TW201726622A - 視網酸x受體之螢光配體及其應用 - Google Patents

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Hiroki Kakuta
Shoya Yamada
Masaki Watanabe
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Nat Univ Corp Okayama Univ
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Abstract

本發明係關於使用下列式(1)至式(3)中之任一者所示之視網酸X受體之螢光配體能夠容易地進行對視網酸X受體結合能力之檢測。其中式(1)至式(3)中，R1為甲基、烷氧基或苯乙烯基；R2為羥基、烷氧基或烷基胺基；A為N或CH；B為NH或O；R3為異丙基或第三丁基；R4為異丙基或異丁基。

Description

視網酸X受體之螢光配體及其應用
本發明係關於一種視網酸X受體之螢光配體。本發明亦關於使用該螢光配體檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力之檢測方法；包含該螢光配體之用以檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力與活化能力之試驗套組；以及包含該螢光配體作為有效成分之醫藥組成物。
類視黃醇(rexinoid)係對視網酸X受體(retinoid X receptor,RXR)表現出結合性之物質之統稱。即，類視黃醇為視網酸X受體之配體(ligand for retinoid X receptor)。
屬於類視黃醇之一的貝瑟羅汀(bexarotene)(註冊商標為targretin)為RXR之活化物質(促效劑)，在美國係將其臨床應用於皮膚浸潤性T細胞淋巴瘤(CTCL)(專利文獻1)。此外，有文獻指出貝瑟羅汀不僅可治療癌症，對於糖尿病(非專利文獻1)、阿茲海默症(專利文獻2及非專利文獻2)以及帕金森氏症(非專利文獻3)亦具有療效。其原因在於RXR與控制糖‧脂質代謝之其他核內受體一併進行協同作用，進而在於RXR與其他核內受體之異型二聚物之活性受到類視黃醇之控制。
再者，已知DHA及EPA屬於天然之類視黃醇(非專利文獻4)，其可用於提高記憶力，亦可用於改善新陳代謝症候群或癌症惡病質，包含DHA及EPA之食品亦可作為功能性食品。因此，RXR成為藥物開發及功能性食品極具吸引力的目標。
以RXR作為標的之配體研究係藉由使用放射性同位素(RI)標記配體之結合試驗或使用培養細胞之轉錄活化試驗，即利用報導基因分析之轉錄 活化試驗而進行(非專利文獻5)。此外，目前已知以套組形式市售之TR-FRET(Time-resolved fluorescence energy transfer，時間分辨螢光共振能量轉移)法。以下對數種現有之類視黃醇研究方法進行說明。
(a)報導基因分析
報導基因分析係利用RXR過度表現之細胞以評價試驗化合物的轉錄活化能力。報導基因分析為檢測受試物質轉錄活化能力最佳的試驗方法，但得出結果需較長時間(3天至4天)。因此，若能夠以一次篩選之方式進行對RXR之結合試驗，則可避免不必要之報導基因分析試驗。
(b)使用RI標記化合物之結合試驗
已知使用放射性同位素標記配體之方法可應用於RXR結合試驗。該方法係依據RI標記受試化合物與試驗化合物對RXR之競爭性結合以評價受試化合物之結合能力，感度較高。然而，實施該方法需要特定儀器，又必須將結合於受試化合物上的RI標記化合物與游離之RI標記化合物加以分離，操作步驟繁雜。此外，該方法中所使用之放射性同位素(RI)試劑([3H]9-順式視網酸)價格甚昂貴，其使用尤其於日本受到法律限制，必須進行繁雜之操作。
(c)TR-FRET法
TR-FRET法係藉由測定經鋱標記之RXR與經螢光標記之輔激活劑的FRET現象以評價受試化合物之RXR活化能之方法。藉由使用市售套組之TR-FRET法進行之類視黃醇研究，可於短時間內獲得提示受試化合物之促效劑活性之資料。然而，須有與TR-FRET法對應之讀板儀，而可供使用之讀板儀有限。
RXR一方面雖為極具吸引力之藥物開發目標，但另一方面則存在具副作用之問題。例如唯一可應用於臨床之類視黃醇，貝瑟羅汀，其具有引起血中脂質上升、甲狀腺功能減退症或易感染等嚴重的副作用。因此，使用貝瑟羅汀時會建議進行血中濃度監測。在進行血中濃度監測時，通常係自血中萃 取出藥物，並以HPLC測定藥物之紫外線吸光強度來定量。由於係以紫外線吸光強度作為指標，故存在藥物感光度較低，或可能受到患者體內其他物質影響等問題。
一般而言，貝瑟羅汀之RXR促效劑係由包含1,1,4,4-四甲基氫化萘結構之疏水性部位、包含苯甲酸或菸鹼酸之酸性部位，且由疏水性部位與酸性部位連結所構成。非專利文獻6中記載藉由疏水性部位為表現螢光之2(1H)-喹啉酮骨架而具有螢光性之RXR促效劑，並藉由觀測該促效劑之螢光偏光度而可測定該促效劑對RXR之結合能力。然而，非專利文獻6記載之RXR促效劑存在螢光強度低，且對RXR之結合能力低的問題。
非專利文獻7中記載有使用具有螢光團之輔因子部分肽與RXR，並依據該輔因子部分肽之螢光偏光度變化來測定其對RXR之結合能力的方法，並可定性地測定受試物質對RXR之促效性或拮抗性。然而，非專利文獻7記載之方法若不使用具有螢光團之輔激活劑(coactivator)與輔抑制劑(corepressor)兩種物質，則無法檢測受試物質對RXR之促效性或拮抗性。因此，存在實驗所用之RXR量較多、且作業時間較長之問題。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1] WO93/21146A1
[專利文獻2] WO2013/056232A2
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Nature(1997)，386(6623)，407-410
[非專利文獻2] Science(2012)，335(6075)，1503-1506
[非專利文獻3] ACS Chem Neurosci.(2013)，4(11)，1430-1438
[非專利文獻4] Mol Cell Proteomics.(2004)，3(7)，692-703
[非專利文獻5] J.Med.Chem.(1994)，37，2930-2941
[非專利文獻6] Bioorg.Med.Chem.Lett.(2010)，20，5143-5146
[非專利文獻7] J.Med.Chem.(2013)，56，1865-1877
本發明之目的在於提供一種視網酸X受體之螢光配體以解決上述之問題。又，提供一種使用該螢光配體而可容易地檢測受試物質對RXR之結合能力的檢測方法。進而，提供一種包含該螢光配體作為有效成分之能夠容易地進行血中濃度監測之醫藥組成物。
上述問題可藉由提供下列式(1)至式(3)中之任一者所示之視網酸X受體之螢光配體而得到解決。
上述式(1)中，R1為甲基、烷氧基或苯乙烯基；R2為羥基、烷氧基或烷基胺基；A為N或CH；B為NH或O。
式(2)中，R1、R2、A及B與式(1)中同義；R3為異丙基或第三丁基。
式(3)中，R1、R2、A及B與式(1)中同義；R3為異丙基或第三丁基；R4為異丙基或異丁基。
又，上述問題亦可藉由提供下列式(4)或式(5)所示之視網酸X受體之螢光配體而得到解決。
式(4)中，R5為異丙基或第三丁基；R6為異丙基或異丁基；W為NR7、C=CH2、C=NOH或C(OCH3)2；R7為烷基；X為N或CH；Y為N或CH；Z為 CH=CH(反式)、NHCO、CONH、CH=CH-CO或CO-CH=CH；Fluorophore為包含芳香環之螢光團，該芳香環與Z鍵結。
式(5)中，R5、R6、W、R7、X及Y與式(4)中同義；Z1為CH=CH(反式)、NHCO、CONH、CH=CH-CO或CO-CH=CH；Z2為CH=CH、NHCO、CONH、NHSO2、SO2NH、CH2NHCO或CH2NHSO2；環Q為苯環、吡啶環、噻吩環、萘環或喹啉環；Fluorophore為包含芳香環之螢光團，該芳香環與Z2鍵結。
較佳實施例係使用上述式(1)至式(5)中之任一者所示之螢光配體而檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力的檢測方法。此時，較佳為於存在該受試物質之水溶液中，藉由測定因該螢光配體結合於視網酸X受體而導致該螢光配體之螢光強度減弱，因而檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力。
於其他較佳實施例係將上述式(1)至式(5)中之任一者所示之螢光配體與具有螢光團之輔因子肽(輔激活劑)併用而檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力與活化能力的檢測方法。
上述課題亦可藉由提供將核內受體之螢光配體與具有螢光團之核內受體輔因子肽併用而檢測受試物質對該核內受體之結合能力與活化能力的檢測方法而得到解決。此時，較佳為該螢光配體之激發波長及螢光波長不與該具螢光團之核內受體輔因子肽之激發波長及螢光波長重合。又，亦較佳為於存 在受試物質之水溶液中，藉由測定因該螢光配體結合於該受體而引起之該螢光配體之螢光強度減弱，進而檢測受試物質對該受體之結合能力，同時藉由測定該核內受體輔因子肽之螢光偏光度，進而檢測受試物質對上述受體之活化能力。
上述課題亦可藉由提供包含視網酸X受體之螢光配體及具有螢光團之核內受體輔因子肽併用以檢測受試物質對核內受體之結合能力與活化能力的試驗套組而得到解決。
又，上述課題亦可藉由提供包含上述式(1)至式(5)中之任一者所示之螢光配體作為有效成分之醫藥組成物而得到解決。
藉由使用本發明之視網酸X受體配體，能夠容易地進行對RXR之結合性之檢測試驗，有助於以RXR作為靶點之醫藥候補或功能性食品之探索。又，亦能夠以螢光作為指標而容易地進行藥劑之血中濃度監測。
圖1係說明受試物質之RXR結合能力之檢測方法之原理示意圖。
圖2係說明同時檢測受試物質對於RXR結合能力與RXR活化能力之檢測方法之原理示意圖。
圖3係表示本發明之螢光配體RXR之轉錄活化能力的濃度曲線。
圖4係表示本發明之化合物10於各種溶劑中之螢光強度柱狀圖。
圖5係使用化合物10作為螢光配體與RXR(RXRα-LBD及全長RXRα)結合之螢光強度折線圖。
圖6係使用本發明之化合物10作為螢光配體與RXR結合成為試驗物質以檢測各受試物質(貝瑟羅汀、CBTF-PMN、PA452及三丁基氯化錫)與RXR之結合能力之曲線圖。
圖7係使用本發明之化合物44作為螢光配體與RXR(RXRα-LBD)成為試驗物質之結合能力之劑量曲線圖。
圖8係關於使用本發明之化合物44作為螢光配體與RXR結合成為試驗物質以檢測各受試物質對於RXR結合能力。
圖9係使用本發明之化合物10作為螢光配體及螢光標記輔因子肽(螢光素-PGC1a)同時測定受試物質對於RXR結合能力與RXR活化能力。
圖10係表示將小鼠經口投予本發明之化合物10作為螢光配體時之血中濃度。
圖11係表示小鼠經口投予本發明之化合物10作為螢光配體於各投予量下之血中濃度。
圖12係表示化合物10作為螢光配體添加時之SEAP活性。
圖13係表示RXR(RXRα-LBD)存在時之化合物62之螢光強度變化。
本發明之視網酸X受體配體係以上述式(1)至式(5)中之任一者。
依據本發明，上述式(1)至式(5)所表示之化合物進而可為藥學上容許之鹽。又，於上述式(1)至式(5)所表示之化合物或其鹽存在異構物(例如光學異構物、幾何異構物及互變異構物)等之情形時，本發明亦包含該等異構物，另外亦包含溶劑合物、水合物及各種形狀之結晶。
依據本發明，所述之藥學上容許之鹽，可列舉藥理學及製劑學上所容許之一般之鹽。作為此種鹽，具體而言例示如下。
作為鹼性加成鹽，可列舉：例如鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；例如鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽；例如銨鹽；例如三甲基胺鹽、三乙基胺鹽；二環己基胺鹽、乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、普魯卡因鹽等脂肪族胺鹽；例如N,N-二苄基乙二胺等芳烷基胺鹽；例如吡啶鹽、甲基吡啶鹽、喹啉鹽、異喹啉鹽等雜環芳香族胺鹽；例如四甲基銨鹽、四乙基銨鹽、苄基三甲基銨鹽、苄基三乙基銨鹽、苄基三丁基銨鹽、甲基三辛基銨鹽、四丁基銨鹽等四級銨鹽；精胺酸鹽、離胺酸鹽等鹼性胺基酸鹽等。
作為酸性加成鹽，可列舉：例如鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、過氯酸鹽等無機酸鹽；例如乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽等有機酸鹽；例如甲磺酸鹽、羥乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等磺酸鹽；例如天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽等酸性胺基酸等。
本說明書中使用之用語於單獨出現或與其他用語一併出現時具有以下之定義。
依據本發明，所述之「烷基」意指碳數1個至20個、較佳為1個至10個之直鏈狀、分支狀或環狀之烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。較佳為碳數1個至6個之烷基，例如可列舉：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基。較佳為碳數1個至6個之低級烷基。
依據本發明，所述之「烯基」意指上述「烷基」具有1個或其以上之雙鍵之碳數2個至20個、較佳為2個至8個之直鏈狀或分支狀之烯基，例如 可列舉：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
