TW202110332A - 營養組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種包含碳水化合物、蛋白質和脂肪組成成分之營養組成物，其中 (a) 該營養組成物具有以乾物質計至少3.5 g/kg的總鈣含量；(b) 該蛋白質包括酪蛋白；(c) 該營養組成物具有每10克酪蛋白7.5毫莫耳或更少的蛋白結合鈣含量；並且 (d) NPN與TN的比率為0.7或更少，並且：- NPN表示該營養組成物中的非蛋白氮，以每100克營養組成物中的克數計（g/100 g）；並且 - TN表示該營養組成物中的總氮（TN），以g/100 g計。本發明還關於一種用於製備呈粉末形式的營養組成物之方法、及該組成物在預防人類受試者、特別0至36月齡的人類受試者中的腸道不適和便秘中之用途。

Description

營養組成物
本發明關於一種營養組成物、一種用於製備呈粉狀形式的這種組成物之方法、和該營養組成物之特定用途。
營養學家長期以來一直認為，提供給年齡為至少6個月的嬰兒的最佳食物或營養係其自己母親的奶；即，新鮮人乳。然而，認識到在許多情況下嬰兒無法用母乳進行餵養，因此已製備了基於牛乳的配方並且用於給嬰兒提供營養。該等配方含有酪蛋白與乳清蛋白之混合物，以提供與母乳盡可能接近的胺基酸譜。業界已作出了很多努力以改善嬰兒配方奶粉使其更接近於母乳。還給年齡超過6個月的較大兒童餵養呈後續配方和成長配方奶形式的用於斷奶目的之配方。重要的是，嬰兒配方以及後續配方和成長配方奶均顯示理想的胃消化特性。
人乳與牛乳的蛋白質系統在量和質上都有實質性差異。在量上的顯著差異包括與牛乳（33-35 g/L）相比人乳（11 g/L）的總蛋白質含量較低，該總蛋白質含量常常表示為總氮含量乘以6.25或6.38。乳中的總含氮組分可以分為真蛋白氮和非蛋白氮（NPN），其中酪蛋白和血清蛋白（後者亦稱為乳清蛋白）係主要類別之蛋白質。酪蛋白係在pH 4.6下發生沈澱的來自乳之蛋白質，而乳清蛋白在此pH值下仍然可溶。在成熟的人乳中乳清蛋白與酪蛋白的比率典型地約為60 : 40至50 : 50，而在牛乳中乳清蛋白與酪蛋白的比率約為18 : 82。
儘管嬰兒配方隨著時間的推移已變得越來越好，但人乳與基於牛乳的嬰兒配方之間仍然存在重要的差異，這會導致用這種嬰兒配方餵養的嬰兒遭受腸道不適和/或甚至由胃消化不良所引起便秘。這會導致嬰兒哭泣的次數增加，因此導致父母更加焦慮。相比之下，母乳餵養的嬰兒表現出頻繁的稀/水樣便，這相應地導致更好的腸道舒適性。
使用嬰兒配方時引起腸道不適的重要原因係在胃消化期間在胃中形成凝乳。這種凝乳係藉由酪蛋白膠束阻塞到一起而形成。如果形成過多的這種固體凝乳，那麼胃排空變得更加困難並且會導致腸道不適或甚至便秘感覺。
本發明旨在提供一種營養組成物，其藉由避免或以任何方式顯著地減少在胃消化過程期間胃中的凝乳形成而表現出改善的胃消化特性，由此促進胃排空並改善腸道舒適性。
已發現藉由仔細地控制營養組成物中鈣的量（特別是蛋白結合鈣的量）可以顯著地減少或甚至避免胃中的凝乳形成，由此改善胃消化。因此，本發明關於一種營養組成物，其中蛋白質組分包括酪蛋白膠束，該酪蛋白膠束具有每10克酪蛋白7.5毫莫耳或更少的蛋白結合鈣含量並且總鈣含量為至少3.5 g/kg，並且非蛋白氮（NPN）與總氮（TN）的比率為0.7或更少。
本發明進一步關於一種用於製備呈粉狀形式的這種營養組成物之方法，其中在製備期間的某些時刻添加鹽（有時亦稱為礦物質），其包括 (i) 鈣結合酸或其水溶性鈣鹽及 (ii) 至少一種選自檸檬酸鈣、磷酸鈣和碳酸鈣的鈣鹽。
在第一方面，本發明關於一種營養組成物，其包含碳水化合物、蛋白質和脂肪組成成分，其中： (a) 該營養組成物具有以乾物質計至少3.5 g/kg的總鈣含量； (b) 該蛋白質包括酪蛋白； (c) 該營養組成物具有每10克酪蛋白7.5毫莫耳或更少、較佳的是在3和6毫莫耳之間的蛋白結合鈣含量；和 (d) NPN與TN的比率為0.7或更少、較佳的是在0.01和0.5之間、更較佳的是在0.03和0.3之間、最較佳的是在0.05和0.15之間，並且： - NPN表示該營養組成物中的非蛋白氮，以每100克營養組成物中的克數計（g/100 g）；並且 - TN表示該營養組成物中的總氮（TN），以g/100 g計。
