TW201730171A - 羥甲糠醛衍生物的製造方法、蘆筍莖熱水加熱處理物的用途以及蘆筍莖加熱處理物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種羥甲糠醛衍生物，係以一般式表示□(式中，R係選自下述式(I)□及(IV)氫原子所構成之群)。

Description

羥甲糠醛衍生物的製造方法、蘆筍莖熱水加熱處理物的用途以及蘆筍莖加熱處理物的用途
本發明係關於一種羥甲糠醛衍生物、羥甲糠醛衍生物的用途、飲食品、羥甲糠醛衍生物的製造方法以及蘆筍莖熱水加熱處理物的用途。
對長時間勞動、暴露於各種肉體及精神的壓力環境等之現代人中，大多數人即便在進行健康診斷等之檢查時沒有異常的現象，惟會抱怨有食慾不振、無法入眠、頭暈、冒冷汗等之身體症狀、或對人的不信任、情緒不安定、焦躁、憂鬱等之精神症狀。伴隨該不安定訴苦的症狀，大多數會被診斷為自律神經失調症。對於這樣的自律神經失調症而言，目前一般有藉由抗憂鬱藥、荷爾蒙劑等之藥物療法、食物療法、以運動等來改善生活習慣等之對策。
已知由於過度壓力負荷會誘發以上述之自律神經失調 症為首的自律神經障礙現象。於自律神經障礙中，有交感神經與副交感神經之均衡性(自律神經平衡性)混亂、自律神經之活動度降低等。自律神經之平衡性混亂，係指交感神經佔於優勢的狀態或副交感神經佔於優勢的狀態。而且，已知因自律神經的活動度降低，而導致壓力應對能力降低。例如由於消化道之運作主要受副交感神經所支配，因壓力負荷而導致交感神經持續性緊張時，會抑制消化道的運作而引起食慾不振、便祕等之腸胃性障礙。此外，因壓力負荷而導致副交感神經無法良好地功能性進行，交感神經之活動持續亢進而引起無法入眠的情形。
如上所述，在壓力與自律神經障礙之間存在有密切的相關性，另外也有不因壓力負荷而產生的自律神經障礙現象。而且，因壓力負荷不僅會引起自律神經障礙，且會誘發其他身體上的症狀。
稱為壓力蛋白質的蛋白質之一，為熱休克蛋白質(以下稱為HSP)。HSP係分子量約為數萬~15萬之蛋白質，視分子量而定，分類成數個家族(HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等)。HSP係於生物體受到物理性、化學性、生理或精神壓力時，於細胞內被誘發的蛋白質之一群。具體而言，HSP於生物體暴露於熱、細菌感染、發炎症、活性氧、紫外線、飢餓、低氧狀態等之各種壓力條件時表現亢進，具有保護細胞的作用。而且，亦具有做為抑制蛋白質之摺疊(folding)、抑制異常蛋白質之凝聚的分子伴護蛋白(molecular chaperone)的功能。
於HSP中，針對HSP70的研究特別盛行，已報告有一直表現於消化道或皮膚等之大多數內臟器官等。近年來，確認HSP70之抗細胞死作用及抗發炎症作用，且已報告具有對各種壓力而言之細胞保護效果(非專利文獻1~4)。因此，進行研究將HSP70誘發活性物質應用於醫藥品、化妝品等。有關來自天然物之HSP70誘發活性物質，則已報告有芍藥之主成分的芍藥苷(paeoniflorin)(非專利文獻5)。
蘆筍係於日本中以北海道為首的各地栽培及收穫的蔬菜。已發現蘆筍具有各種的生理活性。於專利文獻1中記載，蘆筍莖萃取物具有對各種疲勞(因肉體疲勞、精神疲勞之疲勞等)的預防及恢復效果。另外，於專利文獻2中記載，蘆筍莖萃取物具有改善腦功能之效果。此外，於專利文獻3中記載，蘆筍莖擬葉萃取物具有調整自律神經效果。
〔習知技術文獻〕 〔專利文獻〕
專利文獻1：日本特開2007-45750號公報
專利文獻2：日本特開2007-230870號公報
專利文獻3：日本特開2011-153125號公報
〔非專利文獻〕
非專利文獻1：Xiao-Rong Chang et al, World J Gastroenterol; 13(32) : 4355-4359(2007)
非專利文獻2：Sarah M. et al, FASEB J. 22, 3836-3845(2008)
非專利文獻3：Hirata I et al, Digestion; 79(4) : 243-50(2009)
非專利文獻4：Tadashi Nishida et al, Journal of clinical biochemistry and nutrition; 46(1) : 43-51(2010)
非專利文獻5：Dai Yan et al, Cell Stress&Chaperones; 9(4), 378-389(2004)
然而，直至目前仍沒有報告與抗壓效果及自律神經調節效果有關的蘆筍萃取物或蘆筍處理物中之成分。
本發明人等發現來自蘆筍莖熱水加熱處理物之新穎的羥甲糠醛衍生物，且發現該羥甲糠醛衍生物具有優異的HSP誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果，遂而完成本發明。本發明係以提供新穎的羥甲糠醛衍生物、具有優異效果之醫藥品、HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑為目的。另外，提供具有優異的HSP誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果之飲食品為目的。此外，以提供可以低成本化及簡單地製造羥甲糠醛衍生物之方法為目的。
為達成上述目的時，本發明之第1觀點有關的羥甲糠醛衍生物，係以一般式表示，
式中，R係選自下述式(I)
本發明之第2觀點有關的之羥甲糠醛衍生物，其係藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理而製得。
本發明之第3觀點有關的羥甲糠醛衍生物的用途，其係用於製備具有羥甲糠醛衍生物做為有效成分之醫藥品、熱休克蛋白質誘發劑、抗壓劑或自律神經調節劑，該羥甲糠醛衍生物係以一般式表示，
式中，R係選自下述式(I) 及(IV)氫原子所構成之群。
本發明之第4觀點有關的飲食品，其係含有本發明之第3觀點有關的熱休克蛋白質誘發劑、抗壓劑或自律神經調節劑。
本發明之第5觀點有關的羥甲糠醛衍生物的製造方法，其係包括：將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟；以及進行酵素處理的步驟；該羥甲糠醛衍生物係以一般式表示，
式中，R係選自下述式(I) 及(IV)氫原子所構成之群。
本發明之第6觀點有關的蘆筍莖熱水加熱處理物的用途，其係用於製備以蘆筍莖熱水加熱處理物做為有效成分之熱休克蛋白質誘發劑、抗壓劑或自律神經調節劑。
藉由本發明，可提供新穎的羥甲糠醛衍生物、具有優異效果的醫藥品、HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑。而且，可提供具有優異的HSP誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果之飲食品。另外，可提供可以低成本且簡單地製造羥甲糠醛衍生物之方法。
圖1係表示藉由羥甲糠醛衍生物而表現HSP70 mRNA誘發活性的圖。
圖2係表示藉由羥甲糠醛、蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物而表現HSP70 mRNA誘發活性的圖。
圖3係表示藉由羥甲糠醛、蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物而表現HSP70蛋白質誘發 活性的圖。
圖4係表示藉由對斷眠(sleep deprivation)試驗之老鼠投予蘆筍莖熱水加熱處理物的血清中過氧化脂質量之變化圖。
圖5係表示藉由對斷眠試驗之老鼠投予蘆筍莖熱水加熱處理物的血中皮質固酮(corticosterone)濃度之變化圖。
