JP6852897B2 - 蛍光性を有するレチノイドｘ受容体結合性分子及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、蛍光性を有するレチノイドＸ受容体結合性分子に関する。また、当該結合性分子を用いたレチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能を評価する試験方法、当該結合性分子を含む評価物質の結合能と機能を評価するための試験キット、及び当該結合性分子を有効成分として含む医薬組成物に関する。
レキシノイド（rexinoid）とはレチノイドＸ受容体（retinoid X receptor: ＲＸＲ）に対し結合性を示す物質の総称である。すなわち、レキシノイドは、レチノイドＸ受容体結合性分子（ligand for retinoid X receptor）である。
レキシノイドの１つであるベキサロテン（bexarotene）（targretin（登録商標））は、ＲＸＲの活性化物質（作動薬）であり、米国において皮膚浸潤性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）に臨床応用されている（特許文献１）。また、bexaroteneはがんのみならず、糖尿病（非特許文献１）やアルツハイマー病（特許文献２、非特許文献２）、パーキンソン病（非特許文献３）への有効性も報告されている。その理由は、ＲＸＲが糖・脂質代謝を制御している他の核内受容体と協働するためであり、さらにＲＸＲと他の核内受容体とのヘテロ二量体の活性がレキシノイドにより制御されるためである。
また、天然のレキシノイドとしては、ＤＨＡやＥＰＡが知られる（非特許文献４）。これらは、記憶力の向上や、メタボリックシンドロームやがん悪液質の改善にも用いられ、それを含む食品は機能性食品としても応用されている。このように、ＲＸＲは非常に魅力的な創薬及び機能性食品のターゲットである。
ＲＸＲを標的とするリガンドの探索は放射性同位体（ＲＩ）標識リガンドを用いた結合試験や培養細胞を用いた転写活性化試験であるレポータージーンアッセイによる転写活性化試験によって行われている（非特許文献５）。また、キットとして市販されているＴＲ−ＦＲＥＴ法も知られている。以下、これらの既存のレキシノイド探索方法について説明する。
（ａ）レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイは、ＲＸＲを過剰発現させた細胞を用いて、試験化合物の転写活性化能を評価するものである。レポータージーンアッセイは試験物質の転写活性化能を調べるための最適試験法であるが、結果を得るまでに長時間（３〜４日）を要する。そのため、ＲＸＲに対する結合試験を一次スクリーニングとして行うことができれば、無駄なレポータージーンアッセイ試験を回避できる。
（ｂ）ＲＩ標識化合物を用いた結合試験
ＲＸＲに対する結合試験としては放射性同位体標識リガンドを用いた方法が知られる。この方法は、ＲＩ標識化合物と試験化合物のＲＸＲに対する競合的な結合から試験化合物の結合能を評価するものであり、高感度である。しかし、この方法を実施するには特別な施設が必要である。また、試験化合物に結合したＲＩ標識化合物と遊離したＲＩ標識化合物とを分離する必要があり、試験操作も煩雑である。さらに、この方法に用いられるラジオアイソトープ(ＲＩ)試薬（[3H]9-cisレチノイン酸）は非常に高価であり、使用にあたって特に日本においては法的な制約のもと煩雑な操作が必要とされる。
（ｃ）ＴＲ−ＦＲＥＴ法
ＴＲ−ＦＲＥＴ法は、テルビウム標識したＲＸＲと蛍光標識したコアクチベーターとのFRET現象を測定することで試験化合物のＲＸＲ活性化能を評価する方法である。市販されているキットを用いたＴＲ−ＦＲＥＴ法によるレキシノイド探索法によれば、試験化合物のアゴニスト活性を示唆するデータを短時間で得ることができる。しかしながら、ＴＲ−ＦＲＥＴ法に対応したプレートリーダーが必要であり、使用できるプレートリーダーには制限がある。
ＲＸＲは非常に魅力的な創薬ターゲットである一方で副作用の問題を有している。例えば、唯一臨床応用されているレキシノイドであるベキサロテンでは、血中脂質の上昇や甲状腺機能低下症、易感染などの重篤な副作用が問題となっている。そのためベキサロテンの使用時には血中濃度のモニタリングが推奨されている。血中濃度のモニタリングをするに際しては通常、血中から薬物を抽出し、ＨＰＬＣを用いて薬物の紫外線吸光度の強度を測定することで定量している。紫外線吸光を指標にしているため、感度が低い、生体由来の夾雑物の影響を受け得るなどの問題点がある。
ベキサロテンのようなＲＸＲアゴニストは、一般的に1,1,4,4-テトラメチルテトラリン構造からなる疎水性部位と安息香酸もしくはニコチン酸からなる酸性部位、そして疎水性部位と酸性部位を連結するリンカーから構成される。非特許文献６には、疎水性部位が蛍光性を示すカルボスチリル骨格であることによって蛍光性を有するＲＸＲアゴニストが記載されている。そして、そのアゴニストの蛍光偏光度を観測することによって、当該アゴニストのＲＸＲに対する結合能を測定できることが記載されている。しかしながら、非特許文献６記載のＲＸＲアゴニストは、蛍光強度が低く、さらにＲＸＲへの結合能も低いという問題を有していた。
非特許文献７には、蛍光団を有するコファクター部分ペプチドとＲＸＲを用いることによって、当該コファクター部分ペプチドのＲＸＲに対する結合能をその蛍光偏光度の変化によって測定する方法が記載されている。そして、この方法によれば、被評価物質のＲＸＲに対する作動性もしくは拮抗性を定性的に測定できることが記載されている。しかしながら、非特許文献７記載の方法では、蛍光団を有するコアクチベーターとコリプレッサーの２種類を用いなければ、被評価物質のＲＸＲに対する作動性もしくは拮抗性は調べることができなかった。そのため、実験に用いられるＲＸＲ量が多くなる上に、作業時間も長くなるという問題があった。
ＷＯ９３／２１１４６Ａ１ ＷＯ２０１３／０５６２３２Ａ２
Nature (1997), 386(6623), 407-410 Science (2012), 335(6075), 1503-1506 ACS Chem Neurosci. (2013), 4(11), 1430-1438 Mol Cell Proteomics. (2004), 3(7), 692-703 J. Med. Chem. (1994), 37, 2930-2941 Bioorg. Med. Chem. Lett. (2010), 20, 5143-5146 J. Med. Chem. (2013), 56, 1865-1877
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、蛍光性を有するＲＸＲ結合性分子を提供するものである。また、そのような結合性分子を用いてＲＸＲに対する評価物質の結合能を容易に評価する試験方法を提供するものである。さらに、そのような結合性分子を有効成分として含む、容易に血中濃度モニタリングを行える医薬組成物を提供するものである。
上記課題は、下記式（１）〜（３）のいずれかで示され、蛍光性を有するレチノイドＸ受容体結合性分子を提供することによって解決される。
Figure 0006852897
［式中、Ｒ１は、メチル、アルコキシ又はスチリルであり；
Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ又はアルキルアミノであり；
Ａは、Ｎ又はＣＨであり；
Ｂは、ＮＨ又はＯである。］
Figure 0006852897
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ及びＢは、式（１）と同じである。］
Figure 0006852897
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ及びＢは、式（１）と同じであり；
Ｒ３は、イソプロピル又はターシャリーブチルであり；
Ｒ４は、イソプロピル又はイソブチルである。］
また上記課題は、下記式（４）又は（５）で示され、蛍光性を有するレチノイドＸ受容体結合性分子を提供することによっても解決される。
Figure 0006852897
［式中、Ｒ５は、イソプロピル又はターシャリーブチルであり；
Ｒ６は、イソプロピル又はイソブチルであり；
Ｗは、ＮＲ７、Ｃ＝ＣＨ２、Ｃ＝ＮＯＨ又はＣ（ＯＣＨ３）２であり；
Ｒ７はアルキルであり；
Ｘは、Ｎ又はＣＨであり；
Ｙは、Ｎ又はＣＨであり；
ＺはＣＨ＝ＣＨ（トランス）、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ又はＣＯ−ＣＨ＝ＣＨであり；
Fluorophoreは芳香環を含む蛍光団であり、該芳香環がＺと結合する。］
Figure 0006852897
［式中、Ｒ５、Ｒ６、Ｗ、Ｒ７、Ｘ及びＹは、式（４）と同じであり；
Ｚ１はＣＨ＝ＣＨ（トランス）、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ又はＣＯ−ＣＨ＝ＣＨであり；
Ｚ２はＣＨ＝ＣＨ、ＮＨＣＯ、ＣＯＮＨ、ＮＨＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ、ＣＨ２ＮＨＣＯ又はＣＨ２ＮＨＳＯ２であり；
環Ｑは、ベンゼン環、ピリジン環、チオフェン環、ナフタレン環又はキノリン環であり；
Fluorophoreは芳香環を含む蛍光団であり、該芳香環がＺ２と結合する。］
好適な実施態様は、上記式（１）〜（５）のいずれかで示される結合性分子を用いて、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能を評価する試験方法である。このとき、前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子がレチノイドＸ受容体に結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能を評価することが好ましい。
他の好適な実施態様は、上記式（１）〜（５）のいずれかで示される結合性分子及び蛍光団を有するコファクターペプチドを共に用いる、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価する試験方法である。
上記課題は、蛍光性を有する核内受容体結合性分子及び蛍光団を有する核内受容体コファクターペプチドを共に用いる、当該核内受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価する試験方法を提供することによっても解決される。このとき、前記結合性分子の励起及び蛍光波長と、前記コファクターペプチドの励起及び蛍光波長とが重ならないことが好ましい。また、前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子が前記受容体に結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、前記受容体に対する評価物質の結合能を評価し、同時に、核内受容体コファクターペプチドの蛍光偏光度を測定することによって、前記受容体に対する評価物質の機能を評価することも好ましい。
上記課題は、蛍光性を有する核内受容体結合性分子及び蛍光団を有する核内受容体コファクターペプチドを含む、核内受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価するための試験キットを提供することによっても解決される。
また上記課題は、上記式（１）〜（５）のいずれかで示される結合性分子を有効成分として含む医薬組成物を提供することによっても解決される。
本発明のレチノイドＸ受容体結合性分子を用いることで、ＲＸＲに対する結合性の評価試験が容易に行え、ＲＸＲを標的とする医薬候補や機能性食品の探索に貢献できる。また、蛍光を指標にして、薬剤の血中濃度モニタリングを容易に行うこともできる。
試験物質のＲＸＲ結合能を評価する方法の原理を説明する図である。 試験物質のＲＸＲ結合能とＲＸＲ活性化能を同時に評価する方法の原理を説明する図である。 本発明の結合性分子のＲＸＲに対する転写活性化能を示す用量曲線である。 化合物１０の各種溶媒中での蛍光強度を示すグラフである。 蛍光強度測定による化合物１０のＲＸＲ結合のモニタリングに関するグラフである。 化合物１０を用いた試験物質のＲＸＲ結合能の用量曲線である。 化合物４４を用いた試験物質のＲＸＲ結合能の用量曲線である。 化合物４４を用いた試験物質のＲＸＲ結合能に関するグラフである。 化合物１０及び蛍光標識コアクチベーターを用いて、試験物質のＲＸＲ結合能とＲＸＲ活性化能を同時測定したグラフである。 化合物１０のマウス経口投与時の血中濃度を示すグラフである。 化合物１０の各投与量におけるマウス経口投与時の血中濃度を示すグラフである。 化合物１０添加時のＳＥＡＰ活性を示すグラフである。 ＲＸＲ存在時の化合物６２の蛍光強度を示すグラフである。
本発明のレチノイドＸ受容体結合性分子は、上記式（１）〜（５）のいずれかで示される。
本発明において、上記式（１）〜（５）で表される化合物は、さらに、薬学的に許容される塩であってもよい。また、上記式（１）〜（５）で表される化合物又はその塩において、異性体（例えば光学異性体、幾何異性体及び互換異性体）などが存在する場合は、本発明はそれらの異性体を包含し、また溶媒和物、水和物及び種々の形状の結晶を包含するものである。
本発明において、薬学的に許容される塩とは、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩が挙げられる。そのような塩として、具体的には以下が例示される。
塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；例えばＮ、Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアンモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
本明細書において用いる用語は、単独で又は他の用語と一緒になって以下の意義を有する。
「アルキル」は、炭素数１〜２０、好ましくは１〜１０個の直鎖状、分枝状又は環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル、n-デシル等が挙げられる。好ましくは、炭素数１〜６個のアルキルであり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、n-ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、tert-ペンチル、n-ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。炭素数１〜６個の低級アルキルが特に好ましい。
「アルケニル」は、上記「アルキル」に１個又はそれ以上の二重結合を有する炭素数２〜２０個、好ましくは２〜８個の直鎖状又は分枝状のアルケニルを意味し、例えば、ビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、1、3-ブタジエニル、3-メチル-2-ブテニル等が挙げられる。
「アルキニル」は、上記アルキルに１個又はそれ以上の三重結合を有する炭素数２〜２０個、好ましくは２〜１０個のアルキニルを意味し、例えば、エチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、3-ブチニル等が挙げられる。
「アルコキシ」とは、炭素数１〜２０の直鎖状または分枝（鎖）状のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクタデカノキシ基、アリルオキシ基などが挙げられる。炭素数１〜６個の直鎖状または分枝状の低級アルコキシが好ましい。
「アシル」とは、アルカノイルおよびアロイルなどを意味する。該アルカノイルとしては、例えば、炭素数１〜６個、好ましくは１〜４個のアルキルを有するアルカノイル（ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、ブチリルなど）が挙げられる。アロイルとしては、例えば、炭素数７〜１５個のアロイル、具体的には、例えばベンゾイル、ナフトイルなどが挙げられる。
上記式（４）及び（５）においてFluorophoreとして示される蛍光団の例としては、キノリン、キノリニウム、キサンテン、クマリン系色素、ダンシル、ピリジニウム、ベンゾフラザン系色素、フルオレセイン系色素（例えば、フルオレセイン，カルボキシナフトフルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、テトラブロモスルホンフルオレセイン等）、ローダミン系色素（例えば、ローダミン、カルボキシ−Ｘ−ローダミン、カルボキシローダミン、テトラエチルローダミン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、ローダミングリーン等）のほか、シアニン系色素（例えば、Cy7、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3その他のCy色素：GE Healthcare）、Alexa Fluor類（例えば、Alexa Fluor 790、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、 Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 405等：INVITROGEN）、VivoTag（例えば、VivoTag S750、VivoTag 680、VivoTag S680、：VisEn Medical）、Atto系色素（例えば、Atto 740、Atto 725、Atto 700、Atto 680、Atto 655、Atto 647、Atto 637、Atto 635、Atto 633、Atto 620、Atto 611X、Atto 610、Atto 594、Atto 590、Atto 565、Atto 550、Atto 532、Atto 520、Atto 495、Atto 488、Atto 465、Atto 425等：ATTO-TEC GmbH）、BODIPY系色素（例えば、BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY-530/550、BODIPY-FL-X、CAL Fluor系色素（例えば、CAL Fluor-Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635等）、カスケード（Cascade）ブルー、オレゴングリーン系色素（例えば，Oregon Green 488、Oregon Geen 500、Oregon Green 514等）ロードル（Rhodol）グリーン、テキサスレッド等が挙げられる。