鈣係該營養組成物中需存在的重要元素。最低水平係由相關法規所規定。鈣可以來自各種來源，如來自任何基於乳的成分，尤其是脫脂乳、全脂乳和/或奶油，或者來自單獨添加的一種或多種的鈣鹽。為了本發明之目的，重要的是在該營養組成物中以乾物質計的總鈣含量為每千克至少3.5克的Ca（g/kg）。較佳的是，以乾物質計，總鈣含量在3.5至9.5 g/kg、更較佳的是3.6至8.0 g/kg的範圍內。如標準方法ISO 21424: 2018（IDF 243）-乳 、乳製品、 嬰兒配方和成人營養品 - 礦物質和微量元素的測定 - 電感耦合電漿質譜法（ ICP-MS ）所述，可以使用電感耦合電漿質譜法（ ICP-MS ） 確定鈣含量。
該營養組成物中的鈣可以基本上來自兩個來源。首先，鈣可以來自用作該營養組成物的原料之乳製品成分。這類乳製品成分可以例如包括奶油、脫脂乳、全脂乳和/或乳清成分（如天然乳清、脫鹽乳清、或兩者的組合）。其次，鈣也可以源自所添加的鈣鹽。這類鈣鹽應係可允許用於食品、特別是嬰幼兒營養組成物的鹽。合適的鈣鹽的實例係檸檬酸鈣、磷酸鈣和碳酸鈣。也可以使用兩種或更多種的這類鈣源之組合。如熟悉該項技術者將理解的，磷酸鈣鹽可以以不同的形式出現。為了本發明之目的，磷酸鈣鹽可以呈各種形式，條件係在每一種情況下一莫耳的該鹽含有至少一莫耳的鈣和一莫耳的正磷酸鹽。合適的實例包括磷酸氫鈣、磷酸二氫鈣、磷酸鈣、二磷酸二鈣、三磷酸鈣、和磷酸三鈣。
本發明之營養組成物包含蛋白質組分。已發現關鍵的是，與所存在的蛋白質結合的鈣受到仔細的控制並且不應超過某個值，從而最小化或甚至完全地避免胃中的凝乳形成。如上所示，奶牛的乳蛋白可以分為酪蛋白和血清蛋白（亦稱為乳清蛋白）。牛乳中乳清蛋白與酪蛋白的比率大約為18 : 82。在中性條件下，絕大多數的酪蛋白將以膠束的形式存在。在牛乳中，鈣可以以（溶解的）鹽和蛋白結合鈣的形式存在。大部分的蛋白結合鈣（大於90 wt%、典型地大於95 wt%）將結合到酪蛋白和酪蛋白膠束中，其餘的蛋白結合鈣高達100%與乳清蛋白締合。已發現，特別地此蛋白結合鈣在胃中的凝乳形成中起重要作用。因此，在本發明之營養組成物中，這種蛋白結合鈣的含量應為每10克酪蛋白7.5毫莫耳或更少、較佳的是在3毫莫耳和6毫莫耳之間。
通常，營養組成物中蛋白結合鈣的量係如下確定的。參照圖1之過程示意圖，首先使液體營養組成物NC（如果呈粉末形式，那麼首先使營養組成物在水中復原）在20°C下平衡1小時並且在20°C下以200 x g離心15分鐘以除去不溶的鈣鹽，隨後將沈澱團塊（PEL1）與上清液（SUP）分離。隨後使SUP在20°C下平衡2小時，之後在20°C下以100,000 x g離心60分鐘。將所得到的液體血清層（SER）與乳油層（CRE）和沈澱團塊（PEL2）分離，隨後經過10 kDa膜進行過濾以獲得樣本的10 kDa可滲透級分（滲透物，PER10kD）。藉由上述的ICP-MS法，確定SUP（上清液）和PER10kD中的總鈣（＜Ca＞）濃度，以克/千克（g/kg）計。然後，按照乳中不滲透經過10 kDa膜的鈣之分數，確定蛋白結合鈣的濃度（PBCa，以g/kg計）： PBCa = SUP中的＜Ca＞ - PER10kD中的＜Ca＞
如ISO17997/IDF 29-1-酪蛋白氮含量的測定 - 第 1 部分 - 間接法（參考方法） 所述，確定基於乳的液體中的酪蛋白氮含量（CN）（以g/100 g產品計）。基於乳的液體（Cas）中的酪蛋白含量（以g/100 g計）則為： Cas = 基於乳的液體中的CN*6.38
營養組成物中的酪蛋白含量（Cas）也可以按不同方式進行確定，特別是如果組成物的加工歷史係未知的並且在這種加工期間已發生乳清蛋白變性的話。在這種情況下，乳清蛋白中的一些被確定為上述方法ISO 17997/IDF 29-1中的CN，因此將出現CN的不準確值，並且所得到的酪蛋白含量將是不正確的。然而，當使用下述的更複雜方法時，將會始終獲得正確的酪蛋白含量。
因此，在此用於確定營養組成物中酪蛋白含量的更複雜方法中，首先確定組成物的總氮含量（TN）、非蛋白氮（NPN）和胺基酸組成。使用如方法ISO 8968-1/IDF 020-1（乳和乳製品 - 氮含量的測定 - 第 1 部分：凱氏原理和粗蛋白質計算） 所述之凱氏定氮法，確定TN。如方法ISO 8968-4/IDF 020-4（乳和乳 製品 - 氮含量的測定 - 第 4 部分：非蛋白氮含量的測定） 所述，確定NPN。 TN和NPN兩者均以每100克營養組成物的克數（g/100 g）表示。胺基酸組成係藉由基於AOAC法定方法994.12 -餵養中的胺基酸 中所描述方法的離子交換層析法進行測定。隨後如AOAC法定方法2012.7（基於乳的嬰兒配方中乳清蛋白的分數的計算 ）所述，由胺基酸脯胺酸（Pro）、苯丙胺酸（Phe）、天冬胺酸加天冬醯胺（Asp + Asn）和丙胺酸（Ala）的濃度，計算該營養組成物中乳清蛋白與酪蛋白的比率。基於TN和NPN，可以按照(TN-NPN)*6.38計算出總蛋白含量。隨後可以基於總蛋白含量和乳清蛋白與酪蛋白的比率，確定該營養組成物中的酪蛋白含量（以g/100 g計）。
