CN108290841B - 具有荧光性的类视黄醇x受体结合性分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

通过使用由下述式(1)～(3)中任一式所示的、具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子，能够容易地进行对于RXR的结合性的评价试验。[式中，R1为甲基、烷氧基或苯乙烯基；R2为羟基、烷氧基或烷基氨基；A为N或CH；B为NH或O；R3为异丙基或叔丁基；R4为异丙基或异丁基。]
Figure DDA0001681929890000011

Description

具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子及其用途
技术领域
本发明涉及具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子。并且涉及使用该结合性分子来评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力的试验方法、用于评价包含该结合性分子的评价物质的结合能力和功能的试验试剂盒、和包含该结合性分子作为有效成分的医药组合物。
背景技术
rexinoid是对于类视黄醇X受体(retinoid X receptor：RXR)显示结合性的物质的统称。即，rexinoid为类视黄醇X受体结合性分子(ligand for retinoid X receptor)。
作为rexinoid之一的蓓萨罗丁(bexarotene)(targretin(注册商标))是RXR的活化物质(激动药)，在美国临床应用于皮肤浸润性T细胞淋巴瘤(CTCL)(专利文献1)。另外，不仅报道有蓓萨罗丁对癌症的有效性、还报道了其对糖尿病(非专利文献1)、阿尔茨海默氏症(专利文献2、非专利文献2)、帕金森病(非专利文献3)的有效性。其理由是因为RXR与控制糖·脂质代谢的其它核受体协同，进而因为RXR与其它核受体的异二聚体的活性受rexinoid控制。
另外，作为天然的rexinoid，已知有DHA、EPA(非专利文献4)。它们还用于提高记忆力、代谢综合征、癌症恶病质的改善，包含其的食品还用作功能性食品。如此，RXR是非常有吸引力的创新药和功能性食品的靶点。
以RXR作为靶的配体的研究，通过使用放射性同位素(RI)标记配体的结合试验、或通过作为使用培养细胞的转录活化试验的利用报告基因检测法的转录活化试验来进行(非专利文献5)。另外，还已知作为试剂盒市售的TR－FRET法。以下，对于这些现有的rexinoid研究方法进行说明。
(a)报告基因检测法
报告基因检测法使用使RXR过度表达的细胞，评价试验化合物的转录活化能力。虽然报告基因检测法是用于研究试验物质的转录活化能力的最合适的试验法，但是获得结果需要长时间(3～4天)。因此，如果能够作为一次筛选进行对于RXR的结合试验，则能够避免多余的报告基因检测法试验。
(b)使用RI标记化合物的结合试验
作为对于RXR的结合试验，已知有使用放射性同位素标记配体的方法。该方法是由RI标记化合物和试验化合物对于RXR的竞争性的结合来评价试验化合物的结合能力的方法，灵敏度高。但是，为了实施该方法需要特殊的设施。另外，需要将与试验化合物结合的RI标记化合物和游离的RI标记化合物分离，试验操作也繁杂。此外，该方法所使用的放射性同位素(RI)试剂([3H]9-顺式视黄酸)非常昂贵，就使用而言，特别在日本因法律上的制约而需要繁杂的操作。
(c)TR－FRET法
TR－FRET法是通过测定铽标记的RXR与荧光标记的辅激活物的FRET现象来评价试验化合物的RXR活化能力的方法。通过利用使用市售试剂盒的TR－FRET法的rexinoid研究法，则能够在短时间内获得表示试验化合物的激动剂活性的数据。然而，需要与TR－FRET法对应的板分析仪，能够使用的板分析仪受限制。
RXR虽然是非常有吸引力的创新药靶点，但另一方面，具有副作用的问题。例如，作为唯一被临床应用的rexinoid的蓓萨罗丁，血脂上升、甲状腺功能降低症、易感染等严重的副作用成为问题。因此，使用蓓萨罗丁时推荐监测血药浓度。监测血药浓度时，通常通过从血液中提取药物并利用HPLC测定药物的紫外线吸光度的强度来进行定量。由于以紫外线吸光为指标，存在灵敏度低、会受到来自生物体的夹杂物的影响等的问题点。
蓓萨罗丁这样的RXR激动剂一般由包括1,1,4,4-四甲基四氢化萘结构的疏水性部位和包括苯甲酸或者烟酸的酸性部位、以及连结疏水性部位和酸性部位的连接基构成。非专利文献6中，记载有因疏水性部位为显示荧光性的羟基喹啉骨架而具有荧光性的RXR激动剂。并且记载了通过观测该激动剂的荧光偏光度能够测定该激动剂对于RXR的结合能力。然而，非专利文献6记载的RXR激动剂具有荧光强度低、而且对于RXR的结合能力也低这样的问题。
非专利文献7中记载了通过使用具有荧光团的辅因子部分肽和RXR，对该辅因子部分肽与RXR的结合能力根据其荧光偏光度的变化进行测定的方法。并且记载了通过该方法能够定性测定被评价物质对于RXR的激动性或者拮抗性。然而，非专利文献7记载的方法中，如果不使用具有荧光团的辅激活物和辅阻遏物的2种类，则无法研究被评价物质对于RXR的激动性或者拮抗性。因此，存在实验所使用的RXR量变多、而且作业时间也变长这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO93/21146A1
专利文献2：WO2013/056232A2
非专利文献
非专利文献1：Nature(1997),386(6623),407-410
非专利文献2：Science(2012),335(6075),1503-1506
非专利文献3：ACS Chem Neurosci.(2013),4(11),1430-1438
非专利文献4：Mol Cell Proteomics.(2004),3(7),692－703
非专利文献5：J.Med.Chem.(1994),37,2930-2941
非专利文献6：Bioorg.Med.Chem.Lett.(2010),20,5143-5146
非专利文献7：J.Med.Chem.(2013),56,1865-1877
发明内容
发明要解决的课题
本发明是为了解决上述课题而完成的发明，提供一种具有荧光性的RXR结合性分子。并且，提供使用这样的结合性分子来容易地评价评价物质对于RXR的结合能力的试验方法。此外，提供包含这样的结合性分子作为有效成分且能够容易地进行血药浓度监测的医药组合物。
用于解决课题的技术方案
上述课题可以通过提供由下述式(1)～(3)中任一式表示且具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子得以解决。
Figure BDA0001681929870000041
[式中，R1为甲基、烷氧基或苯乙烯基；
R2为羟基、烷氧基或烷基氨基；
A为N或CH；
B为NH或O。]
Figure BDA0001681929870000042
[式中，R1、R2、A和B的含义与式(1)中相同。]
Figure BDA0001681929870000043
[式中，R1、R2、A和B的含义与式(1)中相同；
R3为异丙基或叔丁基；
R4为异丙基或异丁基。]
另外，上述课题也可以通过提供由下述式(4)或(5)表示且具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子得以解决。
Figure BDA0001681929870000051
[式中，R5为异丙基或叔丁基；
R6为异丙基或异丁基；
W为NR7、C＝CH2、C＝NOH或C(OCH3)2；
R7为烷基；
X为N或CH；
Y为N或CH；
Z为CH＝CH(反式)、NHCO、CONH、CH＝CH－CO或CO－CH＝CH；
Fluorophore为含有芳香环的荧光团，该芳香环与Z结合。]
Figure BDA0001681929870000052
[式中，R5、R6、W、R7、X和Y的含义与式(4)中相同；
Z1为CH＝CH(反式)、NHCO、CONH、CH＝CH－CO或CO－CH＝CH；
Z2为CH＝CH、NHCO、CONH、NHSO2、SO2NH、CH2NHCO或CH2NHSO2；
环Q为苯环、吡啶环、噻吩环、萘环或喹啉环；
Fluorophore为含有芳香环的荧光团，该芳香环与Z2结合。]
优选的实施方式为，使用上述式(1)～(5)中任一式表示的结合性分子来评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力的试验方法。此时，优选通过在存在有上述评价物质的水溶液中，测定由于上述结合性分子与类视黄醇X受体结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力。
其它优选的实施方式为评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力和功能的试验方法，其中，将上述式(1)～(5)中任一项表示的结合性分子和具有荧光团的辅因子肽一起使用。
上述课题也可以通过提供评价评价物质对于核受体的结合能力和功能的试验方法来解决，其中，将具有荧光性的核受体结合性分子和具有荧光团的核受体辅因子肽一起使用。此时，优选上述结合性分子的激发和荧光波长不与上述辅因子肽的激发和荧光波长重叠。另外，还优选通过在存在有上述评价物质的水溶液中，测定由于上述结合性分子与上述受体结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于上述受体的结合能力，同时，通过测定核受体辅因子肽的荧光偏光度，来评价评价物质对于上述受体的功能。
上述课题也可以通过提供一种用于评价评价物质对于核受体的结合能力和功能的试验试剂盒来解决，该试验试剂盒包含具有荧光性的核受体结合性分子和具有荧光团的核受体辅因子肽。
另外，上述课题也可以通过提供一种包含上述式(1)～(5)中任一式表示的结合性分子作为有效成分的医药组合物来解决。
发明的效果
通过使用本发明的类视黄醇X受体结合性分子，能够容易地进行对于RXR的结合性的评价试验，能够有助于以RXR为靶的医药候选、功能性食品的研究。另外，还能够以荧光为指标来容易地进行药剂的血药浓度监测。
附图说明
图1是说明评价试验物质的RXR结合能力的方法的原理的图。
图2是说明同时评价试验物质的RXR结合能力和RXR活化能力的方法的原理的图。
图3是表示本发明的结合性分子对于RXR的转录活化能力的用量曲线。
图4是表示化合物10在各种溶剂中的荧光强度的图表。
图5是关于利用荧光强度测定进行的化合物10的RXR结合的监测的图表。
图6是使用化合物10的试验物质的RXR结合能力的用量曲线。
图7是使用化合物44的试验物质的RXR结合能力的用量曲线。
图8是关于使用化合物44的试验物质的RXR结合能力的图表。
图9是使用化合物10和荧光标记辅激活物来同时测定试验物质的RXR结合能力和RXR活化能力的图表。
图10是表示化合物10的小鼠经口给药时的血药浓度的图表。
图11是表示化合物10的各给药量下的小鼠经口给药时的血药浓度的图表。
图12是表示添加化合物10时的SEAP活性的图表。
图13是表示存在RXR时的化合物62的荧光强度的图表。
具体实施方式
本发明的类视黄醇X受体结合性分子由上述式(1)～(5)中任一式表示。
在本发明中，由上述式(1)～(5)表示的化合物还可以为药学上可接受的盐。另外，在由上述式(1)～(5)表示的化合物或其盐中存在有异构体(例如光学异构体、几何异构体和互变异构体)等时，本发明包括这些异构体，并且包括溶剂合物、水合物和各种形状的结晶。
在本发明中，药学上可接受的盐，可以列举药理学和制剂学上可接受的一般的盐。作为这样的盐，具体可以例示以下。
作为碱性加合盐，可以列举例如钠盐、钾盐等的碱金属盐；例如钙盐、镁盐等的碱土金属盐；例如铵盐；例如三甲胺盐、三乙胺盐；二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐等的脂肪族胺盐；例如N、N－二苄基亚乙基二胺等的芳烷基胺盐；例如吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等的杂环芳香族胺盐；例如四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐、甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等的季铵盐；精氨酸盐；赖氨酸盐等的碱性氨基酸盐等。
作为酸加合盐，可以列举例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐等的无机酸盐；例如乙酸盐、丙酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐等的有机酸盐；例如甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等的磺酸盐；例如天冬氨酸盐、谷氨酸盐等的酸性氨基酸等。
本说明书中所使用的用语在单独出现或与其它用语一起出现时具有以下意义。
“烷基”是指碳原子数1～20、优选1～10个的直链状、支链状或环状的烷基，可以列举例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。优选碳原子数1～6个的烷基，可以列举例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基。特别优选碳原子数1～6个的低级烷基。
“烯基”是指在上述“烷基”中具有1个或1个以上的双键的碳原子数2～20个、优选2～8个的直链状或支链状的烯基，可以列举例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、3-甲基-2-丁烯基等。