上記式（１）〜（５）のいずれかで示されるＲＸＲ結合性分子を用いれば、ＲＸＲに対する評価物質の結合能を容易に評価することができる。具体的には、前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子がＲＸＲに結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、ＲＸＲに対する評価物質の結合能を評価することができる。これは、上記ＲＸＲ結合性分子の蛍光強度が、水中で遊離している場合に大きく、ＲＸＲに結合して疎水性の環境にある場合に小さいことを利用したものである（図４参照）。
図１に示されるように、本発明の蛍光性リガンドは、ＲＸＲと結合すると蛍光強度が小さくなるが、他のリガンドがＲＸＲに結合すると蛍光性リガンドは遊離して蛍光強度が大きくなる。これによって、他のリガンドのＲＸＲへの結合能力を測定することが可能である。
また、上記式（１）〜（５）のいずれかで示されるＲＸＲ結合性分子及び蛍光団を有するコファクターペプチドを共に用いる、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価する試験方法も好適に採用される。この方法によれば、評価物質のＲＸＲへの結合能とＲＸＲの活性化能を同時に評価することが可能である。
より具体的には、前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子がＲＸＲに結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、ＲＸＲに対する評価物質の結合能を評価し、同時に、ＲＸＲコファクターペプチドの蛍光偏光度を測定することによって、ＲＸＲに対する評価物質の機能を評価することができる。蛍光偏光度の測定は、ＲＸＲコファクターペプチドがＲＸＲに結合していれば蛍光偏光度が大きく、遊離していれば蛍光偏光度が小さいことを利用したものである。
図２に、ＲＸＲに結合すると蛍光強度が減少する蛍光性レキシノイドと、蛍光性コファクターとを併用した場合の模式図を示す。図２に示されるように、蛍光性アゴニストが結合したＲＸＲに蛍光標識コアクチベーターが結合している場合、蛍光アゴニストからの弱い蛍光が観察されるとともに、蛍光標識コアクチベーターからの高偏光度の蛍光が観察される。ここで、他のアゴニストがＲＸＲに結合すると、蛍光アゴニストからの強い蛍光が観察されるようになるとともに、蛍光標識コアクチベーターからの高偏光度の蛍光が観察される。また、他のアンタゴニストがＲＸＲに結合すると、蛍光アゴニストからの強い蛍光が観察されるようになるとともに、蛍光標識コアクチベーターからの低偏光度の蛍光が観察される。すなわち、蛍光標識コファクターとしてコアクチベーター（あるいはコリプレッサー）を使用するのみで、評価化合物がアゴニストであるかアンタゴニストであるかを判別することができる。
このとき、蛍光性ＲＸＲ結合性分子の励起及び蛍光波長と、前記コファクターペプチドの励起及び蛍光波長とが重ならないことが望ましい。これらの波長が重ならないことによって、精度よく測定することが可能である。また、上記試験方法に用いられるコファクターペプチドとしては、コアクチベーターペプチドとコレプレッサーペプチドのいずれを用いてもよい。また、コファクターペプチドとして、コファクター部分ペプチドを用いてもよい。
蛍光性を有するＲＸＲ結合性分子及び蛍光団を有するＲＸＲコファクターペプチドを含む、ＲＸＲに対する評価物質の結合能と機能を評価するための試験キットも有用である。
一方、上記式（１）〜（５）で表される化合物から選ばれる蛍光性レキシノイドの代わりに、対象としたい核内受容体に結合する蛍光性リガンドと蛍光団を有するコアクチベーターを組み合わせることで、ＲＸＲ以外の核内受容体について、試験化合物の当該核内受容体への結合能と当該核内受容体の活性化能を同時に評価することが可能である。すなわち、前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子が前記受容体に結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、前記受容体に対する評価物質の結合能を評価し、同時に、核内受容体コファクターペプチドの蛍光偏光度を測定することによって、前記受容体に対する評価物質の機能を評価することが可能である。
対象としたい核内受容体に結合する蛍光性リガンドと蛍光団を有するコアクチベーターを組み合わせる結合試験法においては、蛍光性リガンドの励起ならびに蛍光波長と、蛍光団を有するコアクチベーターの励起ならびに蛍光波長が重ならないことが望ましい。また、蛍光性を有する核内受容体結合性分子及び蛍光団を有する核内受容体コファクターペプチドを含む、核内受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価するための試験キットも好適な実施態様である。
本発明の化合物を有効成分とする医薬を用いる場合には、投与量は特に限定されない。本発明の化合物を併用してレチノイドの作用を調節する場合、あるいは、レチノイドを含む医薬を併用せずに、生体内に既に存在するレチノイン酸の作用調節のために本発明の薬剤を投与する場合など、あらゆる投与方法において適宜の投与量が容易に選択できる。例えば、経口投与の場合には有効成分を成人一日あたり０．０１〜１０００ｍｇ程度の範囲で用いることができる。レチノイドを有効成分として含む医薬と本発明の薬剤とを併用する場合には、レチノイドの投与期間中、及び／又はその前若しくは後の期間のいずれにおいても本発明の薬剤を投与することが可能である。
本発明の化合物を薬剤として用いる場合は、上記式（１）〜（５）で表される化合物から選ばれる１種又は２種以上をそのまま投与してもよいが、上記の化合物の１種又は２種以上を含む、経口用あるいは非経口用の医薬組成物として投与することが好ましい。経口用あるいは非経口用の医薬組成物は、当業者に利用可能な製剤用添加物、即ち薬理学的及び製剤学的に許容しうる担体を用いて製造することができる。例えば、炎症性呼吸器疾患に治療効果を示す医薬に上記式（１）〜（５）で表される化合物の１種又は２種以上を配合して、いわゆる合剤の形態の医薬組成物として用いることもできる。具体的には、吸入ステロイド薬、吸入長期間作用性β2刺激薬、ロイコトリエン受容体拮抗剤、経口ステロイド薬等と併用して用いることも出来る。
経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム剤、及び貼付剤等を挙げることができる。上記の医薬組成物の製造に用いられる薬理学的及び製剤学的に許容しうる担体としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができる。
以下、本発明の化合物の製造方法ならびに蛍光物性などを具体的に説明する。化合物の製造方法において用いられた出発原料及び試薬、並びに反応条件などを適宜修飾ないし改変することにより、本発明の範囲に包含される化合物はいずれも製造可能である。本発明の化合物の製造方法は、実施例に具体的に説明されたものに限定されるものではない。
［実施例１］目的化合物１０の合成
本実施例における目的化合物１０の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物２の合成
２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（３．３ｇ、２４ｍｍｏｌ）を酢酸（２４ｍＬ）に溶解し、臭素（１．２ｇ、２４ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下した後、２０時間室温撹拌した。その後、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）プレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３、２回展開）で反応の終了を確認した。水（３５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取し、水で洗浄し、粗結晶（５．３ｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４→１：３）、さらに再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、淡褐色針状結晶の２（１．５ｇ、２８％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 11.25 (s, 1H), 9.70 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 7.66 (s, 1H), 6.63 (s, 1H), 6.11 (s, 1H)
２）化合物３ａの合成
化合物２（２２０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（５２０μＬ、３．０ｍｍｏｌ）、クロロメチルメチルエーテル（３３０μＬ、４．３ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下、氷冷しながら加えた後、２７時間室温撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（６０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（６０ｍＬ×２）、飽和食塩水（６０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（３５０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）を行い、白色固体の３ａ（２８０ｍｇ、９２％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.29 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.01 (s, 1H), 5.32 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 3.53 (s, 6H)
３）化合物３ｂの合成
化合物２（２２０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（２．０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（４２０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド（３６０μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、６０℃で２０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、水（１００ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（４６０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０→１：３）を行い、白色固体の３ｂ（３９０ｍｇ、９９％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.31 (s, 1H), 8.05 (s,1H), 7.42-7.36 (m, 10H), 6.54 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.11 (s, 2H)
４）化合物６の合成
２，５-ジメチル-２，５-ヘキサンジオール（２．０ｇ、１４ｍｍｏｌ）を濃塩酸（２０ｍＬ）に溶解し、室温で１４時間撹拌した。固体をろ取し、水で洗浄した後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、白色固体の粗生成物（２．８ｇ）を得た。得た粗生成物と２-ブロモトルエン（３．３ｍＬ、２７ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、塩化アルミニウム（III）（１７０ｍｇ）を三回に分けて加え、アルゴン雰囲気下、室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（ｎ-ヘキサン）で反応の終了を確認し、反応液をｎ-ヘキサン（１５０ｍＬ）で薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（４．２ｇ）を得た。再結晶（メタノール）を行い、白色固体の６（３．０ｇ、７８％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.42 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.65 (s, 4H), 1.25 (s, 12H)
５）化合物７ａの合成
化合物６（５６０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（６．０ｍＬ）に溶解し、-７８℃で冷却しながらｎ-ブチルリチウム（１．５５M ｎ-ヘキサン溶液、１．６ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。-７８℃で２０分間撹拌した後、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解したホウ酸トリイソプロピル（１．４ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を滴下し、-７８℃で２時間撹拌した。２規定塩酸（１０ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、白色固体の粗生成物（４５０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）を行い、白色固体の７ａ（３６０ｍｇ、７３％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 2.81 (s, 3H), 1.72 (s, 4H), 1.34 (s, 6H), 1.32 (s, 6H)
６）化合物７ｂの合成
化合物６（１．６ｇ、５．８ｍｍｏｌ）、［１，１-ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウム（ＩＩ）ジクロリド ジクロロメタン付加物（１４０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１．７ｇ、１７ｍｍｏｌ）、ビスピナコラトジボロン（１．６ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を無水ジメチルスルホキシド（２０ｍＬ）に懸濁し、アルゴン雰囲気、マイクロウェーブ照射下、１５０℃で９０分間撹拌した。ＴＬＣプレート（ｎ-ヘキサン）で反応の終了を確認し、反応液をセライトろ過した。ろ液を酢酸エチルに薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色固体の粗生成物（２．３ｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝０：１→１：５０）を行い、黄色固体の７ｂ（１．２ｇ、６３％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.73 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 2.48 (s, 3H), 1.66 (s, 4H), 1.31 (s, 12H), 1.30 (s, 6H), 1.26 (s, 6H)
７）化合物８の合成
化合物３ａ（１５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、７ｂ（２００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）をトルエン（２．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（３０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．５ｍＬ）を加え、１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（２００ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：６）を行い、無色オイル状の８（１８０ｍｇ、８６％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.40 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.04 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.16 (s, 2H), 3.56 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.69 (s, 4H), 1.31 (s, 6H), 1.25 (s, 6H)