然後，藉由使用以下公式，按照每10克酪蛋白的蛋白結合鈣的以毫莫耳計的量，計算出蛋白結合鈣的量（即PBCa/Cas比率）： PBCa/Cas = 1000*[PBCa/MW（Ca）] Cas
其中MW（Ca）係鈣的莫耳重量，以g/mol計（= 40 g/mol）；PBCa係蛋白結合鈣，以g/kg計；Cas係酪蛋白的量，以g/100 g計（其等於量*10 g/kg）。蛋白結合鈣的量係在約7的標準pH（即6.5和7.5之間）下確定的。
為了確保蛋白結合鈣的量低於7.5毫莫耳/10克酪蛋白之閾值，在營養組成物的製備中可能需要採取特定措施。然而，也可能的是，某些奶牛品種產生具有在期望範圍內的蛋白結合鈣含量的乳。另一方面，如果需要採取特定的措施，這典型地將包括使用一種或多種鈣結合物質，該等物質可允許使用於食品和具體地嬰兒配方，接著使用於配方和成長配方奶。因此，可以使用可以在食品中使用的鈣結合酸或其水溶性鹽。合適的實例係檸檬酸和檸檬酸鹽。因為鉀和鈉通常也是以鹽的形式而添加，所以較佳的是使用檸檬酸鉀和/或檸檬酸鈉作為鈣結合物質。所使用的一種或多種鈣結合物質的量將取決於在用作原料的乳中的蛋白結合鈣水平。除了或者代替鈣結合物質的添加，使蛋白結合鈣達到正確水平的措施也可以包括添加酪蛋白酸鹽作為低鈣酪蛋白源、或者加工原料乳以減少蛋白結合鈣的量。這種加工可以包括在特定條件下的膜過濾、用離子交換樹脂處理原料乳、和/或使乳經歷電滲析處理。
營養組成物中NPN與TN的比率應為0.7或更少、較佳的是在0.01和0.5之間、更較佳的是在0.03和0.3之間、最較佳的是在0.05和0.15之間。通常，營養組成物中的高NPN/TN比率（即，高於0.7）係在該等產品中使用廣泛水解蛋白質的指示。本發明之一個關鍵方面係存在於營養組成物中的大部分蛋白質具有其天然形式並因此處於非水解狀態。
使用如方法ISO 8968-1/IDF 020-1（乳和乳製品 - 氮含量的測定 - 第 1 部分：凱氏原理和粗蛋白質計算） 所述之凱氏定氮法，確定總氮（TN）。另外，如方法ISO 8968-4/IDF 020-4（乳和乳 製品 - 氮含量的測定 - 第 4 部分：非蛋白氮含量的測定） 所述，確定復原樣本的非蛋白氮含量（NPN）。TN和NPN兩者均以每100克營養組成物的克數（g/100 g）表示。
營養組成物中所使用的脂肪組成成分原則上可以是已知用於嬰兒配方和幼兒配方的任何脂肪組成成分。這種脂肪組成成分可以由在製備過程中的不同階段所添加的兩種或更多種的組分所組成。然而，較佳的是，所使用總脂肪組成成分的至少部分係源自牛乳脂肪。更具體地，較佳的是，基於該脂肪組成成分的總重量，該脂肪組成成分包含至少20重量%、較佳的是至少45重量%的源自牛乳脂肪源的三醯基甘油（TAG）。較佳的牛乳脂肪源係全脂乳、奶油、和無水乳脂肪。可以使用該等牛乳脂肪源中的任一種以及該等牛乳脂肪源中的兩種或更多種之任意組合。
在一個特別較佳的實施方式中，本發明營養組成物中所使用的脂肪組成成分包含 (a) 基於TAG中的脂肪酸醯基的總重量0.5重量%-2.2重量%、較佳的是0.6重量%-2.0重量%的丁酸酯基（C4 : 0）；和 (b) 基於TAG中的脂肪酸醯基的總重量18.0重量%-35.0重量%、較佳的是19.0重量%-32.0重量%的在TAG的sn-1和sn-3位的長鏈飽和脂肪酸醯基，該長鏈飽和脂肪酸醯基具有12個或更多碳原子的鏈長。
可以藉由標準方法ISO 15884/IDF 182: 2002（乳脂肪 - 脂肪酸甲酯的製備 ）和ISO 15885/IDF 184（藉由氣液層析法測定乳脂肪 - 脂肪酸組成成分 ）確定脂肪組成成分中不同脂肪酸的含量。 可以根據Luddy, F. E., Barford, R. A., Herb, S. F., Magidman, P. 和Riemenschneider, R. W.J. Am. Oil Chem. Soc. [美國油脂化學社雜誌], 41, 693-696 (1964) 中所揭露之方法，確定脂肪酸在甘油主鏈上的分佈。在本質上，此方法包括利用sn-1,3特異性胰脂肪酶（豬）將TAG（三醯基甘油）水解。藉由薄層層析法將所需的形成的2-單醯基甘油進行分離，隨後將它們甲基化以便進行氣相層析分析並且以莫耳濃度進行定量。藉由以下公式，由總脂肪中此脂肪酸的莫耳濃度 [FA-TAG] 和sn-2位 [FA(sn-2)] 的此脂肪酸的莫耳濃度計算甘油主鏈的sn-1,3位 [FA(sn-1,3)] 的脂肪酸的莫耳濃度：
