TW201722991A - 中和人類呼吸道融合病毒之抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於具有高抗RSV中和力價之單株抗體。本發明進一步提供編碼本發明之抗體的經分離之核酸及用其轉形之宿主細胞。本發明又進一步提供採用本發明之該等抗體及核酸的診斷、預防及治療方法，尤其作為嬰兒及老年人之被動免疫治療劑。

Description

中和人類呼吸道融合病毒之抗體
本發明係關於具有高抗RSV中和力價之人類單株抗體，以及此等抗體作為嬰兒及老年人中之被動免疫治療劑之用途。
副黏液病毒為包膜負股RNA病毒，其為明顯的人類及動物病原體。人類呼吸道融合病毒(hRSV，RSV)屬於副黏液病毒科(Paramyxoviridae)肺病毒亞科(Pneumovirinae)。已鑑別出兩種次型，A型及B型，且該等次型為年齡小於6個月之兒童中重度呼吸道感染之主要病因且有時甚至為致命的。伴隨有潛在疾病，諸如COPD、哮喘、癌症、免疫功能不全狀態，包括HIV或移植後之成年人亦處於罹患重度RSV感染之風險下。每年歸因於急性呼吸道感染而住院治療的超過50歲之成年人中有15%係由RSV引起。在美國，RSV每年造成超過100,000例住院治療，且每年在全球範圍內估計會造成約160,000例死亡。目前並不存在針對RSV之疫苗，且伴隨福馬林不活化病毒之試驗與嬰兒在RSV感染後之增加的疾病嚴重程度相關聯。與hRSV類似，包括人類偏肺病毒(Human Metapneumo Virus；hMPV)及人類副流行性感冒病毒(Human Parainfluenza Virus；hPIV)之其他家族成員亦為造成急性呼吸道疾病的原因。
hRSV基因組為大約15kb之單股反義RNA分子，其編碼11種蛋白質。此等蛋白質中之兩者為病毒粒子之主要表面糖蛋白。此等蛋白質為(i)介導與細胞結合之病毒的附著(G)蛋白，及(ii)融合(F)蛋白，其促進病毒膜與細胞膜在感染週期之初始階段融合及經感染的細胞之膜與相鄰細胞之膜融合以形成特徵融合細胞。該附著蛋白G結合細胞表面受體且與F相互作用。此相互作用觸發F發生構形變化以誘導膜融合，藉此將病毒核糖核蛋白複合物釋放至宿主細胞細胞質中。
對抗F蛋白或G蛋白之單株抗體已顯示具有活體外中和作用及活體內預防性作用。參見例如Beeler及Coelingh 1989,J.Virol.63：2941-50；Garcia-Barreno等人，1989,J.Virol.63：925-32；Taylor等人，1984,Immunology 52：137-142；Walsh等人，1984,Infection and Immunity 43：756-758；及美國專利第5,842,307號及第6,818,216號。最初藉由鑑別在抗體逃避變異體中變化之胺基酸且藉由評定與RSV F-衍生肽結合之抗體來定位F糖蛋白上之中和抗原決定基。此等研究顯示中和抗體通常靶向兩種截然不同之線性抗原決定基。參見Graham等人，2015,Curr Opin Immunol 35：30-38，其為針對融合前及融合後F形式之抗原位點的綜述。抗原位點II(亦稱為位點A)包括殘基255至275且為帕利珠單抗(palivizumab)(SYNAGIS®，AstraZeneca)之靶向物。預測此抗原決定基具有構形依賴性，且具有此抗原決定基的複合物中之帕利珠單抗之較強效衍生物的結構揭示線性抗原決定基採用螺旋-環-螺旋構形。抗原位點IV(亦稱為位點C)包括殘基422至438且為抗體MAb19及101F之靶向物。此抗原決定基為富含半胱胺酸之區域的C端且為域II之一部分，其在同源副黏液病毒F糖蛋白中在融合前與融合後構形之間在結構上保持不變。5C4、 AM22及D25劃定指定為位點0之抗原決定基，其僅存在於融合前F蛋白上且效力上比帕利珠單抗強50倍。參見McLellan等人，2013,Science 340：1113-1117；國際專利申請案第WO 2008/147196號及美國專利第8,568,726號。其他hRSV抗體描述於國際專利申請案第WO94/06448號及第WO92/04381號及美國專利第8,221,759號中。
可能無法利用用於自動免疫接種之RSV疫苗(若可獲得)來治療免疫系統尚未成熟之新生兒或受到免疫抑止之患者。在需要預防性被動免疫治療之患者中，由於疾病之較慢性形式，經由定期靜脈內接種由混合血漿製備之人類IgG來介導當前療法。歸因於中和抗RSV抗體之低力價，此類型之療法涉及大量球蛋白(例如，每千克0.75公克)且因此需要在高危月份(秋天，冬天及早春)期間在每月基礎上在診所或醫院中歷時超長時間段(2小時至4小時)靜脈內投藥。
本發明提供包含下文所指定之結構性及功能性特徵的抗RSV F蛋白抗體及其抗原結合片段。
在一個實施例中，本發明提供一種與人類RSV F蛋白結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-6M至 約1×10-9M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成。
在另一實施例中，本發明提供一種與人類RSV F蛋白結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，輕鏈或輕鏈可變區不包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈不與包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈締合。在某些實施例中，輕鏈與包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈締合。