８）化合物９の合成
化合物８（１８ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（２００μＬ）を加え室温で１時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（１６ｍｇ）を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ、０．２０mmｏｌ）、マロン酸ジエチル（２２μＬ、０．１４ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、１４時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（１５ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）を行い、褐色固体の９（７．０ｍｇ、３９％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.51 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.75 (s, 1H), 4.41 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 2.11 (s, 3H), 1.72 (s, 4H), 1.40 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.33 (s, 6H), 1.27 (s, 6H)
９）目的化合物１０の合成
化合物９（２２ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム（１．０ｍＬ）を加え、室温で７時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（１８ｍｇ）を得た。再結晶（メタノール）を行い、黄色針状結晶の１０（１５ｍｇ、７４％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.70 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.03 (s, 1H), 6.85 (s, 1H), 2.05 (s, 3H), 1.65 (s, 4H), 1.27 (s, 6H), 1.22 (s, 6H)
［実施例２］目的化合物２３ａ-ｃの合成
本実施例における目的化合物２３ａ-ｃの合成スキームを以下に示す。
Figure 0006852897
１）化合物１８の合成
２，５-ジメチル-２，５-ヘキサンジオール（２．０ｇ、１４ｍｍｏｌ）を濃塩酸（２０ｍＬ）に溶解し、室温で１４時間撹拌した。固体をろ取し、水で洗浄した後、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）に溶解し、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、白色固体の粗生成物（２．４ｇ）を得た。得た粗生成物と２-ブロモフェノール（２．１ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解し、塩化アルミニウム（III）（１７０ｍｇ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０）で反応の終了を確認し、反応液を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色固体の粗生成物（４．４ｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝０：１→１：１０）、さらに再結晶（ｎ-ヘキサン）を行い、褐色粉末状の１８（２．４ｇ、６１％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.34 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 5.25 (s, 1H), 1.65 (s, 4H), 1.25 (s, 6H), 1.24 (s, 6H)
２）化合物１９ａの合成
化合物１８（２００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（オイル中で純度６０％、４４ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、ヨードメタン（６８μＬ、１．１ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（２２０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ｎ-ヘキサン）を行い、白色固体の１９ａ（２００ｍｇ、９７％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.42 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 3.87 (s, 3H), 1.66 (m, 4H), 1.28 (s, 6H), 1.24 (s, 6H)
３）化合物１９ｂの合成
化合物１８（４００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（オイル中で純度６０％、７０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）、１-ヨードプロパン（１７０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（４２０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ｎ-ヘキサン）を行い、無色オイル状の１９ｂ（３９０ｍｇ、８４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.41 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 3.96 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.89-1.80 (m, 2H), 1.67-1.64 (m, 4H), 1.26 (s, 6H), 1.24 (s, 6H), 1.07 (t, 3H, J = 7.5 Hz)
４）化合物１９ｃの合成
化合物１８（４００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（３．０ｍＬ）に溶解し、水素化ナトリウム（オイル中で純度６０％、７０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）、１-ブロモペンタン（２１０μＬ、１．７ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（４９０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ｎ-ヘキサン）を行い、黄色オイル状の１９ｃ（４３０ｍｇ、８８％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.41 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 3.98 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.86-1.79 (m, 2H), 1.67-1.64 (m, 4H), 1.50-1.46 (m, 2H), 1.41-1.37 (m, 2H), 1.26 (s, 6H), 1.24 (s, 6H), 0.94 (t, 3H, J = 7.0 Hz)
５）化合物２０ａの合成
化合物１９ａ（１７０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（２．０ｍＬ）に溶解し、-７８℃で冷却しながらｎ-ブチルリチウム（１．５５M ｎ-ヘキサン溶液、０．４１ｍＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を滴下した。-７８℃で２０分間撹拌した後、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解したホウ酸トリイソプロピル（０．４６ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を滴下し、-７８℃で２時間撹拌した。２規定塩酸（５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、白色固体の粗生成物（１１０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０→１：５）を行い、白色固体の２０ａ（１００ｍｇ、６８％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.77 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 5.82 (br s, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.73-1.64 (s, 4H), 1.30 (s, 6H), 1.29 (s, 6H)
６）化合物２０ｂの合成
化合物１９ｂ（３９０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（３．５ｍＬ）に溶解し、-７８℃で冷却しながらｎ-ブチルリチウム（１．５５M ｎ-ヘキサン溶液、０．９２ｍＬ、１．４ｍｍｏｌ）を滴下した。-７８℃で２０分間撹拌した後、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解したホウ酸トリイソプロピル（０．８０ｍＬ、３．５ｍｍｏｌ）を滴下し、-７８℃で２時間撹拌した。２規定塩酸（５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、白色固体の粗生成物（３１０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝０：１→１：１０）を行い、白色固体の２０ｂ（２８０ｍｇ、８０％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.77 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 5.85 (s, 2H), 4.03 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.91-1.83 (m, 2H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.29-1.28 (m, 12H), 1.07 (t, 3H, J = 7.5 Hz)
７）化合物２０ｃの合成
化合物１９ｃ（４３０ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（４．０ｍＬ）に溶解し、-７８℃で冷却しながらｎ-ブチルリチウム（１．５５M ｎ-ヘキサン溶液、０．９５ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を滴下した。-７８℃で２０分間撹拌した後、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解したホウ酸トリイソプロピル（０．９２ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）を滴下し、-７８℃で２時間撹拌した。２規定塩酸（５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（３１０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝０：１→１：２０）を行い、白色固体の２０ｃ（２７０ｍｇ、７１％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.77 (s, 1H), 6.79 (s, 1H), 5.80 (br s, 2H), 4.05 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.87-1.82 (m, 2H), 1.68 (s, 4H), 1.49-1.36 (m, 4H), 1.29 (m, 12H), 0.94 (t, 3H, J = 7.0 Hz)
８）化合物２１ｂの合成
化合物３ａ（８９ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、２０ｂ（１００ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍＬ）、エタノール（０．５ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１７ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．２５ｍＬ）を加え、１００℃で１０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（８３ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０→１：１０）を行い、白色固体の２１ｂ（７６ｍｇ、５６％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.38 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.02 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.33 (s, 2H), 5.15 (s, 2H), 3.84 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 3.56 (s, 3H), 3.42 (s, 3H), 1.72-1.67 (m, 4H), 1.65-1.62 (m, 2H), 1.32 (s, 6H), 1.25 (s, 6H), 0.86 (t, 3H, J = 7.5 Hz)
９）化合物２１ｃの合成
化合物３ｂ（７６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、２０ｃ（８０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をトルエン（１．０ｍＬ）、エタノール（０．５ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１２ｍｇ、０．０１０ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．２５ｍＬ）を加え、１００℃で１９時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：６）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（２９０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝０：１→１：２０）を行い、白色固体の２１ｃ（９０ｍｇ、７６％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.41 (s, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.42-7.22 (m, 10H), 7.15 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.56 (s, 1H), 5.14 (s, 2H), 5.07 (s, 2H), 3.84 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.72-1.64 (m, 4H), 1.61-1.57 (m, 2H), 1.32 (s, 6H), 1.22-1.20 (m, 10H), 0.81 (t, 3H, J = 7.0 Hz)
１０）化合物２２ａの合成
