和多个抗原结合结构域结合时的结合力的总和称为亲合力(avidity)。在包含多个抗原结合结构域的(即，多价的)抗体等与多个表位结合时，由于亲和力(affinity)加成作用，因此亲合力高于亲和力。

在特定的实施方案中，本说明书所提供的抗原结合结构域具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10^-8M以下，例如10^-8M～10^-13M，例如10^- ⁹M～10^-13M)的解离常数(Kd)。

下文中，针对抗原的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子对表位的结合的确认方法，可根据下列例子合适地实施。

例如，针对某抗原的抗原结合结构域识别存在于某抗原分子中的线性表位，例如可以如下确认。为了上述目的，合成由构成某抗原的细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽。该肽可化学合成。或者，利用某抗原的cDNA中编码相应于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，经基因工程方法获得。接下来，评估由构成细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽与针对某抗原的抗原结合结构域的结合活性。例如，通过以固定的线性肽作为抗原的ELISA，可评估该抗原结合结构域针对该肽的结合活性。或者，基于在该抗原结合结构域针对某抗原表达细胞的结合中，因线性肽而引起的抑制水平，可获知针对线性肽的结合活性。通过这些试验，可获知该抗原结合结构域对线性肽的结合活性。

另外，针对某抗原的抗原结合结构域识别立体表位，可如下所述的确认。为了上述目的，制备表达某抗原的细胞。可以例举针对某抗原的抗原结合结构域在与某抗原表达细胞接触时，与该细胞强力结合，另一方面，该抗原结合结构域对由固定的构成某抗原的细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽或者该抗原结合结构域对使用胍等常规变性剂而变性的构成某抗原的细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽，实质上不结合时等。此处，实质上不结合是指结合活性为对人的某抗原表达细胞的结合活性的80％以下，通常50％以下，优选地30％以下，特别优选地15％以下的结合活性。

另外，作为确认抗原结合结构域的抗原结合活性的方法，例如通过放射性标记抗原结合测定法(radiolabeled antigen binding assay；RIA)测定Kd值的方法。在一个实施方案中，RIA使用目标抗原结合结构域及其抗原来进行。例如，针对抗原的抗原结合结构域在溶液中的结合亲和力可通过在非标记抗原的渐增量系列存在下经最小浓度的(125I)标记抗原使抗原结合结构域平衡化，接下来通过包被有抗原结合结构域的板捕捉结合的抗原来测定(参见例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。

根据另一实施方案，Kd使用BIACORE(注册商标)的表面等离子共振法测定。例如使用BIACORE(注册商标)-2000或BIACORE(注册商标)-3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)的测定法，使用固定有约10反应单位(response unit：RU)的抗原的CM5芯片在25℃实施。在一个实施方案中，将羧甲基化葡聚糖生物传感芯片(CM5，BIACORE，Inc)，根据供货商的指南，使用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。抗原在以5μl/分钟的流速注入之前，使用10mM醋酸钠pH 4.8稀释成5μg/ml(约0.2μM)，以达到约10反应单位(RU)的蛋白质结合。抗原注入后，为了封闭未反应基团，注入1M乙醇胺。为了测定动力学，在25℃以约25μl/分钟的流速注入含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20(注册商标))表面活性剂的PBS(PBST)中的抗原结合结构域的2倍系列稀释物(0.78nM～500nM)。结合速度(kon)及解离速度(koff)以使用简单的一对一朗缪尔结合模型(BIACORE(注册商标)评估软件3.2版)，同时拟合结合及解离的传感图来计算。平衡解离常数(Kd)以koff/kon之比来计算。进一步地，通过使用平衡法分析，也可求得表观解离常数(Kd)。这些方法参考BIACORE(注册商标)所附的操作手册。例如参考Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)或Methods Enzymol.2000；323：325-40。另外，在表面等离子共振测定法中，固定的蛋白质质量或用于反应的蛋白质质量、温度、溶液组成也可由本领域技术人员变更。根据上述表面等离子共振测定法，离子速度超过10⁶M^-1s^-1的情形，离子速度可使用在分光计(例如停流式分光光度计(Aviv Instruments)或使用搅拌比色皿的系列8000的SLM-AMINCO(注册商标)分光光度计(ThermoSpectronic))中所测定的、在渐增浓度的抗原存在下，测定在PBS pH7.2中20nM的抗原结合结构域在25℃的荧光发光强度(激发＝295nm；发光＝340nm、带通16nm)的增加或减少的荧光消光技术而确定。

进一步地，抗原结合结构域的抗原结合活性也能够以电化学发光法等已知的分子间相互作用的测定方法来测定。

作为测定针对某抗原的抗原结合结构域对某抗原的表达细胞的结合活性的方法，可以例举例如Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，通过以某抗原的表达细胞作为抗原的ELISA或FACS(fluorescence activated cell sorting；荧光活化的细胞分选法)的原理而可评估。

在ELISA形式中，通过比较经酶反应所产生的信号水平来定量评估针对某抗原的抗原结合结构域对该抗原的表达细胞的结合活性。即，在固定有某抗原的表达细胞的ELISA板中加入受检抗原结合结构域，利用识别受检抗原结合结构域的酶标记抗体，检测出与细胞结合的受检抗原结合结构域。或者，在FACS中，制备受检抗原结合结构域的稀释系列，通过确定对某抗原表达细胞的抗体结合滴度(titer)，可比较受检抗原结合结构域对某抗原表达细胞的结合活性。

受检的抗原结合结构域对悬浮于缓冲液等的细胞的表面上表达的抗原的结合，可通过流式细胞术检测。作为流式细胞术，已知有例如以下的装置。

FACSCantoTM II

FACSAriaTM

FACSArrayTM

FACSVantageTM SE

FACSCaliburTM(皆为BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(皆为Beckman Coulter社的商品名)。

例如，作为针对某抗原的抗原结合结构域对抗原的结合活性的合适测定方法的一个例子，可以例举以下方法。首先，以识别与表达某抗原的细胞反应的受检抗原结合结构域的FITC标记的二级抗体染色。以适当合适的缓冲液稀释受检抗原结合结构域，将该抗原结合结构域制备为所希望的浓度来使用。例如，可在10μg/ml到10ng/ml之间的任一浓度使用。接着，用FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗原结合结构域对该细胞的结合量反映为通过用CELL QUEST Software(BD公司)分析所获得的荧光强度，即，几何平均(Geometric Mean)值。即，通过获得该几何平均值，可测定由受检抗原结合结构域的结合量所表示的受检抗原结合结构域的结合活性。

针对某抗原的抗原结合结构域与某抗原结合结构域共有表位时，可通过这两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合结构域之间的竞争可通过交叉阻断测定法等检测。例如，竞争性ELISA测定法为优选的交叉阻断测定法。

具体地，在交叉阻断测定法中，包被在微量滴定板的孔上的某抗原蛋白，在成为候补的竞争抗原结合结构域的存在下或不存在下预温育后，添加受检抗原结合结构域。与孔中的某抗原蛋白结合的受检抗原结合结构域的量，与针对相同表位结合竞争的成为候补的竞争抗原结合结构域的结合能力间接相关。即，对同一表位的竞争抗原结合结构域的亲和性越大，受检抗原结合结构域对包被有某抗原蛋白的孔的结合活性越低。

经某抗原蛋白的介导与孔结合的受检抗原结合结构域的量，可通过预先标记抗原结合结构域而容易地测定。例如，可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和合适的底物测定经生物素标记的抗原结合结构域。利用过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定法特别地称为竞争性ELISA测定法。抗原结合结构域能够以可检测或测定的其他标记物质标记。具体地，公知放射性标记或荧光标记等。

与在候补的竞争抗原结合结构域结合体不存在下所实施的对照试验中所获得的结合活性相比较，如果竞争抗原结合结构域可阻断针对某抗原的抗原结合结构域的结合至少20％、优选地至少20-50％、更优选地至少50％，则该受检抗原结合结构域和竞争抗原结合结构域实质上与相同的表位结合，或是竞争对同一表位的结合的抗原结合结构域。

在鉴定针对某抗原的抗原结合结构域结合的表位的结构的情形，可通过比较受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域这两者对于在构成该表位的肽导入氨基酸改变的肽或多肽的结合活性来评估受检抗原结合结构域与对照抗原结合结构域共有表位。

作为测定如此结合活性的方法，例如在上述ELISA形式中，可通过比较受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域对导入变异的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，也可通过使受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域流过结合有变异肽的管柱后，定量洗脱液中所洗脱的抗原结合结构域，测定对结合于管柱的该变异肽的结合活性。使变异肽与例如GST作为融合肽吸附于管柱的方法是公知的。

另外，在已鉴定的表位为立体表位的情形，可以下列方法评估受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域共有表位。首先，制备表达某抗原的细胞和表达表位导入变异的某抗原的细胞。向这些细胞悬浮在PBS等合适缓冲液的细胞悬浮液添加受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域。接着，对于以适当缓冲液洗净的细胞悬浮液，添加可识别受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的FITC标记抗体。经标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数以FACSCalibur(BD公司)测定。受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的浓度以合适的缓冲液适当稀释，制备成所希望的浓度使用。例如，在10μg/ml至10ng/ml之间的任一浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量反映为通过使用CELL QUEST Software(BD公司)分析所获得的荧光强度，即，几何平均值值。即，通过获得该几何平均值，可测定由标记抗体的结合量所表示的受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的结合活性。

进一步地，除上述ELISA或FACS以外，也可利用放射性标记抗原结合测定法(radiolabeled antigen binding assay：RIA)、BIACORE(注册商标)表面等离子共振测定法、电化学发光法等确认抗原结合结构域对与其他抗原结合结构域相同的表位的竞争。

将反映分析所获得的受检抗原结合结构域对变异的某抗原的表达细胞的结合量的几何平均值的比较值(变异的某抗原的分子ΔGeo-Mean值)，和反映受检抗原结合结构域对某抗原的表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean值，进行比较。在此情形，在求对变异的某抗原的表达细胞及某抗原的表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时所使用的受检抗原结合结构域的浓度特别优选地制备为相同或实质上相同的浓度。利用预先确认的识别某抗原中的表位的抗原结合结构域作为对照抗原结合结构域。

受检抗原结合结构域对变异的某抗原的表达细胞的ΔGeo-Mean比较值，如果小于受检抗原结合结构域对某抗原的表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选地50％、更优选地30％、特别优选地15％，则为“与变异的某抗原的表达细胞实质上不结合”。求ΔGeo-Mean值(Geometric Mean)的计算式记载于CELL QUEST Software User’s Guide(BDBiosciences公司)。通过比较比较值，如果为实质上可视为相同的程度，则可评估受检抗原结合结构域和对照抗原结合结构域的表位相同。

本说明书中术语“搬运部分”是指抗原结合分子中的抗原结合结构域以外的部分。本发明的搬运部分通常为由氨基酸构成的肽或多肽，作为一个具体实施方案，抗原结合分子中的搬运部分通过切割位点与抗原结合结构域连接。本发明的搬运部分可以是通过酰胺键连接一连串的肽或多肽，也可以是多个肽或多肽经二硫键等的共价键或氢键、疏水性相互作用等的非共价键所形成的复合体。

在本发明的一些实施方案中，与接头切割前的抗原结合分子相比，接头切割后的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高。换言之，通过接头的切割而去除的部分，抗原结合分子的抗原结合结构域的抗原结合活性为经抑制结构域而受到抑制的状态。作为确认抗原结合结构域的抗原结合活性被抑制结构域抑制的方法，有FACS(fluorescence activatedcell sorting；荧光活化的细胞分选法)、ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay；酶联免疫吸附测定法)、ECL(electrogenerated chemiluminescence；电化学发光法)、SPR(Surface Plasmon Resonance表面等离子共振)法(Biacore)、BLI(Bio-LayerInterferometry；生物膜干涉技术)法(Octet)等的方法。在本发明的一些实施方案中，与接头切割前的抗原结合分子的结合活性相比，接头切割后的抗原结合分子的结合活性成为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的值。在本发明更具体的一些实施方案中，游离前的抗原结合结构域自上述方法选择一种方法进行抗原结合结构域的抗原结合活性的测定时，未发现抗原结合结构域与抗原的结合。

在本发明的一些实施方案中，抗原结合活性的比较，可通过比较接头切割前后的抗原结合活性来进行。即，与使用接头切割前的抗原结合分子所测定的抗原结合活性相比，使用接头切割后的抗原结合分子所测定的抗原结合活性成为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的值。在更具体的一些实施方案中，接头切割前的抗原结合分子自上述方法选择一种方法进行抗原结合活性的测定时，未发现抗原结合结构域与抗原的结合。

在本发明的一些实施方案中，由于抗原结合分子具有的接头被蛋白酶切割，在这样的方案中抗原结合活性的比较可通过比较抗原结合分子在蛋白酶处理前后的抗原结合活性来进行。即，与使用未进行蛋白酶处理的抗原结合分子测定的抗原结合活性相比，使用蛋白酶处理后的抗原结合分子所测定的抗原结合活性成为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、或3000倍以上的值。在更具体的一些实施方案中，未进行蛋白酶处理的抗原结合分子用自上述方法选择一种方法进行抗原结合活性的测定时，未发现抗原结合结构域与抗原的结合。

在本发明中，与接头切割后的抗原结合分子相比，接头切割前的抗原结合分子具有较长的血液中半寿期。为了使抗原结合分子的半寿期变得更长，在本发明的一些实施方案中，将接头切割前的抗原结合分子设计为具有较长的血液中半寿期。作为延长血液中半寿期的实施方案的例子，可以例举例如接头切割前的抗原结合分子的分子量大、或具有FcRn结合性、或具有白蛋白结合性或PEG化，但不限于此。

在本发明中，半寿期的比较优选比较在人血液中的半寿期。当测定在人血液中的半寿期有困难的情形，可根据在小鼠(例如，正常小鼠、表达人抗原的转基因小鼠、表达人FcRn的转基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)的血液中半寿期来预测在人血液中的半寿期。

作为延长抗原结合分子的血液中半寿期的一个实施方案，可以例举例如对接头被切割前的抗原结合分子赋予FcRn结合性。为了使得具有FcRn结合性，存在通常在接头被切割前的抗原结合分子中设置FcRn结合区的方法。作为FcRn结合区，是指具有与FcRn的结合性的区域，只要是具有与FcRn的结合性，任何结构皆可使用。

通过包含FcRn结合区，经FcRn的补救途径(salvage pathway)被摄入细胞内后，再度回到血浆中。例如IgG分子的血浆中滞留性比较长(消失慢)是因为已知作为IgG分子的补救受体的FcRn发挥功能的缘故。通过胞饮作用摄入胞内体的IgG分子在胞内体内的酸性条件下，与在胞内体内表达的FcRn结合。不能与FcRn结合的IgG分子虽然进入溶酶体(lysosome)在该处被分解，但与FcRn结合的IgG分子向细胞表面移动，在血浆中的中性条件下，从FcRn解离，再度回到血浆中。

FcRn结合区优选为直接与FcRn结合的区域。作为FcRn结合区的优选例，可例举抗体的Fc区。但是，可以与白蛋白或IgG等具有与FcRn的结合能力的多肽结合的区域可经由白蛋白或IgG等间接地与FcRn结合，因此本发明的FcRn结合区也可为这样的区域，所述区域结合具有与FcRn的结合能力的多肽。

本发明的FcRn结合区对FcRn、特别是对人FcRn的结合活性，如前述结合活性的段落所述，可通过本领域技术人员公知的方法测定，条件可由本领域技术人员适宜决定。对人FcRn的结合活性能够以KD(Dissociation constant：解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant：表观解离常数)、解离速度kd(Dissociation rate：解离速率)、或表观kd(Apparent dissociation：表观解离速度)等来评估。这些可通过本领域技术人员公知的方法测定。可使用例如Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞术等。

测定FcRn结合区对FcRn的结合活性时的条件可由本领域技术人员适宜选择，没有特别限定。例如可如WO2009/125825中所记载的在MES缓冲液、37℃的条件测定。另外，本发明的FcRn结合区对FcRn的结合活性的测定可以本领域技术人员公知的方法进行，可使用例如Biacore(GE Healthcare)等测定。

作为测定条件所使用的pH，FcRn结合区与FcRn的结合亲和力可在pH4.0～pH6.5的任意pH评估。优选地，为了确定FcRn结合区与人FcRn的结合亲和力，可使用接近活体内的早期胞内体内的pH，为pH5.8～pH6.0的pH。作为测定条件所使用的温度，FcRn结合区与FcRn的结合亲和力也可在10℃～50℃的任意温度评估。更优选地，为了确定FcRn结合区和人FcRn的结合亲和性，使用15℃～40℃的温度。优选地，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及35℃这样的任一个在20℃至35℃的任意温度，同样地也可用于确定FcRn结合区与FcRn的结合亲和力使用。所谓25℃的温度为本发明方案的非限定一例。

作为FcRn结合区的一个例子，可以例举例如IgG抗体Fc区，但不限于此。使用IgG抗体Fc区时，不限定其种类，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的Fc区。

另外，天然型IgG抗体的Fc区只要具有FcRn结合性，当然也可使用一个或一个以上的氨基酸被置换的变异Fc区。例如，可使用包含选自IgG抗体Fc区中EU编号第237位、第238位、第239位、第248位、第250位、第252位、第254位、第255位、第256位、第257位、第258位、第265位、第270位、第286位、第289位、第297位、第298位、第303位、第305位、第307位、第308位、第309位、第311位、第312位、第314位、第315位、第317位、第325位、第332位、第334位、第360位、第376位、第380位、第382位、第384位、第385位、第386位、第387位、第389位、第424位、第428位、第433位、第434位及第436位的至少一个氨基酸被置换为其他氨基酸的氨基酸序列的变体Fc区。

更具体地，可使用包含选自IgG抗体Fc区中EU编号：

第237位Gly置换为Met的氨基酸置换；

第238位Pro置换为Ala的氨基酸置换；

第239位Ser置换为Lys的氨基酸置换；

第248位Lys置换为Ile的氨基酸置换；

第250位Thr置换为Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换；

第252位Met置换为Phe、Trp、或Tyr的氨基酸置换；

第254位Ser置换为Thr的氨基酸置换；

第255位Arg置换为Glu的氨基酸置换；

第256位Thr置换为Asp、Glu、或Gln的氨基酸置换；

第257位Pro置换为Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val的氨基酸置换；

第258位Glu置换为His的氨基酸置换；

第265位Asp置换为Ala的氨基酸置换；

第270位Asp置换为Phe的氨基酸置换；

第286位Asn置换为Ala或Glu的氨基酸置换；

第289位Thr置换为His的氨基酸置换；

第297位Asn置换为Ala的氨基酸置换；

第298位Ser置换为Gly的氨基酸置换；

第303位Val置换为Ala的氨基酸置换；

第305位Val置换为Ala的氨基酸置换；

第307位Thr置换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换；

第308位Val置换为Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr的氨基酸置换；

第309位Leu或Val置换为Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg的氨基酸置换；

第311位Gln置换为Ala、His、或Ile的氨基酸置换；

第312位Asp置换为Ala或His的氨基酸置换；

第314位Leu置换为Lys或Arg的氨基酸置换；

第315位Asn置换为Ala或His的氨基酸置换；

第317位Lys置换为Ala的氨基酸置换；

第325位Asn置换为Gly的氨基酸置换；

第332位Ile置换为Val的氨基酸置换；

第334位Lys置换为Leu的氨基酸置换；

第360位Lys置换为His的氨基酸置换；

第376位Asp置换为Ala的氨基酸置换；

第380位Glu置换为Ala的氨基酸置换；

第382位Glu置换为Ala的氨基酸置换；

第384位Asn或Ser置换为Ala的氨基酸置换；

第385位Gly置换为Asp或His的氨基酸置换；

第386位Gln置换为Pro的氨基酸置换；

第387位Pro置换为Glu的氨基酸置换；

第389位Asn置换为Ala或Ser的氨基酸置换；

第424位Ser置换为Ala的氨基酸置换；

第428位Met置换为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr的氨基酸置换；

第433位His置换为Lys的氨基酸置换；

第434位Asn置换为Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr的氨基酸置换；以及

第436位Tyr或Phe置换为His的氨基酸置换；

的至少一个氨基酸置换的变体Fc区。

从另一方面看，可使用包含选自IgG抗体Fc区中EU编号：

第237位的氨基酸的Met；

第238位的氨基酸的Ala；

第239位的氨基酸的Lys；

第248位的氨基酸的Ile；

第250位的氨基酸的Ala、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、或Tyr；

第252位的氨基酸的Phe、Trp、或Tyr；

第254位的氨基酸的Thr；

第255位的氨基酸的Glu；

第256位的氨基酸的Asp、Glu、或Gln；

第257位的氨基酸的Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、或Val；

第258位的氨基酸的His；

第265位的氨基酸的Ala；

第270位的氨基酸的Phe；

第286位的氨基酸的Ala或Glu；

第289位的氨基酸的His；

第297位的氨基酸的Ala；

第298位的氨基酸的Gly；

第303位的氨基酸的Ala；

第305位的氨基酸的Ala；

第307位的氨基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、或Tyr；

第308位的氨基酸的Ala、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、或Thr；

第309位的氨基酸的Ala、Asp、Glu、Pro、或Arg；

第311位的氨基酸的Ala、His、或Ile；

第312位的氨基酸的Ala或His；

第314位的氨基酸的Lys或Arg；

第315位的氨基酸的Ala或His；

第317位的氨基酸的Ala；

第325位的氨基酸的Gly；

第332位的氨基酸的Val；

第334位的氨基酸的Leu；

第360位的氨基酸的His；

第376位的氨基酸的Ala；

第380位的氨基酸的Ala；

第382位的氨基酸的Ala；

第384位的氨基酸的Ala；

第385位的氨基酸的Asp或His；

第386位的氨基酸的Pro；

第387位的氨基酸的Glu；

第389位的氨基酸的Ala或Ser；

第424位的氨基酸的Ala；

第428位的氨基酸的Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、或Tyr；

第433位的氨基酸的Lys；

第434位的氨基酸的Ala、Phe、His、Ser、Trp、或Tyr；以及

第436位的氨基酸的His；

的至少一个氨基酸的Fc区。

抗原结合分子也可为在抗原结合结构域中具有FcRn结合性。作为接头切割前的抗原结合分子的血液中半寿期较抗原结合结构域的血液中半寿期更长的实施方案，当然可为抗原结合结构域不具有FcRn结合性，也可为即使抗原结合结构域具有FcRn结合性，如果具有较接头切割前的抗原结合分子弱的FcRn结合性的话也可以。

另外，作为延长血液中半寿期的一个实施方案，存在使接头切割前的抗原结合分子与白蛋白结合的方法。白蛋白不被肾排泄且具有FcRn结合性，因此血液中半寿期长至17～19日(J Clin Invest.1953年8月；32(8)：746-768)。因此报导了，与白蛋白结合的蛋白质体积增大，且间接地与FcRn结合成为可能，因而使血液中半寿期增加(Antibodies 2015，4(3)，141-156)。

进一步地，作为延长血液中半寿期的一个实施方案，存在使接头切割前的抗原结合分子PEG化的方法。认为通过使蛋白质PEG化，蛋白质的体积增大，同时通过抑制经血液中的蛋白酶的分解，由此延长蛋白质的血液中半寿期(J Pharm Sci.2008Oct；97(10)：4167-83)。

在本发明的一些实施方案中，接头切割前的抗原结合分子包含抗体Fc区。作为具体的一个实施方案，接头切割前的抗原结合分子包含人IgG抗体的CH2结构域及CH3结构域。作为具体的一个实施方案，接头切割前的抗原结合分子包含从人IgG1抗体重链Cys226或从Pro230延伸至重链羧基端的部分。但是，Fc区C端的赖氨酸(Lys447)或甘氨酸-赖氨酸(Gly446-Lys447)可以存在也可以不存在。

在本发明的一些实施方案中，接头切割前的抗原结合分子包含抗体恒定区。在优选实施方案，接头切割前的抗原结合分子包含IgG抗体恒定区。在优选实施方案，接头切割前的抗原结合分子包含人IgG抗体恒定区。

在本发明的又一些实施方案中，接头切割前的抗原结合分子包含具有实质上类似抗体重链恒定区的结构的区域和与该区域以二硫键等共价键或氢键、疏水性相互作用等非共价键结合的具有实质上类似抗体轻链的结构的区域。

抗原结合分子具有的接头经蛋白酶以约0.001～1500×10⁴M^-1S^-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500×10⁴M^-1S^-1的速度特异性切割。

在本说明书中，术语“蛋白酶”是指使肽键水解的内肽酶或外肽酶等酶，通常指内肽酶。本公开所使用的蛋白酶只限于可切割蛋白酶切割序列的酶，对其种类没有特别限制。在一些实施方案中，使用靶标组织特异性蛋白酶。靶标组织特异性蛋白酶可指以下任一个，例如：

(1)在靶标组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(2)在靶标组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(3)在靶标细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(4)在靶标细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

在更具体的实施方案中，可使用癌组织特异性蛋白酶或炎症组织特异性蛋白酶。

本说明书的术语“靶标组织”是指包含至少一个靶标细胞的组织。在本发明的一些实施方案中，靶标组织为癌组织。在本发明的一些实施方案中，靶标组织为炎症组织。

术语“癌组织”是指包含至少一个癌细胞的组织。因此，可称为例如癌组织是包含癌细胞和血管那样的、参与包含癌细胞及内皮细胞的肿瘤(tumor mass)的形成的所有细胞型。在本说明书中，肿瘤称为肿瘤组织病灶(a foci of tumor tissue)。所谓“肿瘤”这一术语一般用于表示良性赘生物或恶性赘生物。

本说明书中，“炎症组织”可例示地例举例如以下：

风湿性关节炎或骨关节炎的关节

支气管气喘或COPD的肺(肺泡)

发炎性肠道疾病或克罗恩症或溃疡性大肠炎的消化器官

肝脏、肾脏、肺的纤维化疾病的纤维化组织

器官移植中引起排斥反应的组织

动脉硬化或心脏衰竭的血管、心脏(心肌)

代谢综合征的内脏脂肪

特应性皮炎或其他皮炎的皮肤组织

椎间盘突出或慢性腰痛的脊髓神经。

在一些种类的靶标组织中，特异性表达或特异性活化的蛋白酶或认为与靶标组织的疾病状态相关的蛋白酶(靶标组织特异性蛋白酶)是已知的。例如国际公开WO2013/128194号、国际公开WO2010/081173号、国际公开WO2009/025846号等公开了在癌组织特异性表达的蛋白酶。另外，在J Inflamm(Lond).2010；7：45.、Nat Rev Immunol.2006Jul；6(7)：541-50.、Nat Rev Drug Discov.2014Dec；13(12)：904-27.、Respir Res.2016Mar 4；17：23.、Dis Model Mech.2014Feb；7(2)：193-203.、Biochim Biophys Acta.2012Jan；1824(1)：133-45.公开了认为与发炎相关的蛋白酶。

除了在靶标组织特异性表达的蛋白酶之外，也存在在靶标组织特异性活化的蛋白酶。例如，存在蛋白酶以不活化型表达、之后成为活化型的情形，在许多组织存在抑制活化型蛋白酶的物质，通过活化的过程和抑制剂的存在来控制活性(Nat Rev Cancer.2003Jul；3(7)：489-501)。在靶标组织中，存在活化型蛋白酶脱离抑制而特异性活化的情形。活化型蛋白酶的测定方法可使用识别活化型蛋白酶的抗体的方法(PNAS 2013年1月2日；110(1)：93-98)，或者使用将蛋白酶识别的肽以荧光标记，在切割前消光(淬火(quench))但切割后发光的方法(Nat Rev Drug Discov.2010Sep；9(9)：690-701.doi：10.1038/nrd3053.)来测定。

从一个观点，术语“靶标组织特异性蛋白酶”可指以下任一种：

(i)在靶标组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在靶标组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在靶标细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在靶标细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

不限制所解释的这些，作为具体的蛋白酶可以例举例如半胱氨酸蛋白酶(包含组织蛋白酶家族B、L、S等)、天冬氨酰蛋白酶(组织蛋白酶D、E、K、O等)、丝氨酸蛋白酶(包含Matriptase(包含MT-SP1)、组织蛋白酶A及G、凝血酶、纤溶酶、尿激酶(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、弹性蛋白酶、蛋白酶3、凝血酶、激肽释放酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶(chymase))、金属蛋白酶(包含膜结合型(MMP14-17及MMP24-25)及分泌型(MMP1-13及MMP18-23及MMP26-28)两者的金属蛋白酶(MMP1-28)、蛋白酶的A去整合素金属蛋白酶(Adisintegrin and metalloproteinase；ADAM)、具有A去整合素或血小板反应蛋白基序的金属蛋白酶(ADAM proteases with thrombospondin motif；ADAMTS)、穿膜肽酶(穿膜肽酶α(meprinα)、穿膜肽酶β(meprinβ)))、CD10(CALLA)、以及前列腺特异性抗原(PSA)、天冬酰胺内肽酶(legumain)、TMPRSS3、TMPRSS4、嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)、β分泌酶(BACE)、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶(guanidino-benzoatase)(GB)、肝素、脑啡肽酶(neprilysin)、NS3/4A、HCV-NS3/4、钙蛋白酶(calpain)、ADAMDEC1、肾素、组织蛋白酶C、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、Otubain2、激肽释放酶相关肽酶(KLKs(KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14))、骨形态发生蛋白1(BMP-1)、活性蛋白C、血液凝固相关蛋白酶(凝血因子VIIa、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa)、HtrA1、乳铁蛋白(lactoferrin)、Marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4(DPP-4)、TMPRSS2、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、颗粒酶A、Gepsin钙蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶2、AMSH样蛋白酶、AMSH、γ分泌酶、A抗纤溶酶切割酶(APCE)、Decysin1、N-乙酰化α连接的酸性二肽酶样1(NAALADL1)、弗林蛋白酶(furin)等。

从另外的观点，靶标组织特异性蛋白酶可指癌组织特异性蛋白酶或炎症组织特异性蛋白酶。

作为癌组织特异性蛋白酶，可以例举例如国际公开WO2013/128194号、国际公开WO2010/081173号、国际公开WO2009/025846号等公开的在癌组织特异性表达的蛋白酶。

癌组织特异性蛋白酶的种类是在治疗对象的癌组织的表达的特异性越高，则获得副作用减少的效果。癌组织特异性蛋白酶优选地为在癌组织的浓度高于在正常组织的浓度的5倍以上，更优选地为高10倍以上，进一步优选地为高100倍以上，特别优选地为高500倍以上，最优选地为高1000倍以上。另外，癌组织特异性蛋白酶优选地为在癌组织的活性高于在正常组织的活性的2倍以上，更优选地为高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，进一步优选地为高100倍以上，特别优选地为高500倍以上，最优选地为高1000倍以上。

另外，癌组织特异性蛋白酶可以与癌细胞的细胞膜结合，也可以不与细胞膜结合而分泌于细胞外。在癌组织特异性蛋白酶不与癌细胞的细胞膜结合的情形，为了使由免疫细胞引起的细胞毒性对癌细胞是特异的，癌组织特异性蛋白酶优选存在于癌组织的内部或附近。本说明书的“癌组织附近”是指在癌组织特异性蛋白酶切割序列被切割、抗原结合结构域发挥抗原结合活性的范围内。但是，优选地在尽可能不伤害正常细胞的范围。

从另外的观点，癌组织特异性蛋白酶为以下任一种：

(i)在癌组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在癌组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在癌细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在癌细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

癌组织特异性蛋白酶可为1种单独的蛋白酶，也可组合2种以上蛋白酶。癌组织特异性蛋白酶的种类数，可考虑治疗对象的癌种类，由本领域技术人员合适地设定。

从上述观点，作为癌组织特异性蛋白酶，在上述例示的蛋白酶中，优选地为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，更优选地为Matriptase(包含MT-SP1)、尿激酶(uPA)及金属蛋白酶，进一步优选地为MT-SP1、uPA、MMP2、MMP9。

炎症组织特异性蛋白酶的种类是在治疗对象的炎症组织的表达的特异性越高，则获得副作用减少的效果。炎症组织特异性蛋白酶优选地为在炎症组织的浓度高于在正常组织的浓度的5倍以上，更优选地为高10倍以上，进一步优选地为高100倍以上，最优选地为高500倍以上，最优选地为高1000倍以上。另外，炎症组织特异性蛋白酶优选地为在炎症组织的活性高于在正常组织的活性的2倍以上，更优选地为高3倍以上、高4倍以上、高5倍以上、高10倍以上，进一步优选地为高100倍以上，特别优选地为高500倍以上，最优选地为高1000倍以上。

另外，炎症组织特异性蛋白酶也可以与发炎细胞的细胞膜结合，也可以不与细胞膜结合而分泌于细胞外。在炎症组织特异性蛋白酶不与发炎细胞的细胞膜结合的情形，为了使由免疫细胞引起的细胞毒性在发炎细胞为特异的，炎症组织特异性蛋白酶优选存在炎症组织的内部或附近。本说明书的“炎症组织附近”是指在炎症组织特异性蛋白酶切割序列被切割、抗原结合结构域发挥抗原结合活性的范围内。但是，优选地在尽可能不伤害正常细胞的范围。

从另外的观点，炎症组织特异性蛋白酶为以下任一种：

(i)在炎症组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在炎症组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在发炎细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在发炎细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

炎症组织特异性蛋白酶可为1种单独的蛋白酶，也可组合2种以上蛋白酶。炎症组织特异性蛋白酶的种类，可考虑治疗对象的病状，由本领域技术人员合适地设定。

从上述观点，作为炎症组织特异性蛋白酶，在上述例示的蛋白酶中，优选地为金属蛋白酶，在金属蛋白酶中，更优选地为ADAMTS5、MMP2、MMP7、MMP9、MMP13。

蛋白酶切割序列为在水溶液中抗原结合分子经靶标组织特异性蛋白酶而水解之时，由该靶标组织特异性蛋白酶特异性识别的特定氨基酸序列。

从降低副作用的观点，蛋白酶切割序列优选地为经在治疗对象的靶标组织/细胞中更特异性表达或在治疗对象的靶标组织/细胞中更特异性活化的靶标组织特异性蛋白酶以高特异性水解的氨基酸序列。

作为具体的蛋白酶切割序列，可以例举例如国际公开WO2013/128194号、国际公开WO2010/081173号、国际公开WO2009/025846号等公开的经上述例示的在癌组织特异性表达的蛋白酶、炎症组织特异性蛋白酶等特异性水解的靶标序列。也可使用在经已知的蛋白酶特异性水解的靶标序列中导入适当的氨基酸改变等的人为变异的序列。另外，蛋白酶切割序列也可使用如Nature Biotechnology 19，661-667(2001)所记载的以本领域技术人员公知的方法鉴定的序列。

进一步地，也可使用天然存在的蛋白酶切割序列。例如，如TGFβ通过蛋白酶的切割而变化为潜在型，也可使用因蛋白酶的切割而改变分子形式的蛋白质中的受蛋白酶切割的序列。

作为蛋白酶切割序列的例子，可使用国际公开WO2015/116933号、国际公开WO2015/048329号、国际公开WO2016/118629号、国际公开WO2016/179257号、国际公开WO2016/179285号、国际公开WO2016/179335号、国际公开WO2016/179003号、国际公开WO2016/046778号、国际公开WO2016/014974号、日本专利申请案2019-105464号、美国专利公开US2016/0289324号、美国专利公开US2016/0311903号、PNAS(2000)97：7754-7759.、Biochemical Journal(2010)426：219-228.、Beilstein J Nanotechnol.(2016)7：364-373.中所示的序列，但不限于此。

蛋白酶切割序列如上所述优选地为经合适的靶标组织特异性蛋白酶特异性水解的氨基酸序列。经靶标组织特异性蛋白酶特异性水解的氨基酸序列中，优选地包含以下氨基酸序列的序列。

LSGRSDNH(可经MT-SP1、uPA切割)

PLALAG(可经MMP2、MMP9切割)

VPLSLTMG(可经MMP7切割)

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下序列。

TSTSGRSANPRG(可经MT-SP1、uPA切割)

ISSGLLSGRSDNH(可经MT-SP1、uPA切割)

AVGLLAPPGGLSGRSDNH(可经MT-SP1、uPA切割)

GAGVPMSMRGGAG(可经MMP1切割)

GAGIPVSLRSGAG(可经MMP2切割)

GPLGIAGQ(可经MMP2切割)

GGPLGMLSQS(可经MMP2切割)

PLGLWA(可经MMP2切割)

GAGRPFSMIMGAG(可经MMP3切割)

GAGVPLSLTMGAG(可经MMP7切割)

GAGVPLSLYSGAG(可经MMP9切割)

AANLRN(可经MMP11切割)

AQAYVK(可经MMP11切割)

AANYMR(可经MMP11切割)

AAALTR(可经MMP11切割)

AQNLMR(可经MMP11切割)

AANYTK(可经MMP11切割)

GAGPQGLAGQRGIVAG(可经MMP13切割)

PRFKIIGG(可经原尿激酶(pro-urokinase)切割)

PRFRIIGG(可经原尿激酶切割)

GAGSGRSAG(可经uPA切割)

SGRSA(可经uPA切割)

GSGRSA(可经uPA切割)

SGKSA(可经uPA切割)

SGRSS(可经uPA切割)

SGRRA(可经uPA切割)

SGRNA(可经uPA切割)

SGRKA(可经uPA切割)

QRGRSA(可经tPA切割)

GAGSLLKSRMVPNFNAG(可经组织蛋白酶B切割)

TQGAAA(可经组织蛋白酶B切割)

GAAAAA(可经组织蛋白酶B切割)

GAGAAG(可经组织蛋白酶B切割)

AAAAAG(可经组织蛋白酶B切割)

LCGAAI(可经组织蛋白酶B切割)

FAQALG(可经组织蛋白酶B切割)

LLQANP(可经组织蛋白酶B切割)

LAAANP(可经组织蛋白酶B切割)

LYGAQF(可经组织蛋白酶B切割)

LSQAQG(可经组织蛋白酶B切割)

ASAASG(可经组织蛋白酶B切割)

FLGASL(可经组织蛋白酶B切割)

AYGATG(可经组织蛋白酶B切割)

LAQATG(可经组织蛋白酶B切割)

GAGSGVVIATVIVITAG(可经组织蛋白酶L切割)

APMAEGGG(可经穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切割)

EAQGDKII(可经穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切割)

LAFSDAGP(可经穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切割)

YVADAPK(可经穿膜肽酶α、穿膜肽酶β切割)

RRRRR(可经弗林蛋白酶切割)

RRRRRR(可经弗林蛋白酶切割)

GQSSRHRRAL(可经弗林蛋白酶切割)

SSRHRRALD(可经TGFβ切割)

RKSSIIIRMRDVVL(可经纤溶酶原切割)

SSSFDKGKYKKGDDA(可经链激酶切割)

SSSFDKGKYKRGDDA(可经链激酶切割)