“炔基”是指在上述烷基中具有1个或1个以上的三键的碳原子数2～20个、优选2～10个的炔基，可以列举例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基等。
“烷氧基”是指碳原子数1～20的直链状或支链(链)状的烷氧基，可以列举例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基、十八烷氧基、烯丙氧基等。优选碳原子数1～6个的直链状或支链状的低级烷氧基。
“酰基”是指烷酰基和芳酰基等。作为该烷酰基，可以列举例如，具有碳原子数1～6个、优选1～4个的烷基的烷酰基(甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基、丁酰基等)。作为芳酰基，可以列举例如，碳原子数7～15个的芳酰基，具体而言，可以列举例如苯甲酰基、萘甲酰基等。
作为在上述式(4)和(5)中以Fluorophore表示的荧光团的示例，可以列举喹啉、喹啉鎓、呫吨、香豆素系色素、丹磺酰基、吡啶鎓、苯并呋咱系色素、荧光素系色素(例如，荧光素，羧基萘并荧光素、四氯荧光素、四溴砜荧光素等)、罗丹明系色素(例如，罗丹明、羧基－X－罗丹明、羧基罗丹明、四乙基罗丹明、四甲基罗丹明、罗丹明红、罗丹明绿等)、以及花青系色素(例如，Cy7、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3其它Cy色素：GE Healthcare)、Alexa Fluor类(例如，Alexa Fluor 790、Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 680、AlexaFluor 647、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor405等：INVITROGEN)、VivoTag(例如，VivoTag S750、VivoTag 680、VivoTag S680、：VisEnMedical)、Atto系色素(例如，Atto 740、Atto 725、Atto 700、Atto 680、Atto 655、Atto647、Atto 637、Atto 635、Atto 633、Atto 620、Atto 611X、Atto 610、Atto 594、Atto 590、Atto 565、Atto 550、Atto 532、Atto 520、Atto 495、Atto 488、Atto 465、Atto 425等：ATTO-TEC GmbH)、BODIPY系色素(例如，BODIPY 493/503、BODIPY 558/568、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、BODIPY-530/550、BODIPY-FL-X、CALFluor系色素(例如，CAL Fluor-Gold 540、CAL Fluor Orange 560、CAL Fluor Red 590、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Red 635等)、级联(Cascade)蓝、俄勒冈绿系色素(例如，Oregon Green 488、Oregon Geen 500、Oregon Green 514等)罗多尔(Rhodol)绿、德克萨斯红等。
如果使用由上述式(1)～(5)中任一式表示的RXR结合性分子，则能够容易地评价评价物质对于RXR的结合能力。具体而言，通过在存在有上述评价物质的水溶液中，测定由于上述结合性分子与RXR结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，能够评价评价物质对于RXR的结合能力。该方法利用了上述RXR结合性分子的荧光强度在水中游离时较大、在与RXR结合而处于疏水性的环境时较小的原理(参照图4)。
如图1所示，本发明的荧光性配体与RXR结合时荧光强度变小，而在其它配体与RXR结合时，荧光性配体游离而荧光强度变大。由此，能够测定其它配体对RXR的结合能力。
另外，也可以优选采用如下的评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力和功能的试验方法，该方法中，将由上述式(1)～(5)中任一项表示的RXR结合性分子和具有荧光团的辅因子肽一起使用。通过该方法能够同时评价评价物质对于RXR的结合能力和RXR的活化能力。
更具体而言，能够通过在存在有上述评价物质的水溶液中，测定由于上述结合性分子与RXR结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于RXR的结合能力，同时，通过测定RXR辅因子肽的荧光偏光度，来评价评价物质对于RXR的功能。荧光偏光度的测定利用了RXR辅因子肽与RXR结合时荧光偏光度较大、游离时荧光偏光度较小的原理。
在图2表示将与RXR结合时荧光强度减少的荧光性rexinoid和荧光性辅因子并用的情况的示意图。如图2所示，在与荧光性激动剂结合的RXR上结合有荧光标记辅激活物的情况下，可以观察到来自荧光激动剂的弱的荧光，并且可以观察到来自荧光标记辅激活物的高偏光度的荧光。而在其它激动剂与RXR结合时，可以观察到来自荧光激动剂的强的荧光，并且可以观察到来自荧光标记辅激活物的高偏光度的荧光。另外，其它拮抗剂与RXR结合时，可以观察到来自荧光激动剂的强的荧光，并且可以观察到来自荧光标记辅激活物的低偏光度的荧光。即，作为荧光标记辅因子仅使用辅激活物(或者辅阻遏物)，能够判断评价化合物是激动剂还是拮抗剂。
此时，优选荧光性RXR结合性分子的激发和荧光波长不与上述辅因子肽的激发和荧光波长重叠。通过它们的波长不重叠，能够进行高精度测定。另外，作为上述试验方法中所使用的辅因子肽，可以使用辅激活物肽和辅阻遏物肽中的任意种。另外，作为辅因子肽，可以使用辅因子部分肽。
包含具有荧光性的RXR结合性分子和具有荧光团的RXR辅因子肽的、用于评价评价物质对于RXR的结合能力和功能的试验试剂盒也有用。
另一方面，作为选自由上述式(1)～(5)表示的化合物的荧光性rexinoid的替代，将与想要作为对象的核受体结合的荧光性配体和具有荧光团的辅激活物组合，由此，能够对于除RXR以外的核受体，同时评价试验化合物对该核受体的结合能力和该核受体的活化能力。即，能够通过在存在有上述评价物质的水溶液中，测定由于上述结合性分子与上述受体结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于上述受体的结合能力，同时，通过测定核受体辅因子肽的荧光偏光度，来评价评价物质对于上述受体的功能。
在将与想要作为对象的核受体结合的荧光性配体和具有荧光团的辅激活物组合的结合试验法中，优选荧光性配体的激发以及荧光波长不与具有荧光团的辅激活物的激发以及荧光波长重叠。另外，包含具有荧光性的核受体结合性分子和具有荧光团的核受体辅因子肽的、用于评价评价物质对于核受体的结合能力和功能的试验试剂盒也是优选的实施方式。
在使用以本发明的化合物为有效成分的医药的情况下，给药量没有特别限定。在并用本发明的化合物来调节类视黄醇的作用的情况下、或者不并用包含类视黄醇的医药而为了生物体内已经存在的视黄酸的作用调节而给药本发明的药剂的情况下等，在各种给药方法中能够容易地选择适当的给药量。例如，在经口给药的情况下，能够将有效成分按照成人每一天0.01～1000mg左右的范围使用。在并用包含类视黄醇作为有效成分的医药和本发明的药剂的情况下，能够在类视黄醇的给药期间中和/或其之前或者之后的期间的任意期间给药本发明的药剂。
在将本发明的化合物作为药剂使用的情况下，可以将选自由上述式(1)～(5)表示的化合物的1种或2种以上直接给药，但优选以包含上述的化合物的1种或2种以上的经口用或者非经口用医药组合物的形式给药。经口用或者非经口用医药组合物能够使用本领域技术人员能够使用的制剂用添加物、即药理学和制剂学上可接受的载体进行制造。例如，也能够将由上述式(1)～(5)表示的化合物的1种或2种以上与对炎症性呼吸系统疾病显示治疗效果的医药配合，作为所谓合剂形式的医药组合物使用。具体而言，还能够与吸入类固醇药、吸入长期间作用性β2刺激药、白三烯受体拮抗剂、经口类固醇药等并用。
作为适合经口给药的医药用组合物，可以列举例如，锭剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、液剂和糖浆剂等，作为适合非经口给药的医药组合物，可以列举例如，注射剂、输液剂、栓剂、吸入剂、滴鼻剂、软膏剂、乳膏剂和贴剂等。作为上述医药组合物的制造中所使用的药理学和制剂学上可接收的载体，可以列举例如，赋型剂、崩解剂或者崩解辅助剂、结合剂、润滑剂、涂敷剂、色素、稀释剂、基剂、溶解剂或者助溶剂、等渗剂、pH调节剂、稳定化剂、喷射剂和粘合剂等。
实施例
以下，具体说明本发明的化合物的制造方法以及荧光物性等。通过对在化合物的制造方法中使用的起始原料和试剂以及反应条件等进行适当修饰或者改变，能够制造包括在本发明范围内的任意化合物。本发明的化合物的制造方法不限定于实施例中具体说明的方法。
[实施例1]目标化合物10的合成
本实施例中的目标化合物10的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000121
1)化合物2的合成
将2,4－二羟基苯甲醛(3.3g、24mmol)溶解于乙酸(24mL)中，经10分钟滴加溴(1.2g、24mmol)后，室温搅拌20小时。之后，利用TLC(薄层色谱，Thin LayerChromatography)板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3、展开两次)确认反应结束。添加水(35mL)，过滤收集所析出的固体，利用水清洗，得到粗结晶(5.3g)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4→1﹕3)，进而进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到淡褐色针状结晶的2(1.5g、28％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ11.25(s,1H),9.70(d,1H,J＝0.5Hz),7.66(s,1H),6.63(s,1H),6.11(s,1H)
2)化合物3a的合成
将化合物2(220mg、1mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中，将二异丙基乙胺(520μL、3.0mmol)、氯甲基甲醚(330μL、4.3mmol)在氩气氛下一边进行冰冷一边添加，之后，室温搅拌27小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(60mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(60mL×2)、饱和盐水(60mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(350mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)，得到白色固体的3a(280mg、92％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.29(s,1H),8.03(s,1H),7.01(s,1H),5.32(s,2H),5.29(s,2H),3.53(s,6H)
3)化合物3b的合成
将化合物2(220mg、1mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中，添加碳酸钾(420mg、3.0mmol)、苄基溴(360μL、3.0mmol)，在氩气氛下以60℃搅拌20小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入水(100mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(460mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10→1﹕3)，得到白色固体的3b(390mg、99％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.31(s,1H),8.05(s,1H),7.42－7.36(m,10H),6.54(s,1H),5.17(s,2H),5.11(s,2H)
4)化合物6的合成
将2,5-二甲基-2,5-己二醇(2.0g、14mmol)溶解于浓盐酸(20mL)中，室温搅拌14小时。过滤收集固体，利用水清洗之后，溶解于二氯甲烷(150mL)中，利用水(50mL)清洗。将有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到白色固体的粗生成物(2.8g)。将所得到的粗生成物和2-溴代甲苯(3.3mL、27mmol)溶解于无水二氯甲烷(30mL)中，将三氯化铝(170mg)分三次添加，氩气氛下室温搅拌20小时。利用TLC板(正己烷)确认反应结束，将反应液利用正己烷(150mL)稀释，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(4.2g)。进行再结晶(甲醇)，得到白色固体的6(3.0g、78％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.42(s,1H),7.14(s,1H),2.34(s,3H),1.65(s,4H),1.25(s,12H)