化合物３ａ（７８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、２０ａ（８０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）をトルエン（０．８０ｍＬ）、エタノール（０．４０ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．２０ｍＬ）を加え、１００℃で２４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（１１０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）を行い、無色オイル状の粗生成物（８２ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をメタノール（２．０ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（２０μＬ）を加え室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）で反応の終了を確認し、溶媒留去し、粗生成物を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（２．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ）、マロン酸ジエチル（１１０μＬ、０．７５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、６時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（４８ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）を行い、黄色固体の２２ａ（２７ｍｇ、２４％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.54 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 4.41 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 3.89 (s, 3H), 1.73 (s, 4H), 1.41 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.35 (s, 6H), 1.30 (s, 6H)
１１）化合物２２ｂの合成
化合物２１ｂ（７６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、濃塩酸（４０μＬ）を加え室温で１０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）で反応の終了を確認し、溶媒留去し、桃色固体の粗生成物を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（２．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ）、マロン酸ジエチル（９２μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、１４時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（５２ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）を行い、黄色固体の２２ｂ（４２ｍｇ、５４％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.55 (s, 1H), 7.48 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 4.41 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 4.02 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.79-1.72 (m, 4H), 1.41 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.34 (s, 6H), 1.30 (s, 6H), 0.95 (t, 3H, J = 7.5 Hz)
１２）化合物２２ｃの合成
化合物２１ｃ（９０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）、酢酸エチル（２．０ｍＬ）に溶解し、１０％活性化パラジウムカーボン（触媒量）を加え水素雰囲気下、室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０）で反応の終了を確認し、反応液をセライトろ過した後、溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（５８．７ｍｇ）を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ）、マロン酸ジエチル（６５μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、２４時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（５０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）を行い、黄色固体の２２c（２７ｍｇ、３５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.55 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 7.48 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 6.97 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 6.95 (s, 1H), 4.41 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 4.04 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.74-1.71 (m, 6H), 1.41 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.34-1.30 (m, 16H), 0.90-0.84 (m, 3H)
１３）目的化合物２３ａの合成
化合物２２ａ（２７ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム（２．０ｍＬ）を加え、室温で５時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（２０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）を行い黄色固体の１６ａ（１３ｍｇ、５３％）を得た。さらに再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、黄色針状結晶の２３ａ（８．０ｍｇ、３２％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.90 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 7.60 (s, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.08 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 6.98 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 1.76-1.70 (m, 4H), 1.36 (s, 6H), 1.30 (s, 6H)
１４）目的化合物２３ｂの合成
化合物２２ｂ（４２ｍｇ、０．０８８ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム（２．０ｍＬ）を加え、室温で１０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（２５ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）を行い黄色固体の２３ｂ（１５ｍｇ、３８％）を得た。さらに再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、黄色粉末状結晶の２３ｂ（７．０ｍｇ、１８％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.90 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 4.03 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.80-1.69 (m, 6H), 1.34 (s, 6H), 1.30 (s, 6H), 0.94 (t, 3H, J = 7.5 Hz)
１５）目的化合物２３ｃの合成
化合物２２ｃ（２７ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム（２．０ｍＬ）を加え、室温で６時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、水（５０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（２５ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）を行い黄色固体の２３ｃ（２０ｍｇ、７７％）を得た。さらに再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、黄色粉末状結晶の２３ｃ（１７ｍｇ、６６％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.23 (br s, 1H), 8.91 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 7.71 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 7.08 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 6.97 (s, 1H), 4.06 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 1.74-1.70 (m, 6H), 1.33?1.27 (m, 16H), 0.86 (t, 3H, J = 7.0 Hz)
［実施例３］目的化合物３０の合成
本実施例における目的化合物３０の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物２５の合成
チモール（１５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をメタノール（４ｍＬ）に溶解し、硫酸銀（３７０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ヨウ素（３００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌した。（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０）で反応の終了を確認し、反応液を飽和チオ硫酸ナトリウム水（３０ｍＬ）にあけ、セライトろ過し、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（２７０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５０→１：３０）を行い黄色固体の２５（２３０ｍｇ、８５％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.53 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 4.68 (s, 3H), 3.10 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.33 (s, 3H), 1.22 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
２）化合物２６の合成
化合物２５（２３０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（４．０ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウム（１５０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、２-ブロモプロパン（９４μＬ、１．１ｍｍｏｌ）、ヨウ化カリウム（１４ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、６０℃で４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０）で反応の終了を確認し、水（８０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（２１０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（ｎ-ヘキサン）を行い、無色オイル状の２６（１９０ｍｇ、６９％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.53 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.51 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 3.20 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.37 (s, 3H), 1.32 (d, 6H, J = 6.0 Hz), 1.16 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
３）化合物２７の合成
化合物２６（１９０ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（１．８ｍＬ）に溶解し、-７８℃で冷却しながらｎ-ブチルリチウム（１．５５M ｎ-ヘキサン溶液、０．４５ｍＬ、０．７０ｍｍｏｌ）を滴下した。-７８℃で２０分間撹拌した後、無水テトラヒドロフラン（０．５ｍＬ）に溶解したホウ酸トリイソプロピル（０．４１ｍＬ、１．８ｍｍｏｌ）を滴下し、-７８℃で２時間撹拌した。２規定塩酸（５ｍＬ）を加え、室温で１時間撹拌した後、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（９０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０→１：５）を行い、白色固体の２７（７９ｍｇ、５７％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.15 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 4.68 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 3.32 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.82 (s, 3H), 1.38 (d, 6H, J = 6.0 Hz), 1.25 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
４）化合物２８の合成
化合物３ｂ（１１０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、２７（７９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をトルエン（１．２ｍＬ）、エタノール（０．６ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１６ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．３０ｍＬ）を加え、１００℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０→１：１０）を行い、無色オイル状の２８（１２００ｍｇ、８２％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.43 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 7.39-7.24 (m, 10H), 6.98 (s, 1H), 6.73 (s, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.15 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 4.58 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 3.30 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.11 (s, 3H), 1.37 (d, 6H, J = 6.0 Hz), 1.20 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
５）化合物２９の合成