Figure 02_image001
本發明之營養組成物還包含碳水化合物。典型地，這類碳水化合物將主要地由乳糖組成。也可以包含其他碳水化合物成分，如低聚糖（例如，低聚果糖和/或低聚半乳糖）。在一個特別較佳的實施方式中，本發明之營養組成物還包含至少一種人乳低聚糖。合適的人乳低聚糖包括岩藻糖基化乳糖，特別是2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）和3-岩藻糖基乳糖（3-FL）、乳糖-N-四糖（LNT）、乳糖-N-新四糖（LNnT）和6’-唾液酸苷乳糖（6’-SL）。其中，最較佳的是2’-FL。如果存在，以乾物質計，營養組成物中人乳低聚糖的總量合適地為每100克0.05至2.0克、更合適地0.1至1.0克（g/100 g）。
該營養組成物特別適合於0至36月齡的人類受試者，特別是嬰兒（0-12月齡的人，根據食品法典委員會（CODEX STAN 72-1981），進一步稱為CODEX）和高達36月齡的幼兒。用於嬰兒的營養組成物通常被稱為嬰兒配方，針對較大的兒童的配方奶和成長奶通常也使用如前文所述之術語。當作為嬰兒配方使用時，根據本發明之營養組成物應含有處於CODEX所規定的量的各成分（如果需要，按照個別國家的其他法規所規定的）。因此，根據本發明之嬰兒營養組成物包含如上所述之蛋白質、碳水化合物、和脂肪組成成分，並且還將包含維生素、鹽、和微量元素以及符合食品法典CODEX（如果需要，其他的國家法規）所規定規格的其他物質。
本發明之營養組成物可以呈即食配方的形式，採用可飲用或者可勺取的形式，或者採用粉狀配方的形式。在所生產、運輸和銷售的形式中，合適地呈粉末形式。隨後可以將粉末與水混合，以獲得由嬰兒或幼兒食用的即飲型或即勺取配方。呈其即飲或即勺取形式的最終營養組成物的pH值典型地將會在6.5和7.5之間，這係此類型食品的標準pH值。
本發明還關於一種用於製備如上所述呈粉末形式的營養組成物之方法，該方法包括以下步驟： (a) 製備包含乳清蛋白源、酪蛋白源、脂肪源、碳水化合物源和鹽的混合物； (b) 將步驟 (a) 中所得到的混合物噴霧乾燥成為粉末；和 (c) 視需要將鹽乾共混到從步驟 (b) 得到的粉末中，以獲得該營養組成物， 其中該等鹽包括 (i)  鈣結合酸或其水溶性鹽；和 (ii) 至少一種選自磷酸鈣和碳酸鈣的鈣鹽，並且 其中在步驟 (a) 中添加該鈣結合酸或其水溶性鹽，並且在步驟 (a) 和/或步驟 (c) 中添加該至少一種鈣鹽。
該方法的步驟 (a) 可以藉由本領域已知的任何方式而執行。混合物的每個組分，即乳清蛋白源、酪蛋白源、脂肪源、碳水化合物源、和鹽，其自身可由兩種或更多種的子組分所組成，或者可以與一種或多種其他組分組合成為單一成分。例如，脂肪源可以由一種或多種牛乳脂肪組分以及一種或多種植物脂肪和/或油組分所組成，其中的各組分可以在步驟 (a) 期間的不同階段添加。另一方面，如果使用全脂乳，則可以將其用作脂肪源、乳清蛋白源、酪蛋白源、碳水化合物源、和鹽來源，該等全部被組合在單一成分中。同樣地，脫脂乳將會係組合的乳清蛋白源、酪蛋白源、碳水化合物源、和鹽來源。鹽還可以包含多種不同的鹽組分，它們可以在步驟 (a) 期間添加，但也可能在乾混步驟 (c) 期間添加。為了本發明方法之目的，鹽應以任意方式包含 (i)  鈣結合酸或其水溶性鹽；和 (ii) 至少一種選自檸檬酸鈣、磷酸鈣和碳酸鈣的鈣鹽，較佳的是磷酸鈣和碳酸鈣。為了本發明之目的，甚至更較佳的是使用這兩種鈣鹽的組合，因為這能夠更精確地微調最終營養組成物中的蛋白結合鈣水平。
鈣結合酸或其水溶性鹽合適地是選自檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀及該等中兩種或更多種的任意組合，較佳的是檸檬酸鈉與檸檬酸鉀之組合。
所使用的乳清蛋白源原則上可以是常規地用於或可用於製備營養組成物的任何乳清蛋白源。為了本發明之目的，適合使用脫鹽乳清。然而，也可以使用從原料乳中分離出的乳清產品，其中只需最少的熱處理便可將盡可能多的乳清蛋白保持在其天然狀態（所謂的天然乳清）。