圖6係表示藉由對斷眠試驗之老鼠投予蘆筍莖熱水加熱處理物的脫毛表現率之變化圖。
圖7係表示藉由對斷眠試驗之老鼠的胃投予蘆筍莖熱水加熱處理物的HSP70蛋白質表現量之變化圖。
圖8係表示藉由對斷眠試驗之老鼠的肝臟投予蘆筍莖熱水加熱處理物的HSP70蛋白質表現量之變化圖。
圖9係表示藉由對斷眠試驗之老鼠的腎臟投予蘆筍莖熱水加熱處理物的HSP70蛋白質表現量之變化圖。
圖10係表示藉由對人體投予蘆筍莖熱水加熱處理物的HSP70 mRNA表現量之變化圖。
圖11係表示藉由對人體投予蘆筍莖熱水加熱處理物的自律神經平衡性之變化圖。
圖12係表示藉由對人體投予蘆筍莖熱水加熱處理物的自律神經活動度之變化圖。
圖13係表示藉由對人體投予酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之HSP70 mRNA表現量的變化圖。
圖14係表示藉由對人體投予酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之自律神經平衡性的變化圖。
圖15係表示藉由對人體投予酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之自律神經活動度的變化圖。
於下述中，詳細說明有關本發明之實施形態。
(1. 羥甲糠醛衍生物)
本發明之羥甲糠醛衍生物，以下述一般式表示。
(式中，R係選自下述式(I) 及(IV)氫原子所構成之群)。
R為上述式(I)時，羥甲糠醛衍生物以下述構造式表示。
R為上述式(I)時，羥甲糠醛衍生物含有下述之2個立體異構物(R體及S體)。
R為上述(IV)氫原子時，羥甲糠醛衍生物以下述構造式表示(化合物名：羥甲糠醛)。
本發明之羥甲糠醛衍生物，係可如下述所示藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理而製得。
本發明之羥甲糠醛衍生物係如下述所示具有優異的熱休克蛋白質誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果。
(2. 羥甲糠醛衍生物之製造方法)
本發明之羥甲糠醛衍生物的製造方法，包含將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟。
於本說明書中，「熱水加熱處理」係指在熱水中進行加熱處理。本發明所使用的蘆筍莖，例如可使用綠色蘆筍、白色蘆筍、紫色蘆筍等之莖部。而且，蘆筍的產地沒有特別的限制，可使用國產品之蘆筍、或可使用進口品之蘆筍。只要是可達成本發明效果的蘆筍即可，可適當地選擇使用。
將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟，例如藉由在蘆筍莖中加入1~50倍量之水，在熱水中進行加熱20~180分鐘。此時之溫度例如以50~300℃較佳。在大氣壓下進行熱水加熱處理時，例如以100℃以上之溫度較佳。而且，亦可在加壓下進行熱水加熱處理，例如以0.1~0.2MPa(使用壓熱鍋時，例如0.12MPa)之壓力較佳。
如上述藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理，可製得本發明之羥甲糠醛衍生物。如此本發明之羥甲糠醛衍生物的製 造方法，包含將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟。該製造方法中，由於使用廣泛做為蔬菜流通的蘆筍之莖部，可製造低價的羥甲糠醛衍生物。而且，不需使用高度技術、特別的裝置等，可藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理，簡單地製造羥甲糠醛衍生物。另外，由於將食材之蘆筍進行熱水加熱處理，可以說藉由該製造方法所得的羥甲糠醛衍生物之安全性高，亦可藉由熱水加熱以使蘆筍莖滅菌。而且，只要是可達成本發明效果的熱水加熱處理方法即可，可適當選擇使用。
本發明之羥甲糠醛衍生物的製造方法，以提高熱水加熱處理的步驟之效率，有效地製造羥甲糠醛衍生物為目的時，亦可進一步包含下述例示的附加步驟。
上述之附加步驟，例如於熱水加熱處理前，細切蘆筍莖的步驟。可將蘆筍莖切成例如約0.5~10cm之大小。細切時例如可使用刀、切斷器等，以手進行作業，亦可使用細切機、磨碎機等之機器。只要是可達成本發明效果之細切方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟，例如於熱水加熱處理前，壓榨蘆筍莖的步驟。例如可使用壓榨機壓榨蘆筍莖。只要是可達成本發明效果之壓榨方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟，例如為使植物組織崩壞等為目的時，於熱水加熱處理步驟之前或之後進行酵素處理步驟。藉由酵素處理，可更為提高熱水加熱處理的步驟之效率，且可更為有效地製造羥甲糠醛衍生物。例如，以有效地分 解蘆筍莖中之纖維質、果膠等為目的時，可使用纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、支鏈澱粉酶(pullulanase)等之酵素或適當組合2種或3種以上之此等酵素使用。只要是可達成本發明效果之酵素即可，可適當選擇使用。於酵素處理的步驟中，對所使用的酵素而言選擇最適當的添加量、溫度及反應時間。使用纖維素酶時，例如可以0.1~5%(w/w)之纖維素酶添加量、在30~60℃之溫度進行酵素處理1~72小時。酵素處理的步驟可於熱水加熱處理步驟之前進行，亦可於熱水加熱處理步驟之後進行。而且，就更為有效地分解蘆筍莖中之纖維素，更為有效地製造羥甲糠醛衍生物而言，以於熱水加熱處理步驟之後，藉由纖維素酶進行酵素處理較佳。只要是可達成本發明效果的酵素處理方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟例如於熱水加熱處理後，使殘渣進行機械性粉碎的步驟。於粉碎時，例如可使用磨、混合器等之機器。只要是可達成本發明效果之粉碎方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟，例如於熱水加熱處理後進行離心分離或過濾的步驟。藉由進一步含有此等步驟，可有效地除去殘渣而製得加熱處理液。離心分離例如以回轉數3,000~7,000rpm、在4~50℃下進行。於過濾時，例如使用市售的濾紙、濾布等。只要是可達成本發明效果之離心分離方法或過濾方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟，例如於熱水加熱處理後使所得的加 熱處理液在減壓下濃縮的步驟。濃縮例如可使用蒸發器進行。只要是可達成本發明之效果的濃縮方法即可，可適當選擇使用。
上述之附加步驟，例如熱水加熱處理後使加熱處理液進行噴霧乾燥或結凍乾燥的步驟。噴霧乾燥例如在排風溫度70~90℃、反應室溫度80~100℃下進行。只要是可達成本發明效果的噴霧乾燥方法或結凍乾燥方法即可，可適當選擇使用。
藉由於將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟進一步含有上述例示的附加步驟，可更為有效地製造羥甲糠醛衍生物。只要是可達成本發明效果之附加步驟即可，可適當選擇使用。
有關將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟，如下述例示。將蘆筍莖切斷成約0.5~10cm，加入1~50倍量之水。在50~100℃、或121℃之加壓下進行熱水加熱處理20~180分鐘。放冷後，添加0.1~5%(w/w)之纖維素酶，且在30~60℃下進行酵素處理1~72小時。然後，使殘渣進行機械性粉碎，且以回轉數3,000~7,000rpm、在4~50℃下進行離心分離，製得上層澄清液。然後，使該上層澄清液以排風溫度70~90℃、反應室溫度80~100℃下進行噴霧乾燥。