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在另一實施例中，本發明提供一種與人類RSV F蛋白結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所 測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(iii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，輕鏈或輕鏈可變區不包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在某些實施例中，輕鏈不與包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈締合。在某些實施例中，輕鏈與包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈締合。在一個實施例中，抗體或其抗體片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可 變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在另一實施例中，本發明提供一種與人類RSV F蛋白結合之抗體或抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；其中該抗體或其抗原結合片段包含與由SEQ ID NO：7組成之重鏈可變區包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的重鏈可變區及與由SEQ ID NO：8組成之輕鏈可變區包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈可變區。在某些實施例中，重鏈或 重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在此等前述實施例中，序列變化發生於構架區中。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在另一實施例中，本發明亦提供一種與人類RSV結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段在重鏈CDR(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3)中及/或在輕鏈CDR(SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6)中包含1、2或3個胺基酸取代。SEQ ID NO：7之VH序列具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3之CDR；且SEQ ID NO：8之VL序列具有SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6之CDR。在一個實施例中，抗體或其抗原 結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)，如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的可變重鏈及/或包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的可變輕鏈，其中該抗體或其抗原結合片段與人類RSV F蛋白結合。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段包含：重鏈，其包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成；及輕鏈，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成，其中該抗體或其抗原結合片段與人類RSV F蛋白結合。在一個實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其與包含SEQ ID NO：23之重鏈及SEQ ID NO：25之輕鏈的抗體結合於人類RSV F蛋白之相同抗原決定基，其中該抗體或其抗原結合片段具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在一個實施例中，抗體分別與SEQ ID NO：7之重鏈可變區及/或SEQ ID NO：8之輕鏈可變區包含至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段在SEQ ID NO：7之重鏈可變區及/或SEQ ID NO：8之輕鏈可變區中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供一種交叉阻斷包含SEQ ID NO：23之重鏈及SEQ ID NO：25之輕鏈的抗體與人類RSV結合(或與該抗體競爭)之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段具有以下特徵中之至少一者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在一個實施例中，抗體或其抗原 結合片段與SEQ ID NO：7之重鏈可變區或SEQ ID NO：8之輕鏈可變區包含至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段在SEQ ID NO：7之重鏈可變區或SEQ ID NO：8之輕鏈可變區中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸取代。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段在重鏈CDR(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3)中及/或在輕鏈CDR(SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6)中包含1、2或3個胺基酸取代。