KR102059885B1 - 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체 - Google Patents

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도모히로 이토
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Abstract

하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 일반식 (A):
Figure 112014066753983-pct00017
(식 중, R은 식 (I):
Figure 112014066753983-pct00018
, (II) HOOCCH2COCO-, (III) HOOCCH2CH2COCO- 및 (IV) 수소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택된다)로 표시된다.

Description

하이드록시메틸푸르푸랄 유도체{Hydroxymethylfurfural derivative}
본 발명은 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체, 의약품, 열 충격 단백질 유도제, 항스트레스제, 자율 신경 조절제, 음식품 및 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
장시간의 노동, 다양한 육체적 및 정신적 스트레스 환경 등에 노출되는 현대인에 있어서, 많은 사람들은, 건강진단 등의 검사를 행해도 이상이 인정되지 않음에도 불구하고, 식욕 부진, 불면, 현기증, 식은땀 등의 신체적 증상, 또는 인간 불신, 정서 불안정, 초조, 억울한 기분 등의 정신적 증상을 호소하고 있다. 이러한 부정 수소를 수반하는 증상은 자율 신경 실조증으로 진단되는 경우가 많다. 이러한 자율 신경 실조증에 대해서는 통상 항불안약, 호르몬제 등의 약물 요법, 식사 요법, 운동 등에 의한 생활 습관의 개선 등에 의해 대처하고 있는 것이 현재 상황이다.
과도한 스트레스 부하에 의해, 상기 서술과 같은 자율 신경 실조증을 시작으로 한 자율 신경 장해가 유발되는 경우가 알려져 있다. 자율 신경 장해에 있어서는 교감 신경과 부교감 신경의 균형(자율 신경의 밸런스)의 교란, 자율 신경의 활동도의 저하 등이 보인다. 자율 신경의 밸런스의 교란이란, 교감 신경이 우위인 상태, 또는 부교감 신경이 우위인 상태를 의미한다. 또한, 자율 신경의 활동도의 저하에 의해, 스트레스 대처 능력이 저하되는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 소화관의 기능은 주로 부교감 신경에 지배되고 있기 때문에, 스트레스 부하에 의해 교감 신경의 긴장이 지속되면, 소화관의 기능이 억제되어, 식욕 부진, 변비 등의 위장 장해가 발생한다. 또한, 스트레스 부하에 의해 부교감 신경이 제대로 기능하지 않고 교감 신경의 활동의 항진이 계속되면, 불면이 발생한다고 생각되고 있다.
상기 서술한 바와 같이, 스트레스와 자율 신경 장해 사이에는 밀접한 관련성이 존재하는 한편, 스트레스 부하에 의한 것이 아닌 자율 신경 장해도 또한 존재한다. 또한, 스트레스 부하는 반드시 자율 신경 장해를 발생시키는 것은 아니며, 다른 신체적 증상을 유발하는 경우도 있다.
스트레스 단백질로 불리는 단백질의 하나로, 열 충격 단백질(이하, HSP)이 있다. HSP는 분자량이 수만~15만 정도의 단백질이며, 분자량에 따라 몇가지의 패밀리로 분류되고 있다(HSP10, HSP27, HSP40, HSP60, HSP70, HSP90, HSP110 등). HSP는, 생체가 물리적, 화학적, 생리적 또는 정신적 스트레스를 받은 경우에, 세포 내에 유도되는 단백질의 1군이다. HSP는 구체적으로는, 생체가 열, 세균 감염, 염증, 활성 산소, 자외선, 기아, 저산소 상태 등의 다양한 스트레스 조건에 노출되었을 때에 발현이 항진되어, 세포를 보호하는 역할을 가진다. 또한, 단백질의 접힘(폴딩)의 제어, 이상 단백질의 응집 억제와 같은 분자 샤프론으로서의 기능도 가진다.
HSP 중에서도 특히 HSP70에 대해서는 활발히 연구가 이루어지고 있으며, 소화관이나 피부 등의 많은 장기에 항상 발현하고 있는 것 등이 보고되고 있다. 최근, HSP70의 항세포사 작용 및 항염증 작용이 인정되어, 다양한 스트레스에 대한 세포 보호 효과가 보고되고 있다(비특허 문헌 1~4). 이 때문에, HSP70 유도 활성 물질을 의약품, 화장품 등에 응용하려고 하는 연구가 행해지게 되었다. 천연물 유래의 HSP70 유도 활성 물질에 관해서는 작약의 주성분인 파에오니플로린이 보고되고 있다(비특허 문헌 5).
아스파라거스는 일본에 있어서는 홋카이도를 비롯하여 각지에서 재배 및 수확되는 야채이다. 아스파라거스는 다양한 생리 활성을 가지는 것으로 발견되고 있다. 특허 문헌 1에는 아스파라거스 줄기 추출물이 각종의 피로(육체적 피로, 정신적 스트레스에 의한 피로 등)에 대한 예방 및 회복 효과를 가지는 것으로 기재되어 있다. 또한, 특허 문헌 2에는 아스파라거스 줄기 추출물이 뇌기능 개선 효과를 가지는 것으로 기재되어 있다. 또한 특허 문헌 3에는 아스파라거스 의엽 추출물이 자율 신경 조정 효과를 가지는 것으로 기재되어 있다.
특허문헌 1: 일본국 특허공개 2007-45750호 공보 특허문헌 2: 일본국 특허공개 2007-230870호 공보 특허문헌 3: 일본국 특허공개 2011-153125호 공보
비특허문헌 1: Xiao-Rong Chang et al, World J Gastroenterol; 13(32): 4355-4359(2007) 비특허문헌 2: Sarah M. et al, FASEB J.22, 3836-3845(2008) 비특허문헌 3: Hirata I et al, Digestion； 79(4)： 243-50(2009) 비특허문헌 4: Tadashi Nishida et al, Journal of clinical biochemistry and nutrition； 46(1)： 43-51(2010) 비특허문헌 5: Dai Yan et al, Cell Stress＆Chaperones； 9(4), 378-389(2004)
그러나, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과에 관여하는 아스파라거스 추출물 또는 아스파라거스 처리물 중의 성분에 대해서는, 지금까지 보고가 이루어지지 않았었다.
본 발명자들은 아스파라거스 열수 가열 처리물 유래의 신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 발견하고, 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체가 우수한 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 가지는 것을 발견하여 본 발명을 완성했다. 본 발명은 신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체, 우수한 효과를 가지는 의약품, HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 우수한 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 가지는 음식품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 저비용화가 가능하고 또한 간편한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 제1 관점에 관련된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는
일반식:
Figure 112014066753983-pct00001
(식 중, R은 하기 식 (I):
Figure 112014066753983-pct00002
(II) HOOCCH2COCO-, (III) HOOCCH2CH2COCO- 및 (IV) 수소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택된다)로 표시된다.
상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리함으로써 수득되어도 된다.
본 발명의 제2 관점에 관련된 의약품은 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제3 관점에 관련된 열 충격 단백질 유도제는 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제4 관점에 관련된 항스트레스제는 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제5 관점에 관련된 자율 신경 조절제는 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제6 관점에 관련된 음식품은 상기 열 충격 단백질 유도제, 상기 항스트레스제 또는 상기 자율 신경 조절제를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제7 관점에 관련된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법은 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제조 방법은 효소 처리하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명의 제8 관점에 관련된 열 충격 단백질 유도제는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제9 관점에 관련된 항스트레스제는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 유효 성분으로 한다.
본 발명의 제10 관점에 관련된 자율 신경 조절제는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 유효 성분으로 한다.
본 발명에 의하면, 신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체, 우수한 효과를 가지는 의약품, HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 제공할 수 있다. 또한, 우수한 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 가지는 음식품을 제공할 수 있다. 또한, 저비용화가 가능하고 간편한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체에 의한 HSP70 mRNA 발현 유도 활성을 나타내는 도이다.
도 2는 하이드록시메틸푸르푸랄, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물에 의한 HSP70 mRNA 발현 유도 활성을 나타내는 도이다.
도 3은 하이드록시메틸푸르푸랄, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물에 의한 HSP70 단백질 발현 유도 활성을 나타내는 도이다.
도 4는 마우스 단면(斷眠) 모델에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 혈청 중 과산화 지질량의 변화를 나타내는 도이다.
도 5는 마우스 단면 모델에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 혈중 코르티코스테론 농도의 변화를 나타내는 도이다.
도 6은 마우스 단면 모델에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 탈모 발현율의 변화를 나타내는 도이다.
도 7은 마우스 단면 모델의 위에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 HSP70 단백질 발현량의 변화를 나타내는 도이다.
도 8은 마우스 단면 모델의 간장에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 HSP70 단백질 발현량의 변화를 나타내는 도이다.