5)化合物7a的合成
将化合物6(560mg、2.0mmol)溶解于无水四氢呋喃(6.0mL)中，一边在－78℃冷却一边滴加正丁基锂(1.55M正己烷溶液、1.6mL、2.4mmol)。在－78℃搅拌20分钟后，滴加溶解于无水四氢呋喃(0.5mL)中的硼酸三异丙酯(1.4mL、6.0mmol)，在－78℃搅拌2小时。添加2当量盐酸(10mL)，室温搅拌1小时后，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到白色固体的粗生成物(450mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)，得到白色固体的7a(360mg、73％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.28(s,1H),7.21(s,1H),2.81(s,3H),1.72(s,4H),1.34(s,6H),1.32(s,6H)
6)化合物7b的合成
将化合物6(1.6g、5.8mmol)、[1,1-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷加合物(140mg、0.17mmol)、乙酸钾(1.7g、17mmol)、双频哪醇合二硼(1.6g、6.3mmol)悬浮于无水二甲亚砜(20mL)中，在氩气氛、微波照射下、以150℃搅拌90分钟。利用TLC板(正己烷)确认反应结束，将反应液进行硅藻土过滤。将滤液稀释于乙酸乙酯，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色固体的粗生成物(2.3g)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝0﹕1→1﹕50)，得到黄色固体的7b(1.2g、63％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.73(s,1H),7.09(s,1H),2.48(s,3H),1.66(s,4H),1.31(s,12H),1.30(s,6H),1.26(s,6H)
7)化合物8的合成
将化合物3a(150mg、0.50mmol)、7b(200mg、0.60mmol)溶解于甲苯(2.0mL)、乙醇(1.0mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(30mg、0.026mmol)、2当量碳酸钠水(0.5mL)，以100℃搅拌24小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(100mL)、水(100mL)、饱和盐水(100mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(200mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕6)，得到无色油状的8(180mg、86％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.40(s,1H),7.69(s,1H),7.14(s,1H),7.04(s,1H),5.33(s,2H),5.16(s,2H),3.56(s,3H),3.39(s,3H),2.10(s,3H),1.69(s,4H),1.31(s,6H),1.25(s,6H)
8)化合物9的合成
将化合物8(18mg、0.041mmol)溶解于二氯甲烷(2.0mL)中，添加三氟乙酸(200μL)，室温搅拌1小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(16mg)。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(1.0mL)中，添加哌啶(20μL、0.20mmol)、丙二酸二乙酯(22μL、0.14mmol)，在氩气氛下加热回流14小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(50mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(15mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)，得到褐色固体的9(7.0mg、39％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),7.39(s,1H),7.27(s,1H),7.12(s,1H),6.98(s,1H),5.75(s,1H),4.41(q,2H,J＝7.0Hz),2.11(s,3H),1.72(s,4H),1.40(t,3H,J＝7.0Hz),1.33(s,6H),1.27(s,6H)
9)目标化合物10的合成
将化合物9(22mg、0.051mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加2当量氢氧化钠(1.0mL)，室温搅拌7小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗，将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(18mg)。进行再结晶(甲醇)，得到黄色针状结晶的10(15mg、74％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.70(s,1H),7.63(s,1H),7.18(s,1H),7.03(s,1H),6.85(s,1H),2.05(s,3H),1.65(s,4H),1.27(s,6H),1.22(s,6H)
[实施例2]目标化合物23a-c的合成
本实施例中的目标化合物23a-c的合成方案示于以下。
Figure BDA0001681929870000171
1)化合物18的合成
将2,5-二甲基-2,5-己二醇(2.0g、14mmol)溶解于浓盐酸(20mL)中，室温搅拌14小时。过滤收集固体，利用水清洗之后，溶解于二氯甲烷(150mL)中，利用水(50mL)清洗。将有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到白色固体的粗生成物(2.4g)。将所得到的粗生成物和2-溴代苯酚(2.1mL、20mmol)溶解于无水二氯甲烷(30mL)中，添加三氯化铝(170mg)，在氩气氛下室温搅拌3小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10)确认反应结束，将反应液利用乙酸乙酯(150mL)稀释，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色固体的粗生成物(4.4g)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝0﹕1→1﹕10)，进而进行再结晶(正己烷)，得到褐色粉末状的18(2.4g、61％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.34(s,1H),6.95(s,1H),5.25(s,1H),1.65(s,4H),1.25(s,6H),1.24(s,6H)
2)化合物19a的合成
将化合物18(200mg、0.71mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)中，添加氢化钠(油中的纯度60％、44mg、1.1mmol)、碘代甲烷(68μL、1.1mmol)，在氩气氛下以0℃搅拌2小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(220mg)。进行快速柱层析(正己烷)，得到白色固体的19a(200mg、97％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(s,1H),6.79(s,1H),3.87(s,3H),1.66(m,4H),1.28(s,6H),1.24(s,6H)
3)化合物19b的合成
将化合物18(400mg、1.4mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中，添加氢化钠(油中的纯度60％、70mg、1.7mmol)、1-碘代丙烷(170μL、1.7mmol)，在氩气氛下以0℃搅拌2小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(420mg)。进行快速柱层析(正己烷)，得到无色油状的19b(390mg、84％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(s,1H),6.78(s,1H),3.96(t,2H,J＝6.5Hz),1.89-1.80(m,2H),1.67-1.64(m,4H),1.26(s,6H),1.24(s,6H),1.07(t,3H,J＝7.5Hz)
4)化合物19c的合成
将化合物18(400mg、1.4mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中，添加氢化钠(油中的纯度60％、70mg、1.7mmol)、1-溴代戊烷(210μL、1.7mmol)，在氩气氛下以0℃搅拌2小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(490mg)。进行快速柱层析(正己烷)，得到黄色油状的19c(430mg、88％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.41(s,1H),6.78(s,1H),3.98(t,2H,J＝6.5Hz),1.86-1.79(m,2H),1.67-1.64(m,4H),1.50-1.46(m,2H),1.41-1.37(m,2H),1.26(s,6H),1.24(s,6H),0.94(t,3H,J＝7.0Hz)
5)化合物20a的合成
将化合物19a(170mg、0.58mmol)溶解于无水四氢呋喃(2.0mL)中，一边在－78℃冷却一边滴加正丁基锂(1.55M正己烷溶液、0.41mL、0.64mmol)。在－78℃搅拌20分钟后，滴加溶解于无水四氢呋喃(0.5mL)中的硼酸三异丙酯(0.46mL、2.0mmol)，在－78℃搅拌2小时。添加2当量盐酸(5mL)，室温搅拌1小时后，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到白色固体的粗生成物(110mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20→1﹕5)，得到白色固体的20a(100mg、68％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),6.81(s,1H),5.82(br s,2H),3.90(s,3H),1.73-1.64(s,4H),1.30(s,6H),1.29(s,6H)
6)化合物20b的合成
将化合物19b(390mg、1.2mmol)溶解于无水四氢呋喃(3.5mL)中，一边在－78℃冷却一边滴加正丁基锂(1.55M正己烷溶液、0.92mL、1.4mmol)。在－78℃搅拌20分钟后，滴加溶解于无水四氢呋喃(0.5mL)中的硼酸三异丙酯(0.80mL、3.5mmol)，在－78℃搅拌2小时。添加2当量盐酸(5mL)，室温搅拌1小时后，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到白色固体的粗生成物(310mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝0﹕1→1﹕10)，得到白色固体的20b(280mg、80％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),6.79(s,1H),5.85(s,2H),4.03(t,2H,J＝6.5Hz),1.91-1.83(m,2H),1.71-1.64(m,4H),1.29-1.28(m,12H),1.07(t,3H,J＝7.5Hz)
7)化合物20c的合成
将化合物19c(430mg、1.3mmol)溶解于无水四氢呋喃(4.0mL)中，一边在－78℃冷却一边滴加正丁基锂(1.55M正己烷溶液、0.95mL、1.5mmol)。在－78℃搅拌20分钟后，滴加溶解于无水四氢呋喃(0.5mL)中的硼酸三异丙酯(0.92mL、4.0mmol)，在－78℃搅拌2小时。添加2当量盐酸(5mL)，室温搅拌1小时后，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(310mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝0﹕1→1﹕20)，得到白色固体的20c(270mg、71％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),6.79(s,1H),5.80(br s,2H),4.05(t,2H,J＝6.5Hz),1.87-1.82(m,2H),1.68(s,4H),1.49-1.36(m,4H),1.29(m,12H),0.94(t,3H,J＝7.0Hz)