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種與人類RSV F蛋白結合之經分離之抗體或抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈或其變異體，其包含至多30個胺基酸取代，及/或包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈，其包含至多12個胺基酸取代。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明係關於一種與人類RSV F蛋白結合之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體經由以下相互作用中之一或多者或全部以下相互作用與人類RSV F蛋白結合：1)輕鏈CDR3環，經由殘基Phe 91及Leu 92，與人類RSV F蛋白之Arg 429之側鏈經由在CDR3環中之Phe 91及Leu 92之羰基氧與人類RSV F蛋白之Arg 429之胍基氮之間形成兩個氫鍵相互作用；2)輕鏈CDR2環，經由殘基Asp 50及Glu 55，與人類RSV F蛋白之Asn 426及Lys 445形成氫鍵；3)重鏈CDR3環，經由殘基Tyr 104及Tyr 110，與人類RSV F蛋白 上之Ile 432形成凡得瓦爾相互作用(van der Waals interaction)表面；4)重鏈CDR3環，經由Asn 107，與人類RSV F蛋白之Lys 433形成氫鍵；及5)輕鏈與RSV融合前三聚體之鄰近單體之Glu 161及Ser 182結合。
在以上實施例中之任一者之某些態樣中，抗體或其抗原結合片段受到分離。
在以上實施例中之任一者之某些態樣中，抗體或其抗原結合片段為重組抗體。
在以上實施例中之任一者之某些態樣中，抗體或其抗原結合片段為全長抗體。
在上述實施例中之任一者之某些態樣中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含由以下組成之重鏈可變區：(a)上述可變重鏈中之任一者及(b)前導肽(例如，SEQ ID NO：10之前導肽)。在上述實施例中之任一者之某些態樣中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包含由以下組成之輕鏈可變區：(a)上述可變輕鏈中之任一者及(b)前導肽(例如，SEQ ID NO：10之前導肽)。
在上述實施例中之任一者之某些態樣中，本發明之抗體或其抗原結合片段為包含上述可變重鏈中之任一者及任何人類重鏈恆定域之抗體。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段具有IgG同型，且包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人類重鏈恆定域。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含人類重鏈IgG1恆定域，其中IgG1恆定域為去岩藻糖基化的。
在上述實施例中之任一者之某些態樣中，本發明之抗體或其抗原結 合片段可包含上述可變輕鏈中之任一者及人類輕鏈恆定域。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含人類κ輕鏈恆定域或其變異體，其中該變異體包含至多20、10、5、3、2或1個經修飾之胺基酸取代。在另一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含人類λ輕鏈恆定域或其變異體，其中該變異體包含至多20、10、5、3、2或1個經修飾之胺基酸取代。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包含人類κ輕鏈恆定域，其包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體包含全四聚結構，其具有兩個輕鏈及兩個重鏈，其中各輕鏈包含：包含SEQ ID NO：8之可變區及人類κ輕鏈恆定域(SEQ ID NO：14)；且各重鏈包含：包含SEQ ID NO：7之可變區及人類IgG1恆定域(SEQ ID NO：13)。
在上述實施例中之任一者之某些態樣中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段可共軛於至少一種預防或治療性藥劑。在一個實施例中，治療劑包含第二抗體或其片段、免疫調節劑、激素、細胞毒性劑、酶、放射性核種、共軛於至少一種免疫調節劑、酶、放射性標記、激素、反義寡核苷酸或細胞毒性劑之第二抗體或其組合。
本發明亦提供經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25中之任一者之胺基酸序列，或任何該等序列之片段。在某些實施例中，包含重鏈胺基酸序列之多肽不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