可以在步驟 (a) 期間的不同階段添加不同成分。例如，步驟 (a) 可以藉由以下的連續步驟而執行： (a1)      將經組合的一種或多種酪蛋白源、乳脂肪源、和乳清蛋白源進行共混； (a2)      將所得到的混合物加熱以蒸發這種混合物中所包含水的部分，隨後使該混合物冷卻； (a3)      向經冷卻的混合物中添加鹽和維生素； (a4)      巴氏滅菌；和 (a5)      添加植物油源，典型地是一種或多種植物油共混物，並且使該混合物均質化。
隨後可以在步驟 (b) 中將所得到的均質混合物噴霧乾燥。在步驟 (a1) 中所使用的酪蛋白源和乳脂肪源可以是兩種不同的組分，如脫脂乳（酪蛋白源）和奶油或無水乳脂肪（乳脂肪源），但也可以組合成為單一組分，如全脂乳。
眾所周知，如果需要，可以在步驟 (a) 期間的不同時刻按不同循序執行巴氏滅菌和均質化。上面給出的實例只是將所有成分共混到一起的一種方法。原則上，可以使用任意順序的步驟來得到所有成分的均勻混合物。
在步驟 (b) 中，將從步驟 (a) 得到的混合物噴霧乾燥，以獲得呈粉末形式的營養組成物。噴霧乾燥係公知的技術，並且可以使用適合於由從步驟 (a) 得到的液體營養組成物混合物生產粉末的任何噴霧乾燥技術。
最後，在視需要的步驟 (c) 中，可以將其他成分乾共混到從步驟 (b) 得到的粉末中，以獲得最終的營養組成物粉末。可以在此步驟 (c) 中被乾混的一種成分係鹽（的部分），特別是檸檬酸鈣、磷酸鈣和/或碳酸鈣。在本發明之方法中，在步驟 (a) 中添加鈣結合酸或其水溶性鹽，而在步驟 (a) 和/或步驟 (c) 中添加鈣鹽。合適地在添加該一種或多種鈣鹽之前添加鈣結合組分。除了鹽以外，在乾混步驟 (c) 期間也可以添加其他成分。此類成分包括例如維生素、乳糖、低聚半乳糖（GOS）、人乳低聚糖（HMO）、和在營養組成物中適當地存在的微量元素（其預混物）。這在本領域中是眾所周知的。
已發現本發明之營養組成物導致胃中的凝乳形成減少或者甚至根本沒有凝乳形成，由此促進胃排空和胃消化。這有助於防止嬰幼兒中的腸道不適和便秘。因此，在另一方面，本發明關於如上所述之營養組成物，其用於預防人類受試者、合適地0至36月齡的人類受試者中的腸道不適和便秘。
藉由以下的實例進一步說明本發明，然而不將本發明之範圍局限於該等具體實施方式。
無
[圖1]係用於測定結合蛋白鈣的程序之示意圖。
[圖2]示出了所使用體外胃消化模型之設置。
[圖3]示出了在不同pH值下根據本發明之兩個樣本和一個比較樣本的體外胃消化後之攝影圖像。
[圖4]示出了所測試模型配方之SDS-PAGE電泳圖。
[圖5]示出了根據本發明之營養組成物在體外胃消化後之攝影圖像。
[圖6]示出了實例3的營養組成物之SDS-PAGE電泳圖。 實例 實例1-模型配方之製備
製備了具有不同水平的蛋白結合鈣的模型配方並且在體外進行了測試，以證明在胃消化期間蛋白結合鈣對胃中凝乳形成的影響。
使用Pyne & McGann（Pyne, G. T., & McGann, T. C. A. (1960). The colloidal phosphate of milk: II. Influence of citrate [乳的膠體磷酸鹽: II. 檸檬酸鹽的影響]. Journal of Dairy Research [乳業研究學報], 27 (1), 9-17 ）所述之方法，製備具有不同程度的酪蛋白礦化的乳樣本。
為此，獲得了一批50公斤的巴氏滅菌脫脂乳。取三個子樣本（各200 g），將其中的一個（樣本2）保持在其初始pH值，但藉由添加1 M鹽酸（酸）將樣本1調節至pH 5.7並且藉由添加1 M氫氧化鈉（鹼）將樣本3調節至pH 8.0。pH調節係在5°C下執行，其中使乳樣本以及酸和鹼在此溫度下平衡1小時，之後進行pH調節。
由於該pH調節，乳中的鹽平衡已發生了變化。為了使經調節乳的血清組成成分重新平衡，將該等樣本進行透析。因此，隨後使用標稱截留分子量為14 kDa的透析膜，相對於初始巴氏滅菌脫脂乳，將樣本1、樣本2和樣本3徹底地進行透析。在5°C下執行24小時第一次透析，由此對於樣本1、樣本2和樣本3中每個，針對5000 g的初始巴氏滅菌乳，將200 g乳在溫和攪拌下進行透析。在此透析階段之後，將透析管轉移至在5°C下容納5000 g初始巴氏滅菌脫脂乳的另一個容器中，並且在相同條件下再次進行24小時透析。在此透析步驟之後，從透析管中取出樣本。
