JP7008339B2 - ペプチダーゼ活性検出用赤色蛍光プローブ - Google Patents
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Description
<1>以下の式(I)で表される化合物又はその塩:
〔式中、Aは、チオフェン環、シクロペンテン環、シクロペンタジエン環、及びフラン環よりなる群から選択される環構造を表し;
Xは、C0-C3アルキレン基を表し;
Yは、O、S、C(=O)O、又はNHを表し、
Zは、O、C(Ra)(Rb)、Si(Ra)(Rb)、Ge(Ra)(Rb)、Sn(Ra)(Rb)、Se、P(Rc)、又はP(Rc)(=O)を表し(ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Rcは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す);
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される1~3個の同一又は異なる置換基を表し;
R3は、アミノ酸由来のアシル残基を表し(ここで、該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からOH基を除去した残基である);
R4及びR5は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す(ここで、R4又はR5がアルキル基である場合、R2と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい)。〕;
<2>Aがチオフェン環である、上記<1>に記載の化合物又はその塩;
<3>Yが、Oである、上記<1>に記載の化合物又はその塩;
<4>Zが、Si(Ra)(Rb)又はC(Ra)(Rb)である、上記<1>に記載の化合物又はその塩;
<5>R3が、グルタミン酸残基である、上記<1>に記載の化合物又はその塩;
<6>R1、R2、R4及びR5が、いずれも水素原子である、上記<1>に記載の化合物又はその塩;及び
<7>式(I)で表される化合物が以下に示す群から選択される化合物である、上記<1>に記載の化合物又はその塩;
を提供するものである。
<8>上記<1>~<7>のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む、ペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ;
<9>
上記<8>に記載のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを含む、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット;
<10>前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)、又はカルパインである、上記<9>に記載のキット;及び
<11>前記標的細胞が、癌細胞である、上記<9>に記載のキット
を提供するものである。
<12>上記<1>~<7>のいずれかに記載の化合物又はその塩を用いて、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出又は可視化する方法;
<13>前記化合物又はその塩と前記標的細胞とを生体外において接触させる工程;及び、前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、上記<12>に記載の方法;
<14>蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を観測することを含む、上記<13>に記載の方法;
<15>前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)、又はカルパインである、上記<12>に記載の方法;
<16>前記標的細胞が、癌細胞である、上記<12>に記載の方法;及び
<17>特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するための、上記<1>~<7>のいずれかに記載の化合物又はその塩の使用;
<18>標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと上記<1>~<7>のいずれかに記載の化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段を備える、装置;及び
<19>前記装置が内視鏡又はin vivo蛍光イメージング装置である、上記<18>に記載の装置
を提供するものである。
以下、本発明のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブにおける蛍光発光機構について説明する。
の種類及び当該キサンテン骨格に連結する環状構造Aの種類を調整することで、スピロ環の開環による蛍光発光を、蛍光ピーク波長が600nm近傍の赤色領域の蛍光とすることができるという特徴を有するものである。これにより、従来は困難であったリンパ節転移などの生体深部に存在するがん細胞等の可視化が可能となる。
かかる発光機構に従い、本発明の蛍光プローブを用いて特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を特異的に検出又は可視化することができる。具体的には、
A)蛍光プローブと標的細胞とを生体内又は生体外において接触させる工程;及び、
B)前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記蛍光プローブとの反応による蛍光応答を観測する工程
を含むことによって、特定のペプチダーゼを発現している標的細胞のみを特異的に近赤外の蛍光シグナルとして検出又は可視化することができる。なお、本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。
別の態様において、本発明は、式(1)の化合物を含む蛍光プローブと、標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼとの反応による蛍光応答を観測するための蛍光イメージング手段を備える、装置にも関する。
以下に示す反応に用いる有機溶媒は、すべて脱水グレードのものを用いた。市販の原料は試薬メーカー(Aldrich Chemical Co. Ltd.、東京化成工業株式会社、和光純薬株式会社、株式会社同仁化学研究所)より購入した。
A: 精製水(0.1% トリフルオロ酢酸を含む)
B: アセトニトリル(20%精製水を含む)
化合物4は、文献(O'Sullivan, S., Doni, E., Tuttle, T. and Murphy, J. A., Angew. Chem., 2014, 53, 474-478)に従って合成した。
ビルスマイヤー試薬(7.4g、57.7mmol)を無水DMF(40mL)に溶解し、混合物を0℃でAr雰囲気下で撹拌した。次に、化合物4(10.0g、10.9mL、57.7mmol)を加え、室温で20時間撹拌を続けた。飽和NaHCO3水溶液を添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から2/1)により精製し、無色液体の化合物5を得た(9.14g、79%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ3.99 (d, 4H, J = 5.6 Hz), 5.12-5.20 (m, 4H), 5.79-5.87 (m, 2H), 6.69 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.69 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 9.71 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ52.8, 111.5, 116.8, 125.7, 132.1, 132.3, 153.3, 190.3.