도 9는 마우스 단면 모델의 신장에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 HSP70 단백질 발현량의 변화를 나타내는 도이다.
도 10은 인간에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 HSP70 mRNA 발현량의 변화를 나타내는 도이다.
도 11은 인간에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 자율 신경 밸런스의 변화를 나타내는 도이다.
도 12는 인간에 있어서 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 자율 신경 활동도의 변화를 나타내는 도이다.
도 13은 인간에 있어서 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 HSP70 mRNA 발현량의 변화를 나타내는 도이다.
도 14는 인간에 있어서 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 자율 신경 밸런스의 변화를 나타내는 도이다.
도 15는 인간에 있어서 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 투여에 의한 자율 신경 활동도의 변화를 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대해서 상세하게 설명한다.
(1. 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체)
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 하기 일반식으로 표시된다.
Figure 112014066753983-pct00003
상기 일반식 중, R은 하기 식 (I):
Figure 112014066753983-pct00004
(II) HOOCCH2COCO-, (III) HOOCCH2CH2COCO- 및 (IV) 수소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
R이 상기 식 (I)인 경우, 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 하기 구조식으로 표시된다.
Figure 112014066753983-pct00005
R이 상기 식 (I)인 경우, 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 하기의 2개의 입체 이성체를 포함한다(R체 및 S체).
Figure 112014066753983-pct00006
R이 상기(IV) 수소 원자인 경우, 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 하기 구조식으로 표시된다(화합물명: 하이드록시메틸푸르푸랄).
Figure 112014066753983-pct00007
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는, 이하에 나타내는 바와 같이, 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리함으로써 수득되어도 된다.
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는, 이하에 나타내는 바와 같이, 우수한 열 충격 단백질 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 가진다.
(2. 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법)
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법은 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 「열수 가열 처리한다」란, 열수 중에서 가열 처리하는 것을 의미한다. 본 발명에서 이용되는 아스파라거스 줄기로서는, 예를 들면, 그린 아스파라거스, 화이트 아스파라거스, 퍼플 아스파라가스 등의 줄기부를 이용할 수 있다. 또한, 아스파라거스의 산지는 특별히 한정되지 않고, 국산품의 아스파라거스를 이용해도 되거나 수입품의 아스파라거스를 이용해도 된다. 본 발명의 효과를 나타내는 아스파라거스이면, 적당히 선택될 수 있다.
아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정은, 예를 들면, 아스파라거스 줄기에 1배량~50배량의 물을 더하고, 20분~180분 동안 열수 중에서 가열함으로써 행해진다. 이때의 온도는, 예를 들면, 50℃~300℃가 바람직하다. 대기압 하에서 열수 가열 처리를 행하는 경우에는, 예를 들면, 100℃ 이상의 온도가 바람직하다. 또한, 가압 하에서 열수 가열 처리를 행해도 되고, 예를 들면, 0.1MPa~0.2MPa의 압력(오토클레이브를 이용하는 경우에는, 예를 들면, 0.12MPa)이 바람직하다.
상기 서술한 바와 같이 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리함으로써, 본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 수득할 수 있다. 이와 같이, 본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법은 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정을 포함한다. 상기 제조 방법에 있어서는, 야채로서 널리 유통되고 있는 아스파라거스의 줄기부를 이용하기 때문에, 염가로 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 제조할 수 있다. 또한, 고도의 기술, 특별한 장치 등을 이용하지 않고, 아스파라거스를 열수 가열 처리함으로써, 간편하게 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 제조할 수 있다. 또한, 식재인 아스파라거스를 열수 가열 처리하기 때문에, 상기 제조 방법에 의해 수득된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체는 안전성이 높다고 할 수 있으며, 열수 가열에 의해 아스파라거스 줄기를 멸균할 수도 있다. 또한, 본 발명의 효과를 나타내는 열수 가열 처리 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법은 열수 가열 처리하는 공정의 효율을 높여 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 효율적으로 제조할 목적으로 하기에 예시되는 부가적인 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 전에 있어서 아스파라거스 줄기를 세단하는 공정을 들 수 있다. 아스파라거스 줄기를, 예를 들면, 0.5cm~10cm 정도의 크기로 세단할 수 있다. 세단에 있어서는, 예를 들면, 나이프, 커터 등을 이용하여 수작업으로 행해도 되고, 세단기, 분쇄기 등의 기계를 이용해도 된다. 본 발명의 효과를 나타내는 세단 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 전에 있어서 아스파라거스 줄기를 압착하는 공정을 들 수 있다. 아스파라거스 줄기를, 예를 들면, 압착기를 이용하여 압착할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 압착 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 식물 조직을 붕괴시키는 등의 목적을 위해, 열수 가열 처리하는 공정의 전 또는 후에, 효소 처리하는 공정을 들 수 있다. 효소 처리함으로써, 열수 가열 처리하는 공정의 효율을 보다 높여 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 아스파라거스 줄기 중의 섬유질, 펙틴 등을 효율적으로 분해시킬 목적으로 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 아밀라아제, 풀룰라나아제 등의 효소 또는 이들 효소의 2 혹은 3 이상의 조합이 적합하게 이용된다. 본 발명의 효과를 나타내는 효소이면, 적당히 선택될 수 있다. 효소 처리하는 공정에 있어서는, 이용하는 효소에 대해 가장 적합한 첨가량, 온도 및 반응 시간이 선택될 수 있다. 셀룰라아제를 이용하는 경우, 예를 들면, 0.1%~5%(w/w)의 셀룰라아제 첨가량으로, 30℃~60℃의 온도에서 1시간~72시간 효소 처리를 행할 수 있다. 효소 처리하는 공정은 열수 가열 처리하는 공정 전에 행해도 되고, 열수 가열 처리하는 공정 후에 행해도 된다. 또한, 아스파라거스 줄기 중의 셀룰로오스를 보다 효율적으로 분해시키고 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 보다 효율적으로 제조하는 관점으로부터, 열수 가열 처리하는 공정 후에 셀룰라아제에 의해 효소 처리하는 것이 바람직하다. 본 발명의 효과를 나타내는 효소 처리 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 후에 있어서 잔사를 기계적으로 분쇄하는 공정을 들 수 있다. 분쇄에 있어서는, 예를 들면, 분쇄기, 혼합기 등의 기계를 이용해도 된다. 본 발명의 효과를 나타내는 분쇄 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 후에 있어서 원심 분리 또는 여과하는 공정을 들 수 있다. 이러한 공정을 더 포함시킴으로써, 효율적으로 잔사를 제거하여 가열 처리액을 수득할 수 있다. 원심 분리는, 예를 들면, 회전수 3,000rpm~7,000rpm, 4℃~50℃에서 행해질 수 있다. 여과에 있어서는, 예를 들면, 시판의 여과지, 여과천 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 원심 분리 방법 또는 여과 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 후에 있어서 수득된 가열 처리액을 감압 하에서 농축하는 공정을 들 수 있다. 농축은, 예를 들면, 증발기 등을 이용하여 행할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 농축 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
상기 부가적인 공정으로서, 예를 들면, 열수 가열 처리 후에 있어서 가열 처리액을 분무 건조 또는 동결 건조시키는 공정을 들 수 있다. 분무 건조는, 예를 들면, 배풍(排風) 온도 70℃~90℃, 챔버 온도 80℃~100℃에서 행해질 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 분무 건조 방법 또는 동결 건조 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정에, 상기에 예시된 부가적인 공정을 더 포함시킴으로써, 보다 효율적으로 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 제조할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 부가적인 공정이면, 적당히 선택될 수 있다.
아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정에 대해서, 이하에 예시한다. 아스파라거스 줄기를 0.5cm~10cm 정도로 세단하고, 물을 1배량~50배량 더한다. 50℃~100℃에서 또는 121℃의 가압 하에서, 20분~180분 동안 열수 가열 처리를 행한다. 방냉 후, 0.1%~5%(w/w)의 셀룰라아제를 첨가하고, 30℃~60℃에서 1시간~72시간 효소 처리를 행한다. 그 후, 잔사를 기계적으로 분쇄하여 회전수 3,000rpm~7,000rpm, 4℃~50℃에서 원심 분리를 행함으로써 상청을 수득한다. 그 후, 상기 상청을 배풍 온도 70℃~90℃, 챔버 온도 80℃~100℃에서 분무 건조한다.
본 명세서에 있어서 「아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물」이란, 아스파라거스 줄기를 열수 중에서 가열 처리하고, 그 후, 원심 분리, 여과 등에 의해 잔사를 제거하여 농축한 것을 말한다. 또한, 본 명세서에 있어서 「효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물」이란, 열수 가열 처리하는 공정의 전 또는 후에, 상기 서술한 대로 효소 처리하는 공정을 거쳐 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 의미한다. 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물에는 유효 성분으로서 상기 서술한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체가, 예를 들면, 적어도 0.05% 이상 함유된다.