於本說明書中，「蘆筍莖熱水加熱處理物」係指將蘆筍莖在熱水中進行加熱處理，然後，藉由離心分離、過濾等除去殘渣，且經濃縮者。而且，於本說明書中「酵素處理 蘆筍莖熱水加熱處理」係指於熱水加熱處理步驟之前或之後，經由前述之酵素處理的步驟所得的蘆筍莖熱水加熱處理物。例如於蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物中，至少含有0.05%以上之前述羥甲糠醛衍生物做為有效成分。
有關藉由本發明之製造方法所得的羥甲糠醛衍生物，例如可將蘆筍莖熱水加熱處理物溶解於水或有機溶劑(甲醇等)中，使用於逆相用載體(例如DIAION HP-20(製品名)(三菱化學公司製)等)之烤箱柱色層分析法。另外，例如藉由凝膠過濾用載體(例如Sephadex LH-20(製品名)(Pharmacia Fine Chemicals公司製)等)予以分離。此外，可以上述方法溶出的指定部分藉由例如高速液體色層分析法(HLPC)進行離析而予以精製。
雖不受特定理論拘束，惟藉由如上述將蘆筍莖進行熱水加熱處理，在高溫下使來自蘆筍莖之有機酸與糖類反應，而製得本發明之羥甲糠醛衍生物。有機酸例如焦麩胺酸、α-酮基麩胺酸、酸草醯基醋酸等。另外，糖類例如果糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等。
例如，於將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟中，使來自蘆筍莖之焦麩胺酸與果糖在高溫下進行反應，製得下述之化合物。
於本發明之羥甲糠醛衍生物的製造方法中，可適當使用除上述例示的含有有機酸與糖類之蘆筍以外的植物。例如可使用含有焦麩胺酸與果糖之蔬菜。例如可適當使用高麗菜、花椰菜、南瓜、洋蔥、蒜頭、紅蘿蔔等之蔬菜而得。只要是可達成本發明效果之植物即可，可適當選擇使用。
(3. HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑)
藉由本發明可提供含有做為有效成分之本發明羥甲糠醛衍生物的HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑。
本發明之HSP誘發劑，係使用於為誘發存在於生物體內或生物體外之HSP時。此處之HSP例如HSP70、HSP10、HSP27、HSP40、HSP60、HSP90、HSP110等，較佳者為HSP70。有關HSP誘發活性，例如可在細胞內添加該HSP誘發劑進行培養，藉由已知的方法測定HSP mRNA之表現誘發活性、HSP蛋白質之表現誘發活性等予以評估。只要是可達成本發明效果之評估方法即可，可適當選擇使用。
本發明之抗壓劑，可藉由投予生物體而得到抗壓效果。抗壓效果例如對哺乳動物投予該抗壓劑，測定投予前後之氧化壓力指標、血中壓力荷爾蒙濃度等進行評估。只要是可達成本發明效果的評估方法即可，可適當選擇使用。
本發明之自律神經調節劑，可藉由投予生物體而得到自律神經調節效果。自律神經調節效果例如可對哺乳動物投予該自律神經調節劑，藉由測定投予前後之自律神經平衡性、自律神經活動度等進行評估。只要是可達成本發明效果的評估方法即可，可適當選擇使用。
另外，藉由本發明亦可提供含有做為有效成分之蘆筍莖熱水加熱處理物的HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑。該蘆筍莖熱水加熱處理物，如前述藉由將蘆筍莖熱水加熱處理而製得。而且，於該蘆筍莖熱水加熱處理物中含有本發明之羥甲糠醛衍生物。
(4. 飲食品及醫藥品)
藉由本發明可提供含有本發明之HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑的飲食品。該飲食品可藉由常法加工成顆粒狀、粒狀、錠劑、膠囊、凝膠狀、乳霜狀、糊料狀、懸浮液狀、水溶液狀、乳液狀、粉末狀等適合飲食用的形態。而且，可添加於飲食品中一般使用的賦形劑、結合劑、潤滑劑、著色劑，崩壞劑、增黏劑、保存劑、安定化劑、pH值調整劑等。另外，為改善口味品質時，在不會損害本發明效果的範圍內，可添加糖類、糖醇類、鹽類、油脂類、胺基酸類、有機酸類、甘油等。而且，使用於已知的飲食品中含有本發明之HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑時，形成糊料之飲食品只要是可達成本發明效果之飲食品即可，可適當選擇使用。
使用本發明之HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑做為飲食品時，例如藉由攝取以蘆筍莖熱水加熱處理物(或酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物)換算為50mg~2000mg/日、較佳者為100mg~1000mg/日，可得所期望的HSP誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果。有關攝取量，係以攝取的目的、飲食品之形態等為基準予以適當選擇使用。
本發明之飲食品，具有抗壓效果及自律神經調節效果等兩者。而且，對因壓力負荷之自律神經障礙而言，藉由抗壓效果及自律神經調節效果之相乘作用，期待可達成更高的效果。此外，即使對於不因壓力負荷之自律神經障礙，亦可期待達成自律神經調節效果。
本發明之HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑，可使用做為醫藥品。本發明之醫藥品，含有前述之羥甲糠醛衍生物做為有效成分。此時，可藉由常法調製成錠劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑等之劑型。而且，可添加醫藥品中一般使用的賦形劑、結合劑、潤滑劑、著色劑、崩壞劑、增黏劑、保存劑、安定化劑、pH值調整劑等。有關投予方法，在可達成本發明效果之範圍內適當選擇使用經口投予、靜脈內投予、腹腔內投予、皮內投予、舌下投予等。
使用本發明之HSP誘發劑、抗壓劑及自律神經調節劑做為醫藥品時，例如藉由投予以蘆筍莖熱水加熱處理物(或酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物)換算為50mg~2000mg/日(較佳者100mg~1000mg/日)，可得所期望的HSP誘發活性，抗壓效果及自律神經調節效果。有關投予量，係以投予目的、劑型、患者年齡、體重等為基準予以適當選擇使用。
〔實施方法〕 〔實施例〕
於下述中，以實施例具體地說明本發明。惟本發明不 受此等實施例所限制。
(實施例1)
(藉由蘆筍莖熱水加熱處理製造羥甲糠醛)
在蘆筍莖(新鮮重量1.5kg)中加入水1.5L，以熱水加熱處理為目的時使用壓熱鍋進行加熱滅菌(121℃、20分鐘)，然後，以濾布過濾，且將所得的液體在減壓下，以蒸發器予以濃縮，製得加熱處理物。將所得的加熱處理物藉由柱色層分析(製品名：DIAION HP-20、三菱化學公司製：500mL、溶出；H2O、50%甲醇、100%甲醇)進行分離且製得1.7g。其次，藉由製備層析用HPLC(製品名：Hitachi L-7100、日立公司製)精製所得的分離物，製得化合物(X)(5.0mg)。柱係使用製品名：CAPCELL PAK C18 UG 120、20φx250mm(資生堂公司製)，移動相如表1所示(A：H2O、B：甲醇)。製備層析用HPLC之流速為8mL/分鐘，藉由紫外線吸光度檢測器之檢測波長280nm進行檢測。
如上述所得的化合物(X)之NMR數據，如下所述。