8)化合物21b的合成
将化合物3a(89mg、0.29mmol)、20b(100mg、0.35mmol)溶解于甲苯(1.0mL)、乙醇(0.5mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(17mg、0.010mmol)、2当量碳酸钠水(0.25mL)，在100℃搅拌10小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(50mL)、水(50mL)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(83mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20→1﹕10)，得到白色固体的21b(76mg、56％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.38(s,1H),7.81(s,1H),7.13(s,1H),7.02(s,1H),6.82(s,1H),5.33(s,2H),5.15(s,2H),3.84(t,2H,J＝6.5Hz),3.56(s,3H),3.42(s,3H),1.72-1.67(m,4H),1.65-1.62(m,2H),1.32(s,6H),1.25(s,6H),0.86(t,3H,J＝7.5Hz)
9)化合物21c的合成
将化合物3b(76mg、0.24mmol)、20c(80mg、0.20mmol)溶解于甲苯(1.0mL)、乙醇(0.5mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(12mg、0.010mmol)、2当量碳酸钠水(0.25mL)，在100℃搅拌19小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕6)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(50mL)、水(50mL)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(290mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝0﹕1→1﹕20)，得到白色固体的21c(90mg、76％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.41(s,1H),7.83(s,1H),7.42－7.22(m,10H),7.15(s,1H),6.82(s,1H),6.56(s,1H),5.14(s,2H),5.07(s,2H),3.84(t,2H,J＝6.5Hz),1.72-1.64(m,4H),1.61-1.57(m,2H),1.32(s,6H),1.22-1.20(m,10H),0.81(t,3H,J＝7.0Hz)
10)化合物22a的合成
将化合物3a(78mg、0.25mmol)、20a(80mg、0.30mmol)溶解于甲苯(0.80mL)、乙醇(0.40mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(15mg、0.013mmol)、2当量碳酸钠水(0.20mL)，在100℃搅拌24小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(50mL)、水(50mL)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(110mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)，得到无色油状的粗生成物(82mg)。将所得到的粗生成物溶解于甲醇(2.0mL)中，添加浓盐酸(20μL)，室温搅拌12小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)确认反应结束，将溶剂蒸馏除去，得到粗生成物。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(2.0mL)中，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(110μL、0.75mmol)，在氩气氛下加热回流6小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(48mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)，得到黄色固体的22a(27mg、24％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.47(s,1H),7.19(s,1H),7.05(s,1H),6.97(s,1H),6.96(s,1H),4.41(q,2H,J＝7.0Hz),3.89(s,3H),1.73(s,4H),1.41(t,3H,J＝7.0Hz),1.35(s,6H),1.30(s,6H)
11)化合物22b的合成
将化合物21b(76mg、0.20mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加浓盐酸(40μL)，室温搅拌10小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)确认反应结束，将溶剂蒸馏除去，得到桃色固体的粗生成物。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(2.0mL)中，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(92μL、0.60mmol)，在氩气氛下加热回流14小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(52mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)，得到黄色固体的22b(42mg、54％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.55(s,1H),7.48(s,1H),7.20(s,1H),6.97(s,1H),6.96(s,1H),4.41(q,2H,J＝7.0Hz),4.02(t,2H,J＝6.5Hz),1.79-1.72(m,4H),1.41(t,3H,J＝7.0Hz),1.34(s,6H),1.30(s,6H),0.95(t,3H,J＝7.5Hz)
12)化合物22c的合成
将化合物21c(90mg、0.15mmol)溶解于甲醇(4.0mL)、乙酸乙酯(2.0mL)中，添加10％活化钯炭(催化剂量)，在氢气氛下、室温搅拌24小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10)确认反应结束，将反应液进行硅藻土过滤，之后，将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(58.7mg)。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(1.0mL)中，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(65μL、0.42mmol)，在氩气氛下加热回流24小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(50mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)，得到黄色固体的22c(27mg、35％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(d,1H,J＝0.5Hz),7.48(s,1H),7.47(s,1H),7.19(s,1H),6.97(d,1H,J＝0.5Hz),6.95(s,1H),4.41(q,2H,J＝7.0Hz),4.04(t,2H,J＝6.5Hz),1.74-1.71(m,6H),1.41(t,3H,J＝7.0Hz),1.34-1.30(m,16H),0.90-0.84(m,3H)
13)目标化合物23a的合成
将化合物22a(27mg、0.059mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加2当量氢氧化钠(2.0mL)，室温搅拌5小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(20mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)，得到黄色固体的16a(13mg、53％)。进而进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到黄色针状结晶的23a(8.0mg、32％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(d,1H,J＝0.5Hz),7.60(s,1H),7.26(s,1H),7.19(s,1H),7.08(d,1H,J＝0.5Hz),6.98(s,1H),3.90(s,3H),1.76-1.70(m,4H),1.36(s,6H),1.30(s,6H)
14)目标化合物23b的合成
将化合物22b(42mg、0.088mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加2当量氢氧化钠(2.0mL)，室温搅拌10小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(25mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)，得到黄色固体的23b(15mg、38％)。进而进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到黄色粉末状结晶的23b(7.0mg、18％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(s,1H),7.68(s,1H),7.61(s,1H),7.20(s,1H),7.08(s,1H),6.97(s,1H),4.03(t,2H,J＝6.5Hz),1.80-1.69(m,6H),1.34(s,6H),1.30(s,6H),0.94(t,3H,J＝7.5Hz)
15)目标化合物23c的合成
将化合物22c(27mg、0.053mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加2当量氢氧化钠(2.0mL)，室温搅拌6小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入水(50mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(25mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)，得到黄色固体的23c(20mg、77％)。进而进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到黄色粉末状结晶的23c(17mg、66％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ12.23(br s,1H),8.91(d,1H,J＝0.5Hz),7.71(s,1H),7.61(s,1H),7.20(s,1H),7.08(d,1H,J＝0.5Hz),6.97(s,1H),4.06(t,2H,J＝6.5Hz),1.74-1.70(m,6H),1.33？1.27(m,16H),0.86(t,3H,J＝7.0Hz)
[实施例3]目标化合物30的合成
本实施例中的目标化合物30的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000241
1)化合物25的合成
将百里酚(150mg、1.0mmol)溶解于甲醇(4mL)中，添加硫酸银(370mg、1.2mmol)、碘(300mg、1.2mmol)，室温搅拌6小时。利用(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10)确认反应结束，将反应液倒入饱和硫代硫酸钠水(30mL)中，进行硅藻土过滤，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(270mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕50→1﹕30)，得到黄色固体的25(230mg、85％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.53(s,1H),6.67(s,1H),4.68(s,3H),3.10(sep,1H,J＝7.0Hz),2.33(s,3H),1.22(d,6H,J＝7.0Hz)
2)化合物26的合成