IEGR(可经凝血因子Xa切割)

IDGR(可经凝血因子Xa切割)

GGSIDGR(可经凝血因子Xa切割)

GPQGIAGQ(可经胶原蛋白酶切割)

GPQGLLGA(可经胶原蛋白酶切割)

GIAGQ(可经胶原蛋白酶切割)

GPLGIAG(可经胶原蛋白酶切割)

GPEGLRVG(可经胶原蛋白酶切割)

YGAGLGVV(可经胶原蛋白酶切割)

AGLGVVER(可经胶原蛋白酶切割)

AGLGISST(可经胶原蛋白酶切割)

EPQALAMS(可经胶原蛋白酶切割)

QALAMSAI(可经胶原蛋白酶切割)

AAYHLVSQ(可经胶原蛋白酶切割)

MDAFLESS(可经胶原蛋白酶切割)

ESLPVVAV(可经胶原蛋白酶切割)

SAPAVESE(可经胶原蛋白酶切割)

DVAQFVLT(可经胶原蛋白酶切割)

VAQFVLTE(可经胶原蛋白酶切割)

AQFVLTEG(可经胶原蛋白酶切割)

PVQPIGPQ(可经胶原蛋白酶切割)

LVPRGS(可经凝血酶切割)。

在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经半胱氨酸蛋白酶切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经金属蛋白酶切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经Matriptase切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经MT-SP1切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经uPA切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经Matriptase及uPA切割。在一些实施方案中，蛋白酶切割序列至少可经MT-SP1及uPA切割。

在一个实施方案中，蛋白酶切割序列选自由可经MMP切割的PLALAG、VPLSLTMG、GAGVPMSMRGGAG、GAGIPVSLRSGAG、GPLGIAGQ、GGPLGMLSQS、PLGLWA、GAGRPFSMIMGAG、GAGVPLSLTMGAG、GAGVPLSLYSGAG、AANLRN、AQAYVK、AANYMR、AAALTR、AQNLMR、AANYTK、GAGPQGLAGQRGIVAG组成的组。

在一个实施方案中，蛋白酶切割序列选自由可经胶原蛋白酶切割的GPQGIAGQ、GPQGLLGA、GIAGQ、GPLGIAG、GPEGLRVG、YGAGLGVV、AGLGVVER、AGLGISST、EPQALAMS、QALAMSAI、AAYHLVSQ、MDAFLESS、ESLPVVAV、SAPAVESE、DVAQFVLT、VAQFVLTE、AQFVLTEG、PVQPIGPQ组成的组。

作为蛋白酶切割序列，也可使用序列编号1～725所示的序列。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4为R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、F、L、M、P、Q、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2为选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自E、F、K、M、N、P、Q、R、S及W的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、F、G、L、M、P、Q、V及W的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、I、K、N、T及W的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1是选自A、G、I、P、Q、S及Y的氨基酸；X2为选自K或T的氨基酸；X3为G；X4为R；X5为S；X6为A；X7为选自H、I及V的氨基酸；X8为选自H、V及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8

其中，X1到X8分别表示1个氨基酸，X1为Y；X2为选自S及T的氨基酸；X3为G；X4为R；X5为S；X6为选自A及E的氨基酸；X8为选自H、P、V及Y的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2为选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4为R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、E、F、G、H、K、M、N、P、Q、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2为选自A、D、F、L、M、P、Q、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W及Y的氨基酸；X4是R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4为R；X5是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4为R；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自E、F、K、M、N、P、Q、R、S及W的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1是选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X4为R；X5为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6是选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、F、G、L、M、P、Q、V及W的氨基酸；X8为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、S、T、W及Y的氨基酸；X2是选自A、D、E、F、H、K、L、M、P、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸；X3为选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X5是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X6为选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X7是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸；X8是选自A、D、E、F、G、I、K、N、T及W的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为选自A、G、I、P、Q、S及Y的氨基酸；X2为选自K或T的氨基酸；X3为G；X4为R；X5为S；X6为A；X7为选自H、I及V的氨基酸；X8为选自H、V及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

作为蛋白酶切割序列，也可使用以下所示序列：

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9

其中，X1到X9分别表示1个氨基酸，X1为Y；X2为选自S及T的氨基酸；X3为G；X4为R；X5为S；X6为选自A及E的氨基酸；X8为选自H、P、V及Y的氨基酸；X9为选自R及G的氨基酸。

除了使用上述蛋白酶切割序列之外，也可通过新的筛选获得蛋白酶切割序列。例如，从已知的蛋白酶切割序列的结晶结构分析的结果，改变切割序列与酶的活性残基、识别残基的相互作用，可探索新的蛋白酶切割序列。另外，在已知的蛋白酶切割序列中加入氨基酸变异，通过确认与蛋白酶的相互作用，可探索新的蛋白酶切割序列。作为另外的例子，使用噬菌体展示、核糖体展示等体外展示法，展示肽文库，或使用固定在芯片或珠的肽阵列，通过确认与蛋白酶的相互作用，可探索以蛋白酶切割的序列。作为确认蛋白酶切割序列与蛋白酶的相互作用的方法，可通过体外或体内确认蛋白酶切割来进行。

本公开的蛋白酶切割序列可经蛋白酶以约0.001～1500×10⁴M^-1S^-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250、或1500×10⁴M^-1S^-1的速度特异性修饰(切割)。

确认经蛋白酶的切割的方法

作为评估本说明书记载的蛋白酶底物或蛋白酶切割序列经蛋白酶切割的方法，可例示Mol Cell Proteomics.2014年6月；13(6)：1585-97.doi：10.1074/mcp.M113.033308.Epub 2014年4月4日所记载的方法。

评估中使用的蛋白酶的种类或浓度、处理温度或处理时间可合适地选择，例如可使用含1000nM人uPA的PBS、含1000nM小鼠uPA的PBS、含500nM人MT-SP1的PBS、或含500nM小鼠MT-SP1的PBS，在37℃进行1小时处理。

另外，也可使用血清(包含人血清、小鼠血清)代替使用含有蛋白酶的溶液，处理肽阵列，使用从芯片所测定的荧光值。

评估中使用的血清的种类或浓度、处理温度或处理时间可合适地选择，例如可使用稀释至80％浓度的人血清作为处理液，在37℃处理一晚。

作为定性确认多肽中所含的蛋白酶切割序列是否经蛋白酶切割的方法，可通过将含有包含蛋白酶切割序列的多肽的溶液进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，测定片段的分子量来确认。另外，可通过比较未经蛋白酶处理的多肽和蛋白酶处理后多肽的分子量来确认。

在本说明书中，术语“被切割”是指经蛋白酶的作用，蛋白酶切割序列的改变和/或蛋白酶切割序列的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键还原后的多肽断裂的状态。在本说明书中，术语“未被切割”是指在不存在蛋白酶切割序列经蛋白酶切割下和/或不存在蛋白酶切割序列的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键的还原下，多肽中的蛋白酶切割序列的两侧的部分仍连接的状态。

另外，经定量由SDS-PAGE等的电泳法分离的蛋白酶处理后的切割片段量，可进行蛋白酶切割序列的评估、及导入了蛋白酶切割序列的分子的切割率的评估。作为评估导入了蛋白酶切割序列的分子的切割率的方法的一个非限定性方案，可例举以下方法。例如，使用重组人u-纤溶酶原激活物/尿激酶(人uPA，huPA)(R&D Systems；1310-SE-010)或重组人Matriptase/ST14催化结构域(人MT-SP1，hMT-SP1)(R&D Systems；3946-SE-010)评估导入了蛋白酶切割序列的抗体变体的切割率的情形，使huPA40nM或hMT-SP1 3nM、抗体变体100μg/mLPBS，在37℃的条件下反应1小时后，进行毛细管电泳免疫测定法。毛细管电泳免疫测定法可使用Wes(Protein Simple)，但不限于此，作为代替毛细管电泳免疫测定法的方法，也可以经SDS-PAGE等分离后，以Western印迹法检测，但不限于这些方法。可使用抗人λ链HRP标记抗体(abcam；ab9007)检测切割前后的轻链，但可检测切割片段的抗体也可使用任何抗体。通过蛋白酶处理后所获得的各峰的面积使用Wes专用软件(Compass for SW；ProteinSimple)输出，根据(切割轻链峰面积)×100/(切割轻链峰面积+未切割轻链峰面积)的算式，可算出抗体变体的切割率(％)。通过用上述方法计算切割率，例如可比较导入了不同切割序列的抗体变体在生物体内的切割率，又也可比较在正常小鼠模型或肿瘤移植模型等的不同动物模式之间相同抗体变体的切割率。

例如，接头包含序列编号1～725所例示的蛋白酶切割序列的任一抗原结合分子作为经蛋白酶作用而水解的蛋白酶底物是有用的。即，在本发明中，可使用成为本说明书所例示的蛋白酶底物的接头。该接头，例如在组入抗原结合分子时，可以用作用于根据目的选择具有特性的物质的文库。具体地，为了使抗原结合分子经局部存在于病灶的蛋白酶选择性切割，可评估该蛋白酶的敏感性。包含接头的抗原结合分子在施用至生物体后，经过与各种蛋白酶的接触，有到达病灶的可能性。因此，期望对于定位在病灶的蛋白酶具有敏感性，而对于其之外的蛋白酶具有尽可能高的耐受性。为了根据目的选择所希望的蛋白酶切割序列，如果事先对于各蛋白酶底物综合性分析对各种蛋白酶的敏感性，可获知蛋白酶的耐受性。基于所获得的蛋白酶的耐受性谱，可以找到具有必要的敏感性和耐受性的蛋白酶切割序列。

或者，组入了蛋白酶切割序列的抗原结合分子不仅经蛋白酶的酶促作用，而且还经pH变化、温度、氧化还原应激等各种环境负荷，到达病灶。即使对于这样的外部因素，也可以基于比较各蛋白酶底物的耐受性的信息来选择根据目的具有所希望特性的蛋白酶切割序列。

在本发明的一个实施方案中，进一步在蛋白酶切割序列的任一端或两端加上柔性接头。蛋白酶切割序列的一端的柔性接头可称为第一柔性接头，另一端的柔性接头可称为第二柔性接头。在特定的实施方案中，蛋白酶切割序列和柔性接头包含下式之一。

(蛋白酶切割序列)

(第一柔性接头)-(蛋白酶切割序列)

(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)

(第一柔性接头)-(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)

该实施方案中的柔性接头优选地为肽接头。第一柔性接头和第二柔性接头各自独立且任意存在，为包含至少一个柔性氨基酸(Gly等)的相同或不同的柔性接头。例如，蛋白酶切割序列包含足够数量的残基(任意地选自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等氨基酸，特别是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，更特别是Gly及Ser，特别是Gly等)以获得所希望的蛋白酶可及性。

适合在蛋白酶切割序列的两端使用的柔性接头通常提高蛋白酶对蛋白酶切割序列的可及性、提高蛋白酶的切割效率。合适的柔性接头可容易地选择，可始自从1个氨基酸(Gly等)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸、或7个氨基酸至8个氨基酸，从3个氨基酸至12个氨基酸等不同长度中选择合适的。本发明的一些实施方案中，柔性接头为1至7个氨基酸的肽接头。

作为柔性接头的例子，可以例举例如甘氨酸聚合物(G)_n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如包含(GS)_n、(GSGGS)_n及(GGGS)_n，n为至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、现有技术中公知的其他柔性接头，但不限于此。

其中，甘氨酸及甘氨酸-丝氨酸聚合物受到关注，原因是这些氨基酸是相对非结构化的，在成分之间容易发挥作为中性连接物的功能。

作为由甘氨酸-丝氨酸聚合物所形成的柔性接头的例子，可以例举例如

Ser

Gly·Ser(GS)

Ser·Gly(SG)

Gly·Gly·Ser(GGS)

Gly·Ser·Gly(GSG)

Ser·Gly·Gly(SGG)

Gly·Ser·Ser(GSS)

Ser·Ser·Gly(SSG)

Ser·Gly·Ser(SGS)

Gly·Gly·Gly·Ser(GGGS)

Gly·Gly·Ser·Gly(GGSG)

Gly·Ser·Gly·Gly(GSGG)

Ser·Gly·Gly·Gly(SGGG)

Gly·Ser·Ser·Gly(GSSG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS)

Gly·Gly·Gly·Ser·Gly(GGGSG)

Gly·Gly·Ser·Gly·Gly(GGSGG)

Gly·Ser·Gly·Gly·Gly(GSGGG)

Gly·Ser·Gly·Gly·Ser(GSGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG)

Gly·Ser·Ser·Gly·Gly(GSSGG)

Gly·Ser·Gly·Ser·Gly(GSGSG)

Ser·Gly·Gly·Ser·Gly(SGGSG)

Gly·Ser·Ser·Ser·Gly(GSSSG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGGG)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS))_n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG))_n等，但不限于此。

本说明书中“缔合”可换言指例如2个以上的多肽区相互作用的状态。一般而言，在成为对象的多肽区之间形成由疏水键、氢键、离子键等作成的缔合体。作为常见的缔合的一个例子，已知为在代表天然抗体的抗体中，通过重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)两者间的非共价键等维持配对结构。

本说明书中的“界面”通常指进行缔合(相互作用)时的缔合面，形成界面的氨基酸残基通常为提供该缔合的多肽区所包含的1个或多个氨基酸残基，优选是指，缔合时接近并参与相互作用的氨基酸残基。该相互作用具体地包含在缔合时接近的氨基酸残基彼此形成氢键、静电相互作用、盐桥的情形等的非共价键。

本说明书中“形成界面的氨基酸残基”，如果详述的话，是指在构成界面的多肽区中，该多肽区所含的氨基酸残基。构成界面的多肽区，如果举一例显示，是指在抗体、配体、受体、底物等中，在其分子内或分子间担任选择性结合的多肽区。形成界面的氨基酸残基的例子可以例举例如缔合时接近的氨基酸残基，但不限于此。缔合时接近的氨基酸残基可通过例如分析多肽的立体结构，调查在该多肽缔合时形成界面的多肽区的氨基酸序列而发现。

在本发明的一些实施方案中，抗原结合结构域VHH与抑制结构域VL缔合。作为VHH中的、与VL的缔合相关的氨基酸残基的例子，可指形成VHH与VL的界面的氨基酸残基。另外，作为VHH中的、与VL的缔合相关的氨基酸残基的例子，可以例举例如第37位、第44位、第45位、第47位的氨基酸残基(J.Mol.Biol.(2005)350，112-125)，但不限于此。通过促进VHH和VL的缔合，抑制VHH的活性。同时，作为VL中的、与VHH的缔合相关的氨基酸残基的例子，可指形成VHH与VL的界面的氨基酸残基。

为了促进VHH和VL的缔合，可改变VHH中的、与VL的缔合相关的氨基酸残基。作为这样的氨基酸置换的例子，可以例举例如F37V、Y37V、E44G、Q44G、R45L、H45L、G47W、F47W、L47W、T47W、或/和S47W，但不限于此。进一步地，也可对VHH中的各残基不进行改变，使用具有来自最初的37V、44G、45L、或/和47W的氨基酸残基的VHH。

进一步地，只要可达到促进VHH与VL缔合的目的，可不改变VHH中的氨基酸，而改变VL中的、与VHH缔合相关的氨基酸残基，进一步地也可在VHH和VL两者都导入氨基酸改变。

为了改变多肽的氨基酸序列中的氨基酸，可合适地采用定点诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82，488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。另外，置换为天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法也可采用多个公知方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11)，6353-6357)。例如，也可合适地使用无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等，其终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补性琥珀抑制子tRNA包含与非天然氨基酸结合的tRNA。

在本发明的另一些实施方案中，使用VHH作为抗原结合结构域，使用VH或VHH作为抑制结构域，可使抗原结合结构域和抑制结构域缔合。为了促进抗原结合结构域VHH和抑制结构域VH或VHH的缔合，能够鉴定抗原结合结构域的VHH中的、与抑制结构域VH或VHH缔合相关的氨基酸残基，并改变这些氨基酸残基。另外，能够鉴定抑制结构域VH或VHH中的、与抗原结合结构域VHH中的缔合相关的氨基酸残基，并改变这些氨基酸残基。

另外，使用VHH以外的单结构域抗体作为抗原结合结构域时，也可同样地鉴定抗原结合结构域或抑制结构域中的与缔合相关的氨基酸残基，并可对这些氨基酸残基进行改变。

在特定的实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗原结合分子内的抗体恒定区。在此情形，蛋白酶切割序列位于抗体恒定区内，从而在受到蛋白酶的切割时，使抗原结合结构域游离是优选的。在具体的实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗原结合分子中所包含的抗体重链恒定区内，更具体地，位于抗体重链恒定区中的第140位(EU编号)氨基酸的靠抗原结合结构域侧，优选地，位于抗体重链恒定区中的第122位(EU编号)氨基酸的靠抗原结合结构域侧。在其他具体实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗原结合分子中所包含的抗体轻链恒定区内，更具体地，位于抗体轻链恒定区中的第130位(Kabat编号)氨基酸的靠抗原结合结构域侧，优选地，位于抗体轻链恒定区中的第113位(Kabat编号)氨基酸的靠抗原结合结构域侧。

在特定的实施方案中，蛋白酶可切割接头位于可变区与恒定区的边界附近或恒定区内的CH1与CH2的边界附近。可变区与恒定区的边界附近是指在连接VH与CH1的部位的前后，或在连接VL与CL的部位的前后，不显著影响抗原结合结构域的二级结构的部位，包含肘状铰链区(从第109位(EU编号)到第140位(EU编号))。CH1与CH2的边界附近是指在连接CH1与CH2的部位的前后，不显著影响抗原结合结构域的二级结构的部位，包含上铰链(upperhinge)区(从第215位(EU编号)到第220位(EU编号))、下铰链(lower hinge)区(从第221位(EU编号)到第230位(EU编号))。

在更具体的实施方案中，蛋白酶可切割接头位于抗原结合分子内的抗原结合结构域与抗体恒定区的边界附近。抗原结合结构域与抗体恒定区的边界附近可指抗原结合结构域与抗体重链恒定区的边界附近、或抗原结合结构域与抗体轻链恒定区的边界附近。在抗原结合结构域为由VH所作成的单结构域抗体或VHH与抗体重链恒定区相连的情形，抗原结合结构域与抗体恒定区的边界附近可指从单结构域抗体第101位(Kabat编号)的氨基酸到抗体重链恒定区第140位(EU编号)的氨基酸之间，优选地，从单结构域抗体第109位(Kabat编号)的氨基酸到抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间。在抗原结合结构域为由VH所作成的单结构域抗体或VHH与抗体轻链恒定区相连的情形，抗原结合结构域与抗体轻链恒定区的边界附近可指从单结构域抗体第101位(Kabat编号)的氨基酸到抗体轻链恒定区第130位(Kabat编号)的氨基酸之间，优选地，从单结构域抗体第109位(Kabat编号)的氨基酸到抗体轻链恒定区第113位(Kabat编号)的氨基酸之间。在抗原结合结构域为由VL所作成的单结构域抗体的情形时，抗原结合结构域与抗体恒定区的边界附近是指在连接VHH和CH2的部位的前后、不显著影响抗原结合结构域的二级结构的部位，包含铰链(lowerhinge)区，始于单结构域抗体第96位(Kabat编号)、优选地始于单结构域抗体第104号(Kabat编号)。

在本发明的其他实施方案中，切割位点/蛋白酶切割序列位于抗体重链恒定区中的第140位(EU编号)氨基酸的靠可变区侧，优选地位于抗体重链恒定区中的第122位(EU编号)氨基酸的靠可变区侧。在一些具体实施方案中，将切割位点/蛋白酶切割序列导入抗体重链恒定区第118位氨基酸(EU编号)至抗体重链恒定区第140位氨基酸(EU编号)的序列中的任意位置。在其他更具体的实施方案中，切割位点/蛋白酶切割序列位于抗体轻链恒定区中的第130位(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧，优选地位于抗体轻链恒定区中的第113位(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧、抗体轻链恒定区中的第112位(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧。在一些具体实施方案中，将切割位点/蛋白酶切割序列导入抗体轻链恒定区第108位氨基酸(Kabat编号)至抗体轻链恒定区第131位氨基酸(Kabat编号)的序列中的任意位置。

在一个实施方案中，切割位点/蛋白酶切割序列位于抗体VL与抗体恒定区的边界附近。抗体VL与抗体轻链恒定区的边界附近可指从抗体VL第96位(Kabat编号)的氨基酸到抗体轻链恒定区第130位(EU编号)(Kabat编号第130位)的氨基酸之间，优选地，从抗体VL第104位(Kabat编号)的氨基酸到抗体轻链恒定区第113位(EU编号)(Kabat编号第113位)的氨基酸之间，或从抗体VL第105位(Kabat编号)的氨基酸到抗体轻链恒定区第112位(EU编号)(Kabat编号第112位)的氨基酸之间。在抗体VL和抗体重链恒定区连接的情形，抗体VL与抗体重链恒定区的边界附近可指从抗体VL第96位(Kabat编号)的氨基酸到抗体重链恒定区第140位(EU编号)的氨基酸之间，优选地，从抗体VL第104位(Kabat编号)的氨基酸到抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间，或从抗体VL第105位(Kabat编号)的氨基酸到抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间。

在一个实施方案中，将切割位点/蛋白酶切割序列导入抗体重链恒定区的CH2/CH3界面附近。此处，CH2/CH3界面附近为第335位(EU编号)到第345位(EU编号)的区域。

在配体结合分子中可设置多个切割位点/蛋白酶切割序列，例如可设置在选自抗体恒定区内、抗体VH内、抗体VL内、抗体VH与抗体恒定区的边界附近、抗体VL与抗体恒定区的边界附近的多个位置。另外，只要是接触本发明的本领域技术人员，能够替换抗体VH和抗体VL等、改变包含抗体VH和抗体VL和抗体恒定区的分子形态，该分子形态不超出本发明的范围。

本说明书所使用的术语“IgG抗体样分子”是用于定义具有实质类似于如IgG抗体的恒定结构域或恒定区的结构的部分、和具有实质类似于如IgG抗体的可变结构域或可变区的结构的部分、具有与IgG抗体实质上类似的立体结构的分子。但是，本说明书的“IgG抗体样分子”不限于维持与IgG抗体类似结构而发挥抗原结合活性的那些分子。

当抗原结合分子是IgG抗体样分子的情形，在相当于IgG抗体的2个可变区的部分分别设有抗原结合结构域的实施方案，对接触本发明的本领域技术人员是可理解的实施方案。组入其两臂的抗原结合结构域具有相同的抗原结合特异性或具有不同的抗原结合特异性，这对接触本发明的本领域技术人员也是可理解的实施方案，明确了不超出本发明的范围。

在本说明书中，术语“特异性”是指特异性结合的分子这一方的分子对其一个或多个结合的对象方的分子以外的分子实质上不结合的性质。也用于抗原结合结构域对特定的抗原中所含的表位具有特异性的情形。另外，也用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中的特定表位具有特异性的情形。此处，实质上不结合可根据在结合活性段落所记载的方法确认，特异性结合分子对上述对象方以外的分子的结合活性是指显示对上述对象方的分子的结合活性的80％以下，通常为50％以下，优选地为30％以下、特别优选地为15％以下的结合活性。

本说明书使用的“治疗”(以及其语法上的衍生词，例如“进行治疗”、“治疗着”等)表示意图改变受治疗个体的自然经过的临床性介入，可以为了预防的目的实施，也可以在临床的疾病过程期间实施。治疗的希望效果包括疾病的发生或复发的防止、症状的减轻、因疾病引起的任何直接或间接的病理性影响的减弱、转移的防止、疾病的进展速度减慢、自疾病状态的恢复或缓和、及经缓解或改善的预后，但不限于此。在一些实施方案中，本发明的药物组合物用于延迟疾病的发病或推迟疾病的进展。

本发明中的药物组合物通常是指疾病的治疗或预防、或检查、诊断用的药剂。在本发明中，在将药物组合物与其他成分的施用组合使用的情形，药物组合物可以与其他成分的施用同时、分别、或连续施用。本发明的药物组合物也可含有其他成分作为成分。

本发明的药物组合物可使用本领域技术人员公知方法制剂化。例如以与水或其以外的药学上可容许的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂的形式，非经口使用。例如，可以与药学上容许的载剂或溶剂，具体地为灭菌水或生理食盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体(vehicle)、防腐剂、粘合剂等合适地组合，以一般认可的制药实施所要求的单位用量形式混合而制剂化。将这些制剂中的有效成分量设定为能获得所指示的范围的适当容量。

注射用的无菌组合物可使用如注射用蒸馏水这样的载体根据通常的制剂方法获得调配。作为注射用水溶液，可以例举例如生理食盐水、包含葡萄糖或其他辅剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等张液。可并用合适的助溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(聚山梨糖醇80(TM)、HCO-50等)。

作为油性液体，可以例举例如麻油、大豆油，也可并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为助溶剂。另外，也可以与缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液及乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如普鲁卡因盐酸盐(procaine hydrochloride))、稳定剂(例如苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂调配。经调配的注射液通常填充于适当的安瓿。

本发明的药物组合物优选地通过非经口施用来给药。施用例如注射剂型、经鼻施用剂型、经肺施用剂型、经皮施用型的组合物。可通过例如静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部施用。

施用方法可根据患者年龄、症状合适地选择。本发明的药物组合物的施用量可设定为例如每一次每1kg体重0.0001mg到1000mg的范围。或者，可设定例如每位患者0.001～100000mg的施用量，但本发明不一定限于这些数值。施用量及施用方法根据患者的体重、年龄、症状等而变动，可由本领域技术人员考虑这些条件而设定适当的施用量及施用方法。

本发明中的多核苷酸通常被担载(插入)于适当的载体(vector)而导入宿主细胞。该载体只要是稳定维持插入的核酸即可，没有特别的限定，例如使用大肠杆菌为宿主的话，克隆用的载体优选为pBluescript载体(Stratagene公司制)等，但可利用市售的各种载体。本发明的实施中，在生产所使用的多肽(例如嵌合受体、IgG抗体、双特异性抗体、抗原结合分子等)的目的中使用载体的情形，特别地，表达载体是有用的。作为表达载体，只要是在试管内、大肠杆菌内、培养细胞内、生物个体内表达多肽的载体即可，没有特别限定，例如在试管内表达的话，优选pBEST载体(Promega公司制)，在大肠杆菌的话，优选pET载体(Invitrogen公司制)，在培养细胞的话，优选pME18S-FL3载体(GenBank登录号AB009864)，在生物个体的话，优选pME18S载体(Mol Cell Biol.8：466-472(1988))等。本发明的DNA对载体的插入可根据常规方法，例如通过使用限制性酶切位点的连接酶反应进行(Currentprotocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人，(1987)Publish.John Wiley&amp；Sons.Section 11.4-11.11)。

作为上述宿主细胞，没有特别限定，根据目的来使用各种宿主细胞。作为用于表达多肽的细胞，可例示例如细菌细胞(如链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)、枯草杆菌)、真菌细胞(如酵母菌、曲霉(Aspergillus)、昆虫细胞(如果蝇S2、夜蛾(Spodoptera)SF9)、动物细胞(如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞)及植物细胞。对宿主细胞的载体导入可以例如磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(Current protocols in Molecular Biologyedit.Ausubel等人，(1987)Publish.John Wiley&amp；Sons.Section 9.1-9.9)、脂转染法(GIBCO-BRL公司制)、显微注射法等公知方法进行。

为了使在宿主细胞表达的多肽分泌到内质网的内腔、细胞周围腔或细胞外环境，可将适当的分泌信号组入目标多肽。这些信号对目标多肽可以是内源性的，也可以是异种信号。

在上述制造方法中的多肽的回收，在本发明的多肽分泌到培养基的情形，回收培养基。在本发明的多肽产生于细胞内的情形，首先溶解该细胞，之后回收多肽。

对于从重组的细胞培养物回收本发明的多肽并纯化，可使用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水性相互作用层析法、亲和层析法、羟基磷灰石层析法及凝集素层析法的公知方法。

另外，作为本发明的一些实施方案中所使用的抗原结合结构域，可以例举例如单结构域抗体，在这些实施方案中，该单结构域抗体通过与特定的VL缔合、或与特定的VH缔合、或与特定的VHH缔合，来抑制抗原结合活性。本发明也涉及筛选这样的单结构域抗体的方法。

作为抑制单结构域抗体的抗原结合活性的VL/VH/VHH，可使用序列已知的VL/VH/VHH，例如序列登录于IMGT或Kabat数据库的那些序列。另外，也可使用从人抗体文库等鉴定的新的VL/VH/VHH的序列。组合这些序列制备蛋白质，通过使用上述方法测定结合活性，可选定抑制单结构域抗体的结合活性的VL/VH/VHH。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VL缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的筛选方法，包括以下步骤：

(a)取得具有靶标抗原结合活性的单结构域抗体的步骤；

(b)使(a)步骤取得的单结构域抗体与特定的VL缔合的步骤；

(c)确认在(b)步骤与特定的VL缔合的上述单结构域抗体对上述抗原的结合活性减弱或丧失的步骤。

本发明中所谓“结合活性减弱”是指与缔合前相比较，对靶标抗原的结合活性减少，不论减少的程度。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的筛选方法，包括以下步骤：

(a)取得具有靶标抗原结合活性的单结构域抗体的步骤；

(b)使(a)步骤取得的单结构域抗体与特定的VH缔合的步骤；

(c)确认在(b)步骤与特定的VH缔合的上述单结构域抗体对上述抗原的结合活性减弱或丧失的步骤。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VHH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的筛选方法，包括以下步骤：

(a)取得具有靶标抗原结合活性的单结构域抗体的步骤；

(b)使(a)步骤取得的单结构域抗体与特定的VHH缔合的步骤；

(c)确认在(b)步骤与特定的VHH缔合的上述单结构域抗体对上述抗原的结合活性减弱或丧失的步骤。

作为单结构域抗体与特定的VL/VH/VHH缔合的方法的例子，可以例举例如设计在完全抗体、Fab、Fab’、(Fab)₂等包含VH和VL两者的抗体或抗体片段中，使用单结构域抗体的序列代替VH和VL其中之一的序列的分子，使具有该序列的多肽表达的方法。

另外，本发明除了筛选通过与特定的VL缔合、或与特定的VH缔合、或与特定的VHH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体以外，也涉及制造通过促进单结构域抗体与特定的VL/VH/VHH的缔合、促进与特定的VL缔合、或促进与特定的VH缔合、或促进与特定的VHH缔合，来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的方法。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VL缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，包括以下步骤：

(a)制作置换在单结构域抗体中的、与抗体VL的缔合相关的氨基酸残基，维持该单结构域抗体对靶标抗原的结合活性的变体单结构域抗体的步骤。

在特定的实施方案中，提供了通过与特定VL缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，还包含以下步骤：

(b)使(a)步骤制作的变体单结构域抗体与特定的VL缔合的步骤；

(c)确认与该VL缔合的上述变体单结构域抗体的抗原结合活性减弱或丧失的步骤。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，包括以下步骤：

(a)制作置换在单结构域抗体中的、与抗体VH的缔合相关的氨基酸残基，维持该单结构域抗体对靶标抗原的结合活性的变体单结构域抗体的步骤。

在特定的实施方案中，提供了通过与特定VH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，还包含以下步骤：

(b)使(a)步骤制作的变体单结构域抗体与特定的VH缔合的步骤；

(c)确认与该VH缔合的该变体单结构域抗体的抗原结合活性减弱或丧失的步骤。

在本发明的一个实施方案中，提供了通过与特定VHH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，包括以下步骤：

(a)制作置换在单结构域抗体中的、与抗体VHH的缔合相关的氨基酸残基，维持该单结构域抗体对靶标抗原的结合活性的变体单结构域抗体的步骤。

在特定的实施方案中，提供了通过与特定VHH缔合来抑制抗原结合活性的单结构域抗体的制造方法，还包含以下步骤：

(b)使(a)步骤制作的变体单结构域抗体与特定的VHH缔合的步骤；

(c)确认与该VHH缔合的该变体单结构域抗体的抗原结合活性减弱或丧失的步骤。

使单结构域抗体与特定的VL/VH/VHH缔合的步骤，可通过设计在完全抗体、Fab、Fab’、(Fab)₂等包含VH和VL两者的抗体或抗体片段中，使用单结构域抗体的序列代替VH和VL其中之一的序列，表达具有该序列的多肽的方法来进行。

根据本发明的某个实施方案，通过与本发明的特定的VL/VH/VHH缔合来抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体，可从含有多个使单结构域抗体与第1缔合支持结构域连接的融合多肽的文库取得。

作为本说明书中的“文库”的实施方案，可提供能够有效取得通过与特定的VL/VH/VHH缔合而抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的文库。

在本说明书中，“文库”是指分别具有不同序列的多个融合多肽、或编码这些融合多肽的核酸或多核苷酸的组。文库中所含的多个融合多肽不是单一序列，而是彼此序列不同的融合多肽。

在本说明书中，所谓彼此序列不同的多个融合多肽中所述的”彼此序列不同”是指文库中各个融合多肽的序列彼此不同。更优选地是指，文库中各个融合多肽中的单结构域抗体部分的序列不同。即，文库中彼此不同序列的数量反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量，也称为”文库大小”。通常的噬菌体展示文库为10⁶到10¹²，通过适用核糖体展示法等公知技术可扩大文库大小至10¹⁴。但是，在噬菌体展示法的淘选选择时所使用的噬菌体粒子的实际数量通常较文库大小大10至10,000倍。此过剩倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各个克隆可存在10至10,000倍。因此，本发明中的“彼此序列不同”表示除了文库当量数以外的文库中各个多肽的序列彼此不同，更具体地为彼此序列不同的多肽存在10⁶至10¹⁴个分子、优选为10⁷至10¹²个分子。

另外，本发明的所谓由多个融合多肽为主形成的文库所述的“多个”是指，例如本发明的多肽、多核苷酸分子、载体或病毒通常是该物质的2个以上的种类的集合。例如，如果某2个以上的物质在关于特定的性状上彼此不同的话，表示该物质存在2种以上。作为例子，可例举在氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的变体氨基酸。例如，除了表面露出的非常多样的氨基酸位置的特定变体氨基酸不同以外，其余为实质上相同、优选为相同序列的本发明的2个以上多肽的情形，存在多个本发明的多肽。在另一个例子中，如果除了编码表面露出的非常多样的氨基酸位置的特定变体氨基酸的碱基不同以外，其余为实质上相同、优选为相同序列的本发明的2个以上多核苷酸分子的话，则本发明的多核苷酸分子存在多个。

将结合活性作为指标的融合多肽的筛选方法合适地也可使用利用噬菌体载体的淘选法。编码单结构域抗体的基因与编码IgG抗体CH1结构域或轻链恒定区的基因可通过以适当的实施方式连接而形成融合多肽。通过将编码融合多肽的基因插入噬菌体载体，可取得在表面表达融合多肽的噬菌体。通过使此噬菌体与所希望的抗原接触后、回收与抗原结合的噬菌体，可回收获得编码具有目标结合活性的融合多肽的DNA。此操作根据需要重复进行，可浓缩具有所希望结合活性的融合多肽。

除了噬菌体展示法以外，作为使用文库通过淘选获得融合多肽的技术，已知使用无细胞翻译系统的技术、在细胞或病毒表面呈现融合多肽的技术、使用乳化的技术等。例如，作为使用无细胞翻译系统的技术，可使用：通过去除终止密码子，经核糖体形成mRNA与翻译的蛋白质复合体的核糖体展示方法；使用嘌呤霉素等化合物使基因序列与翻译的蛋白质共价键合的cDNA展示法；mRNA展示法；使用对核酸的结合蛋白质而形成基因和翻译的蛋白质的复合体的CIS展示法等。另外，作为在细胞或病毒表面呈现融合多肽的技术，除了噬菌体展示法以外，也可使用大肠杆菌展示法、革兰氏阳性菌展示法、酵母菌展示法、哺乳动物细胞展示法、病毒展示法等。作为使用乳化的技术，可使用经由在乳剂中包含基因及翻译相关分子的体外病毒展示法等。这些方法已是公知的(Nat Biotechnol.2000Dec；18(12)：1287-92、Nucleic Acids Res.2006；34(19)：e127、Proc Natl Acad Sci U S A.2004Mar2；101(9)：2806-10、Proc Natl Acad Sci U S A.2004Jun 22；101(25)：9193-8、ProteinEng Des Sel.2008Apr；21(4)：247-55、Proc Natl Acad Sci U S A.2000Sep 26；97(20)：10701-5、MAbs.2010Sep-Oct；2(5)：508-18、Methods Mol Biol.2012；911：183-98)。

本发明的其他实施方案中，提供了包含单结构域抗体与IgG抗体轻链恒定区连接的多个融合多肽的文库，其是上述单结构域抗体中包含通过与特定的VL/VH/VHH缔合来抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的文库，以及从该文库筛选通过与特定的VL/VH/VHH缔合而抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的方法。

“抗原结合活性在一定值以下”可指例如以本说明书例示的方法测定抗原结合活性时，低于一定基准的抗原结合活性。“抗原结合活性在一定值以上”同样地，可指例如以本说明书例示的方法测定抗原结合活性时，高于一定基准的抗原结合活性。与抗原结合活性在一定值以下的融合多肽相比较，抗原结合活性在一定值以上的融合多肽与抗原结合较强。

以下，对于使用IgG抗体CH1结构域作为第1缔合支持结构域、使用IgG抗体CL作为第2缔合支持结构域的一些实施方案，进行说明。

可从包含单结构域抗体与IgG抗体CH1结构域连接的多个融合多肽的文库筛选包含目标单结构域抗体的融合多肽。

本发明的一些实施方案中提供了，包含单结构域抗体与IgG抗体CH1结构域连接的多个融合多肽的文库，其是上述单结构域抗体中包含通过与特定的VL/VH/VHH缔合来抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的文库，以及从该文库筛选包含通过与特定的VL/VH/VHH缔合而抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽的方法。

在特定实施方案中，提供了从包含单结构域抗体与IgG抗体CH1结构域连接的多个融合多肽的文库筛选包含通过与特定的VL缔合来抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽的方法。具体地，提供了单结构域抗体的筛选方法，包括以下步骤：

(a)使本发明中的文库的融合多肽进行体外展示的步骤；

(b)准备特定的VL和IgG抗体轻链恒定区融合的缔合配偶体的步骤；

(c)使在(a)步骤展示的融合多肽和在(b)步骤准备的缔合配偶体进行缔合，选择在单结构域抗体与上述VL缔合的状态下不与抗原结合或者抗原结合活性在一定值以下的融合多肽的步骤；