1H-NMR(400MHz、DMSO-d6)δ 4.49(1H,dd,J=5.2Hz) 5.59(1H,dt,J=5.6Hz)6.55(1H,d,J=3.6Hz)7.48(1H,d,J=3.6Hz)9.52(1H,s)
13C-NMR(100MHz、DMSO-d6)δ 55.9 109.7 124.5 151.7 162.1 178.0
為確定上述所得的化合物(X)之構造時，將其與市售品之羥甲糠醛(製品名：5-Hydroxymethyl-2-furaldehyde、東京化成販賣股份有限公司)比較。於下述中，係表示市售品之羥甲糠醛的NMR數據。
1H-NMR(400MHz、DMSO-d6)δ 4.51(1H,dd,J=5.2Hz)5.59(1H,dt,J=5.6Hz)6.60(1H,d,J=3.6Hz)7.49(1H,d,J=3.6Hz)9.56(1H,s)
13C-NMR(100MHz、DMSO-d6)δ 55.9 109.7 124.4 151.7 162.1 177.9
由於上述所得的化合物(X)之NMR數據與市售品一致，可知化合物(X)為羥甲糠醛(下述構造式)。由上述可知，在蘆筍莖熱水加熱處理物中含有羥甲糠醛。
(實施例2)
(藉由蘆筍莖熱水加熱處理製造新穎的羥甲糠醛衍生物)
在蘆筍莖(新鮮重量1.0kg)中加入水1L，以熱水加熱處理為目的時使用壓熱鍋進行加熱滅菌(121℃、20分鐘)，然後，以濾布過濾，且將所得的液體在減壓下，以蒸發器予以濃縮，製得蘆筍莖熱水加熱處理物。將所得的加熱處理物藉由柱色層分析(製品名：DIAION HP-20、三菱化學公司製：500mL、溶出；H2O、30%甲醇、100%甲醇)進行分離。其次，將所得的分離物723.8mg藉由柱色層分析(製品名：Sephadex LH-20、Pharmacia Fine Chemical公司製；250mL、溶出；H2O)予以精製。另外，將所得的分離物12.6mg藉由製備層析用HPLC(製品名：Hitachi L-7100、日立公司製)予以精製，製得化合物(Y)(2.0mg)。製備層析用HPLC之條件與實施例1相同。
將上述所得的化合物(Y)藉由HPLC(製品名：Hitachi L-7100、日立公司製)分析的結果，滯留時間(retardation time)為22.99分鐘。於該分析用HPLC中，柱係使用製品名：CAPCELL PAK C18 UG 120、4.6φx250mm(資生堂公司製)，移動相如表2所示(C：20mM磷酸鈉緩衝液(pH值2.3)、D：乙腈)。分析用HPLC之流速為1mL/分鐘，藉由紫外線吸光度檢測器之檢測波長280nm進行檢測。
上述所得的化合物(Y)之LC/Tof MS分析數據，如下所述。
實測值m/z 238.0710([M+H]+)；C11H12NO5
理論值m/z 238.0715([M+H]+)；C11H12NO5
由上述可知，上述所得的化合物(Y)為具有C11H11NO5之分子式。
上述所得的化合物(Y)之1H-NMR數據，如下所述。
1H-NMR(400MHz、CD3OD)δ 2.00(4H,m)4.20(1H,dd,J=3.9,9.2Hz)5.20(2H,s) 6.55(1H,d,J=3.6Hz)7.37(1H,d,J=3.6Hz)9.45(1H,s)
(實施例3)
(新穎的羥甲糠醛衍生物之合成)
於實施例2中所得的化合物(Y)(C11H11NO5)係預測藉由來自蘆筍莖之焦麩胺酸(C5H7NO3)與果糖(C6H12O6)在加熱下所生成。為驗證該物時，使用焦麩胺酸及果糖以下述方法合成化合物。而且，考慮化合物(Y)存在有如下述之立體異構物時，各合成以L-焦麩胺酸為起始材料之S(L)體、及以D-焦麩胺酸為起始材料之R(D)體。
於錐形瓶中混合L-焦麩胺酸(製品名：L-Pyroglutamic acid、東京化成販賣股份有限公司)3.0g與D-果糖(製品名：D(-)-fructose、純正化學股份有限公司)1.5g，使用壓熱鍋進行加壓加熱處理(121℃、20分鐘)。將所得的反應物藉由柱色層分析(製品名：DIAION HP-20、三菱化學公司製：150mL、溶出；H2O、30%甲醇、100%甲醇)進行分離。其次，將100%甲醇分離物藉由使用柱(製品名：CAPCELL PAK C18 UG 120、20φx250mm、資生堂公司製)之製備層析用HPLC進行精製，製得S體之化合物(Z)(24.4mg)。製 備層析用HPLC之條件與實施例1相同。
於錐形瓶中混合D-焦麩胺酸(製品名：D-Pyroglutamic acid、東京化成販賣股份有限公司)2.0g與D-果糖(製品名：D(-)-fructose、純正化學股份有限公司)1.0g，使用壓熱鍋進行加壓加熱處理(121℃、20分鐘)。將所得的反應物藉由柱色層分析(製品名：DIAION HP-20、三菱化學公司製：100mL、溶出；H2O、30%甲醇、60%甲醇)進行分離。其次，將60%甲醇分離物在減壓下，以蒸發器濃縮至約50mL，然後，以醋酸乙酯(50mLx5)進行分液。將醋酸乙酯層在減壓下，以蒸發器予以濃縮，藉由柱色層分析(製品名：DIAION HP-20、三菱化學公司製：10mL、溶出；H2O、30%甲醇、60%甲醇)進行分離。將60%甲醇在減壓下，以蒸發器予以濃縮，製得R體之化合物(Z)(24.6mg)。
使藉由上述所得的S體、R體之化合物(Z)進行HPLC分析(製品名：Hitachi L-7100、日立公司製)的結果，滯留時間各為22.89分鐘。分析用HPLC之條件與實施例2相同。
有關藉由上述所得的S體、R體之化合物(Z)，MS、NMR分析數據如下所示。
EI-MS：m/z 237
EI-HR-MS：m/z 237.0612；C11H11NO5
1H-NMR(400MHz、CD3OD)：S體δ 2.33(4H,m) 4.34(1H,dd,J=3.9,9.0Hz)5.51(2H,s)6.73(1H,d,J=3.4Hz)7.38(1H,d,J=3.4Hz)9.57(1H,s)
13C-NMR(100MHz、CD3OD)：S體δ 25.8 30.2 57.0 59.6 114.0 124.0 154.5 156.7 173.4 179.6 181.1
1H-NMR(400MHz、CD3OD)：R體δ 2.33(4H,m)4.34(1H,dd,J=3.9,9.0Hz)5.27(2H,s)6.73(1H,d,J=3.6Hz)7.38(1H,d,J=3.6Hz)9.57(1H,s)
13C-NMR(100MHz、CD3OD)：S體δ 25.8 30.3 57.0 59.6 113.7 124.0 154.5 156.8 173.4 179.6 181.1
為決定實施例2所得的化合物(Y)之絕對構造時，將實施例2所得的化合物(Y)與藉由上述所得的S體之化合物(Z)、R體之化合物(Z)使用對掌柱(製品名：CHIRAL PAK 1A、4.6φx150mm、DIACEL公司製)進行HPLC分析(製品名：Hitachi L-7100、日立公司製)。柱以外之分析用HPLC條件與實施例2相同。結果，S體之化合物(Z)的滯留時間為18.92分鐘，R體之滯留時間為20.57分鐘。由於實施例2所得的化合物(Y)之滯留時間為19.06分鐘，故可知實施例2所得的化合物(Y)為S體。
實施例2之HPLC分析數據、LC/Tof MS分析數據及1H-NMR數據、與本實施例之上述分析數據相比時，藉由實施例2所得的化合物(Y)與藉由本實施例所得的化合物 (Z)係表示相同的化合物。而且，可知在實施例2所得的蘆筍莖熱水加熱處理物中至少含有具下述構造式之羥甲糠醛衍生物的S體。
(實施例4)
(HSP70 mRNA表現誘發活性之評估)