依據本發明，所述之「炔基」意指上述烷基具有1個或其以上之三鍵之碳數2個至20個、較佳為2個至10個之炔基，例如可列舉：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等。
依據本發明，所述之「烷氧基」意指碳數1個至20個之直鏈狀或分支(鏈)狀之烷氧基，例如可列舉：甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、第二丁氧基、第三丁氧基、戊氧基、己氧基、十八烷氧基、烯丙氧基等。較佳為碳數1個至6個之直鏈狀或分支狀之低級烷氧基。
依據本發明，所述之「醯基」意指烷醯基及芳醯基等。作為該烷醯基，例如可列舉具有碳數1個至6個、較佳為1個至4個之烷基之烷醯基(甲醯基、乙醯基、三氟乙醯基、丙醯基、丁醯基等)。作為芳醯基，例如碳數7個至15個之芳醯基，具體而言，例如可列舉苯甲醯基、萘甲醯基等。
依據本發明，上述式(4)及式(5)中，作為以Fluorophore表示之螢光團之例，可列舉：喹啉、喹啉鎓、口星、香豆素系色素、丹磺醯、吡啶鎓、苯并呋呫系色素、螢光素系色素(例如螢光素、羧基萘并螢光素、四氯螢光素、四溴碸螢光素等)、若丹明系色素(例如若丹明、羧基-X-若丹明、羧基若丹明、四乙基若丹明、四甲基若丹明、若丹明紅、若丹明綠等)，另外亦可列舉：花青系色素(例如Cy7、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、其他Cy色素：GE Healthcare)、Alexa Fluor類(例如Alexa Fluor 790、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 405等：INVITROGEN)、VivoTag(例如VivoTag S750、VivoTag 680、VivoTag S680：VisEn Medical)、Atto系色素(例如Atto 740、Atto 725、Atto 700、Atto 680、Atto 655、Atto 647、Atto 637、Atto 635、Atto 633、Atto 620、Atto 611X、Atto 610、Atto 594、Atto 590、Atto 565、Atto 550、Atto 532、Atto 520、Atto 495、Atto 488、Atto 465、Atto 425等：ATTO-TEC GmbH)、BODIPY系色素(例如BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY-530/550、BODIPY-FL-X)、CAL Fluor系色素(例如CAL Fluor-Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635等)、Cascade Blue、Oregon Green系色素(例如Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514等)、Rhodol Green、Texas Red等。
若使用上述式(1)至式(5)中之任一者所表示之螢光配體，則可容易地檢測受試物質對RXR之結合能力。具體而言，於存在上述受試物質之水溶液中，藉由測定因該螢光配體結合於RXR而引起之該螢光配體之螢光強度減弱，可檢測受試物質對RXR之結合能力。其所利用原理如下：該螢光配體於在水中處於游離狀態之情形時其螢光強度較大，於結合於RXR而處於疏水性環境中之情形時則螢光強度較小(如圖4所示)。
如圖1所示，本發明之該螢光配體若與RXR結合，則螢光強度變小，但若其他配體(受試物質)結合於RXR，則該螢光配體游離而螢光強度變大，藉此，能夠測定其他配體(受試物質)對於RXR之結合能力。
又，亦適合採用將上述式(1)至式(5)中之任一者所表示之螢光配體與具有螢光團之輔因子肽併用而檢測受試物質對視網酸X受體之結合能力與活化能力的檢測方法。根據該方法，能夠同時檢測受試物質對RXR之結合能力與RXR之活化能力。
更具體而言，於存在受試物質之水溶液中，藉由測定因螢光配體結合於RXR所引起之該螢光配體之螢光強度減弱，可檢測受試物質對RXR之 結合能力，同時藉由測定具有螢光團之輔因子肽之螢光偏光度，可檢測受試物質對RXR之活化能力。螢光偏光度之測定其所利用之原理如下：具有螢光團之輔因子肽若結合於RXR則螢光偏光度較大，若為游離狀態則螢光偏光度較小。
圖2表示將若結合於RXR則螢光強度減小之螢光性類視黃醇、與螢光性輔因子肽併用之模式。如圖2所示，於螢光性促效劑所結合之RXR上結合有螢光標記輔激活劑之情形時，觀察到來自螢光促效劑之較弱螢光，且觀察到來自螢光標記輔激活劑之高偏光度之螢光。此處，若其他促效劑結合於RXR，則會觀察到來自螢光性促效劑之較強螢光，且觀察到來自螢光標記輔激活劑之高偏光度之螢光。又，若其他拮抗劑結合於RXR，則會觀察到來自螢光性促效劑之較強螢光，且觀察到來自螢光標記輔激活劑之低偏光度之螢光。即，藉由僅使用輔激活劑(或輔抑制劑)作為螢光標記之共活化劑，可判別受試物質為促效劑或為拮抗劑。
此時，較理想為螢光配體之激發波長及螢光波長不與輔因子肽之激發波長及螢光波長重合。藉由該等之波長不重合，能夠進行高精度之測定。又，作為上述檢測方法所使用之輔因子肽，可使用輔激活肽與輔抑制肽中之任一者。又，作為輔因子肽，亦可使用輔因子部分肽。
亦可使用包含螢光配體及具有螢光團之RXR輔因子肽而用以檢測受試物質對RXR之結合能力與活化能力的試驗套組。
另一方面，藉由代替選自上述式(1)至式(5)所表示之化合物中之螢光性類視黃醇而將結合於欲作為對象之核內受體上之螢光性配體與具有螢光團之輔因子肽進行組合，能夠針對RXR以外之核內受體，同時檢測試驗化合物對該核內受體之結合能力與該核內受體之活化能力。即，於存在上述受試物質之水溶液中，藉由測定因螢光配體結合於上述受體而引起之該螢光配體之螢光 強度減弱，可檢測受試物質對上述受體之結合能力，同時藉由測定核內受體共活化劑之螢光偏光度，可檢測受試物質對上述受體之活化能力。
關於將結合於欲作為對象之核內受體上之螢光性配體與具有螢光團之共活化劑進行組合之結合試驗法，較理想為螢光性配體之激發及螢光波長不與具有螢光團之共活化劑之激發及螢光波長重合。又，包含核內受體之螢光配體及具有螢光團之核內受體輔因子肽而用以檢測受試物質對核內受體之結合能力與活化能力的試驗套組亦為較佳之實施態樣。
於使用以本發明之化合物作為有效成分之醫藥之情形時，投予量並無特別限定。於併用本發明之化合物而調節視網酸之作用之情形或於不併用包含視網酸之醫藥而投予本發明之藥劑以調節活體內既有視網酸之作用之情形等，可針對各投予方法而容易地選擇適宜之投予量。例如於經口投予之情形時，可於以有效成分計成人每天0.01mg至1000mg左右之範圍內使用。於將包含視網酸作為有效成分之醫藥與本發明之藥劑併用之情形時，可於視網酸之投予期間、及/或投予前或投予後之期間之任一時間投予本發明之藥劑。
於使用本發明之化合物作為藥劑之情形時，可直接投予選自上述式(1)至式(5)所表示之化合物中之1種或2種以上，但較佳為以包含1種或2種以上之上述化合物之經口用或非經口用之醫藥組成物之形式投予。經口用或非經口用之醫藥組成物可使用業者所能夠利用之製劑用添加物、即藥理學及製劑學上可容許之載體而製造。例如亦可於對炎症性呼吸器官疾病具有治療效果之醫藥中調配上述式(1)至式(5)所表示之化合物之1種或2種以上而作為所謂合劑形態之醫藥組成物使用。具體而言，亦可與吸入類固醇藥、吸入長期作用性β2刺激藥、白三烯受體拮抗劑、經口類固醇藥等併用而使用。
作為適於經口投予之醫藥用組成物，例如可列舉：錠劑、膠囊劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、液劑及糖漿劑等，作為適於非經口投予之醫藥組 成物，例如可列舉：注射劑、點滴劑、栓劑、吸入劑、滴鼻劑、軟膏劑、乳霜劑及貼附劑等。作為用於製造上述醫藥組成物之於藥理學及製劑學上可容許之載體，例如可列舉：賦形劑、崩解劑或崩解輔助劑、結合劑、潤滑劑、包衣劑、色素、稀釋劑、基劑、溶解劑或溶解輔助劑、等張劑、pH調節劑、穩定化劑、噴射劑及黏著劑等。
[實施例]
以下將更具體地說明本發明之化合物之製造方法及螢光物性等。本發明之範圍內所包含之各化合物均可藉由對化合物之製造方法中所使用之起始原料及試劑以及反應條件等進行適當修飾或改變而成功製造。本發明之化合物之製造方法並不限定於實施例所具體說明者。
[實施例1]目標化合物10之合成
本實施例中之目標化合物10之合成方法如下所示。
1)化合物2之合成
將2,4-二羥基苯甲醛(3.3g、24mmol)溶解於乙酸(24mL)，歷時10分鐘滴加溴(1.2g、24mmol)後，於室溫下攪拌20小時。其後，利用TLC(Thin Layer Chromatography，薄層層析)板(乙酸乙酯：正己烷=1：3，2次展開)確認反應結束。添加水(35mL)，過濾分離所析出固體，用水洗淨而獲得粗結晶(5.3g)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：4→1：3)，進而進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得淡褐色針狀結晶之化合物2(1.5g、28%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 11.25(s,1H),9.70(d,1H,J=0.5Hz),7.66(s,1H),6.63(s,1H),6.11(s,1H)
2)化合物3a之合成
將化合物2(220mg、1mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(3.0mL)，一面於氬氣環境中冰浴冷卻一面添加二異丙基乙基胺(520μL、3.0mmol)、氯甲基甲醚(330μL、4.3mmol)後，於室溫下攪拌27小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(60mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(60mL×2)、飽和食鹽水(60mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(350mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：5)，而獲得白色固體狀之化合物3a(280mg、92%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.29(s,1H),8.03(s,1H),7.01(s,1H),5.32(s,2H),5.29(s,2H),3.53(s,6H)
3)化合物3b之合成
將化合物2(220mg、1mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(2.0mL)，添加碳酸鉀(420mg、3.0mmol)、苄基溴(360μL、3.0mmol)，於氬氣環境中於60℃下攪拌20小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至水(100mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(460mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：10→1：3)，而獲得白色固體狀之化合物3b(390mg、99%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.31(s,1H),8.05(s,1H),7.42-7.36(m,10H),6.54(s,1H),5.17(s,2H),5.11(s,2H)
4)化合物6之合成
將2,5-二甲基-2,5-己二醇(2.0g、14mmol)溶解於濃鹽酸(20mL)，於室溫下攪拌14小時。過濾分離固體，用水洗淨後，使之溶解於二氯甲烷(150mL)，用水(50mL)洗淨。利用硫酸鎂乾燥有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得白色固體之粗生成物(2.8g)。使所獲得之粗生成物與2-溴甲苯(3.3mL、27mmol)溶解於無水二氯甲烷(30mL)，分三次添加氯化鋁(III)(170mg)，於氬氣環境中於室溫下攪拌20小時。利用TLC板(正己烷)確認反應結束後，利用正己烷(150mL)稀釋反應液，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(4.2g)，進行再結晶(甲醇)，而獲得白色固體狀之化合物6(3.0g、78%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.42(s,1H),7.14(s,1H),2.34(s,3H),1.65(s,4H),1.25(s,12H)
5)化合物7a之合成
將化合物6(560mg、2.0mmol)溶解於無水四氫呋喃(6.0mL)，一面於-78℃下冷卻一面滴加正丁基鋰(1.55M正己烷溶液、1.6mL、2.4mmol)。於-78℃下攪拌20分鐘後，滴加已溶解於無水四氫呋喃(0.5mL)之硼酸三異丙酯(1.4mL、6.0mmol)，於-78℃下攪拌2小時。添加2N鹽酸(10mL)，於室溫下攪拌1小時後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得白色固體之粗生成物(450mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：5)，而獲得白色固體狀之化合物7a(360mg、73%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.28(s,1H),7.21(s,1H),2.81(s,3H),1.72(s,4H),1.34(s,6H),1.32(s,6H)