如使用標準設備在20°C下所測量的，經透析樣本1DIA（從樣本1獲得的經透析樣本）、2DIA（從樣本2中獲得的經透析樣本）、和3DIA（從樣本3獲得的經透析樣本）的pH值為6.8。
隨後分別使用樣本1DIA、樣本2DIA、和樣本3DIA製備模型配方MF1、MF2和MF3，其中將21 g的各個經滲析樣本與21 g的脫鹽乳清（DEMINAL® 90 Liquid ex FrieslandCampina成分，其具有以乾物質計13.5 wt%的總蛋白含量、以乾物質計84.5 wt%的乳糖含量、以乾物質計0.040 wt%的鈣含量、28 wt%的總固體含量）和58 g的乳滲透物加以混合，該乳滲透物藉由將巴氏滅菌脫脂乳在50°C下使用10 kDa膜進行超濾而產生，並且具有小於0.05 g/100 g的TN、4.9 wt%的乳糖含量和0.028 wt%的鈣含量。
隨後對模型配方MF1、MF2和MF3的總氮含量（TN）、非蛋白氮含量（NPN）、酪蛋白氮含量（CN）、和鈣含量（Ca）進行分析。隨後以每10 g酪蛋白的Ca毫莫耳數計，計算蛋白結合鈣與酪蛋白的比率（PBCa/Cas）。
使用如方法ISO 8968-1/IDF 020-1（乳和乳製品 - 氮含量的測定 - 第 1 部分：凱氏原理和粗蛋白質計算） 所述之凱氏定氮法，確定TN。
如方法ISO 8968-4/IDF 020-4（乳和乳 製品 - 氮含量的測定 - 第 4 部分：非蛋白氮含量的測定） 所述，確定NPN。
如ISO 17997/IDF 29-1-酪蛋白氮含量的測定 - 第 1 部分 - 間接法（參考方法） 所述，確定CN。然後，按照CN*6.38，計算經透析樣本的酪蛋白含量。
如標準方法ISO 21424 I IDF 243: 2018（乳、乳製品、 嬰兒配方和成人營養品 - 礦物質和微量元素的測定 - 電感耦合血漿原子質譜法（ ICP-MS ） ）所述，使用電感耦合電漿原子質譜法（ICP-MS）確定鈣含量。
如前文中參照圖1所述，確定PBCa。因此，首先使MF1、MF2、和MF3的樣本在20°C下平衡1小時，並且在20°C下以200 x g離心15分鐘以除去任何不溶的鈣鹽，隨後將沈澱團塊與上清液（SUP）分離。隨後使SUP在20°C下平衡2小時，之後在20°C下以100,000 x g離心60分鐘。將所得到的液體血清層與乳油層和沈澱團塊分離，隨後經過10 kDa膜進行過濾，以獲得該樣本的10 kDa可滲透級分（PER10 kD）。藉由上述的ICP-MS方法，確定SUP（上清液）和PER10 kD中的總鈣（＜Ca＞）濃度，以克/千克（g/kg）計。按照如下，計算蛋白結合鈣的濃度（PBCa，以g/kg計）： PBCa = SUP中的＜Ca＞ - PER10kD中的＜Ca＞
模型配方MF1、MF2和MF3的關鍵參數示於表1。
[表1]. 模型配方MF1、MF2和MF3的組成參數
   樣本MF1 樣本MF2 樣本MF3
Ca（g/kg） 0.40 0.45 0.47
NPN（g/100 g） 0.03 0.03 0.03
TN（g/100 g） 0.25 0.26 0.25
CN（g/100 g） 0.09 0.09 0.09
NPN/TN 0.12 0.12 0.12
CN/TN 0.4 0.4 0.4
PBCa/Cas（mmol/10 g酪蛋白） 5.4 7.1 8.0
實例2-體外胃消化
在NIZO（荷蘭埃德市（Ede）），使用半動態消化模型，使用適合於模擬嬰兒胃狀態的消化條件，進行配方MF1、MF2（兩者均根據本發明）和MF3（比較）的體外胃消化實驗。
對於樣本的體外胃消化，使用如在圖2中所述之系統。對於典型的實驗，將0.83 g 30 mM HCl放入置於37°C和約120 rpm的攪拌水浴裝置中的100 mL瓶中。也使該樣本在37°C下平衡。隨後將20 mL樣本以1 mL/min的速率輸入瓶中，但以0.13 mL/min的速率添加胃液（含有250 U/mL胃蛋白酶和8.75 U/ mL脂肪酶的30 mM HCl）。將胃液保持在冰上，以防止酶活性的損失。將豬胃蛋白酶（西格瑪公司（Sigma））用作胃液中的胃蛋白酶源，而Amano脂肪酶A（安滿能公司（Amano））係所使用的標準脂肪酶。
體外胃消化的標準條件總結於表2中。
[表2]. 體外胃消化的標準條件
胃液 30 mM HCl
   8.75 U/mL脂肪酶A
   250 U/mL胃蛋白酶
產生速率 0.4 mL/min
酶 來自黑麯黴（Aspergullus niger）的Amano脂酶A