(d)选择在(c)步骤所选择的融合多肽所含的单结构域抗体在不与上述VL缔合的状态下与抗原结合或者抗原结合活性在一定值以上的融合多肽的步骤。

在上述(b)步骤准备的缔合配偶体还包含蛋白酶切割序列，在上述(d)步骤，可经蛋白酶处理而消除上述单结构域抗体与上述VL的缔合，确认在单结构域抗体与VL不缔合的状态下单结构域抗体的抗原结合活性。缔合配偶体中的蛋白酶切割序列，只要是切割时消除单结构域抗体与VL的缔合，其位置没有限定。作为蛋白酶切割序列位置的例子，如可位于缔合配偶体的VL与IgG抗体轻链恒定区的边界附近，优选地位于VL的第96位(Kabat编号)氨基酸到抗体轻链恒定区第130位(EU编号)(Kabat编号第130位)氨基酸之间，更优选地位于VL的第104位(Kabat编号)氨基酸到抗体轻链恒定区第113位(EU编号)(Kabat编号第113位)氨基酸之间。

另外，代替使用包含蛋白酶切割序列的缔合配偶体，也可在文库中的融合多肽导入蛋白酶切割序列，通过融合多肽经蛋白酶切割，消除单结构域抗体与VL的缔合。融合多肽中的蛋白酶切割序列只要是在切割时消除单结构域抗体与VL的缔合、且切割后也维持单结构域抗体的抗原结合活性，其位置没有限制。作为蛋白酶切割序列的位置的例子，如可位于融合多肽中的单结构域抗体与IgG抗体CH1结构域的边界附近。

进一步地，在上述(d)步骤，也可使在(c)步骤所选择的融合多肽的全长或包含单结构域抗体的部分再度展示，确认在单结构域抗体与VL不缔合的状态下单结构域抗体的抗原结合活性。

在特定实施方案中，提供了从包含单结构域抗体与IgG抗体轻链恒定区连接的多个融合多肽的文库，筛选包含通过与特定的VH缔合来抑制或丧失抗原结合活性的单结构域抗体的融合多肽的方法。具体地，提供包含单结构域抗体的融合多肽的筛选方法，包括以下步骤：

(a)使本发明中的文库的融合多肽进行体外展示的步骤；

(b)准备特定的VH和IgG抗体CH1结构域融合的缔合配偶体的步骤；

(c)使在(a)步骤展示的融合多肽和在(b)步骤准备的缔合配偶体进行缔合，选择在单结构域抗体与上述VH缔合的状态下不与抗原结合或者抗原结合活性在一定值以下的融合多肽的步骤；

(d)选择在(c)步骤所选择的融合多肽所含的单结构域抗体在不与上述VH缔合的状态下与抗原结合或者抗原结合活性在一定值以上的融合多肽的步骤。

在上述(b)步骤准备的缔合配偶体还包含蛋白酶切割序列，在上述(d)步骤，可经蛋白酶处理而消除上述单结构域抗体与上述VH的缔合，确认在单结构域抗体与VH不缔合的状态下单结构域抗体的抗原结合活性。缔合配偶体中的蛋白酶切割序列，只要是切割时消除单结构域抗体与VH的缔合，其位置没有限定。作为蛋白酶切割序列位置的例子，如可位于缔合配偶体的VH与IgG抗体CH1结构域的边界附近，优选地位于VH的第101位(Kabat编号)氨基酸到抗体重链恒定区第140位(EU编号)氨基酸之间，更优选地位于VH的第109位(Kabat编号)氨基酸到抗体重链恒定区第122位(EU编号)氨基酸之间。

另外，代替使用包含蛋白酶切割序列的缔合配偶体，也可在文库中的融合多肽导入蛋白酶切割序列，通过融合多肽经蛋白酶切割，消除单结构域抗体与VH的缔合。融合多肽中的蛋白酶切割序列只要是在切割时消除单结构域抗体与VH的缔合、且切割后也维持单结构域抗体的抗原结合活性，其位置没有限制。作为蛋白酶切割序列的位置的例子，如可位于融合多肽中的单结构域抗体与IgG抗体轻链恒定区的边界附近。

进一步地，在上述(d)步骤，也可使在(c)步骤所选择的融合多肽的全长或包含单结构域抗体的部分再度展示，确认在单结构域抗体与VH不缔合的状态下单结构域抗体的抗原结合活性。

本发明所记载的氨基酸序列所含的氨基酸也存在受到翻译后修饰(例如N端的谷氨酰胺经焦谷氨酰化为焦谷氨酸的修饰是本领域技术人员周知的修饰)的情形，即使是这样的氨基酸翻译后修饰的情形，也当然包含于本发明记载的氨基酸序列中。

制作具有所希望结合活性的抗体的方法为本领域技术人员公知。在本发明中，可使用以在靶标细胞(病变细胞)表面表达的分子作为抗原(靶标抗原)的抗原结合分子。当靶标细胞是肿瘤细胞或癌细胞的情形，该抗原作为肿瘤抗原如本说明书下述例示的那样，例示了制备与肿瘤抗原结合的抗体的方法。

与肿瘤抗原结合的抗体可使用公知手段取得多克隆抗体或单克隆抗体。该抗体可优选地制备为来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体包含通过杂交瘤产生的单克隆抗体、以及通过基因工程的方法以包含抗体基因的表达载体转化的宿主细胞所产生的单克隆抗体等。

产生单克隆抗体的杂交瘤可通过使用公知技术，例如如下所述制备。即，使用肿瘤抗原蛋白作为致敏性抗原，根据通常的免疫方法免疫哺乳动物。所获得的免疫细胞经通常的细胞融合法与公知的亲代细胞融合。然后，通过通常的筛选法，筛选单克隆抗体产生细胞，可选出产生抗肿瘤抗原抗体的杂交瘤。

具体地，单克隆抗体的制备例如如下述所示进行。首先，使肿瘤抗原基因表达，可取得作为取得抗体的致敏性抗原使用的肿瘤抗原蛋白。即，将编码肿瘤抗原的基因序列插入公知的表达载体，转化适当的宿主细胞。从该宿主细胞中或培养上清液中以公知方法纯化所希望的人肿瘤抗原蛋白。为了从培养上清液取得可溶型肿瘤抗原，可使用例如在肿瘤抗原多肽序列中缺少构成疏水性区域的部分的蛋白质。另外，纯化的天然GPC3蛋白质也同样可作为致敏性抗原使用。

可使用该纯化的肿瘤抗原蛋白作为用于对哺乳动物免疫的致敏性抗原。也可使用肿瘤抗原的部分肽作为致敏性抗原。此时，该部分肽也可由人肿瘤抗原的氨基酸序列经化学合成而取得。另外，将部分的肿瘤抗原基因插入表达载体而表达也可获得。进一步地，使用蛋白质分解酶分解肿瘤抗原蛋白也可获得，但作为部分肽使用的肿瘤抗原肽的区域及大小不不特别限定为特定的形式。构成作为致敏性抗原的肽的氨基酸的数目优选地至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，作为致敏性抗原可使用8～50个、优选地10～30个残基的肽。

另外，可利用肿瘤抗原蛋白的所希望部分的多肽或肽与不同的多肽融合而成的融合蛋白作为致敏性抗原。为了制造作为致敏性抗原使用的融合蛋白，例如可优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体与编码所希望的二种或以上的多肽片段的基因以符合读框地融合，该融合基因如上所述插入表达载体而制备。融合蛋白的制备方法记载于Molecular Cloning第二版(Sambrook，J等人，Molecular Cloning第二版，9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。作为一个例子为，作为致敏性抗原使用的GPC3的取得方法及使用其的免疫方法也具体记载在WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等。

以该致敏性抗原免疫的哺乳动物不限于特定动物，但优选地考虑与细胞融合所使用的亲代细胞的适合性来选择。一般合适地使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠，或兔、猴等。

根据公知方法对上述动物通过使用致敏性抗原而免疫。例如，作为常规方法，通过在哺乳动物的腹腔内或皮下注射施用致敏性抗原来实施免疫。具体地，将用PBS(磷酸缓冲盐水)或生理食盐水等以合适的稀释倍率稀释的致敏性抗原根据需要与通常的佐剂例如完全弗氏佐剂混合、乳化后，以每4至21日数次对哺乳动物施用该致敏性抗原。另外，在致敏性抗原免疫时可使用合适的载体。特别是使用分子量小的部分肽作为致敏性抗原的情形，也有希望以与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白结合的该致敏性抗原肽进行免疫的情形。

另外，产生所希望的抗体的杂交瘤也可使用DNA免疫，如下述制备。DNA免疫为在免疫动物中施用以可表达编码抗原蛋白的基因的方式所构建的载体DNA的该免疫动物中，使致敏性抗原在该免疫动物的体内表达，提供免疫刺激的免疫方法。与施用蛋白质抗原至免疫动物的一般免疫方法相比，期待DNA免疫具有下述优势。

-可维持膜蛋白的结构、提供免疫刺激。

-不必纯化免疫抗原。

为了经DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先施用免疫动物表达肿瘤抗原蛋白的DNA。编码肿瘤抗原的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所获得的DNA插入合适的表达载体，施与免疫动物。表达载体可合适地利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。将载体施与生物体的方法可利用通常使用的方法。例如，通过将吸附表达载体的金粒子以基因枪导入免疫动物个体的细胞内，进行DNA免疫。进一步地，识别肿瘤抗原的抗体的制备也可使用国际公开WO2003/104453所记载的方法制备。

如此免疫哺乳动物，确认与血清中的肿瘤抗原结合的抗体滴度上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，提供用于细胞融合。优选的免疫细胞特别地可使用脾细胞。

与上述免疫细胞融合的细胞使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选地具有供筛选用的合适选择标志物。选择标志物是指在特定培养条件下可存活(或不能存活)的性状。选择标志物如次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称TK缺陷)等是公知的。具有HGPRT或TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞在HAT选择培养基中无法进行DNA合成而死亡，但当与正常细胞融合时，利用正常细胞的补救途径可继续DNA的合成，因此即使在HAT选择培养基中也能增殖。

HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞可分别在含有6-硫代鸟嘌呤、8-氮鸟嘌呤(以下简称8AG)、或5’溴代脱氧尿苷的培养基中选择。DNA中摄入这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。另一方面，不摄入这些嘧啶类似物的这些酶缺陷的细胞，可在选择培养基中生存。另外，称为G418抗性的选择标志物经新霉素抗性基因提供对2-脱氧链霉胺类抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是公知的。

这样的骨髓瘤细胞可合适地使用例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4)，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7)，511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3)，405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685)，269-270)、FO(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2)，1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1)，313-323)、R210(Nature(1979)277(5692)，131-133)等。

基本上根据公知方法，例如

和Milstein等人的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体地，例如在细胞融合促进剂的存在下，于通常的营养培养基中，可实施上述细胞融合。融合促进剂使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了进一步提高融合效率，可根据需要添加二甲基亚砜等辅助剂使用。

免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可任意设定。例如优选地将免疫细胞对骨髓瘤细胞为1至10倍。作为用于上述细胞融合的培养基，例如使用适于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养基、MEM培养基；另外，使用这种细胞培养所使用的常规培养基；进一步地，可合适地添加胎牛血清(FCS)等血清补充液。

细胞融合是将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的特定量在上述培养基中均匀混合，通常以30至60％(w/v)的浓度添加事先加热到约37℃的PEG溶液(例如平均分子量约1000至6000)。通过将混合液缓慢混合，形成所希望的融合细胞(杂交瘤)。接着，逐次添加如上举例的合适培养基，重复离心、去除上清液的操作，可去除不利杂交瘤生长的细胞融合剂等。

如此所获得的杂交瘤可通过培养在通常的选择培养基，例如HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养基)培养来选择。继续使用上述HAT培养基培养至使所希望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的充足时间(通常，充足的时间为数日至数周)。接着，通过通常的有限稀释法，实施产生所希望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。

如此所获得的杂交瘤，可利用相应于细胞融合所用的骨髓瘤具有的选择标志物的选择培养基来进行选择。例如具有HGPRT或TK缺陷的细胞，用HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养基)培养来进行选择。即，在将HAT敏感性的骨髓瘤细胞用于细胞融合的情形时，在HAT培养基中可使与正常细胞成功细胞融合的细胞选择性地增殖。继续使用上述HAT培养基进行培养至所希望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的充足时间。具体地，一般经数日至数周的培养，可选择所希望的杂交瘤。接着，通过通常的有限稀释法，可实施产生所希望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。

所希望抗体的筛选和单克隆化可基于公知的抗原抗体反应通过筛选方法合适地实施。例如，与GPC3结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的GPC3结合。这样的单克隆抗体可例如通过FACS(荧光活化的细胞分选法)筛选。FACS为用激光分析与荧光抗体接触的细胞，通过测定各个细胞发出的荧光，可测定抗体对细胞表面的结合的系统。

为了通过FACS筛选产生本发明单克隆抗体的杂交瘤，首先制备表达GPC3的细胞。筛选用的优选细胞为强制表达所用的肿瘤抗原的哺乳动物细胞。通过将作为宿主细胞使用的非转化的哺乳动物细胞作为对照使用，可选择性地检测出抗体对细胞表面的肿瘤抗原的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、但与GPC3强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可获得产生肿瘤抗原单克隆抗体的杂交瘤。

或者，抗体对固定的肿瘤抗原表达细胞的结合活性可基于ELISA原理而评估。例如，在ELISA板的孔固定GPC3表达细胞。使杂交瘤培养上清液和孔内的固定细胞接触，检测与固定细胞结合的抗体。在单克隆抗体来自小鼠的情形，可用抗小鼠免疫球蛋白抗体检出与细胞结合的抗体。通过这样的筛选所选择的、产生具有对抗原的结合能力的所希望抗体的杂交瘤，可通过有限稀释法等筛选。

如此所制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在常规培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可在液氮中长期保存。

该杂交瘤根据常规方法培养，可从该培养上清液获得所希望的单克隆抗体。或者，将杂交瘤施与适合其的哺乳动物而增殖，从其腹水获得单克隆抗体。前者方法是对获得高纯度抗体为合适的方法。

也可合适地利用经从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因所编码的抗体。经克隆的抗体基因通过插入合适的载体并导入宿主，表达经该基因编码的抗体。抗体基因的分离、对载体的导入、及宿主细胞的转化用的方法已例如由Vandamme等人确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3)，767-775)。如下所述的重组抗体的制造方法也是公知的。

例如，从产生与肿瘤抗原结合的抗体的杂交瘤细胞，获得编码该抗体可变区(V区)的cDNA。为此，通常先从杂交瘤提取总RNA。从细胞提取mRNA的方法可利用例如下所述的方法：-胍超离心法(Biochemistry(1979)18(24)，5294-5299)-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1)，156-159)。

可使用mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare BioSciences制)等纯化所提取的mRNA。或者，从细胞直接提取总mRNA用的试剂盒也有市售，如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GEHealthcare BioSciences制)等这样的试剂盒。使用这样的试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。使用反转录酶，从所获得的mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业社制)等合成。另外，cDNA的合成及扩增可合适地使用SMARTRACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)及使用PCR的5’-RACE法(Prac.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85(23)，8998-9002、Nucleic Acids Res.(1989)17(8)，2919-2932)。进一步地，在这样的cDNA合成过程中，可在cDNA的两端导入后述的合适限制性酶切位点。

从所获得的PCR产物纯化目的cDNA片段，然后与载体DNA连接。如此制备重组载体，选择导入大肠杆菌等的菌落后，可从形成该菌落的大肠杆菌制备所希望的重组载体。然后，以公知方法，例如双脱氧核苷酸链终止法等确认该重组载体是否具有目的cDNA的碱基序列。

为了获得编码可变区的基因，利用使用可变区基因扩增用引物的5’-RACE法是简便的。首先，从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板，合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。对于5’-RACE cDNA文库的合成，可合适地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售试剂盒。

将所获得的5’-RACE cDNA文库作为模板，经PCR法扩增抗体基因。可基于公知的抗体基因序列，设计小鼠抗体基因扩增用引物。这样的引物是对每个免疫球蛋白亚类都不同的碱基序列。因此，希望事先使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来决定亚类。

具体地，例如在以获得编码小鼠IgG的基因为目之时，可利用可能的引物扩增编码重链为γ1、γ2a、γ2b、γ3、轻链为κ链和λ链的基因。为了扩增IgG可变区基因，一般对于3’端引物，利用复性于对应靠近可变区的恒定区的部分的引物。另一方面，对于5’端的引物，利用5’-RACE cDNA文库制备试剂盒中所附的引物。

利用如此扩增的PCR产物，可再构成由重链和轻链的组合形成的免疫球蛋白。以再构成的免疫球蛋白对抗原的结合活性作为指标，可筛选所希望的抗体。例如，在以获得对GPC3的抗体为目之时，优选地抗体对GPC3的结合为特异性的。本发明中所使用的抗体可通过例如如下所述的筛选：

(1)使包含自杂交瘤获得的cDNA编码的V区的抗体与抗原表达细胞接触的步骤；

(2)检测抗原表达细胞与抗体结合的步骤；以及

(3)选择与抗原表达细胞结合的抗体的步骤。

检测抗体与肿瘤抗原表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，如上所述经FACS等方法可检测出抗体与肿瘤抗原表达细胞的结合。可合适地利用肿瘤抗原表达细胞的固定样本来评估抗体的结合活性。

以结合活性作为指标的抗体筛选方法，也可合适地使用利用噬菌体载体的淘选法。在自多克隆抗体表达细胞群获得以抗体基因作为重链和轻链的亚类的文库的情形，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可通过合适的接头序列连接形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所希望的抗原接触后，通过回收与抗原结合的噬菌体，可回收编码具有目的结合活性的scFv的DNA。根据需要重复此操作，可浓缩具有所希望结合活性的scFv。

在获得编码与目标肿瘤抗原结合的抗体的V区的cDNA后，通过识别插入在该cDNA两端的限制性酶切位点的限制性酶，消化该cDNA。优选的限制性酶识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进一步地，为了将1个拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选产生粘末端的限制性酶的插入。通过将如上述消化的编码抗GPC3抗体的V区的cDNA插入合适的表达载体，可获得抗体表达载体。此时，如果将编码抗体恒定区(C区)的基因与编码上述V区的基因以符合读框地融合，可获得嵌合抗体。此处，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同的抗体。因此，除了小鼠-人等的异种嵌合抗体以外，人-人的同种嵌合抗体也包含于本发明的嵌合抗体。通过事先在具有恒定区的表达载体插入上述V区基因，可构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如在具有编码所希望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’端，可合适地配置消化上述V区基因的限制性酶的限制性酶识别序列。以相同组合的限制性酶消化的两者以符合读框地融合，构建嵌合抗体表达载体。

为了制造单克隆抗体，将抗体基因插入表达载体以在表达控制区域的控制下表达。表达抗体用的表达控制区域包含例如增强子或启动子。另外，可在氨基端添加合适的信号序列以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述记载的实施例中，信号序列使用例如具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS的肽等，但除这些以外，也可添加合适的信号序列。所表达的多肽在上述序列的羧基端部分被切割，经切割的多肽作为成熟多肽，可分泌到细胞外。然后，通过用该表达载体转化合适的宿主细胞，可获得表达编码与目标肿瘤抗原结合的抗体的DNA的重组细胞。

为了表达抗体基因，将编码抗体重链(H链)及轻链(L链)的DNA，分别插入不同的表达载体。通过将插入H链和L链的载体同时转化(co-transfect)同一宿主细胞，可表达具有H链和L链的抗体分子。或者，可通过将编码H链和L链的DNA插入单一表达载体，转化宿主细胞(参见国际公开WO 94/11523)。

通过将分离的抗体基因导入合适的宿主而制备抗体用的宿主细胞和表达载体的多种组合是公知的。这些表达系统可应用于分离任何包含本发明的抗体可变区的结构域。在以真核细胞作为宿主细胞使用时，可合适地使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体地，动物细胞可例示下列细胞。

(1)哺乳动物细胞：CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾细胞；baby hamster kidney)、Hela、Vero等

(2)两栖动物类细胞：非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞等

(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。

或者，通过来自植物细胞如烟草(Nicotiana tabacum)等的烟草属(Nicotiana)的细胞的抗体基因表达系统是公知的。植物细胞的转化可合适地利用愈伤组织培养的细胞。

进一步地，真菌细胞可利用如下细胞。

-酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等的酵母属(Saccharomyces)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等的毕赤酵母属(Pichia)

-丝状菌：黑曲霉(Aspergillus niger)等的曲霉属(Aspergillus)。

另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞的情形，可合适地利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。将包含目的抗体基因的表达载体经转化导入这些细胞中。通过体外培养经转化的细胞，从该转化细胞的培养物可获得所希望的抗体。

除了上述宿主细胞之外，也可利用转基因动物用于重组抗体的产生。即，可从导入编码所希望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，通过将抗体基因符合读框地插入编码本来产生于乳汁中的蛋白质的基因的内部，可作为融合基因构建。可利用例如羊β酪蛋白等作为分泌在乳汁中的蛋白质。将包含插入抗体基因的融合基因的DNA片段注入羊胚胎，将该注入的胚胎导入雌羊。自接受胚胎的羊所生的转基因羊(或其子代)所产生的乳汁，可获得所希望抗体与乳汁蛋白质的融合蛋白质。另外，为了使转基因羊所产生的含有所希望抗体的乳汁量增加，可对转基因羊施用激素(Bio/Technology(1994)，12(7)，699-702)。

在对人施用本说明书所记载的抗原结合分子的情形，作为该抗原结合分子中包含抗体可变区的结构域，以对人的异种抗原性降低等作为目的，合适地采用来自人为改变的基因重组型抗体的结构域。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些变异抗体可使用公知方法合适地制造。

为了制备本说明书所记载的抗原结合分子中的包含抗体可变区的结构域，所使用的抗体可变区通常由4个构架区(FR)所夹的3个互补性决定区(complementarity-determining region；CDR)构成。CDR为实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。一方面，构成FR的氨基酸序列常常在具有不同结合特异性的抗体之间也显示高的同一性。因此，一般通过CDR移植，可将某抗体的结合特异性移植到其他抗体。

人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体。具体地，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体的人源化抗体等是公知的。用于得到人源化抗体的一般基因重组方法也是已知的。具体地，作为将小鼠抗体CDR移植到人FR的方法，例如重叠延伸PCR(OverlapExtension PCR)是公知的。在重叠延伸PCR中，将编码应移植的小鼠抗体CDR的碱基序列添加到合成人抗体的FR用的引物中。对4个FR分别准备引物。一般而言，在小鼠CDR移植到人FR的移植中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，这在维持CDR的功能上是有利的。即，一般地，优选利用与应移植的小鼠CDR邻接的FR氨基酸序列同一性高的氨基酸序列组成的人FR。

另外，连接的碱基序列设计为彼此符合读框地连接。通过各自的引物分别合成人FR。结果获得各FR加上编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列设计为彼此重叠。接着，以人抗体基因为模板，使合成的产物重叠的CDR部分彼此复性，进行互补链合成反应。通过此反应，人FR经由小鼠CDR序列连接。

最后，连接3个CDR和4个FR的V区基因，复性于其5’端和3’端，通过添加了合适的限制性酶识别序列的引物，扩增其全长。如上所述获得的DNA和编码人抗体C区的DNA以符合读框地融合、插入表达载体中，可产生人源化抗体表达用载体。通过将该重组载体导入宿主、建立重组细胞后，培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。

定性或定量测定和评估如上述制备的人源化抗体对抗原的结合活性，可合适地选择经CDR连接时该CDR形成良好抗原结合部位的人抗体的FR。根据需要，可置换FR的氨基酸残基使重构人抗体的CDR形成合适的抗原结合部位。例如，应用小鼠CDR移植到人FR所用的PCR法，可对FR导入氨基酸序列的变异。具体地，可在复性于FR的引物中导入部分碱基序列的变异。经这样的引物合成的FR中导入了碱基序列的变异。经置换氨基酸的变异型抗体对抗原的结合活性经上述方法测定评估，可选择具有所希望性质的变异FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res，1993,53,851-856)。

另外，以具有人抗体基因全部的抗体基因库的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，经DNA免疫可以获得所希望的人抗体。

进一步地，使用人抗体文库经淘选获得人抗体的技术也是已知。例如，将人抗体的V区作为单链抗体(scFv)经噬菌体展示法而在噬菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过分析所选择的噬菌体基因，可确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，通过将该V区序列和所希望的人抗体C区序列以符合读框地融合后，插入合适的表达载体，可制备表达载体。将该表达载体导入如上例示的合适表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达来获得该人抗体。已公知这样的方法(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388)。

包含具有T细胞受体复合体结合活性的抗体可变区的结构域

在本说明书中，”包含具有T细胞受体复合体结合活性的抗体可变区的结构域”是指包含与T细胞受体复合体的一部分或全部特异性结合且互补的区域而成的T细胞受体复合体抗体的一部分。T细胞受体复合体可以是T细胞受体本身，也可以是与T细胞受体一起的、构成T细胞受体复合体的适配体分子(adaptor molecule)。合适的适配体(adaptor)是CD3。

包含具有T细胞受体结合活性的抗体可变区的结构域

在本说明书中，“包含具有T细胞受体结合活性的抗体可变区的结构域”是指包含与T细胞受体的一部分或全部特异性结合且互补的区域而成的T细胞受体抗体的一部分。本发明的结构域结合的T细胞受体的一部分可以是可变区，也可以是恒定区，优选地为存在于恒定区的表位。作为恒定区的序列，可例举例如RefSeq登录编号CAA26636.1的T细胞受体α链、RefSeq登录编号C25777的T细胞受体β链、RefSeq登录编号A26659的T细胞受体γ1链、RefSeq登录编号AAB63312.1的T细胞受体γ2链、RefSeq登录编号AAA61033.1的T细胞受体δ链的序列。

包含具有CD3结合活性的抗体可变区的结构域

在本说明书中，“包含具有CD3结合活性的抗体可变区的结构域”是指包含和CD3的一部分或全部特异性结合且互补的区域而成的CD3抗体的一部分。优选地，该结构域包含抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和抗CD3抗体的重链可变区(VH)。

本发明的包含具有CD3结合活性的抗体可变区的结构域，如果存在构成人CD3的γ链、δ链、或ε链序列中的表位，也可为与任何表位结合的抗体可变区的结构域。在本发明中，优选地，合适地使用包含与存在于人CD3复合体e链的细胞外结构域的表位结合的抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和抗CD3抗体的重链可变区(VH)的结构域。作为这样的结构域，除了实施例记载的抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和抗CD3抗体的重链可变区(VH)以外，也可合适地使用OKT3抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4914-4917)或各种公知的包含抗CD3抗体的轻链可变区(VL)和抗CD3抗体的重链可变区(VH)的CD3结合结构域。另外，可合适地使用通过将构成人CD3的γ链、δ链、或ε链使用上述方法免疫所希望的动物而获得的包含具有所希望性质的抗CD3抗体作为起源的抗体可变区的结构域。包含具有CD3结合活性的抗体可变区的结构域成为起源的抗CD3抗体，如上所述，可合适地使用合适的人源化抗体或人抗体。对于构成CD3的γ链、δ链、或ε链的结构，其多核苷酸序列记载于RefSeq登录编号NM_000073.2、NM_000732.4及NM_000733.3，其多肽序列记载于RefSeq登录编号NP_000064.1、NP_000723.1及NP_000724.1。

特异性

特异性是指特异性结合的分子这一方的分子，对于其一个或多个结合的对象方的分子以外的分子，不显示任何有显著性结合的状态。另外，包含抗体可变区的结构域也可用于对某抗原所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，在包含抗体可变区的结构域结合的表位被包含于多个不同抗原的情形，具有包含该抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以与包含该表位的多种抗原结合。

表位

意指存在于抗原中的抗原决定基的表位是指，与本说明书所公开的抗原结合分子中的包含抗体可变区的结构域结合的抗原上的部位。因此，例如表位可根据其结构定义。另外，根据对识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性，也可定义该表位。当抗原为肽或多肽的情形，也可根据构成表位的氨基酸残基来确定表位。另外，当表位为糖链的情形，也可根据特定的糖链结构来确定表位。

线性表位为这样的表位，其包含氨基酸一级序列被识别的表位。线性表位典型地包含在固有序列中的至少3个、最普通至少5个，例如约8～约10个、6～20个的氨基酸。

与线性表位相反，立体表位不是包含表位的氨基酸一级序列为被识别的表位的单一定义成分的表位(例如，氨基酸的一级序列不一定是被特定表位的抗体所识别的表位)。立体表位，相对于线性表位，可包含增大数目的氨基酸。关于立体表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三级结构。例如，当蛋白质分子折叠形成三级结构时，形成立体表位的氨基酸和/或多肽主链并列，抗体可识别表位。确定表位的立体结构的方法，包括例如X光结晶学、二维核磁共振光谱学及部位特异性自旋标签及电磁顺磁共振光谱学，但不限于此。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology(1996)，第66卷，Morris(编)。

以下例举通过与肿瘤抗原结合的抗原结合分子确认对表位的结合的方法。

例如，可如下确认与肿瘤抗原结合的抗原结合分子识别肿瘤抗原分子中存在的线性表位。为了上述目的，合成由构成肿瘤抗原的细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽。该肽可化学合成。或者，利用肿瘤抗原的cDNA中编码相应于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，经基因工程方法获得。接下来，评估由构成细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽与具有包含对肿瘤抗原具有结合活性的抗体可变区的结构域的受检抗原结合分子的结合活性。例如，通过以固定的线性肽作为抗原的ELISA，可评估该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于在该抗原结合分子对肿瘤抗原表达细胞的结合中，因线性肽而引起的抑制水平，可获知针对线性肽的结合活性。通过这些试验，可获知该抗原结合分子对线性肽的结合活性。

另外，可如下述确认具有包含对肿瘤抗原具有结合活性的抗体可变区的结构域的受检抗原结合分子识别立体结构表位。为了上述目的，制备表达肿瘤抗原的细胞。可以例举具有包含对肿瘤抗原具有结合活性的抗体可变区的结构域的受检抗原结合分子在接触肿瘤抗原表达细胞时，与该细胞强力结合，另一方面，该抗原结合分子对由固定的构成肿瘤抗原的细胞外结构域的氨基酸序列所形成的线性肽实质上不结合时等。此处，所谓实质上不结合是指结合活性为对人肿瘤抗原表达细胞的结合活性的80％以下，通常50％以下，优选地30％以下，特别优选地15％以下的结合活性。

测定包含针对肿瘤抗原的抗原结合结构域的受检抗原结合分子对肿瘤抗原表达细胞的结合活性的方法，例如Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，通过将GPC3表达细胞作为抗原的ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选法)的原理而可评估。

在ELISA形式中，通过比较经酶反应所产生的信号水平来定量评估针含有针对目标肿瘤抗原的抗原结合结构域的受检抗原结合分子对该肿瘤抗原表达细胞的结合活性。即，在固定有肿瘤抗原表达细胞的ELISA板中加入受检抗原结合分子，利用识别受检抗原结合分子的酶标记抗体，检测出与细胞结合的受检抗原结合分子。或者，在FACS中，制备受检抗原结合分子的稀释系列，通过确定对肿瘤抗原表达细胞的抗体结合滴度，可比较受检抗原结合分子对肿瘤抗原表达细胞的结合活性。

受检抗原结合分子对悬浮于缓冲液等的细胞的表面上表达的抗原的结合，可通过流式细胞术检测。作为流式细胞术，已知有例如以下的装置。

FACSCanto TM II

FACSAria TM

FACSArray TM

FACSVantage TM SE

FACSCalibur TM(皆为BD Biosciences公司的商品名)

EPICS ALTRA HyPerSort

Cytomics FC 500

EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(皆为Beckman Coulter社的商品名)

例如，作为受检抗原结合分子对抗原的结合活性的合适测定方法一个例子，可以例举以下方法。首先，以识别与表达目标肿瘤抗原的细胞反应的受检抗原结合分子的FITC标记的二级抗体染色。以适当合适的缓冲液稀释受检抗原结合分子，将该缔合体制备为所希望的浓度来使用。例如，可在10μg/ml至10ng/ml之间的任一浓度使用。接着，用FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量反映为通过用CELLQUEST Software(BD公司)分析所获得的荧光强度，即，几何平均值。即，通过获得该几何平均值，可测定由受检抗原结合分子的结合量所表示的受检抗原结合分子的结合活性。

受检抗原结合分子与某抗原结合分子共有表位时，可通过这两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子之间的竞争可通过交叉阻断测定法等检测。例如竞争性ELISA测定法为优选的交叉阻断测定法。

具体地，在交叉阻断测定法中，包被在微量滴定板的孔上的肿瘤抗原蛋白，在成为候补的竞争抗原结合分子的存在下或不存在下预温育后，添加受检抗原结合分子。与孔中的肿瘤抗原蛋白结合的受检抗原结合分子的量，与针对相同表位结合竞争的成为候补的竞争抗原结合分子的结合能力间接相关。即，对同一表位的竞争抗原结合分子的亲和性越大，受验抗原结合分子对包被有肿瘤抗原蛋白的孔的结合活性越低。

经肿瘤抗原蛋白的介导与孔结合的受检抗原结合分子的量，可通过预先标记抗原结合分子而容易地测定。例如，可通过使用抗生物素蛋白过氧化物酶缀合物和合适的底物测定经生物素标记的抗原结合分子。利用过氧化物酶等酶标记的交叉阻断测定法特别地称为竞争性ELISA测定法。抗原结合分子能够以可检测或测定的其他标记物质标记。具体地，公知放射性标记或荧光标记等。

与在候补的竞争抗原结合分子不存在下所实施的对照试验中所获得的结合活性相比较，如果竞争竞争抗原结合分子可阻断包含对肿瘤抗原的抗原结合结构域的受检抗原结合分子的结合至少20％、优选地至少20-50％、更优选地至少50％，则该受检抗原结合分子是和竞争抗原结合分子实质上与相同的表位结合，或是竞争对同一表位的结合的抗原结合分子。

在鉴定含有针对目标肿瘤抗原的抗原结合结构域的受检抗原结合分子结合的表位的结构的情形，可通过比较受检抗原结合分子和对照抗原结合分子这两者对于在构成该表位的肽导入氨基酸改变的肽或多肽的结合活性来评估受检抗原结合分子和对照抗原结合分子共有表位。

作为测定如此结合活性的方法，例如在上述ELISA形式中，可通过比较受检抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入变异的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，也可通过使受检抗原结合分子和对照抗原结合分子流过结合有变异肽的管柱后，定量洗脱液中所洗脱的抗原结合分子，测定对结合于管柱的该变异肽的结合活性。使变异肽与例如GST作为融合肽吸附于管柱的方法是公知的。

另外，在已鉴定的表位为立体表位的情形，可以下列方法评估受检抗原结合分子和对照抗原结合分子共有表位。首先，制备表达肿瘤抗原的细胞和表达表位导入变异的肿瘤抗原的细胞。向这些细胞悬浮于PBS等合适缓冲液的细胞悬浮液添加受检抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，对于以合适缓冲液洗净的细胞悬浮液，添加可识别受检抗原结合分子和对照抗原结合分子的FITC标记抗体。经标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数以FACSCalibur(BD公司)测定。受检抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度以适当的缓冲液适当稀释，制备成所希望的浓度使用。例如在10μg/ml至10ng/ml之间的任一浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量反映为通过使用CELL QUEST Software(BD公司)分析所获得的荧光强度，即，几何平均值值。即，通过获得该几何平均值，可测定由标记抗体的结合量所表示的受检抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。

可用下列方法判断本方法中与包含变异的肿瘤抗原表达细胞实质上不结合。首先，将结合于表达变异肿瘤抗原的细胞的受检抗原结合分子和对照抗原结合分子用标记抗体染色。接着，检测细胞的荧光强度。在荧光检测上使用FACSCalibur作为流式细胞术的情形，所获得的荧光强度可使用CELL QUEST Software分析。从抗原结合分子存在下和不存在下的几何平均值，根据下列算式计算出此比较值(ΔGeo-Mean)，可求得因抗原结合分子的结合引起的荧光强度的增加比例。

ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(抗原结合分子存在下)/Geo-Mean(抗原结合分子不存在下)

Fv(可变区片段)

在本说明书中，术语”Fv(可变区片段(variable ffagment))”是指由抗体的轻链可变区(VL(light chain variable region))和抗体的重链可变区(VH(heavy chainvariable region))配对所形成的来自抗体的抗原结合结构域的最小单位。1988年Skerra和Pluckthun发现，在细菌的信号序列的下游插入了抗体基因的大肠杆菌中，经诱导该基因表达，可以均一且维持活性的状态从大肠杆菌的周质级分制备(Science(1988)240(4855)，1038-1041)。从周质级分制备的Fv中，VH和VL以具有对抗原的结合的形式缔合。

在本说明书中，Fv是例如以下的抗原结合分子：其也合适地包含一对Fv，为在包含以下的抗原结合分子等中：

(1)二价的抗原结合结构域；所述二价的抗原结合结构域是二价的scFv，是将二价的scFv中的一个一价的scFv经由构成CD3结合结构域的重链Fv片段与构成Fc区的一个多肽相连接，另一个一价的scFv经由构成CD3结合结构域的轻链Fv片段与构成Fc区的另一个多肽相连接而成的二价的抗原结合结构域；

(2)包含Fc区的结构域，其中Fc区为在IgG1、IgG2a、IgG3或IgG4的构成Fc区的氨基酸中不具有Fcγ受体-结合活性的Fc区；和

(3)至少一价的CD3结合结构域，其中轻链Fv片段和重链Fv片段以具有对CD3结合的方式缔合而构成CD3结合结构域。

scFv、单链抗体、或sc(Fv)₂

在本说明书中，术语”scFv”、”单链抗体”、或”sc(Fv)₂”是指在单一多肽链内包含来自重链及轻链两者的可变区，但缺乏恒定区的抗体片段。通常，单链抗体还在VH结构域和VL结构域之间含有多肽接头，这使得能够形成被认为允许抗原结合的所需结构。Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg，及Moore编，Springer-Verlag，NewYork，269～315(1994)中详细讨论了单链抗体。同样地，可参照国际公开WO1988/001649及美国专利第4,946,778号及第5,260,203号。在特定实施方案中，单链抗体可以是双特异性的和/或人源化的。

scFv是构成Fv的VH和VL经肽接头连接而成的抗原结合结构域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(16)，5879-5883)。通过该肽接头可维持VH和VL接近的状态。

sc(Fv)₂为两个VL和两个VH的4个可变区由肽接头等的接头连接而构成一条链的单链抗体(J Immunol.Methods(1999)231(1-2)，177-189)。这两个VH和VL也可以由来于不同的单克隆抗体。例如也适合举出：在Journal of Immunology(1994)152(11)，5368-5374中所公开的识别存在于相同抗原中的两种表位的双特异性(bispecific sc(Fv)₂)。sc(Fv)₂可由本领域技术人员以公知方法制备。例如sc(Fv)₂可以通过将scFv用肽接头等的接头连接来制备。

作为构成本说明书中的sc(Fv)₂的抗原结合结构域的构成，可以举出：两个VH和两个VL以一条链多肽的N末端侧为基点按照VH、VL、VH、VL([VH]-接头-[VL]-接头-[VH]-接头-[VL])的顺序排列为特征的抗体。两个VH和两个VL的顺序不特别限于上述的构成，而是以什么样的顺序排列都可以。例如，也可以举出以下这样的顺序的构成。