본 발명에 의한 제조 방법에 의해 수득된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체에 있어서는, 예를 들면, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 물 또는 유기 용매(메탄올 등)에 용해시켜, 역상용 담체(예를 들면, DIAION HP-20(제품명)(미츠비시 화학 사제) 등)의 오픈 컬럼 크로마토그래피를 실시하게 할 수 있다. 또한, 예를 들면, 겔 여과용 담체(예를 들면, Sephadex LH-20(제품명)(파마시아 파인케미컬 사제) 등)에 의해 분획할 수도 있다. 또한, 상기 서술의 방법으로 용출된 소정의 획분을, 예를 들면, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리함으로써, 정제할 수 있다.
특정의 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니지만, 상기 서술한 바와 같이 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리함으로써, 아스파라거스 줄기 유래의 유기산과 당류가 고온 하에서 반응하여 본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체가 수득된다고 생각할 수 있다. 유기산으로서는, 예를 들면, 피로글루타민산, α-케토글루타르산, 옥살로아세트산 등이 예시된다. 한편, 당류로서는, 예를 들면, 프룩토오스, 글루코오스, 수크로오스, 만노오스 등이 예시된다.
예를 들면, 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리하는 공정에 있어서, 아스파라거스 줄기 유래의 피로글루타민산과 프룩토오스가, 고온 하에서 반응하여 이하의 화합물이 수득된다고 생각할 수 있다.
Figure 112014066753983-pct00008
본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법에 있어서는, 상기 서술에 예시되는 바와 같은 유기산과 당류를 함유하는 아스파라거스 이외의 식물을 적절히 이용할 수 있다. 예를 들면, 피로글루타민산과 프룩토오스를 함유하는 야채를 적합하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 양배추, 브로콜리, 호박, 양파, 마늘, 당근 등의 야채가 적합하게 이용될 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 식물이면, 적당히 선택될 수 있다.
(3. HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제)
본 발명에 의해, 유효 성분으로서 본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제가 제공된다.
본 발명에 의한 HSP 유도제는 생체 내 또는 생체 외에 존재하는 HSP를 유도하기 위해 이용될 수 있다. 여기서 말하는 HSP란, 예를 들면, HSP70, HSP10, HSP27, HSP40, HSP60, HSP90, HSP110 등이며, 바람직하게는 HSP70이다. HSP 유도 활성에 대해서는, 예를 들면, 세포에 상기 HSP 유도제를 첨가하고 배양하여, 기존의 방법에 의해, HSP mRNA의 발현 유도 활성, HSP 단백질의 발현 유도 활성 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 평가 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 항스트레스제는 생체에 투여함으로써 항스트레스 효과를 수득할 수 있다. 항스트레스 효과는, 예를 들면, 포유 동물에 상기 항스트레스제를 투여하고, 투여 전후의 산화 스트레스 지표, 혈중 스트레스 호르몬 농도 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 평가 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 자율 신경 조절제는 생체에 투여함으로써 자율 신경 조절 효과를 수득할 수 있다. 자율 신경 조절 효과는, 예를 들면, 포유 동물에 상기 자율 신경 조절제를 투여하고, 투여 전후의 자율 신경 밸런스, 자율 신경 활동도 등을 측정함으로써 평가할 수 있다. 본 발명의 효과를 나타내는 평가 방법이면, 적당히 선택될 수 있다.
또 본 발명에 의해, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 유효 성분으로서 함유하는 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제도 또한 제공된다. 상기 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은, 상기 서술한 대로, 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리함으로써 수득할 수 있다. 따라서, 상기 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 중에는 본 발명에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체가 함유된다.
(4. 음식품 및 의약품)
본 발명에 의해, 본 발명에 의한 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 함유하는 음식품이 제공된다. 상기 음식품은 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 과립상, 입상, 정제, 캅셀, 겔상, 크림상, 페이스트상, 현탁액상, 수용액상, 유액상, 분말상 등의 음식용으로 적합한 형태로 가공할 수 있다. 또한, 음식품 중에 통상 이용되는 부형제, 결합제, 활택제, 착색제, 붕괴제, 증점제, 보존제, 안정화제, pH 조정제 등을 첨가할 수 있다. 또한, 미질(味質)의 개선을 위해, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서, 당류, 당알코올류, 염류, 유지류, 아미노산류, 유기산류, 글리세린 등을 첨가할 수 있다. 또한, 기존의 음식품에, 본 발명에 의한 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 함유시켜 이용하는 경우, 베이스가 되는 음식품으로서는, 본 발명의 효과를 나타낼 수 있는 음식품이면, 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 음식품으로서 이용하는 경우, 예를 들면, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(또는 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물) 환산으로 50mg~2000mg/일, 바람직하게는 100mg~1000mg/일 섭취함으로써, 원하는 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 수득할 수 있다. 섭취량에 대해서는 섭취의 목적, 음식품의 형태 등에 기초하여 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 음식품은 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과 양쪽을 가진다. 따라서, 스트레스 부하에 의한 자율 신경 장해에 대해, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과의 상승(相乘) 작용에 의해 보다 높은 효과를 나타내는 것이 기대된다. 또한, 스트레스 부하에 의한 것이 아닌 자율 신경 장해에 대해서도, 자율 신경 조절 효과를 나타내는 것이 기대된다.
본 발명에 의한 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제는 의약품으로서 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 의약품은 유효 성분으로서 상기 서술한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유한다. 이 경우, 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 정제, 과립제, 산제, 캅셀제, 시럽제, 주사제 등의 제형으로 조제할 수 있다. 또한, 의약품 중에 통상 이용되는 부형제, 결합제, 활택제, 착색제, 붕괴제, 증점제, 보존제, 안정화제, pH 조정제 등을 첨가할 수 있다. 투여 방법에 대해서는 경구 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 피내 투여, 설하 투여 등이 본 발명의 효과를 나타내는 범위에서 적당히 선택될 수 있다.
본 발명에 의한 HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 의약품으로서 이용하는 경우, 예를 들면, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(또는 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물) 환산으로 50mg~2000mg/일, 바람직하게는 100mg~1000mg/일로 투여함으로써, 원하는 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 수득할 수 있다. 투여량에 대해서는 투여의 목적, 제형, 환자의 연령, 체중 등에 기초하여 적당히 선택될 수 있다.
<실시예>
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
(아스파라거스 줄기 열수 가열 처리에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄의 제조)
그린 아스파라거스 줄기(생중량 1.5kg)에 물 1.5L를 더하고, 열수 가열 처리할 목적으로 오토 클레이브를 이용하여 가압 멸균하고(121℃, 20분간), 그 후, 여과포로 여과하고, 수득된 액을 증발기로 감압 하에서 농축하여 가열 처리물을 수득하였다. 수득된 가열 처리물을 컬럼 크로마토그래피(제품명： DIAION HP-20, 미츠비시 화학 사제； 500mL, 용출； H2O, 50% 메탄올, 100% 메탄올)에 의해 분획하여 1.7g을 수득하였다. 다음에, 수득된 분획물을 분취용 HPLC(제품명： Hitachi L-7100, 히타치 사제)에 의해 정제하여 화합물(X)(5.0mg)을 수득하였다. 컬럼은 제품명： CAPCELL PAK C18 UG 120, 20φ×250mm(시세이도 사제)를 사용하고, 이동상은 표 1 대로였다(A： H2O, B： 메탄올). 분취용 HPLC의 유속은 8mL/분이며, 자외 흡광도 검출기에 의해 검출 파장 280nm로 검출했다.
Figure 112014066753983-pct00009
상기 서술에 의해 수득된 화합물(X)의 NMR 데이터를 이하에 나타낸다.
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)
δ 4.49(1H, dd, J=5.2Hz)
5.59(1H, dt, J=5.6Hz)
6.55(1H, d, J=3.6Hz)
7.48(1H, d, J=3.6Hz)
9.52(1H, s)
13C-NMR(100MHz, DMSO-d6)
δ 55.9
109.7
124.5
151.7
162.1
178.0
상기 서술에서 수득된 화합물(X)의 구조를 확정하기 위해, 시판품의 하이드록시메틸푸르푸랄(제품명： 5-하이드록시메틸-2-푸르알데하이드, 도쿄 화성 판매 주식회사)의 NMR 데이터와 화합물(X)의 NMR 데이터를 비교했다. 이하에 시판품의 하이드록시메틸푸르푸랄의 NMR 데이터를 나타낸다.