化合物２８（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（６．０ｍＬ）に溶解し、１０％活性化パラジウムカーボン（触媒量）を加え水素雰囲気下、室温で４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、反応液をセライトろ過した後、溶媒留去し、無色オイル状の粗生成物を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（２．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ）、マロン酸ジエチル（１００μＬ、０．６８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、１１時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（４０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（６１ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４→１：３）を行い、黄色固体の２９（４１ｍｇ、４２％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.51 (s, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.96 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.63 (s, 1H), 4.63 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 4.41 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 3.30 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.11 (s, 3H), 1.43-1.38 (m, 9H), 1.20 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
６）目的化合物３０の合成
化合物２９（４１ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）をメタノール（４．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム（２．０ｍＬ）を加え、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で酸性にし、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（４７ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）を行い黄色固体の２３（３７ｍｇ、９７％）を得た。さらに再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、黄色粉末状結晶の３０（２８ｍｇ、７４％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.86 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 7.50 (s, 1H), 7.07 (d, 1H, J = 0.5 Hz), 6.99 (s, 1H), 6.83 (s, 1H), 5.86 (s, 1H), 4.63 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 3.31 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.10 (s, 3H), 1.40 (d, 6H, J = 6.0 Hz), 1.20 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
［実施例４］目的化合物３６の合成
本実施例における目的化合物３６の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物３２の合成
イソバニリン（３００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５．０ｍＬ）に溶解し、濃硝酸（３８０μＬ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で薄め、飽和重曹水（５０ｍＬ）、水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（３７０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２→２：３）を行い黄色固体の３２（１００ｍｇ、２６％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.42 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 4.08 (s, 3H)
２）化合物３３の合成
化合物３２（４２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（３９μＬ、０．２３ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（１００μＬ）を加え、室温で１３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、２規定塩酸（２０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（５９ｍｇ）を得た。シリカろ過を行い黄色固体の３３（５８ｍｇ、８２％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.33 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.74 (s, 1H), 4.13 (s, 1H)
３）化合物３４の合成
化合物３３（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、７ｂ（１８０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）をトルエン（２．０ｍＬ）、エタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）、２規定炭酸ナトリウム水（０．４５ｍＬ）を加え、１００℃で３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）で反応の終了を確認し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）に薄め、飽和塩化アンモニウム水（１００ｍＬ）、水（１００ｍＬ）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２５）を行い、黄色固体の３４（１４０ｍｇ、８０％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 10.40 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 7.04 (s, 2H), 3.95 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.70 (s, 4H), 1.32 (s, 6H), 1.27 (s, 6H)
４）化合物３５の合成
化合物３４（３０ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）をメタノール（６．０ｍＬ）に溶解し、１０％活性化パラジウムカーボン（触媒量）を加え水素雰囲気下、室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）で反応の終了を確認し、反応液をセライトろ過した後、溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物を得た。得られた粗生成物を蒸留エタノール（１．０ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２０μＬ）、マロン酸ジエチル（１２０μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、３０時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝２：１）で反応の終了を確認し、水（６０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（１００ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝３：１→５：１→１：０）を行い、黄色オイル状の３５（１２ｍｇ、３４％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.24 (br s, 1H), 8.56 (s, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.97 (s, 1H), 4.42 (q, 2H, J = 7.0 Hz), 3.94 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.71 (s, 4H), 1.42 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.33 (s, 6H), 1.28 (s, 6H)
５）目的化合物３６の合成
化合物３５（１２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．０ｍＬ）に溶解し、三臭化ホウ素（１．０Ｍ ジクロロメタン溶液、１４滴）を０℃で加え、室温で２２時間撹拌した。水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色固体の粗生成物（２１ｍｇ）を得た。再結晶（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン）を行い、淡褐色粉末状結晶の３６（５．１ｍｇ、４５％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.14 (br s, 1H), 8.94 (s, 1H), 7.60 (s, 1H), 7.19 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 1.72 (s, 4H), 1.33 (s, 6H), 1.28 (s, 6H)
［実施例５］目的化合物４０の合成
本実施例における目的化合物４０の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物３８の合成
化合物３７（１１０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、トリブチルビニルスズ（１３０μＬ、０．４６ｍｍｏｌ）、トリスベンジリデンアセトンジパラジウム（１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）に無水トルエン（２．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で１８時間加熱還流した。ＨＰＬＣ（水：メタノール＝１０：９０、０．１％ギ酸添加）で反応の終了を確認した。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２０）を行い褐色オイル状の３８（８４ｍｇ、９３％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.86 (dd, 1H, J = 2.5, 0.5 Hz), 7.79 (dd, 1H, J = 9.0, 2.5 Hz), 7.53 (s, 1H), 6.57-6.50 (m, 2H), 5.99 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.63 (dd, 1H, J = 17.5, 1.0 Hz), 5.10 (dd, 1H, J = 11.0, 1.0 Hz), 4.20-4.15 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.83-3.76 (m, 1H), 3.67 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 3.35 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.11 (sep, 1H, J = 6.5 Hz), 1.29 (t, 6H, J = 6.5 Hz), 1.24 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.05 (d, 6H, J = 6.5 Hz)
２）化合物３９の合成
化合物３８（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、６-ブロモキノリン（３５μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）、ジクロロビストリフェニルホスフィンパラジウム（２．７ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（５４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）に無水N、N-ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下で４８時間１００℃撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、水（５０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（７１ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４）を行い褐色オイル状の３９（４３ｍｇ、６５％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.92 (dd, 1H, J = 2.5, 0.5 Hz), 8.83 (dd, 1H, J = 4.5, 2.0 Hz), 8.09 (dd, 1H, J = 8.5, 1.0 Hz), 8.00 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.82 (dd, 1H, J = 9.0, 2.5 Hz), 7.77 (dd, 1H, J = 9.0, 2.0 Hz), 7.71 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 7.08 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 6.60 (s, 1H), 6.10 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.30-4.21 (m, 1H), 3.88-3.82 (m, 4H), 3.70 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 3.40 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.14 (sep, 1H J = 6.5 Hz), 1.35 (d, 6H, J = 5.0 Hz), 1.29 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.07 (d, 6H, J = 6.5 Hz)
３）化合物４０の合成
化合物３９（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）をメタノール（２．０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、水（１．０ｍＬ）に溶解した水酸化リチウム水和物（８０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で４６時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（４０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（２０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（３０ｍＬ×２）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の４０（４６ｍｇ）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 9.03 (dd, 1H, J = 2.5, 0.5 Hz), 8.86 (dd, 1H, J = 4.5, 1.5 Hz), 8.13 (dd, 1H, J = 8.5, 1.0 Hz), 8.08 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.89 (dd, 1H, J = 9.0, 2.5 Hz), 7.79 (dd, 1H, J = 9.0, 2.0 Hz), 7.72 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.70 (s, 1H), 7.39 (dd, 1H, J = 8.5, 4.5 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 7.08 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 6.62 (s, 1H), 6.12 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.27-4.25 (m, 1H), 3.93-3.89 (m, 1H), 3.72 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 3.41 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.14 (sep, 1H J = 6.5 Hz), 1.36 (d, 6H, J = 6.5 Hz), 1.30 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.07 (d, 6H, J = 6.5 Hz)