将化合物25(230mg、0.85mmol)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中，添加碳酸钾(150mg、1.1mmol)、2-溴代丙烷(94μL、1.1mmol)、碘化钾(14mg、0.085mmol)，在氩气氛下以60℃搅拌4小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10)确认反应结束，倒入水(80mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(210mg)。进行快速柱层析(正己烷)，得到无色油状的26(190mg、69％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ7.53(s,1H),6.74(s,1H),4.51(sep,1H,J＝6.0Hz),3.20(sep,1H,J＝7.0Hz),2.37(s,3H),1.32(d,6H,J＝6.0Hz),1.16(d,6H,J＝7.0Hz)
3)化合物27的合成
将化合物26(190mg、0.59mmol)溶解于无水四氢呋喃(1.8mL)，一边在－78℃冷却一边滴加正丁基锂(1.55M正己烷溶液、0.45mL、0.70mmol)。在－78℃搅拌20分钟后，滴加溶解于无水四氢呋喃(0.5mL)中的硼酸三异丙酯(0.41mL、1.8mmol)，在－78℃搅拌2小时。添加2当量盐酸(5mL)，室温搅拌1小时后，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(90mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10→1﹕5)，得到白色固体的27(79mg、57％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.15(s,1H),6.73(s,1H),4.68(sep,1H,J＝6.0Hz),3.32(sep,1H,J＝7.0Hz),2.82(s,3H),1.38(d,6H,J＝6.0Hz),1.25(d,6H,J＝7.0Hz)
4)化合物28的合成
将化合物3b(110mg、0.28mmol)、27(79mg、0.33mmol)溶解于甲苯(1.2mL)、乙醇(0.6mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(16mg、0.014mmol)、2当量碳酸钠水(0.30mL)，在100℃搅拌12小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(50mL)、水(50mL)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(150mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20→1﹕10)，得到无色油状的28(1200mg、82％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.43(s,1H),7.71(s,1H),7.39－7.24(m,10H),6.98(s,1H),6.73(s,1H),6.59(s,1H),5.15(s,2H),5.08(s,2H),4.58(sep,1H,J＝6.0Hz),3.30(sep,1H,J＝7.0Hz),2.11(s,3H),1.37(d,6H,J＝6.0Hz),1.20(d,6H,J＝7.0Hz)
5)化合物29的合成
将化合物28(120mg、0.23mmol)溶解于乙酸乙酯(6.0mL)中，添加10％活化钯炭(催化剂量)，在氢气氛下室温搅拌4小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，将反应液进行硅藻土过滤，之后，将溶剂蒸馏除去，得到无色油状的粗生成物。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(2.0mL)中，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(100μL、0.68mmol)，在氩气氛下加热回流11小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(80mL)中，利用乙酸乙酯(40mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(61mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4→1﹕3)，得到黄色固体的29(41mg、42％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),7.37(s,1H),7.00(s,1H),6.96(s,1H),6.82(s,1H),5.63(s,1H),4.63(sep,1H,J＝6.0Hz),4.41(q,2H,J＝7.0Hz),3.30(sep,1H,J＝7.0Hz),2.11(s,3H),1.43-1.38(m,9H),1.20(d,6H,J＝7.0Hz)
6)目标化合物30的合成
将化合物29(41mg、0.096mmol)溶解于甲醇(4.0mL)中，添加2当量氢氧化钠(2.0mL)，室温搅拌3小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用2当量盐酸调成酸性，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(47mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)，得到黄色固体的23(37mg、97％)。进而进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到黄色粉末状结晶的30(28mg、74％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86(d,1H,J＝0.5Hz),7.50(s,1H),7.07(d,1H,J＝0.5Hz),6.99(s,1H),6.83(s,1H),5.86(s,1H),4.63(sep,1H,J＝6.0Hz),3.31(sep,1H,J＝7.0Hz),2.10(s,3H),1.40(d,6H,J＝6.0Hz),1.20(d,6H,J＝7.0Hz)
[实施例4]目标化合物36的合成
本实施例中的目标化合物36的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000271
1)化合物32的合成
将异香草醛(300mg、2.0mmol)溶解于乙酸乙酯(5.0mL)中，添加浓硝酸(380μL、5.0mmol)，室温搅拌2小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，利用乙酸乙酯(100mL)稀释，利用饱和碳酸氢钠水(50mL)、水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(370mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2→2﹕3)，得到黄色固体的32(100mg、26％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.42(s,1H),7.66(s,1H),7.47(s,1H),6.20(s,1H),4.08(s,3H)
2)化合物33的合成
将化合物32(42mg、0.21mmol)溶解于无水二氯甲烷(1.0mL)中，添加三氟甲磺酸酐(39μL、0.23mmol)、无水吡啶(100μL)，室温搅拌13小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入2当量盐酸(20mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)提取。将有机层利用水(30mL×2)、饱和盐水(30mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(59mg)。进行二氧化硅过滤，得到黄色固体的33(58mg、82％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.33(s,1H),7.89(s,1H),7.74(s,1H),4.13(s,1H)
3)化合物34的合成
将化合物33(150mg、0.45mmol)、7b(180mg、0.54mmol)溶解于甲苯(2.0mL)、乙醇(1.0mL)中，添加四(三苯基膦)钯(0)(26mg、0.022mmol)、2当量碳酸钠水(0.45mL)，在100℃搅拌3小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)确认反应结束，稀释于乙酸乙酯(150mL)，利用饱和氯化铵水(100mL)、水(100mL)、饱和盐水(100mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(150mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕25)，得到黄色固体的34(140mg、80％)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.40(s,1H),7.84(s,1H),7.61(s,1H),7.18(s,1H),7.04(s,2H),3.95(s,3H),2.07(s,3H),1.70(s,4H),1.32(s,6H),1.27(s,6H)
4)化合物35的合成
将化合物34(30mg、0.079mmol)溶解于甲醇(6.0mL)中，添加10％活化钯炭(催化剂量)，在氢气氛下室温搅拌30分钟。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)确认反应结束，将反应液进行硅藻土过滤，之后，将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物。将所得到的粗生成物溶解于蒸馏乙醇(1.0mL)中，添加哌啶(20μL)、丙二酸二乙酯(120μL、0.79mmol)，在氩气氛下加热回流30小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝2﹕1)确认反应结束，倒入水(60mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(100mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝3﹕1→5﹕1→1﹕0)，得到黄色油状的35(12mg、34％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ12.24(br s,1H),8.56(s,1H),7.44(s,1H),7.17(s,1H),7.10(s,1H),6.97(s,1H),4.42(q,2H,J＝7.0Hz),3.94(s,3H),2.08(s,3H),1.71(s,4H),1.42(t,3H,J＝7.0Hz),1.33(s,6H),1.28(s,6H)
5)目标化合物36的合成
将化合物35(12mg、0.027mmol)溶解于无水二氯甲烷(1.0mL)中，在0℃添加三溴化硼(1.0M二氯甲烷溶液、14滴)，室温搅拌22小时。倒入水(30mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)提取。将有机层利用水(30mL×2)、饱和盐水(30mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色固体的粗生成物(21mg)。进行再结晶(乙酸乙酯﹕正己烷)，得到淡褐色粉末状结晶的36(5.1mg、45％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ12.14(br s,1H),8.94(s,1H),7.60(s,1H),7.19(s,1H),7.09(s,1H),6.98(s,1H),3.96(s,3H),2.08(s,3H),1.72(s,4H),1.33(s,6H),1.28(s,6H)
[实施例5]目标化合物40的合成
本实施例中的目标化合物40的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000301
1)化合物38的合成
向化合物37(110mg、0.23mmol)、三丁基乙烯基锡(130μL、0.46mmol)、三亚苄基丙酮二钯(11mg、0.012mmol)、三苯基膦(13mg、0.048mmol)中添加无水甲苯(2.0mL)中，在氩气氛下加热回流18小时。利用HPLC(水﹕甲醇＝10﹕90、0.1％甲酸添加)确认反应结束。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕20)，得到褐色油状的38(84mg、93％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.86(dd,1H,J＝2.5,0.5Hz),7.79(dd,1H,J＝9.0,2.5Hz),7.53(s,1H),6.57-6.50(m,2H),5.99(d,1H,J＝9.0Hz),5.63(dd,1H,J＝17.5,1.0Hz),5.10(dd,1H,J＝11.0,1.0Hz),4.20-4.15(m,1H),3.85(s,3H),3.83-3.76(m,1H),3.67(d,2H,J＝6.5Hz),3.35(sep,1H,J＝7.0Hz),2.11(sep,1H,J＝6.5Hz),1.29(t,6H,J＝6.5Hz),1.24(t,3H,J＝7.0Hz),1.05(d,6H,J＝6.5Hz)