1H-NMR(400MHz, DMSO-d6)
δ 4.51(1H, dd, J=5.2Hz)
5.59(1H, dt, J=5.6Hz)
6.60(1H, d, J=3.6Hz)
7.49(1H, d, J=3.6Hz)
9.56(1H, s)
13C-NMR(100MHz, DMSO-d6)
δ 55.9
109.7
124.4
151.7
162.1
177.9
상기 서술에서 수득된 화합물(X)의 NMR 데이터와 시판품의 NMR 데이터가 일치했기 때문에, 화합물(X)은 하이드록시메틸푸르푸랄(하기 구조식)인 것을 알 수 있었다. 이상으로부터, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 중에 하이드록시메틸푸르푸랄이 포함되는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112014066753983-pct00010
(실시예 2)
(아스파라거스 줄기 열수 가열 처리에 의한 신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조)
그린 아스파라거스 줄기(생중량 1.0kg)에 물 1L를 더하고, 열수 가열 처리할 목적으로 오토 클레이브를 이용하여 가압 멸균하고(121℃, 20분간), 그 후, 여과포로 여과하고, 수득된 액을 증발기로 감압 하에서 농축하여 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 수득하였다. 수득된 가열 처리물을 컬럼 크로마토그래피(제품명： DIAION HP-20, 미츠비시 화학 사제； 500mL, 용출； H2O, 30% 메탄올, 100% 메탄올)에 의해 분획했다. 다음에, 수득된 분획물 723.8mg을 컬럼 크로마토그래피(제품명： Sephadex LH-20, 파마시아 파인케미컬 사제； 250mL, 용출； H2O)에 의해 정제했다. 또한, 수득된 분획물 12.6mg을 분취용 HPLC(제품명： Hitachi L-7100, 히타치 사제)에 의해 정제하여 화합물(Y)(2.0mg)을 수득하였다. 분취용 HPLC의 조건은 실시예 1과 동일했다.
상기 서술에 의해 수득된 화합물(Y)을 HPLC 분석(제품명： Hitachi L-7100, 히타치 사제)한 결과, 보유 시간은 22.99분이었다. 이 분석용 HPLC에 있어서, 컬럼은 제품명： CAPCELL PAK C18 UG 120, 4.6φ×250mm(시세이도 사제)를 사용하고, 이동상은 표 2 대로였다(C：20mM 인산 나트륨 완충액(pH 2.3), D： 아세토니트릴). 분석용 HPLC의 유속은 1mL/분이며, 자외 흡광도 검출기에 의해 검출 파장 280nm로 검출했다.
Figure 112014066753983-pct00011
상기 서술에 의해 수득된 화합물(Y)의 LC/Tof MS 분석 데이터를 이하에 나타낸다.
실측치 m/z 238.0710([M+H]+)； C11H12NO5
이론치 m/z 238.0715([M+H]+)； C11H12NO5
이상으로부터, 상기 서술에 의해 수득된 화합물(Y)는 C11H11NO5의 분자식을 가지는 것으로 밝혀졌다.
상기 서술에 의해 수득된 화합물(Y)의 1H-NMR 데이터를 이하에 나타낸다.
1H-NMR(400MHz, CD3OD)
δ 2.00(4H, m)
4.20(1H, dd, J=3.9, 9.2Hz)
5.20(2H, s)
6.55(1H, d, J=3.6Hz)
7.37(1H, d, J=3.6Hz)
9.45(1H, s)
(실시예 3)
(신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 합성)
실시예 2에 있어서 수득된 화합물(Y)(C11H11NO5)는 아스파라거스 줄기 유래의 피로글루타민산(C5H7NO3)과 프룩토오스(C6H12O6)가 가열 하에서 반응한 것에 의해 생성되었다고 예상되었다. 이것을 검증하기 위해, 피로글루타민산 및 프룩토오스를 이용하여 이하의 방법으로 화합물을 합성했다. 또한, 화합물(Y)는 하기 입체 이성체의 존재를 생각할 수 있기 때문에, L-피로글루타민산을 출발 물질로 한 S(L)체 및 D-피로글루타민산을 출발 물질로 한 R(D)체를 각각 합성했다.
Figure 112014066753983-pct00012
L-피로글루타민산(제품명：L-피로글루타민산, 도쿄 화성 판매 주식회사) 3.0g과 D-프룩토오스(제품명： D(-)-프룩토오스, 쥰세이 화학 주식회사) 1.5g을 삼각 플라스크 내에서 혼합하고, 오토 클레이브를 이용하여 가압 가열 처리(121℃, 20분간)했다. 수득된 반응물을 컬럼 크로마토그래피(제품명： DIAION HP-20, 미츠비시 화학 사제； 150mL, 용출； H2O, 30% 메탄올, 100% 메탄올)에 의해 분획했다. 또한 100% 메탄올 획분을 컬럼(제품명： CAPCELL PAK C18 UG 120, 20φ×250mm, 시세이도 사제)을 이용한 분취용 HPLC에 의해 정제하여 S체의 화합물(Z)(24.4mg)를 수득하였다. 분취용 HPLC의 조건은 실시예 1과 동일했다.
D-피로글루타민산(제품명： D-피로글루타민산, 도쿄 화성 판매 주식회사) 2.0g과 D-프룩토오스(제품명： D(-)-프룩토오스, 쥰세이 화학 주식회사) 1.0g을 삼각 플라스크 내에서 혼합하고, 오토 클레이브를 이용하여 가압 가열 처리(121℃, 20분간)했다. 수득된 반응물을, 컬럼 크로마토그래피(제품명： DIAION HP-20, 미츠비시 화학 사제； 100mL, 용출； H2O, 30% 메탄올, 60% 메탄올)에 의해 분획했다. 60% 메탄올 획분을 증발기로 감압 하에서 약 50mL까지 농축하고, 그 후, 아세트산에틸(50mL×5)로 분액했다. 아세트산에틸층을 증발기로 감압 하에서 농축하고, 컬럼 크로마토그래피(제품명： DIAION HP-20, 미츠비시 화학 사제； 10mL, 용출； H2O, 30% 메탄올, 60% 메탄올)에 의해 분획했다. 60% 메탄올 획분을 증발기로 감압 하에서 농축하여 R체의 화합물(Z)(24.6mg)을 수득하였다.
상기 서술에 의해 수득된 S체, R체의 화합물(Z)를 HPLC 분석(제품명： Hitachi L-7100, 히타치 사제)한 결과, 보유 시간은 각각 22.89분이었다. 분석용 HPLC의 조건은 실시예 2와 동일하다.
상기 서술에 의해 수득된 S체, R체의 화합물(Z)에 대해서, MS, NMR 분석 데이터를 이하에 나타낸다.
EI-MS： m/z 237
EI-HR-MS： m/z 237.0612； C11H11NO5
1H-NMR(400MHz, CD3OD)： S체
δ 2.33(4H, m)
4.34(1H, dd, J=3.9, 9.0Hz)
5.51(2H, s)
6.73(1H, d, J=3.4Hz)
7.38(1H, d, J=3.4Hz)
9.57(1H, s)
13C-NMR(100MHz, CD3OD)： S체
δ 25.8
30.2
57.0
59.6
114.0
124.0
154.5
156.7
173.4
179.6
181.1
1H-NMR(400MHz, CD3OD)： R체
δ 2.33(4H, m)
4.34(1H, dd, J=3.9, 9.0Hz)
5.27(2H, s)
6.73(1H, d, J=3.6Hz)
7.38(1H, d, J=3.6Hz)
9.57(1H, s)
13C-NMR(100MHz, CD3OD)： R체
δ 25.8
30.3
57.0
59.6
113.7
124.0
154.5
156.8
173.4
179.6
181.1
실시예 2에서 수득된 화합물(Y)의 절대 구조를 결정하기 위해, 실시예 2에서 수득된 화합물(Y)과 상기 서술에 의해 수득된 S체의 화합물(Z), R체의 화합물(Z)을 키랄 컬럼(제품명： CHIRAL PAK IA, 4.6φ×150mm, 다이셀 사제)을 이용하여 HPLC 분석(제품명： Hitachi L-7100, 히타치 사제)을 행했다. 컬럼 이외의 분석용 HPLC 조건은 실시예 2와 동일했다. 그 결과, S체의 화합물(Z)의 보유 시간은 18.92분이고, R체의 화합물(Z)의 보유 시간은 20.57분이었다. 실시예 2에서 수득된 화합물(Y)의 보유 시간은 19.06분이었기 때문에, 실시예 2에서 수득된 화합물(Y)은 S체인 것으로 밝혀졌다.