［実施例６］目的化合物４４の合成
本実施例における目的化合物４４の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物４２の合成
ダンシルクロリド（１００ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１．０ｍＬ）に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン（７０μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）、４-アミノスチレン（４０μＬ、０．３４ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で２４時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水（８０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（４０ｍＬ×２）、飽和食塩水（４０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（１５０ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０→１：４）を行い黄色固体の４２（１００ｍｇ、８３％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.49 (dt, 1H, J = 8.5, 1.0 Hz), 8.32 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 8.16 (dd, 1H, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.59 (dd, 1H, J = 8.5, 7.5 Hz), 7.43 (dd, 1H, J = 8.5, 7.5 Hz), 7.19-7.17 (m, 3H), 6.88 (d, 2H, J = 6.67 (s, 1H), 6.67 (s, 1H), 6.55 (dd, 1H, J = 17.5, 11.0 Hz), 5.59 (dd, 1H, J = 17.5, 1.0 Hz), 5.15 (dd, 1H, J = 11.0, 1.0 Hz), 2.88 (s, 6H)
２）化合物４３の合成
化合物４２（４４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、３７（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２．０ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）、トリトリルホスフィン（６．０ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（８４μＬ、０．６１ｍｍｏｌ）に無水アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、２７時間加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：３）で反応の終了を確認し、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１０→１：５）を行い黄色オイル状の４３（１６ｍｇ、１８％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.86 (s, 1H), 8.47 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 8.35-8.32 (m, 1H), 8.17 (dd, 1H, J = 7.5, 1.0 Hz), 7.77 (dd, 1H, J = 9.0, 1.5 Hz), 7.54-7.51 (m, 2H), 7.41 (dd, 1H, J = 8.5, 7.5 Hz), 7.15 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.87-6.82 (m, 3H), 6.74 (d, 1H, J = 16.3 Hz), 6.53 (s, 1H), 6.01 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.20-4.13 (m, 1H), 3.85 (s, 3H), 3.80-3.72 (m, 1H), 3.66 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 3.35 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.85 (s, 6H), 2.11 (sep, 1H, J = 6.5 Hz), 1.31-1.26 (m, 6H), 1.21 (t, 3H, J = 7.0 Hz), 1.04 (d, 6H, J = 6.5 Hz)
３）目的化合物４４の合成
化合物４３（１６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をメタノール（５．０ｍＬ）に溶解し、２規定水酸化ナトリウム水（０．５ｍＬ）を加え、６５℃で１時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、フラッシュクロマトグラフィー（メタノール：ジクロロメタン＝１：４０）を行い黄色固体の４４（６ｍｇ、３９％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.92 (d, 1H, J = 2.25 Hz), 8.47 (dd, 1H, J = 8.5, 1.0 Hz), 8.31 (d, 1H, J 8.5 Hz), 8.15 (dd, 1H, J = 7.5, 1.5 Hz), 7.79 (dd, 1H, J = 9.0, 2.25 Hz), 7.56-7.54 (m, 2H), 7.41 (dd, 1H, J = 8.5, 7.5 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 7.10 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.99 (s, 1H), 6.85-6.82 (m, 3H), 6.73 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 6.54 (s, 1H), 6.02 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.22-4.15 (m, 1H), 3.81-3.77 (m, 1H), 3.67 (d, 2H, J = 6.5 Hz), 3.35 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 2.85 (s, 6H), 2.11 (sep, 1H, J = 6.5 Hz), 1.29-1.23 (m, 9H), 1.05 (d, 6H, J = 7.0 Hz)
［実施例７］目的化合物４８の合成
本実施例における目的化合物４８の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物４６の合成
化合物４５（３４０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水酢酸（５．０ｍＬ）、テトラヒドロフラン（５．０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、無水酢酸（０．６ｍＬ）に溶解した濃硝酸（２１０μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で２２時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、５規定水酸化ナトリウム水により塩基性にし、室温で３０分間撹拌した。反応液を氷水（１５０ｍＬ）にあけ、２規定塩酸で中和し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（１５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（１５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（３９０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５．０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、トリエチルアミン（２１０μＬ、１．５ｍｍｏｌ）、クロロメチルメチルエーテル（１１０μＬ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、０℃で１時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、氷水（１００ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（１００ｍＬ×２）、飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（５００ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：８）を行い淡黄色オイル状の４６（４００ｍｇ、９３％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.87 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 8.03 (s, 1H), 7.95 (dd, 1H, J = 9.0, 2.5 Hz), 6.67 (s, 1H), 6.22 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.44 (s, 2H), 4.61 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 4.34-4.22 (m, 1H), 3.86-3.59 (m, 1H), 3.52 (s, 3H), 3.33 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 1.39 (d, 6H, J = 6.0 Hz), 1.28-1.26 (m, 9H)
２）化合物４７の合成
化合物４６（４００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（１５ｍＬ）に溶解し、１０％活性化パラジウムカーボン（触媒量）を加え、水素雰囲気下、室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、反応液をセライトろ過した後、溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（３４０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物（２６ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、７-（ジエチルアミノ）クマリン-３-カルボン酸（１６ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（０．５ｍＬ）、ジイソプロピルエチルアミン（２０μＬ、０．１１ｍｍｏｌ）に溶解し、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で２０時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：２）で反応の終了を確認し、水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（１５ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（２０ｍＬ×２）、飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（４９ｍｇ）を得た。フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：４→１：２）を行い黄色固体の４７（４２ｍｇ、９３％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.93 (s, 6H), 8.96 (dd, 1H, J = 2.5, 0.5 Hz), 8.71 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 7.86 (dd, 1H, J = 9.0, 2.5 Hz), 7.40 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 6.65 (s, 1H), 6.63 (dd, 1H, J = 9.0, 2.35 Hz), 6.43 (d, 1H, J = 2.35 Hz), 6.16 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 5.42 (s, 2H), 4.45 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 4.35-4.29 (m, 1H), 3.89-3.83 (m, 1H), 3.51 (s, 3H), 3.43 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 3.36 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 1.34-1.27 (m, 15H), 1.22 (t, 6H, J = 7.0 Hz)
３）目的化合物４８の合成
化合物４７（４１ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、４規定塩酸酢酸エチル（２ｍＬ）を氷冷下加え、０℃で５０分間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ-ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、溶媒留去し、再結晶（ジクロロメタン：ｎ-ヘキサン）を行い、黄色針状結晶の４８（３２ｍｇ、８４％）を得た。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ 10.96 (s, 1H), 8.67 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.40-8.38 (m, 2H), 7.57 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 7.06-7.03 (m, 2H), 6.85 (dd, 1H, J = 9.0, 2.3 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 4.63 (sep, 1H, J = 6.0 Hz), 4.19-4.09 (m, 1H), 4.02-3.93 (m, 1H), 3.53 (q, 4H, J = 7.0 Hz), 3.41 (sep, 1H, J = 7.0 Hz), 1.38-1.34 (m, 9H), 1.30 (d, 6H, J = 7.0 Hz), 1.23 (t, 6H, J = 7.0 Hz)
［実施例８］目的化合物６２の合成
本実施例における目的化合物６２の合成スキームを以下の式に示す。
Figure 0006852897
１）化合物５７の合成
１，３-ベンゼンジオール（１．１ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５．２ｍＬ，３０ｍｍｏｌ），クロロメチルメチルエーテル（２．３ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６８時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（８０ｍＬ×２）、飽和食塩水（８０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色オイル状の粗生成物（３．１４ｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン）を行い、無色オイル状の５７（１．２８ｇ，６５％）を得た。
1H-NMR（400 MHz, CDCl3） 7.19 (t, 1H, J = 8.2 Hz), 6.74 (ｄ, 1H, J = 2.2 Hz), 6.70 (dd, 2H, J = 8.2, 2.2 Hz), 5.16 (s, 4H), 3.48 (s, 6H)
２）化合物５８の合成
化合物５７（２９７ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）をジエチルエーテル１．５ ｍＬに溶解し、０℃で１．６Mのｎ−ブチルリチウム／ヘキサン溶液（１．１２５ｍL、１．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。その後、０℃でホウ酸トリメチル（２５０μL、２．２５ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間撹拌した。その後、０℃で２N塩酸水溶液を加えて酸性化し、室温で１時間撹拌した。析出した結晶を水を用いて吸引ろ過し、淡黄色結晶５８（１７７ｍｇ、４９％）を得た。