2)化合物39的合成
向化合物38(50mg、0.13mmol)、6-溴代喹啉(35μL、0.26mmol)、二氯双三苯基膦钯(2.7mg、0.0038mmol)、碳酸钾(54mg、0.39mmol)中添加无水N、N-二甲基甲酰胺(1.0mL)，在氩气氛下以100℃搅拌48小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，倒入水(50mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)提取。将有机层利用水(30mL×2)、饱和盐水(30mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(71mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4)，得到褐色油状的39(43mg、65％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.92(dd,1H,J＝2.5,0.5Hz),8.83(dd,1H,J＝4.5,2.0Hz),8.09(dd,1H,J＝8.5,1.0Hz),8.00(d,1H,J＝9.0Hz),7.82(dd,1H,J＝9.0,2.5Hz),7.77(dd,1H,J＝9.0,2.0Hz),7.71(d,1H,J＝16.5Hz),7.08(d,1H,J＝16.5Hz),6.60(s,1H),6.10(d,1H,J＝9.0Hz),4.30-4.21(m,1H),3.88-3.82(m,4H),3.70(d,2H,J＝6.5Hz),3.40(sep,1H,J＝7.0Hz),2.14(sep,1H J＝6.5Hz),1.35(d,6H,J＝5.0Hz),1.29(t,3H,J＝7.0Hz),1.07(d,6H,J＝6.5Hz)
3)化合物40的合成
将化合物39(50mg、0.095mmol)溶解于甲醇(2.0mL)、四氢呋喃(1.0mL)中，添加溶解于水(1.0mL)中的水合氢氧化锂(80mg、1.9mmol)，室温搅拌46小时搅拌。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(40mL)中，利用乙酸乙酯(20mL×3)提取。将有机层利用水(30mL×2)、饱和盐水(30mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的40(46mg)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ9.03(dd,1H,J＝2.5,0.5Hz),8.86(dd,1H,J＝4.5,1.5Hz),8.13(dd,1H,J＝8.5,1.0Hz),8.08(d,1H,J＝9.0Hz),7.89(dd,1H,J＝9.0,2.5Hz),7.79(dd,1H,J＝9.0,2.0Hz),7.72(d,1H,J＝2.0Hz),7.70(s,1H),7.39(dd,1H,J＝8.5,4.5Hz),7.18(d,1H,J＝16.5Hz),7.08(d,1H,J＝16.5Hz),6.62(s,1H),6.12(d,1H,J＝9.0Hz),4.27-4.25(m,1H),3.93-3.89(m,1H),3.72(d,2H,J＝6.5Hz),3.41(sep,1H,J＝7.0Hz),2.14(sep,1H J＝6.5Hz),1.36(d,6H,J＝6.5Hz),1.30(t,3H,J＝7.0Hz),1.07(d,6H,J＝6.5Hz)
[实施例6]目标化合物44的合成
本实施例中的目标化合物44的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000321
1)化合物42的合成
将丹磺酰氯(100mg、0.37mmol)悬浮于无水二氯甲烷(1.0mL)中，添加二异丙基乙胺(70μL、0.40mmol)、4-氨基苯乙烯(40μL、0.34mmol)，在氩气氛下室温搅拌24小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水(80mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(40mL×2)、饱和盐水(40mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(150mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10→1﹕4)，得到黄色固体的42(100mg、83％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.49(dt,1H,J＝8.5,1.0Hz),8.32(d,1H,J＝8.5Hz),8.16(dd,1H,J＝7.5,1.5Hz),7.59(dd,1H,J＝8.5,7.5Hz),7.43(dd,1H,J＝8.5,7.5Hz),7.19－7.17(m,3H),6.88(d,2H,J＝6.67(s,1H),6.67(s,1H),6.55(dd,1H,J＝17.5,11.0Hz),5.59(dd,1H,J＝17.5,1.0Hz),5.15(dd,1H,J＝11.0,1.0Hz),2.88(s,6H)
2)化合物43的合成
向化合物42(44mg、0.12mmol)、37(60mg、0.12mmol)、乙酸钯(2.0mg、0.0089mmol)、三甲苯基膦(6.0mg、0.020mmol)、三乙胺(84μL、0.61mmol)中添加无水乙腈(1.0mL)，在氩气氛下加热回流27小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕10→1﹕5)，得到黄色油状的43(16mg、18％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.86(s,1H),8.47(d,1H,J＝8.5Hz),8.35-8.32(m,1H),8.17(dd,1H,J＝7.5,1.0Hz),7.77(dd,1H,J＝9.0,1.5Hz),7.54－7.51(m,2H),7.41(dd,1H,J＝8.5,7.5Hz),7.15(d,2H,J＝7.5Hz),7.10(d,2H,J＝8.5Hz),6.87-6.82(m,3H),6.74(d,1H,J＝16.3Hz),6.53(s,1H),6.01(d,1H,J＝9.0Hz),4.20-4.13(m,1H),3.85(s,3H),3.80-3.72(m,1H),3.66(d,2H,J＝6.0Hz),3.35(sep,1H,J＝7.0Hz),2.85(s,6H),2.11(sep,1H,J＝6.5Hz),1.31-1.26(m,6H),1.21(t,3H,J＝7.0Hz),1.04(d,6H,J＝6.5Hz)
3)目标化合物44的合成
将化合物43(16mg、0.022mmol)溶解于甲醇(5.0mL)中，添加2当量氢氧化钠水(0.5mL)，在65℃搅拌1小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，进行快速柱层析(甲醇﹕二氯甲烷＝1﹕40)，得到黄色固体的44(6mg、39％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.92(d,1H,J＝2.25Hz),8.47(dd,1H,J＝8.5,1.0Hz),8.31(d,1H,J 8.5Hz),8.15(dd,1H,J＝7.5,1.5Hz),7.79(dd,1H,J＝9.0,2.25Hz),7.56－7.54(m,2H),7.41(dd,1H,J＝8.5,7.5Hz),7.16(d,1H,J＝7.5Hz),7.10(d,2H,J＝8.5Hz),6.99(s,1H),6.85-6.82(m,3H),6.73(d,1H,J＝16.5Hz),6.54(s,1H),6.02(d,1H,J＝9.0Hz),4.22-4.15(m,1H),3.81-3.77(m,1H),3.67(d,2H,J＝6.5Hz),3.35(sep,1H,J＝7.0Hz),2.85(s,6H),2.11(sep,1H,J＝6.5Hz),1.29-1.23(m,9H),1.05(d,6H,J＝7.0Hz)
[实施例7]目标化合物48的合成
本实施例中的目标化合物48的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000341
1)化合物46的合成
将化合物45(340mg、1.0mmol)溶解于乙酸酐(5.0mL)、四氢呋喃(5.0mL)中，在冰冷下滴加溶解于乙酸酐(0.6mL)中的浓硝酸(210μL、3.0mmol)，室温搅拌22小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，利用5当量氢氧化钠水调成碱性，室温搅拌30分钟。将反应液倒入冰水(150mL)中，利用2当量盐酸中和，利用乙酸乙酯(100mL×3)提取。将有机层利用水(150mL×2)、饱和盐水(150mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(390mg)。将所得到的粗生成物溶解于无水N,N－二甲基甲酰胺(5.0mL)中，在冰冷下添加三乙胺(210μL、1.5mmol)、氯甲基甲醚(110μL、1.5mmol)，在氩气氛下以0℃搅拌1小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入冰水(100mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×3)提取。将有机层利用水(100mL×2)、饱和盐水(100mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(500mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕8)，得到淡黄色油状的46(400mg、93％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.87(d,1H,J＝2.0Hz),8.03(s,1H),7.95(dd,1H,J＝9.0,2.5Hz),6.67(s,1H),6.22(d,1H,J＝9.0Hz),5.44(s,2H),4.61(sep,1H,J＝6.0Hz),4.34-4.22(m,1H),3.86-3.59(m,1H),3.52(s,3H),3.33(sep,1H,J＝7.0Hz),1.39(d,6H,J＝6.0Hz),1.28-1.26(m,9H)
2)化合物47的合成
将化合物46(400mg、0.92mmol)溶解于乙酸乙酯(15mL)中，添加10％活化钯炭(催化剂量)，在氢气氛下室温搅拌20小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，将反应液进行硅藻土过滤，之后，将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(340mg)。将所得到的粗生成物(26mg、0.06mmol)、7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(16mg、0.06mmol)溶解于无水二氯甲烷(0.5mL)、二异丙基乙胺(20μL、0.11mmol)中，添加1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(17mg、0.09mmol)、1-羟基苯并三唑水合物(14mg、0.09mmol)，在氩气氛下室温搅拌20小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕2)确认反应结束，倒入水(30mL)中，利用乙酸乙酯(15mL×3)提取。将有机层利用水(20mL×2)、饱和盐水(20mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(49mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕4→1﹕2)，得到黄色固体的47(42mg、93％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ10.93(s,6H),8.96(dd,1H,J＝2.5,0.5Hz),8.71(s,1H),8.55(s,1H),7.86(dd,1H,J＝9.0,2.5Hz),7.40(d,1H,J＝9.0Hz),6.65(s,1H),6.63(dd,1H,J＝9.0,2.35Hz),6.43(d,1H,J＝2.35Hz),6.16(d,1H,J＝9.0Hz),5.42(s,2H),4.45(sep,1H,J＝6.0Hz),4.35-4.29(m,1H),3.89-3.83(m,1H),3.51(s,3H),3.43(q,4H,J＝7.0Hz),3.36(sep,1H,J＝7.0Hz),1.34-1.27(m,15H),1.22(t,6H,J＝7.0Hz)
3)目标化合物48的合成