6)化合物7b之合成
將化合物6(1.6g、5.8mmol)、[1,1-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀(II)-二氯甲烷加成物(140mg、0.17mmol)、乙酸鉀(1.7g、17mmol)、雙(頻哪醇酯)二硼烷(1.6g、6.3mmol)懸浮於無水二甲基亞碸(20mL)中，於氬氣環境中於微波照射下，於150℃下攪拌90分鐘。利用TLC板(正己烷)確認反應結束後，對反應液進行矽藻土過濾。利用乙酸乙酯稀釋濾液，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色固體之粗生成物(2.3g)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=0：1→1：50)，而獲得黃色固體狀之化合物7b(1.2g、63%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.73(s,1H),7.09(s,1H),2.48(s,3H),1.66(s,4H),1.31(s,12H),1.30(s,6H),1.26(s,6H)
7)化合物8之合成
將化合物3a(150mg、0.50mmol)、化合物7b(200mg、0.60mmol)溶解於甲苯(2.0mL)、乙醇(1.0mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(30mg、0.026mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.5mL)，於100℃下攪拌24小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(100mL)、水(100mL)、飽和食鹽水(100mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(200mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：6)，而獲得無色油狀之化合物8(180mg、86%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.40(s,1H),7.69(s,1H),7.14(s,1H),7.04(s,1H),5.33(s,2H),5.16(s,2H),3.56(s,3H),3.39(s,3H),2.10(s,3H),1.69(s,4H),1.31(s,6H),1.25(s,6H)
8)化合物9之合成
將化合物8(18mg、0.041mmol)溶解於二氯甲烷(2.0mL)，添加三氟乙酸(200μL)，於室溫下攪拌1小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(16mg)。使所獲得之粗生成物溶解於蒸餾乙醇(1.0mL)，添加哌啶(20μL、0.20mmol)、丙二酸二乙酯(22μL、0.14mmol)，於氬氣環境中進行14小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(50mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(15mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：3)，而獲得褐色固體狀之化合物9(7.0mg、39%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.51(s,1H),7.39(s,1H),7.27(s,1H),7.12(s,1H),6.98(s,1H),5.75(s,1H),4.41(q,2H,J=7.0Hz),2.11(s,3H),1.72(s,4H),1.40(t,3H,J=7.0Hz),1.33(s,6H),1.27(s,6H)
9)目標化合物10之合成
將化合物9(22mg、0.051mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加2N氫氧化鈉(1.0mL)，於室溫下攪拌7小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層，利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體之粗生成物(18mg)，進行再結晶(甲醇)，而獲得黃色針狀結晶之化合物10(15mg、74%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.70(s,1H),7.63(s,1H),7.18(s,1H),7.03(s,1H),6.85(s,1H),2.05(s,3H),1.65(s,4H),1.27(s,6H),1.22(s,6H)
[實施例2]目標化合物23a-c之合成
於本實施例中之目標化合物23a-c之合成方法如下。
1)化合物18之合成
將2,5-二甲基-2,5-己二醇(2.0g、14mmol)溶解於濃鹽酸(20mL)，於室溫下攪拌14小時。過濾分離固體，用水洗淨後，使之溶解於二氯甲烷(150mL)，用水(50mL)洗淨。利用硫酸鎂乾燥有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得白色固體之粗生成物(2.4g)。使所獲得之粗生成物與2-溴苯酚(2.1mL、20mmol)溶解於無水二氯甲烷(30mL)，添加氯化鋁(III)(170mg)，於氬氣環境中於室溫 下攪拌3小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：10)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)稀釋反應液，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色固體之粗生成物(4.4g)，進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=0：1→1：10)，進而進行再結晶(正己烷)，而獲得褐色粉末狀之化合物18(2.4g、61%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.34(s,1H),6.95(s,1H),5.25(s,1H),1.65(s,4H),1.25(s,6H),1.24(s,6H)
2)化合物19a之合成
將化合物18(200mg、0.71mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(1.5mL)，添加氫化鈉(油中純度60%、44mg、1.1mmol)、碘甲烷(68μL、1.1mmol)，於氬氣環境中於0℃下攪拌2小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：10)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(220mg)，進行快速層析(正己烷)，而獲得白色固體狀之化合物19a(200mg、97%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.42(s,1H),6.79(s,1H),3.87(s,3H),1.66(m,4H),1.28(s,6H),1.24(s,6H)
3)化合物19b之合成
將化合物18(400mg、1.4mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(3.0mL)，添加氫化鈉(油中純度60%、70mg、1.7mmol)、1-碘丙烷(170μL、1.7mmol)，於氬氣環境中於0℃下攪拌2小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：20)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸 鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(420mg)。進行快速層析(正己烷)，而獲得無色油狀之化合物19b(390mg、84%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41(s,1H),6.78(s,1H),3.96(t,2H,J=6.5Hz),1.89-1.80(m,2H),1.67-1.64(m,4H),1.26(s,6H),1.24(s,6H),1.07(t,3H,J=7.5Hz)
4)化合物19c之合成
將化合物18(400mg、1.4mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(3.0mL)，添加氫化鈉(油中純度60%、70mg、1.7mmol)、1-溴戊烷(210μL、1.7mmol)，於氬氣環境中於0℃下攪拌2小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：20)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(490mg)，進行快速層析(正己烷)，而獲得黃色油狀之化合物19c(430mg、88%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41(s,1H),6.78(s,1H),3.98(t,2H,J=6.5Hz),1.86-1.79(m,2H),1.67-1.64(m,4H),1.50-1.46(m,2H),1.41-1.37(m,2H),1.26(s,6H),1.24(s,6H),0.94(t,3H,J=7.0Hz)
5)化合物20a之合成
將化合物19a(170mg、0.58mmol)溶解於無水四氫呋喃(2.0mL)，一面於-78℃下冷卻一面滴加正丁基鋰(1.55M正己烷溶液、0.41mL、0.64mmol)。於-78℃下攪拌20分鐘後，滴加已溶解於無水四氫呋喃(0.5mL)之硼酸三異丙酯(0.46mL、2.0mmol)，於-78℃下攪拌2小時。添加2N鹽酸(5mL)，於室溫下攪拌1小時後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水 (50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得白色固體之粗生成物(110mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：20→1：5)，而獲得白色固體狀之化合物20a(100mg、68%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.77(s,1H),6.81(s,1H),5.82(brs,2H),3.90(s,3H),1.73-1.64(s,4H),1.30(s,6H),1.29(s,6H)
6)化合物20b之合成
將化合物19b(390mg、1.2mmol)溶解於無水四氫呋喃(3.5mL)，一面於-78℃下冷卻一面滴加正丁基鋰(1.55M正己烷溶液、0.92mL、1.4mmol)。於-78℃下攪拌20分鐘後，滴加已溶解於無水四氫呋喃(0.5mL)之硼酸三異丙酯(0.80mL、3.5mmol)，於-78℃下攪拌2小時。添加2N鹽酸(5mL)，於室溫下攪拌1小時後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得白色固體之粗生成物(310mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=0：1→1：10)，而獲得白色固體狀之化合物20b(280mg、80%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.77(s,1H),6.79(s,1H),5.85(s,2H),4.03(t,2H,J=6.5Hz),1.91-1.83(m,2H),1.71-1.64(m,4H),1.29-1.28(m,12H),1.07(t,3H,J=7.5Hz)
7)化合物20c之合成
將化合物19c(430mg、1.3mmol)溶解於無水四氫呋喃(4.0mL)，一面於-78℃下冷卻一面滴加正丁基鋰(1.55M正己烷溶液、0.95mL、1.5mmol)。於-78℃下攪拌20分鐘後，滴加已溶解於無水四氫呋喃(0.5mL)之硼酸三異丙酯(0.92mL、4.0mmol)，於-78℃下攪拌2小時。添加2N鹽酸(5mL)，於室溫下攪拌1小時後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑， 而獲得黃色油狀之粗生成物(310mg)，進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=0：1→1：20)，而獲得白色固體狀之化合物20c(270mg、71%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.77(s,1H),6.79(s,1H),5.80(brs,2H),4.05(t,2H,J=6.5Hz),1.87-1.82(m,2H),1.68(s,4H),1.49-1.36(m,4H),1.29(m,12H),0.94(t,3H,J=7.0Hz)
8)化合物21b之合成