[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]

[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]

[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]

[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]

[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]

关于sc(Fv)₂的分子形态也详细记载于WO2006/132352，本领域技术人员根据这些记载，为了制作本说明书中公开的抗原结合分子，可以适当制作所需的sc(Fv)₂。

另外，本发明的抗原结合分子也可以与PEG等载体高分子或抗癌剂等有机化合物缀合。另外，插入糖链附加序列，能够以糖链获得所需效果为目的合适的添加。

作为结合抗体的可变区的接头，可使用经遗传工程学可导入的任意肽接头、或合成化合物接头(例如Protein Engineering，9(3)，299-305，1996)所公开的接头等，但本发明中优选肽接头。肽接头的长度没有特别的限定，可根据目的由本领域技术人员合适地选择，优选的长度为5个氨基酸以上(对于上限没有特别的限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选地为15个氨基酸。在sc(Fv)₂包含3个肽接头的情形，可全部使用相同长度的肽接头，也可使用不同长度的肽接头。

例如，肽接头的情况下，可以举出以下序列：

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)_n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)_n

[其中，n为1以上的整数]等。但是，肽接头的长度和序列本领域技术人员可以根据目的适当选择。

合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于交联肽的交联剂，例如有：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二琥珀酰亚氨基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯(BS3)、二硫代双(琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DSP)、二硫代双(磺基琥珀酰亚氨基丙酸酯)(DTSSP)、双(琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(EGS)、双(磺基琥珀酰亚氨基琥珀酸)乙二醇酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚氨基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚氨基酒石酸盐(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、以及双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂均有市售。

在连接4个抗体可变区的情形，通常需要3个接头，可全部使用相同的接头，也可以使用不同的接头。

“Fab”由一条轻链、以及一条重链的CH1区和可变区构成。Fab分子的重链不能够与其他重链分子形成二硫键。

“F(ab’)₂”和“Fab’”是指，通过将免疫球蛋白(单克隆抗体)用作为蛋白质分解酶的胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶等进行处理来制备，在存在于铰链区中的两条H链间的二硫键的前后被消化而生成的抗体片段。例如，可以将IgG用木瓜蛋白酶处理，在存在于铰链区中的两条H链间的二硫键的上游被切割，制备由VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)组成的L链和由VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区)组成的H链片段在C末端区通过二硫键连接而成的同种的两个抗体片段。这些两个同种的抗体片段分别被称为Fab’。

“F(ab’)₂”包含两条轻链和两条重链，所述两条重链包含CH1结构域和部分CH2结构域的恒定区以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的F(ab’)₂可以合适地如下获得：通过将具有所需抗原结合结构域的全长单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使Fc片段吸附于蛋白A柱而除去。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定pH等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成F(ab’)₂即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。

构成本说明书公开的抗原结合分子的Fc结构域可以合适地如下获得：通过将单克隆抗体等的抗体用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，使片段吸附于蛋白A柱或者蛋白G柱后，用适当的洗脱缓冲液等使其洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定pH等的酶的反应条件来消化单克隆抗体等的抗体即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。

本说明书所记载的抗原结合分子在IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的构成Fc区的氨基酸中含有Fcγ受体-结合活性降低的Fc区。

抗体的同种型由恒定区的结构决定。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的各同种型的恒定区分别被称为Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4。

Fc区是是指包含两条轻链和两条重链的除外F(ab’)₂的区域，所述两条重链包含CH1结构域和CH1和CH2结构域之间的区域的恒定区的一部分以使链间的二硫键在两条重链间形成。构成本说明书中公开的抗原结合分子的Fc结构域可以合适地如下获得：通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等的蛋白质分解酶部分消化后，将吸附于蛋白A柱上的组分进行再洗脱。作为所述的蛋白质分解酶，只要是可以通过适当设定pH等的酶的反应条件来消化全长抗体有选择性地生成F(ab’)₂即可，没有特别的限定，例如，可以例示胃蛋白酶或无花果蛋白酶等。

Fcγ受体是指可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，也表示实质上Fcγ受体基因所编码的蛋白质家族的所有成员。以人来说，该家族包括：包含同种型(isoform)FcγRIa、FcγRib及FcγRIc的FcγRI(CD64)；包含同种型FcγRIIa(包含同种异型的(allotype)H131及R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型的V158及F158)及FcγRIIIb(包含同种异型的FcγRIIIb-NA1及FcγRIIIb-NA2)的FcγRHI(CD16)，以及至今未发现的类人FcγR或FcγR同种型或同种异型，但不限于这些。FcγR包含来自人、小鼠、大鼠、兔及猴，但不限于这些，也可以来自任何生物。小鼠FcγR包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)，以及至今未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但不限于这些。这样的Fcγ受体的合适例子是人FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)和/或FcγRIIIB(CD16)。FcγRI的多核苷酸序列及氨基酸序列分别记载为RefSeq登录编号NM_000566.3及NP_000557.1，FcγRIIA的多核苷酸序列及氨基酸序列分别记载为RefSeq登录编号BC020823.1及30AAH20823.1，FcγRIIB的多核苷酸序列及氨基酸序列分别为RefSeq登录编号BC146678.1及AAI46679.1，FcγRIIIA的多核苷酸序列及氨基酸序列分别记载为RefSeq登录编号BC033678.1及AAH33678.1，及FcγRIIIB的多核苷酸序列及氨基酸序列分别记载为BC128562.1及AAI28563.1。Fcγ受体是否与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式以外，也可通过ALPHA筛选法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。

另外，“Fc配体”或“效应配体”是指结合于抗体的Fc区形成Fc/Fc配体复合体的、来自任意生物的分子，优选为多肽。Fc配体与Fc的结合优选诱发一个或以上的效应功能。Fc配体包含Fc受体、FcγR、FcαR、FcεR、FcRn、Clq、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌的蛋白A、葡萄球菌的蛋白质G和病毒的FcγR，但不限于这些。Fc配体还包含与FcγR同种的为Fc受体家族的Fc受体同系物(FcRH)(Davis等，(2002)Immunological Reviews 190，123-136)。Fc配体还可以包含结合于Fc的未发现的分子。

Fc区对FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA和/或FcγIIIB中任一个的Fcγ受体-结合活性降低，这一点可以通过上述所记载的FACS或ELISA形式、以及利用ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或基于表面等离子共振(SPR)的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。

ALPHA筛选通过使用供体和受体的两种珠的ALPHA技术，基于下述原理进行实施。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子生物学上相互作用，仅在两种珠接近的状态时，检测到发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧气变换为激发状态的单线态氧。单线态氧向供体珠周边扩散，当到达接近的受体珠时引起珠内的化学发光反应，最终放出光。结合于供体珠的分子与结合于受体珠的分子不相互作用时，供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。

例如，使生物素标记的抗原结合分子结合在供体珠上，使用谷胱甘肽S转移酶(GST)进行标签化的Fcγ受体结合在受体珠上。在具有竞争的突变Fc区的抗原结合分子的非存在下，具有野生型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体相互作用，产生520-620nm的信号。具有非标签化的突变Fc区的抗原结合分子和具有野生型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过定量竞争的结果出现的荧光的减少，可以决定相对的结合亲和力。将抗体等的抗原结合分子使用Sulfo-NHS-生物素等进行生物素化是公知的。作为将Fcγ受体用GST进行标签化的方法，可以合适地采用以下方法：将编码Fcγ受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸符合读框的融合，使所得融合基因在持有表达可能的载体的细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱进行纯化的方法等。所得信号适合通过使用例如GRAPHPAD PRISM(GraphPad；San Diego)等的软件使其适应于利用非线性回归分析的单位点竞争(one-sitecompetition)模型来进行分析。

若将观察相互作用的物质的一方(配体)固定于感应芯片的金薄膜上，从感应芯片的背侧照射光使其在金薄膜和玻璃的界面得以全反射，则在反射光的一部分形成反射强度降低的部分(SPR信号)。若将观察相互作用的物质的另一方(分析物)流至感应芯片的表面，使配体与分析物相结合，则得以固定的配体分子的质量增加，感应芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生移动(相反，若结合解离，则信号的位置还原)。Biacore系统将上述的移动的量、即在感应芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据来表示(传感图)。由传感图的曲线求得动力学参数(结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd))，由该两个常数之比求得亲和力(KD)。在BIACORE法中也适合使用抑制测定法。抑制测定法的例子记载于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010中。

显示抗肿瘤效果的多个治疗用抗体是通过对癌细胞的增殖上必要信号的抑制、细胞死亡信号的诱发、或者ADCC(Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity；抗体依赖性细胞毒作用)、CDC(Complement Dependent Cytotoxicity；补体依赖性细胞毒作用)来发挥对癌细胞的抗肿瘤效果。通过抗体的Fc区与存在于NK细胞或巨噬细胞等效应细胞上的Fc受体结合，这些效应细胞对抗体所结合的目标癌细胞发挥的细胞毒性为ADCC。在抗体的结构中存在的补体结合部位结合补体复合体。该复合体中存在的补体成分通过在抗体所结合的细胞的细胞膜上形成孔，促进水或离子向细胞内流入，破坏细胞，所引起的细胞伤害为CDC。Fc受体中，Fcγ受体是指可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，在对Fcγ受体的结合活性低的情形，在T细胞和NK细胞或巨噬细胞等表达的受体以癌抗原非依赖性地不被桥连。因此，不会发生癌抗原非依赖性的细胞因子的诱导。Fc区对FcγI、FcγIIA、FcγIIB、FcγIIIA和/或FcγIIIB的任一Fcγ受体的结合活性低的抗体，是期望的一级分子的抗体或IgG抗体样分子，及期望的作为二级分子的双特异性抗体。

在本说明书中，对Fcγ受体的结合活性低是指，例如基于上述分析方法，与作为对照的抗原结合分子的竞争活性相比较，受检抗原结合分子的竞争活性显示50％以下，优选地为45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下，特别优选地为10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。

作为对照的抗原结合分子可合适地使用具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构例如RefSeq登录编号AAC82527.1的N端加上A的序列、RefSeq登录编号AAB59393.1的N端加上A的序列、RefSeq登录编号CAA27268.1的N端加上A的序列、RefSeq登录编号AAB59394.1N端加上A的序列。另外，在具有某特定的同种型的抗体的Fc区突变体的抗原结合分子作为受检物质使用的情形，通过使用具有该特定同种型的抗体的Fc区的抗原结合分子作为对照，验证该突变体具有的变异对Fcγ受体的结合活性的效果。如上所述，可合适地制备对Fcγ受体的结合活性低得以验证的Fc区的突变体的抗原结合分子。

作为这样的突变体的例子，为根据EU编号所指定的氨基酸的231A-238S的缺失(WO2009/011941)、C226S、C229S、P238S(C220S)(J.Rheumatol(2007)34，11)、C226S、C229S(Hum.Antibod.Hybridomas(1990)1(1)，47-54)、C226S、C229S、E233P、L234V、L235A(Blood(2007)109，1185-1192)等的突变体是公知的。

即，在构成特定的同种型的抗体的Fc区的氨基酸中，合适地可以例举具有根据EU编号所指定的下列任一氨基酸被置换的Fc区的抗原结合分子：第220位、第226位、第229位、第231位、第232位、第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第238位、第239位、第240位、第264位、第265位、第266位、267位、第269位、第270位、第295位、第296位、第297位、第298位、第299位、第300位、第325位、第327位、第328位、第329位、第330位、第331位、第332位。作为Fc区起源的抗体的同种型没有特别限定，可以合适地利用以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4单克隆抗体作为起源的Fc区，但优选利用以IgG1抗体作为起源的Fc区。

例如，也可合适地使用：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个的置换(数字分别表示根据EU编号所指定的氨基酸残基的位置，位于数字前的单字氨基酸记号表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字氨基酸记号表示置换后的氨基酸残基)的Fc区：

(a)L234F、L235E、P331S、

(b)C226S、C229S、P238S、

(c)C226S、C229S、

(d)C226S、C229S、E233P、L234V、L235A

(e)L234A、L235A或L235R、N297A

(f)L235A或L235R、S239K、N297A，

或缺失第231位至第238位的氨基酸序列的Fc区的抗原结合分子。

另外，也可合适地使用：在构成IgG2抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个的置换(数字分别表示根据EU编号所指定的氨基酸残基的位置，位于数字前的单字氨基酸记号表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字氨基酸记号表示置换后的氨基酸残基)的Fc区的抗原结合分子：

(g)H268Q、V309L、A330S、P331S

(h)V234A

(i)G237A

(j)V234A、G237A

(k)A235E、G237A

(l)V234A、A235E、G237A。

另外，也可合适地使用：在构成IgG3抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个的置换(数字分别表示根据EU编号所指定的氨基酸残基的位置，位于数字前的单字氨基酸记号表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字氨基酸记号表示置换后的氨基酸残基)的Fc区的抗原结合分子：

(m)F241A

(n)D265A

(o)V264A。

另外，也可合适地使用：在构成IgG4抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个的置换(数字分别表示根据EU编号所指定的氨基酸残基的位置，位于数字前的单字氨基酸记号表示置换前的氨基酸残基，位于数字后的单字氨基酸记号表示置换后的氨基酸残基)的Fc区的抗原结合分子：

(p)L235A、G237A、E318A

(q)L235E

(r)F234A、L235A。

作为其他优选的例子，可以适合举出：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个氨基酸：第233位、第234位、第235位、第236位、第237位、第327位、第330位、第331位，置换为对应的IgG2或IgG4中其EU编号对应的氨基酸的Fc区的抗原结合分子。

作为其他优选的例子，可以适合举出：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个或以上的氨基酸：第234位、第235位、第297位，置换为其他氨基酸的Fc区的抗原结合分子。对置换后存在的氨基酸种类没有特别限定，特别优选地以具有在第234位、第235位、第297位的任一个或以上的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子。

作为其他优选的例子，可以适合举出：在构成IgG1抗体的Fc区的氨基酸之中，具有根据EU编号所指定的下列的任一个的氨基酸：第265位经其他氨基酸置换的Fc区的抗原结合分子为优选例。置换后存在的氨基酸种类没有特别限定，特别优选地以具有在第265位的氨基酸置换为丙氨酸的Fc区的抗原结合分子。

IgG类抗体的效应功能的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒作用(CDC)的研究至今为数众多，在人IgG类之中，以IgG1亚类抗体具有最高的ADCC活性、CDC活性。另外，经由IgG类抗体介导的对靶标细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)也教导为抗体的效应功能之一。IgG1亚类抗体由于对肿瘤可发挥这些效应功能，因此针对癌抗原的大多数抗体药物使用IgG1亚类抗体。

另一方面，IgG抗体为了介导抗体的效应功能ADCC、ADCP，或靶标细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)活性，IgG抗体的Fc区与存在于杀伤细胞、自然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上的Fcγ受体(FcγR)的结合是必要的。

ADCC和ADCP等细胞毒性的效应功能的增强是增强抗癌抗体的抗肿瘤效果用的期望手段。教导了对Fcγ受体的结合具有优化的Fc区的抗体介导更强力的效应功能，因此发挥更有效的抗肿瘤效果。因此，作为针对癌抗原的抗体药物的抗肿瘤活性增强或提升的抗体工程的方法，有各式各样的报导(如WO2013047752等)。

对于Fc区和Fcγ受体的结合，显示添加在抗体的铰链区和CH2结构域内的一些氨基酸残基及与CH2结构域结合的EU编号第297位的Asn上的糖链是重要的(Clark，M.，Chemical Immunology(1997)65，88-110、Greenwood J，Clark M，Waldmann H.，Eur.J.Immunol.(1993)23，1098-1104、Morgan A，Jones ND，Nesbitt AM，Chaplin L，Bodmer MW，Emtage JS.，Immunology(1995)86，319-324)。以该结合位点为中心，至今研究了具有多样的Fcγ受体结合特性的Fc区突变体，获得对Fcγ受体具有更高活性的亲和性的Fc区突变体(WO2000/042072、WO2006/019447)。

如此，在以膜抗原为靶标的抗体中，对Fcγ受体的结合活性由于在细胞毒性上发挥重要的作用，因此在细胞毒性是必需的情形时，使用对FcγR的结合活性高的人IgG1同种型，再经由增强对Fcγ受体的结合活性来增强细胞毒性为广泛使用的技术。另外，在以可溶型抗原作为靶标的抗体中，也可尝试增强对Fcγ受体的结合活性(WO2013047752)。

优选地，具有Fc区包含选自如下的Fc区的EU编号所示部位中的至少一个以上氨基酸的Fc区的IgG抗体或IgG抗体样分子是二级分子的具有ADCC活性的抗体：

第221位的氨基酸为Lys或Tyr中任一个；

第222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个；

第223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中任一个；

第224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中任一个；

第225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中任一个；

第227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个；

第228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个；

第230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中任一个；

第231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个；

第232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中任一个；

第233位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第234位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第235位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第236位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第237位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第238位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第239位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第240位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个；

第241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中任一个；

第243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gln、Arg、Trp或Tyr中任一个；

第244位的氨基酸为His；

第245位的氨基酸为Ala；

第246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个；

第247位的氨基酸为Ala、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Thr、Val或Tyr中任一个；

第249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中任一个；

第250位的氨基酸为Glu或Gln中任一个；

第251位的氨基酸为Phe；

第254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中任一个；

第255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中任一个；

第256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中任一个；

第258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中任一个；

第260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个；

第262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中任一个；

第263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个；

第264位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个；

第265位的氨基酸为Ala、Leu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中任一个；

第267位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第268位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Trp中任一个；

第269位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第270位的氨基酸为Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个；

第271位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第272位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第273位的氨基酸为Phe或Ile中任一个；

第274位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第275位的氨基酸为Leu或Trp中任一个；

第276位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第278位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个；

第279位的氨基酸为Ala；

第280位的氨基酸为Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gln、Trp或Tyr中任一个；

第281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中任一个；

第282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中任一个；

第283位的氨基酸为Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg或Tyr中任一个；

第284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中任一个；

第285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gln、Trp或Tyr中任一个；

第286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中任一个；

第288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中任一个；

第290位的氨基酸为Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp或Tyr中任一个、291位的氨基酸为Asp、Glu、Gly、His、Ile、Gln或Thr中任一个；

第292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中任一个；

第293位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第294位的氨基酸为Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第295位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第296位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中任一个；

第297位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第298位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第299位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个；

第300位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Trp中任一个；

第301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中任一个；

第302位的氨基酸为Ile；

第303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中任一个；

第304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中任一个；

第305位的氨基酸为Glu、Ile、Thr或Tyr中任一个；

第311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中任一个；

第313位的氨基酸为Phe；

第315位的氨基酸为Leu；

第317位的氨基酸为Glu或Gln；

第318位的氨基酸为His、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr、Val或Tyr中任一个；

第320位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第322位的氨基酸为Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Pro、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第323位的氨基酸为Ile；

第324位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第325位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Set、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第326位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第327位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第328位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第329位的氨基酸为Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第330位的氨基酸为Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第331位的氨基酸为Asp、Phe、His、Ile、Leu、Met、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第332位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中任一个；

第333位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Tyr中任一个；

第334位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile、Leu、Pro或Thr中任一个；

第335位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、His、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr中任一个；

第336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中任一个；

第337位的氨基酸为Glu、His或Asn中任一个；

第339位的氨基酸为Asp、Phe、Gly、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser或Thr中任一个；

第376位的氨基酸为Ala或Val中任一个；

第377位的氨基酸为Gly或Lys中任一个；

第378位的氨基酸为Asp；

第379位的氨基酸为Asn；

第380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中任一个；

第382位的氨基酸为Ala或Ile中任一个；

第385位的氨基酸为Glu；

第392位的氨基酸为Thr；

第396位的氨基酸为Leu；

第421位的氨基酸为Lys；

第427位的氨基酸为Asn；

第428位的氨基酸为Phe或Leu中任一个；

第429位的氨基酸为Met；

第434位的氨基酸为Trp；

第436位的氨基酸为Ile；以及

第440位的氨基酸为Gly、His、Ile、Leu或Tyr中任一个。

一级分子的制备

一级分子为与病变细胞表达的抗原结合，且包含蛋白酶可切割接头的抗原结合分子，作为一例为，对于根据上述顺序所获得的(1)与病变细胞表达的抗原结合的抗体，插入被蛋白酶可切割的接头来制备。

更具体地，制备在编码部分或全部的接头的DNA序列加上欲插入接头的抗体的部分序列的3’方向和5’方向的PCR引物，再以欲插入接头的抗体的重链或轻链的碱基序列作为模板，在DNA的5’端及3’端进行PCR反应。接着，将所获得的PCR产物利用In-Fusion(R)HDCloning Kit(Clontec)等插入公知的表达载体。所获得的表达载体经由成对的轻链或重链的质粒及公知方法，转染培养细胞。抗体表达后，使用蛋白质A柱等公知方法纯化，获得插入了接头的抗体。

本公开的”结合”是指通常经静电、范德华力、氢键等的非共价键为主的相互作用的结合。作为本公开的结合方式的合适的例子，可以例举例如抗原结合区、抗原结合分子、抗体、及抗体片段等与抗原结合的抗原抗体反应，但不限于此。

本公开的一级分子只限于与病变细胞表达的抗原结合的一级分子，只要是在未切割或切割后的状态下可以与病变细胞表达的抗原结合，任何结构的分子皆可使用。作为一级分子的例子，没有特别限定，可以例举例如抗体、单结构域抗体(sdAb)、存在生物体内的细胞膜蛋白Avimer所含的约35个氨基酸的称为A结构域的模块(国际公开WO2004/044011、WO2005/040229)、包含与细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白质结合的结构域即10Fn3结构域的Adnectin(国际公开WO2002/032925)、使构成由蛋白质A的58个氨基酸组成的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域支架化(scaffold)的Affibody(国际公开WO1995/001937)、在具有包含33个氨基酸残基的转角和2个反平行的螺旋及环的亚单元重复累积的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域DARPins(DesignedAnkyrin Repeat proteins)(国际公开WO2002/020565)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等的脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反平行链在中央方向支持扭曲的桶状结构的一侧的4个环区域的Anticalin等(国际公开WO2003/029462)、在七鳃鳗、盲鳗等无颚类的作为后天免疫系统的不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富含亮氨酸残基的重复序列(leucine-rich-repeat(LRR))模块重复累积的马蹄型结构内部的平行片层结构的凹陷区域(国际公开WO2008/016854)。

在本发明的一个实施方案中，进一步在蛋白酶切割序列的任一端或两端加上柔性接头。蛋白酶切割序列一端的柔性接头可称为第一柔性接头，另一端的柔性接头可称为第二柔性接头。在特定的实施方案中，蛋白酶切割序列和柔性接头包含下式之一。

(蛋白酶切割序列)

(第一柔性接头)-(蛋白酶切割序列)

(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)

(第一柔性接头)-(蛋白酶切割序列)-(第二柔性接头)

本实施方案中的柔性接头优选为肽接头。第一柔性接头和第二柔性接头各自独立且任意存在，为包含至少一个柔性氨基酸(Gly等)的相同或不同的柔性接头。例如，蛋白酶切割序列包含足够数量的残基(任意地选自Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Ala等氨基酸，特别是Gly、Ser、Asp、Asn、Ala，更特别是Gly及Ser，特别是Gly等)以获得所希望的蛋白酶可及性。

Ser

Gly·Ser(GS)

Ser·Gly(SG)

Gly·Gly·Ser(GGS)

Gly·Ser·Gly(GSG)

Ser·Gly·Gly(SGG)

Gly·Ser·Ser(GSS)

Ser·Ser·Gly(SSG)

Ser·Gly·Ser(SGS)

Gly·Gly·Gly·Ser(GGGS)

Gly·Gly·Ser·Gly(GGSG)

Gly·Ser·Gly·Gly(GSGG)

Ser·Gly·Gly·Gly(SGGG)

Gly·Ser·Ser·Gly(GSSG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS)

Gly·Gly·Gly·Ser·Gly(GGGSG)

Gly·Gly·Ser·Gly·Gly(GGSGG)

Gly·Ser·Gly·Gly·Gly(GSGGG)

Gly·Ser·Gly·Gly·Ser(GSGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG)

Gly·Ser·Ser·Gly·Gly(GSSGG)

Gly·Ser·Gly·Ser·Gly(GSGSG)

Ser·Gly·Gly·Ser·Gly(SGGSG)

Gly·Ser·Ser·Ser·Gly(GSSSG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGG)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGGGS)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGGGG)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(GGGGS))_n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SGGGG))_n[n为1以上的整数]等，但不限于此。其中，肽接头的长度或序列可由本领域技术人员根据目的合适地选择。

本公开的抗原结合分子是包含切割序列的多肽。蛋白酶切割该切割序列。切割序列只要是切割后所产生的抗原结合片段可以与靶标细胞(病变细胞)表达的抗原结合即可，也可以配置在多肽中的任何位置。另外，多肽中所包含的切割序列可以是1个也可以是多个。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合分子通过切割序列被切割，产生抗原结合片段，该抗原结合片段作为接头切割后的抗原结合分子具有与抗原的结合活性。

作为检测发生抗原结合分子的接头切割后的抗原结合片段的方法，存在用识别该片段的检测用抗体等的检测方法。使用抗原结合片段检测用抗体的检测，例如FACS、ELISA形式、ALPHA筛选法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法、BLI(Bio-Layer Interferometry；生物膜干涉)法(Octet)等，可以通过周知方法确认(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11)，4005-4010)。例如，在使用Octet检测抗原结合片段的情形，将识别抗原结合片段的检测用抗体进行生物素化，在与生物传感器接触之后，测定对样本中的抗原结合片段的结合，可检测抗原结合片段的发生。具体地，对于含有蛋白酶处理前的抗原结合分子和蛋白酶处理后的抗原结合片段的样本，使用检测抗体测定抗原结合片段的量，比较蛋白酶处理前后的样本中的抗原结合片段的检测量，可检测出抗原结合片段的发生。另外，对于含有蛋白酶和接头切割前的抗原结合分子和接头切割后的抗原结合片段的样本、以及不含蛋白酶的含有接头切割前的抗原结合分子和接头切割后的抗原结合片段的样本，使用检测抗体，测定抗原结合片段的量，比较有无蛋白酶的样本中的检测量，可检测出抗原结合片段的发生。更具体地，根据本申请实施例中的方法，可检测抗原结合片段的发生。在接头切割前的抗原结合分子形成融合蛋白的情形，对于含有蛋白酶处理前或蛋白酶处理后的融合蛋白的样本，使用抗原结合片段检测抗体，测定抗原结合片段的量，比较蛋白酶处理前后的样本中的抗原结合片段检测量，可检测抗原结合片段的发生。另外，对于含有蛋白酶和融合蛋白的样本、及不含蛋白酶的含有融合蛋白的样本，使用抗原结合片段检测抗体，测定抗原结合片段的量，比较有无蛋白酶的样本中的抗原结合片段检测量，可检测抗原结合片段的发生。更具体地，根据本申请实施例中的方法，可检测抗原结合片段的发生。

在本发明的一个实施方案中，切割序列包含蛋白酶切割序列，其通过蛋白酶被切割。

在本说明书中，术语“蛋白酶”是指使肽键水解的内肽酶或外肽酶等酶，通常指内肽酶。本发明所使用的蛋白酶只限于可切割蛋白酶切割序列的酶，对其种类没有特别限制。在一些实施方案中，使用靶标组织特异性蛋白酶。靶标组织特异性蛋白酶可指以下任一个，例如：

(1)在靶标组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(2)在靶标组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(3)在靶标细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(4)在靶标细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

本说明书中，“炎症组织”可例示地例举例如以下：

风湿性关节炎或骨关节炎的关节

支气管气喘或COPD的肺(肺泡)

发炎性肠道疾病或克罗恩症或溃疡性大肠炎的消化器官

肝脏、肾脏、肺的纤维化疾病的纤维化组织

器官移植中引起排斥反应的组织

动脉硬化或心脏衰竭的血管、心脏(心肌)

代谢综合征的内脏脂肪

特应性皮炎或其他皮炎的皮肤组织

椎间盘突出或慢性腰痛的脊髓神经。

(i)在靶标组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在靶标组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在靶标细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在靶标细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

不限制所解释的这些，作为具体的蛋白酶可以例举例如半胱氨酸蛋白酶(包含组织蛋白酶家族B、L、S等)、天冬氨酰蛋白酶(组织蛋白酶D、E、K、O等)、丝氨酸蛋白酶(包含Matriptase(包含MT-SP1)、组织蛋白酶A及G、凝血酶、纤溶酶、尿激酶(uPA)、组织纤溶酶原激活物(tPA)、弹性蛋白酶、蛋白酶3、凝血酶、激肽释放酶、类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶(chymase))、金属蛋白酶(包含膜结合型(MMP14-17及MMP24-25)及分泌型(MMP1-13及MMP18-23及MMP26-28)两者的金属蛋白酶(MMP1-28)、蛋白酶的A去整合素金属蛋白酶(ADAM)、具有A去整合素或血小板反应蛋白基序的金属蛋白酶(ADAMTS)、穿膜肽酶(穿膜肽酶α(meprinα)、穿膜肽酶β(meprinβ)))、CD10(CALLA)、以及前列腺特异性抗原(PSA)、天冬酰胺内肽酶(legumain)、TMPRSS3、TMPRSS4、嗜中性细胞弹性蛋白酶(HNE)、β分泌酶(BACE)、纤维母细胞活化蛋白α(FAP)、颗粒酶B、胍基苯甲酸酶(GB)、肝素、脑啡肽酶、NS3/4A、HCV-NS3/4、钙蛋白酶、ADAMDEC1、肾素、组织蛋白酶C、组织蛋白酶V/L2、组织蛋白酶X/Z/P、Cruzipain、Otubain 2、激肽释放酶相关肽酶(KLKs(KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14))、骨形态发生蛋白1(BMP-1)、活性蛋白C、血液凝固相关蛋白酶(凝血因子VIIa、凝血因子IXa、凝血因子Xa、凝血因子XIa、凝血因子XIIa)、HtrA1、乳铁蛋白、Marapsin、PACE4、DESC1、二肽基肽酶4(DPP-4)、TMPRSS2、组织蛋白酶F、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、颗粒酶A、Gepsin钙蛋白酶2、谷氨酸羧肽酶2、AMSH样蛋白酶、AMSH、γ分泌酶、A抗纤溶酶切割酶(APCE)、Decysin 1、N-乙酰化α连接的酸性二肽酶样1(NAALADL1)、弗林蛋白酶(furin)等。

另外，癌组织特异性蛋白酶可以与癌细胞的细胞膜结合，也可以不与细胞膜结合而分泌于细胞外。在癌组织特异性蛋白酶不与癌细胞的细胞膜结合的情形，为了使由免疫细胞引起的细胞毒性对癌细胞是特异的，癌组织特异性蛋白酶优选存在于癌组织的内部或附近。优选地在尽可能不伤害正常细胞的范围。

从另外的观点，癌组织特异性表达的蛋白酶(“癌组织特异性蛋白酶”)为以下任一种：

(i)在癌组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在癌组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在癌细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在癌细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

另外，炎症组织特异性蛋白酶也可以与发炎细胞的细胞膜结合，也可以不与细胞膜结合而分泌于细胞外。在炎症组织特异性蛋白酶不与发炎细胞的细胞膜结合的情形，为了使由免疫细胞引起的细胞毒性在发炎细胞为特异的，炎症组织特异性蛋白酶优选存在炎症组织的内部或附近。优选地在尽可能不伤害正常细胞的范围。

从另外的观点，炎症组织特异性蛋白酶为以下任一种：

(i)在炎症组织以较正常组织高水平表达的蛋白酶，

(ii)在炎症组织具有较正常组织高的活性的蛋白酶，

(iii)在发炎细胞以较正常细胞高水平表达的蛋白酶，

(iv)在发炎细胞具有较正常细胞高的活性的蛋白酶。

在本发明更具体的一些实施方案中，抗原结合分子(一级分子)是抗体。在使用抗体作为抗原结合分子的情形时，接头切割后的抗原结合分子可包含含有全部或部分的可变区的抗原结合片段及部分的切割接头。在更具体的一些实施方案中，抗原结合分子是IgG抗体。在使用IgG抗体作为抗原结合分子的情形时，对其种类不限定，可使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。即使在使用IgG抗体作为抗原结合分子的情形，也可通过包含全部或部分的可变区的抗原结合片段来实现对靶标细胞或病变细胞表达的抗原的结合。

在本发明的一些实施方案中，通过抗原结合分子中的切割序列/蛋白酶切割序列被切割，使抗原结合分子中的对病变细胞表达的抗原具有结合活性的结构域分断，从而可以与病变细胞表达的抗原结合。例如，在使用IgG抗体作为抗原结合分子的情形，在抗体可变区中设置切割序列/蛋白酶切割序列，在切割状态中，虽然变得不能形成完全的抗体可变区，但可以与病变细胞表达的抗原结合。

在本发明的一些实施方案中，抗原结合分子所包含的VH和VL缔合。另外，抗体VH和抗体VL的缔合可通过例如抗原结合分子所包含的接头中的蛋白酶切割序列的切割而消除。缔合的消除可换言为例如2个以上多肽区的相互作用状态的全部或部分消除。消除VH和VL的缔合可以是VH和VL的相互作用全部被消除，也可以是VH和VL的相互作用中的一部分被消除。

本发明的抗原结合分子包含这样的抗原结合分子，所述抗原结合分子中的抗体VL或其部分和抗体VH或其部分的缔合通过接头被切割而消除该缔合。

在本发明的一些实施方案中，抗原结合分子包含抗体VH和抗体VL，在抗原结合分子的接头的蛋白酶切割序列未被切割的状态下，抗原结合分子中的抗体VH和抗体VL缔合，而经接头的蛋白酶切割序列的切割，抗原结合分子中的抗体VH和抗体VL的缔合被消除。抗原结合分子中接头的蛋白酶切割序列只要是即使被切割也能使抗原结合分子与病变细胞表达的抗原结合，配置在抗原结合分子的哪个位置皆可。

在本发明更进一步的一些实施方案中，抗原结合分子包含抗体VH和抗体VL和抗体恒定区。

如Rothlisberger等人(J Mol Biol.2005Apr 8；347(4)：773-89.)所述，已知抗体的VH和VL、CH和CL在结构域间经多个氨基酸侧链介导来相互作用。已知VH-CH1和VL-CL作为Fab结构域可形成稳定的结构，但如已报导的那样，VH和VL之间的氨基酸侧链一般以10^-5到10^-8范围的解离常数相互作用，认为在只有VH结构域和VL结构域存在的情形下，形成缔合状态的比例少。

在本发明的一些实施方案中，设计如下的抗原结合分子：在含有抗体VH和抗体VL的抗原结合分子中设置含有蛋白酶切割序列的接头，在切割前，Fab结构中重链-轻链相互作用全部存在于2个肽之间，与此相反，在切割了蛋白酶切割序列时，含有VH(或部分VH)的肽和含有VL(或部分VL)的肽之间的相互作用减弱，VH和VL的缔合被消除。

在本发明的一个实施方案中，含有蛋白酶切割序列的接头位于抗体恒定区内。在更具体的实施方案中，含有蛋白酶切割序列的接头位于抗体重链恒定区中的第140位(EU编号)氨基酸的靠可变区侧，优选地位于抗体重链恒定区中的第122位(EU编号)氨基酸的靠可变区侧。在一些具体实施方案中，将蛋白酶切割序列导入抗体重链恒定区第118位氨基酸(EU编号)至抗体重链恒定区第140位氨基酸(EU编号)的序列中的任意位置。在其他更具体的实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗体轻链恒定区中的第130位氨基酸(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧，优选地位于抗体轻链恒定区中的第113位氨基酸(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧，位于抗体轻链恒定区中的第112位氨基酸(Kabat编号)氨基酸的靠可变区侧。在一些具体的实施方案中，将蛋白酶切割序列导入抗体轻链恒定区第108位氨基酸(Kabat编号)至抗体轻链恒定区第131位氨基酸(Kabat编号)的序列中的任意位置。

在本发明的一个实施方案中，含有蛋白酶切割序列的接头位于抗原结合分子的抗体VH内或抗体VL内。在更具体的实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗体VH的第7位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，优选地位于抗体VH的第40位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，更优选地位于抗体VH的第101位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，进一步优选地位于抗体VH的第109位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，位于抗体VH的第111位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧。在更具体的实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗体VL的第7位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，优选地位于抗体VL的第39位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，更优选地位于抗体VL的第96位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，进一步优选地位于抗体VL的第104位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧，位于抗体VL的第105位(Kabat编号)氨基酸的靠抗体恒定区侧。

在一些更具体的实施方案中，将蛋白酶切割序列导入形成抗体VH或抗体VL中的环结构的残基及接近环结构的残基的位置。抗体VH或抗体VL中的环结构是指在抗体VH或抗体VL中，不形成α-螺旋、β-折叠等二级结构的部分。形成环结构的残基及接近环结构的残基的位置具体可指：从抗体VH第7位氨基酸(Kabat编号)至第16位氨基酸(Kabat编号)、第40位氨基酸(Kabat编号)至第47位氨基酸(Kabat编号)、第55位氨基酸(Kabat编号)至第69位氨基酸(Kabat编号)、第73位氨基酸(Kabat编号)至第79位氨基酸(Kabat编号)、第83位氨基酸(Kabat编号)至第89位氨基酸(Kabat编号)、第95位氨基酸(Kabat编号)至第99位氨基酸(Kabat编号)、第101位氨基酸(Kabat编号)至第113位氨基酸(Kabat编号)、从抗体VL第7位氨基酸(Kabat编号)至第19位氨基酸(Kabat编号)、第39位氨基酸(Kabat编号)至第46位氨基酸(Kabat编号)、第49位氨基酸(Kabat编号)至第62位氨基酸(Kabat编号)、第96位氨基酸(Kabat编号)至第107位氨基酸(Kabat编号)的范围。

当抗原结合分子为抗体的情形，在其他实施方案中，将接头导入抗体重链恒定区的CH2/CH3界面附近。此处，CH2/CH3界面附近为EU编号335-345的区域。

在本发明的一个实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗体VH与抗体恒定区的边界附近。抗体VH与抗体重链恒定区的边界附近可指从抗体VH第101位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第140位(EU编号)的氨基酸之间，优选地可指从抗体VH第109位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间，或可指从抗体VH第111位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间。另外，在连接抗体VH和抗体轻链恒定区的情形，抗体VH与抗体轻链恒定区的边界附近可指从抗体VH第101位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第130位(Kabat编号)的氨基酸之间，优选地可指从抗体VH第109位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第113位(Kabat编号)的氨基酸之间，或者可指从抗体VH第111位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第112位(Kabat编号)的氨基酸之间。