将化合物47(41mg、0.064mmol)溶解于乙酸乙酯(2mL)中，在冰冷下添加4当量盐酸乙酸乙酯(2mL)，在0℃搅拌50分钟。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，将溶剂蒸馏除去，进行再结晶(二氯甲烷﹕正己烷)，得到黄色针状结晶的48(32mg、84％)。
1H-NMR(300MHz,CD3OD)δ10.96(s,1H),8.67(s,1H),8.48(s,1H),8.40-8.38(m,2H),7.57(d,1H,J＝9.0Hz),7.06－7.03(m,2H),6.85(dd,1H,J＝9.0,2.3Hz),6.56(d,1H,J＝2.3Hz),4.63(sep,1H,J＝6.0Hz),4.19-4.09(m,1H),4.02-3.93(m,1H),3.53(q,4H,J＝7.0Hz),3.41(sep,1H,J＝7.0Hz),1.38-1.34(m,9H),1.30(d,6H,J＝7.0Hz),1.23(t,6H,J＝7.0Hz)
[实施例8]目标化合物62的合成
本实施例中的目标化合物62的合成方案示于以下的式。
Figure BDA0001681929870000361
1)化合物57的合成
将1,3-苯二酚(1.1g、10mmol)溶解于无水DMF(10mL)中，添加N,N－二异丙基乙胺(5.2mL，30mmol)、氯甲基甲醚(2.3mL，30mmol)，室温搅拌168小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，倒入饱和氯化铵水溶液(100mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×3)提取。将有机层利用水(80mL×2)、饱和盐水(80mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色油状的粗生成物(3.14g)。进行快速柱层析(正己烷)，得到无色油状的57(1.28g，65％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.19(t,1H,J＝8.2Hz),6.74(d,1H,J＝2.2Hz),6.70(dd,2H,J＝8.2,2.2Hz),5.16(s,4H),3.48(s,6H)
2)化合物58的合成
将化合物57(297mg、1.5mmol)溶解于二乙醚1.5mL中，在0℃添加1.6M的正丁基锂/己烷溶液(1.125mL、1.8mmol)，室温搅拌3小时。之后，在0℃添加硼酸三甲酯(250μL、2.25mmol)，室温搅拌1小时。之后，在0℃添加2N盐酸水溶液而使其酸性化，室温搅拌1小时。将所析出的结晶利用水进行吸滤，得到淡黄色结晶58(177mg、49％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)7.36(t,1H,J＝8.3Hz),7.23(s,2H),6.88(d,2H,J＝8.3Hz),5.30(s,4H),3.51(s,6H)
3)化合物59的合成
向化合物6(113mg、0.4mmol)、化合物58(145mg、0.6mmol)、四三苯基膦钯(69mg、0.06mmol)、磷酸钾(255mg、1.2mmol)中添加二甲氧基乙烷(4mL)、水(1.3mL)，加热回流30分钟。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕3)确认反应结束，倒入水(30mL)中，利用乙酸乙酯(30mL×3)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到褐色的粗生成物(263mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕30)，得到白色固体59(124mg，78％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)7.24(t,1H,J＝8.4Hz),7.13(s,1H),7.05(s,1H),6.89(d,2H,J＝8.4Hz),5.04(d,2H,J＝6.6Hz),4.96(d,2H,J＝6.6Hz),3.27(s,6H),2.07(s,3H),1.68(s,4H),1.55(s,3H),1.30(s,6H),1.23(s,6H)
4)化合物60的合成
将化合物59(108mg，0.27mmol)溶解于乙酸乙酯(2mL)中，添加4N盐酸/乙酸乙酯溶液(2mL)，室温搅拌3小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，倒入水(30mL)中，添加乙酸乙酯(30mL)，利用水(30mL)、饱和盐水(30mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色固体的粗生成物(88mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕8)，得到淡黄色固体60(46mg，54％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)7.31(s,1H),7.17(t,1H,J＝8.1Hz),6.60(d,2H,J＝8.1Hz),4.67(s,2H),2.10(s,3H),1.71(s,4H),1.33(s,6H),1.25(s,6H)
5)化合物61的合成
向N,N－二甲基甲酰胺(350μL)中在0℃添加磷酰氯(100μL)，搅拌1.5小时。向其中滴加溶解于N,N－二甲基甲酰胺(1.5mL)中的化合物60(40mg，0.13mmol)，室温搅拌48小时。利用TLC板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕5)确认反应结束，倒入冰水(30mL)中，利用饱和碳酸氢钠水溶液，将pH调节为2－3，利用乙酸乙酯(50mL×2)提取。将有机层利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到黄色油状的粗生成物(60mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕8)，得到淡黄色固体的61(17mg，39％)。
1H-NMR(300MHz,CDCl3)11.71(s,1H),9.76(s,1H),7.48(d,1H,J＝8.5Hz),7.29(s,1H),7.11(s,1H),6.69(d,1H,J＝8.5Hz),5.61(s,1H),2.11(s,3H),1.70(s,4H),1.32(d,6H,J＝5.3Hz),1.26(d,6H,J＝5.3Hz)
6)目标化合物62的合成
混合化合物61(17mg，0.05mmol)、2,2－二甲基－1,3－二噁烷－4,6－二酮(7.2mg，0.05mmol)、哌啶(50μL)、乙醇(1mL)，加热回流30分钟。利用TL11C板(乙酸乙酯﹕正己烷＝1﹕1)确认反应结束，倒入水(30mL)中，利用乙酸乙酯(50mL×2)清洗，利用2N盐酸水溶液使水层酸性化，利用乙酸乙酯(50mL×2)提取。利用水(50mL×2)、饱和盐水(50mL)清洗。将所得到的有机层利用硫酸镁进行干燥之后，减压下将溶剂蒸馏除去，得到淡黄色固体的粗生成物(29mg)。进行快速柱层析(乙酸乙酯﹕正己烷1﹕3→1﹕0)，得到黄色固体的62(14mg，69％)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)8.92(s,1H),7.69(d,1H,J＝8.6Hz),7.32(s,1H),7.16(d,1H,J＝8.6Hz),7.10(s,1H),5.92(s,1H),2.06(s,3H),1.72(d,4H,J＝8.6Hz),1.35(d,6H,J＝16.4Hz),1.26(d,6H,16.4Hz)
[实施例9]RXR激动剂活性和RXR拮抗剂活性的评价
对于所合成的各化合物，通过萤光素酶报告基因检测法，评价对于RXR的转录活化能力。
1)测定原理
由于大部分核受体为涉及转录调节的转录因子，作为测定其转录活性的方法，进行报告基因分析(reporter gene assay)。向COS－1细胞、HeLa细胞等细胞中，导入RXR受体蛋白质表达质粒和报告质粒。在此，在RXR激动性物质(配体)与受体结合时，配体依赖性地发生转录，下游的萤光素酶开始产生。通过测定该萤光素酶活性，测定RXR激动剂活性。另外，通过测定对于现有的RXR激动剂的拮抗作用，来评价RXR拮抗剂活性。另外，导入分泌型碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒，测定SEAP的活性，由此进行转化效率的修正。
2)宿主细胞的培养
细胞的增殖培养基使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)。首先，将4.75g的DMEM粉末溶解于500mL的超纯水(利用Milli－Q(注册商标)生成)中，进行高压加热灭菌(121℃、20分钟)之后，恢复室温，向其中以成为10％(v/v)的方式添加灭活的胎牛血清(FBS)，进而添加10mL的经高压加热灭菌的10％NaHCO3，之后将使0.292g的L-谷氨酰胺溶解于8mL的超纯水而得到的物质过滤灭菌后添加，从而制备。
关于各细胞的传代，除去在100mm培养皿培养的细胞的培养上清液，通过胰蛋白酶处理回收细胞，以1500rpm离心分离3分钟后，添加增殖培养基使细胞分散，向100mm培养皿添加经细胞分散的增殖培养基15mL，在37℃、5％CO2气氛下培养。
使用EffecteneTM Transection Reagent(QIAGEN社)进行转化。作为RXR的阳性对比使用LGD1069。这些以DMSO溶解后的物质为储备溶液，在分析板上进行计测。
3)转录活性的测定
(第1天)向60mm培养皿中，与增殖培养基5mL一同，接种COS－1细胞50×104cells，培养一夜。
(第2天)通过使用EffecteneTM Transection Reagent(QIAGEN社)的脂质转染法进行转化。转化中使用受体蛋白质表达质粒1μg、报告质粒4μg、SEAP表达质粒1μg。
(第3天)16～18小时后，除去培养上清液，通过胰蛋白酶处理回收细胞，以1500rpm离心分离3分钟后，添加增殖培养基使细胞分散，以成为20×104cells/well的方式在96孔的白板接种。之后，以DMSO浓度为1％的方式添加各化合物。
(第4天)24小时后，使用上清液25μL进行SEAP测定，使用剩余的细胞液进行萤光素酶活性测定。
SEAP测定按照Methods in molecular biology，63，pp.49－60，1997/BD GreatEscAPe SEAP User manual(BD bioscience)所述的方法进行。
具体而言，通过以下方法测定。向上述第4天的上清液25μL添加稀释用缓冲液25μL后，在65℃孵育30分钟。之后恢复室温，添加分析用缓冲液(7μL)、10×MUP(0.3μL)、稀释用缓冲液(2.7μL)，在暗室以室温孵育60分钟。之后，使用微孔板检测仪(Infinite 200、TECAN社制)，利用激发波长360nm、荧光波长465nm测定荧光强度。
通过以下方法制备分析用缓冲液。将L-高精氨酸(0.45g)和氯化镁(0.02g)溶解于50mL的超纯水(利用Milli－Q(注册商标)生成)中，添加二乙醇胺(21mL)。之后，使用盐酸将pH调节为9.8，之后，使用超纯水定容以使总量成为100mL，将其在4℃保存。
通过以下方法制备稀释用缓冲液。将氯化钠(4.38g)和三羟甲基氨基甲烷(TrisBase)(2.42g)溶解于90mL的超纯水(利用Milli－Q(注册商标)生成)中。之后，使用盐酸将pH调节为7.2，制作5倍浓度稀释用缓冲液，将其在4℃保存。通过在即将使用之前将其进行5倍稀释而制作稀释用缓冲液。
将4-甲基伞形酮磷酸酯以成为25mM的方式溶解于超纯水(利用Milli－Q(注册商标)生成)中，将使其在－20℃保存的物质作为10×MUP。
关于萤光素酶活性，用NUNC社制96孔白板，利用微孔板检测仪(Infinite 200、TECAN社制)测定与发光基质(Steady－Glo(注册商标)Luciferase Assay System、Promega社制)的反应产物的发光强度。
4)测定结果
将上述测定结果示于图3。
将使作为阳性对比的蓓萨罗丁1μM反应时的转录活性设为1，研究相对活性并将结果示于图3A。其结果，对于化合物10、23a、23b、30确认到RXR激动剂活性。另外，在作为RXR激动剂的NEt－TMN的存在下添加化合物44的结果示于图3B。其结果，对于化合物44确认到RXR拮抗剂活性。另外，通过同样进行试验，对于化合物23c、49确认到RXR拮抗剂活性。
[实施例10]制造出的化合物的荧光物性
对于所合成的化合物，评价在甲醇中、氯仿中的激发极大波长、荧光极大波长。测定中利用日立F－4500形分光荧光光度计，使用四面透明石英比色皿(光路长1cm)，在激发、荧光狭缝10nm、光电倍增管电压700V进行。测定结果示于以下的表2。
[表1]
Figure BDA0001681929870000411
[实施例11]化合物10在各种溶剂中的荧光强度
对于化合物10，在水中、甲醇中、乙腈中、氯仿中、环己烷中测定激发波长340nm、荧光波长465nm下的荧光强度。测定利用Tecan SPARK 10M，使用Greiner社制96孔半区黑色板，在激发、荧光带宽20nm下进行。测定结果示于图4。测定结果为有机溶剂中的荧光强度比水中的荧光强度减弱。
[实施例12]利用荧光强度测定进行的化合物10的RXR结合的监测