將化合物3a(89mg、0.29mmol)、20b(100mg、0.35mmol)溶解於甲苯(1.0mL)、乙醇(0.5mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(17mg、0.010mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.25mL)，於100℃下攪拌10小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(50mL)、水(50mL)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(83mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：20→1：10)，而獲得白色固體狀之化合物21b(76mg、56%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.38(s,1H),7.81(s,1H),7.13(s,1H),7.02(s,1H),6.82(s,1H),5.33(s,2H),5.15(s,2H),3.84(t,2H,J=6.5Hz),3.56(s,3H),3.42(s,3H),1.72-1.67(m,4H),1.65-1.62(m,2H),1.32(s,6H),1.25(s,6H),0.86(t,3H,J=7.5Hz)
9)化合物21c之合成
將化合物3b(76mg、0.24mmol)、20c(80mg、0.20mmol)溶解於甲苯(1.0mL)、乙醇(0.5mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(12mg、0.010mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.25mL)，於100℃下攪拌19小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：6)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(50mL)、水(50mL)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之 有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(290mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=0：1→1：20)，而獲得白色固體狀之化合物21c(90mg、76%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.41(s,1H),7.83(s,1H),7.42-7.22(m,10H),7.15(s,1H),6.82(s,1H),6.56(s,1H),5.14(s,2H),5.07(s,2H),3.84(t,2H,J=6.5Hz),1.72-1.64(m,4H),1.61-1.57(m,2H),1.32(s,6H),1.22-1.20(m,10H),0.81(t,3H,J=7.0Hz)
10)化合物22a之合成
將化合物3a(78mg、0.25mmol)、20a(80mg、0.30mmol)溶解於甲苯(0.80mL)、乙醇(0.40mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(15mg、0.013mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.20mL)，於100℃下攪拌24小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：4)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(50mL)、水(50mL)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(110mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：5)，而獲得無色油狀之粗生成物(82mg)。使所獲得之粗生成物溶解於甲醇(2.0mL)，添加濃鹽酸(20μL)並於室溫下攪拌12小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：4)確認反應結束後，蒸餾去除溶劑，而獲得粗生成物。使所獲得之粗生成物溶解於蒸餾乙醇(2.0mL)，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(110μL、0.75mmol)，於氬氣環境中進行6小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(48mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：3)，而獲得黃色固體狀之化合物22a(27mg、24%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.54(s,1H),7.47(s,1H),7.19(s,1H),7.05(s,1H),6.97(s,1H),6.96(s,1H),4.41(q,2H,J=7.0Hz),3.89(s,3H),1.73(s,4H),1.41(t,3H,J=7.0Hz),1.35(s,6H),1.30(s,6H)
11)化合物22b之合成
將化合物21b(76mg、0.20mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加濃鹽酸(40μL)並於室溫下攪拌10小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：4)確認反應結束後，蒸餾去除溶劑，而獲得粉色固體粗生成物。將該粉紅色固體之粗生成物溶解於蒸餾乙醇(2.0mL)，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(92μL、0.60mmol)，於氬氣環境中進行14小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(52mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：4)，而獲得黃色固體狀之化合物22b(42mg、54%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.55(s,1H),7.48(s,1H),7.20(s,1H),6.97(s,1H),6.96(s,1H),4.41(q,2H,J=7.0Hz),4.02(t,2H,J=6.5Hz),1.79-1.72(m,4H),1.41(t,3H,J=7.0Hz),1.34(s,6H),1.30(s,6H),0.95(t,3H,J=7.5Hz)
12)化合物22c之合成
將化合物21c(90mg、0.15mmol)溶解於甲醇(4.0mL)、乙酸乙酯(2.0mL)，添加10%活化鈀碳(觸媒量)，於氫氣環境中於室溫下攪拌24小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：10)確認反應結束後進行矽藻土過濾並蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(58.7mg)並將其溶解於蒸餾乙醇(1.0mL)，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(65μL、0.42mmol)，於氬氣環境中進行24小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，傾入至飽和 氯化銨水溶液(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(50mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：5)，而獲得黃色固體狀之化合物22c(27mg、35%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.55(d,1H,J=0.5Hz),7.48(s,1H),7.47(s,1H),7.19(s,1H),6.97(d,1H,J=0.5Hz),6.95(s,1H),4.41(q,2H,J=7.0Hz),4.04(t,2H,J=6.5Hz),1.74-1.71(m,6H),1.41(t,3H,J=7.0Hz),1.34-1.30(m,16H),0.90-0.84(m,3H)
13)目標化合物23a之合成
將化合物22a(27mg、0.059mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加2N氫氧化鈉(2.0mL)，於室溫下攪拌5小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(20mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：2)，而獲得黃色固體狀之化合物16a(13mg、53%)。進而進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得黃色針狀結晶之化合物23a(8.0mg、32%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.90(d,1H,J=0.5Hz),7.60(s,1H),7.26(s,1H),7.19(s,1H),7.08(d,1H,J=0.5Hz),6.98(s,1H),3.90(s,3H),1.76-1.70(m,4H),1.36(s,6H),1.30(s,6H)
14)目標化合物23b之合成
將化合物22b(42mg、0.088mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加2N氫氧化鈉(2.0mL)，於室溫下攪拌10小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30 mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(25mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：4)，而獲得黃色固體狀之化合物23b(15mg、38%)。進而進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得黃色粉末狀結晶之化合物23b(7.0mg、18%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.90(s,1H),7.68(s,1H),7.61(s,1H),7.20(s,1H),7.8(s,1H),6.97(s,1H),4.03(t,2H,J=6.5Hz),1.80-1.69(m,6H),1.34(s,6H),1.30(s,6H),0.94(t,3H,J=7.5Hz)
15)目標化合物23c之合成
將化合物22c(27mg、0.053mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加2N氫氧化鈉(2.0mL)，於室溫下攪拌6小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至水(50mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(25mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：2)，而獲得黃色固體狀之化合物23c(20mg、77%)。進而進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得黃色粉末狀結晶之化合物23c(17mg、66%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 12.23(brs,1H),8.91(d,1H,J=0.5Hz),7.71(s,1H),7.61(s,1H),7.20(s,1H),7.08(d,1H,J=0.5Hz),6.97(s,1H),4.06(t,2H,J=6.5Hz),1.74-1.70(m,6H),1.33？1.27(m,16H),0.86(t,3H,J=7.0Hz)
[實施例3]目標化合物30之合成
於本實施例中之目標化合物30之合成方法如下。
1)化合物25之合成
將瑞香草酚(150mg、1.0mmol)溶解於甲醇(4mL)，添加硫酸銀(370mg、1.2mmol)、碘(300mg、1.2mmol)，於室溫下攪拌6小時。利用(乙酸乙酯：正己烷=1：10)確認反應結束後傾入至飽和硫代硫酸鈉水溶液(30mL)中，進行矽藻土過濾，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(270mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：50→1：30)，而獲得黃色固體狀之化合物25(230mg、85%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.53(s,1H),6.67(s,1H),4.68(s,3H),3.10(sep,1H,J=7.0Hz),2.33(s,3H),1.22(d,6H,J=7.0Hz)
2)化合物26之合成