실시예 2에 있어서의 HPLC 분석 데이터, LC/Tof MS 분석 데이터 및 1H-NMR 데이터와 본 실시예에 있어서의 상기 서술한 분석 데이터를 비교하면, 실시예 2에 의해 수득된 화합물(Y)과 본 실시예에 의해 수득된 화합물(Z)은 동일한 화합물인 것으로 나타났다. 따라서, 실시예 2에서 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 중에, 적어도 이하의 구조식을 가지는 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 S체가 포함되는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112014066753983-pct00013
(실시예 4)
(HSP70 mRNA 발현 유도 활성의 평가)
시판품의 하이드록시메틸푸르푸랄(실시예 1과 동일)(이하, 샘플 1이라고 한다), 실시예 3에서 합성된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 S체(이하, 샘플 2-S라고 한다) 및 상기 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 R체(이하, 샘플 2-R이라고 한다) 및 이하의 방법으로 제조된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(이하, 샘플 3이라고 한다) 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(이하, 샘플 4라고 한다)의 HSP70 유도 활성을, HSP70의 mRNA 발현 레벨을 측정함으로써 평가했다.
이하에, 샘플 3의 제조 방법을 나타낸다. 그린 아스파라거스 줄기(생중량 6.63kg)에 물 28.5L를 더하고, 열수 가열 처리할 목적으로 가압 멸균(121℃, 20분)을 행했다. 냉각 후, 여과지(제품명： 토요 여지 5A, 토요 여지 사제)로 여과하여 증발기로 농축을 행했다. 농축액 약 10L에 부형제(제품명： 파인덱스, 마츠야 화학공업 사제) 275.4g을 첨가하고, 동결 건조하여 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 542.4g(이 중, 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 267.0g, 부형제 275.4g)을 수득하였다.
이하에, 샘플 4의 제조 방법을 나타낸다. 그린 아스파라거스 줄기(생중량 12kg)에 물 24L를 더하고, 열수 가열 처리할 목적으로 가압 멸균(121℃, 20분)을 행했다. 45℃까지 방냉 후, 수크라아제 C(제품명)(미츠비시 화학 푸드 사제) 20g 및 마세로자임 A(제품명)(야쿠르트 약품 공업 사제) 20g을 첨가하고, 45℃에서 3일간 효소 처리를 행했다. 그 후, 가압 멸균(121℃, 20분)하고, 여과포로 여과하여 여과액 35L를 회수했다. 증발기에 의해 9L의 용량이 될 때까지 농축했다. 이 농축액에 부형제(제품명： 파인덱스, 마츠야 화학공업 사제) 1.20kg을 첨가하고, 재차 가압 멸균(121℃, 20분)했다. 그 후, 동결 건조하여 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 2.12kg(이 중, 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 0.92kg, 부형제 1.20kg)을 수득하였다.
우선, 샘플 1, 샘플 2-S 및 샘플 2-R에 대해서, 인간 전골수성 백혈병 세포(HL-60 세포)를 이용하여 HSP70 mRNA 발현 레벨을 평가했다.
이하에, 인간 전골수성 백혈병 세포(HL-60 세포)를 이용한 HSP70 mRNA 발현 레벨의 평가법을 나타낸다. HL-60(제공원： 다이니혼 제약)을, 10%의 우태아 혈청(FBS)(제품명： MultiSer, Thermo Trace 사제)을 첨가한 RPMI1640 배지(제품명： RPMI1640 배지 「닛스이」(2) 분말, 닛스이 제약 주식회사제)에 현탁시켜, 1.5mL 샘플링 튜브 내로 옮겼다(50만개/1mL/튜브). 동시에 최종 농도 1mg/mL가 되도록, 이온 교환수로 조제한 각 샘플(샘플 1, 샘플 2-S 및 샘플 2-R)을 0.1mL 첨가했다. 콘트롤에는 이온 교환수 0.1mL를 첨가했다. 37℃, 5% CO2 존재 하에서 4시간 배양 후, 세포를 3,000rpm로 회수하여 mRNA 검출용으로 제공했다. 이것으로부터, TRIzol 시약(라이프 테크놀로지스 사제)를 사용하여 토탈 RNA를 추출하여 Nanodrop(사모 사이언티픽 사제)로 농도를 측정했다. cDNA 합성 키트(제품명： ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover, 토요보 라이프 사이언스 사제)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 역전사 후의 반응액을 3ng/μL가 되도록 뉴클레아제 무함유 수로 희석하여 리얼타임 PCR의 주형으로 했다.
PCR에 있어서는, 프라이머로서, HSP70 포워드 프라이머(배열 번호 1) 및 HSP70 리버스 프라이머(배열 번호 2)를 사용했다. HSP70 유전자의 발현을 보정하는 내부 표준 유전자로서 베타 2 마이크로글로불린 유전자를 이용하고, 그 프라이머로서, 베타 2 마이크로글로불린 포워드 프라이머(배열 번호 3) 및 베타 2 마이크로글로불린 리버스 프라이머(배열 번호 4)를 사용했다. 리얼타임 PCR은 반응 키트(제품명： SsoAdvanced SYBR Green Supermix, 바이오 래드 래브러토리즈 사제)로 리얼타임 PCR 해석 시스템(제품명： CFX Connect, 바이오 래드 래브러토리즈 사제)에 의해 갔다. 토탈 10μL의 PCR 반응액을 95℃에서 3분간 인큐베이트(초기 변성)하고, 그 후 95℃에서 1초의 변성, 59℃에서 10초의 아닐링을 40사이클 반복했다.
상기의 리얼타임 PCR 해석 시스템에 의해 수득된 Cq치를 이용하여 이하의 계산식에 기초하여 HSP70 유전자의 발현량비를 산출했다(ΔΔCt법). 또한, Cq 값은, 유전자의 증폭 반응에 있어서, 증폭된 유전자가 있는 일정량에 이르렀을 때의 반응 사이클수를 나타낸다.
콘트롤의 HSP70의 Cq 값： A
콘트롤의 B2M의 Cq 값： B
샘플의 HSP70의 Cq 값： C
샘플의 B2M의 Cq 값： D
ΔCq(콘트롤)=A-B
ΔCq(샘플)=C-D
Δ(ΔCq)=ΔCq(샘플)-ΔCq(콘트롤)
발현량비=2-Δ(Δ Cq )
결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 있어서는, 샘플 1, 샘플 2-S 및 샘플 2-R의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성을, 콘트롤의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성에 대한 비율(%)로서 나타낸다. 샘플 1, 2-S 및 2-R에서는, 콘트롤에 비해, HSP70 mRNA 발현이 약 3배~9배 증강되었다(샘플 2-S, 2-R, **p＜0.01 대 콘트롤, 샘플 1, *p=0.069 대 콘트롤). 이것으로부터, 하이드록시메틸푸르푸랄 및 이하의 구조식을 가지는 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 S체 및 R체는 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 mRNA 발현 레벨에서 밝혀졌다.
Figure 112014066753983-pct00014
다음에, 샘플 1, 샘플 3 및 샘플 4에 대해서, 인간 자궁경 암세포(HeLa 세포)를 이용하여 HSP70 mRNA 발현 레벨을 평가했다.
인간 자궁경 암세포(HeLa 세포)(제공원： 독립 행정법인 이화학 연구소 바이오 리소스 센터)를, 10%의 우태아 혈청(FBS)(제품명： MultiSer, Thermo Trace 사제)을 첨가한 둘베코 변법 이글 배지(DMEM)(제품명： 둘베코 변법 이글 배지 「닛스이」 2분말, 일본 제약 사제)에 현탁시켜, 6구멍 플레이트에 파종했다(20만개/2mL/well). 다음날, 신선한 DMEM(1.8mL)로 교환하여 각각 최종 농도 1mg/mL(샘플 3 및 4에 대해서는, 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 최종 농도로서 1mg/mL)가 되도록, 이온 교환수로 조제한 각 샘플을 0.2mL 첨가했다. 콘트롤에는 이온 교환수 0.2mL를 첨가했다. 22시간 배양 후, 세포를 셀 스크랩퍼로 벗겨, mRNA 검출용으로 제공했다. 이것으로부터, RNA 추출 키트(제품명： Fast Pure RNA kit, 다카라 바이오 사제)를 사용하여 토탈 RNA를 추출하고, DEPC 처리수로 100배로 희석 후, 분광 광도계로 흡광도(파장 260nm)를 측정했다. RNA 농도는 흡광도(파장 260nm)×40×희석 배율=RNA 농도(ng/μL)의 계산식을 이용하여 산출했다. RNA 용액을 TE 완충액으로 임의의 농도로 희석하고, cDNA 합성 키트(제품명： Prime Script 1st Strand cDNA synthesis kit, 다카라 바이오 사제)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 프라이머에는 올리고 dT 프라이머(제품명)(다카라 바이오 사제)를 사용했다. 역전사 후의 반응액을 10ng/μL가 되도록 TE 완충액으로 희석하여 PCR의 주형으로 했다.