將市售品之羥甲糠醛(與實施例1相同)(以下稱為試料1)、以實施例3所合成的羥甲糠醛衍生物之S體(以下稱為試料2-S)及同羥甲糠醛衍生物之R體(以下稱為試料2-R)、以下述方法所製造的蘆筍莖熱水加熱處理物(以下稱為試料3)及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物(以下稱為試料4)之HSP70誘發活性藉由測定HSP70之mRNA表現水平進行評估。
下述係表示試料3之製造方法。於綠色蘆筍莖(新鮮重量6.63kg)中加入水28.5L，以熱水加熱處理為目的時進行加壓滅菌(121℃、20分鐘)。於冷卻後，以濾紙(製品名：東洋濾紙5A、東洋濾紙公司製)過濾，且以蒸發器進行濃縮。於濃縮液約10L中添加賦形劑(製品名：Pinedex、松谷化學工業公司製)275.4g，進行結凍乾燥，製得含蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末542.4g(其中，來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物267.0g、賦形劑275.4g)。
下述係表示試料4之製造方法。於綠色蘆筍莖(新鮮重 量12kg)中加入水24L，以熱水加熱處理為目的時進行加壓滅菌(121℃、20分鐘)。放冷至45℃後，以Sucrase C(製品名)(三菱化學食品公司製)20g及Maserozyme A(製品名)(Yakult藥品工業公司製)20g，且於45℃下進行酵素處理3日。然後，進行加壓滅菌(121℃、20分鐘)且以濾布過濾，回收濾液35L。藉由蒸發器進行濃縮至9L之容量為止。於濃縮液中添加賦形劑(製品名：Pinedex、松谷化學工業公司製)1.20kg，再次進行加壓滅菌(121℃、20分鐘)。然後，進行結凍乾燥，製得含酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末2.12kg(其中，來自蘆筍莖固成分之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物0.92g、賦形劑1.20kg)。
首先，有關試料1、試料2-S及試料2-R，使用人體前骨髓性白血病細胞(HL-60細胞)評估HSP70 mRNA表現水平。
下述係表示使用人體前骨髓性白血病細胞(HL-60細胞)之HSP70 mRNA表現水平之評估法。將HL-60(提供源：大日本製藥)懸浮於添加有10%牛胎兒血清(FBS)(製品名：MultiSer、Thermo Trace公司製)之RPMI1640培養基(製品名：RPMI1640培養基「Nissui」(2)粉末、日水製藥股份有限公司製)中，移至1.5mL試管內(50萬個/1mL/試管)。同時添加以離子交換水所調製的各試料(試料1、試料2-S及試料2-R)0.1mL使最終濃度為1mg/mL。對照組係添加離子交換水0.1mL。在37℃、5%CO2存在下培養4小時後，以3,000rpm回收細胞，提供mRNA檢測用。使用TRIzol reagent(Life Technologies公司製)自該物萃取出全部RNA(Total RNA)，以Nanodrop(Thermo Scientific公司製)測定濃度。使用cDNA合成試劑盒(製品名：ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover、Toyobo Life Science公司製)，合成cDNA。使逆轉印後之反應液以無核酸酶(Nuclease-free)水稀釋成3ng/μL，做為real-time PCR(即時聚合酶連鎖反應)之鑄模。
於PCR中，使用HSP70前置引子(forward primer)(配列編號1)、及HSP70反置引子(reverse primer)(配列編號2)做為引發物質。使用beta 2微球蛋白遺傳子做為修正HSP70遺傳子表現之內部標準遺傳子，其引發物質係使用beta 2微球蛋白前置引子(配列編號3)、及beta 2微球蛋白反置引子(配列編號4)。Real-time PCR係藉由以反應試劑盒(製品名：SsoAdvanced SYBR Green Supermix、Bio-Rad公司製)之同步PCR解析系統(製品名：CFX Connect、Bio-Rad公司製)。全部10μL之PCR反應液在95℃下進行培養3分鐘(初期改質)，然後在95℃下進行改質1秒，在59℃下進行回溫10秒，重複進行40次。
使用藉由上述同步PCR解析系統所得的Cq值，以下述計算式為基準求得HSP70遺傳子之表現量比(△△Ct法)。而且，Cq值係表示於遺傳子之增幅反應中使經增幅的遺傳子達到一定量時之反應循環數。
對照組之HSP70的Cq值：A
對照組之B2M的Cq值：B
試料之HSP70的Cq值：C
試料之B2M的Cq值：D
△Cq(對照組)=A-B
△Cq(試料)=C-D
△(△Cq)=△Cq(試料)-△Cq(對照組)
表現量比=2-△(△Cq)
結果如圖1所示。於圖1中，以試料1、試料2-S及試料2-R之HSP70 mRNA表現誘發活性做為對對照組而言的比例(%)。試料1、2-S及2-R與對照組相比時，HSP70 mRNA表現增強約3~9倍(試料2-S、2-R、**p<0.01 vs對照組、試料1、*p=0.069 vs對照組)。由此可知，羥甲糠醛以及具有下述構造式之羥甲糠醛衍生物的S體及R體具有的HSP70誘發活性為mRNA表現水平。
其次，有關試料1、試料3及試料4，使用人體子宮頸癌細胞(HeLa細胞)進行評估HSP70 mRNA表現水平。
將人體子宮頸癌細胞(HeLa細胞)(提供源：獨立行政法人理化學研究所Bioresource Center)懸浮於添加有10%牛胎兒血清(FBS)(製品名：MultiSer、Thermo Trace公司製)之Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)(製品名：Dulbecco’s Modified Eagle Medium「Nussui」2粉末、日本製藥公司製)，播種於6孔板上(20萬個/2mL/well)。翌日， 交換成浮現的DMEM(1.8mL)，且添加以離子交換水調製的各試料0.2mL使各最終濃度為1mg/mL(試料3及4係來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之最終濃度為1mg/mL)。對照組係添加離子交換水0.2mL。培養22小時後，以細胞刮刀剝離細胞，提供給mRNA檢測用。由此可知，使用RNA萃取試劑盒(製品名：Fast Pure RNA kit、Takara Bio公司製)萃取全部RNA，且以DEPC處理水稀釋成100倍後，以分光光度計測定吸光度(波長260nm)。RNA濃度係使用吸光度(波長260nm)x40x稀釋倍率=RNA濃度(ng/μL)之計算式求得。將RNA溶液以TE緩衝液稀釋成任意的濃度，且使用cDNA合成試劑盒(製品名：Prime Script 1st Strand cDNA synthesis kit、Takara Bio公司製)合成cDNA。引發物質係使用Oligo dT primer(製品名)(Takara Bio公司製)。將逆轉印後之反應液以TE緩衝液稀釋成10ng/μL，做為PCR之鑄模。
於PCR中，使用HSP70前置引子(配列編號5)及HSP70反置引子(配列編號6)做為引發物質。使用beta 2微球蛋白遺傳子做為修正HSP70遺傳子之表現的內部標準遺傳子，使用beta 2微球蛋白前置引子(配列編號3)及beta 2微球蛋白反置引子(配列編號4)做為其引發物質。於PCR中使用PCR酵素(製品名：TaKaRa EX Taq、Takara Bio公司製)。使全部20μL之PCR反應液在94℃下進行培養1分鐘(初期改質)，然後，在94℃下進行改質30秒，在57℃(HSP70)或59℃(beta 2微球蛋白)進行回溫30秒，以及在72℃下進 行伸長30秒，重複循環操作32次(HSP70)或24次(beta 2微球蛋白)。最後，在72℃下進行伸長反應30秒，完成全部的PCR。使PCR反應液藉由常法進行電泳後，藉由溴化乙菲錠予以染色。