將化合物25(230mg、0.85mmol)溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(4.0mL)，添加碳酸鉀(150mg、1.1mmol)、2-溴丙烷(94μL、1.1mmol)、碘化鉀(14mg、0.085mmol)，於氬氣環境中於60℃下攪拌4小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：10)確認反應結束後，傾入至水(80mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(210mg)。進行快速層析(正己烷)，而獲得無色油狀之化合物26(190mg、69%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 7.53(s,1H),6.74(s,1H),4.51(sep,1H,J=6.0Hz),3.20(sep,1H,J=7.0Hz),2.37(s,3H),1.32(d,6H,J=6.0Hz),1.16(d,6H,J=7.0Hz)
3)化合物27之合成
將化合物26(190mg、0.59mmol)溶解於無水四氫呋喃(1.8mL)，一面於-78℃下冷卻一面滴加正丁基鋰(1.55M正己烷溶液、0.45mL、0.70mmol)。於-78℃下攪拌20分鐘後，滴加已溶解於無水四氫呋喃(0.5mL)之硼酸三異丙酯(0.41mL、1.8mmol)，於-78℃下攪拌2小時。添加2N鹽酸(5mL)，於室溫下攪拌1小時後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(90mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：10→1：5)，而獲得白色固體狀之化合物27(79mg、57%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.15(s,1H),6.73(s,1H),4.68(sep,1H,J=6.0Hz),3.32(sep,1H,J=7.0Hz),2.82(s,3H),1.38(d,6H,J=6.0Hz),1.25(d,6H,J=7.0Hz)
4)化合物28之合成
將化合物3b(110mg、0.28mmol)、化合物27(79mg、0.33mmol)溶解於甲苯(1.2mL)、乙醇(0.6mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(16mg、0.014mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.30mL)，於100℃下攪拌12小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(50mL)、水(50mL)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(150mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：20→1：10)，而獲得無色油狀之化合物28(1200mg、82%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.43(s,1H),7.71(s,1H),7.39-7.24(m,10H),6.98(s,1H),6.73(s,1H),6.59(s,1H),5.15(s,2H),5.08(s,2H),4.58(sep,1H,J=6.0Hz),3.30(sep,1H,J=7.0Hz),2.11(s,3H),1.37(d,6H,J=6.0Hz),1.20(d,6H,J=7.0Hz)
5)化合物29之合成
將化合物28(120mg、0.23mmol)溶解於乙酸乙酯(6.0mL)，添加10%活化鈀碳(觸媒量)，於氫氣環境中於室溫下攪拌4小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，對反應液進行矽藻土過濾後，蒸餾去除溶劑，而獲得無色油狀之粗生成物。使所獲得之粗生成物溶解於蒸餾乙醇(2.0mL)，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(100μL、0.68mmol)，於氬氣環境中進行11小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(61mg)。進行快速管柱層析 (乙酸乙酯：正己烷=1：4→1：3)，而獲得黃色固體狀之化合物29(41mg、42%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.51(s,1H),7.37(s,1H),7.00(s,1H),6.96(s,1H),6.82(s,1H),5.63(s,1H),4.63(sep,1H,J=6.0Hz),4.41(q,2H,J=7.0Hz),3.30(sep,1H,J=7.0Hz),2.11(s,3H),1.43-1.38(m,9H),1.20(d,6H,J=7.0Hz
6)目標化合物30之合成
將化合物29(41mg、0.096mmol)溶解於甲醇(4.0mL)，添加2N氫氧化鈉(2.0mL)，於室溫下攪拌3小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用2N鹽酸調節為酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(47mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：1)，而獲得黃色固體狀之化合物23(37mg、97%)。進而進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得黃色粉末狀結晶之化合物30(28mg、74%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.86(d,1H,J=0.5Hz),7.50(s,1H),7.07(d,1H,J=0.5Hz),6.99(s,1H),6.83(s,1H),5.86(s,1H),4.63(sep,1H,J=6.0Hz),3.31(sep,1H,J=7.0Hz),2.10(s,3H),1.40(d,6H,J=6.0Hz),1.20(d,6H,J=7.0Hz)
[實施例4]目標化合物36之合成
於本實施例中之目標化合物36之合成方法如下。
1)化合物32之合成
將異香草精(300mg、2.0mmol)溶解於乙酸乙酯(5.0mL)，添加濃硝酸(380μL、5.0mmol)，於室溫下攪拌2小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(100mL)加以稀釋，利用飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)、水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(370mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：2→2：3)，而獲得黃色固體狀之化合物32(100mg、26%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.42(s,1H),7.66(s,1H),7.47(s,1H),6.20(s,1H),4.8(s,3H)
2)化合物33之合成
將化合物32(42mg、0.21mmol)溶解於無水二氯甲烷(1.0mL)，添加三氟甲磺酸酐(39μL、0.23mmol)、無水吡啶(100μL)，於室溫下攪拌13小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至2N鹽酸(20mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)進行萃取。利用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)清洗 有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(59mg)。進行矽石過濾，而獲得黃色固體狀之化合物33(58mg、82%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.33(s,1H),7.89(s,1H),7.74(s,1H),4.13(s,1H)
3)化合物34之合成
將化合物33(150mg、0.45mmol)、化合物7b(180mg、0.54mmol)溶解於甲苯(2.0mL)、乙醇(1.0mL)，添加四(三苯基膦)鈀(0)(26mg、0.022mmol)、2N碳酸鈉水溶液(0.45mL)，於100℃下攪拌3小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：4)確認反應結束後，利用乙酸乙酯(150mL)進行稀釋，利用飽和氯化銨水溶液(100mL)、水(100mL)、飽和食鹽水(100mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(150mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：25)，而獲得黃色固體狀之化合物34(140mg、80%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.40(s,1H),7.84(s,1H),7.61(s,1H),7.18(s,1H),7.4(s,2H),3.95(s,3H),2.07(s,3H),1.70(s,4H),1.32(s,6H),1.27(s,6H)
4)化合物35之合成
將化合物34(30mg、0.079mmol)溶解於甲醇(6.0mL)，添加10%活化鈀碳(觸媒量)，於氫氣環境中於室溫下攪拌30分鐘。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：4)確認反應結束後，對反應液進行矽藻土過濾後，蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物。使所獲得之粗生成物溶解於蒸餾乙醇(1.0mL)，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(120mL、0.79mmol)，於氬氣環境中進行30小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=2：1)確認反應結束後，傾入至水(60mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50 mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(100mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=3：1→5：1→1：0)，而獲得黃色油狀之化合物35(12mg,34%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 12.24(brs,1H),8.56(s,1H),7.44(s,1H),7.17(s,1H),7.10(s,1H),6.97(s,1H),4.42(q,2H,J=7.0Hz),3.94(s,3H),2.08(s,3H),1.71(s,4H),1.42(t,3H,J=7.0Hz),1.33(s,6H),1.28(s,6H)
5)目標化合物36之合成
將化合物35(12mg、0.027mmol)溶解於無水二氯甲烷(1.0mL)，於0℃下添加三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液，14滴)，於室溫下攪拌22小時。傾入至水(30mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)進行萃取。利用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色固體粗生成物(21mg)。進行再結晶(乙酸乙酯：正己烷)，而獲得淡褐色粉末狀結晶之化合物36(5.1mg、45%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 12.14(brs,1H),8.94(s,1H),7.60(s,1H),7.19(s,1H),7.09(s,1H),6.98(s,1H),3.96(s,3H),2.08(s,3H),1.72(s,4H),1.33(s,6H),1.28(s,6H)
[實施例5]目標化合物40之合成
於本實施例中之目標化合物40之合成方法如下。
1)化合物38之合成
對化合物37(110mg、0.23mmol)、三丁基乙烯基錫(130μL、0.46mmol)、三亞苄基丙酮二鈀(11mg、0.012mmol)、三苯基膦(13mg、0.048mmol)添加無水甲苯(2.0mL)，於氬氣環境中進行18小時之加熱回流。利用HPLC(水：甲醇=10：90，添加有0.1%甲酸)確認反應結束。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：20)，而獲得褐色油狀之化合物38(84mg、93%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.86(dd,1H,J=2.5,0.5Hz),7.79(dd,1H,J=9.0,2.5Hz),7.53(s,1H),6.57-6.50(m,2H),5.99(d,1H,J=9.0Hz),5.63(dd,1H,J=17.5,1.0Hz),5.10(dd,1H,J=11.0,1.0Hz),4.20-4.15(m,1H),3.85(s,3H),3.83-3.76(m,1H),3.67(d,2H,J=6.5Hz),3.35(sep,1H,J=7.0Hz),2.11(sep,1H,J=6.5Hz),1.29(t,6H,J=6.5Hz),1.24(t,3H,J=7.0Hz),1.05(d,6H,J=6.5Hz)