在一个实施方案中，蛋白酶切割序列位于抗体VL与抗体恒定区的边界附近。抗体VL与抗体轻链恒定区的边界附近可指从抗体VL第96位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第130位(Kabat编号)的氨基酸之间，优选地可指从抗体VL第104位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第113位(Kabat编号)的氨基酸之间，或者可指从抗体VL第105位(Kabat编号)的氨基酸至抗体轻链恒定区第112位(Kabat编号)的氨基酸之间。在连接抗体VL和抗体重链恒定区的情形，抗体VL与抗体重链恒定区的边界附近可指从抗体VL第96位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第140位(EU编号)的氨基酸之间，优选地可指从抗体VL第104位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间，或者可指从抗体VL第105位(Kabat编号)的氨基酸至抗体重链恒定区第122位(EU编号)的氨基酸之间。

可在一级分子中设置多个蛋白酶切割序列，所述蛋白酶切割序列例如可设置在选自抗体恒定区内、抗体VH内、抗体VL内、抗体VH与抗体恒定区的边界附近、抗体VL与抗体恒定区的边界附近的多个位置。另外，只要是接触本发明的本领域技术人员，能够替换抗体VH和抗体VL等、改变包含抗体VH和抗体VL和抗体恒定区的分子形态，该分子形态不超出本发明的范围。

二级分子(T细胞重定向抗体)的制备

二级分子为具有与T细胞受体复合体结合的抗体可变区和与接头切割后的抗原结合分子结合的抗体可变区的T细胞重定向抗体；或具有与接头切割后的抗原结合分子结合的细胞外结构域的嵌合受体，作为一个例子，使用通过上述操作获得的(2)抗CD3抗体、(3)与接头切割后的抗原结合分子结合的抗体制备T细胞重定向抗体。

双特异性抗体

作为本发明的T细胞重定向抗体的优选方案之一，可例示双特异性抗体。此处，双特异性抗体是具有二个不同特异性的抗体。可通过融合二种产生IgG抗体的杂交瘤所产生的杂交-杂交瘤(hybrid hybridoma)(四源杂交瘤(quadroma))来分泌IgG型双特异性抗体(Milstein C et al.Nature(1983)305，537-540)。作为双特异性抗体的Fc区，在使用对Fcγ受体的结合活性低的Fc区的情形，也适合使用以双特异性抗体为起源的Fc区。

另外，通过将构成目标的2种IgG的L链和H链的基因、总计4种基因导入细胞、将它们共同表达来分泌IgG型双特异性抗体。但是，以这些方法产生的IgG的H链和L链的组合理论上总共10种。从10种IgG纯化出目标组合的H链L链所形成的IgG是困难的。而且，目标组合的分泌量理论上也显著降低，因此大的培养规模称为必要，导致制造成本进一步增大。

因此，本发明的双特异性抗体可应用促进目标组合的H链间及L链H链间的缔合的技术。

例如，对于多特异性抗体的缔合化，可适用在抗体H链的第二恒定区(CH2)或H链的第三恒定区(CH3)的界面导入电荷排斥来抑制非目标的H链彼此的缔合的技术(WO2006/106905)。

在CH2或CH3的界面导入电荷排斥来抑制非所需的H链彼此缔合的技术中，作为在H链的其他恒定区的界面处接触的氨基酸残基，可例举例如对应于CH3区中的EU编号第356位残基、EU编号第439位残基、EU编号第357位残基、EU编号第370位残基、EU编号第399位残基、EU编号第409位残基的区域。更具体地，例如，可以是这样的抗体，所述抗体包含两种H链CH3区，其中第一H链CH3区中选自以下(1)至(3)所示氨基酸残基对的一至三对氨基酸残基带有同种电荷：(1)包含在H链CH3区中在EU编号第356位及第439位的氨基酸残基；(2)包含在H链CH3区中在EU编号第357位及第370位的氨基酸残基；(3)包含在H链CH3区中在EU编号第399位及第409位的氨基酸残基。

进一步地，所述抗体可以是这样的抗体，其中不同于上述第一H链CH3区的第二H链CH3区中的氨基酸残基对选自上述(1)至(3)所示的氨基酸残基对，其中与上述第一H链CH3区中的带有同种电荷的上述(1)至(3)所示的氨基酸残基对相对应的一至三对氨基酸残基带有与上述第一H链CH3区中对应的氨基酸残基相反的电荷。

上述(1)至(3)中所记载的各氨基酸残基在缔合期间彼此接近。本领域技术人员可以通过同源性建模等使用可商购的软件找到所需的H链CH3区或H链恒定区中对应于上述(1)至(3)所记载的氨基酸残基的位置，并且这些位置的氨基酸残基可以进行适当修饰。

在上述抗体中，“带电荷的氨基酸残基”优选地选自例如以下(a)或(b)任一组所含的氨基酸残基：

(a)谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)，

(b)赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)。

上述抗体中，“具有同种电荷”表示例如2个以上的氨基酸残基的任一个皆具有上述(a)或(b)任一组所包含的氨基酸残基。“具有相反电荷”表示例如2个以上的氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基在具有上述(a)或(b)任一组所包含的氨基酸残基的情形时，其余的氨基酸残基具有不同组所含的氨基酸残基。

在优选的实施方案中，上述抗体也可通过二硫键将第一H链CH3区和第二H链CH3区桥连。

作为本发明中进行改变的氨基酸残基不限于上述抗体可变区或抗体恒定区的氨基酸残基。本领域技术人员可以通过使用市售软件的同源性建模等找到多肽突变体或异种多聚体中形成界面的氨基酸残基，可将该部位的氨基酸残基进行改变以调节缔合。

另外，也可进一步使用其他公知技术用于本发明的双特异性抗体的缔合化。通过将存在于抗体的一个H链的Fc区的氨基酸侧链置换为较大的侧链(knob；突起)，将存在于另一个H链的相对Fc区的氨基酸侧链置换为较小的侧链(hole；空隙)，通过将突起可配置在空隙内，能够有效地引起具有Fc区的不同氨基酸的多肽彼此的缔合化(WO1996/027011、Ridgway JB等人，Protein Engineering(1996)9，617-621、Merchant AM等人，NatureBiotechnology(1998)16，677-681、US20130336973)。

除此之外，也可进一步使用其他公知技术来形成本发明的双特异性抗体。通过使用抗体的一个H链的CH3的一部分为对应该部分的来自IgA的序列、另一个H链的CH3的互补部分使用导入对应该部分的来自IgA的序列的链交换工程化的结构域CH3(strand-exchange engineered domain CH3)，可有效地引起具有不同序列的多肽通过CH3的互补性缔合化而缔合化(Protein Engineering Design&amp；Selection，23；195-202，2010)。也可使用此公知技术来有效地形成目的双特异性抗体。

此外，双特异性抗体的形成也可利用WO2011/028952或WO2014/018572或NatBiotechnol.2014Feb；32(2)：191-8.所记载的抗体的CH1和CL的缔合化、VH、VL的缔合化的抗体制备技术；WO2008/119353或WO2011/131746所记载的使用分别制备的多种单克隆抗体制备双特异性抗体的技术(Fab臂交换(Fab Arm Exchange))；WO2012/058768或WO2013/063702记载的调控抗体重链CH3间的缔合的技术；WO2012/023053记载的制备由二种轻链和一种重链所构成的双特异性抗体的技术；Christoph等(Nature Biotechnology Vol.31，p753-758(2013)记载的利用分别表达由单条H链和单条L链形成的抗体部分链的2种细菌细胞株制造双特异性抗体的技术等。

另外，即使是不能有效地形成目的双特异性抗体的情形，也可通过从所产生的抗体中分离、纯化目的双特异性抗体，得到本发明的双特异性抗体。例如已有报导可以通过在2种H链可变区导入氨基酸置换、提供等电点(pI)差异，以离子交换层析法纯化2种同源体和目的异源抗体(WO2007114325)。另外，作为纯化异源体的方法，至今已有报导用蛋白质A纯化由与蛋白质A结合的小鼠IgG2a H链及不与蛋白质A结合的大鼠IgG2b H链所形成的异源二聚化抗体的方法(WO98050431、WO95033844)。进一步地，也可通过使用将IgG与蛋白质A的结合部位的EU编号第435位及第436位的氨基酸残基置换为Tyr、His等对蛋白质A的结合力不同的氨基酸的H链，或者根据参考实施例5记载的方法获得对蛋白质A的结合力不同的H链，使各H链和蛋白质A的相互作用变化，然后通过使用蛋白质A柱，有效地纯化出仅异源二聚化抗体。

另外，也可以获得能够提供对不同的多个H链具有结合能力的共有L链，将其作为双特异性抗体的共有L链使用。通过将这样的共有L链和不同的多个H链基因导入细胞并表达IgG，可效率良好地使双特异性IgG表达(Nature Biotechnology(1998)16，677-681)。在选择共有H链之时，也可利用选择对应任意不同的H链显示高结合能力的共有L链的方法(WO2004/065611)。

另外，作为本发明的Fc区，可合适地使用Fc区C端的异质性改善的Fc区。更具体地，在构成以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4作为起源的Fc区的2个多肽的氨基酸序列中，提供根据EU编号所指定的第446位的甘氨酸及第447位的赖氨酸缺失的Fc区。

也可组合这些技术中的多个、例如2个以上使用。另外，这些技术也可以合适地分别应用于欲缔合的2个H链。进一步地，这些技术也可组合上述对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区使用。另外，本发明的抗原结合分子可以是基于进行上述修饰的分子而单独制备的具有相同氨基酸序列的抗原结合分子。

在本发明中，“功能上等同”的抗体可变区只要是满足上述条件的抗体H链可变区和/或抗体L链可变区即可，没有特别限定。作为这样的抗体可变区，也可为例如上述表1～3所记载的可变区氨基酸序列置换、缺失、添加和/或插入了1个或多个氨基酸(例如1、2、3、4、5或10个氨基酸)。作为本领域技术人员熟知的用于在氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入1个或多个氨基酸的方法已知有蛋白质导入变异的方法。例如，本领域技术人员使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh，T，Mizuno，T，Ogasahara，Y，和Nakagawa，M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis.Gene 152，271-275；Zoller，MJ和Smith，M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors.MethodsEnzymol.100，468-500；Kramer，W，Drutsa，V，Jansen，HW，Kramer，B，Pflugfelder，M，和Fritz，HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction.Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer W和Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNAMethods.Enzymol.154，350-367；Kunkel，TA(1985)Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A.82，488-492)等，通过在氨基酸序列种导入合适的变异，可制备与具有上述功能的抗体可变区功能上等同的可变区。

在改变氨基酸序列的情形，希望变异为保留氨基酸侧链性质的其他氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可例示例如疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱性的侧链的氨基酸(R、K、H)、及具有含芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内的任一氨基酸以单字母标记)。各组内的这些氨基酸置换称为保守性置换。已知具有对某氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或经其他氨基酸置换而修饰的氨基酸序列的多肽可维持其生物学活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81：5662-6；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Res.(1982)10：6487-500；Wang，A.等人，Science(1984)224：1431-3；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79：6409-13)。包含这样的氨基酸改变的本发明的可变区具有与变异前的可变区的CDR序列、FR序列或可变区全部的氨基酸序列的至少70％、更优选地至少75％、更优选地至少80％、进一步优选地至少85％、进一步更优选地至少90％、最优选地至少95％的氨基酸序列同一性。在本说明书中，序列同一性定义为，为了使序列同一性成为最大，根据需要比对序列，导入合适的缺口(gap)后，与原始的H链可变区或L链可变区的氨基酸序列的残基相同的残基比例。可通过后述方法确定氨基酸序列的同一性。

另外，“功能上等同的抗体可变区”也可例如获自与包含编码上述表1至3所记载的可变区的氨基酸序列的的碱基序列在严格条件下杂交的核酸。用于分离与包含编码可变区的氨基酸序列的碱基序列的核酸在严格条件下杂交的核酸的、严格的杂交条件可例示6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC、37℃的条件或与此等同的严格杂交条件。更严格的条件例如使用6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC、42℃的条件，可期待分离同源性更高的核酸。杂交后的洗净条件是例如0.5×SSC(1×SSC是0.15M NaCL、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)、及在0.1％SDS、60℃洗净，更优选地是0.2×SSC、及在0.1％SDS、60℃洗净，更优选地是0.2×SSC、及在0.1％SDS、62℃洗净，更优选地是0.2×SSC、及在0.1％SDS、65℃洗净，更优选地是0.1×SSC、及在0.1％SDS、65℃洗净。可通过后述的公知方法进行分离的核酸序列的确定。分离的核酸的同源性具有全部碱基序列的至少50％以上、进一步优选地70％以上、进一步优选地90％以上(例如95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。

除了利用上述杂交技术的方法之外，也可以利用使用基于编码可变区的氨基酸序列的碱基序列信息合成的引物的基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法，分离与包含编码可变区的氨基酸序列的碱基序列的核酸在严格条件下杂交的核酸。

可根据Karlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：5873-7)确定碱基序列和氨基酸序列的同一性。基于此算法，开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)。在基于BLAST、经BLASTN分析碱基序列的情形时，参数设为例如分值＝100、字宽＝12。另外，在基于BLAST、经BLASTX分析氨基酸序列的情形时，参数设为例如分值＝50、字宽＝3。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情形时，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方法为公知(参照NCBI(National Centerfor Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)的网站；http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

本发明的双特异性抗体所含的Fc区，只要是对Fcγ受体的结合活性降低的Fc区即可，没有特别限定，作为本发明的优选Fc区，可例示例如WO2016/047722A1记载的E22Hh的Fc区部分和E22Hk的Fc区部分的组合、E2702GsKsc的Fc区部分和E2704sEpsc的Fc区部分的组合、E2702sKsc的Fc区部分和E2704sEpsc的Fc区部分的组合。

本发明可根据需要将本发明的药物组合物封入微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微胶囊)，作为胶体药物递送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子及纳米胶囊等)(参照Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition，OsloEd.(1980)等)。进一步地，将药剂作为缓释型药剂的方法也是公知的，该方法可适用于本发明的双特异性抗原结合分子(J.Biomed.Mater.Res.(1981)15，267-277；Chemtech.(1982)12，98-105；美国专利第3773719号；欧洲专利公开公报EP58481号·EP133988号；Biopolymers(1983)22，547-556)。

本发明的药物组合物或细胞毒性诱导剂和细胞增殖抑制剂，可经口、非经口施用任一种而施与患者。优选地为非经口施用。作为该施用方法，具体地可以例举注射施用、经鼻施用、经肺施用、经皮施用等。作为注射施用，可以例举例如静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等。例如经注射施用本发明的药物组合物或细胞毒性诱导剂和细胞增殖抑制剂可全身性或局部性施用。另外，根据患者的年龄、症状可选择合适的施用方法。施用量可选择例如每一次施用每1kg体重0.0001mg至1000mg的范围的施用量。或者，例如可以每一患者0.001mg/人至100000mg/人的范围的施用量。但是，本发明的药物组合物或细胞毒性诱导剂和细胞增殖抑制剂不限于这样的施用量。

本发明的药物组合物或细胞毒性诱导剂和细胞增殖抑制剂可根据常规方法制剂化(例如Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)，也可共同含有药学上容许的载剂或添加物。可以例举例如表面活性剂、赋形剂、着色料、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、等张剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动促进剂、矫味剂等。进一步地，不限于这些，可合适地使用其他常用的载剂。具体地，可以例示轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯缩醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、明胶、中链脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、白砂糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等作为载剂。

嵌合受体

也可使用具有与接头切割后的抗原结合分子结合的细胞外结构域的嵌合受体作为二级分子。作为一个例子，使用经上述操作获得的与接头切割后的抗原结合分子结合的抗体来制备嵌合受体。

术语“嵌合受体”是指至少包含细胞外结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的、当在免疫效应细胞表达时对靶标细胞例如癌细胞具有特异性及细胞内信号产生的重组多肽。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”表示细胞外结合结构域与抗原结合的嵌合受体。

术语“细胞外结合结构域”表示可以与指定的抗原等分子特异性结合的任意蛋白质性分子或其一部分，例如包含肿瘤抗原等特异的单克隆抗体可变区的轻链(VL)和重链(VH)串联连接的单链抗体(scFv)。细胞外结合结构域可换言为细胞外识别结构域。

术语“跨膜结构域”包含位于该细胞外结合结构域和该细胞内信号传导结构域之间、具有跨细胞膜的功能的多肽。

术语“细胞内信号传导结构域”表示已知传导在细胞内引起生物学过程的活化或抑制，例如T细胞或NK细胞等免疫细胞的活化的信号的作用的任意寡肽结构域或多肽结构域，也可以包含如后述的来自T细胞刺激分子的至少一个“刺激分子信号传导结构域”，也可以还包含如后述的来自T细胞共刺激分子的至少一个”共刺激分子信号传导结构域”。

在本公开中使用时，“结构域”表示与其他区域独立地、折叠成特定结构和/或具有特定功能的多肽的一个区域。结构域可为例如分子的细胞质部分或其一部分。在本公开使用时，分子的“细胞质结构域”表示全长的细胞质结构域、或在活化时传递细胞内信号的其部分。

在一个实施方案中，嵌合受体为包含以下定义的结构域的分子。

在一个实施方案中，嵌合受体包含细胞外结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域、和含有来自刺激分子的刺激分子信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白。

在一个实施方案中，嵌合受体包含细胞外结合结构域、细胞外铰链结构域、跨膜结构域、和含有来自共刺激分子的共刺激分子信号传导结构域及来自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白。

在一个实施方案中，嵌合受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域、和含有1个或多个来自共刺激分子的2个功能性信号传导结构域及来自刺激分子的功能性信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白。

在一个实施方案中，嵌合受体包含细胞外结合结构域、跨膜结构域、和含有1个或多个来自共刺激分子的至少2个共刺激分子信号传导结构域、来自刺激分子的刺激分子信号传导结构域、及其他功能性结构域和/或基序的细胞内信号传导结构域的嵌合融合蛋白。

在一个实施方案中，本说明书记载的嵌合受体可作为嵌合抗原受体(CAR)使用。

在一个实施方案中，公开了嵌合受体，其包含i)可以与指定的抗原结合的细胞外结构域、ii)跨膜结构域、及iii)细胞内区段，其包含选自细胞质共刺激域和/或白介素受体链的细胞质结构域的1个以上的细胞内信号传导结构域和含有外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域(其中，上述细胞内区段包含内源性或外源性JAK结合基序及STAT5相关基序)。在某实施方案中，这些结构域视情况从N端开始以上述顺序直接或间接融合。在某实施方案中，细胞内区段内的这些结构域以相反顺序融合。

在一个实施方案中，在该细胞外结合结构域和该细胞内信号传导结构域之间也可包含细胞外铰链结构域及跨膜结构域。术语“细胞外铰链结构域”表示连接细胞外结合结构域及跨膜结构域的结构域。细胞外铰链结构域只要是可连接细胞外结合结构域及跨膜结构域的结构域即可，没有特别限制。也可以是来自天然蛋白质的结构域，也可以是人为设计的结构域。细胞外铰链结构域可以例如约10～300个氨基酸、优选约20～100个氨基酸构成。细胞外铰链结构域优选地不妨碍细胞外结合结构域和本公开的Fc区变异抗体的Fc区的结合能力，且不妨碍通过细胞内信号传导结构域的信号传导。术语”跨膜结构域”位于该细胞外结合结构域和该细胞内信号传导结构域之间，只要是具有跨细胞膜的功能的多肽即可，没有特别限定。跨膜结构域可以是来自天然蛋白质的，也可以是人为设计的。来自天然蛋白质的跨膜结构域可从任意的膜结合蛋白或跨膜蛋白来获得。

在一个实施方案中，嵌合受体包含添加在嵌合受体融合蛋白的氨基末端(N端)的前导序列。

在一个实施方案中，嵌合受体还包含在细胞外结合结构域的N端的前导序列，此处，该前导序列也可以在细胞加工和嵌合受体对细胞膜的定位之间，自该抗原识别结构域(例如scFv)被切割。

术语“scFv”表示包含含有轻链可变区的至少一个抗体片段和含有重链可变区的至少一个抗体片段的融合蛋白。在一个实施方案中，scFv可通过例如合成接头如短的柔性多肽接头连续性连接轻链可变区及重链可变区，作为单链的多肽表达，进一步地，scFv表示维持其原有的抗体特异性的融合蛋白。如果没有特别规定，在本公开中，scFv也可以以任何顺序具有轻链可变区(VL)及重链可变区(VH)，例如关于多肽的N末端和C末端的终端，scFv可含有VL-接头-VH，或者也可含有VH-接头-VL。用于制备scFv的各种方法是已知的，包括美国专利第4694778号；Science，vol.242，pp.423-442(1988)；Nature，vol.334，p.54454(1989)；及Science，vol.242，pp.1038-1041(1988)所记载的方法。

术语“柔性多肽接头”或“接头”，在关于scFv使用的情形，是指为了一起连接可变重链区及可变轻链区，由单独或组合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基等的氨基酸组成的肽接头。在一个实施方案中，柔性多肽接头为Gly/Ser接头，包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)_n，式中n为1以上的整数。例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5、n＝6、n＝7、n＝8、n＝9及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头例如(Gly₄Ser)₅、(Gly₄Ser)₄或(Gly₄Ser)₃，但不限于这些。在其他实施方案中，接头包含(Gly₂Ser)、(GlySer)或(Gly₃Ser)的多个重复。因参照而并入本说明书的WO2012/138475中所说明的接头也包含于本公开的范围内。

在一个实施方案中，作为细胞外铰链结构域，可以例举例如CD8α、CD8β、CD28、CD4、NKp30、NKp44、NKp46的细胞外铰链结构域等。另外，也可使用免疫球蛋白(例如IgG4等)的铰链区。

在一个实施方案中，作为跨膜结构域的来源蛋白，可以例示例如T细胞受体的α链和β链、CD3ζ、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、GITR、NKp30、NKp44、NKp46等。在一个实施方案中，跨膜结构域的来源蛋白是CD28或CD3ε。

术语“信号传导结构域”是指通过传递细胞内信息而起作用的蛋白质功能部分，旨在通过生成第二信使或应答这样的信使来作为效应物而功能化，经由规定的信号传导途径调节细胞活性。

“细胞内信号传导结构域”在本公开中使用的情形，是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域可以生成促进含有CAR等嵌合受体的细胞例如CART细胞的免疫效应功能的信号。例如，作为CART细胞中免疫效应功能的例子，可以例举细胞溶解活性和辅助活性，例如细胞因子分泌等。在实施方案中，细胞内信号传导结构域是传导效应功能信号并使细胞实施特定功能的蛋白质的部分。虽然存在采用全部细胞内信号传导结构域的情形，但在多数情形，不一定要使用全部链。只要是使用细胞内信号传导结构域的被截短部分，且这样的被截短部分如果传导效应功能信号，则可代替无损的链来使用。因此，所谓的细胞内信号传导结构域这一术语表示包含对传递效应功能信号充分的细胞内信号传导结构域的所有被截短部分。

在某个实施方案中，细胞内信号传导结构域也包含初级细胞内信号传导结构域。作为典型的初级细胞内信号传导结构域，可以例举来自初级刺激或抗原依赖性刺激(antigen dependent simulation)相关的分子。在某个实施方案中，细胞内信号传导结构域也可包含共刺激细胞内结构域。作为典型的共刺激细胞内信号传导结构域，可以例举来自共刺激信号或抗原非依赖性刺激相关的分子。例如在CART的情形，初级细胞内信号传导结构域也可包含T细胞受体的细胞质内序列，共刺激细胞内信号传导结构域也可包含来自辅助受体或共刺激分子的细胞质内序列。

术语“CD3ζ”，在本公开中使用的情形，意指所有的哺乳动物种类、优选地指人的分化抗原簇3(CD3)T细胞共受体。在哺乳动物，CD3包含CD3ζ链、CD3δ链和2个CD3ε链。CD3ζ链(例如NCBI RefSeq：NP_932170.1)包含用于操作嵌合受体可使用的细胞内信号传导结构域。在本公开的特定的嵌合受体中，CD3ζ的初级信号传导序列为Genbank NM000734.3的胞质区序列(核苷酸序列299～634)全长或一部分，或来自非人的，例如小鼠、啮齿类、猴、类人猿和同种动物的等价残基。

在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域也可包含白介素受体链的细胞质结构域。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域也可使用CD28、4-1BB、ICOS、或连接了多个信号传导结构域的CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28-OX40。在一个实施方案中，跨膜结构域来源的蛋白质为CD28或CD3ε，且细胞内信号传导结构域也可为CD28、4-1BB、ICOS、或连接了多个信号传导结构域的CD3ζ-CD28-4-1BB或CD3ζ-CD28-OX40。

在一个实施方案中，公开了这样的嵌合受体，其包含i)可以与特定抗原结合的细胞外结构域、ii)跨膜结构域、及iii)细胞内区段，其包含选自细胞质共刺激结构域和/或白介素受体链的细胞质结构域的1个以上的细胞内信号传导结构域和含有外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域(其中，上述细胞内区段包含内源性或外源性JAK结合基序和STAT5相关基序)。在某实施方案中，这些结构域视情况从N末端开始，以上述顺序直接或间接融合。在某实施方案中，细胞内区段中的这些结构域以相反顺序融合。

术语“CD3ζ”在本公开中使用的情形，表示所有的哺乳动物种类、优选地人的分化抗原簇3(CD3)T细胞共受体。在哺乳动物中，CD3包含CD3ζ链、CD3δ链和2个CD3ε链。CD3ζ链(例如NCBI RefSeq：NP_932170.1)包含用于操作本公开的嵌合受体可使用的细胞内信号传导结构域。

术语“刺激”是指经由刺激分子(例如TCR/CD3复合体或CAR)与其相同起源的配体(或在CAR的情形为肿瘤抗原)的结合而诱导的初级应答，由此，经TCR/CD3复合体介导的信号传导、或经CAR的合适NK受体或信号传导结构域介导的信号传导等介导了信号传导事项，但不限于此。刺激也介导特定分子的表达改变。

术语“刺激分子”在关于免疫细胞信号传导途径的至少一部分方面中，是指具有以刺激的方式调节免疫细胞活化的细胞质内信号传导序列的、由免疫细胞例如T细胞、NK细胞或B细胞表达的分子。在一个实施方案中，信号为例如通过TCR/CD3复合体与呈递有肽的MHC分子的结合而启动的初级信号，由此，引起包括但不限于增殖、活化、分化和类似等的T细胞应答的媒介。以刺激的方式发挥作用的初级细胞质内信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)也可含有信号传导基序，所述信号传导基序已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。在本公开中，作为具有特定用途的含有细胞质内信号传导序列的ITAM的例子，可以例举来自CD3ζ、共有的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12、CLEC2、CLEC7A(Dectinl)、CLEC9A、EZRIN、RADIXIN和MOESIN的那些，但不限于此。在本公开的特定嵌合受体中，本公开的任一个或多个嵌合受体中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如CD3ζ的初级信号传导序列。

术语“共刺激分子”是指通过与共刺激配体特异性结合，虽不限于此但介导增殖等由T细胞引起的共刺激应答(次级信号)的、在T细胞上的相同起源的结合配偶体。共刺激分子是成为有效免疫反应的原因之一的、抗原受体以外的细胞表面分子或这些的配体。术语“共刺激细胞内信号传导结构域”是指共刺激分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域也可包含细胞内部分的全体、或其所获得的分子的天然型细胞内信号传导结构域的全体、或它们的功能性片段或衍生物。作为共刺激分子，可以例举与MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40(CD134)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD5、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD154及CD83特异性结合的配体，但不限于此。

在一个实施方案中，共刺激分子例如选自4-1BB(即CD137)、CD27、CD28和/或OX40，增强T细胞受体的刺激。

术语“4-1BB”是指具有GenBank登录号AAA62478.2所提供的序列氨基酸序列的TNFR超家族的一员，或来自非人种例如小鼠、啮齿类、猴、类人猿及同种的等价残基，“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214～255，或来自非人种例如小鼠、啮齿类、猴、类人猿及同种的等价残基。在一个实施方案中，“4-1BB共刺激结构域”为GenBank登录号NM001561.5的核苷酸序列886～1026序列的全长或一部分，或来自非人种例如小鼠、啮齿类、猴、类人猿及同种的等价残基。

术语“抗原”或“Ag”是指引发免疫反应的分子。该免疫反应可包含抗体的产生或特异性免疫活性细胞的活化的任一者或其两者。实质上，存在所有的包含蛋白质或肽的高分子作为抗原发挥作用的可能性。进一步地，抗原也可来自重组的或基因组DNA。包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分的核苷酸序列的所有DNA，结果在本公开中称为抗原这一术语使用的情形时，编码相同的“抗原”。进一步地，抗原不一定只由基因的全长核苷酸序列编码。在本公开中，不限于但可容易理解为包含多于一个的基因部分核苷酸序列的使用，进而以编码引发所希望的免疫反应的多肽的方式，使这些核苷酸序列以各种组合配置。进一步地，抗原也可以不一定由“基因”编码。抗原可为生成的或可为合成的，或来自生物体样本，或为多肽以外的高分子。作为这样的生物体样本，可以例示组织样本、肿瘤样本、细胞或包含其他生物学成分的流体，但不限于此。本公开的嵌合受体在具有将来自抗体的氨基酸序列作为细胞外结合结构域的一部分的情形时，细胞外结合结构域所结合的分子也可称为抗原。

本发明中使用的以增强抗体依赖性细胞毒性作用(Antibody-DependentCellular Cytotoxicity；ADCC)为特征的IgG抗体可参照例如WO 2013/002362 A1、WO2014/104165 A1、WO 2005/014651 A1、WO 2006/046751 A1等制备。

在一个实施方案中，上述IgG抗体为包含Fc区，该Fc区由含有第一多肽和第二多肽的异二聚体所构成为特征的抗体，相较于该Fc区只由含有第一多肽的同二聚体所构成为特征的抗体和该Fc区只由含有第二多肽的同二聚体所构成为特征的抗体，其为对Fcγ受体的结合活性增强为特征的抗体。上述IgG抗体也可在上述Fc区中导入至少一个以上的氨基酸改变。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在上述Fc区的CH2区中，在选自EU编号第231位的Ala、EU编号第232位的Pro、EU编号第233位的Glu、EU编号第234位的Leu、EU编号第235位的Leu、EU编号第236位的Gly、EU编号第237位的Gly、EU编号第238位的Pro、EU编号第239位的Ser、EU编号第240位的Val、EU编号第265位的Asp、EU编号第266位的Val、EU编号第267位的Ser、EU编号第268位的His、EU编号第269位的Glu、EU编号第270位的Asp、EU编号第271位的Pro、EU编号第295位的Gln、EU编号第296位的Tyr、EU编号第298位的Ser、EU编号第300位的Tyr、EU编号第324位的Ser、EU编号第325位的Asn、EU编号第326位的Lys、EU编号第327位的Ala、EU编号第328位的Leu、EU编号第329位的Pro、EU编号第330位的Ala、EU编号第331位的Pro、EU编号第332位的Ile、EU编号第333位的Glu、EU编号第334位的Lys、EU编号第335位的Thr、EU编号第336位的Ile、及EU编号第337位的Ser的氨基酸位点处导入至少一个以上的氨基酸改变为特征。

此处，对上述Fcγ受体没有特别限定，为例如选自FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIaH、FcγRIIb、及FcγRIIIa的受体。优选地，上述Fcγ受体为FcγRIIIa。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第234位的氨基酸L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸L置换为Y或Q、EU编号第236位的氨基酸G置换为W、EU编号第239位的氨基酸由S置换为M、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第270位的氨基酸由D置换为E、EU编号第298位的氨基酸S置换为A、EU编号第326位的氨基酸由K置换为D、EU编号第327位的氨基酸由A置换为D、EU编号第328位的氨基酸由L置换为W、EU编号第330位的氨基酸由A置换为M或K及EU编号第334位的氨基酸由K置换为E或L的至少一个以上的氨基酸改变为特征。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在构成上述Fc区的第一多肽和/或第二多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第234位的Leu、第235位的Leu、第236位的Gly、第239位的Ser、第268位的His、第270位的Asp、第298位的Ser、EU编号第326位的Lys、第327位的Ala、第328位的Leu、第330位的Ala及第334位的Lys的至少一个氨基酸导入变异为特征。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方的多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第234位的Leu、第235位的Leu、第236位的Gly、第239位的Ser、第268位的His、第270位的Asp、第298位的Ser、第327位的Ala、第328位的Leu及第334位的Lys的至少一个氨基酸导入变异，在另一方的多肽的氨基酸序列中，在选自EU编号第270位的Asp、EU编号第326位的Lys、第330位的Ala及第334位的Lys的至少一个氨基酸导入变异为特征。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方的多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y或Q、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第239位的氨基酸由S置换为M、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第270位的氨基酸由D置换为E、EU编号第298位的氨基酸由S置换为A及EU编号第327位的氨基酸由A置换为D、EU编号第328位的氨基酸由L置换为W及EU编号第334位的氨基酸由K置换为L的至少一个氨基酸改变，在另一方的多肽的氨基酸序列中，导入选自EU编号第270位的氨基酸由D置换为E、EU编号第326位的氨基酸由K置换为D、EU编号第330位的氨基酸由A置换为M或K、EU编号第334位的氨基酸由K置换为E的至少一个氨基酸改变为特征。

在其他实施方案中，上述IgG抗体在构成上述Fc区的第一多肽或第二多肽的任一方的多肽的氨基酸序列中，导入(i)至(vi)的任一个变异，在另一方的多肽的氨基酸序列中，导入(vii)至(ix)的任一个变异：

(i)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D及EU编号第298位的氨基酸由S置换为A；

(ii)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第270位的氨基酸由D置换为E及EU编号第298位的氨基酸由S置换为A；

(iii)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Q、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第239位的氨基酸由S置换为M、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第270位的氨基酸由D置换为E及EU编号第298位的氨基酸由S置换为A；

(iv)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第298位的氨基酸由S置换为A及EU编号第327位的氨基酸由A置换为D；

(v)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第239位的氨基酸由S置换为M、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第298位的氨基酸由S置换为A及EU编号第327位的氨基酸由A置换为D；

(vi)EU编号第234位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第235位的氨基酸由L置换为Y、EU编号第236位的氨基酸由G置换为W、EU编号第239位的氨基酸由S置换为M、EU编号第268位的氨基酸由H置换为D、EU编号第298位的氨基酸由S置换为A、EU编号第327位的氨基酸由A置换为D、EU编号328位的氨基酸由L置换为W及EU编号第334位的氨基酸由K置换为L；

(vii)EU编号第326位的氨基酸由K置换为D、EU编号第330位的氨基酸由A置换为M及EU编号第334位的氨基酸由K置换为E；

(viii)EU编号第270位的氨基酸由D置换为E、EU编号第326位的氨基酸由K置换为D、EU编号第330位的氨基酸由A置换为M及EU编号第334位的氨基酸由K置换为E；

(ix)EU编号第270位的氨基酸由D置换为E、EU编号第326位的氨基酸由K置换为D、EU编号第330位的氨基酸由A置换为K及EU编号第334位的氨基酸由K置换为E。

在本发明的一个实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是以由包含第一多肽和第二多肽的异二聚体构成为特征的多肽，该第一多肽和第二多肽的任一方含有导入(i)或(ii)记载的变异的Fc区，与含有没有导入变异的Fc区的多肽相比较，所述以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是以Fc区的功能改变为特征的多肽：

(i)EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的氨基酸为Y或Q，第236位的氨基酸为W，第239位的氨基酸为M或I，第268位的氨基酸为D，及第298位的氨基酸为A；

(ii)EU编号第270位的氨基酸为E，第326位的氨基酸为D，第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，及第334位的氨基酸为E。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是含有上述第一多肽和第二多肽任一方导入(i)或(ii)记载的变异的Fc区，另一方为以导入(iii)记载的变异为特征的多肽：

(i)EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的氨基酸为Y或Q，第236位的氨基酸为W，第239位的氨基酸为M或I，第268位的氨基酸为D，第298位的氨基酸为A，及第327位为D；

(ii)EU编号第234位的氨基酸为L、S、F、E、V、D、Q、I、M、T、A、G或H，第235位的氨基酸为Y或Q，第236位的氨基酸为W，第239位的氨基酸为M或I，第268位的氨基酸为D，第270位的氨基酸为E，及第298位的氨基酸为A；

(iii)EU编号第270位的氨基酸为E，第326位的氨基酸为D，第330位的氨基酸为A、K、M、F、I、Y或H，及第334位的氨基酸为E。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是(i)的EU编号第234位的氨基酸为E、D、T或L的多肽。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是[2]记载的多肽，其中[4]上述[2](ii)的EU编号第234位的氨基酸为L、F、E或D。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是[2]记载的多肽，其中[5]上述[2](i)的EU编号第234位的氨基酸为V、I、T、M或L。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是[2]记载的多肽，其中[6]上述[2](i)的EU编号第234位的氨基酸为V、E、D、T、I、L或F，及第239位的氨基酸为M或I，(iii)的EU编号第330位的氨基酸为A或K。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是[2]记载的多肽，其中[7]上述[2](ii)的EU编号第234位的氨基酸为F、E、D、S或L，及第239位的氨基酸为M或I，(iii)的EU编号第330位的氨基酸为A、F或K。

在本发明的其他实施方案中，以增强ADCC活性为特征的IgG抗体是通过上述Fc区功能的改变而具有多肽对Fcγ受体的结合活性增强的多肽。此处，上述Fcγ受体选自由FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb、FcγRIIIaF和FcγRIIIaV组成的组。

在一个实施方案中，本发明的靶标抗原可以合适地例举例如受体、肿瘤抗原、MHC抗原、分化抗原等。

作为受体的例子，可以例示例如属于造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联型受体家族、GPI锚型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘附因子家族、激素受体家族等受体家族的受体等。关于属于这些受体家族的受体及其特征已记载于多篇文献，例如Cooke BA.，KingRJB.，van der Molen HJ.编著，New Comprehesive Biochemistry Vol.18B Hormones andtheir Actions Part IIpp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV.；或，宫坂昌之监修，细胞工学别册HANDBOOK SERIES“粘附因子HANDBOOK”(1994)(秀润社，东京，日本)等的综述之外；还有Patthy(Cell(1990)61(1)，13-14)；Ullrich等人(Cell(1990)61(2)，203-212)；Massague(e带有重音标记)(Cell(1992)69(6)，1067-1070)；Miyajima等人(Annu.Rev.Immunol.(1992)10，295-331)；Taga等人(FASEB J.(1992)6，3387-3396)；Fantl等人(Annu.Rev.Biochem.(1993)，62，453-481)；Smith等人(Cell(1994)76(6)959-962)；Flower DR.Biochim.Biophys.Acta，Flower(Biochim.Biophys.Acta(1999)1422(3)207-234等。