藉由以AlphaView(製品名)(Alpha Innotech公司製)測定紫外線照射下之螢光強度，測定HSP70遺傳子之表現量。此時，以藉由內部標準遺傳子之表現量所修正之值做為HSP70遺傳子之表現量。
結果如圖2所示。圖2係表示試料1,3及4之HSP70 mRNA表現誘發活性各對對照組之比例(%)。試料1,3及4與對照組相比時，HSP70 mRNA之表現量約增強1.2~1.5倍(試料1,4、**p<0.01 vs對照組、試料3、*p<0.05 vs對照組)。由此可知，羥甲糠醛、本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物具有的HSP70誘發活性為mRNA表現水準。
(實施例5)
(HSP70蛋白質表現誘發活性之評估)
藉由測定HSP70蛋白質表現水平進行評估與實施例4相同的試料1、3及4之HSP70誘發活性。
與實施例4相同地，將懸浮於DMEM(添加10%FBS)之HeLa細胞播種於12孔板上(10萬個/mL/well)。翌日，交換成浮現的DMEM(0.9mL)且添加0.1mL以離子交換水所調製的各試料使各最終濃度為1mg/mL(有關試料3,4係來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆 筍莖熱水加熱處理物的最終濃度為1mg/mL)。對照組中係添加0.1mL離子交換水。培養24小時後，除去培養上層澄清液，且以PBS(-)(磷酸緩衝生理食鹽水、pH值7.2)洗淨。然後，以細胞刮刀剝離部分細胞，回收1.5mL試管，提供給HSP70蛋白質定量及全部蛋白質定量用。
有關HSP70蛋白質之定量係使用HSP70 ELISA試劑盒(製品名)(Enzo公司製)，有關全部蛋白質之定量係使用Micro BCA Protein Assay Reagent試劑盒(製品名)(PIERCE Biotechnology公司製)。有關殘餘的細胞係藉由3-(4,5-dimethylthial-2-yl)-2,5-diphenyltetrazalium bromide(MTT)法評估對細胞增殖的影響。然後，以全部蛋白質質量及生細胞數所修正之值做為HSP70蛋白質質量。
結果如圖3所示。圖3係表示試料1,3及4之HSP70蛋白質表現誘發活性對對照組而言之比例(%)表示。G4。試料1,3及4與對照組相比時，HSP70蛋白質表現約增強1.3倍(*p<0.05 vs對照組)。由此可知，羥甲糠醛、本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物具有的HSP70誘發活性為蛋白質表現水平。
藉由上述可知，羥甲糠醛、本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物及酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物，具有優異的HSP70誘發活性。
(實施例6)
(斷眠試驗老鼠之抗壓效果的評估)
使用斷眠試驗老鼠，評估實施例4所得的蘆筍莖熱水 加熱處理物(實施例4之”試料3”)之抗壓效果。
將32隻6周大的雄性Sic：ddY老鼠(Clea Japan公司製)分為4群(各群8隻)。各為正常群、對照群、低用量蘆筍莖熱水加熱處理物群(以下稱為低用量群)及高用量蘆筍莖熱水加熱處理物群(以下稱為高用量群)。自負荷斷眠壓力之7日前，低用量群老鼠以200mg/kg(來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物換算)之用量，高用量群老鼠以1000mg/kg(同換算)之用量，於一般粉末飼料(製品名CE-2、Clea Japan公司製)中添加含有蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末，每日餵食。正常群、對照群餵食一般的粉末飼料。經過3日後，對照群、低用量群及高用量群藉由使老鼠浸水1日2小時(8：00~20：00)，進行斷眠壓力負荷。正常群沒有施予斷眠壓力負荷。
有關抗壓效果，對最後斷眠壓力負荷日之翌日的老鼠進行(1)測定做為氧化壓力指標之血清中過氧化脂質量(對血清三酸甘油脂(TG)量而言之過氧化物脂質(LPO)量比(LPO/TG))，(2)測定做為壓力荷爾蒙之已知血中皮質固酮濃度，及(3)評估脫毛老鼠之表現率予以檢討。
圖4係表示血清中過氧化脂質量之測定結果。圖中LPO/TG之值愈高時，呈現血中氧化壓力愈高的狀態。對照群之LPO/TG之值變高，惟低用量群及高用量群直至與正常群相同程度為止，LPO/TG之值變低(*p<0.05 vs對照群)。由此可知，因斷眠壓力負荷而血中氧化壓力變高的狀態之老鼠，藉由攝取本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物， 血中氧化壓力減低至無斷眠壓力負荷之水平。
圖5係表示血中皮質固酮濃度之測定結果。圖中皮質固酮濃度之值愈高時，呈現高壓力狀態。對照群中皮質固酮濃度之值變高，惟低用量群中直至與正常群相同程度為止，皮質固酮濃度之值變低，另外，高用量群較正常群之皮質固酮濃度之值更低(**p<0.01 vs對照群、*p<0.05 vs對照群)。由此可知，因斷眠壓力負荷而表現高壓力狀態的老鼠，藉由攝取本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物，高壓力狀態減低至無斷眠壓力負荷之水平，另外，高用量群減低至該水平以下。
圖6係表示脫毛老鼠之表現率。圖中脫毛表現率愈高時，表現高壓力狀態。正常群、對照群、低用量群及高用量群之脫毛表現率，各為0%、75.0%、37.5%及12.5%，低用量群及高用量群與對照群相比時，脫毛表現率低。由此可知，因斷眠壓力負荷而表現高壓力狀態的老鼠，藉由攝取本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物，可減低高壓力狀態。
由上述可知，含有本實施例之羥甲糠醛衍生物之蘆筍莖熱水加熱處理物，具有優異的抗壓力效果。
(實施例7)
(斷眠試驗老鼠之HSP70蛋白質表現誘發活性的評估)
使用實施例6所使用的老鼠，藉由測定胃、肝臟及腎臟之HSP70蛋白質表現水平進行評估實施例4所得的蘆筍莖熱水加熱處理物(實施例4之”試料3”)之HSP70誘發活性。
在實施例6之試驗最終日屠殺各群老鼠，各摘取胃、肝臟及腎臟。將各內臟(50mg)加入1.5mL之試管中，加入添加有0.2%(v/v)Protease Inhibitor Cocktail(製品名)(Sigma公司製)之HSP70 ELISA試劑盒(製品名)(Enzo公司製)之萃取試藥500μL。然後，在冰塊上使用研磨棒，將各內臟器官搗碎，在4℃下，以1,500rpm進行離心分離30分鐘後，回收上層澄清液。將上層澄清液提供給HSP70蛋白質之定量及全部蛋白質之定量。
與實施例5相同地，有關HSP70蛋白質之定量係使用HSP70 ELISA試劑盒(製品名)(Enzo公司製)進行，有關全部蛋白質之定量係使用Micro BCA Protein Assay Reagent試劑盒(製品名)(PIERCE Biotechnology公司製)進行。以全部蛋白質量所修正之值做為HSP70蛋白質量。