化合物5(8000mg、39.7mmol)を無水メタノール(50mL)に溶解し、0℃で撹拌した。 ナトリウムテトラヒドロボレート(1654mg、43.7mmol)を加え、室温で4時間撹拌を続けた。H2Oを添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 2/1から1/1)で精製し、無色液体の化合物6得た(7450mg、92%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ3.92 (d, 4H, J = 4.0 Hz), 4.53 (s, 2H), 5.14-5.19 (m, 4H), 5.80-5.89 (m, 2H), 6.67 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.19 (d, 2H, J = 9.2 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ52.9, 65.4, 112.4, 116.1, 128.7, 128.8, 133.9, 148.5.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 204.13884, Found, 204.13520 (-3.64 mmu).
化合物2(2522mg、10.0mmol)および化合物6(2030mg、10.0mmol)を無水CH2Cl2(20mL)に溶解し、0℃で撹拌した。三フッ化ホウ素エチルエーテル錯体(2.5mL、20.0mmol)を加え、室温で22時間撹拌を続けた。反応を飽和NaHCO3水溶液で終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から8/2)により精製し、無色液体の化合物7を得た(3870mg、88%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ3.85-3.90 (m, 10H), 5.12-5.19 (m, 8H), 5.77-5.90 (m, 4H), 6.55 (dd, 1H, J = 8.4 Hz, 2.8 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.87 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.93 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.4 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ39.7, 52.8, 52.9, 111.8, 112.5, 116.0, 116.1, 116.3, 125.5, 128.4, 128.6, 129.6, 131.1, 133.6, 134.4, 147.1, 148.1
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15924, 439.15719, Found, 437.16055, 439.15909 (+1.32 mmu, +1.90 mmu)
Arを充填した乾燥フラスコに、化合物7(1800mg、4.1mmol)および無水THF(15mL)を添加した。混合物を-78℃に冷却し、1M sec-BuLi(4.1mL、4.1mmol)を加え、さらにアセトン(0.6mL、8.2mmol)を添加した。混合物を室温で3時間撹拌した。H2Oを添加し反応を終了させ、混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から8/2)で精製し、無色固体の化合物8を得た(1073mg、63%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.60 (s, 6H), 1.76 (s, 1H), 3.87-3.91 (m, 8H), 4.16 (s, 2H), 5.11-5.22 (m, 8H), 5.79-5.92 (m, 4H), 6.56 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.61 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 6.82 (s, 1H), 6.93-6.97 (m, 3H).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ31.8, 38.0, 53.0, 53.2, 74.3, 110.2, 111.3, 112.6, 116.0, 116.2, 126.5, 129.4, 130.9, 134.0, 134.4, 134.6, 146.6, 146.9, 146.9.
化合物8(8900mg、21.4mmol)を95% H2SO4(10mL)に溶解し、0℃で10分間攪拌した。飽和NaHCO3水溶液を添加し反応を終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。 有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。その後、残渣をアセトニトリル(120mL)に溶解し、0℃で攪拌した。 KMnO 4(10128mg、64.1mmol)を少しずつ加えた。 混合物を室温で2時間撹拌し、メタノールを添加し反応を終了させた。混合物をセライトで濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2/メタノール= 100 / 0から97 / 3)で精製することにより、淡黄色固体の化合物9を得た(1420mg、16%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.63 (s, 6H), 4.02 (d, 8H, J = 2.8 Hz), 5.20-5.23 (m, 8H), 5.84-5.93 (m, 4H), 6.72 (dd, 2H, J = 2.0 Hz, 8.8 Hz), 6.76 (d, 2H, J = 2.0 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.8 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ33.6, 38.1, 53.0, 108.5, 111.1, 116.6, 120.3, 129.2, 133.3, 151.8, 152.3, 181.1.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 413.25929, Found, 413.25696(-2.23mmu)
化合物11は、文献(S. Gao, Z. Wu, F. Wu, A. Lin, H. Yao, Adv. Synth. Catal. 2016, 358, 4129)に従って合成した。
化合物11(1000mg、4.9mmol)を無水THF(20mL)に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート(278mg、7.4mmol)を加え、室温で22時間撹拌した。反応を1N HCl水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から7/3)により精製し、無色液体の化合物12を得た(714mg、71%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.49 (d, 3H, J = 6.8 Hz), 2.43 (d, 1H, J = 4.4 Hz), 4.91-4.97 (m, 1H), 7.23 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 3.6 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ23.4, 66.0, 109.9, 121.3, 123.7, 145.2.