   來自豬胃黏膜的胃蛋白酶
空腹胃內pH值 3.5
產品輸送速率 1.0 mL/min
輸送時間 20 min
產品的量 20 mL
為了允許在規定的pH值下進行採樣，首先確定樣本的緩衝曲線。為此，將樣本與不同體積的30 mM HCl加以混合並測定pH值。基於達到某個pH值所需的30 mM HCl的量和泵送速度，可以計算出應取樣的時間點。為了抑制採樣後的胃蛋白酶活性，以50 μL/10 mL經消化樣本的水平添加胃酶抑素A儲備溶液（18 mL甲醇 + 2 mL冰醋酸中0.02 g胃酶抑素A）。
在消化期間的設定點（pH 6.0、5.0、4.5、3.5）取出產品（針對各pH點使用單獨的產品），將容器的內容物傾倒入培養皿中並拍照，以便對凝乳形成和分解進行目視觀察。隨後，將樣本以4000 x g離心10分鐘，並且藉由傾析使沈澱團塊與上清液分離。將這兩個級分稱重並進行冷凍乾燥，隨後在還原條件下藉由SDS-PAGE進行分析。
圖3示出了在不同pH值下的體外胃消化後的模型配方的攝影圖像。在其中對樣本進行攝影的容器的直徑為88 mm。圖3示出了在任何pH值下在樣本MF1（根據本發明）中均未觀察到可見凝乳形成。在樣本MF2（根據本發明）中，在pH 6.0下未觀察到可見凝結，但隨著消化的進行，在pH 5.0下觀察到凝結。然而，在進一步進行時，在此樣本中未觀察到殘留的凝乳顆粒，從而表明最初形成的凝乳顆粒之分解。對於樣本MF3（比較），在pH 6.0下已經觀察到強的凝結，儘管隨時間推移觀察到顆粒的一些分解，甚至在消化結束時（pH 3.5；＞ 120 min）仍然觀察到大的殘留凝乳顆粒。
也將樣本MF1、樣本MF2和樣本MF3進行離心，得到沈澱團塊和上清液（血清），並且在還原條件下藉由SDS-PAGE進行分析。如在圖4中所述，僅在初始樣本和所形成的沈澱團塊中觀察到在25-35 kDa範圍內在SDS-PAGE凝膠上所觀察到的完整酪蛋白。
在pH 6.0下，在所有樣本MF1、樣本MF2和樣本MF3的沈澱團塊中，均觀察到殘留的完整酪蛋白；然而，在pH 5.0下，在樣本MF1中不再觀察到殘留的完整酪蛋白，但樣本MF2和樣本MF3仍然顯示殘留的完整酪蛋白。在較低的pH下，在樣本MF2中不再觀察到完整的酪蛋白。然而，在樣本MF3中，即使在消化過程結束時（pH 3.5），仍然觀察到殘留的完整酪蛋白，可能也包含在仍然在該等樣本中觀察到的大凝乳顆粒內（參見圖3）。因此，顯然所形成凝乳顆粒的大小係決定樣本中酪蛋白分解速率的關鍵因素。如果形成大的顆粒，則總顆粒表面積較低，並且消化酶經過顆粒的擴散很可能是限速步驟，酪蛋白分解緩慢。 實例3-營養組成物
由經加熱的全脂乳、奶油、和脫鹽乳清製備複合共混物。為此，將145 kg的全脂乳與163 kg的脫鹽乳清和16 kg的奶油加以混合。如上所述，確定各成分和複合共混物的TN、NPN、總鈣含量和酪蛋白含量。另外，如上所述，確定乳和複合共混物的蛋白結合鈣（PBCa）。使用羅斯-高特裡巴（Rose Gottlieb）法（ISO 1211/IDF 1，乳-脂肪含量的測定-重量法 （參考方法 ））確定脂肪含量。結果示於表3中。
[表3]. 特性
樣本 TN （ g/100 g ） NPN （ g/100 g ） NPN/TN 脂肪（ g/100 g ） Ca （ g/kg ） PBCa/Cas （ mmol/10 g ）
乳 0.54 0.03 0.06 4.3 1.20 7.3
奶油 0.33 0.02 0.06 42.2 0.61 -
乳清 0.56 0.06 0.11 0.2 0.056 -
共混物 0.54 0.05 0.09 4.1 0.60 6.3
使複合共混物經歷蒸發處理並添加其他成分（配方參見表4）。將所得到的混合物進行巴氏滅菌，均質化並且噴霧乾燥，從而獲得水分含量為2.5%的經噴霧乾燥基礎粉末。藉由乾混將其他的成分添加到經噴霧乾燥的基礎粉末中，如在表4中所示。
最終營養組成物粉末具有 ＜ 3.0%的水分含量。
[表4]. 營養組成物配方
成分 添加量（ kg/100 kg 最終產品）
     
添加到經蒸發的複合共混物中：
脂肪共混物 13.4
檸檬酸鉀 0.55
碳酸鈣 0.37
氯化鎂 0.21
磷酸三鈣 0.15
檸檬酸鈉 0.09
氯化鈉 0.15
氫氧化鈣 0.03
     
經乾混的：   
乳糖 5.6
低聚半乳糖粉末 4.4
預混物維生素、微量元素、核苷酸 0.4
2’-岩藻糖基乳糖 0.30