PCR에 있어서는, 프라이머로서, HSP70 포워드 프라이머(배열 번호 5) 및 HSP70 리버스 프라이머(배열 번호 6)를 사용했다. HSP70 유전자의 발현을 보정하는 내부 표준 유전자로서 베타 2 마이크로글로불린 유전자를 이용하고, 그 프라이머로서, 베타 2 마이크로글로불린 포워드 프라이머(배열 번호 3) 및 베타 2 마이크로글로불린 리버스 프라이머(배열 번호 4)를 사용했다. PCR에는 PCR 효소(제품명： TaKaRa Ex Taq, 다카라 바이오 사제)를 사용했다. 토탈 20μL의 PCR 반응액을 94℃에서 1분간 인큐베이트(초기 변성)하고, 그 후 94℃에서 30초의 변성, 57℃(HSP70) 또는 59℃(베타 2 마이크로글로불린)에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장을 32사이클(HSP70) 또는 24사이클(베타 2 마이크로글로불린) 반복했다. 마지막에 72℃에서 30초의 신장 반응을 행하여 모든 PCR을 종료시켰다. PCR 반응액은 통상의 방법에 의해 전기 영동한 후, 에티듐 브로마이드에 의해 염색했다.
AlphaView(제품명)(Alpha Innotech 사제)에서 자외선 조사 하의 형광 강도를 측정함으로써, HSP70 유전자의 발현량을 측정했다. 이때, 내부 표준 유전자의 발현량에 의해 보정한 값을 HSP70 유전자의 발현량으로 했다.
결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 있어서는, 샘플 1, 3 및 4의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성을, 콘트롤의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성에 대한 비율(%)로서 나타낸다. 샘플 1, 3 및 4에서는, 콘트롤에 비해, HSP70 mRNA 발현이 약 1.2배~1.5배 증강되었다(샘플 1, 4, **p＜0.01 대 콘트롤, 샘플 3, *p＜0.05 대 콘트롤). 이것으로부터, 하이드록시메틸푸르푸랄, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 mRNA 발현 레벨에서 밝혀졌다.
(실시예 5)
(HSP70 단백질 발현 유도 활성의 평가)
실시예 4와 동일한 샘플 1, 3 및 4의 HSP70 유도 활성을, HSP70 단백질 발현 레벨을 측정함으로써 평가했다.
실시예 4와 마찬가지로 DMEM(10% FBS 첨가)에 현탁시킨 HeLa 세포를, 12구멍 플레이트에 파종했다(10만개/mL/well). 다음날, 신선한 DMEM(0.9mL)로 교환하여 각각 최종 농도 1mg/mL(샘플 3 및 4에 대해서는 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 최종 농도로서 1mg/mL)가 되도록, 이온 교환수로 조제한 각 샘플을 0.1mL 첨가했다. 콘트롤에는 이온 교환수 0.1mL를 첨가했다. 24시간 배양 후, 배양 상청을 제거하고, PBS(-)(인산 완충 생리 식염수, pH 7.2)로 세정했다. 그 후, 일부의 세포를 셀 스크랩퍼로 벗겨, 1.5mL샘플 튜브에 회수하고, HSP70 단백질 정량 및 토탈 단백질 정량용으로 제공했다.
HSP70 단백질의 정량에 대해서는 HSP70 ELISA 키트(제품명)(Enzo 사제), 토탈 단백질의 정량에 대해서는 마이크로 BCA 프로테인 어세이 시약 키트(제품명)(PIERCE Biotechnology 사제)를 이용하여 행했다. 나머지의 세포에 관해서는 3-(4,5-디메틸티알-2-일)-2,5-디페닐테트라잘륨 브로마이드(MTT) 법에 의해 세포 증식에 주는 영향을 평가했다. 그 후, 토탈 단백질량 및 생세포수로 보정한 값을 HSP70 단백질량으로 했다.
결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에 있어서는, 샘플 1, 3 및 4의 HSP70 단백질 발현 유도 활성을, 콘트롤의 HSP70 단백질 발현 유도 활성에 대한 비율(%)로서 나타낸다. 샘플 1, 3 및 4에서는, 콘트롤에 비해, HSP70 단백질 발현이 약 1.3배 증강되었다(*p＜0.05 대 콘트롤). 이것으로부터, 하이드록시메틸푸르푸랄, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 단백질 발현 레벨에서 밝혀졌다.
이상으로부터, 하이드록시메틸푸르푸랄, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 및 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 우수한 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 나타났다.
(실시예 6)
(마우스 단면 모델에 있어서의 항스트레스 효과의 평가)
마우스 단면 모델을 사용하여 실시예 4에서 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(실시예 4에 있어서의 “샘플 3”)의 항스트레스 효과를 평가했다.
6주령의 웅성 Slc： ddY 마우스(일본 쿠레아 사제) 32마리를 4군으로 나누었다(각 군 8마리). 각각, 노멀군, 콘트롤군, 저용량 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군(이하, 저용량군이라고 한다) 및 고용량 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군(이하, 고용량군이라고 한다)으로 했다. 단면 스트레스를 부하하기 7일 전부터, 저용량군의 마우스에는 200mg/kg(아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 환산)의 용량으로, 고용량군의 마우스에는 1000mg/kg(동일 환산)의 용량으로, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말을 통상 분말 먹이(제품명： CE-2, 일본 쿠레아 사제)에 첨가하여 매일 급여했다. 노멀군, 콘트롤군에는 통상 분말 먹이를 주었다. 콘트롤군, 저용량군 및 고용량군에는 3일간에 걸쳐 1일 12시간(8:00 ~ 20:00) 마우스를 수침시킴으로써, 단면 스트레스를 부하했다. 노멀군에는 단면 스트레스를 부하하지 않았다.
항스트레스 효과에 대해서, 마지막 단면 스트레스 부하일의 다음날의 마우스에 있어서, (1) 산화 스트레스 지표로서의 혈청 중 과산화 지질량(혈청 트리글리세리드(TG)량에 대한 과산화 지방질(LPO)량비(LPO/TG))의 측정, (2) 스트레스 호르몬으로서 알려져 있는 혈중 코르티코스테론 농도의 측정 및 (3) 탈모 마우스의 발현율의 평가를 행함으로써 검토했다.
도 4에 혈청 중 과산화 지질량의 측정 결과를 나타낸다. 도면 중, LPO/TG의 값이 높을수록, 혈중 산화 스트레스가 높은 상태인 것을 나타낸다. 콘트롤군에서는 LPO/TG의 값이 높지만, 저용량군 및 고용량군에서는 노멀군과 동일한 정도까지 LPO/TG의 값이 낮아졌다(*p＜0.05 대 콘트롤). 이것으로부터, 단면 스트레스 부하에 의해 혈중 산화 스트레스가 높은 상태에 있는 마우스에, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 섭취시킴으로써, 혈중 산화 스트레스가 단면 스트레스 부하가 없는 레벨에까지 저감되는 것으로 나타났다.
도 5에 혈중 코르티코스테론 농도의 측정 결과를 나타낸다. 도면 중, 코르티코스테론 농도의 값이 높을 수록, 고스트레스 상태에 있는 것을 나타낸다. 콘트롤군에서는 코르티코스테론 농도의 값이 높지만, 저용량군에서는 노멀군과 동일한 정도까지 코르티코스테론 농도의 값이 낮아지고, 고용량군에서는 노멀군보다 코르티코스테론 농도의 값이 낮아졌다(**p＜0.01 대 콘트롤, *p＜0.05 대 콘트롤). 이것으로부터, 단면 스트레스 부하에 의해 고스트레스 상태에 있는 마우스에, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 섭취시킴으로써, 고스트레스 상태가 단면 스트레스 부하가 없는 레벨에까지, 고용량군에서는 상기 레벨 이하로 저감되는 것으로 나타났다.
도 6에 탈모 마우스의 발현율을 나타낸다. 도면 중, 탈모 발현율이 높을수록, 고스트레스 상태에 있는 것을 나타낸다. 노멀군, 콘트롤군, 저용량군 및 고용량군으로의 탈모 발현율은 각각, 0%, 75.0%, 37.5% 및 12.5%이며, 저용량군 및 고용량군에서는 콘트롤군에 비해 탈모 발현율이 낮았다. 이것으로부터, 단면 스트레스 부하에 의해 고스트레스 상태에 있는 마우스에, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 섭취시킴으로써, 고스트레스 상태가 저감되는 것으로 나타났다.
이상으로부터, 본 실시예에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 우수한 항스트레스 효과를 가지는 것으로 나타났다.