作为属于上述受体家族的具体受体，合适地例示例如，人或小鼠促红细胞生成素(EPO)受体(Blood(1990)76(1)，31-35、Cell(1989)57(2)，277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1990)87(22)，8702-8706、mG-CSFR(Cell(1990)61(2)，341-350)、人或小鼠促血小板生成素(TPO)受体(Proc Natl Acad SciU S A.(1992)89(12)，5640-5644、EMBO J.(1993)12(7)，2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature(1985)313(6005)，756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)91(2)，459-463)、人或小鼠血小板衍生生长因子(PDGF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1988)85(10)3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell(1990)60(2)，225-234；和Cell(1994)77(3)，391-400)、人或小鼠瘦素受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。

术语“肿瘤抗原”是指在癌细胞表达的抗原，其表达和细胞的恶性变化相关而被识别的具有抗原性的生物体分子。本公开的一个方案中，靶标抗原为肿瘤抗原。肿瘤抗原包含肿瘤特异性抗原(只存在于肿瘤细胞，在其他正常细胞未发现的抗原)、及肿瘤相关抗原(在其他器官及组织或异种及同种异体的正常细胞也存在的抗原，或在发生和/或分化时表达的抗原)。另外，细胞癌变时在细胞表面或蛋白质分子上出现的异常糖链也是肿瘤抗原，也称为癌糖链抗原。

作为肿瘤抗原的例子，可以合适地例举例如作为上述受体，属于GPI锚型受体家族但在以肝癌为首的几种癌中表达的GPC3(Int J Cancer.(2003)103(4)，455-65)、在以肺癌为首的多个癌表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A.(1989)86(1)，27-31)(分别地，其多核苷酸序列记载为RefSeq登录号NM_002354.2、多肽序列记载为RefSeq登录号NP_002345.2)、EGFR、CA19-9、CA15-3、唾液酸(sialyl)SSEA-1(SLX)、Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、肿瘤抗原-125(CA-125)、钙网蛋白(calreticulin)、MUC-1、MUC-16、上皮性膜蛋白(EMA)、上皮性肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑素瘤相关抗原(MAGE)、嗜铬粒蛋白(chromogranin)、细胞角蛋白(cytokeratin)、肌间线蛋白(desmin)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、肉眼囊胞性疾病液体蛋白质(巨囊性病的液状蛋白(gross cystic disease fluid protein))(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白Melan-A(被T淋巴细胞识别的黑素瘤抗原；MART-1)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经纤维丝(neurofilament)、神经特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触素(synaptophysin)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶M2型的二聚体形(肿瘤M2-PK)、GD2(神经节苷脂G2)、EGFRvIII(表皮生长因子受体变体III)、精子蛋白质17(Sp17)、间皮素(mesothelin)、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、prostein、TARP(T细胞受体γ可变阅读框蛋白)、Trp-p8、STEAP1(前列腺1的6次跨膜型上皮抗原)、TROP-2、Claudin6、RNF43a、异常ras蛋白、或异常p53蛋白、整合素αvβ3(CD61)、半乳糖凝集素(galectin)、K-Ras(V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)或Ral-B等。

进一步地，也可以例举促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1(CD2亚组1、CRACC、SLAMF7、CD319及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；Tn抗原(Tn Ag)；T抗原(T Ag)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2)；白介素11受体α(IL-11Ra)；白介素2受体α(IL-2Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚性抗原-4(SSEA-4)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基β型9(LMP2)；蝶素A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1(fucosylGM1)；唾液酸化Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；密连蛋白(Claudin)6(CLDN6)；G蛋白偶联受体C5家族亚型D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；未分化淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的六碳糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；Uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白(Pannexin)3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体、基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ选择性阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤(Wilms’stumor)蛋白质(WT1)；位于染色体12p的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白质17(SPA17)；X抗原家族、成员1A(XAGE1)；结合血管生成素的细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位切割位点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜型蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰基葡萄糖胺转移酶V(NA17)；Paired Box蛋白质Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；T细胞3识别的扁平上皮细胞肿瘤抗原(SART3)；Paired Box蛋白质Pax-5(PAX5)；前顶体素(proacrosin)结合蛋白p32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤、X切割位点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白受体样亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓间质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模式的黏液素样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂肌醇聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)等。

“分化抗原”是巨噬细胞、T细胞、B细胞等伴随从骨髓干细胞的分化而消长的细胞表面分子的总称。分化抗原可包含CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD70、CD71、CD73、CD95、CD99、CD102、CD106、CD117、CD122、CD126、CDw130。

识别接头切割后的抗原结合分子的结构域

本公开的双特异性抗体及嵌合受体具有识别接头切割后的抗原结合分子的结构域。在一个实施方案中，与接头切割前的抗原结合分子相比较，双特异性抗体和嵌合受体与接头切割后的抗原结合分子具有高的结合活性。含有抗体可变区的结构域由一个或多个抗体的可变结构域提供，优选地，含有抗体可变区的结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。包含这样的抗体可变区的结构域的例子，可以合适地例示“scFv(单链Fv)”、“单链抗体(single chain antibody)”、“Fv”、“scFv₂(single chain Fv₂)”、“Fab”或“F(ab’)₂”等。

术语“特异性”是指特异性结合的分子对其一个或多个结合的对象方的分子以外的分子不显示相同的结合活性或结合活性显著降低的状态。另外，包含抗体可变区的结构域也可用于对某抗原所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，在包含抗体可变区的结构域结合的表位被包含于多个不同抗原的情形，具有包含该抗体可变区的结构域的抗原结合分子可以与包含该表位的多种抗原结合。

术语“竞争”或“交叉竞争”在用于指抗体分子的能力时，在本公开中同意义地使用。对结合的干涉可以是直接的或间接的(例如，通过抗体分子或靶标的别构(allosteric)改变)。抗体分子可干涉其他抗体分子对靶标的结合的程度及是否因此可以说是竞争，可例如本公开所说明的那样，使用竞争结合测定法来判定。在一部分实施方案中，竞争结合测定法为定量的竞争测定法。在一部分实施方案中，竞争结合测定法(例如本公开中说明的竞争测定法)中，第一抗体分子的对靶标的结合减少10％以上，例如20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上的情形，可谓第一抗体分子与第二抗体分子竞争对靶标的结合。

在本公开使用时，术语“表位”是指与抗体分子特异性相互作用的抗原的成分。这样的成分典型地包含氨基酸侧链或糖侧链等要件，或为这样的要件的一部分。表位可根据例如本领域技术人员公知的或本公开所公开的方法，例如通过结晶学或氢-氘交换来定义。与表位特异性相互作用的抗体分子上的成分的至少一个或几个典型地位于CDR内。典型地，表位具有特异的三维结构的特征。典型地，表位具有特异的电荷的特征。也有是线性表位的表位，另一方面也有是立体结构表位的表位。

另外，也可通过识别该表位的抗体分子对抗原的结合活性来定义该表位。当抗原为肽或多肽的情形，也可通过构成表位的氨基酸残基来确定表位。另外，当表位为糖链的情形，也可通过特定的糖链结构来确定表位。

在本公开的嵌合受体具有来自抗体的氨基酸序列作为细胞外结合结构域的一部分的情形，细胞外结合结构域所结合的分子的结合部位也可称为表位。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、及它们单链或双链任一形式的聚合物。术语“核酸”包含基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子为合成的(例如化学合成的)核酸分子或重组的核酸分子。不特别地限定，此术语包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，所述核酸具有与参照核酸类似的结合特性并且以与天然存在核苷酸类似的方式代谢。只要没有其他特别地指出，特定的核酸序列事实上也包含它们经保守性改变的突变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直系同源基因、SNP、及互补序列、以及明确呈现的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换[Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994)]。

术语“核酸序列”，在本公开使用的情形，表示由天然的碱基、糖、糖间(主链)键接所形成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语也包含非天然的单体或含有其一部分的修饰或置换序列。本申请的核酸序列可为脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，包含含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、及尿嘧啶的天然碱基。这些序列也可含有修饰碱基。这样的修饰碱基的例子包含氮杂和去氮杂腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

术语“分离的核酸”，在本公开使用的情形，是指在经重组DNA技术生产的情形下实质上不包含细胞材料或培养基，或在化学合成的情形下实质上不包含化学前体或其他化学物质的核酸。分离的核酸也实质上不包含来自其核酸的、与核酸天然邻接的序列(即，位于该核酸的5’末端和3’末端的序列)。术语“核酸”包含DNA及RNA，也可以为双链或单链的任一种，相当于有义链或反义链。术语“核酸”还包含互补的核酸序列，例如cDNA。

术语“编码”是指具有核苷酸(例如rRNA、tRNA及mRNA)的特定序列或氨基酸的特定序列任一者在生物学过程中作为其他聚合物和高分子的合成用模板发挥作用的、在基因、cDNA或mRNA等的多核苷酸中的核苷酸特异性序列的固有特性和由此产生的生物学特性。因此，在细胞或其他生物系统中经对应基因的mRNA转录和翻译而产生蛋白质的情形，则该基因、cDNA、或RNA编码蛋白质。该核苷酸序列与mRNA序列是相同的，任一通常在序列表所示的编码链和作为基因或cDNA转录用的模板而使用的非编码链均可称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他生成物。

除非有其他特别规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包含互相为简并核苷酸序列或编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。另外，所称的编码蛋白质或RNA的核苷酸序列的句子，在一些情形下，编码该蛋白质的核苷酸序列以可含有内含子的程度也可包含内含子。另外，核酸分子可以与嵌合受体表达用的至少一个调节元件可操作地连接。

术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”以同义使用，表示经肽键以共价键合连接的氨基酸残基所构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少2个氨基酸，可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包含含有相互以肽键连接在一起的2个以上氨基酸的所有肽或蛋白质。该术语在本公开中使用的情形，是指本领域一般也称为例如肽、寡肽和寡聚物的短链，以及本领域一般称为多种类型存在的蛋白质的较长链两者。作为“多肽”，可以例举例如尤其是生物学活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的突变体、变异的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白。作为多肽，可以例举天然肽、重组肽或它们的组合。

本公开中的多肽通常是指具有约10个氨基酸以上长度的肽和蛋白质。在从N末端到C端以肽键连接的氨基酸的链为单肽链的情形时，本公开的多肽也可以是多个单肽链通过S-S键、疏水性相互作用、离子键等相互作用所形成的复合体蛋白质。

术语“分离的多肽”也称为“分离的蛋白质”，表示在经重组DNA技术生产的情形下实质上不包含细胞材料或培养基的多肽，或在化学合成的情形下实质上不包含化学前体或其他化学物质的多肽。

术语“氨基酸”包含天然氨基酸和修饰氨基酸的总合。

“保守性氨基酸改变”，在本公开使用的情形，是不损害该蛋白质所期望的特性、将某氨基酸残基用其他氨基酸残基置换。

术语“保守性序列改变”指对含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征不造成显著的影响或不改变该结合特征的氨基酸改变。作为这样的保守性改变，可以例举氨基酸的置换、添加及缺失。可通过定点诱变和PCR介导的突变等的本领域公知的标准技术，将改变导入本公开的抗体或抗体片段。保守性氨基酸置换是以具有类似侧链的氨基酸残基置换氨基酸残基的置换。具有类似的侧链的氨基酸残基家族如本领域所定义。这样家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、非带电性极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的嵌合受体内的1个或多个氨基酸残基也可以相同的侧链家族的其他氨基酸残基置换，经改变的嵌合受体可使用本公开说明的功能测定法进行测试。

术语“表达”指经启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

本公开中的“宿主细胞”、“宿主细胞株”和“宿主细胞培养物”彼此可交换使用，是指导入了外来核酸的细胞(包含这样的细胞的子代)。宿主细胞包含“转化体”和“转化细胞”，包含原代转化细胞和来自该细胞的不论传代数的子代。子代和亲代细胞在核酸的内容上也可不用完全相同，也可含有变异。本公开也包含这样的突变体子代，其具有与原始的转化细胞用于筛选或选择时相同的功能或生物学活性。

本公开中的“载体”指可使与其连接的另一个核酸增加的核酸分子。此术语包含自我复制核酸结构的载体和重组入导入了其的宿主细胞的基因组中的载体。某载体能够表达本身可操作地连接的核酸。这样的载体在本公开中也称为“表达载体”。

转染是指表达载体进入宿主细胞，实际上不知道该宿主细胞是否表达任意的编码序列。具有通常技能的技术人员知道转染的多个方法，存在例如CaPO₄沉淀法及电穿孔法。通常，在宿主细胞内该载体发挥的征兆显现时认为成功的转染。

术语“启动子”是指对起始多核苷酸序列的特异性转录为必要的、通过细胞的合成机制或被导入的合成机制所识别的DNA序列。

术语“慢病毒(Lentivirus)”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；慢病毒可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞的DNA，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的全部例子。

术语“慢病毒载体”指来自慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别是例如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)所示的自体失活的慢病毒载体。作为有可能在医疗设施使用的慢病毒载体的其他例子，可以例举例如Oxford BioMedica制的LENTIVECTOR(注册商标)基因传递技术、Lentigen制的LENTIMAX(商标)载体系统等，但不限于此。也可利用非临床型的慢病毒载体，可由本领域技术人员合适地进行载体的选择及制备。

术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)发生复合体化的外来抗原的辅助细胞(例如，B细胞、树状细胞等)等的免疫系统细胞。T细胞可以使用具T细胞受体(TCR)来识别这些复合体。APC加工抗原、使抗原呈递于T细胞。

“免疫效应细胞”，此术语在本说明书、本公开使用的情形，指与促进免疫反应例如免疫效应反应相关的细胞。作为免疫效应细胞的例子，可以例举T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NK-T)细胞、肥大细胞和来自骨髓的吞噬细胞。

作为T细胞，可以例示来自人的T细胞或来自狗、猫、猪、小鼠等的非人哺乳动物的T细胞。另外，T细胞可从血液、骨髓液等体液、或脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或浸润于原发性肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等的癌组织的免疫细胞分离、纯化。作为这样的T细胞，可以例示αβT细胞、γδT细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、NKT细胞。

“免疫效应功能或免疫效应应答”，此术语在本说明书、本公开使用的情形，指例如增强或促进免疫效应细胞对靶标细胞的免疫攻击的功能或应答。例如，免疫效应功能或应答指促进靶标细胞的生长或增殖的死亡或抑制的T或NK细胞的特性。在T细胞的情形，初次刺激和共刺激为免疫效应功能或应答的例子。

术语“效应功能”指细胞的特殊化的功能。T细胞的效应功能可以是例如细胞溶解活性或细胞因子分泌等的辅助活性。

术语“自体”指这样的任何材料，所述材料从稍后将向个体再次引入所述材料的相同个体衍生。

术语“同种异体”指来自与导入材料的个体同种但不同动物的所有材料。2个以上的个体在1个或多个基因座中的基因不相同的情形，彼此称为同种异体。在一些实施方案中，来自同种物种个体的同种异体材料也可以对于抗原性相互作用而言，具有充分程度的遗传学上的不同。

术语“异种”指来自不同种动物的移植片。

术语“对象”，在本公开使用的情形，表示包含人的动物界的所有成员。在优选的实施方案中，对象为人。

在本公开的状况中，只要是跟此处列记的任何疾病状态相关，术语“处置”、“进行处置”等表示，伴随如此状态的至少一个症状的缓和或减轻或如此状态进展的推迟或逆转。在本公开的此意思的范围内，术语“处置”也表示停止、发病(即，直至疾病的临床上显著化的期间)推迟和/或疾病发病或恶化的风险降低。例如，与癌相关的术语”处置”可表示患者的肿瘤负荷的排除或减轻或转移的预防、推迟或阻止等。

在本公开使用的情形，如本技术领域所充分了解的，“治疗”包含临床结果，为获得有利或所希望结果的手段。有利或所希望的临床结果，虽无限定但不管是否能检测，可包含1个以上的症状或病态的缓和或改善、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定化(即没有恶化)、疾病扩散的防止、疾病进展的延迟或徐缓化、疾病状态的改善或减轻、及缓解(部分或完全)。“治疗”也可表示，与未接受治疗的情形的预测存活时间相比较，存活时间延长。“减轻”疾病或障碍是指，与未治疗障碍的情形相比较，障碍或疾病状态的程度和/或不希望的临床表现变轻、和/或进展的过程徐缓化或延长。

术语“癌”指以异常细胞不能控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流及淋巴系统蔓延到身体的其他部分。在本公开说明了多种癌的例子，可以例举乳癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰脏癌、结肠直肠癌、肾脏癌、肝脏癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等，但不限于此。术语“肿瘤”及“癌”，在本说明书和本公开同义使用，例如任何术语包含实体及体液性，例如弥漫性或循环性的肿瘤。术语“癌”或“肿瘤”，在本公开使用的情形，包含癌前期的、同样地也包含恶性的癌及肿瘤。

作为本公开的抗癌剂或在后述的癌的治疗方法中的癌，可以例示腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈部癌、子宫癌、肝癌、肾脏癌、胰脏癌、脾脏癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌等的癌，或骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织及造血组织的癌以外，还有软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性许旺细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等的肉瘤，或肝胚细胞瘤、髓母细胞瘤、肾胚细胞瘤、神经母细胞瘤、胰胚细胞瘤、胸膜肺胚细胞瘤、视网膜胚细胞瘤等的母细胞瘤或胚细胞肿瘤、淋巴瘤、或白血病。

在一部分实施方案中，与癌种类相关的肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞两者表达的标记物，例如系统性标记物，如B细胞上的CD19。在某个特定实施方案中，本公开的肿瘤抗原来自癌，所述癌包含原发性或转移性黑色素肿瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、子宫颈癌、膀胱癌、肾脏癌、及腺癌，例如乳癌、前列腺癌、卵巢癌、胰脏癌及同种癌，但不限于它们。在一部分实施方案中，肿瘤抗原是特定的增生性疾病共有的抗原。在一部分实施方案中，癌相关抗原为，相较于正常细胞，在癌细胞中过度表达，例如，与正常细胞相比较，为1倍的表达、2倍的过度表达、3倍的过度表达或以上的细胞表面分子。在一部分实施方案中，癌相关抗原为在癌细胞不适当地合成的细胞表面分子，例如与在正常细胞表达的分子相比较，含有缺失、添加或突变的分子。在一部分实施方案中，癌相关抗原以全长或片段(如MHC/肽)排他性在癌细胞的细胞表面表达、但在正常细胞表面未合成也未表达。在一部分实施方案中，本公开的嵌合受体包含含有与经MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，来自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的凹槽中，经CD8⁺T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。经所有有核细胞组成型表达MHC I类复合体。在癌中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体为免疫疗法用的细胞表面靶标的特有型的代表。在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形，已描述了以来自病毒或肿瘤抗原的肽为靶标的TCR样抗体(例如Sastry等人，J Virol.2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Bood，2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer GeneTher 2012 19(2)：84-100)。例如，TCR样抗体可通过筛选人scFv噬菌体展示文库等的文库而鉴定。

在本公开使用的情形，所谓“治疗或预防癌”表示抑制癌细胞的复制、提供抗肿瘤免疫、抑制癌扩散(转移)、抑制肿瘤增殖、减少癌细胞数或肿瘤增殖、或改善癌相关症状。在本公开使用的情形，只要没有其他特别限定，术语“进行预防”、“预防着”及“预防”指对象在前述状态感到痛苦开始前或在上述状态再复发前所进行的行为。预防不一定带来上述状态的完全预防，上述状态或上述状态的症状的部分预防或减轻、或者上述状态发病的风险降低，均包含于该术语中。

术语“抗癌作用”是指指可通过例如肿瘤体积减小、癌细胞数减少、转移数减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活减少、或与癌性症状相关的各种生理学症状的改善等各种手段证明的生物学作用，但不限于此。“抗癌作用”也可以是经本公开说明的肽、多核苷酸、细胞及抗体的能力而证明对最初处所的癌发生的预防。术语“抗肿瘤效果”指可通过例如肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数的减少、肿瘤细胞增殖的减少或肿瘤细胞存活的减少等的各种手段证明的生物学作用，但不限于这些。

此处使用的用量或量上适用的“治疗上有效”的术语是指在施用于必须处理的对象时，产生所希望活性的充足的化合物或药物组合物的量，其中所述组合物是(例如，包含本公开的嵌合受体，根据需要还包含肿瘤特异性细胞毒性单克隆抗体或含有Fc部分的其他抗肿瘤分子(例如，免疫球蛋白的Fc部分或者与含有Fc的DNA或RNA组合的且结合肿瘤表面受体的配体(例如，细胞因子、免疫细胞受体)组成的杂合分子)的、包含T淋巴细胞(和/或NK细胞)的组合物、或包含本公开的一级抗体的组合物)。在本公开的状况内，术语“治疗上有效”是指对于经本公开的方法有效地使所处理的障碍的至少一个症状显著延迟、进展停止、缓和或减轻的化合物或药物组合物的量。在以活性成分的组合施用时，应注意该组合的有效量有包含也有不包含分别施用时为有效的各成分的量的情形。

在本公开中，术语“药学上容许”是指施用于哺乳动物(例如，人)时，生理学上的耐受性，典型地为不产生不希望的反应的这样的组合物的分子实体和其他成分。优选地，本公开中的“药学上容许”表示对于在哺乳动物、更具体地为人的使用，记载于联邦政府或州政府的主管机关所承认的、或美国药典或其他通常认可的药典。

本公开的嵌合受体

在一个实施方案中，本公开的嵌合受体包含此处记载的2个信号传导结构域，即，CD3ζ和4-1BB/CD137，或者包含CD3ζ和1个以上的信号传导结构域。在一个特定实施方案中，数个信号传导结构域互相融合，以发挥相加或协同的作用。添加的有用信号传导结构域的非限制性例子包含TCRζ链、CD27、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIy、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP-10和CD40中1个以上的部分或全部。

在本公开中，公开了一种嵌合受体，其包含i)可通过接头切割后的抗原结合分子与特定抗原结合的细胞外结构域；ii)跨膜结构域；及iii)细胞内区段，其包含选自细胞质共刺激结构域和/或白介素受体链的细胞质结构域的1个以上的细胞内信号传导结构域和含有外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域(其中，上述细胞内区段包含内源性或外源性JAK结合基序和STAT5相关基序)。在某个实施方案中，这些结构域视情况从N末端开始以上述顺序直接或间接融合。在某个实施方案中，细胞内区段内的这些结构域以相反顺序融合。

又在本公开中，也包含一种这样的嵌合受体，其包含i)可通过接头切割后的抗原结合分子来结合的细胞外结构域；ii)跨膜结构域；及iii)细胞内区段，其包含含有IL受体链的细胞质结构域和根据情况至少一个补充的细胞质结构域的1个以上细胞内信号传导结构域。在某个实施方案中，这些结构域视情况从N末端开始以上述顺序直接或间接融合。在一个实施方案中，细胞内区段内的这些结构域以相反顺序融合。

在一些实施方案中，IL受体链位于跨膜结构域的附近位置、和/或接近嵌合受体细胞内区段的NN端、或形成N末端。在其他实施方案中，IL受体链接近嵌合受体细胞内区段的C末端、或形成C末端。在一些实施方案中，IL受体链位于包含外源性STAT3相关基序YXXQ的CD3ζ细胞内信号传导结构域的上游或N末端侧。

在细胞内区段只包含IL受体链的信号传导结构域的实施方案，可经内源性TCR介导通过存在于MHC复合体内的指定抗原、和/或经内源性CD28介导通过CD80/86分子，例如通过B细胞，来活化嵌合受体表达细胞。

另外，本公开也提供了表达嵌合受体的细胞。这样的细胞，例如可具有高的增殖速度和/或高的存活率、产生大量的细胞因子、和/或与不表达嵌合受体的亲代细胞相比较，对在其表面具有嵌合受体结合的指定的/预选的抗原的细胞，可具有高的细胞毒性。例如，如实施例所示，本公开的嵌合受体转导T细胞具有一级抗体依赖性且癌抗原肿瘤抗原依赖性高的细胞分裂、增殖能力，在接受上述细胞的小鼠中，作为治疗提供抗肿瘤效果，且改善总存活率。因此，也期待对人的抗肿瘤效果。

细胞外结构域

关于本公开的嵌合受体所使用的细胞外结构域，其为包含可以与成为目标的接头切割后的抗原结合分子结合的蛋白质性分子或其一部分而形成的结构域，例如，包含抗体的抗原结合结构域和受体的配体结合结构域。该结构域与存在于细胞表面的抗原结合而相互作用，由此赋予表达嵌合受体的细胞特异性。例如，关于本公开的嵌合受体所使用的细胞外结构域，可使用包含抗体(例如H链和L链)的可变区、单链和其结合片段或TCR(TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ)，例如抗体Fab片段、抗体可变区[H链的V区(VH)和L链(VL)的V区]、或受体的细胞外配体结合结构域。特别地，在某个实施方案中，可使用举链可变片段(scFv)。

本公开的嵌合受体的细胞外结构域可只与1个成为目标的接头切割后的抗原结合分子结合，也可以与2个以上成为目标的接头切割后的抗原结合分子结合。此外，本公开包含以下两者：含有1个细胞外结构域而成的嵌合受体和含有2个以上细胞外结构域而成的嵌合受体。

作为本公开的嵌合受体的细胞外结构域结合的接头切割后的抗原结合分子结合的抗原的例子，包括病毒抗原、细菌(特别地，感染性细菌)抗原、寄生虫抗原、与特定疾病相关的靶标细胞上的细胞表面标记物(例如，肿瘤抗原)、和产生自身免疫的免疫细胞的表面分子。

本公开在一个方面提供了能够经由接头切割后的抗原结合分子来结合这样的抗原的嵌合受体，所述抗原来自逆转录病毒科(例如，人类免疫缺陷病毒，例如HIV-1及HIV-LP)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒和埃可病毒)、风疹病毒、冠状病毒、水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、细小病毒、腺病毒科、疱疹病毒科[例如，1型和2型单纯疱疹病毒(HSV))、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)和疱疹病毒]、痘病毒科(例如，天花病毒、痘苗病毒和痘病毒)或丙型肝炎病毒。

本公开在另一方面提供了能够经由接头切割后的抗原结合分子来结合这样的抗原的嵌合受体，所述抗原来自葡萄球菌属(Staphylococci)、链球菌属(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌属(Pseudomonas)、或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株。特别地，本公开提供了能够经由接头切割后的抗原结合分子来结合这样的抗原的嵌合受体，所述抗原来自感染性细菌，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌种的菌株(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)、或戈登分枝杆菌(M.gordonea)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌、B组链球菌(无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、或破伤风梭菌(Clostridium tetani)。

本公开在另一方面，与嵌合受体的细胞外结合结构域结合的抗体可以与5T4、α5β1-整合素、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-catenin/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/new、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUC-16、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190次要(minor)bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、存活蛋白(Survivin)、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、NY-Eso-1或NY-Eso-B等肿瘤抗原结合。本公开中的所述抗体还可以与细胞表面粘附分子、自身免疫疾病中发现的炎症性细胞的表面分子、或产生自身免疫的TCR结合。

细胞内区段

本公开的嵌合受体的细胞内区段可以包含1个以上的细胞内信号传导结构域，是存在于相同分子中的细胞外结构域在与其相应抗原(cognate antigen)/配体结合(相互作用)时可以对细胞传导信号的蛋白质性分子。

在某一方面，嵌合受体的细胞内区段包含含有外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域。此外，嵌合受体的细胞内区段包含选自IL受体链的细胞质结构域和/或细胞质共刺激结构域的1个以上的细胞内信号传导结构域，上述细胞内区段包含内源性或外源性JAK结合基序和STAT5相关基序而成。

初级细胞质信号传导序列调节TCR复合体的初级活性。例如，CD3ζ细胞内信号传导结构域提供初级细胞质信号。初级细胞质信号传导序列也可包含已知为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)[Nature，vol.338，pp.383-384(1989)]的信号传导基序。另一方面，以抑制性方式起作用的初级细胞质信号传导序列也可包含已知为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)[J Immunol.，vol.162，No.2，pp.897-902(1999)]的信号传导基序。在本公开中，可以使用具有ITAM和/或ITIM的细胞内信号传导结构域。

本公开中，CD3ζ的细胞内结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。具有可使用的ITAM的细胞内信号传导结构域的例子包括例如，取代CD3ζ或替换CD3ζ，具有来自FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的ITAM的细胞内信号传导结构域。具体地，包含1个以上ITAM的细胞内结构域的例子包括具有CD3ζ(NCBI RefSeq：NP_932170.1)的氨基酸编号52～164、FcεRIγ(NCBI RefSeq：NP_004097.1)的氨基酸编号45～86、FcεRIβ(NCBI RefSeq：NP_000130.1)的氨基酸编号201～244、CD3γ(NCBI RefSeq：NP_000064.1)的氨基酸编号139～182、CD3δ(NCBI RefSeq：NP_000723.1)的氨基酸编号128～171、CD3ε(NCBI RefSeq：NP_000724.1)的氨基酸编号153～207、CD5(NCBI RefSeq：NP_055022.2)的氨基酸编号402～495、CD22(NCBI RefSeq：NP_001762.2)的氨基酸编号707～847、CD79a(NCBI RefSeq：NP_001774.1)的氨基酸编号166～226、CD79b(NCBI RefSeq：NP_000617.1)的氨基酸编号182～229、及CD66d(NCBI RefSeq：NP_001806.2)的氨基酸编号177～252的序列的肽、以及与这些肽具有相同功能的它们的突变体。基于本说明书所记载的NCBI RefSeq ID或GenBank的氨基酸序列信息的氨基酸编号是基于各蛋白质前体(包含信号肽序列等)的全长进行编号。

在某个实施方案中，STAT3相关基序YXXQ中的“X”表示的氨基酸残基可以是任何天然氨基酸，也包含维持STAT3结合的任何修饰的天然氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸X独立地选自亮氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸。例如，氨基酸X为精氨酸。例如，氨基酸X为组氨酸。

在某个实施方案中，STAT3相关基序YXXQ的酪氨酸残基相邻的2个氨基酸残基为精氨酸-组氨酸。在其他实施方案中，外源性STAT3相关基序为YRHQ。

外源性STAT3相关基序YXXQ也可导入CD3ζ的细胞内结构域的任何部分，在某个实施方案中，YXXQ相关基序插入C末端区附近。虽然不希望被特定理论束缚，但认为多数的内源性YXXQ基序配置在距离C末端100aa附近或以内。另外，经GP130及LIFR研究，位于C末端区附近的YXXQ基序显示越位于近位则功能性高(Schmitz J等人，J Immunol.2000；164：848-54；Tomida M等人，Blood.1999；93：1934-41)。

在某个实施方案中，外源性STAT3相关基序YXXQ导入位于嵌合受体C末端200个氨基酸残基内的CD3ζ细胞内结构域的任意部分。例如，STAT3相关基序导入嵌合受体C末端200个氨基酸残基内、150个氨基酸残基内、100个氨基酸残基内、90个氨基酸残基内、80个氨基酸残基内、70个氨基酸残基内、60个氨基酸残基内、50个氨基酸残基内、40个氨基酸残基内、30个氨基酸残基内、20个氨基酸残基内、或10个氨基酸残基内。在一个实施方案中，将外源性STAT3相关基序导入ITAM以外的位置。

在某个实施方案中，包含外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内结构域包含至少一个ITAM基序。在一个实施方案中，包含外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内结构域包含2个ITAM基序。在又一实施方案中，包含外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内结构域包含3个ITAM基序。

本领域技术人员了解可使用将STAT3相关基序导入CD3ζ细胞内信号传导结构域用的一些方法。例如，通过将CD3ζ的细胞内信号传导结构域的氨基酸残基104～106的氨基酸残基Leu-His-Met置换为：残基第104位的酪氨酸和与该酪氨酸残基在第105位及第106位邻接的任意2个其他氨基酸残基，可导入外源性STAT3相关基序。CD3ζ细胞内信号传导结构域的氨基酸残基104-105-106相当于全长CD3ζ(例如NCBI RefSeq：NP_932170.1)的氨基酸残基156-157-158。

如记载的那样，在某个实施方案中的嵌合受体包含细胞内区段，所述细胞内区段含有选自IL受体链和细胞质共刺激结构域的细胞质结构域的1个以上细胞内信号传导结构域。

在本公开中，IL受体链的细胞质结构域可使用能够选自IL受体的任意链的细胞质结构域，例如，包括IL-2受体β链(NCBI REFSEQ：NP_000869.1)(IL-21受体α链(NCBIREFSEQ：NP_068570.1)的氨基酸编号256～538)的氨基酸编号266～551、共有IL-2受体γ链(NCBI REFSEQ：NP_000197.1)的氨基酸编号284～369、IL-7Rα(NCBI REFSEQ：NP_002176.2)的氨基酸编号265～459、IL-9Rα(NCBI REFSEQ：NP_002177.2)的氨基酸编号292～521或IL-4Rα(NCBI REFSEQ：NP_000409.1)的氨基酸编号257～825。可使用IL受体链的细胞质结构域的全部区域。

或者，也可使用IL受体链的上述细胞质结构域的末端切割片段。例如，末端切割片段包含至ILR细胞质结构域的250个氨基酸，或为50～200个氨基酸或80～150个氨基酸。

在某个实施方案中，IL受体链的细胞质结构域任选地IL受体链的上述细胞质结构域的末端切割片段包含至少STAT相关基序任选地STAT5相关基序、和JAK结合基序(也已知为box-1基序)。在某个实施方案中，IL受体链的细胞质结构域或其末端切割片段包含STAT5相关基序和JAK结合基序。

在某个实施方案中，IL受体链的细胞质结构域和/或末端切割片段包含具有相同功能的突变体，例如，诱导STAT信号传导任选地STAT5信号传导和/或JAK信号传导的突变体。

在本公开的一个方面，可使用IL-2受体(IL-2R)β链的细胞质结构域。本公开可使用的IL-2Rβ链的细胞质结构域的例子，包含IL-2Rβ链(NCBI RefSeq：NP_000869.1)的氨基酸编号266～551。在一个实施方案中，包含具有氨基酸编号266～337及530～551的序列的任一者的肽。在本公开的一个方面，可使用IL-2Rβ链细胞质结构域的末端切割片段。该末端切割片段也可包含i)可以与酪氨酸激酶JAK1缔合、也称为BOX-1基序的JAK结合基序(例如，NCBI RefSeq：NP_000869.1的氨基酸编号278～286)、和ii)STAT相关基序，视情况为STAT5或STAT3相关基序。IL受体链的其他部分可通过例如保守性氨基酸改变而改变。

在某个实施方案中，细胞内区段也可包含含有外源性JAK结合基序或JAK结合基序的信号传导分子。例如，JAK结合基序来自IL2Rγ(IL2RG)、促红细胞生成素受体(EpoR)、促血小板生成素受体(TpoR)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体(GM-CSFR)、和生长激素受体(GHR)。

IL-2Rβ链包含用于STAT5缔合的3个功能性STAT5结合基序，为YFFF、YCTF和YLSL。它们中的酪氨酸残基的变异可使IL2Rβ链的IL-2反应性无效(Friedmann等人，1996)。促红细胞生成素受体(EpoR)包含介导STAT5活化的2个酪氨酸残基，即Y343和Y401，已记载了两者皆具有YXXL基序(Klingmuller等人，1996)。因此，YXXL在STAT5的动员上可为优选的基序。例如，如IL-2Rβ链STAT5结合基序所示，其他氨基酸残基也是有功能的。在一个实施方案中，STAT5相关基序为IL-2Rβ链STAT5相关基序，包含酪氨酸残基-510(酪氨酸残基510为NCBI RefSeq：NP_000869.1的氨基酸编号536)。

在某个实施方案中，STAT5相关基序可来自IL2Rγ、EpoR、TpoR、GM-CSFR和GHR。

在某个实施方案中，IL-2Rβ链的STAT5相关基序包含氨基酸残基YXXL。在某个实施方案中，STAT5相关基序中“X”表示的氨基酸残基可以是任何天然氨基酸，也包含维持STAT5结合的任何修饰的天然氨基酸。

同样地，细胞内区段包含也可配置或导入细胞内信号传导结构域的1个以上JAK结合基序。

在本公开的一个方面，可使用IL-21受体(IL-21R)α链的细胞质结构域。本公开所使用的IL-21Rα链的细胞质结构域的例子包含含有IL-21Rα链的氨基酸编号256～538(NCBIRefSeq：NP_068570.1)的细胞内信号传导结构域。在本公开的一个方面，可使用IL-21Rα链的细胞质结构域的末端切割片段。末端切割片段包含与酪氨酸激酶JAK1缔合所必要的box-1基序(NCBI RefSeq：NP_068570.1的氨基酸编号266～274)，另外，包含STAT相关基序。在某个实施方案中，STAT相关基序包含酪氨酸残基-500(NCBI RefSeq：NP_000869.1的氨基酸编号519)和STAT1/3缔合所必要的酪氨酸残基500，即邻接YLRQ的C末端侧的3个残基。

细胞内信号传导结构域的其他例子包括来自TCR复合体和/或共刺激分子的胞质区以及与这些序列具有相同功能的任意突变体。其他例子包括经引用而作为本说明书的一部分的Sadelain等人，2009的表2中所列举的细胞质信号传导结构域。

天然T细胞的活化经由2个不同种类的细胞内信号传导结构域传导，即，用于通过TCR复合体而诱导抗原依赖性初级活化(例如由CD3ζ所提供的，例如，初级细胞质信号)的结构域，及用于提供二级或共刺激信号(第二细胞质信号)的由抗原非依赖性作用的结构域。

本公开可使用的包含二级或共刺激细胞质信号传导结构域的细胞内结构域的例子，包含来自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137(4-1BB)、ICOS、和CD154的、例如来自包含信号传导基序的其末端切割片段的序列。其具体例包含具有CD2(NCBI RefSeq：NP_001758.2)的氨基酸编号236～351、CD4(NCBI RefSeq：NP_000607.1)的氨基酸编号421～458、CD5(NCBI RefSeq：NP_055022.2)的氨基酸编号402～495、CD8α(NCBI RefSeq：NP_001759.3)的氨基酸编号207～235、CD8β(GenBank：AAA35664.1)的氨基酸编号196～210、CD28(NCBI RefSeq：NP_006130.1)的氨基酸编号180～220、CD137(4-1BB、NCBI RefSeq：NP_001552.2)的氨基酸编号214～255、CD134(OX40、NCBI RefSeq：NP_003318.1)的氨基酸编号241～277、及ICOS(NCBI RefSeq：NP_036224.1)的氨基酸编号166～199的任一序列的肽、及与具有这些肽的序列具有相同功能的它们的突变体。

优选的公开是在一个方面，包含含有这样的细胞内区段的嵌合受体，所述细胞内区段除了包含外源性STAT3相关基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域以外，还具有1个以上、例如2或3个的细胞内信号传导结构域。

本公开还包含含有这样的细胞内区段的嵌合受体，所述细胞内区段具有串联的2个以上相同的细胞内信号传导结构域。在一个方面，本公开提供了IL受体的细胞质结构域位于CD3ζ细胞内信号传导结构域的N末端侧的嵌合受体，即，提供了包含IL受体的细胞质结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域从N末端侧以此顺序连接的嵌合受体。本公开也包含上述嵌合受体进一步添加CD28(例如，CD28的细胞质共刺激结构域)的细胞内结构域而获得的嵌合受体，即，包含CD28的细胞内信号传导结构域、IL受体的细胞质结构域、和含有外因性STAT3基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域从N末端侧以此顺序连接的嵌合受体。