以每90克水13克粉末的水平，使粉狀營養組成物在40°C的去離子水中復原60分鐘。利用上述方法，確定產品中酪蛋白礦化的水平（即，蛋白結合鈣，PBCa/Cas）。
利用前文中所描述之方法，對營養組成物進行分析。如前文所述，利用TN、NPN和胺基酸組成確定酪蛋白含量。結果示於表5中。
[表5]. 營養組成物之關鍵特徵
總蛋白（6.38* TN） g/100 g 11.4
酪蛋白（CN* 6.38） g/100 g 4.2
NPN g/100 g 0.18
NPN/TN    0.10
脂肪 g/100 g 27
2’-FL g/100 g 0.25
GOS g/100 g 3.0
乳糖 g/100 g 51.7
Ca mg/100 g 421
PBCa/Cas mmol/10 g酪蛋白 5.2
隨後利用實例2中所述之方法使樣本經歷體外消化，在pH 6.5、6.0、5.5、4.5和3.5下取樣。達到該等pH值後的樣本的攝影圖像示於圖4中，SDA-PAGE電泳圖示於圖6中。
如從圖5和圖6中可見，在pH低於6.0時，未觀察到大的凝結物並且不再觀察到完整的酪蛋白（參見25-35 kDa範圍），從而清楚地表明在胃條件（pH ＜ 5）下未發生凝乳形成並且消化有效地進行。

Claims (11)

  1. 一種包含碳水化合物、蛋白質、和脂肪組成成分之營養組成物，其中： (a) 該營養組成物具有以乾物質計至少3.5 g/kg的總鈣含量； (b) 該蛋白質包括酪蛋白； (c) 該營養組成物具有每10克酪蛋白7.5毫莫耳或更少的蛋白結合鈣含量；並且 (d) NPN與TN的比率為0.7或更少，並且： - NPN表示該營養組成物中的非蛋白氮，以每100克營養組成物中的克數計（g/100 g）；並且 - TN表示該營養組成物中的總氮（TN），以g/100 g計。
  2. 如請求項1所述之營養組成物，其中基於該脂肪組成成分的總重量，該脂肪組成成分包含至少20重量%、較佳的是至少45重量%的源自牛乳脂肪源的三醯基甘油（TAG）。
  3. 如請求項2所述之營養組成物，其中該牛乳脂肪源係全脂乳、奶油或無水乳脂肪。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之營養組成物，其中該脂肪組成成分包含 (a) 基於TAG中的脂肪酸醯基的總重量0.5重量%-2.2重量%、較佳的是0.6重量%-2.0重量%的丁酸酯基（C4 : 0）；和 (b) 基於TAG中的脂肪酸醯基的總重量18.0重量%-35.0重量%、較佳的是19.0重量%-32.0重量%的在TAG的sn-1和sn-3位的長鏈飽和脂肪酸醯基，該長鏈飽和脂肪酸醯基具有12個或更多碳原子的鏈長。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之營養組成物，該營養組成物進一步包含至少一種人乳低聚糖，較佳的是岩藻糖基化乳糖，更較佳的是2’-岩藻糖基乳糖。
  6. 如請求項5所述之營養組成物，其中該至少一種人乳低聚糖係按以乾物質計每100克的該營養組成物中0.05至2.0克的量而存在。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之營養組成物，其呈粉末形式。
  8. 一種用於製備如請求項7所述之營養組成物之方法，該方法包括以下步驟 (a) 製備包含乳清蛋白源、酪蛋白源、脂肪源、碳水化合物源和鹽的混合物； (b) 將步驟 (a) 中所得到的混合物噴霧乾燥成為粉末；和 (c) 視需要將其他的鹽乾共混到從步驟 (b) 得到的粉末中，以獲得該營養組成物， 其中該等鹽包括 (i)  鈣結合酸或其水溶性鹽；和 (ii) 至少一種選自磷酸鈣和碳酸鈣的鈣鹽，並且 其中在步驟 (a) 中添加該鈣結合酸或其水溶性鹽，並且在步驟 (a) 和/或步驟 (c) 中添加該至少一種鈣鹽。
  9. 如請求項8所述之方法，其中在步驟 (c) 中添加該至少一種鈣鹽。
  10. 如請求項8或9所述之方法，其中該鈣結合酸或其水溶性鹽係選自檸檬酸、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀及該等中兩種或更多種的任意組合，較佳的是檸檬酸鈉與檸檬酸鉀之組合。
  11. 如請求項1-7中任一項所述之營養組成物，其用於預防人類受試者、較佳的是0至36月齡的人類受試者中的腸道不適和便秘。
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