(실시예 7)
(마우스 단면 모델에 있어서의 HSP70 단백질 발현 유도 활성의 평가)
실시예 6에서 사용한 마우스를 이용하여, 실시예 4에서 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(실시예 4에 있어서의 “샘플 3”)의 HSP70 유도 활성을, 위, 간장 및 신장에 있어서의 HSP70 단백질 발현 레벨을 측정함으로써 평가했다.
실시예 6에 있어서의 시험 최종일에, 각 군의 마우스를 도살하여 위, 간장 및 신장을 각각 적출했다. 각 장기(50mg)를 1.5mL의 샘플 튜브에 넣고, 프로테아제 억제제 칵테일(제품명)(시그마 사제)을 0.2%(v／v) 첨가한 HSP70 ELISA 키트(제품명)(Enzo 사제)의 추출 시약 500μL를 더했다. 그 후, 얼음 위에서 막자를 이용하여 각 장기를 갈아 으깨어, 4℃, 1,500rpm로 30분간 원심 분리한 후, 상청을 회수했다. 이 상청을 HSP70 단백질의 정량 및 토탈 단백질의 정량에 제공했다.
실시예 5와 마찬가지로, HSP70 단백질의 정량에 대해서는 HSP70 ELISA 키트(제품명)(Enzo 사제), 토탈 단백질의 정량에 대해서는 마이크로 BCA 프로테인 어세이 시약 키트(제품명)(PIERCE Biotechnology 사제)를 이용하여 행했다. 토탈 단백질량으로 보정한 값을 HSP70 단백질량으로 했다.
도 7~9에 위, 간장 및 신장에 있어서의 HSP70 단백질 발현량을 나타낸다. 도 7~9에 있어서는, 콘트롤군, 저용량군 및 고용량군의 HSP70 단백질 발현 유도 활성을, 노멀군의 HSP70 단백질 발현 유도 활성에 대한 비율(%)로서 나타낸다. 위(도 7) 및 간장(도 8)에서는, 콘트롤군에서는 노멀군에 비해 HSP70 단백질 발현량이 저하되어 있었지만, 저용량군 및 고용량군에서는 노멀군과 동일한 정도 또는 그 이상으로 HSP70 단백질 발현이 증강되었다(*p＜0.05 대 콘트롤). 신장(도 9)에 있어서도, 저용량군 및 고용량군에서는 콘트롤군에 비해 HSP70 단백질 발현이 증강되었다(**p＜0.01 대 콘트롤).
이상으로부터, 본 실시예에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 동물에 투여된 경우에 있어서도 우수한 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 단백질 발현 레벨에서 밝혀졌다. 또한, 실시예 6에 있어서 나타낸 항스트레스 효과의 작용 기작의 하나가, 본 실시예에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 HSP70 발현 유도 활성인 것으로 시사되었다.
(실시예 8)
(인간에 있어서의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성의 평가)
실시예 4에서 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(실시예 4에 있어서의 “샘플 3”)을 이용하여, 인간 백혈구 중의 HSP70 유도 활성을, HSP70 mRNA 발현 레벨을 측정함으로써 평가했다.
자주적으로 참가를 표명한 자원봉사자 3명을 피험자로 했다(이하, 피험자 1, 피험자 2 및 피험자 3이라고 한다). 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말을, 피험자 1은 200mg/일의 용량으로, 피험자 2는 400mg/일의 용량으로 및 피험자 3은 800mg/일의 용량으로, 1일 2회(아침 및 저녁)로 나누어, 3일간 섭취했다(상기 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 200mg(피험자 1), 400mg(피험자 2) 및 800mg(피험자 3) 중에, 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 각각 98mg, 197mg 및 394mg 포함하고 있었다).
섭취 개시 전 및 섭취 종료일에 채혈을 행하여 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현량을 측정했다. 혈액 1mL를 37℃의 ACK 완충 용액(0.15M 염화 암모늄, 1.0mM 탄산수소칼륨, 0.1mM EDTA-2Na, pH 7.2) 10mL에 혼화하여 37℃에서 10분간 보온했다. 그 후, 3,000rpm로 5분간 원심 분리하여 상청을 제거했다. 침전된 백혈구에 재차 ACK 완충 용액 10mL를 더하여 현탁시켰다. 동일한 조작을 3회 반복한 후, 침강된 백혈구에 Trizol 시약(제품명)(라이프 테크놀로지스사) 1.5mL를 더하여 전체 RNA를 추출했다. PCR 반응을 포함하는 이후의 조작은 실시예 4(HeLa 세포에서의 평가)와 동일하게 행하여 HSP70 mRNA의 발현량을 평가했다.
결과를 도 10에 나타낸다. 도 10에 있어서는, 섭취 개시 전의 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현량에 대한, 섭취 종료 후의 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현량의 비율(%)을 나타낸다. 섭취 종료 후의 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현은 섭취 개시 전에 비해, 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 용량 의존적으로 2.5배~3.5배 정도 증강되었다.
이상으로부터, 본 실시예에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 인간에 투여된 경우에 있어서도 우수한 HSP70 유도 활성을 가지는 것으로 mRNA 발현 레벨에서 밝혀졌다.
(실시예 9)
(아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 자율 신경 조절 효과의 임상적 평가)
실시예 4에서 수득된 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물(실시예 4에 있어서의 “샘플 3”)을 이용하여 인간에 있어서의 자율 신경 조절 효과를 평가했다.
자주적으로 참가를 표명한 자원봉사자 30명을 피험자로 하여 무작위화 플라시보 콘트롤·이중 맹검 시험을 행했다. 피험자는 제비뽑기로, 플라시보군(이하, P군이라고 한다) 15명 또는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군(이하, A군이라고 한다) 15명으로 할당되었다. 시험 기간 중 4주간에 걸쳐 매일, P군의 피험자는 부형제(제품명： 파인덱스, 마츠야 화학공업 사제)(400mg/일)를, 한편, A군의 피험자는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말(400mg/일)을 1일 2회(아침 및 저녁)로 나누어 복용한(상기 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 400mg 중, 197mg가 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물이고, 나머지 203mg가 부형제(동상)였다).
시험 개시 전과 시험 종료일에, 가속도 맥파 검사 시스템(제품명； 펄스 애널라이저 플러스 TAS-9, YKC 사제)을 이용하여 자율 신경 밸런스 및 자율 신경 활동도를 평가했다. 상기 시스템은 지첨부로부터 가속도 맥파를 측정함으로써, 심박 미세 변화(Heart Rate Variability： HRV)를 검지하여 자율 신경 기능을 평가하는 시스템이다. HRV는 자율 신경이 심박에 가져오는 다양한 영향에 대한 임상적 귀결로서 나타난다. 자율 신경 밸런스에 대해서는, 상기 시스템에 의해 부여되는 교감 신경 활동에 대한 지표(Low Frequency：LF)를 X축으로, 부교감 신경 활동에 대한 지표(High Frequency： HF)를 Y축으로 플롯한 이차원 그래프에 있어서, 상기 그래프 상의 가장 자율 신경 밸런스가 양호한 점과 실측치에서의 점 사이의 거리를 이용하여 평가했다. 한편, 자율 신경 활동도에 대해서는, 상기 시스템에 의해 부여되는 자율 신경의 활동도를 나타내는 수치(LF 및 HF 등을 이용하여 상기 시스템에 의해 산출된다)를 이용했다.
도 11에, 자율 신경 밸런스의 변화를 나타낸다. 도면 중, 수치가 제로에 가까울수록, 자율 신경의 밸런스가 양호한 것을 나타낸다. P군(플라시보군)에 있어서는, 시험 개시 전에 비해 시험 종료일에서는 자율 신경의 밸런스가 악화되어 있었다. 한편, A군(아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군)에 있어서는, 시험 개시 전에 비해 시험 종료일에서는 자율 신경의 밸런스가 유의하게 개선되어 있었다(*p＜0.05 대 시험 개시 전, p＜0.01 대 플라시보군). 이것으로부터, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 복용함으로써, 자율 신경의 밸런스가 개선되는 것으로 나타났다.
도 12에, 자율 신경 활동도의 변화를 나타낸다. 도면 중, 수치가 높을수록, 자율 신경 활동도가 높은 것을 나타낸다. P군(플라시보군)에 있어서는, 시험 개시 전에 비해 시험 종료일에서는 자율 신경 활동도의 저하가 보였다. 한편, A군(아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군)에 있어서는, 시험 개시 전에 비해 시험 종료일에서는 자율 신경 활동도의 상승이 보였다. 이것으로부터, 본 실시예에 의한 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 복용함으로써, 자율 신경 활동이 개선되는 것으로 나타났다.
이상으로부터, 본 실시예에 의한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 함유하는 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물은 우수한 자율 신경 조절 효과를 가지는 것으로 나타났다.