在某个实施方案中，嵌合受体包含这样的细胞内区段，所述细胞内区段含有选自外源性STAT3基序、白介素受体链的细胞质结构域和细胞质共刺激结构域的细胞内信号传导结构域、含有CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中，细胞内信号传导结构域的至少一个包含内源性或外源性的JAK结合基序和STAT5相关基序。

在一个实施方案中，嵌合受体包含具有外源性STAT3基序的CD3ζ细胞内信号传导结构域、以及含有内源性或外源性的JAK结合基序和STAT5相关基序的IL受体链片段的细胞质结构域、以及CD28的细胞质共刺激结构域。

本公开的嵌合受体可在细胞内区段的结构域之间插入寡肽接头或多肽接头，以在该处连接结构域和/或使它们与其他结构域连接。例如，可使用具有2～10个氨基酸长度的接头。特别地，可使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头。例如，可在CD28细胞质结构域和部分的细胞质IL-2受体β结构域之间插入接头IDGGGGSGGGGSGGGGS。例如，可在部分的细胞质IL-2受体β结构域和CD3ζ链的细胞内结构域之间插入接头KLGGSGP。

在其他方面，提供了嵌合受体，其包含i)可以与特定的抗原结合的细胞外结构域、ii)跨膜结构域、和iii)细胞内区段，包含含有白介素受体链的细胞质结构域和任选地补充的细胞质结构域的1个以上细胞内信号传导结构域。

IL受体链的细胞质结构域也可选自本说明书记载的IL受体的任一链。可使用IL受体链的细胞质结构域的全部区域。或者，也可使用IL受体链的上述细胞质结构域的末端切割片段。全长及其末端切割片段的例子显示于本说明书中。

在某个实施方案中，末端切割片段也可包含本说明书记载的至少一个酪氨酸激酶相关基序(也已知为box-1基序)和STAT(信号传导转录活化因子)相关基序。例如，末端切割片段包含ILR细胞质结构域的至多250个氨基酸，或为50～200个氨基酸或80～150个氨基酸。

IL-2Rβ链的STAT相关基序包含酪氨酸残基-510(酪氨酸残基510为NCBI RefSeq：NP_000869.1的氨基酸编号536)。在某个实施方案中，STAT相关基序包含酪氨酸残基510和邻接酪氨酸残基510的C末端侧的4个残基，即YLSLQ。

其他的STAT相关基序也为已知，包括例如IL-6的YXXQ、任选地YXPQ、IL-10的YXXQ、IL-12的YLPSNID、IL-2的YLSLQ、YCTFP、YFFFH、IL-7的YVTMS、IL-9的YLPQE、以及IL-4的YKAFS及YKPFQ。也可使用任何的STAT信号传导结构域，和/或可导入ILR链。

在某个实施方案中，除了IL受体的细胞质结构域之外，嵌合受体细胞内区段还包含：存在于IL受体内之外的至少一个补充的信号传导结构域。细胞内信号传导结构域的例子包括来自TCR复合体的细胞质结构域和/或共刺激分子、及与这样的序列具有相同功能的任意突变体。其他例子包括经引用而作为本说明书一部分的Sadelain等人，2009的表2所列举的细胞质信号传导结构域。

本公开包含还有这样的细胞内区段的嵌合受体，所述细胞内区段除了包含IL受体的细胞质结构域之外，还包含1个以上、例如2或3个细胞内信号传导结构域。例如，嵌合受体包含IL受体的细胞质结构域及CD3ζ的细胞内信号传导结构域。例如，嵌合受体包含IL受体的细胞质结构域、CD3ζ的细胞内信号传导结构域、及CD28的细胞质共刺激结构域。

在某个实施方案中，嵌合受体包含含有CD3ζ细胞内信号传导结构域的细胞内区段、1个以上的细胞质共刺激结构域，其中，上述细胞内区段包含JAK结合基序、STAT5和/或STAT3相关基序。

跨膜结构域和间隔结构域

本公开的嵌合受体包含跨膜结构域。跨膜结构域可来自天然多肽，也可为人工设计。来自天然多肽的跨膜结构域可获自膜结合或跨膜蛋白。可使用例如T细胞受体α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154、或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域主要为包含亮氨酸和缬氨酸等疏水性残基的多肽。例如，可在合成的跨膜结构域的各末端见到苯丙氨酸、色氨酸及缬氨酸的三联体。视情况，在本说明书记载的跨膜结构域及细胞内区段之间可配置短链寡肽接头或多肽接头，例如2～10个氨基酸长度的接头。特别地，可使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。

例如，可使用具有CD28(NCBI RefSeq：NP_006130.1)的氨基酸编号153～179的序列的任一个跨膜结构域作为跨膜结构域。

本公开的嵌合受体可在细胞外结构域和跨膜结构域之间、或细胞内区段和跨膜结构域之间，配置间隔结构域。间隔结构域也表示作用为连接跨膜结构域和细胞外结构域、和/或跨膜结构域和细胞内区段的任何寡肽或多肽。间隔结构域包含至多300个氨基酸，例如约10～100个氨基酸，或约25～50个氨基酸。

间隔结构域优选地具有促进接头切割后的抗原结合分子介导的嵌合受体与抗原的结合、且增强对细胞的信号传导的序列。促进结合的所期待的氨基酸的例子包含半胱氨酸、带电氨基酸、以及潜在的糖基化部位内的丝氨酸和苏氨酸，这些氨基酸可作为构成间隔结构域的氨基酸使用。

在某个实施方案中，间隔结构域包含CD8α(NCBI RefSeq：NP_001759.3)的氨基酸编号118～178，即CD8α的铰链区、CD8β(GenBank：AAA35664.1)的氨基酸编号135～195、CD4(NCBI RefSeq：NP_000607.1)的氨基酸编号315～396、CD28(NCBI RefSeq：NP_006130.1)的氨基酸编号114～152、或它们的一部分，或者由它们组成的多肽。进一步地，间隔结构域也可为人工合成的序列。

本公开的嵌合受体可设计为以形成聚合物、特别地是二聚体。例如为了通过二硫键而使嵌合受体聚合(二聚体化)，在间隔结构域和/或跨膜结构域插入半胱氨酸。

进一步地，本公开的嵌合受体可在N末端链接信号肽序列。信号肽序列多存在于分泌蛋白质和膜蛋白的N末端，具有15～30个氨基酸长度。本说明书记载的具有细胞内结构域的蛋白质分子多为膜蛋白，具有信号肽序列。来自这样的分泌蛋白质和膜蛋白的信号肽可作为本公开的嵌合受体的信号肽使用。可使用任何的信号肽。例如，信号肽可为抑癌素M信号肽。信号肽可来自人，也可来自非人，例如，来自昆虫细胞或病毒。在某个实施方案中，信号肽为人信号肽。

(2)编码嵌合受体的核酸

本公开提供了编码本说明书记载的嵌合受体的核酸。编码嵌合受体的核酸可从所示的嵌合受体的氨基酸序列经常规方法而容易地制备。编码氨基酸序列的核酸序列可从各结构域的氨基酸序列相关的上述NCBI RefSeq ID或GenBank的登录号取得，使用标准的分子生物学和/或化学的步骤可以制备本公开的核酸。例如，可基于核苷酸序列合成核酸，通过组合从cDNA文库使用聚合酶链反应(PCR)所获得的DNA片段，可制备本公开的核酸。

本公开的核酸可以与其他核酸连接以在合适启动子的控制下表达。启动子的例子包括组成型促进基因或可操作地连接的构建体表达的启动子、通过药物等(例如，四环霉素或多柔比星)的作用诱导基因或可操作地连接的构建体表达的启动子。本公开的核酸还可以连接到包含其他调控元件例如增强子序列或终止子序列的核酸，它们与启动子或转录起始位点配合，以获得核酸的有效转录。除了本公开的核酸之外，也可以纳入能够作为确认核酸表达的标记基因(例如，抗药性基因、编码报告酶的基因或编码荧光蛋白的基因)。

某个实施方案中，核酸是经密码子优化的核酸，以在特定的宿主中表达。

本公开提供了包含作为有效成分的本公开的核酸和药学上可容许的赋形剂的组合物。合适的药学上可容许的赋形剂为本领域技术人员所周知。药学上可容许的赋形剂的例子包括，含有磷酸缓冲生理盐水(例如0.01M磷酸盐、0.138M的NaCl、0.0027M的KCl、pH7.4)、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐或硫酸盐等无机酸盐的水溶液、生理盐水、乙二醇或乙醇的溶液、和乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐等有机酸盐。也可使用湿润剂或乳化剂、和pH缓冲剂等佐剂。作为药学上可容许的赋形剂，可合适地使用Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)(引用作为本说明的一部分)所记载的赋形剂。本公开的组合物可以配制成优选地用于非经口施用的已知形式，例如注射或输注。进一步地，本公开的组合物也可包含悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂等制剂添加剂、及用于延长保存中的有效性的防腐剂。本组合物也可为干燥形态，用于使用前在合适的无菌液体重构。为了通过微粒施用，可将显微镜可见大小的金粒子等的粒子用DNA包被。

在将本公开的核酸以离体(ex vivo)导入细胞的情形，本公开的核酸除了与促进核酸迁移进入细胞的物质例如上述赋形剂组合之外，本公开的核酸也可以与脂质体或阳离子脂质等用于导入核酸的试剂组合。或者，如后所述，运送本公开的核酸的载体也是有用的。特别地，含有由优选的载体携带的本公开的核酸、且为施用于生物体的优选形态的组合物适合于体内基因疗法。

包含本公开的核酸作为有效成分的组合物，通过该核酸编码的嵌合受体经接头切割后的抗原结合分子介导而结合的抗原，可施用用于例如癌[血液癌(白血病)、实体肿瘤等]、炎症性疾病/自身免疫疾病(哮喘、湿疹)、肝炎、及原因为流行性感冒和HIV等的病毒、细菌、或真菌的感染性疾病、例如结核、MRSA、VRE、或深层真菌病等的疾病的治疗。包含本公开的核酸作为有效成分的组合物可在皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻腔内、动脉内、静脉内、肿瘤内或传入淋巴管通过非经口施用，例如注射或注入而施用，或可为了这些施用而合适的调配处方，但对施用途径没有特别的限定。

用于生产表达嵌合受体的细胞的方法

本公开的用于生产表达嵌合受体的细胞的方法包括将编码本说明书记载的嵌合受体的核酸导入细胞的步骤。此步骤离体进行。例如，可将细胞离体地用运送本公开的核酸的病毒载体或非病毒载体进行转化，以生产表达本公开的嵌合受体的细胞。

本公开的方法可使用来自哺乳动物的细胞，例如人细胞、或来自猴、小鼠、大鼠、猪、马、或狗等的非人哺乳动物的细胞。

在一个实施方案中，哺乳动物是人。

根据本公开，提供了嵌合受体、编码上述嵌合受体的核酸、表达上述嵌合受体的细胞、和包含上述任一者的组合物。在某个实施方案中，可使用上述1个以上在以肿瘤抗原等抗原作为靶标的过继免疫基因疗法的领域和/或在筛选或其他体外(in vitro)测定法中。将本公开的嵌合抗原受体导入细胞，例如可得到在该细胞中嵌合抗原受体的表达量增强或上升。这样的细胞对表达靶标抗原的细胞可发挥细胞毒性。

在一个方面，提供了表达本公开的嵌合受体的细胞的制备方法，包括：

a)从哺乳动物分离免疫细胞(视情况，上述免疫细胞是T细胞)；

b)将分离的免疫细胞(视情况，为T细胞)用编码本说明书记载的嵌合受体的核酸进行转染或转导；和

c)视情况，在转染或转导后，分离嵌合受体表达细胞(视情况，为嵌合受体表达T细胞)，和/或扩大培养。

在一个实施方案中，在对对象再导入前，使自体T淋巴细胞或自体NK细胞、自体巨噬细胞离体(ex vivo)活化和/或增殖。在一个实施方案中，T淋巴细胞或NK细胞为同种异体的T淋巴细胞或同种异体的NK细胞。在一个实施方案中，同种异体的T淋巴细胞是内源性T细胞受体的表达受到抑制或排除的T淋巴细胞。在一个实施方案中，在对对象导入前，使同种异体的T淋巴细胞或同种异体的NK细胞离体活化和/或增殖。在一个实施方案中，通过选自由逆转录病毒转导、慢病毒转导、DNA电穿孔法和RNA电穿孔法、经DNA或RNA转染或基因编辑的基因改变组成的组的方法，将嵌合受体导入T淋巴细胞或NK细胞或巨噬细胞。

本公开的方法中使用的NK细胞缺乏或几乎不表达主要组织相容性抗原I和/或II分子，通过暴露于基因修饰的细胞可优先增殖，以表达膜结合IL-15和4-1BB配体(CDI37L)。这样的细胞株包含K562[ATCC、CCL 243；Lozzio等人，Blood 45(3)：321-334(1975)；Klein等人，Int.J.Cancer 18：421-431(1976)]和病毒肿瘤细胞株HFWT[Fehniger T A，Caligiuri M A.Int Rev Immunol 20(3-4)：503-534(2001)；Harada H，等人，Exp Hematol32(7)：614-621(2004)]、子宫内膜肿瘤细胞株HHUA、黑色素肿瘤细胞株HMV-II、肝母细胞肿瘤细胞株HuH-6、肺小细胞癌细胞株Lu-130及Lu-134-A、神经母细胞肿瘤细胞株NB 19及N1369、来自睾丸NEC 14的胚性癌细胞株、颈癌细胞株TCO-2和骨髓转移神经母细胞肿瘤细胞株TNB 1[Harada H.等人，Jpn.J.Cancer Res 93：313-319(2002)]，但不一定限于这些。优选使用的细胞株是如K562及HFWT细胞株那样的、缺乏或几乎不表达MHC I和II分子两者。可使用固体支持体代替细胞株。这样的支持体在其表面结合有至少一个分子，优选地与NK细胞结合来诱发初期活化现象和/或增殖性应答；或者具有这样的作用的分子的结合是可能的，由此作为支架而发挥作用。支持体可在其表面结合有CD137配体蛋白质、CD137抗体、IL-15蛋白质或IL-15受体抗体。优选地，支持体具有结合于其表面的IL-15受体抗体及CD137抗体。

在一个实施方案中，在包括T淋巴细胞活化的任一本公开的方法中，T淋巴细胞在选自由抗CD3/CD28、IL-2和植物血凝素组成的组的1种以上药剂存在下可活化。在包括NK细胞活化的任一本公开的方法中，NK细胞在选自由CD137配体蛋白质、CD137抗体、IL-15蛋白质、IL-15受体抗体、IL-2蛋白质、IL-12蛋白质、IL-21蛋白质和K562细胞株组成的组的1种以上药剂存在下可活化。

对本公开的方法所使用的细胞没有特别限定，可使用任何细胞。例如，可使用从体液、组织或器官，例如血液(外周血、脐带血等)或骨髓采集、分离或纯化的细胞，或使上述细胞分化、或为了制备多能干细胞(iPSC)而经初期化所得到的细胞(参照例如Themeli等人2013)。可使用外周血单个核细胞(PBMC)、免疫细胞[例如T细胞、树状细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞或造血细胞(包含嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)]、脐带血单个核细胞、成纤维细胞、脂肪细胞前体、肝细胞、皮肤角质形成细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、各种癌细胞株、或神经干细胞。例如，可使用NK细胞或T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有这些细胞的细胞群。T细胞的例子包括CD8阳性T细胞、CD4阳性T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、和肿瘤浸润淋巴细胞。包含T细胞和T细胞前体细胞的细胞群包括PBMC。上述细胞可从活体采集，也可通过扩大培养从活体采集的细胞而获得，或者也可建立细胞株。在希望所产生的嵌合受体表达细胞或从所产生的嵌合受体表达细胞分化的细胞移植活体的情形，可将核酸导入从该活体本身或其同种活体采集的细胞。

与多核苷酸组合在一起，本公开也提供了包含这样的多核苷酸的载体(包含这样的多核苷酸与用于表达嵌合受体的至少一个调节元件可操作地连接的载体)。本公开的有用的载体的非限定例子包括例如逆转录病毒载体和慢病毒载体这样的病毒载体。

在一个特定方面，这样的载体包含自杀基因。此处使用的术语自杀基因表示使表达自杀基因的细胞致死的基因。自杀基因可为对表达该基因的细胞赋予对药剂例如药物的敏感性，使该细胞和该药剂接触时或暴露于该药剂时，使细胞致死的基因。自杀基因是本领域已知的(参见例如Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews，Springer，CarolineJ.(Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute ofCancer Research，Sutton，Surrey，UK)，Humana Press，2004)，例如，包含单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶和半胱天冬酶8这样的半胱天冬酶。

可将编码本公开的嵌合受体的核酸导入载体，并可将该载体导入细胞。例如，可使用逆转录病毒载体(包含致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体和假型载体(pseudotypevector))、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、Epstein-Barr病毒(EBV)载体、和HSV载体等的病毒载体。例如，可使用在感染细胞内缺乏复制能力的病毒载体，以便不会在感染细胞内自我复制。

除此之外，非病毒载体也可如本公开中WO96/10038、WO97/18185、WO97/25329、WO97/30170和WO97/31934(通过引用作为本说明书的一部分)所记载，与脂质体或阳离子脂质等缩合剂组合使用。本公开的核酸也可通过磷酸钙转导、DEAE-葡聚糖、电穿孔法或粒子轰击而导入细胞。

例如，在使用逆转录病毒载体的情形，本公开的方法可以通过基于LTR序列选择经合适的包装细胞和载体加工的包装信号序列、并使用包装细胞制备逆转录病毒粒子来进行。包装细胞的例子包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86及GP+envAm-12(美国专利第5,278,056号)、及Psi-Crip[Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，vol.85，pp.6460-6464(1988)]。也可使用293细胞或具有高转染效率的293T细胞来制备逆转录病毒粒子。基于逆转录病毒和可用于包装逆转录病毒载体的包装细胞所产生的多种类的病毒载体由多个公司广为市售。

本公开又提供了包含上述嵌合受体的宿主细胞。有用的宿主细胞的非限定性例子包括T淋巴细胞和NK细胞，它们可以是自体的或可以是同种异体的(去除或维持了内源性T细胞受体)。在某个特定的方面，宿主细胞为从患有癌的患者分离的自体T淋巴细胞。在一个特定的方面，离体活化和增殖这样的自体T淋巴细胞。

本公开的嵌合受体可通过本领域已知的任意方法导入宿主细胞。特别地，有用的方法的非限定性例子包括逆转录病毒转导、慢病毒转导、以及DNA和mRNA电穿孔法。如下述实施例所示，mRNA电穿孔法使在T淋巴细胞中有效表达产生本公开的嵌合受体。记载逆转录病毒转导的参考文献的例子包括Anderson等人，美国专利5,399,346号；Mann等人，Cell33：153(1983)；Temin等人，U.S.Pat.No.4,650,764；Temin等人，美国专利5,124,263号；Dougherty等人的国际专利公开WO95/07358号(1995年3月16日公开)；和Kuo等人，Blood82：845(1993)。国际专利公开WO95/07358号记载了原代B淋巴细胞的高效率转导。例如，对于可使用的逆转录病毒转导和mRNA电穿孔法的具体技术，也可参照下列实施例的章节。

使用宿主细胞活化和增殖，使常规病毒载体向基因组的插入及编码本公开的嵌合受体的基因的表达成为可能。但是，如果使用mRNA电穿孔法，则活化和增殖不是必要的(但电穿孔法在活化细胞上实施时更有效)。作为病毒转导的结果，宿主细胞(T淋巴细胞或NKT细胞)有较该受体瞬时(典型地为3～5日)表达时的mRNA电穿孔法产生更强效果的可能性，长时间表达本公开的嵌合受体。但是，病毒转导复杂、昂贵、实施困难，但另一方面，mRNA电穿孔法简单的多，容易实施的多。进一步地，如果有毒性的可能性则瞬时表达有用，因为副作用的可能性在临床试验的初期应该有帮助。

在一方面，涉及本说明书公开的细胞的制备方法，包括用本说明书记载的核酸或载体转染或转导细胞。

在一个实施方案中，分离的免疫细胞是分离的T细胞。

在某个实施方案中，分离的细胞是CD3⁺，任选地在转导或转染前，任选地用可溶型或膜结合型的抗CD3抗体例如OKT3或mOKT3和/或用APC刺激。在一个实施方案中，APC为人工APC(aAPC)。在其他实施方案中，APC表达膜型的抗CD3单克隆抗体。

在一个实施方案中，重复转染或转导步骤。例如，可进行转染或转导步骤2次或3次或4次，或例如直至达到充分的表达水平。例如，可进行转染或转导步骤5次。

在一个实施方案中，对细胞进行连续2天以上的转染或转导。例如，对细胞进行连续2天、连续3天、或连续4天的转染或转导。

在一个实施方案中，用表达指定抗原的照射细胞刺激嵌合受体转导细胞。例如，以效应物∶靶标比为100∶1、75∶1、50∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶50或1∶100用照射细胞刺激嵌合受体转导T细胞。优选地为1∶1。

表达嵌合受体的细胞及其用途

本公开的表达嵌合受体的细胞为将编码本说明书所记载的嵌合受体的核酸通过本说明书记载的生产方法导入和表达的细胞。

本公开的细胞经嵌合受体介导而与指定的抗原结合，由此将信号传导至细胞，结果使细胞活化。根据宿主细胞的种类及嵌合受体的细胞内结构域的不同，表达嵌合受体的细胞的活化不同，可基于例如细胞因子的释放、细胞增殖速度的提高、或细胞表面分子的变化等作为指标来确认。例如，自活化细胞释放的细胞毒性细胞因子(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)引起表达抗原的靶标细胞的破坏。进一步地，细胞因子的释放或细胞表面分子的变化刺激其他免疫细胞，例如B细胞、树状细胞、NK细胞和巨噬细胞。

本公开的方法中使用的T淋巴细胞最优选地是患者本身的细胞(即自体细胞)，所述细胞首先从血液样本分离，优选使用例如抗CD3/CD28珠、IL-2或植物血凝素这样的标准方法，离体活化和增殖(例如3～5日)。或者，可使用同种异体的T淋巴细胞(优选地为内源性T细胞受体的表达受到抑制或排除的同种异体的T淋巴细胞)。参照Torikai等人，Blood，2012119：5697-5705。分离(及根据需要活化和/或增殖)后，将编码本公开的嵌合受体的多核苷酸(或包含这样的多核苷酸的载体)转导(或电穿孔)至来自患者的T淋巴细胞及NK细胞，然后使嵌合受体在T细胞或NK细胞的细胞表面表达。可在之后施与患者修饰细胞(例如治疗用抗体点滴1天后施与)。

在一方面，提供了本说明书记载的嵌合受体表达细胞、核酸、载体、细胞或组合物的用途，用于治疗疾病。

另一方面为，提供了在哺乳动物中治疗或预防疾病的方法，是包括对有该需要的哺乳动物施用有效量的本说明书公开的细胞或组合物的方法。

包含嵌合受体表达细胞作为有效成分的治疗药可通过皮内、肌内、皮下、腹膜内、鼻腔内、动脉内、静脉内、肿瘤内、或输入淋巴管来非经口施用，例如，可通过注射或注入施用，但对施用途径没有特别限定。

在又一方面，可以例举使用病毒载体等将编码本公开的嵌合受体的核酸导入活体内，使该嵌合受体直接表达的方法。作为病毒载体，例如腺病毒，但不限于此。另外，不使用病毒载体，通过电穿孔法或直接施用核酸的方法等，将编码该嵌合受体的核酸直接导入活体内也是可能的，通过将基因改变的细胞施用至活体，以使该嵌合受体分泌表达，由此使该嵌合受体继续在活体内分泌也是可能的。

根据本公开，可通过将包含本公开的嵌合受体的T淋巴细胞或NK细胞以约10⁵～10¹⁰个以上的细胞/公斤体重(个细胞/Kg)的范围的治疗上有效施用量注入来处理患者。注入只要是达到所希望的反应、患者显示耐受性即可，可尽量频繁且多次、反复进行。合适的注入用量和日程安排根据每个患者而异，针对特定患者，处置医师可以决定。典型地，注入约10⁶个细胞/Kg的初次施用量，增加至10⁸个以上的细胞/Kg。可联用IL-2，用于使注入细胞在注入后增殖。IL-2的量可为约1～5×10⁶国际单位/平方米体表面积。

治疗药包含表达嵌合受体的细胞作为有效成分，也可进一步包含合适的赋形剂。赋形剂的例子包括，含有本公开的核酸作为有效成分的组合物用的上述药学上可容许赋形剂、各种细胞培养基、和等张性氯化钠。

本公开的药物组合物

本公开的又一方面提供了药物组合物。在一个实施方案中，本公开提供了包含i)含有编码本公开的嵌合受体的多核苷酸或这样的多核苷酸的载体和ii)药学上容许的载剂或添加物的药物组合物。

本公开的药物组合物所使用的合适的添加物为本领域技术人员周知，例如可包含组织培养基(例如，用于使细胞离体存活)或食盐水溶液(例如，向患者注射细胞时)。药学上容许的添加物的详细记载可从Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)获得。

施用本发明的药物组合物的疾病只要是该疾病对使用的疗法显示敏感性即可，没有特别限定。在一个实施方案中，疾病为癌。在一个实施方案中，对象为疑似患有癌、或者患有癌。

例如，癌为血液癌或实体肿瘤。例如，血癌为白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。例如，实体肿瘤为腺癌、扁平上皮癌、腺扁平上皮癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈部癌、子宫癌、肝癌、肾脏癌、胰脏癌、脾脏癌、肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、小肠癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌等的癌，或骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌，以及软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、悪性血管内皮瘤、恶性许旺细胞瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等的肉瘤，或肝胚细胞瘤、骨髓胚细胞瘤、肾胚细胞瘤、神经胚细胞瘤、胰胚细胞瘤、胸膜肺胚细胞瘤、视网膜胚细胞瘤等的胚细胞瘤，或胚胎细胞瘤。

在某个实施方案中，疾病为炎症性疾病/自身免疫疾病(哮喘、湿疹)、肝炎、及其原因为流行性感冒及HIV等的病毒、细菌、或真菌的感染性疾病、例如结核病、MRSA、VRE、或深部真菌病。在一个实施方案中，对象为疑似患有这样的炎症性疾病、或者患有炎症性疾病。

为了治疗上述疾病从而减轻或消除疾病，施用本公开的药物组合物，以治疗这些疾病，所述药物组合物是通过所希望的细胞与经加工的抗原即肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原等结合的药物组合物。

因此，一个方面是减少对象中表达指定抗原的细胞数的方法，包括含有对有此需要的对象施用有效量的本说明书记载的药物组合物的方法，其中，嵌合受体表达细胞经与细胞外结合结构域结合的接头切割后的抗原结合分子的介导而与指定的抗原特异性结合。

本公开的细胞还可以用于以复发性白血病的缓解等为目的的、骨髓移植或放射线照射、供者淋巴细胞输血后的感染性疾病的预防。

本公开的嵌合受体提供T淋巴细胞抗体依赖性细胞毒作用，增强NK细胞中的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。受体通过与肿瘤细胞结合的抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)结合，诱发T细胞活化、持续增殖和该抗体(或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子)对目的癌细胞的特异性细胞毒性。

本公开的嵌合受体促进对多样的癌细胞型使用某一个受体成为可能的T细胞治疗。考虑到肿瘤利用的免疫逃逸机制，可以是最终有利的战略，同时靶向多样的抗原也成为可能(Grupp等人，N.Engl.J.Med.2013；368(16)：1509-1518)。抗体介导的细胞毒性经由抗体施用的简单中止，任何时候使用都能停止。表达本公开的嵌合受体的T细胞只通过与靶标细胞结合的抗体而活化，因此未结合的免疫球蛋白对注入的T细胞内不发挥任何刺激。为了控制有某种可能性的某自身免疫反应性，通过使用瞬时表达嵌合受体用的mRNA电穿孔，可以进一步提高临床上的安全性。

在上述方法的一个实施方案中，T淋巴细胞或NK细胞为从该对象分离的自体T淋巴细胞或NK细胞。在一个特定实施方案中，在对对象再导入前，离体使自体T淋巴细胞或NK细胞活化和/或增殖。在其他实施方案中，T淋巴细胞或NK细胞为同种异体的T淋巴细胞或NK细胞。在某个特定实施方案中，T淋巴细胞为抑制或消除了内源性T细胞受体表达的同种异体T淋巴细胞。在一个特定实施方案中，在对对象导入前，离体使同种异体T淋巴细胞活化和/或增殖。T淋巴细胞例如在抗CD3/CD28、IL-2和植物血凝素的存在下，可通过本领域已知的任意方法活化。NK细胞在选自CD137配体蛋白质、CD137抗体、IL-15蛋白质、IL-15受体抗体、IL-2蛋白质、IL-12蛋白质、IL-21蛋白质和K562细胞株的1个以上药剂的存在下，可通过本领域已知的任意方法活化。例如用于增殖NK细胞的有用方法的记载参考美国专利第7,435,596号和第8,026,097号。

在上述方法的一个实施方案中，对对象导入T淋巴细胞或NK细胞(或再导入)之后，施与对象治疗有效量的PD-1/PD-L1信号抑制剂和/或VEGF信号抑制剂。

本公开的组合的处置

本说明书记载的组合物和方法可以与化学疗法、手术、放射线、基因治疗等这样的用于癌的其他类型的治疗组合利用。这样的治疗可以与根据本公开的免疫疗法同时或依次(以任意顺序)应用。

与额外的治疗剂联用时，各药剂的合适的治疗上有效施用量可以因相加或协同作用而减少。

可将本公开的处置与其他免疫调节处置组合，所述其他免疫调节处置例如治疗用疫苗(包含GVAX、DC疫苗等，但不限于此)、检查点抑制剂(包含阻断CTLA4、PD1、LAG3、TIM3等的药剂，但不限于此)或激活剂(包含增强41BB、OX40等的药剂，但不限于此)。

本公开的药物组合物，根据处置的指定适应症，有必要的话，也可包含一个以上额外的活性化合物，优选地为互相没有不利影响、具有补充的活性的化合物。可能的额外活性化合物的非限定性例子包含例如PD-1/PD-L1信号抑制剂及VEGF信号抑制剂。

在其他实施方案中，本公开的药物组合物还包含对癌细胞可发挥细胞毒性的单克隆抗体(例如，利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、hu14.18K322A等)或包含Fc部分的其他抗肿瘤分子(例如由与免疫球蛋白的Fc部分或含有Fc的DNA或RNA组合并结合肿瘤表面受体的配体(例如细胞因子、免疫细胞受体)形成的混合分子)。

根据处置的癌种类、疾病的严重度及经过、先前的治疗、患者的临床历史及对抗体的反应及处置医师的裁量确定使用的抗体的合适施用量。以一次或连续多次处置对患者施用抗体。根据本公开的治疗的进行可根据现有的已知技术和测定法容易地监控。

抗体的施用包括全身施用和对疾病部位(例如，对原发性肿瘤)的直接施用，可以通过任意的合适途径实施。

与本公开的免疫疗法组合的其他有用治疗剂的非限定性例子包含以下治疗剂。

(i)抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、基质金属蛋白酶抑制物质(TIMP1及TIMP2)、催乳素(16Kd片段)、血管抑制素(纤溶酶原的38Kd片段)、内皮抑素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR及FLT-1受体、胎盘的增殖素相关蛋白以及Carmeliet和Jain(2000)中记载的那些；

(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，例如，抗VEGF抗体、VEGF突变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体(aptamer)、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂和它们的任意组合；

(iii)例如，嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷(floxuridine)Floxuridine、卡培他滨凯希得平(Capecitabine)、吉西他滨和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂及相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他汀及2-氯脱氧腺苷(Cladribine))这样的化疗化合物；抗增殖性/有丝分裂抑制剂，包含长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)的天然产物、如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇、长春新碱、长春花碱、诺考达唑(Nocodazole)、埃博霉素类和诺维本(Navelbine)的微管破坏剂、表鬼臼毒素(依托泊苷(Etoposide)、替尼泊苷(Teniposide))、DNA伤害剂(放线菌素、Amsacrine、蒽环类、博来霉素、二甲磺酸丁酯(Busulfan)、喜树碱(Camptothecin)、卡铂(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、顺铂(Cisplatin)、环磷酰胺、癌得星(Cytoxan)、更生霉素(Dactinomycin)、柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、六甲基三聚氰胺(Hexamethylmelamine)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、美法仑(Melphalan)、氮芥(Mechlorethamine)、丝裂霉素(Mitomycin)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、亚硝脲(nitrosourea)、普卡霉素(Plicamycin)、丙卡巴肼(Procarbazine)、紫杉醇(Taxol)、泰索帝(Taxotere)、替尼泊苷(Teniposide)、三亚乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(Etoposide)(VP16))；抗生素，如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星(Idarubicin)、蒽环类(Anthracyclines)、米托蒽醌、博来霉素类、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(例如，系统性代谢L-天冬酰胺并去除缺乏合成自身天冬酰胺能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂，例如，氮芥类(二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类(六甲基三聚氰胺和噻替哌(Thiotepa))、烷基磺酸类-白消安、亚硝脲类(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链脲佐菌素)、如利格列汀(Trazenta)类-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物，如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位配合物类(顺铂、卡铂)、Procarbazine、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦和氨基鲁米特；激素类、激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺和尼鲁他胺)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成的肝素盐类和其他凝血酶抑制剂)；纤溶剂(例如，组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷和阿昔单抗；抗趋化剂；抗分泌剂(布雷菲定)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(例如，TNP-470、金雀异黄酮(Genistein)、贝伐单抗(Bevacizumab))和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻滞剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导因子(维甲酸(Tretinoin))；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(亚德里亚霉素(阿霉素))、安吖啶(Amsacrine)、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、替尼泊苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、强的松和泼尼松龙)；增殖因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能不全诱导因子和半胱天冬酶活化因子(caspase activator)；以及染色质干扰因子。

更有效的药剂的例子参照Physician’s Desk Reference，59.sup.th edition，(2005)，Thomson P D R，Montvale N.J.；Gennaro等人编著，Remington’s The Scienceand Practice of Pharmacy 20.sup.th edition，(2000)，Lippincott Williams andWilkins，Baltimore Md.；Braunwald等人编著，Harrison’s Principles of InternalMedicine，15.sup.th edition，(2001)，McGraw Hill，NY；Berkow等人编著，The MerckManual ofDiagnosis and Therapy，(1992)，Merck Research Laboratories.Rahway N.J。

上述公开整体地说明本申请。可参照下列具体例更完全的了解。这些例子仅仅只是为了举例而描述，非限定本申请的范围。如果暗示或显示状况合适的话，也尝试方式的变化及等价物的替换。在本公开虽使用特定术语，但这些术语是意图描述的意义，并非以限定为目的。

另外，本说明书中所引用的全部现有技术文献，作为参考并入本说明书中。

实施例

以下通过实施例更详细地说明本发明，但这些实施例非限制本发明的范围。

[实施例1]在病变部位特异性被切割的抗体及利用识别该切割的抗体的抗体技术的概念

通过对抗体赋予对在如癌组织或炎症组织的病变部位表达增加的蛋白酶的敏感性，使组织特异性及治疗窗口扩大的已知抗体技术(Probody(注册商标))如图1所示。Probody(注册商标)是连接有抗体、掩蔽抗体的抗原结合部位的掩蔽肽和被在病变部位表达的蛋白酶切割的肽序列的分子(Sci Transl Med.2013Oct 16；5(207)：207ra144)。抗体的抗原结合部位在肽序列未被切割的状态下由于被掩蔽肽掩蔽，因此不能与抗原结合。Probody(注册商标)的切割肽序列由于被靶标病变部位表达的蛋白酶切割，导致掩蔽肽解离，产生有抗原结合活性的抗体分子，可以与目标病态组织特异性抗原结合。另一方面，Probody(注册商标)存在国际公开WO2018/097307、WO2018/097308中所示的问题点。为了解决这些课题，提议了经蛋白酶作用产生的活化抗体的血液中半寿期短、且当不发生蛋白酶的切割时完全不发挥药理作用的分子群，且是具有泛用性的分子群(图2～图5)。

作为这些分子群的制备方法，首先，获得与靶标抗原结合的抗体(一级分子，为抗原结合分子)，以及T细胞重定向抗体和介导ADCC活性的抗体或嵌合受体等活化效应细胞的二级分子这2种分子群。与插入了具有被病变部位特异性蛋白酶切割的序列的蛋白酶切割接头的靶标抗原结合的抗体作为一级分子使用。另一方面，对活化效应细胞的抗体或嵌合受体(二级分子)赋予对经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子的结合能力。这2种分子在接头未切割的情形，彼此不结合。因此，在正常组织中，效应细胞和靶标抗原不进行桥连，不发生活化。另一方面，当接头被蛋白酶切割，则切割了接头的抗原结合分子与二级分子结合，形成复合体。复合体在抗原存在时，靶标抗原和效应细胞之间形成桥连，使效应细胞活化。被蛋白酶切割的一级分子可为融合了VHH等单结构域抗体的变异抗体(例如IgG抗体样分子或重链抗体等)，也可为插入了切割接头的IgG抗体。另外，二级分子和切割了接头的抗原结合分子的结合，可以是识别因切割而产生的肽末端，也可以是因切割而露出的接头为被切割的抗原结合分子的分子界面。作为此方式的应用例，考虑依赖在病变部位高表达的蛋白酶及靶标抗原这两者来发挥ADCC或TDCC活性的抗体、CAR-T细胞、ADC(抗体药物缀合物；Antibody drug conjugate)、免疫细胞因子、溶瘤病毒(Oncolytic virus)或基因治疗用的病毒载体等疗法。

在本发明中，在抗原结合分子为抗体或IgG抗体样分子的情形，经蛋白酶切割前的抗原结合分子具有长的血液中滞留性。另一方面，通过接头的切割，去除了Fc，通过Fc-FcRn相互作用的补救机制受到抑制，则切割了接头的抗原结合分子被快速代谢。实际上，相对于全长IgG的血液中半寿期，抗体片段(Fab)的半寿期为一半以下(Toxicol Pathol 1999Sep-Oct(5)：536-44)，VHH的血液中半寿期为80分钟(Br J Pharmacol.2010Jun；160(4)：1016-28)。因此，切割了接头的抗原结合分子滞留，与在正常组织表达的抗原作用，使效应细胞活化的可能性降低。另外，对于未切割的一级分子，不与进行效应细胞活化的二级分子结合，即使未切割的一级分子在高浓度施用时也没有产生副作用的担心。