圖7~9係表示胃、肝臟及腎臟之HSP70蛋白質表現量。圖7~9係表示對照群、低用量群及高用量群之HSP70蛋白質表現誘發活性各對正常群之比例(%)。於胃(圖7)及肝臟(圖8)中，對照群與正常群相比時HSP70蛋白質表現量雖降低，惟低用量群及高用量群為與對照群相同程度或其以上，HSP70蛋白質表現被增強(*p<0.05 vs對照群)。於腎臟(圖9)中，低用量群與高用量群與對照群相比時，HSP70蛋白質表現被增強(**p<0.01 vs對照群)。
藉由上述可知，將含有本實施例之羥甲糠醛衍生物的蘆筍莖熱水加熱處理物投予動物時，具有的優異HSP70誘發活性亦為蛋白質表現水平。而且，於實施例6中所示之 抗壓效果之作用機序之一，示唆含有本實施例之羥甲糠醛衍生物的蘆筍莖熱水加熱處理物之HSP70表現誘發活性。
(實施例8)
(人體之HSP70 mRNA表現誘發活性之評估)
使用實施例4所得的蘆筍莖熱水加熱處理物(實施例4之”試料3”)，藉由測定HSP70 mRNA表現水平評估人體白血球中之HSP70誘發活性。
以自願參加的自願者3名做為被試驗者(以下稱為被試驗者1、被試驗者2及被試驗者3)。將含有蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末以被試驗者1(200mg/日)、被試驗者2(400mg/日)及被試驗者3(800mg/日)之用量，分1日2次(早晚各一次)服用，攝取3日(該含有蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末200mg(被試驗者1)、400mg(被試驗者2)及800mg(被試驗者3)中各含有98mg、197mg及394mg來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物)。
於攝取開始前及攝取完成日進行採血，測定白血球中之HSP70 mRNA表現量。將1mL血混合於37℃之ACK緩衝溶液(0.15M氯化銨、1.0mM碳酸氫鉀、0.1mM EDTA-2Na、pH7.2)10mL，且在37℃下保溫10分鐘。然後，以3,000rpm進行離心分離5分鐘，除去上層澄清液。再次於經沉澱的白血球中加入ACK緩衝溶液10mL予以懸浮。重複3次相同的操作後，在經沉澱的白血球中加入Trizol reagent(製品名)(Life Technologis公司)1.5mL，萃取全部RNA。含有PCR反應之繼後操作與實施例4(HeLa細 胞之評估)相同地進行，評估HSP70 mRNA之表現量。
結果如圖10所示。圖10係表示對攝取開始前之白血球中的HSP70 mRNA表現量而言攝取完成後的各比例(%)。攝取完成後之白血球中的HSP70 mRNA表現與攝取開始前相比，蘆筍莖熱水加熱處理物之用量相關性增強約2.5~3.5倍。
由上述可知，即使將含有本實施例之羥甲糠醛衍生物的蘆筍莖熱水加熱處理物投予人體時，具有的優異HSP70誘發活性仍為mRNA表現水平。
(實施例9)
(蘆筍莖熱水加熱處理物之自律神經調節效果的臨床評估)
使用實施例4所得的蘆筍莖熱水加熱處理物(實施例4之”試料3”)，評估人體之自律神經調節效果。
以自願參加的自願者30名做為被試驗者，進行無做為的偽藥對照群‧雙盲試驗。被試驗者抽籤決定分為偽藥群(以下稱為P群)15名，及蘆筍莖熱水加熱處理物群(以下稱為A群)15名。於試驗期間中每隔4周、每日中1日2次(早晚各1次)，P群之被試驗者服用賦形劑(製品名：Pinedex、松谷化學工業公司製)(400mg/日)，另外，A群之被試驗者服用含有蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末(400mg/日)(於該含有蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末400mg中，197mg為來自蘆筍莖固成分之蘆筍莖熱水加熱處理物、殘餘的203mg為賦形劑(同上))。
於攝取開始前及攝取完成日使用加速度脈搏檢查系統 (製品名：Pulse analyzer Plus TAS-9、YKC公司製)，評估自律神經平衡性及自律神經活動度。該系統係藉由自指尖測定加速度脈搏，檢測心跳微細變化(Heart Rate Variablility：HRV)，且評估自律神經功能的系統。HRV係表示自律神經對保持心跳之各種影響而言的臨床全部結論。有關自律神經平衡性係以藉由該系統所提供的交感神經活動而言之指標(Low Frequency：LF)為X軸，以對副交感神經活動而言之指標(High Frequency：HF)為Y軸之圖形化的二次元圖表中，使用該圖表上之最佳的自律神經平衡性之點、與實測值之點間的距離進行評估。另外，有關自律神經活動度，係使用藉由該系統所提供的自律神經之活動度的數值(使用LF及HF等，藉由該系統求得)。
圖11係表示自律神經平衡性的變化。圖中數值愈接近0時，自律神經之平衡性愈佳。P群(偽藥群)在與試驗開始前相比，試驗完成日之自律神經的平衡性惡化。另外，A群(蘆筍莖熱水加熱處理物群)在與試驗開始前相比，試驗完成日之自律神經平衡性經改善(*p<0.05 vs試驗開始前、p<0.01 vs偽藥群)。由此可知，藉由服用本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物，可改善自律神經之平衡性。
圖12係表示自律神經活動度的變化。圖中數值愈高時，自律神經活動度愈高。P群(偽藥群)在與試驗開始前相比，試驗完成日會有自律神經活動度降低的情形。另外，於A群(蘆筍莖熱水加熱處理物群)與試驗開始前相比，試驗完成日會有自律神經活動度上昇的情形。由此可知，藉 由服用本實施例之蘆筍莖熱水加熱處理物，可改善自律神經活動。
由上述可知，含有本發明之羥甲糠醛衍生物的蘆筍莖熱水加熱處理物，具有優異的自律神經調節效果。
(實施例10)
(酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理之人體的HSP70 mRNA表現誘發活性評估、及自律神經調節效果的臨床評估)
使用如下述所得的酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物填充膠囊，進行人體之HSP70 mRNA表現誘發活性評估及自律神經調節效果之臨床評估。
(酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物填充膠囊之製造方法)
下述係表示人體攝取用酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物填充膠囊之製造法。在綠色蘆筍莖(新鮮重量130kg)中加入170L水，以熱水加熱處理為目的時進行加熱殺菌(100℃、45分鐘)。放冷至45℃後，添加酵素(Sumizyme C、及Sumizyme MC；Yakult藥品工業公司製)3.0kg，且在45℃下進行攪拌24小時。然後，使酵素失活(100℃、20分鐘)，進行離心分離。藉由蒸發器予以濃縮，添加賦形劑(製品名：Pinedex、松谷化學工業公司製)9.0kg，且進行加壓滅菌(121℃、45分鐘)。繼後，藉由噴霧-乾燥製得含有酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末16.0kg(其中，來自蘆筍莖固成分之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物7.0kg、賦形劑9.0kg)。混合該含有酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之粉末8.50kg與防止固結劑(製品名：硬脂酸鈣、Science 公司製)1.86kg、纖維素(製品名：CEOLUS、旭化成公司製)8.20kg，調製含有20%來自蘆筍莖固成分之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物之膠囊用粉末。以於1號膠囊中每1膠囊填充280mg該膠囊用粉末者做為酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物填充膠囊。