2)化合物39之合成
對化合物38(50mg、0.13mmol)、6-溴喹啉(35μL、0.26mmol)、二氯雙(三苯基膦)鈀(2.7mg、0.0038mmol)、碳酸鉀(54mg、0.39mmol)添加無水N,N-二甲基甲醯胺(1.0mL)，於氬氣環境中於100℃下攪拌48小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，傾入至水(50mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)進行萃取。利用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)清洗有機層。利 用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(71mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：4)，而獲得褐色油狀之化合物39(43mg、65%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.92(dd,1H,J=2.5,0.5Hz),8.83(dd,1H,J=4.5,2.0Hz),8.09(dd,1H,J=8.5,1.0Hz),8.00(d,1H,J=9.0Hz),7.82(dd,1H,J=9.0,2.5Hz),7.77(dd,1H,J=9.0,2.0Hz),7.71(d,1H,J=16.5Hz),7.08(d,1H,J=16.5Hz),6.60(s,1H),6.10(d,1H,J=9.0Hz),4.30-4.21(m,1H),3.88-3.82(m,4H),3.70(d,2H,J=6.5Hz),3.40(sep,1H,J=7.0Hz),2.14(sep,1HJ=6.5Hz),1.35(d,6H,J=5.0Hz),1.29(t,3H,J=7.0Hz),1.07(d,6H,J=6.5Hz)
3)化合物40之合成
將化合物39(50mg、0.095mmol)溶解於甲醇(2.0mL)、四氫呋喃(1.0mL)，添加已溶解於水(1.0mL)之氫氧化鋰水合物(80mg、1.9mmol)，於室溫下攪拌46小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(40mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)進行萃取。利用水(30mL×2)、飽和食鹽水(30mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體狀之化合物40(46mg)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 9.03(dd,1H,J=2.5,0.5Hz),8.86(dd,1H,J=4.5,1.5Hz),8.13(dd,1H,J=8.5,1.0Hz),8.08(d,1H,J=9.0Hz),7.89(dd,1H,J=9.0,2.5Hz),7.79(dd,1H,J=9.0,2.0Hz),7.72(d,1H,J=2.0Hz),7.70(s,1H),7.39(dd,1H,J=8.5,4.5Hz),7.18(d,1H,J=16.5Hz),7.08(d,1H,J=16.5Hz),6.62(s,1H),6.12(d,1H,J=9.0Hz),4.27-4.25(m,1H),3.93-3.89(m,1H),3.72(d,2H,J=6.5Hz),3.41(sep,1H,J=7.0Hz),2.14(sep,1HJ=6.5Hz),1.36(d,6H,J=6.5Hz),1.30(t,3H,J=7.0Hz),1.07(d,6H,J=6.5Hz)
[實施例6]目標化合物44之合成
於本實施例中之目標化合物44之合成方法如下。
1)化合物42之合成
將丹磺醯氯(100mg、0.37mmol)懸浮於無水二氯甲烷(1.0mL)中，添加二異丙基乙基胺(70mL、0.40mmol)、4-胺基苯乙烯(40mL、0.34mmol)，於氬氣環境中於室溫下攪拌24小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(80mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(40mL×2)、飽和食鹽水(40mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(150mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：10→1：4)，而獲得黃色固體狀之化合物42(100mg、83%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.49(dt,1H,J=8.5,1.0Hz),8.32(d,1H,J=8.5Hz),8.16(dd,1H,J=7.5,1.5Hz),7.59(dd,1H,J=8.5,7.5Hz),7.43(dd,1H,J=8.5,7.5Hz),7.19-7.17(m,3H),6.88(d,2H,J=6.67(s,1H),6.67(s,1H),6.55(dd,1H,J=17.5,11.0Hz),5.59(dd,1H,J=17.5,1.0Hz),5.15(dd,1H,J=11.0,1.0Hz),2.88(s,6H)
2)化合物43之合成
將化合物42(44mg、0.12mmol)、化合物37(60mg、0.12mmol)、乙酸鈀(2.0mg、0.0089mmol)、三甲苯基膦(6.0mg、0.020mmol)、三乙基胺(84μL、0.61mmol)添加無水乙腈(1.0mL)，於氬氣環境中進行27小時之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：10→1：5)，而獲得黃色油狀之化合物43(16mg、18%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.86(s,1H),8.47(d,1H,J=8.5Hz),8.35-8.32(m,1H),8.17(dd,1H,J=7.5,1.0Hz),7.77(dd,1H,J=9.0,1.5Hz),7.54-7.51(m,2H),7.41(dd,1H,J=8.5,7.5Hz),7.15(d,2H,J=7.5Hz),7.10(d,2H,J=8.5Hz),6.87-6.82(m,3H),6.74(d,1H,J=16.3Hz),6.53(s,1H),6.01(d,1H,J=9.0Hz),4.20-4.13(m,1H),3.85(s,3H),3.80-3.72(m,1H),3.66(d,2H,J=6.0Hz),3.35(sep,1H,J=7.0Hz),2.85(s,6H),2.11(sep,1H,J=6.5Hz),1.31-1.26(m,6H),1.21(t,3H,J=7.0Hz),1.04(d,6H,J=6.5Hz)
3)目標化合物44之合成
將化合物43(16mg、0.022mmol)溶解於甲醇(5.0mL)，添加2N氫氧化鈉水溶液(0.5mL)，於65℃下攪拌1小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，進行快速層析(甲醇：二氯甲烷=1：40)，而獲得黃色固體狀之化合物44(6mg、39%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 8.92(d,1H,J=2.25Hz),8.47(dd,1H,J=8.5,1.0Hz),8.31(d,1H,J8.5Hz),8.15(dd,1H,J=7.5,1.5Hz),7.79(dd,1H,J=9.0,2.25Hz),7.56-7.54(m,2H),7.41(dd,1H,J=8.5,7.5Hz),7.16(d,1H,J=7.5Hz),7.10(d,2H,J=8.5Hz),6.99(s,1H),6.85-6.82(m,3H),6.73(d,1H,J=16.5Hz),6.54(s,1H),6.02(d,1H,J=9.0Hz),4.22-4.15(m,1H),3.81-3.77(m,1H),3.67(d,2H,J=6.5Hz),3.35(sep,1H,J=7.0Hz),2.85(s,6H),2.11(sep,1H,J=6.5Hz), 1.29-1.23(m,9H),1.05(d,6H,J=7.0Hz)
[實施例7]目標化合物48之合成
於本實施例中之目標化合物48之合成方法如下。
1)化合物46之合成
將化合物45(340mg、1.0mmol)溶解於乙酸酐(5.0mL)、四氫呋喃(5.0mL)，於冰浴冷卻下滴加已溶解於乙酸酐(0.6mL)之濃硝酸(210μL、3.0mmol)，於室溫下攪拌22小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，利用5N氫氧化鈉水溶液調節為鹼性，於室溫下攪拌30分鐘，而後傾入至冰水(150mL)中，經2N鹽酸中和後，利用乙酸乙酯(100mL×3)進行萃取。利用水(150mL×2)、飽和食鹽水(150mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(390mg)。將該黃色固體粗生成物溶解於無水N,N-二甲基甲醯胺(5.0mL)，於冰浴冷卻下添加三乙基胺(210μL、1.5mmol)、氯甲基甲醚(110μL、1.5mmol)，於氬氣環境中於0℃下攪拌1小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至冰水(100mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×3)進行萃取。利用 水(100mL×2)、飽和食鹽水(100mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(500mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：8)，而獲得淡黃色油狀之化合物46(400mg、93%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 8.87(d,1H,J=2.0Hz),8.03(s,1H),7.95(dd,1H,J=9.0,2.5Hz),6.67(s,1H),6.22(d,1H,J=9.0Hz),5.44(s,2H),4.61(sep,1H,J=6.0Hz),4.34-4.22(m,1H),3.86-3.59(m,1H),3.52(s,3H),3.33(sep,1H,J=7.0Hz),1.39(d,6H,J=6.0Hz),1.28-1.26(m,9H)
2)化合物47之合成
將化合物46(400mg、0.92mmol)溶解於乙酸乙酯(15mL)，添加10%活化鈀碳(觸媒量)，於氫氣環境中於室溫下攪拌20小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後進行矽藻土過濾並蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(340mg)。將該粗生成物(26mg、0.06mmol)、7-(二乙基胺基)香豆素-3-羧酸(16mg、0.06mmol)溶解於無水二氯甲烷(0.5mL)、二異丙基乙基胺(20μL、0.11mmol)，添加1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(17mg、0.09mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(14mg、0.09mmol)，於氬氣環境中於室溫下攪拌20小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：2)確認反應結束後，傾入至水(30mL)中，利用乙酸乙酯(15mL×3)進行萃取。利用水(20mL×2)、飽和食鹽水(20mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(49mg)。進行快速層析(乙酸乙酯：正己烷=1：4→1：2)，而獲得黃色固體狀之化合物47(42mg、93%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 10.93(s,6H),8.96(dd,1H,J=2.5,0.5Hz),8.71(s,1H),8.55(s,1H),7.86(dd,1H,J=9.0,2.5Hz),7.40(d,1H,J=9.0Hz),6.65(s, 1H),6.63(dd,1H,J=9.0,2.35Hz),6.43(d,1H,J=2.35Hz),6.16(d,1H,J=9.0Hz),5.42(s,2H),4.45(sep,1H,J=6.0Hz),4.35-4.29(m,1H),3.89-3.83(m,1H),3.51(s,3H),3.43(q,4H,J=7.0Hz),3.36(sep,1H,J=7.0Hz),1.34-1.27(m,15H),1.22(t,6H,J=7.0Hz)
3)目標化合物48之合成