化合物12(1077mg、5.23mmol)、tert-ブチルジメチルクロロシラン(2366mg、15.7mmol)およびイミダゾール(2136mg、31.4mmol)を無水DMF(12mL)に溶解した。当該溶液をAr雰囲気下、室温で4時間撹拌した。混合物を塩水からn-ヘキサンで抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10/0から9/1)で精製して、無色液体の化合物13を得た(1384mg、82%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.01 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0.90 (s, 9H), 1.41 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 4.91 (q, 1 H, J = 6.0 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.26 (d, 1H, J = 3.6 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -4.86, -4.82, 18.3, 25.6, 25.9, 67.5, 108.9, 121.2, 123.1, 146.5.
rを充填した乾燥フラスコに、化合物13(546mg、1.7mmol)および無水THF(12mL)を添加した。混合物を-85℃に冷却し、1M sec-BuLi(1.6mL、1.7mmol)を加えた。そこに、化合物9(140mg、0.34mmol)の無水THF(4mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。2N HCl水溶液で反応を終了させた。混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:
A / B = 80/20(0分)- 0/100(30分)、直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20,0.1%TFA)。暗紫色の固体の化合物14を得た(137mg、77%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.23 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 1.69 (s, 3H), 1.74 (s, 3H), 4.28-4.32 (m, 8H), 4.46 (q, 1H, J = 6.0 Hz), 5.26 (d, 4H, J = 17.6 Hz), 5.28 (d, 4H, J = 10.4 Hz), 5.89-5.97 (m, 4H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ23.3, 32.0, 33.7, 41.6, 53.5, 64.5, 111.7, 111.7, 113.4, 113.4, 116.6, 121.3, 121.4, 122.1, 126.8, 131.4, 134.2, 137.7, 138.0, 147.4, 156.4, 156.4, 157.2, 161.8.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 523.27831, Found, 523.27729 (-1.02 mmu)
化合物14(125mg、0.24mmol)をメタノール(20mL)に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート(18mg、0.48mmol)を加え、室温で15分間で撹拌を続けた。反応を飽和NaHCO 3水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣を脱水CH2Cl2(20mL)に溶解し、1,3-ジメチルバルビツール酸(186mg、1.19mmol)およびPd(PPh3)4(58mg、0.05mmol)を加えた。この溶液を35℃、Ar雰囲気下で14時間攪拌した。次にクロラニル(118mg、0.48mmol)を加え、室温で30分間撹拌を続けた。混合物を2N NaOH水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:A / B = 80/20(0分)から0/100(60分)、直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1%TFA)で溶出した。紫色固体の化合物15を得た(51mg、58%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.23 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 1.66 (s, 3H), 1.71 (s, 3H), 4.46 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 6.62 (dd, 2H, J = 9.2 Hz, 3.2 Hz), 7.12 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.13 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.16 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 9.2 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 3.2 Hz), 7.63 (d, 1H, J = 3.2 Hz).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ23.4, 31.5, 33.4, 41.0, 64.6, 112.6, 112.7, 114.6, 114.6, 120.7, 120.9, 121.9, 126.5, 134.4, 138.5, 138.8, 147.4, 157.9, 159.3, 159.4, 161.4.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 363.15311, Found, 363.15147 (-1.64 mmu)
化合物15(31mg、0.085mmol)、boc-Glu-OtBu(13mg、0.043mmol)およびN、N-ジイソプロピルエチルアミン(110mg、0.85mmol)を無水DMF(2mL)に溶解し、室温で撹拌した。HATU(16.2mg、0.043mmol)を加え、撹拌を2時間続けた。混合物を蒸発させ、残渣をCH2Cl2(5mL)およびトリフルオロ酢酸(5mL)に溶解し、40℃で1時間攪拌した。 その後、混合物を蒸発させた。 残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:A / B = 80/20(0分)~0 / 100(45分)、直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1%TFA)で溶出した。橙色固体の化合物16を得た(11mg、52%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ1.24-1.30 (m, 3H), 1.71 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 2.20-2.32 (m, 2H), 2.75 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 4.05 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 4.42-4.50 (m, 1H), 6.83 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7.20-7.34 (m, 2H), 7.42-7.52 (m, 2H), 7.59 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.66 (t, 1H, J = 3.2Hz), 8.26 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ22.9, 23.3, 25.4, 31.1, 31.1, 32.2, 33.1, 41.3, 52.4, 64.4, 64.6, 115.2, 115.3, 116.9, 117.0, 117.8, 118.0, 118.1, 122.4, 122.6, 124.5, 124.6, 125.8, 125.9, 127.3, 127.3, 133.7, 134.0, 134.4, 134.8, 141.8, 142.2, 145.4, 145.4, 147.1, 147.5, 152.6, 160.8, 161.1, 161.8, 163.4, 163.5, 170.6, 171.9.
HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 492.19570, Found, 492.19380 (-1.90 mmu)
3-ブロモチオフェン-2-カルボキシアルデヒド(1910mg、10.0mmol)を無水THF(40mL)に溶解し、0℃で撹拌した。ナトリウムテトラヒドロボレート(757mg、20.0mmol)を加え、室温で3時間撹拌を続けた。反応を2N HCl水溶液で終了させた。混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 9/1から7/3)で精製し、無色液体の化合物33を得た(2015mg、定量的)。
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ2.25 (t, 1H, J = 5.1 Hz), 4.79 (d, 2H, J = 5.1 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 5.9 Hz), 7.27 (d, 1H, J = 5.9 Hz).
化合物33(2000mg、10.36mmol)、tert-ブチルジメチルクロロシラン(2342mg、15.54mmol)およびイミダゾール(2116mg、31.08mmol)を無水DMF(20mL)に溶解し、Ar雰囲気下、室温で3時間撹拌した。混合物を塩水からn-ヘキサンで抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン)で精製して、無色液体の化合物34を得た(2884mg、91%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ0.11 (s, 6H), 0.93 (s, 9H), 4.80 (s, 2H), 6.90 (d, 1H, J = 4.8 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 4.8 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ-5.2, 18.4, 25.9, 60.7, 106.1, 124.6, 129.8, 140.4
化合物35~39の合成は、文献(Hirabayashi, K.; Hanaoka, K.; Takayanagi, T.; Toki, Y.; Egawa, T.; Kamiya, M.; Komatsu, T.; Ueno, T.; Terai, T.; Yoshida, K.; Uchiyama, M.; Nagano, T.; Urano, Y. Analytical chemistry 2015, 87, 9061)に従って行った。
化合物39(1600mg、5.92mmol)およびピリジン(1.9mL、23.7mmol)を無水CH 2 Cl 2(40mL)に溶解し、混合物を0℃で撹拌した。次いで、トリフルオロメタンスルホン酸無水物(3.9mL、23.7mmol)を加え、4時間攪拌を続けた。 反応をH2Oで終了させ、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、CH2Cl2)で精製して、無色固体の化合物40を得た(1660mg、52%)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.55 (s, 6H), 7.48 (dd, 2H, J = 2.8 Hz, 8.8 Hz), 7.57 (d, 2H, J = 2.8 Hz), 8.49 (d, 2H, J = 8.8 Hz).
13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ-2.4, 118.8(q, J = 320 Hz),123.2, 125.6, 132.9, 140.0, 142.2, 152.2, 184.8
化合物40(1500mg、2.8mmol)、ベンゾフェノンイミン(4060mg、22.4mmol)、Pd2(dba)3(513mg、0.56mmol)、キサントホス(324mg、0.56mmol)およびCs2CO3(9123mg、28.0 mmol) を脱気したジオキサン(50mL)に溶解し、溶液を100℃でAr雰囲気下で22時間撹拌した。混合物をCH2Cl2で抽出し、有機溶液をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。 残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、n-ヘキサン/ AcOEt = 10 / 0から7 / 3)により精製して、黄色固体の化合物41を得た(220mg、13%)。
1H NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ0.13 (s, 6H), 6.82 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 6.95 (dd, 2H, J = 8.4, 2.4 Hz), 7.11-7.15 (m, 3H), 7.22-7.32 (m, 6H), 7.42-7.53 (m, 7H), 7.78 (d, 4H, J = 8.0 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.4 Hz). 13C NMR (100 MHz, CD2Cl2) δ-1.64, 123.1, 125.2, 128.4, 128.6, 129.2, 129.6, 129.8, 130.3, 130.6, 131.5, 136.3, 139.3, 140.2, 154.6, 169.2, 186.1. HRMS (ESI+): calcd for [M+H]+, 597.23621 ; found, 597.23370 (-2.51 mmu).