1H-NMR（300 MHz, CDCl3） 7.36 (t, 1H, J = 8.3 Hz), 7.23 (s, 2H), 6.88 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 5.30 (s, 4H), 3.51 (s, 6H)
３）化合物５９の合成
化合物６（１１３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、化合物５８（１４５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（６９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、リン酸カリウム（２５５ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）にジメトキシエタン（４ｍL）、水（１．３ｍL）を加え、３０分加熱還流した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝1：3）で反応の終了を確認し、水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、褐色の粗生成物（２６３ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：３０）を行い、白色固体５９（１２４ｍｇ，７８％）を得た。
1H-NMR（400 MHz, CDCl3） 7.24 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7.13 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.89 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.04 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 4.96 (d, 2H, J = 6.6 Hz), 3.27 (s, 6H), 2.07 (s, 3H), 1.68 (s, 4H), 1.55 (s, 3H), 1.30 (s, 6H), 1.23 (s, 6H)
４）化合物６０の合成
化合物５９（１０８ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２ｍＬ）に溶解し、４Ｎ塩酸／酢酸エチル溶液（２ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色固体の粗生成物（８８ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：８）を行い、淡黄色固体６０（４６ｍｇ，５４％）を得た。
1H-NMR（300 MHz, CDCl3） 7.31 (s, 1H), 7.17 (t, 1H, J = 8.1 Hz), 6.60 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 4.67 (s, 2H), 2.10 (s, 3H), 1.71 (s, 4H), 1.33 (s, 6H), 1.25 (s, 6H)
５）化合物６１の合成
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３５０μＬ）に０℃で塩化ホスホリル（１００μＬ）を加えて１．５時間撹拌した。そこへ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）に溶解した化合物６０（４０ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４８時間撹拌した。ＴＬＣプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：５）で反応の終了を確認し、氷水（３０ｍＬ）にあけ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨを２−３に調整し、酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、黄色オイル状の粗生成物（６０ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：８）を行い淡黄色固体の６１（１７ｍｇ，３９％）を得た。
1H-NMR（300 MHz, CDCl3） 11.71 (s,1H), 9.76 (s, 1H), 7.48 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.29 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.69 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 5.61 (s, 1H), 2.11 (s, 3H), 1.70 (s, 4H), 1.32 (d, 6H, J = 5.3 Hz), 1.26 (d, 6H, J = 5.3 Hz)
６）目的化合物６２の合成
化合物６１（１７ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン（７．２ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）、ピペリジン（５０μＬ）、エタノール（１ｍＬ）を混合し、３０分加熱還流した。ＴＬ11Ｃプレート（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１）で反応の終了を確認し、水（３０ｍＬ）にあけ、酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で洗浄し、水層を２Ｎ塩酸水溶液で酸性化して、酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。水（５０ｍＬ×２）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。得た有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下にて溶媒留去し、淡黄色固体の粗生成物（２９ｍｇ）を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン１：３→１：０）を行い黄色固体の６２（１４ｍｇ，６９％）を得た。
1H-NMR（400 MHz, CDCl3） 8.92 (s, 1H), 7.69 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.32 (s, 1H), 7.16 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.10 (s, 1H), 5.92 (s, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.72 (d, 4H, J = 8.6 Hz), 1.35 (d, 6H, J = 16.4 Hz), 1.26 (d, 6H, 16.4 Hz)
［実施例９］ＲＸＲアゴニスト活性及びＲＸＲアンタゴニスト活性の評価
合成した各化合物について、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイにより、ＲＸＲに対する転写活性化能を評価した。
１）測定原理
核内受容体の多くは転写調節に関わる転写因子であるため、その転写活性を測定する手段としてレポーター遺伝子アッセイ（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ａｓｓａｙ）が行われる。ＣＯＳ−１細胞やＨｅＬａ細胞などの細胞に、ＲＸＲ受容体タンパク質発現プラスミド及びレポータープラスミドを導入する。そこに、ＲＸＲ作動性物質（リガンド）が受容体に結合すると、転写がリガンド依存的に起こり、下流にあるルシフェラーゼの産生が始まる。このルシフェラーゼ活性を測ることにより、ＲＸＲアゴニスト活性を測定した。また、ＲＸＲアンタゴニスト活性は、既存のＲＸＲアゴニストに対する拮抗作用を測定することにより評価した。また、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現プラスミドを導入し、ＳＥＡＰの活性を測定することで、形質転換効率の補正を行った。
２）宿主細胞の培養
細胞の増殖培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。まず、５００ｍＬの超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）にて生成）にＤＭＥＭ粉末を４．７５ｇ溶解し、高圧加熱滅菌（１２１℃、２０分間）を行った後、室温に戻し、これに非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％（ｖ/ｖ）となるように加え、さらに高圧加熱滅菌した１０％ ＮａＨＣＯ3を１０ｍＬ添加し、その後Ｌ-グルタミン０．２９２ｇを８ｍＬの超純水に溶解したものをろ過滅菌後添加して調製した。
各細胞の継代は、１００ｍｍ培養シャーレで培養した細胞の培養上清を除き、トリプシン処理により細胞を回収し、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離後、増殖培地を加えて細胞を分散させ、１００ｍｍ培養シャーレに細胞を分散した増殖培地を１５ｍＬ加え、３７℃、５％ ＣＯ2雰囲気下で培養した。
形質転換はＥｆｆｅｃｔｅｎｅTM Ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。ＲＸＲの陽性コントロールにはＬＧＤ１０６９を用いた。これらは、ＤＭＳＯ溶解したものをストック溶液とし、アッセイするプレートにおいて計測した。
３）転写活性の測定
（１日目）６０ｍｍ培養シャーレに、増殖培地５ｍＬとともにＣＯＳ−1細胞を５０×１０4ｃｅｌｌｓ播種し、一晩培養した。
（２日目）ＥｆｆｅｃｔｅｎｅＴＭ Ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いたリポフェクション法により形質転換を行った。形質転換には、受容体タンパク質発現プラスミド１μｇ、レポータープラスミド４μｇ、ＳＥＡＰ発現プラスミド１μｇを用いた。
（３日目）１６〜１８時間後、培養上清を除き、トリプシン処理により細胞を回収し、１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離後、増殖培地を加えて細胞を分散し、２０×１０4ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌとなるように９６ウェルのホワイトプレートに播種した。その後、ＤＭＳＯ濃度が１％になるように各化合物を加えた。
（４日目）２４時間後、上清２５μＬをＳＥＡＰ測定に用い、残りの細胞液はルシフェラーゼ活性測定に用いた。
ＳＥＡＰ測定は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，６３，ｐｐ.４９−６０，１９９７/ＢＤ Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅ ＳＥＡＰ Ｕｓｅｒ ｍａｎｕａｌ（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に記載の方法に従い行った。
具体的には、以下の方法で測定した。上記４日目の上清２５μＬに対して希釈用緩衝液を２５μＬ加えた後、６５℃で３０分間インキュベートした。その後室温に戻し、アッセイ用緩衝液（７μＬ）、１０×ＭＵＰ（０．３μＬ）、希釈用緩衝液（２．７μＬ）を加え、暗所室温で６０分間インキュベートした。その後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００、ＴＥＣＡＮ社製）を用い励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍにより蛍光強度を測定した。
アッセイ用緩衝液は、以下の方法で調製した。５０ｍＬの超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）にて生成）にＬ-ホモアルギニン（０．４５ｇ）と塩化マグネシウム（０．０２ｇ）を溶解させ、ジエタノールアミン（２１ｍＬ）を加えた。その後、塩酸を用いてｐＨを９．８になるように調整後、超純水を用いて全量が１００ｍＬになるようにメスアップし、それを４℃で保存した。
希釈用緩衝液は、以下の方法で調製した。９０ｍＬの超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）にて生成）に塩化ナトリウム（４．３８ｇ）とＴｒｉｓ Ｂａｓｅ（２．４２ｇ）を溶解させた。その後、塩酸を用いてｐＨが７．２になるように調整し、５倍濃度希釈用緩衝液を作製し、それを４℃で保存した。使用直前にそれを５倍希釈することで希釈用緩衝液を作製した。
４-メチルウンベリフェリルホスフェートを２５ｍＭになるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）にて生成）に溶解させ、それを−２０℃で保存したものを、１０×ＭＵＰとした。
ルシフェラーゼ活性は、ＮＵＮＣ社製の９６穴ホワイトプレートを用い、発光基質（Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）との反応産物との発光強度をマイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて測定した。
４）測定結果
上記の測定結果を図３に示す。
陽性コントロールであるｂｅｘａｒｏｔｅｎｅを１μＭ反応させたときの転写活性を１とし、相対活性を調べた結果を図３Ａに示す。その結果、化合物１０、２３ａ、２３ｂ、３０についてＲＸＲアゴニスト活性を認めた。また、ＲＸＲアゴニストであるＮＥｔ−ＴＭＮの存在下に化合物４４を添加した結果を図３Ｂに示す。その結果、化合物４４についてＲＸＲアンタゴニスト活性を認めた。また、同様に試験することによって、化合物２３ｃ、４９についてＲＸＲアンタゴニスト活性を認めた。
［実施例１０］創出化合物の蛍光物性
合成した化合物について、メタノール中、クロロホルム中での励起極大波長、蛍光極大波長を評価した。測定は日立Ｆ−４５００形分光蛍光光度計にて、四面透明石英セル（光路長１ｃｍ）を用い、励起、蛍光スリット１０ｎｍ、フォトマル電圧７００Ｖで行った。測定結果を以下の表２に示した。
Figure 0006852897
［実施例１１］化合物１０の各種溶媒中での蛍光強度
化合物１０について、水中、メタノール中、アセトニトリル中、クロロホルム中、シクロヘキサン中で、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍでの蛍光強度を測定した。測定はＴｅｃａｎ ＳＰＡＲＫ １０Ｍにて、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製９６穴ハーフエリア黒色プレートを用い、励起、蛍光バンド幅２０ｎｍで行った。測定結果を図４に示す。測定結果は、水中に比べ、有機溶媒中で蛍光強度が減弱した。
［実施例１２］蛍光強度測定による化合物１０のＲＸＲ結合のモニタリング
ＲＸＲタンパク質存在下における蛍光強度測定の緩衝液は、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールとした。測定はＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｆにて、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製３８４穴スモールボリューム黒色プレートを用い、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ、励起、蛍光バンド幅３５ｎｍで行った。１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬとした。ＲＸＲαタンパク質はＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を１００ｎＭ（図５Ａ）もしくはｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ＲＸＲαを３μＭ（図５Ｂ）で用いた。化合物１０の濃度を変化させて溶液調製し、室温にて２時間インキュベートし、化合物１０単独時からの蛍光強度の減少量をプロットした。また、そこへｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ１０μＭを共存させた際の蛍光強度の減少量も同様にプロットした。なお、いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。
その結果、図５に示すように、ＲＸＲαタンパク質の存在により１０の蛍光強度は減弱し、ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅを共存させることで蛍光強度が回復した。化合物１０およびＲＸＲαタンパク質存在時のプロットから、ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ共存時のプロットを減じることにより、化合物１０のＲＸＲαタンパク質への特異的な結合による蛍光強度の変化をプロットした。ＲＸＲα−ＬＢＤを用い、得られた特異的結合のプロットから最小二乗法により化合物１０のＲＸＲαタンパク質に対する結合解離定数（Ｋｄ）は８７ｎＭと算出された。