將化合物47(41mg、0.064mmol)溶解於乙酸乙酯(2mL)，於冰浴冷卻下添加4N鹽酸乙酸乙酯(2mL)，於0℃下攪拌50分鐘。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，蒸餾去除溶劑，進行再結晶(二氯甲烷：正己烷)，而獲得黃色針狀結晶之化合物48(32mg、°84%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 10.96(s,1H),8.67(s,1H),8.48(s,1H),8.40-8.38(m,2H),7.57(d,1H,J=9.0Hz),7.06-7.03(m,2H),6.85(dd,1H,J=9.0,2.3Hz),6.56(d,1H,J=2.3Hz),4.63(sep,1H,J=6.0Hz),4.19-4.09(m,1H),4.02-3.93(m,1H),3.53(q,4H,J=7.0Hz),3.41(sep,1H,J=7.0Hz),1.38-1.34(m,9H),1.30(d,6H,J=7.0Hz),1.23(t,6H,J=7.0Hz)
[實施例8]目標化合物62之合成
於本實施例中之目標化合物62之合成方法如下。
1)化合物57之合成
將1,3-苯二酚(1.1g、10mmol)溶解於無水DMF(10mL)，添加N,N-二異丙基乙基胺(5.2mL、30mmol)、氯甲基甲醚(2.3mL、30mmol)，於室溫下攪拌168小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，傾入至飽和氯化銨水溶液(100mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×3)進行萃取。利用水(80mL×2)、飽和食鹽水(80mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色油狀之粗生成物(3.14g)。進行快速管柱層析(正己烷)，而獲得無色油狀之化合物57(1.28g、65%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)7.19(t,1H,J=8.2Hz),6.74(d,1H,J=2.2Hz),6.70(dd,2H,J=8.2,2.2Hz),5.16(s,4H),3.48(s,6H)
2)化合物58之合成
將化合物57(297mg、1.5mmol)溶解於二乙醚1.5mL，於0℃下添加 1.6M之正丁基鋰/己烷溶液(1.125mL、1.8mmol)，於室溫下攪拌3小時。其後，於0℃下添加硼酸三甲酯(250μL、2.25mmol)，於室溫下攪拌1小時。其後，於0℃下添加2N鹽酸水溶液而實現酸性化，於室溫下攪拌1小時。使用水抽吸過濾所析出結晶，而獲得淡黃色結晶之化合物58(177mg、49%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)7.36(t,1H,J=8.3Hz),7.23(s,2H),6.88(d,2H,J=8.3Hz),5.30(s,4H),3.51(s,6H)
3)化合物59之合成
對化合物6(113mg、0.4mmol)、化合物58(145mg、0.6mmol)、四(三苯基膦)鈀(69mg、0.06mmol)、磷酸鉀(255mg、1.2mmol)添加二甲氧基乙烷(4mL)、水(1.3mL)，進行30分鐘之加熱回流。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：3)確認反應結束後，傾入至水(30mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得褐色之粗生成物(263mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：30)，而獲得白色固體狀之化合物59(124mg、78%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)7.24(t,1H,J=8.4Hz),7.13(s,1H),7.05(s,1H),6.89(d,2H,J=8.4Hz),5.04(d,2H,J=6.6Hz),4.96(d,2H,J=6.6Hz),3.27(s,6H),2.07(s,3H),1.68(s,4H),1.55(s,3H),1.30(s,6H),1.23(s,6H)
4)化合物60之合成
將化合物59(108mg、0.27mmol)溶解於乙酸乙酯(2mL)，添加4N鹽酸/乙酸乙酯溶液(2mL)，於室溫下攪拌3小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，傾入至水(30mL)中，添加乙酸乙酯(30mL)，利用水(30mL)、飽和食鹽水(30mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色固體粗生成物(88mg)。進行快速管柱層析(乙 酸乙酯：正己烷=1：8)，而獲得淡黃色固體狀之化合物60(46mg、54%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)7.31(s,1H),7.17(t,1H,J=8.1Hz),6.60(d,2H,J=8.1Hz),4.67(s,2H),2.10(s,3H),1.71(s,4H),1.33(s,6H),1.25(s,6H)
5)化合物61之合成
將N,N-二甲基甲醯胺(350μL)於0℃下添加磷醯氯(100μL)，攪拌1.5小時。而後滴加已溶解於N,N-二甲基甲醯胺(1.5mL)之化合物60(40mg、0.13mmol)，於室溫下攪拌48小時。利用TLC板(乙酸乙酯：正己烷=1：5)確認反應結束後，傾入至冰水(30mL)中，利用飽和碳酸氫鈉水溶液將pH值調整為2-3，利用乙酸乙酯(50mL×2)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)清洗有機層。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得黃色油狀之粗生成物(60mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷=1：8)，而獲得淡黃色固體狀之化合物61(17mg、39%)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)11.71(s,1H),9.76(s,1H),7.48(d,1H,J=8.5Hz),7.29(s,1H),7.11(s,1H),6.69(d,1H,J=8.5Hz),5.61(s,1H),2.11(s,3H),1.70(s,4H),1.32(d,6H,J=5.3Hz),1.26(d,6H,J=5.3Hz)
6)目標化合物62之合成
將化合物61(17mg、0.05mmol)、2,2-二甲基-1,3-二口咢烷-4,6-二酮(7.2mg、0.05mmol)、哌啶(50μL)、乙醇(1mL)加以混合，進行30分鐘之加熱回流。利用TL11C板(乙酸乙酯：正己烷=1：1)確認反應結束後，傾入至水(30mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×2)進行清洗，利用2N鹽酸水溶液使水層酸性化，利用乙酸乙酯(50mL×2)進行萃取。利用水(50mL×2)、飽和食鹽水(50mL)進行清洗。利用硫酸鎂乾燥所獲得之有機層後，於減壓下蒸餾去除溶劑，而獲得淡黃色固體粗生成物(29mg)。進行快速管柱層析(乙酸乙酯：正己烷1：3→1：0)，而獲得黃色固體狀之化合物62(14mg、69%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)8.92(s,1H),7.69(d,1H,J=8.6Hz),7.32(s,1H),7.16(d,1H,J=8.6Hz),7.10(s,1H),5.92(s,1H),2.06(s,3H),1.72(d,4H,J=8.6Hz),1.35(d,6H,J=16.4Hz),1.26(d,6H,16.4Hz)
[實施例9]RXR促效劑及RXR拮抗劑之活性檢測
針對所合成之各化合物，藉由螢光素酶報導基因分析以檢測對RXR之轉錄活化能力。
1)測定原理
核內受體大多為與轉錄調節相關之轉錄因子，因此作為測定其轉錄活性之方法而進行報導基因分析(reporter gene assay)。對COS-1細胞或HeLa細胞等細胞導入RXR受體蛋白質表現質粒及報導質粒。此時，若RXR促效性物質(配體)與受體結合，則依賴於配體而發生轉錄，開始產生位於下游之螢光素酶。藉由測定該螢光素酶活性而測定RXR促效劑活性。又，RXR拮抗劑活性係藉由測定對既有RXR促效劑之拮抗作用而進行檢測。又，導入分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)表現質粒，測定SEAP之活性，藉此進行轉形效率之修正。
2)宿主細胞之培養
使用達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)作為細胞之增殖培養基。首先，使4.75g之DMEM粉末溶解於500mL之超純水(利用Milli-Q(註冊商標)生成)，進行高壓加熱滅菌(121℃、20分鐘)後，恢復至室溫，於其中以成為10%(v/v)之方式添加滅活胎牛血清(FBS)，進而添加10mL之經高壓加熱滅菌之10%NaHCO3，其後，添加使0.292g之L-麩醯胺溶解於8mL之超純水並經過濾滅菌所得者而製備。
關於各細胞之繼代，去除100mm培養皿中所培養之細胞之培養上清液，藉由胰蛋白酶處理而回收細胞，經過1500rpm、3分鐘之離心分離後，添加增 殖培養基而使細胞分散，向100mm培養皿中添加分散有細胞之增殖培養基15mL，於37℃、5%CO2環境下培養。
轉形係使用EffecteneTMTransection Reagent(QIAGEN公司)而進行。RXR之陽性對照係使用LGD1069。該等係將溶於DMSO者作為貯備溶液，於分析板中進行計測。
3)轉錄活性之測定
(第1天)於60mm培養皿中播種增殖培養基5mL與COS-1細胞50×104cells，培養一晚。
(第2天)藉由使用EffecteneTMTransection Reagent(QIAGEN公司)之脂轉染法進行轉形。轉形時，使用受體蛋白質表現質粒1μg、報導質粒4μg、SEAP表現質粒1μg。
(第3天)16小時至18小時後，去除培養上清液，藉由胰蛋白酶處理而回收細胞，經過1500rpm、3分鐘之離心分離後，添加增殖培養基而使細胞分散，以成為20×104cells/well之方式種至96孔盤中。其後，以DMSO濃度成為1%之方式添加各化合物。
(第4天)24小時後，將25μL上清液用於SEAP測定，剩餘之細胞液用於螢光素酶活性測定。
SEAP測定係依據Methods in molecular biology,63,pp.49-60,1997/BD Great EscAPe SEAP User manual(BD bioscience)記載之方法而進行。
具體而言係藉由以下方法進行測定。對上述第4天之上清液25μL添加稀釋用緩衝液25μL後，於65℃下培養(incubate)30分鐘。其後恢復至室溫，添加分析用緩衝液(7μL)、10×MUP(0.3μL)、稀釋用緩衝液(2.7μL)，於暗處在室溫下反應60分鐘。其後，使用微孔板檢測儀(Infinite 200，TECAN公司製造)於激發波長360nm、螢光波長465nm下測定螢光強度。
前述分析用緩衝液係藉由以下方法製備。使L-高精胺酸(0.45g)與氯化鎂(0.02g)溶解於50mL之超純水(利用Milli-Q(註冊商標)生成)，添加二乙醇胺(21mL)。其後，使用鹽酸將pH值調整為9.8後，使用超純水以總量成為100mL之方式進行定容，將其於4℃下保存。
前述稀釋用緩衝液係藉由以下方法製備。使氯化鈉(4.38g)與Tris Base(2.42g)溶解於90mL之超純水(利用Milli-Q(註冊商標)生成)。其後，使用鹽酸將pH值調整為7.2而製作5倍濃度稀釋用緩衝液，將其於4℃下保存。於即將使用前將其稀釋5倍，藉此製作稀釋用緩衝液。
使4-甲基繖形酮基磷酸酯以成為25mM之方式溶解於超純水(利用Milli-Q(註冊商標)生成)並於-20℃下保存，將所獲得者作為10×MUP。
關於螢光素酶活性，使用NUNC公司製造之96孔盤並利用微孔盤檢測儀(Infinite 200，TECAN公司製造)測定發光基質(Steady-Glo(註冊商標)Luciferase Assay System，Promega公司製造)與反應產物之發光強度。
4)測定結果
上述測定結果如圖3A及圖3B所示。
將1μM作為陽性對照之貝瑟羅汀反應時之轉錄活性設為1，檢測相對活性，將所獲得之結果示於圖3A。其結果為化合物10、23a、23b、30確認具RXR促效劑之活性。又，含有作為RXR促效劑之NEt-TMN時添加化合物44之結果如圖3B所示。其結果為化合物44具RXR拮抗劑之活性。又，以相同之方式進行檢測時，化合物23c、49亦具RXR拮抗劑之活性。
[實施例10]所創化合物之螢光物性
檢測所合成之化合物於甲醇中、氯仿中之激發極大波長、螢光極大波長。檢測係利用日立F-4500型分光螢光光度計，使用四面透明石英池(光路長度1 cm)，於激發/螢光狹縫10nm、光電倍增管電壓700V下進行。將測定結果如表1所示。
[實施例11]化合物10於各種溶劑中之螢光強度
測定化合物10於水中、甲醇中、乙腈中、氯仿中、環己烷中時於激發波長340nm、螢光波長465nm下之螢光強度。測定係利用Tecan SPARK 10M，使用Greiner公司製造之96孔半量黑色孔盤，於激發/螢光頻帶寬度20nm下進行。將測定結果如圖4所示。測定結果為與於水中相比，化合物10於有機溶劑中時其螢光強度減弱。
[實施例12]化合物10結合RXR之檢測