(評估方法)
以自願參加的自願者20名做為被試驗者。進行以低用量在短時間無做為的偽藥對照群‧雙盲試驗。將被試驗者分為偽藥群(以下稱為P群)10名，或酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物群(以下稱為E群)10名。於試驗期間中經過1周、每日晚飯後P群之被試驗者服用偽藥膠囊(製品名：Pinedex(松谷化學工業公司製)699.9mg、及製品名：Marutsu Extract(Oriental工業公司製)140.1mg之混合物、計840mg(3膠囊)/日)(該酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物填充膠囊840mg中，168mg為來自蘆筍莖固成分之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物、殘餘的672mg為Pinedex、硬脂酸鈣及CEOLUS)。評估項目為白血球中之HSP70 mRNA之表現量、自律神經平衡性及自律神經活動度。
(HSP70 mRNA表現誘發活性評估)
首先，測定白血球中之HSP70 mRNA表現量水平。於試驗開始前及試驗完成日進行採血，使用RNA萃取試劑盒(製品名：Nucleo Spin RNA Blood、Takara Bio公司製)自血液400μL萃取全部RNA。cDNA之合成、及PCR之方法以實施例8記載的方法為基準。
結果如圖13所示。圖13係表示對攝取開始前之白血球中之HSP70 mRNA表現量而言攝取完成後之各比例(%)。P群(偽藥群)之HSP70 mRNA表現量與攝取開始前相比，平均值為175%。另外，E群(酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物群)之HSP70 mRNA表現量與攝取開始前相比，平均值為278%，表現被增強(*p=0.098 vs P群)。由此可知，藉由服用本實施例之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物，可顯著增強HSP70 mRNA之表現量。
(有關自律神經調節效果之臨床評估)
其次，於試驗開始前與試驗完成日使用加速度脈搏檢察系統(製品名：Pulse Analyzer Plus TAS-9、YKC公司製)，評估自律神經平衡性及自律神經活動度。測定之詳細方法如實施例9所記載。
圖14係表示自律神經平衡性之變化。P群(偽藥群)中，試驗完成日與試驗開始前相比時，自律神經平衡性顯著惡化(*p<0.05 vs試驗開始前)。另外，E群(酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物群)，試驗完成日與試驗開始前相比時，自律神經之平衡性經改善。由此可知，藉由服用本實施例之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物，可改善自律神經之平衡性。
圖15係表示自律神經活動度之變化。P群(偽藥群)中，試驗完成日與試驗開始前相比時，自律神經活動度顯著惡化(**p<0.01 vs試驗開始前)。另外，E群(酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物群)，試驗完成日與試驗開始前相比時，自 律神經之活動度經改善。由此可知，藉由服用本實施例之酵素處理蘆筍莖熱水加熱處理物，可防止自律神經活動度惡化。
由上述說明可知，本發明可提供新穎的羥甲糠醛衍生物、具有優異效果之醫藥品、HSP誘發劑、抗壓劑、及自律神經調節劑。而且，可提供具有優異的HSP誘發活性、抗壓效果及自律神經調節效果之飲食品。另外，可提供可低成本化且簡單製造羥甲糠醛衍生物的方法。
而且，本發明在不脫離本發明廣義的精神及範圍內，可為各種的實施形態及變形。而且，上述之實施形態係為說明本發明者，不限制本發明之範圍。總之，本發明之範圍不為實施形態，係申請專利範圍所示者。因此，在申請專利範圍內及與其同等的發明意義之範圍內所實施的各種變形，皆在本發明之範圍內。
本發明係以2011年12月20日所提出的日本專利申請2011-277926號為基準。於本說明書中參照採用日本專利申請2011-277926號說明書、申請專利範圍、圖式全體。
<110> AMINO UP CHEMICAL CO.,LTD.
<120> 羥甲糠醛衍生物
<130> 12F096-PCT
<150> JP2011-277926
<151> 2011-12-20
<160> 6
<170> PatentIn版本3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> HSP70前置引子
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> HSP70反置引子
<400> 2
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> beta 2微球蛋白前置引子
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> beta 2微球蛋白反置引子
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> HSP70前置引子
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> HSP70反置引子
<400> 6

Claims (5)

  1. 一種羥甲糠醛衍生物的製造方法，其係包括：在蘆筍莖中加入1倍量至50倍量之水，在50℃至300℃的溫度下對蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟；以及藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理所得之加熱處理物經由管柱色層分析進行分離的步驟；該羥甲糠醛衍生物係以一般式表示， 式中，R係選自下述式(I) 及(IV)氫原子所構成之群。
  2. 如請求項1中所記載之羥甲糠醛衍生物的製造方法，其中在前述將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟，係以0.1MPa至0.2MPa的壓力對蘆筍莖進行熱水加熱處理。
  3. 如請求項1中所記載之羥甲糠醛衍生物的製造方法，其中在將蘆筍莖進行熱水加熱處理的步驟之後，進一步含有藉由將蘆筍莖進行熱水加熱處理所得之加熱處理物放冷後，添加0.1%至5%之由纖維素酶、半纖維 素酶、果膠酶、澱粉酶、支鏈澱粉酶所構成之群組中至少選擇一種之酵素，且在30℃至60℃下進行酵素處理1小時至72小時之步驟。
  4. 一種蘆筍莖熱水加熱處理物的用途，其係用於製備以蘆筍莖熱水加熱處理物做為有效成分之熱休克蛋白質誘發劑、抗壓劑或自律神經調節劑；前述蘆筍莖熱水加熱處理物係含有如請求項1所記載之羥甲糠醛衍生物的製造方法所製造之羥甲糠醛衍生物。
  5. 一種蘆筍莖加熱處理物的用途，其係用於製備以藉由將蘆筍莖進行加熱處理所得之蘆筍莖加熱處理物做為有效成分之熱休克蛋白質誘發劑、抗壓劑或自律神經調節劑。
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