[实施例2]具有蛋白酶切割接头的抗体及和该抗体的切割了接头的抗原结合分子结合的抗体的制备

(2-1)插入了蛋白酶可切割接头的抗体的表达及纯化

编码插入了蛋白酶可切割接头的抗体的碱基，使用编码该接头的引物以公知方法制备。更具体地，制备在编码部分或全长的切割接头的DNA序列加上欲插入切割接头的抗体的部分序列的3’方向和5’方向的PCR引物，再以欲插入蛋白酶切割接头的抗体的碱基序列为模板，在DNA的5’侧及3’侧进行PCR。接着，利用In-Fusion(注册商标)HD Cloning Kit(Clontec)等，将所获得的PCR产物插入公知的表达载体。以本领域技术人员指定的方法培养来自人胎儿肾细胞的FreeStyle 293-F株或Expi293株(Invitrogen)，经脂转染法导入编码上述碱基序列的质粒。在CO₂培养箱(37℃、8％CO₂，90rpm)培养4天，使用rProtein ASepharose^TMFast Flow(Amersham Biosciences)以本领域技术人员公知的方法，从培养上清液纯化含有Fc区的抗体。使用分光光度计，测定纯化的抗体溶液在280nm的吸光度。使用从所获得的测定值以PACE法算出的吸光系数，计算出经纯化的抗体浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。

(2-2)与经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子和人CD3特异性结合的双特异性抗体的表达及纯化

与经MMP13等切割的II型胶原蛋白的肽末端结合的抗体臂(WO2011/034128)20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT是使组合轻链可变区20A10L(序列编号728)及轻链恒定区k0MT(序列编号729)的轻链20A10L-k0MT、对组合重链可变区20A10H(序列编号726)及重链恒定区F760nN17(序列编号727)的重链20A10H-F760nN17共同表达而制备的。

与经IdeS切割的人IgG1肽末端结合的抗体臂(WO2012/067624)20952H-F760nN17/20952L-k0MTC是使组合轻链可变区20952L(序列编号731)及轻链恒定区k0MTC(序列编号746)的轻链20952L-k0MTC、对组合重链可变区20952H(序列编号730)及重链恒定区F760nN17(序列编号727)的重链20952H-F760nN17共同表达而制备的。

进一步地，抗人CD3抗体臂TR01H113-F760nP17/L0011-k0a是使组合轻链可变区L0011(序列编号734)及轻链恒定区k0a(序列编号729)的轻链L0011-k0a、对组合重链可变区TR01H113(序列编号732)及重链恒定区F760nP17(序列编号733)的重链TR01H113-F760nP17共同表达而制备的。这些抗体臂的恒定区F760nN17和F760nN17降低对Fcγ受体的结合，使用加入变异的恒定区使2个重链异缔合化。

20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT、20952H-F760nN17/20952L-k0MTC、TR01H113-F760nP17/L0011-k0a分别以实施例3-2所示方法表达、纯化。各抗体利用恒定区电荷的不同，以本领域技术人员公知的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，110，5145-5150，2013)予以混合，制备针对经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子及人CD3的双特异性抗体(分别为20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a、20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a、H000-F760nN17/GL4-k0a//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a)。

另外，本说明书中的抗体根据以下规则命名。(重链可变区)-(重链恒定区)/(轻链可变区)-(轻链恒定区)。例如，称为20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT的抗体名，表示该抗体的重链可变区为20A10H、重链恒定区为F760nN17、轻链可变区为20A10L、轻链恒定区为k0MT。另外，由2种不同抗体所构成的异缔合体在构成异缔合体的各抗体名之间插入//来表示。例如，20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a是指这样的抗体，其包含20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT作为一方抗体臂，且包含TR01H113-F760nP17/L0011-k0a作为另一方抗体臂。

(2-3)与经蛋白酶切割了接头的抗原结合分子特异性结合的ADCC活性增强抗体的表达及纯化

识别经MMP13等切割的II型胶原蛋白的肽末端的抗体20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT是使组合轻链可变区20A10L(序列编号728)及轻链恒定区k0MT(序列编号729)的轻链20A10L-k0MT、对组合重链可变区20A10H(序列编号726)及重链恒定区Kn125(序列编号735)的重链20A10H-Kn125、及组合重链可变区20A10H(序列编号726)及重链恒定区H1076(序列编号736)的重链20A10H-H1076共同表达而制备的。

识别经IdeS切割的人IgG1肽末端的抗体20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC是使组合轻链可变区20952L(序列编号731)及轻链恒定区k0MTC(序列编号746)的轻链20952L-k0MTC、对组合重链可变区20952H(序列编号730)及重链恒定区H1076.G236E(序列编号737)的重链20952H-F760nN17、及组合重链可变区20952H(序列编号730)及重链恒定区Kn125(序列编号735)的重链20952H-Kn125共同表达而制备的。

编码这些抗体的基因分别插入动物表达用质粒，以(2-1)所述的方法表达及纯化。这些抗体增强对人FcγRIIIa的结合。

以下显示所制备的抗体结构的表。

[表1]

[实施例3]蛋白酶可切割抗体的体外切割评估

(3-1)评估含有蛋白酶可切割接头的抗体经重组蛋白酶的切割

针对插入了MMP可切割接头(II型胶原蛋白的部分)的人GPC3的人IgG1抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a是使组合轻链可变区GL4(序列编号740)及轻链恒定区k0a(序列编号729)的轻链GL4-k0a、对重链可变区H0000(序列编号738)分别组合重链恒定区LK4.col2.LK4.G1T4(序列编号739)或LK4.col2.LK4.G1T0(序列编号745)的重链分别为H0000-LK4.col2.LK4.G1T4或H0000-LK4.col2.LK4.G1T0共同表达而制备的。

针对不具有MMP可切割接头的人GPC3的人IgG1抗体H0000-G1T4/GL4-k0a或H0000-G1T0/GL4-k0a是使组合轻链可变区GL4(序列编号730)及轻链恒定区k0a(序列编号729)的轻链GL4-k0a、对重链可变区H0000(序列编号738)组合重链恒定区G1T4(序列编号741)或重链恒定区G1T0(序列编号742)的重链分别为H0000-G1T4或重链H0000-G1T0共同表达而制备的。

用实施例2-1的方法表达、纯化H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a。悬浮在TCNB(50mM Tris，10mM CaCl₂，150mM NaCl，0.05％Brij-35(w/v)，pH7.5)中的0.27mg/ml的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a，通过在含有1mM APMA的TCNB中于37℃活化2小时的终浓度为38nM的重组MMP13(R&amp；D systems，511-MM-010)，在37℃处理20小时。处理后的抗体经还原SDS-PAGE展开，分析经MMP13的切割。确认在H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a出现经MMP13切割的条带，但在H0000-G1T4/GL4-k0a则未发现切割(图7)。这个结果显示，发生经蛋白酶对抗体的切割是蛋白酶切割接头依赖性的。

IdeS可切割的抗人GPC3的人IgG1抗体H0000-G1T3/GL4-k0a是使组合轻链可变区GL4(序列编号740)及轻链恒定区k0a(序列编号729)的轻链GL4-k0a、对组合重链可变区H0000(序列编号738)及重链恒定区G1T3(序列编号743)的重链H0000-G1T3共同表达而制备的。

IdeS不可切割的抗人GPC3的人IgG1抗体H0000-dGG1T3/GL4-k0a，使组合轻链可变区GL4(序列编号740)及轻链恒定区k0a(序列编号729)的轻链GL4-k0a、对组合重链可变区H0000(序列编号738)及重链恒定区dGG1T3(序列编号744)的重链H0000-dGG1T3共同表达而制备的。

对在PBS中以0.27mg/ml悬浮的H0000-G1T3/GL4-k0a或H0000-dGG1T3/GL4-k0a，添加终浓度是0.1EU/μl的重组IdeS(Promega，V7511)，在37℃处理0或20小时。蛋白酶处理后的抗体经还原SDS-PAGE展开，分析经IdeS的切割(图8)。发现在H0000-G1T3/GL4-k0a出现经IdeS切割的条带。另一方面，在不含IdeS切割位点的H0000-dGG1T3/GL4-k0a未发现条带。此结果显示，发生经蛋白酶对抗体的切割是蛋白酶切割接头依赖性的。

以下显示在确认经蛋白酶的切割试验中所提供的抗体的结构表。

[表2]

另外，实施例记载的轻链恒定区k0a及k0MT为碱基序列不同的相同氨基酸序列。

[实施例4]与经蛋白酶切割的切割接头特异性结合的抗体、以及经蛋白酶切割的抗体之间的结合特异性的评估

(4-1)与经MMP切割的肽和人CD3结合的双特异性抗体对MMP处理抗体的结合评估

用实施例2所述方法制备的双特异性抗体20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，与具有MMP切割接头的抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不具有MMP切割接头的抗体H0000-G1T4/GL4-k0a的结合评估使用Biacore T200(GE Healthcare)进行。H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a经MMP13的切割用实施例3所述的方法进行。在感应芯片CM4上用胺偶联法固定全长抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a和其蛋白酶消化产物，以及作为阴性对照的H0000-G1T4/GL4-k0a，以20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a作为分析物，以流速20μl/分钟相互作用180秒，解离180秒，定量其结合量的变化。使用HBS-EP+为运行缓冲液，在37℃测定。测定结果的分析使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)，以1∶1结合模式通过曲线拟合计算结合速度常数ka(1/Ms)及解离速度常数kd(1/s)，基于该值计算解离常数KD(M)。从该结果可知，20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0对切割的H0000-LK4.col2.LK4-G1T4/GL4-k0a结合，但对未切割的H0000-LK4.col2.LK4-G1T4/GL4-k0a及不含切割接头的H0000-G1T4/GL4-k0a不结合(图10、表3)。

[表3]

ND：结合信号强度弱，因此不可定量

(4-2)与经IdeS切割的肽和人CD3结合的双特异性抗体对IdeS处理抗体的结合评估

用实施例2所述方法制备的双特异性抗体20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，与具有IdeS切割接头的抗体H0000-G1T3/GL4-k0a或不具有IdeS切割接头的抗体H0000-dGG1T3/GL4-k0a的结合评估使用Biacore T200(GEHealthcare)进行。H0000-G1T3/GL4-k0a的经IdeS的切割以实施例3记载的方法进行。在感应芯片CM4上用胺偶联法固定全长抗体H0000-G1T3/GL4-k0a和其蛋白酶消化产物、以及作为阴性对照的H0000-dGG1T3/GL4-k0a，以20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a作为分析物，以流速20μl/分钟相互作用180秒，解离180秒，定量其结合量的变化。使用HBS-EP+(GE Healthcare)为运行缓冲液，在37℃测定。测定结果的分析使用Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)，以1∶1结合模式(bindingmodel)通过曲线拟合计算结合速度常数ka(1/Ms)及解离速度常数kd(1/s)，基于该值计算解离常数KD(M)。从该结果可知，20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a对切割的H0000-G1T3/GL4-k0a结合，但对未切割的H0000-G1T3/GL4-k0及不含切割接头的H0000-dGG1T3/GL4-k0a不结合(图11、表4)。

[表4]

ND：结合信号强度弱，因此不可定量

(4-3)与经MMP切割的肽特异性结合的ADCC增强抗体对MMP处理抗体的结合评估

用实施例2(2-3)所述方法制备的ADCC增强抗体20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT，与具有MMP切割接头的抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不具有MMP切割接头的抗体H0000-G1T4/GL4-k0a的结合评估使用Biacore T200(GEHealthcare)进行。用实施例3记载的方法进行作为配体的切割后抗体的制备。用实施例4(4-1)记载的方法进行根据Biacore的测定。该结果显示，20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT结合切割后的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a，但不结合未切割的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及不含切割接头的抗体H0000-G1T4/GL4-k0a(图12、表5)。

[表5]

ND：结合信号强度弱，因此不可定量

(4-4)与经IdeS切割了接头的抗原结合分子特异性结合的ADCC增强抗体对IdeS处理抗体的结合评估

用实施例2所述方法制备的ADCC增强抗体20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC与具有IdeS切割接头的H0000-G1T3/GL4-k0a或不具有IdeS切割接头的H0000-dGG1T3/GL4-k0a的结合评估使用Biacore T200(GE Healthcare)进行。用实施例3记载的方法进行作为配体的切割后抗体的制备。用实施例4(4-2)记载的方法进行根据Biacore的测定。该结果显示，20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC结合切割后的H0000-G1T3/GL4-k0a，但不结合未切割的H0000-G1T3/GL4-k0a及不含切割接头的抗体H0000-dGG1T3/GL4-k0a(图13、表6)。

[表6]

ND：结合信号强度弱，因此不可定量

[实施例5]使用依赖CD3刺激或FcγR刺激而诱导报导基因表达的Jurkat细胞的报导基因测定法

(5-1)报导细胞的培养溶液的制备

将响应于CD3刺激而表达荧光素酶的Jurkat细胞株GloResponse^TMNFAT-RE-luc2Jurkat Cell Line(Promega)或响应于FcγR刺激而表达荧光素酶的Jurkat细胞株ADCCBioassay Effector Cells(Promega)在培养后，用包含10％FBS(HyClone，SH30070.03)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen，11360)、MEM非必需氨基酸(Invitrogen，11140)的RPMI-1640(Gibco，22400)(以下称为分析缓冲液)以3×10⁶个细胞/ml的细胞密度悬浮。所述细胞分别称为NFAT-RE-Luc2-Jurkat或Jurkat-hFcgR-luc，供后续实验使用。

(5-2)靶标细胞的制备

以公知方法培养表达作为肿瘤抗原的人GPC3的肿瘤细胞株PC-10(株式会社免疫生物研究所)、Hep3B(ATCC)及KYSE70(Health Science Research Resources Bank)或SK-pca-60(参照EP3296395)。将所述细胞悬浮于分析缓冲液，作为靶标细胞，供后续实验使用。

(5-3)插入了蛋白酶切割接头的抗体在靶标细胞中的切割评估

将实施例5(5-2)制备的5×10⁶个细胞/ml的PC-10、Hep3B及KYSE70以每25μl接种于96孔板(corning)(1.25×10⁵个细胞/孔)。接着，将插入了MMP可切割接头的人GPC3抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及未插入MMP可切割接头的抗体H0000-G1T4/GL4-k0a用分析缓冲液稀释至终浓度为1nM，添加50uL。将板在37℃、5％CO₂存在下温育0小时或24小时后，加入样本缓冲液，作为还原SDS-PAGE的检测样本。SDS-PAGE后，通过使用山羊抗人IgGHRP(H+L)缀合物(Invitrogen，目录号81-7120)的Western印迹法，检测检测样本中的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及H0000-G1T4/GL4-k0a之时，发现插入了MMP可切割接头的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a伴随着培养细胞中的抗体切割的条带的出现。另一方面，在未插入切割接头的抗体H0000-G1T0/GL4-k0a未发现切割(图9)。此结果显示，发生H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a的切割是蛋白酶切割接头依赖性的。另外，在KYSE70中，几乎未发现伴随着因H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a切割的条带的移动，表明KYSE70几乎未切割H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a。

(5-4)使用具有MMP切割接头的抗体及识别该抗体的切割产物和CD3的双特异性抗体的报导基因测定法

以NFAT-RE-Luc2-Jurkat细胞在TCR信号下游受到表达控制的荧光素酶的表达来评估受检抗体引起的CD3活化能力。首先，用实施例5(5-2)制备的4×10⁶个细胞/ml的PC-10、Hep3B及KYSE70以每孔接种25μl接种于96孔平底板(Coster，3917)(1×10⁵个细胞/孔)。接着，添加使用分析缓冲液制备成各浓度的含有MMP切割接头的抗人GPC3抗体溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0或不含MMP切割接头的抗人GPC3抗体H0000-G1T0/GL4-k0。接着，添加以分析缓冲液稀释至终浓度为10nM的抗切割接头抗体//抗人CD3双特异性抗体20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760n P17/L0011-k0a。再添加实施例5(5-1)制备的NFAT-RE-Luc2-Jurkat溶液各25μl(7.5×10⁴个细胞/孔)。将该板在5％二氧化碳气体培养箱中37℃静置一晚，反应后添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液(Promega)75μl。用读板机(EnVision，PerkinElmer)定量荧光素酶引起的发光。读板机的定量值以未添加受检抗体的情形的测定值进行校正。结果确认了，在具有切割H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0的蛋白酶活性的PC-10及Hep3B中，添加H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a和20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a，则NFAT-RE-Luc2-Jurkat细胞活化，另一方面，在添加H0000-G1T0/GL4-k0a和20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的情形，或者在不具有切割H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a的蛋白酶活性的KYSE70中，未确认到NFAT-RE-Luc2-Jurkat细胞的活化(图14)。由此结果表明，依赖被蛋白酶切割的H0000-LK4.col2.LK4.G1T0/GL4-k0a来诱导TDCC活性。

(5-5)使用具有Ides切割接头的抗体及与该抗体的切割了接头的抗原结合分子和CD3结合的双特异性抗体的报导基因测定法

以NFAT-RE-Luc2-Jurkat细胞在TCR信号下游受到表达控制的荧光素酶的表达来评估受检抗体引起的CD3活化能力。另外，IdeS为来自放线菌的蛋白酶，由于没有表达Ides的哺乳动物细胞，所以将蛋白酶添加于反应溶液。首先，用实施例(5-2)制备的5×10⁵个细胞/ml的SK-pca60以每孔接种25μl接种于96孔平底板(Coster，3917)(1.25×10⁴个细胞/孔)。接着，将含有IdeS切割接头的抗人GPC3抗体溶液H0000-G1T3/GL4-k0a或不含IdeS切割接头的抗人GPC3抗体H0000-dGG1T3/GL4-k0a使用分析缓冲液制备成各浓度，各添加12.5μl。接着，含有终浓度为10nM的抗切割接头抗体//抗人CD3双特异性抗体20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a及终浓度是0.2U/μl的IdeS的分析缓冲液，各添加12.5μl。再添加实施例5(5-1)制备的NFAT-RE-Luc2-Jurkat溶液各25μl(7.5×10⁴个细胞/孔)。将该板在5％二氧化碳气体培养箱中37℃静置一晚。反应后，添加Bio-Gloluciferase Assay System溶液(Promega)75μl，用读板机(EnVision，PerkinElmer)定量荧光素酶引起的发光。读板机的定量值以未添加受检抗体的情形的测定值进行校正。结果确认了，在添加被IdeS切割的抗体H0000-G1T3/GL4-k0a及20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的细胞悬浮液，Jurkat细胞活化，但在添加不被IdeS切割的H0000-dGG1T3/GL4-k0a及20952H-F760nN17/20952L-k0MTC//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a的情形，未发现NFAT-RE-Luc2-Jurkat细胞的应答(图15)。由此结果表明，依赖被IdeS切割的H0000-G1T3/GL4-k0a来诱导TDCC活性。

(5-6)使用具有MMP13切割接头的抗体及与该抗体的切割了接头的抗原结合分子结合的ADCC活性增强抗体的报导基因测定法

以Jurkat-hFcgR-luc细胞在FcγR信号下游受到表达控制的荧光素酶的表达来评估受检抗体引起的FcγR活化能力。首先，用实施例5(5-2)制备的3×10⁶个细胞/ml的靶标细胞PC-10、Hep3B、KYSE70以每孔接种25μl接种于96孔平底板(Coster，3917)(7.5×10⁴个细胞/孔)。接着，使用分析缓冲液制备成各浓度的含有MMP13切割接头的抗人GPC3抗体溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含MMP13切割接头的抗人GPC3抗体H0000-G1T4/GL4-k0a，添加12.5μl。接着，以分析缓冲液稀释至终浓度为3nM的与切割了接头的抗原结合分子结合的ADCC增强抗体20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT添加12.5μl。再添加实施例5(5-1)制备的Jurkat-hFcgR-luc溶液各25μl(7.5×10⁴个细胞/孔)。将该板在5％二氧化碳气体培养箱中37℃静置一晚，反应后添加Bio-Glo luciferaseAssay System溶液(Promega)75μl，用读板机(EnVision，PerkinElmer)定量荧光素酶引起的发光。读板机的定量值以未添加受检抗体的情形的测定值进行校正。结果确认了，在添加经MMP13切割的抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a及20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT的细胞悬浮液中，Jurkat细胞活化，但在添加不被MMP切割的H0000-G1T4/GL4-k0a及20A10H_Kn125/20A10L-k0MT//20A10H_H1076/20A10L-k0MT的情形，未发现Jurkat-hFcgR-luc细胞的应答(图16)。由此结果表明，依赖被MMP13切割的H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a来诱导ADCC活性。

(5-7)使用具有Ides切割接头的抗体及与该抗体的切割了接头的抗原结合分子结合的ADCC活性增强抗体的报导基因测定法

以Jurkat-hFcgR-luc细胞在FcγR信号下游受到表达控制的荧光素酶的表达来评估受检抗体引起的FcγR活化能力。另外，IdeS为来自放线菌的蛋白酶，由于没有表达IdeS的哺乳动物细胞，所以将蛋白酶添加于反应溶液。首先，用实施例5(5-2)制备的靶标细胞SK-pca60以细胞密度为2.5×10⁴个细胞/ml悬浮，在96孔平底板(Coster，3917)每孔接种25μl接种(2.5×10⁵个细胞/孔)。接着，将含有IdeS切割接头的抗人GPC3抗体溶液H0000-G1T3/GL4-k0a或不含IdeS切割接头的抗人GPC3抗体H0000-dGG1T3/GL4-k0a，使用分析缓冲液制备成各浓度，各添加12.5μl。接着，含有稀释成终浓度是0.5nM的ADCC增强抗体20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MT的分析缓冲液，各添加12.5μl。再添加实施例5(5-1)制备的Jurkat-hFcgR-luc溶液各25μl(7.5×10⁴个细胞/孔)。添加IdeS终浓度是0.033U/μl。将该板在5％二氧化碳气体培养箱中37℃静置一晚。反应后，添加Bio-Glo luciferase Assay System溶液(Promega)75μl，用读板机(EnVision，PerkinElmer)定量荧光素酶引起的发光。读板机的定量值以未添加受检抗体的情形的测定值进行校正。结果确认了，在添加被IdeS切割的抗体H0000-G1T3/GL4-k0a及20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC的细胞悬浮液，Jurkat-hFcgR-luc细胞活化，但在添加不被IdeS切割的H0000-dGG1T3/GL4-k0a及20952H-H1076.G236E/20952L-k0MTC//20952H-Kn125/20952L-k0MTC的情形，未发现ADCC Bioassay Effector细胞(ADCC生物分析效应细胞)的应答(图17)。由此结果表明，依赖被IdeS切割的H0000-G1T3/GL4-k0a来诱导ADCC活性。

[实施例6]使用具有MMP13切割接头的抗体及经切割的该抗体和人CD3双特异性抗体确认体外的细胞毒性

对健康人提供者进行肝素采血，用PBS(nacalai#14249-95)稀释后，置于Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)上。以1000g离心30分钟，分离外周血单个核细胞(PBMC)级分。在RPMI 1640(Sigma R8758)+10％FBS(Sigma 172012-500ML)(培养基)中制备所获得的PBMC。使用培养基制备成各浓度的含有MMP切割接头的抗人GPC3抗体溶液H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含切割接头的抗人GPC3抗体H0000-G1T4/GL4-k0a，添加于96孔圆底板(Corning)，再添加稀释成终浓度10nM的双特异性抗体20A10H-F760nN17/20A10L-k0MT//TR01H113-F760nP17/L0011-k0a。用实施例5(5-2)记载的方法制备的PC-10作为靶标细胞，接种成1×10⁵个细胞/孔。添加制备的PBMC成2×10⁵个细胞/孔。在37℃、5％CO₂培养该板。24小时后，使用Pierce LDH细胞毒性分析试剂盒(Thermo fisherscientific，88954)，根据本领域技术人员指定的方法定量LDH量。结果显示，在添加插入了MMP13切割接头的抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a的检测样本中，发现添加的抗体浓度依赖性的LDH释放，但在添加不具有MMP13切割接头的抗体H0000-G1T4/GL4-k0a的检测样本中，未发现LDH的释放。根据本研究，可知对表达肿瘤特异性蛋白酶的人肿瘤细胞，显示特异性细胞毒性。由此结果可期待，针对切割了接头的抗原结合分子和CD3的双特异性抗体，即使在人体内也能发挥肿瘤特异性细胞毒性(图18)。

[实施例7]作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物的制备

对靶标抗原显示结合性的VHH可从骆驼科动物的PBMC等制备的文库进行筛选等，根据本领域技术人员公知的方法获得，根据WO/2018/097307、WO/2018/097308所示方法，将序列编号1～725的蛋白酶切割接头之一与人IgG基因的部分序列进行基因融合。将所制备的碱基序列插入哺乳动物细胞用表达载体，根据实施例2-1的方法，表达、纯化抗体药物，所述抗体是具有靶标抗原结合活性的VHH为蛋白酶依赖性游离的抗体。

[实施例8]作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物的、与切割了接头的抗原结合分子特异性结合的抗体的取得

(8-1)与蛋白酶切割接头的切割位点特异性结合的抗体的取得

用通过肽的合成等本领域技术人员公知的方法制备WO2018/097307及WO2018/097308所示的蛋白酶切割接头(序列编号1～725)任一个(是与实施例7选择的序列相同的序列)以及该肽的切割了接头的抗原结合分子，以与KLH等缀合而作为缀合物通过本领域技术人员公知的方法免疫兔。从已免疫的兔血液或脾脏采集的细胞悬浮液，使用autoMACSPro Separator和FACSAria(BD)，筛选出与切割了接头的抗原结合分子具有结合活性的候选细胞。接着，ELISA法评估细胞的培养上清液所分泌的抗体是否具有与切割了接头的抗原结合分子的结合活性。ELISA法中，应答值超过对照值的检测样本，挑选为与切割了接头的抗原结合分子结合的抗体(正向选择)。另一方面，对被选出的该抗体，从对未经蛋白酶处理的蛋白酶切割接头不结合来筛选不与未切割的肽序列结合(负向选择)。通过一连串的筛选，获得了与切割了接头的抗原结合分子结合且与未切割的蛋白酶切割接头不结合的抗体。

(8-2)与经蛋白酶切割的切割了接头的抗原结合分子VHH特异性结合的抗体的取得

将实施例7获得的、对靶标抗原具有结合性的VHH作为免疫原，以本领域技术人员公知的方法免疫兔。从已免疫的兔血液或脾脏采集的细胞悬浮液，使用autoMACS ProSeparator和FACSAria(BD)，筛选对VHH具有结合活性的候选细胞。接着，ELISA法评估细胞的培养上清液所分泌的抗体是否对切割了接头的抗原结合分子的VHH具有结合活性。ELISA法中，应答值超过对照值的检测样本，挑选为与VHH结合的抗体(正向选择)。另一方面，对被选出的该抗体，从对实施例7所制备的、未经蛋白酶处理的抗靶标抗原VHH-蛋白酶切割接头-人IgG融合蛋白不结合来筛选不识别非游离VHH(负向选择)。通过一连串的筛选，获得了与蛋白酶切割了接头的抗原结合分子VHH结合且与非游离的VHH不结合的抗体。

(8-3)与经蛋白酶切割而切割了接头的抗原结合分子特异性结合的抗体的制备

使用PCR法从表达实施例8-1或实施例8-2所获得的抗体的B细胞获得重链可变区基因及轻链可变区基因。获得的可变区基因用PCR等本领域技术人员公知的方法，与人IgG1重链恒定区和人轻链恒定区组合并表达、人源化，根据实施例2-1的方法表达、纯化。分别根据实施例2-2及实施例2-3记载的方法制备针对人CD3及切割了接头的抗原结合分子的双特异性抗体或识别切割了接头的抗原结合分子的ADCC增强抗体。

[实施例9]使用作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物以及识别该分子的切割了接头的抗原结合分子和人CD3的双特异性抗体的报导基因测定法

使用实施例8制备的针对人CD3和经切割的肽序列的双特异性抗体，及实施例7制备的作为可切割接头的抗原结合分子的、作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物作为受检检测样本，确认受检检测样本蛋白酶活性依赖的CD3活化能力。受检检测样本的报导基因测定法根据实施例5-4记载的方法进行。对于表达蛋白酶及靶标抗原的靶标细胞，添加作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物。检测了样本分子被蛋白酶切割，作为切割了接头的抗原结合分子的VHH游离，与靶标细胞结合。接着，由识别切割了接头的抗原结合分子及人CD3的双特异性抗体经切割了接头的抗原结合分子介导将靶标细胞和效应细胞的CD3桥连。由此，诱导效应细胞的荧光素酶表达，通过监视该荧光素酶的表达，确认效应细胞的活化。

[实施例10]使用作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物以及特异性识别自该分子游离的靶标抗原结合分子的ADCC活性增强抗体的报导基因测定法

使用实施例8所制备的针对经切割的肽序列的ADCC增强抗体，及实施例7所制备的作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物作为受检检测样本，确认受检检测样本的蛋白酶活性依赖的FcγR活化能力。ADCC增强抗体的报导基因测定法根据实施例5-6记载的方法进行。对于表达蛋白酶及靶标抗原的靶标细胞，添加作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物。检测了样本分子被蛋白酶切割，具有靶标抗原结合活性的VHH游离，与靶标细胞结合。接着，由与切割了接头的抗原结合分子特异性结合的ADCC增强抗体经切割了接头的抗原结合分子介导将靶标细胞和效应细胞的FcγR桥连。由此，诱导效应细胞的荧光素酶表达，通过监视该荧光素酶的表达，确认效应细胞的活化。

[实施例11]使用识别蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子和人CD3的双特异性抗体以及作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物的细胞毒性的确认

使用实施例8制备的针对人CD3和蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子的双特异性抗体，及实施例7所制备的作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子VHH被释放的抗体药物作为受检检测样本，确认受检检测样本的蛋白酶活性依赖的细胞毒性。对健康人提供者进行肝素采血，用PBS(nacalai#14249-95)稀释后，置于Ficoll-Paque Plus(GE healthcare)上。以1000g离心10分钟，分离外周血单个核细胞(PBMC)级分。所获得的PBMC在RPMI 1640(Nacalai Tesque)培养基以2×10⁵个细胞/孔接种于96孔圆底板(Corning)。添加使用RPMI制备成各浓度的作为蛋白酶依赖性地切割了接头的抗原结合分子的VHH被释放的抗体药物，再添加抗切割了接头的抗原结合分子VHH//抗人CD3双特异性抗体。接种表达靶标抗原及可切割受检检测样本的蛋白酶切割接头的蛋白酶的细胞作为靶标细胞。在37℃、5％CO₂培养该板。24小时后，使用Pierce LDH细胞毒性分析试剂盒(Thermofisher scientific，88954)根据本领域技术人员指定的方法定量LDH量。根据本研究，可知对表达肿瘤特异性蛋白酶的人肿瘤细胞显示特异性的细胞毒性。

[实施例12]利用与切割了接头的抗原结合分子特异性结合的抗体的泛用CAR-T的制备

利用实施例8-1或8-2获得的与切割了接头的抗原结合分子特异性结合的抗体，制备与切割了接头的抗原结合分子结合的嵌合受体。将实施例8-1或8-2获得的切割了接头的抗原结合分子的抗体的scFv称为抗切割了接头的抗原结合分子-scFv。使用实施例7制备的VHH等游离分子作为切割了接头的抗原结合分子。对于抗切割了接头的抗原结合分子-scFv，经PCR等与编码跨膜区及胞质区的碱基序列连接。将此序列插入公知的病毒载体等，生成表达针对切割了接头的抗原结合分子的CAR(称为抗切割了接头的抗原结合分子-CAR)的病毒载体。再使用公知的病毒转导方法，制备表达与切割了接头的抗原结合分子结合的抗切割了接头的抗原结合分子抗体的scFv的CAR-T。即使靶标抗原为任一种肿瘤抗原，该细胞也为可以与切割了接头的抗原结合分子结合、并经切割了接头的抗原结合分子活化的泛用CAR-T。

[实施例13]针对切割了接头的抗原结合分子的泛用CAR-T在体外的细胞毒性的评估

可以使用LDH释放测定法、流式细胞术的测定法、或使用xCELLigence的测定法(WO2016/047722)等评估实施例12制备的针对VHH等切割了接头的抗原结合分子的泛用CAR-T细胞(抗切割了接头的抗原结合分子-CAR)的细胞毒性。准备SK-Hep1作为阴性对象，在SK-Hep1稳定表达人GPC3的SK-pca60等作为靶标细胞。将阴性对象及靶标细胞接种于板，开始xCELLigence实时细胞分析仪的测定。一晚培养后，混合抗切割了接头的抗原结合分子-CAR表达细胞作为效应细胞。接着，添加仿效实施例7的方法制备的抗切割了接头的GPC3抗原结合分子-蛋白酶切割接头-人IgG融合蛋白。再将该板设置于xCELLigence实时细胞分析仪，从5％CO₂、37℃培养72小时后的Index值求得细胞增殖抑制率(％)。

以残存癌细胞的比例来评估细胞毒性。残存癌细胞的比例以活细胞中CD45-级分的细胞的比例计算。

即使靶标抗原为GPC3以外的抗原，也同样地可以通过使用靶标抗原表达细胞及具有对该抗原的抗原结合结构域的一级分子，本泛用CAR-T产生靶标组织特异性的细胞毒性。

[实施例14]与MMP可切割接头经切割的抗原结合分子结合的泛用CAR-T的制备

(14-1)表达与MMP可切割接头经切割的抗原结合分子结合的嵌合受体的反转录病毒载体的构建

制备表达识别MMP可切割接头经切割的抗原结合分子的抗体的scFv的嵌合受体的反转录病毒载体。使用pMSGV1-CD8-28BBZ(Hughes M.S.等人，Hum Gene Ther 2005Apr；16(4)：457-72，由Richard Morgan博士(美国国立癌研究所)获得)作为反转录病毒载体骨架，及使用pMSGV(Tamada k等人，Clin Cancer Res 18：6436-6445(2002))作为基于小鼠干细胞病毒的splice-gag载体。图19为载体构建体及从5’端到3’端的构架单位的构成要件的配置顺序的概略图。识别MMP可切割接头经切割的抗原结合分子的人scFv称为20A10VH25VL-scFv。该scFv由重链可变区、后接的25个氨基酸的接头及轻链可变区组成(序列编号747)。将20A10VH25VL-scFv连接至人CD8α链(核苷酸序列1271～1519，Genbank NM001768.6)的铰链区及跨膜区、以及人CD28分子(核苷酸序列760～882，Genbank NM006139.2)、4-1BB分子(核苷酸序列886～1026，Genbank NM001561.5)、CD3ζ分子(核苷酸序列299～634，GenbankNM000734.3)的胞质区、再连接2A肽(F2A)(来自口蹄疫病毒)和eGFP分子(核苷酸序列5521～6237bp，Genebank KF957646.1)。用本领域技术人员已知的方法合成编码20A10VH25VL-scFv-CAR(序列编号：748)的基因。将该序列连接入pMSGV1，生成20A10VH25VL-scFv-CD28-4-1BB-CD3ζ-eGFP-CAR反转录病毒载体(称为20A10VH25VL-scFv-CAR载体)。

(14-2)泛用CAR-T的制备

使用人T细胞的反转录病毒转导方法、使用(14-1)所构建的20A10VH25VL-scFv-CAR载体，制备识别MMP可切割接头经切割的抗原结合分子的泛用CAR-T。

具体地，首先，通过Lipofectamine 2000或3000(Life Technologies)，将上述20A10VH25VL-scFv-CAR载体和pAmpho质粒(Takara Bio)转染入GP2-293包装细胞株(Takara Bio)，制备导入了20A10VH25VL-scFv-CAR载体的反转录病毒。从转染开始48小时后，回收含有上述反转录病毒的上清液，吸附于2个24孔板，制备转导用板。

接着，为了转导人T细胞，在固定有抗CD3单克隆抗体及RetroNectin(注册商标：Takara Bio)的6孔板上，于IL-2存在下培养每孔2×10⁶个人外周血单个核细胞72小时。回收培养后的细胞，在IL-2存在下，在吸附有上述制备的20A10VH25VL-scFv-CAR反转录病毒的转导用板上培养一晚之后，次日将细胞再移到另1个转导用板，再培养一晚，获得导入20A10VH25VL-scFv-CAR载体的人T细胞(20A10VH25VL-scFv-CAR表达T细胞)。

(14-3)CAR蛋白质表达率的确认

转导后，在人IL-2存在下维持细胞，从开始培养已转导的外周血单个核细胞7～8日后用于实验。以CD8及生物素标记的蛋白酶切割肽(序列编号749)染色细胞后，通过流式细胞术确定转导的人T细胞中20A10VH25VL-scFv-CAR的表面表达。确认了全部T细胞的约60％表达20A10VH25VL-scFv-CAR。

[实施例15]针对MMP可切割接头经切割的抗原结合分子的泛用CAR-T在体外的细胞毒性的评估

用CytoFLEX S(BECKMAN COULTER)评估了实施例15-1制备的针对可切割接头经切割的抗原结合分子的泛用CAR-T细胞(20A10VH25VL-scFv-CAR-T)的细胞毒性。准备KYSE70作为阴性对象，PC-10作为靶标细胞。尽管任一KYSE70、PC-10均表达GPC3，但是根据实施例5(5-3)的结果，KYSE70几乎不能切割MMP可切割接头，相反地，PC-10能切割MMP可切割接头。将阴性对象和靶标细胞分别以1×10⁵个细胞和1×10⁵个细胞接种于24孔板。以20A10VH25VL-scFv-CAR-T作为效应细胞，以1×10⁵个细胞混合使效应细胞对靶标细胞(E∶T)的比例为1∶1。接着，添加实施例2制备的含有可切割接头的抗GPC3抗体H0000-LK4.col2.LK4.G1T4/GL4-k0a或不含可切割接头的H0000-G1T4/GL4-k0a。从添加到48小时后，回收CAR-T细胞及靶标细胞。回收的细胞使用Zombie YellowTM Fixable ViabilityKit(BioLegend，423104)染色死细胞，使用抗人CD45抗体(BioLegend，304039)染色CAR-T细胞。

以残存癌细胞的比例来评估细胞毒性。残存癌细胞的比例以活细胞中CD45-级分的细胞的比例计算。这些结果显示于图20及21。

由此结果，显示了在体外与可切割接头经切割的抗原结合分子结合的泛用CAR-T的细胞毒性。

[表7-1]

[表7-2]

[表7-3]

[表7-4]

产业可利用性

根据本发明，提供了经蛋白酶作用而产生的活化抗体的血液中半寿期短，在不发生经蛋白酶的切割时则不发挥药理作用的分子群或使用其的具有ADCC活性的抗体疗法、双特异性抗体疗法和/或CAR-T疗法。

即，根据本发明的分子群，依赖在病变部位高表达的蛋白酶及靶标抗原两者，特异性发挥包括ADCC或TDCC活性的效应物作用，当可切割接头被切割时，所产生的切割了接头的抗原结合分子快速被代谢，对于在正常组织表达的抗原，效应细胞作用的可能性变低，即使在高浓度施用时安全性也极高的理想治疗成为可能。