Arを充填した乾燥フラスコに、化合物34(412mg、1.34mmol)および無水THF(10mL)を添加した。混合物を-78℃に冷却し、1M sec-BuLi(1.3mL、1.30mmol)を加えた。化合物41(80mg、0.13mmol)の無水THF(4mL)溶液を加えた。混合物を室温で1時間撹拌した。反応を2N HCl水溶液で終了させ、混合物を飽和NaHCO3水溶液からCH2Cl2で抽出した。有機溶液をNa2SO4で乾燥し、濾過し、蒸発させた。 残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:A / B = 80/20(0分)から0/100(30分)、直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1%TFA)で溶出した。オレンジ色の固体の化合物42を得た(50mg、92%)。
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ0.37 (s, 3H), 0.46 (s, 3H), 4.37 (s, 2H), 6.69 (dd, 2H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 6.91 (d, 2H, J = 2.4 Hz), 7.01-7.10 (m, 4H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ-0.9, 0.0, 60.5, 85.0, 118.8, 119.1, 122.0, 129.8, 132.5, 136.6, 138.7, 139.4, 147.1, 147.4. HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 365.11438, Found, 365.11429 (-0.09 mmu)
化合物42(20mg、0.055mmol)を無水ピリジン(3mL)に溶解し、0℃でAr雰囲気下で撹拌した。無水ピリジン(1mL)中の無水酢酸(5.6mg、0.55mmol)を滴下し、24時間撹拌を続けた。反応をH2Oでクエンチさせ、混合物を蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:A / B = 80/20(0分)から0/100(30分)、直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1%TFA)で溶出した。赤色固体の化合物43を得た(1.5mg、7%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ0.47 (s, 3H), 0.53 (s,3H), 2.12 (s,3H), 5.11 (s, 2H), 6.63-6.69 (m, 2H), 6.97-7.03 (m, 2H), 7.11-7.14 (m, 1H), 7.44-7.47 (m, 2H), 7.81-7.82 (m, 1H). HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 407.12495, Found, 407.12319 (-1.76 mmu)
化合物42(30mg、0.082mmol)、boc-Glu-OtBu(12.4mg、0.041mmol)およびN、N-ジイソプロピルエチルアミン(106mg、0.82mmol)を無水DMF(2mL)に溶解し、室温で撹拌した。HATU(15.6mg、0.041mmol)を加え、撹拌を1時間続けた。混合物を蒸発させ、残渣をCH2Cl2(5mL)およびトリフルオロ酢酸(5mL)に溶解し、40℃で1時間攪拌した。その後、混合物を蒸発させた。残渣を以下の条件で分取HPLCにより精製した:A / B = 80/20(0分)から0 / 100(45分)直線勾配(溶媒A:H2O、0.1%TFA;溶媒B:アセトニトリル/ H2O = 80/20, 0.1%TFA)で溶出した。赤色固体の化合物44を得た(16mg、80%)。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ0.55 (s, 6H), 2.18-2.36 (m, 2H), 2.74-2.79 (m, 2H), 4.09 (t, 1H, J = 6.4 Hz), 4.42 (s, 2H), 6.85 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.97 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.21 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.41 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.46 (s, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 7.72 (dd, 1H, J = 8.8 Hz, 2.4 Hz), 8.15 (d, 1H, J = 2.4 Hz) HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 494.15698, Found, 494.15708 (+0.10mmu)
標的であるペプチダーゼによる式(I)のアシル残基の切断により発蛍光性を示し得る好適な蛍光プローブ化合物の構造について、pKcycl計算値に基づく検討を行った。
実施例1で合成した蛍光プローブ1(gGlu-MHM4ThPCR550)及び蛍光プローブ2(gGlu-HM3ThPSiR600)の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルをそれぞれ測定した。
本発明の蛍光プローブ1及び2にγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)を添加して蛍光強度変化を測定した。結果をそれぞれ図5及び6に示す。図5中の矢印はGGTの添加時間を示す。
実験条件:
共溶媒として0.03%のDMSOを含む2.5 mlの10mM NaPi緩衝液(pH7.4)に蛍光プローブ1又は2を1μMになるよう溶解した。37 ℃に保った溶液をマグネチックスターラーで攪拌し、蛍光強度を測定した。ネガティブコントロール以外の実験では、測定開始から2分後に1.1UのGGTを添加した。蛍光プローブ1は585nmでの蛍光強度を合計6000秒、蛍光プローブ2は613nmでの蛍光強度を合計2400秒間測定し、経過時間の関数としてプロットした。 励起波長は蛍光プローブ1が550nm、蛍光プローブ2が593nmで、スリット幅は、励起・蛍光ともに2.4nm5.0 nm、光電子増倍管電圧は700 Vであった。
SHIN3を腹腔内に注射したモデルマウスに100μMの蛍光プローブ1及び2を300μL腹腔内に注射した。5分後にイソフルラン麻酔をかけ、腹部を切開しMaestroイメージャーを用いてイメージングを行った。
蛍光スペクトルイメージングは、SHIN3細胞を腹腔内播種したマウスモデルを用いて行った。SHIN3播種モデルマウスは7週齢の雌のヌードマウスに300 μLのPBS(-) 中に懸濁した3×106個のSHIN3細胞を腹腔内注射することによって樹立した。実験は注射29-30日後に行った。PBS(-) に溶解したプローブ溶液(100 μM, 300 μL)を腹腔内注射し、5分間静置した。その後イソフルランの吸入によってマウスを麻酔し、腹部の皮膚を切開した。腸を切開部から引き出し、黒いゴム板に載せ、腸間膜を広げた。広げた腸間膜に滴下した。蛍光画像は、MaestroTM Ex In-Vivo Imaging System (CRi Inc.) を用いて撮影した。蛍光プローブ1(gGlu-MHM4ThPCR550)にはgreen-filter setting (excitation, 503 to 555 nm; emission, 580 nm long-pass)、蛍光プローブ2(gGlu-HM3ThPSiR600)にはyellow-filter setting (excitation, 575 to 605 nm; emission, 645 nm long-pass)を用いた。プローブ由来の蛍光の波長を切り出した画像、または自家蛍光とのスペクトルアンミックスを施した画像を掲示している。
Claims (17)
- 以下の式(I)で表される化合物又はその塩:
Xは、C0-C3アルキレン基を表し;
Yは、O又はNHを表し、
Zは、C(Ra)(Rb)、Si(Ra)(Rb)、Se、P(Rc)、又はP(Rc)(=O)を表し(ここで、Ra及びRbは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表し、Rcは、水素原子、アルキル基、又はアリール基を表す);
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から選択される1~3個の同一又は異なる置換基を表し;
R3は、アミノ酸由来のアシル残基を表し(ここで、該アシル残基は、アミノ酸のカルボキシル基からOH基を除去した残基である);
R4及びR5は、それぞれ独立に水素原子もしくはアルキル基を表す(ここで、R4又はR5がアルキル基である場合、R2と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい)。〕 - Aがチオフェン環である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- Yが、Oである、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- Zが、Si(Ra)(Rb)又はC(Ra)(Rb)である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- R3が、グルタミン酸残基である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- R1、R2、R4及びR5が、いずれも水素原子である、請求項1に記載の化合物又はその塩。
- 請求項1~7のいずれかに記載の化合物又はその塩を含む、ペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブ。
- 請求項8に記載のペプチダーゼ活性検出用蛍光プローブを含む、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するためのキット。
- 前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)、又はカルパインである、請求項9に記載のキット。
- 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項9に記載のキット。
- 請求項1~7のいずれかに記載の化合物又はその塩を用いて、特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出又は可視化する方法。
- 前記化合物又はその塩と前記標的細胞とを生体外において接触させる工程;及び、前記標的細胞において特異的に発現するペプチダーゼと前記化合物又はその塩との反応による蛍光応答を観測する工程を含むことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 蛍光イメージング手段を用いて前記蛍光応答を観測することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)、又はカルパインである、請求項12に記載の方法。
- 前記標的細胞が、癌細胞である、請求項12に記載の方法。
- 特定のペプチダーゼが発現している標的細胞を検出するための又は可視化するための、請求項1~7のいずれかに記載の化合物又はその塩の使用。
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URANO, Yasuteru et al.,Rapid Cancer Detection by Topically Spraying a γ-Glutamyltranspeptidase-Activated Fluorescent Probe,Science Translational Medicine,2011年11月23日,Vol.3, No.110,pp.1-10,DOI: 10.1126/scitranslmed.3002823 |
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