(실시예 10)
(효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물의 인간에 있어서의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성 평가 및 자율 신경 조절 효과의 임상적 평가)
이하와 같이 수득된 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀을 이용하여 인간에 있어서의 HSP70 mRNA 발현 유도 활성 평가 및 자율 신경 조절 효과의 임상적 평가를 행했다.
(효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀의 제조법)
이하에, 인간 섭취용의 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀의 제조법을 나타낸다. 그린 아스파라거스 줄기(생중량 130kg)에 물 170L를 더하고, 열수 가열 처리할 목적으로 가열 살균(100℃, 45분)을 행했다. 45℃까지 방냉 후, 효소(스미팀 C 및 스미팀 MC； 야쿠르트 약품 공업 사제) 3.0kg을 첨가하고, 45℃에서 24시간 교반을 행했다. 그 후, 효소를 실활(100℃, 20분)시켜, 원심 분리를 행했다. 증발기에 의해 농축하고, 부형제(제품명： 파인덱스, 마츠야 화학공업 사제) 9.0kg을 첨가하고, 가압 멸균(121℃, 45분)했다. 그 후, 분무 건조에 의해 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 16.0kg(이 중, 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 7.0kg, 부형제 9.0kg)을 수득하였다. 이 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 함유 분말 8.50kg과 고결방지제(제품명： 스테아린산 칼슘, 산에스 사제) 1.86kg, 셀룰로오스(제품명： 세오라스, 아사히 화성 사제) 8.20kg을 혼합하여 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 20% 포함하는 캅셀용 분말을 조제했다. 이 캅셀용 분말을 1호 캅셀에 1캅셀당 280mg 충전한 것을 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀로 했다.
(평가 방법)
자주적으로 참가를 표명한 자원봉사자 20명을 피험자로 하여 저용량으로 단기간의 무작위화 플라시보 콘트롤·이중 맹검 시험을 행했다. 피험자는 무작위로 플라시보군(이하, P군이라고 한다) 10명 또는 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군(이하, E군이라고 한다) 10명으로 할당되었다. 시험 기간 중 1주간에 걸쳐, 매일, P군의 피험자는 위약 캅셀(제품명： 파인덱스(마츠야 화학공업 사제) 699.9mg 및 제품명： 말츠 엑기스(오리엔탈 공업 사제) 140.1mg의 혼합물, 합계 840mg(3캅셀)/일)을, 한편 E군의 피험자는 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀(840mg(3캅셀)/일)을 매일 저녁 식사 후에 복용했다(상기 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물 충전 캅셀 840mg 중, 168mg가 아스파라거스 줄기 고형분 유래의 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물이고, 나머지 672mg가 파인덱스, 스테아린산 칼슘 및 세오라스였다). 평가 항목을 백혈구 중의 HSP70 mRNA의 발현량, 자율 신경 밸런스 및 자율 신경 활동도로 했다.
(HSP70 mRNA 발현 유도 활성 평가)
처음에, 인간 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현 레벨을 측정했다. 시험 개시 전 및 시험 종료일에 채혈을 행하여 혈액 400μL로부터 RNA 추출 키트(제품명： Nucleo Spin RNA Blood, 다카라 바이오 사제)를 이용하여 토탈 RNA를 추출했다. cDNA의 합성 및 PCR의 방법은 실시예 8에 기재한 방법에 준했다.
결과를 도 13에 나타낸다. 도 13에 있어서는, 섭취 개시 전의 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현량에 대한, 섭취 종료 후의 백혈구 중의 HSP70 mRNA 발현량의 비율(%)을 나타낸다. P군(플라시보군)의 HSP70 mRNA 발현량은 섭취 개시 전에 비해, 평균치로 175%였다. 한편, E군(효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군)의 HSP70 mRNA 발현량은 섭취 개시 전에 비해, 평균치로 278%이며, 발현이 증강되어 있었다(*p=0.098 대 P군). 이것으로부터, 본 실시예에 의한 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 복용함으로써, HSP70 mRNA의 발현량이 현저하게 증강되는 것으로 나타났다.
(자율 신경 조절 효과에 관한 임상적 평가)
다음에, 시험 개시 전과 시험 종료일에, 가속도 맥파 검사 시스템(제품명； 펄스 애널라이저 플러스 TAS-9, YKC 사제)을 이용하여 자율 신경 밸런스 및 자율 신경 활동도를 평가했다. 측정의 상세는 실시예 9에 기재한 대로이다.
도 14에 자율 신경 밸런스의 변화를 나타낸다. P군(플라시보군)에 있어서는, 시험 개시 전과 비교해 시험 종료일에서는 자율 신경 밸런스가 유의하게 악화되어 있었다(*p＜0.05 대 시험 개시 전). 한편, E군(효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군)에 있어서는, 시험 개시 전과 비교해 시험 종료일에서는 자율 신경의 밸런스가 개선되어 있었다. 이것으로부터, 본 실시예에 의한 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 복용함으로써, 자율 신경의 밸런스를 개선하는 것으로 나타났다.
도 15에 자율 신경 활동도의 변화를 나타낸다. P군(플라시보군)에 있어서는, 시험 개시 전과 비교해 시험 종료일에서는 자율 신경 활동도가 유의하게 악화되어 있었다(**p＜0.01 대 시험 개시 전). 한편, E군(효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물군)에 있어서는, 시험 개시 전과 비교해 시험 종료일에서는 자율 신경 활동도가 개선되어 있었다. 이것으로부터, 본 실시예에 의한 효소 처리 아스파라거스 줄기 열수 가열 처리물을 복용함으로써, 자율 신경 활동도의 악화를 막는 것으로 나타났다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 신규한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체, 우수한 효과를 가지는 의약품, HSP 유도제, 항스트레스제 및 자율 신경 조절제를 제공할 수 있다. 또한, 우수한 HSP 유도 활성, 항스트레스 효과 및 자율 신경 조절 효과를 가지는 음식품을 제공할 수 있다. 또한 저비용화가 가능하고 간편한 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 광의의 정신 및 범위를 일탈하지 않고, 다양한 실시 형태 및 변형이 가능해지는 것이다. 또한, 상기 서술한 실시 형태는 본 발명을 설명하기 위한의 것이며, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 범위는, 실시 형태가 아니라, 청구의 범위에 의해 나타난다. 그리고, 청구의 범위 내 및 이와 동등한 발명의 의의의 범위 내에서 실시되는 다양한 변형은 본 발명의 범위 내로 간주된다.
본 발명은 2011년 12월 20일에 출원된 일본 특허 출원 2011-277926호에 기초한다. 본 명세서 중에 일본 특허 출원 2011-277926호의 명세서, 특허 청구의 범위, 도면 전체를 참조로서 도입하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> AMINO UP CHEMICAL CO., LTD. <120> Hydroxymehylfurfural Derivatives <130> 12F096-PCT <140> US 14/366,276 <141> 2014-06-18 <150> JP2011-277926 <151> 2011-12-20 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 forward primer <400> 1 gcatttccta gtatttctgt ttgt 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 reverse primer <400> 2 aatagtcgta agatggcagt ata 23 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta 2 microglobulin forward primer <400> 3 tagctgtgct cgcgctact 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta 2 microglobulin reverse primer <400> 4 agtgggggtg aattcagtgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 forward primer <400> 5 caagatcacc atcaccaacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP70 reverse primer <400> 6 ctcaaactcg tccttctcgg 20

Claims (12)

  1. 일반식:
    Figure 112019026853053-pct00015

    (식 중, R은 하기 식 (I)이다)
    Figure 112019026853053-pct00016

    로 표시되는 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체.
  2. 청구항 1에 기재된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 포함하는 식품.
  3. 청구항 1에 기재된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 포함하는 음료.
  4. 청구항 1 에 기재된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 하는 자율 신경 실조증 치료용 조성물.
  5. 청구항 1 에 기재된 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체를 유효 성분으로 하는 열 충격 단백질 유도 작용, 항스트레스 작용, 자율 신경 조절 작용을 갖는 자율 신경 실조증 치료용 조성물.
  6. 아스파라거스 줄기에 물을 1배량~50배량 더하고, 50℃~300℃에서, 대기압 하 또는 가압 하에서, 20분~180분 동안 열수 가열 처리함으로써 아스파라거스 줄기를 열수 가열 처리 하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    일반식:
    Figure 112019026853053-pct00036

    (식 중, R은 하기 식 (I)이다)
    Figure 112019026853053-pct00037

    로 표시되는 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    30℃~60℃의 온도에서, 1시간~72시간, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 펙티나아제, 아밀라아제 및 풀룰라나아제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 효소를 사용하여 효소 처리하는 공정을 더욱 포함하는 하이드록시메틸푸르푸랄 유도체의 제조 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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