RXR蛋白质存在下的荧光强度测定的缓冲液设为20mM的tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油。测定利用Tecan Infinite200F，使用Greiner社制384孔小体积黑色板，以激发波长360nm、荧光波长465nm、激发、荧光带宽35nm进行。每1孔的样品量设为20μL。关于RXRα蛋白质，将Active Motif社制的配体结合域(LBD)以100nM(图5A)或者将全长RXRα以3μM(图5B)使用。使化合物10的浓度变化而进行溶液制备，室温孵育2小时，标绘自化合物10单独时的荧光强度的减少量。另外，同样标绘使10μM的蓓萨罗丁与其共存时的荧光强度的减少量。其中，在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。
其结果，如图5所示，由于RXRα蛋白质的存在而导致10的荧光强度减弱，通过与蓓萨罗丁共存而恢复荧光强度。通过从化合物10和RXRα蛋白质存在时的标绘值减去蓓萨罗丁共存时的标绘值，由此标绘由于化合物10与RXRα蛋白质的特异性结合导致的荧光强度的变化。使用RXRα－LBD，由所得到的特异性结合的标绘值通过最小二乘法计算出化合物10对于RXRα蛋白质的结合解离常数(Kd)为87nM。
[实施例13]使用化合物10的RXR配体的RXR结合能力的评价
使用化合物10的RXR配体的RXR结合能力评价中的荧光强度测定的缓冲液设为20mM的tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油。测定利用Tecan Infinite200F，使用Greiner社制384孔小体积黑色板，以激发波长360nm、荧光波长465nm、激发、荧光带宽35nm进行。每1孔的样品量设为20μL。关于RXRα蛋白质(配体结合域(LBD))，将Active Motif社制的物质以100nM使用，10以100nM使用，作为试验化合物使用RXR激动剂蓓萨罗丁、CBTF－PMN、RXR拮抗剂PA452、作为具有RXR激动性的环境激素的三丁基氯化锡。溶液制备后，室温孵育2小时，测定荧光强度，进行标绘。其中，在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。
其结果，如图6所示，任意的RXR配体均浓度依赖性地恢复10的荧光强度。
从各标绘值通过最小二乘法求出EC50值，通过Cheng－Prusoff式(Ki＝EC50/(1+([化合物10浓度]/Kd)))求出结合阻碍常数(Ki)。结果示于下表。
[表2]
试验化合物 Ki值
蓓萨罗丁 151nM
CBTF-PMN 73nM
PA452 108nM
三丁基氯化锡 27nM
[实施例14]利用荧光强度测定进行的化合物44的RXR结合的监测
RXR蛋白质存在下的荧光强度测定的缓冲液设为20mM的tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油。测定利用Tecan SPARK 10M，使用Thermofischer社制384孔黑色板，以激发波长330nm、荧光波长560nm、激发、荧光带宽20nm进行。每1孔的样品量设为20μL。化合物44设为30nM，关于RXRα蛋白质(配体结合域(LBD))将Active Motif社制的物质变化浓度而制备溶液，室温孵育2小时，标绘荧光强度。另外，还同样标绘使其与1μM的蓓萨罗丁共存时的荧光强度。其中，在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。
其结果，如图7所示，由于RXRα蛋白质的浓度上升而导致化合物44的荧光强度增大，通过使蓓萨罗丁共存而使荧光强度减少。
[实施例15]使用化合物44进行的RXR配体的RXR结合的检测
RXR蛋白质存在下的荧光强度测定的缓冲液设为20mM的tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油。测定利用Tecan SPARK 10M，使用Thermofischer社制384孔黑色板，以激发波长330nm、荧光波长560nm、激发、荧光带宽20nm进行。每1孔的样品量设为20μL。化合物44设为30nM，关于RXRα蛋白质(配体结合域(LBD))，将Active Motif社制的物质以100nM、试验化合物以1μM进行溶液制备，室温孵育2小时，之后，测定荧光强度。其中，在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。
其结果，如图8所示，由于作为RXR配体的、蓓萨罗丁、NEt－3IB、NEt－SB的存在，化合物44的荧光强度减少，检测到RXR配体与RXR结合。
[实施例16]组合使用化合物10的结合评价和使用荧光标记辅激活物的RXR活化能力评价的复合分析
通过测定荧光素标记辅激活物肽(荧光素－PGC1a)的荧光偏光度，能够测定辅激活物向RXR的聚集(recuit)、即RXR向活化型结构的变化。通过组合使用化合物10的结合试验和使用荧光素－PGC1a的活化能力试验，如图2所示，能够同时评价试验化合物对于RXR的结合能力和RXR活化能力。
化合物10的荧光强度测定和荧光素－PGC1a的荧光偏光度测定中的缓冲液设为20mM的tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油。测定利用Tecan Polarion，使用Greiner社制384孔小体积黑色板，化合物10的荧光测定以激发波长360nm、荧光波长465nm进行，荧光素－PGC1a的荧光偏光测定以激发波长485nm、荧光波长535nm进行。每1孔的样品量设为20μL。全长RXRα蛋白质使用3μM、10使用3μM、荧光素－PGC1a使用30nM，作为试验化合物，将RXR激动剂蓓萨罗丁、RXR拮抗剂PA452分别使用10μM。溶液制备后，室温孵育2小时，测定化合物10的荧光强度和荧光素－PGC1a的荧光偏光度。其中，在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。
其结果，任意的RXR配体均恢复10的荧光强度(图9A)。另一方面，荧光素－PGC1a的荧光偏光度在作为RXR激动剂的蓓萨罗丁中上升，相对于此，在作为RXR拮抗剂的PA452中减少(图9B)。其中，显著差异检验通过one－way ANOVA(Bonferroni法)进行(＊＊:p＜0.01)。
[实施例17]化合物10的小鼠经口给药时的血液迁移性
将化合物10以30mg/kg向ICR小鼠(雄性、6周龄、每一组5只)经口给药，在经口给药0.5、1、3和6小时后实施采血，测定血药浓度。使用通过下述实验方法准备的样品进行血药浓度测定。对绝食的6周龄雄性ICR小鼠实施经口给药，在每1、3和6小时，将各小鼠在醚麻醉下实施安乐死，之后进行采血。将采血血液以4℃、4400g进行离心分离，采取100μL上清液。向其中添加100μL冰冷5mM乙酸铵水溶液(利用乙酸调节为pH5.0)，再添加乙酸乙酯1mL后，利用VORTEX(注册商标)搅拌30秒钟，分取其上清液800μL。减压下使溶剂蒸发，向其中添加100μL的HPLC用甲醇。对其中的30μL，利用液相层析系统(SCL-10AD、岛津制作所)和HPLC(Inertsil(注册商标)、ODS－3柱(4.6i.d.x250mm、5μm)、GLSciences)，作为溶剂使用甲醇﹕水﹕乙酸＝90﹕9﹕1(v/v)，在0.7mL/min的流速、激发波长350nm、荧光波长450nm下进行测定。通过所得到的峰面积，定量样品量。
其结果，如图10所示，给药0.5小时后达到大约3μM的血药浓度。另外，观测到时间依赖性地从血液中消失。
[实施例18]化合物10的低容量下的小鼠经口给药时的血药浓度测定
将化合物10以10、3和1mg/kg向ICR小鼠(雄性、6周龄、每一组4－5只)经口给药，经口给药1小时后实施采血，测定血药浓度。使用通过下述实验方法准备的样品进行血药浓度测定。对绝食的6周龄雄性ICR小鼠实施经口给药，在1小时后，将各小鼠在醚麻醉下实施安乐死，之后进行采血。将采血血液以4℃、4400g进行离心分离，采取100μL上清液。向其中添加100μL冰冷5mM乙酸铵水溶液(利用乙酸调节为pH5.0)，再添加乙酸乙酯1mL后，利用VORTEX(注册商标)搅拌30秒钟，分取800μL其上清液。减压下使溶剂蒸发，向其中添加100μL的HPLC用甲醇。对其中的30μL，利用液相色谱系统(SCL-10AD、岛津制作所)和HPLC(Inertsil(注册商标)、ODS－3柱(4.6i.d.x250mm、5μm)、GLSciences)，作为溶剂使用甲醇﹕水﹕乙酸＝90﹕9﹕1(v/v)，在0.7mL/min的流速、激发波长350nm、荧光波长450nm下进行测定。通过所得到的峰面积，定量样品量。
其结果，如图11所示，在EC50附近的浓度下也能够测定血药浓度。
[实施例19]LPS刺激下对于NFκB转录活性的抑制活性试验
将由Novus biologicals购买的NFκB/EAPorter RAW Cell Line调成56×104cells/mL，以90μL/well接种在96孔透明板(5×104cells/well)，在37℃、5％CO2进行培养。在其第二天，将被验化合物的稀释调整溶液和LPS(最终浓度1ng/mL)各添加10μL/well，使总量成为100μL/well，在37℃、5％CO2培养。在添加被验化合物的稀释调整溶液和LPS的24小时后，将培养上清液25μL分注在96well白色板，利用荧光板分析仪测定SEAP活性。通过比较相对于不添加被验化合物的LPS添加孔的SEAP活性的、被验化合物/LPS添加孔的SEAP活性，计算被验化合物对于NFκB转录活性的抑制活性。
在图12示出结果。图中，斜线部分表示以添加LPS时的未添加被检化合物时的SEAP活性为100％的相对SEAP活性。涂白色的部分表示未添加LPS且未添加被检化合物时的相对SEAP活性，涂黑色的部分表示添加LPS且添加各浓度被检化合物时的相对SEAP活性。如图所示，通过添加作为被检化合物的化合物10，抑制SEAP活性，显示对于NFκB的抑制活性。
[实施例20]利用荧光强度测定进行的化合物62的RXR结合的监测
进行化合物62的RXR蛋白质非存在下和存在下的荧光强度测定。实验中，将包括20mM tris-盐酸(pH7.5)、150mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸、5mM二硫苏糖醇、10％甘油的溶液用作缓冲液，使用Greiner社制384孔小体积黑色板，每1孔的样品量设为20μL，将化合物62的最终浓度设为10μM，RXRα－LBD使用100nM。在任意情况下，用作化合物的助溶剂的二甲亚砜浓度均设为1％。测定中使用Tecan Infinite200F，以激发波长360nm、荧光波长465nm、激发、荧光带宽35nm进行。
实验结果示于图13。其结果，由于RXRα蛋白质的存在导致化合物10的荧光强度减弱，示出对于RXR的结合。

Claims (11)

1.一种具有荧光性的类视黄醇X受体结合性分子，其由下述式(1)～(3)中任一式表示，
Figure FDA0002822448280000011
式(1)中，R1为甲基或者碳原子数1～20的直链状或支链状的烷氧基；
R2为羟基、碳原子数1～20的直链状或支链状的烷氧基或烷基氨基，所述烷基氨基中的烷基是指碳原子数1～20的直链状、支链状或环状的烷基；
A为N或CH；
B为NH或O，
Figure FDA0002822448280000012
式(2)中，R1、R2、A和B的含义与式(1)中相同，
Figure FDA0002822448280000013
式(3)中，R1、R2、A和B的含义与式(1)中相同；
R3为异丙基或叔丁基；
R4为异丙基或异丁基。
2.如权利要求1所述的结合性分子，其特征在于：
由所述式(1)表示。
3.如权利要求1所述的结合性分子，其特征在于：
由所述式(2)表示。
4.如权利要求1所述的结合性分子，其特征在于：
由所述式(3)表示。
5.一种使用权利要求1～4中任一项所述的结合性分子来评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力的试验方法。
6.如权利要求5所述的试验方法，其特征在于：
通过在存在有所述评价物质的水溶液中，测定由于所述结合性分子与类视黄醇X受体结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于类视黄醇X受体的结合能力。
7.一种评价评价物质对于核受体的结合能力和功能的试验方法，其特征在于：
将具有荧光性的核受体结合性分子和具有荧光团的核受体辅因子肽一起使用，所述结合性分子为权利要求1～4中任一项所述的结合性分子。
8.如权利要求7所述的试验方法，其特征在于：
所述结合性分子的激发和荧光波长不与所述辅因子肽的激发和荧光波长重叠。
9.如权利要求7或8所述的试验方法，其特征在于：
通过在存在有所述评价物质的水溶液中，测定由于所述结合性分子与所述受体结合而导致的该结合性分子的荧光强度的减少量，来评价评价物质对于所述受体的结合能力，同时，通过测定核受体辅因子肽的荧光偏光度，来评价评价物质对于所述受体的功能。
10.一种用于评价评价物质对于核受体的结合能力和功能的试验试剂盒，其特征在于，包含：
具有荧光性的核受体结合性分子和具有荧光团的核受体辅因子肽，所述结合性分子为权利要求1～4中任一项所述的结合性分子。
11.一种包含权利要求1～4中任一项所述的结合性分子作为有效成分的医药组合物。
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