［実施例１３］化合物１０を用いたＲＸＲリガンドのＲＸＲ結合能の評価
化合物１０を用いたＲＸＲリガンドのＲＸＲ結合能評価における蛍光強度測定の緩衝液は、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールとした。測定はＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｆにて、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製３８４穴スモールボリューム黒色プレートを用い、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ、励起、蛍光バンド幅３５ｎｍで行った。１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬとした。ＲＸＲαタンパク質（リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ））はＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製のものを１００ｎＭで、１０は１００ｎＭで用い、試験化合物としてはＲＸＲアゴニストｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ、ＣＢＴＦ−ＰＭＮ、ＲＸＲアンタゴニストＰＡ４５２、ＲＸＲ作動性のある環境ホルモンであるトリブチルスズクロリドを用いた。溶液調製後、室温で２時間インキュベートし、蛍光強度を測定し、プロットした。なお、いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。
その結果、図６に示すように、いずれのＲＸＲリガンドも濃度依存的に１０の蛍光強度を回復させた。
それぞれのプロットから最小二乗法によりＥＣ50値を求め、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式（Ｋｉ＝ＥＣ50／（１＋（［化合物１０濃度］／Ｋｄ）））により結合阻害定数（Ｋｉ）を求めた。結果を下表に示す。
Figure 0006852897
［実施例１４］蛍光強度測定による、化合物４４のＲＸＲ結合のモニタリング
ＲＸＲタンパク質存在下における蛍光強度測定の緩衝液は、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールとした。測定はＴｅｃａｎ ＳＰＡＲＫ １０Ｍにて、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ社製３８４穴黒色プレートを用い、励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長５６０ｎｍ、励起、蛍光バンド幅２０ｎｍで行った。１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬとした。化合物４４は３０ｎＭとし、ＲＸＲαタンパク質（リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ））はＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製のものを濃度を変化させて溶液調製し、室温にて２時間インキュベートし、蛍光強度をプロットした。また、そこへｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ １μＭを共存させた際の蛍光強度も同様にプロットした。なお、いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。
その結果、図７に示すように、ＲＸＲαタンパク質の濃度上昇により化合物４４の蛍光強度は増大し、ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅを共存させることで蛍光強度が減少した。
［実施例１５］化合物４４を用いたＲＸＲリガンドのＲＸＲ結合の検出
ＲＸＲタンパク質存在下における蛍光強度測定の緩衝液は、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールとした。測定はＴｅｃａｎ ＳＰＡＲＫ １０Ｍにて、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ社製３８４穴黒色プレートを用い、励起波長３３０ｎｍ、蛍光波長５６０ｎｍ、励起、蛍光バンド幅２０ｎｍで行った。１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬとした。化合物４４は３０ｎＭ、ＲＸＲαタンパク質（リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ））はＡｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ社製のものを１００ｎＭ、試験化合物は１μＭで溶液調製し、室温にて２時間インキュベートしたのち、蛍光強度を測定した。なお、いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。
その結果、図８に示すように、ＲＸＲリガンドである、Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ、ＮＥｔ−３ＩＢ、ＮＥｔ−ＳＢの存在により化合物４４の蛍光強度は減少しＲＸＲリガンドのＲＸＲへの結合を検出した。
［実施例１６］化合物１０を用いた結合評価と蛍光標識コアクチベーターを用いたＲＸＲ活性化能評価を組み合わせた複合アッセイ
フルオレセイン標識コアクチベーターペプチド（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａ）の蛍光偏光度を測定することで、ＲＸＲへのコアクチベーターのリクルート、則ち、ＲＸＲの活性化型構造への変化を検出することができる。化合物１０を用いた結合試験と、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａを用いた活性化能試験を組み合わせることで、図２に示すように、試験化合物のＲＸＲへの結合能とＲＸＲ活性化能を同時に評価することが可能である。
化合物１０の蛍光強度測定およびｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａの蛍光偏光度測定における緩衝液は、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールとした。測定はＴｅｃａｎ Ｐｏｌａｒｉｏｎにて、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製３８４穴スモールボリューム黒色プレートを用い、化合物１０の蛍光測定は励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍで、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａの蛍光偏光測定は励起波長４８５ｎｍ、蛍光波長５３５ｎｍで行った。１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬとした。Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ＲＸＲαタンパク質は３μＭ、１０は３μＭ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａは３０ｎＭで用い、試験化合物としてはＲＸＲアゴニストｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ、ＲＸＲアンタゴニストＰＡ４５２をそれぞれ１０μＭで用いた。溶液調製後、室温で２時間インキュベートし、化合物１０の蛍光強度、およびＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａの蛍光偏光度を測定した。なお、いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。
その結果、いずれのＲＸＲリガンドも１０の蛍光強度を回復させた（図９Ａ）。一方、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＰＧＣ１ａの蛍光偏光度はＲＸＲアゴニストであるｂｅｘａｒｏｔｅｎｅでは上昇したのに対し、ＲＸＲアンタゴニストであるＰＡ４５２では減少した（図９Ｂ）。なお、有意差検定はｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法）にて行った（＊＊: p ＜ 0.01）。
［実施例１７］化合物１０のマウス経口投与時の血中移行性
化合物１０を３０ｍｇ／ｋｇでＩＣＲマウス（雄性、６週齢、一群あたり５匹）に経口投与し、経口投与０．５、１、３、および６時間後に採血を施し、血中濃度を測定した。血中濃度の測定は次の実験方法によって準備したサンプルを用いて行った。絶食した６ 週齢の雄性ＩＣＲマウスに対し、経口投与を施し、１、３、および６時間毎に、個々のマウスをエーテル麻酔下安楽死させた後、採血した。採血した血液を４℃、４４００ｇにて遠心分離し、上清を１００μＬ採取した。そこに、１００μＬの氷冷した５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（酢酸によりｐＨ５．０に調整）を加え、さらに酢酸エチル１ｍＬを加えた後、３０秒間ボルテックス（登録商標）にて攪拌し、その上清８００μＬを分取した。減圧下、溶媒を蒸発させ、これに１００μＬのＨＰＬＣ用メタノールを加えた。これのうち３０μＬを、 液体クロマトグラフィーシステム（SCL-10AD、島津製作所）およびＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）、ＯＤＳ−３カラム（４．６ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ、５μｍ）、ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、溶媒としてメタノール：水：酢酸=９０：９：１（ｖ／ｖ）、０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて測定を行った。得られるピーク面積にて、サンプル量を定量した。
その結果、図１０に示すように、投与０．５時間後でおよそ３μＭの血中濃度を与えた。また、時間依存的な血中からの消失が観測された。
［実施例１８］化合物１０の低容量でのマウス経口投与時の血中濃度測定
化合物１０を１０、３、および１ｍｇ／ｋｇでＩＣＲマウス（雄性、６週齢、一群あたり４−５匹）に経口投与し、経口投与１時間後に採血を施し、血中濃度を測定した。血中濃度の測定は次の実験方法によって準備したサンプルを用いて行った。絶食した６週齢の雄性ＩＣＲマウスに対し、経口投与を施し、１時間後に、個々のマウスをエーテル麻酔下安楽死させた後、採血した。採血した血液を４℃、４４００ｇにて遠心分離し、上清を１００μＬ採取した。そこに、１００μＬの氷冷した５ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（酢酸によりｐＨ５．０に調整）を加え、さらに酢酸エチル１ｍＬを加えた後、３０秒間ボルテックス（登録商標）にて攪拌し、その上清８００μＬを分取した。減圧下、溶媒を蒸発させ、これに１００μＬのＨＰＬＣ用メタノールを加えた。これのうち３０μＬを、 液体クロマトグラフィーシステム（SCL-10AD、島津製作所）およびＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ（登録商標）、ＯＤＳ−３カラム（４．６ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ、５μｍ）、ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、溶媒としてメタノール：水：酢酸=９０：９：１（ｖ／ｖ）、０．７ｍＬ／ｍｉｎの流速、励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍにて測定を行った。得られるピーク面積にて、サンプル量を定量した。
その結果、図１１に示すように、ＥＣ50付近の濃度をでも血中濃度の測定が可能であった。
［実施例１９］ＬＰＳ刺激下におけるＮＦκＢ転写活性に対する阻害活性試験
Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓより購入したＮＦκＢ/ＥＡＰｏｒｔｅｒ ＲＡＷ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅを５６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、９０ μＬ/ｗｅｌｌで９６穴透明プレートに播種(５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ)、３７℃、５％ＣＯ２培養した。その翌日に、被験化合物の希釈調整溶液とＬＰＳ(最終濃度１ｎｇ／ｍＬ)を１０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、全量が１００μＬ／ｗｅｌｌとなるようにして、３７℃、５％ＣＯ２培養した。被験化合物の希釈調整溶液とＬＰＳ添加２４時間後に、培養上清２５μＬを９６ｗｅｌｌ白色プレートに分注し、ＳＥＡＰ活性を蛍光プレートリーダーにて測定した。被験化合物非添加のＬＰＳ添加ウェルのＳＥＡＰ活性に対する、被験化合物／ＬＰＳ添加ウェルのＳＥＡＰ活性を比較することで、被験化合物のＮＦκＢ転写活性に対する阻害活性を算出した。
図１２に、結果を示す。図中、斜線箇所はＬＰＳ添加時の被検化合物未添加時のＳＥＡＰ活性を１００％とした相対的ＳＥＡＰ活性を示す。白塗り箇所はＬＰＳ未添加かつ被検化合物未添加時、黒塗り箇所はＬＰＳ添加かつ各濃度の被検化合物添加時での相対的ＳＥＡＰ活性である。図に示すように、被検化合物である化合物１０を添加することで、ＳＥＡＰ活性が抑制され、ＮＦκＢに対する阻害活性が示された。
［実施例２０］蛍光強度測定による化合物６２のＲＸＲ結合のモニタリング
化合物６２の、ＲＸＲタンパク質非存在下および存在下における蛍光強度測定を行った。実験には、２０ｍＭトリス-塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、５ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロールからなる溶液を緩衝液として用いて、Ｇｒｅｉｎｅｒ社製３８４穴スモールボリューム黒色プレートを用い、１ウェルあたりのサンプル量は２０μＬ、化合物６２の最終濃度を１０μＭとして、ＲＸＲα−ＬＢＤを１００ｎＭで用いた。いずれの場合においても化合物の溶解補助剤として用いるジメチルスルホキシド濃度は１％とした。測定にはＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００Ｆを用いて、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ、励起、蛍光バンド幅３５ｎｍで行った。
実験結果を図１３に示す。その結果、ＲＸＲαタンパク質の存在により化合物１０の蛍光強度は減弱し、ＲＸＲに対する結合が示された。

Claims (8)

  1. 下記式（１）〜（３）のいずれかで示され、蛍光性を有するレチノイドＸ受容体結合性分子。
    Figure 0006852897
     ［式中、Ｒ１は、メチル、アルコキシ又はスチリルであり；
    Ｒ２は、ヒドロキシ、アルコキシ又はアルキルアミノであり；
    Ａは、Ｎ又はＣＨであり；
    Ｂは、ＮＨ又はＯである。］
    Figure 0006852897
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ及びＢは、式（１）と同じである。］
    Figure 0006852897
     ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ａ及びＢは、式（１）と同じであり；
    Ｒ３は、イソプロピル又はターシャリーブチルであり；
    Ｒ４は、イソプロピル又はイソブチルである。］
  2. 前記式（１）で示される、請求項１に記載の結合性分子。
  3. 前記式（２）で示される、請求項１に記載の結合性分子。
  4. 前記式（３）で示される、請求項１に記載の結合性分子。
  5. 請求項１〜４のいずれかに記載の結合性分子を用いて、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能を評価する試験方法。
  6. 前記評価物質が存在する水溶液中において、前記結合性分子がレチノイドＸ受容体に結合することによる該結合性分子の蛍光強度の減少量を測定することによって、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能を評価する、請求項５に記載の試験方法。
  7. 請求項１〜４のいずれかに記載の結合性分子及び蛍光団を有するコファクターペプチドを共に用いる、レチノイドＸ受容体に対する評価物質の結合能と機能を評価する試験方法（但し、前記結合性分子をヒトに投与する場合を除く。）。
  8. 請求項１〜４のいずれかに記載の結合性分子を有効成分として含む医薬組成物。
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