測定具RXR蛋白質存在下螢光強度的緩衝液係為20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油。測定螢光強度係利用Tecan Infinite 200F，使用Greiner公司製造之384孔微量黑色孔盤，以激發波長360nm、螢光波長465nm、激發/螢光頻帶寬度35nm下進行檢測。每孔之樣品量設為20μL。RXRα蛋白質係使用Active Motif公司製造之100nM之配體結合域(LBD)(圖5A)或3μM之全長(full-length)RXRα(圖5B)。因需改變化合物10之濃度而製備溶液，於室溫下反應2小時，繪製相較於化合物10單獨存在時，化合物10螢光強度減弱量之曲線。又，亦於該處同樣地繪製加入10μM貝瑟羅汀後之化合物10螢光強度 減弱量之曲線。再者，各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。
其結果如圖5所示，於RXRα蛋白質之存在下，化合物10之螢光強度減弱；藉由加入貝瑟羅汀後而使化合物10之螢光強度恢復。將化合物10及RXRα蛋白質存在時之曲線減去加入貝瑟羅汀後之曲線，而得到因化合物10向RXRα蛋白質之特異性結合而引起之螢光強度變化之曲線。利用該特異性結合之曲線以最小平方法演算出化合物10對RXRα蛋白質之結合解離常數(Kd)為87nM。
[實施例13]利用化合物10結合RXR進行RXR配體與RXR結合能力之檢測
使用化合物10之RXR配體之RXR結合能力評價中之螢光強度測定之本實施例所使用之緩衝液成分為20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油。利用Tecan Infinite 200F儀器，使用Greiner公司製造之384孔微量黑色孔盤，於激發波長360nm、螢光波長465nm、激發/螢光頻帶寬度35nm下進行檢測。每孔之樣品量設為20μL。RXRα蛋白質(配體結合域(LBD))係以100nM使用Active Motif公司製造者，10係以100nM使用，受試物質為使用RXR之促效劑貝瑟羅汀與CBTF-PMN；RXR之拮抗劑PA452以及具有RXR促效性之環境激素的三丁基氯化錫。將溶液製備後，於室溫下反應2小時，測定螢光強度，繪製曲線。再者，各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。
其結果如圖6所示，各RXR配體均濃度依賴地使化合物10之螢光強度得以恢復。
根據圖6之各曲線，利用最小平方法而求出EC50值，再利用Cheng-Prusoff式(Ki=EC50/(1+([化合物10濃度]/Kd)))而求出結合抑制常數(Ki)。將結果如下列表2所示。
[實施例14]化合物44結合RXR之檢測
測定具RXR蛋白質存在下螢光強度的緩衝液係為20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油。利用Tecan SPARK 10M測定螢光強度，使用Thermofischer公司製造之384孔微量黑色孔盤，於激發波長330nm、螢光波長560nm、激發/螢光頻帶寬度20nm下進行。每孔之樣品量設為20μL。化合物44設為30nM，改變Active Motif公司製造之RXRα蛋白質(配體結合域(LBD))之濃度而製備溶液，於室溫下反應2小時，繪製螢光強度曲線。又，亦同樣地繪製將化合物44與1μM貝瑟羅汀共存時之RXRα蛋白質螢光強度之曲線。再者，各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。
其結果如圖7所示，化合物44之螢光強度隨著RXRα蛋白質之濃度上升而增大，化合物44與貝瑟羅汀共存時而螢光強度減小。
[實施例15]利用化合物44結合RXR進行RXR配體與RXR結合能力之檢測
檢測具RXR蛋白質存在下螢光強度的緩衝液係為20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油。利用Tecan SPARK 10M檢測螢光強度，使用Thermofischer公 司製造之384孔微量黑色孔盤，於激發波長330nm、螢光波長560nm、激發/螢光頻帶寬度20nm下進行。每孔之樣品量設為20μL。化合物44設為30nM、RXRα蛋白質(配體結合域(LBD))設為Active Motif公司製造者100nM、受試物質(貝瑟羅汀、NEt-3IB、NEt-SB)濃度設為1μM，依此製備溶液，於室溫下反應2小時後測定螢光強度。再者，各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。
其結果如圖8所示，當存在為RXR配體之貝瑟羅汀、NEt-3IB、NEt-SB時，化合物44之螢光強度減小，從而檢測出RXR配體與RXR之結合。
[實施例16]利用化合物10及螢光標記共活化劑複合結合RXR進行RXR配體與RXR結合能力之檢測
藉由測定螢光素標記共活化劑(輔因子肽，螢光素-PGC1a)之螢光偏光度，可檢測RXR對共活化劑之募集(recruit)，即RXR向活化型結構之改變。藉由使用化合物10與RXR結合與使用螢光素-PGC1a與RXR結合以測試活化能力加以組合(如圖2所示)，即能夠同時檢測受試物質對於RXR之結合能力與RXR活化能力。
化合物10之螢光強度測定及螢光素-PGC1a之螢光偏光度測定之緩衝液為20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油。使用Tecan Polarion檢測螢光強度，使用Greiner公司製造之384孔微量黑色孔盤，化合物10之螢光測定係於激發波長360nm、螢光波長465nm下進行，螢光素-PGC1a之螢光偏光度測定係於激發波長485nm、螢光波長535nm下進行。每孔之樣品量設為20μL。全長RXRα蛋白質濃度為3μM、化合物10濃度為3μM、螢光素-PGC1a濃度為30nM，作為受試物質之RXR促效劑貝瑟羅汀、RXR拮抗劑PA452之濃度分別為10μM。溶液製備後，於室溫下反應2小時，測定化合物10之螢光強度及螢光素-PGC1a之螢 光偏光度。再者，各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。
請參閱圖9A，各RXR配體均使化合物10之螢光強度得以恢復。另一方面，請參閱圖9B，螢光素-PGC1a之螢光偏光度於作為RXR促效劑之貝瑟羅汀之存在下上升，相反地，於作為RXR拮抗劑之PA452之存在下減小。再者，有意義差檢測係藉由單因素方差分析(one-way ANOVA)(Bonferroni法)進行(**：p<0.01)。
[實施例17]化合物10於小鼠經口投予時之血中移行性
對ICR小鼠(雄性，6週齡，每群組各5隻)以30mg/kg經口投予化合物10，於經口投予0.5小時、1小時、3小時及6小時後實施採血，測定血中濃度。血中濃度之測定係藉由如下實驗方法，使用所準備樣品而進行。對經絕食之6週齡雄性ICR小鼠實施經口投予，分別於投予後1小時、3小時及6小時後使各小鼠於醚麻醉下安樂死，其後採血。將所採集血液於4℃、4400g之條件下進行離心分離，採集100μL上清液。於該上清液中添加100μL之經冰浴冷卻之5mM乙酸銨水溶液(利用乙酸將pH值調整為5.0)，進而添加乙酸乙酯1mL後，利用Vortex(註冊商標)震盪混合30秒，分層後取其上清液800μL。於減壓下使溶劑蒸發，向其中添加100μL之HPLC用甲醇。取用其中之30μL，使用液相層析系統(SCL-10AD，島津製作所)及HPLC(Inertsil(註冊商標)，ODS-3管柱(4.6(i.d.)×250mm、5μm)，GL Sciences)，溶劑設為甲醇：水：乙酸=90：9：1(v/v)，於流速0.7mL/min、激發波長350nm、螢光波長450nm下進行測定。根據所得峰面積而定量出樣品量。
結果如圖10所示，於投予0.5小時後，化合物10於血中濃度達到約3μM。又，觀測到化合物10隨時間依賴性自血中消失。
[實施例18]小鼠經口投予低用量化合物10時之血中濃度測定
對ICR小鼠(雄性，6週齡，每群組各4-5隻)以10mg/kg、3mg/kg及1mg/kg經口投予化合物10，於經口投予1小時後實施採血，測定血中濃度。血中濃度之測定係藉由如下實驗方法，使用所準備樣品而進行。對經絕食之6週齡雄性ICR小鼠實施經口投予，1小時後使各小鼠於醚麻醉下安樂死，其後採血。將所採集血液於4℃、4400g之條件下進行離心分離，採集100μL上清液。於該上清液中添加100μL之經冰浴冷卻之5mM乙酸銨水溶液(利用乙酸將pH值調整為5.0)，進而添加乙酸乙酯1mL後，利用Vortex(註冊商標)震盪混合30秒，分層後取其上清液800μL。於減壓下使溶劑蒸發，向其中添加100μL之HPLC用甲醇。取用其中之30μL，使用液相層析系統(SCL-10AD，島津製作所)及HPLC(Inertsil(註冊商標)，ODS-3管柱(4.6(i.d.)×250mm、5μm)，GL Sciences)，溶劑設為甲醇：水：乙酸=90：9：1(v/v)，於流速0.7mL/min、激發波長350nm、螢光波長450nm下進行測定。根據所得峰面積而定量出樣品量。
其結果如圖11所示，即便於EC50附近之濃度時亦能夠進行血中濃度測定。
[實施例19]LPS刺激下之對NFκB轉錄活性之抑制活性試驗
將自Novus biologicals購入之NFκB/EAPorter RAW Cell Line調整為56×104cells/mL，以90μL/well種至96孔透明孔盤中(5×104cells/well)，於37℃、5% CO2之條件下培養。於次日以10μL/well添加受試物質之稀釋調整溶液與LPS(最終濃度1ng/mL)而使總量成為100μL/well，於37℃、5% CO2之條件下培養24小時後，將培養上清液25μL分注至96孔白色孔盤中，利用螢光讀板儀測定SEAP活性。藉由將添加受試物質及LPS之組別的SEAP活性對照僅添加LPS之組別的SEAP活性進行比較，以算出受試物質對NFκB轉錄活性之抑制活性。
結果如圖12所示。圖12中，斜線柱部分為將僅含有LPS時之SEAP活性設為100%以比對SEAP活性。空白柱部分為未添加LPS且未添加受試物質時之相對SEAP活性，黑柱部分為添加LPS且添加不同濃度之受試物質時之相對SEAP活性。如圖12所示，藉由添加作為被檢驗化合物之化合物10，SEAP活性受到抑制，表現出對NFkB之抑制活性。
[實施例20]化合物62結合之RXR之檢測
檢測化合物62於含有或不含有RXR蛋白質時之螢光強度。實驗時，使用由20mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸鹽(pH值7.5)、150mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫蘇糖醇、10%甘油所構成之溶液作為緩衝液，使用Greiner 公司製造之384孔微量黑色孔盤，每孔之樣品量為20μL，化合物62之最終濃度為10μM，RXRα-LBD濃度為100nM。各情形時用作化合物之溶解輔助劑之二甲基亞碸濃度均設為1%。螢光強度測定係使用Tecan Infinite 200F，於激發波長360nm、螢光波長465nm、激發/螢光頻帶寬度35nm下進行。
實驗結果如圖13所示，於RXRα蛋白質之存在下化合物62之螢光強度減弱，表示化合物62與RXR結合。

Claims (15)

  1. 一種視網酸X受體之螢光配體，其係下述式(1)至式(3)中之任一者： ；以及， 其中，於式(1)至式(3)中，R1為甲基、烷氧基或苯乙烯基；R2為羥基、烷氧基或烷基胺基；A為N或CH；B為NH或O；R3為異丙基或第三丁基；R4為異丙基或異丁基。
  2. 如請求項1所述之螢光配體，其為該式(1)。
  3. 如請求項1所述之螢光配體，其為該式(2)。
  4. 如請求項1所述之螢光配體，其為該式(3)。
  5. 一種視網酸X受體之螢光配體，其係以下式(4)或式(5)： ；以及， 其中，於式(4)及式(5)中，R5為異丙基或第三丁基；R6為異丙基或異丁基；W為NR7、C=CH2、C=NOH或C(OCH3)2；R7為烷基；X為N或CH；Y為N或CH；Z為CH=CH(反式)、NHCO、CONH、CH=CH-CO或CO-CH=CH；Fluorophore為包含芳香環之螢光團，且該芳香環與Z鍵結；於式(5)中，Z1為CH=CH(反式)、NHCO、CONH、CH=CH-CO或CO-CH=CH；Z2為CH=CH、NHCO、CONH、NHSO2、SO2NH、CH2NHCO或CH2NHSO2；環Q為苯環、吡啶環、噻吩環、萘環或喹啉環；Fluorophore為包含芳香環之螢光團，且該芳香環與Z2鍵結。
  6. 如請求項5所述之螢光配體，其為該式(4)。
  7. 如請求項5所述之螢光配體，其為該式(5)。
  8. 一種使用如請求項1至7中任一項所述之螢光配體之檢測方法，其係利用螢光配體結合視網酸X受體以檢測該檢測受試物質對於視網酸X受體之結合能力。
  9. 如請求項8所述之檢測方法，其中該螢光配體處於含有該受試物質之溶液中，藉由測定該螢光配體之螢光強度變化量，以檢測該受試物質對於視網酸X受體之結合能力。
  10. 一種使用如請求項1至7中任一項所述之螢光配體之檢測方法，其係利用視網酸X受體結合螢光配體與具有螢光團之輔因子肽併用，以檢測受試物質視網酸X受體之結合能力與活化能力。
  11. 一種檢測方法，其將核內受體之螢光配體與具有螢光團之核內受體輔因子肽併用以檢測受試物質對該核內受體之結合能力與活化能力。
  12. 如請求項11之檢測方法，其中該螢光配體之激發波長及螢光波長不與該輔因子肽之激發波長及螢光波長重合。
  13. 如請求項11或12中任一項所述之檢測方法，其中該螢光配體處於含有該受試物質之溶液中，藉由測定該配體之螢光強度變化量，以檢測該受試物質對於該核內受體之結合能力；同時藉由測定該核內受體輔因子肽之螢光偏光度，以檢測該受試物質對於該核內受體之活化能力。
  14. 一種試驗套組，其包含核內受體螢光配體及具有螢光團之核內受體輔因子肽而用以檢測受試物質對核內受體之結合能力與活化能力。
  15. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至7中任一項所述之螢光配體作為有效成分。
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