本發明亦提供編碼本發明之抗hRSV F蛋白抗體中之任一者或抗原結合片段的經分離之核酸。在一個實施例中，本發明提供編碼SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之多肽中之任一者的 經分離之核酸，其中該等多肽可視情況包含前導序列。在某些實施例中，包含重鏈胺基酸序列之多肽不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。本發明亦提供包含編碼SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之多肽(其中該等多肽可視情況包含前導序列)中之任一者的核酸之表現載體。在某些實施例中，包含重鏈胺基酸序列之多肽不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。此等經分離之核酸及包含其之表現載體可用於在重組宿主細胞中表現本發明之抗體或其抗原結合片段。因此，本發明亦提供包含經分離之核酸的宿主細胞，該等經分離之核酸編碼SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25之多肽(其中該等多肽可視情況包含前導序列)中之任一者。在某些實施例中，包含重鏈胺基酸序列之多肽不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在一個實施例中，宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。在一個實施例中，宿主細胞為酵母細胞，例如畢赤酵母(Pichia)細胞或甲醇酵母(Pichia pastoris)宿主細胞。
本發明亦提供包含本發明之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的醫藥組合物。在一個實施例中，醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑為L-組胺酸。在此實施例之一態樣中，抗體或抗原結合片段調配在10mM L-組胺酸、7%(w/v)蔗糖及0.02%(w/v)聚山梨醇酯-80，pH 6.0中。抗體或抗原結合片段通常以約100mg/mL存在於此類調配物中。
在一個實施例中，本發明提供包含本發明之抗體或其抗原結合片段且包含另一預防或治療性藥劑之組合物。在一個實施例中，該另一預防或治療性藥劑選自由以下組成之群：第二抗hRSV抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明之第二抗hRSV抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2 之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
本發明亦提供一種容器或注射裝置，其包含本發明之抗hRSV F蛋白抗體中之任一者或抗原結合片段。在一個實施例中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
本發明亦提供一種產生本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含：將包含編碼本發明抗體(或其抗原結合片段)的重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸之宿主細胞在有利於表現該聚核苷酸之條件下培養；且視情況，自宿主細胞及/或培養基回收抗體或抗原結合片段。在一個實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸及編碼輕鏈之聚核苷酸處於單一載體中。在另一實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸及編碼輕鏈之聚核苷酸處於不 同載體中。在一個實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸及編碼輕鏈之聚核苷酸編碼一種抗體或抗原結合片段，該抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
本發明亦提供一種在有需要之個體中預防或治療hRSV感染之方法，該方法包含向個體投與有效量之本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段，視情況與另一預防或治療性藥劑或治療程序結合。在一個實施例中，進行治療之個體為人類個體。在一個實施例中，該另一預防或治療性藥劑選自由以下組成之群：第二抗hRSV抗體或其抗原結合片段、編碼抗RSV F抗體或抗原結合片段之核酸或抗體共軛物。在一個實施例中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基 酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
本發明亦提供一種在有需要之個體中預防或治療hRSV感染之方法，該方法包含向個體投與有效量之本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段，視情況與另一預防或治療性藥劑或治療程序組合。在一個實施例中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
本發明亦提供一種疫苗或免疫原性組合物，其包含本發明之抗體或抗原結合片段。在一個實施例中，本發明之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1； (ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在一個實施例中，疫苗或免疫原性組合物進一步包含選自RSV F蛋白及RSV G蛋白及其片段之抗原。
本發明亦提供一種用於(藉由偵測F蛋白或其片段)偵測樣本中存在RSV之方法，該方法包含使樣本與本發明之抗體或其抗原結合片段接觸且偵測抗體或片段與肽之間的複合物之存在；其中偵測到該複合物指示存在RSV F蛋白。在一個實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
本發明亦提供一種增加抗hRSV F蛋白抗體之抗hRSV活性之方法，該方法包含：獲得親本抗hRSV F蛋白抗體且增加該親本抗hRSV F蛋白抗體之效應功能；其中與親本抗hRSV F蛋白抗體相比，所得抗hRSV F蛋白抗體之活性有所增加。如本文所用，「親本抗體」係指具有野生型Fc區及/或野生型糖基化(亦即，由多肽在未經工程改造之哺乳動物宿主細胞中之表現所產生之糖基化模式)的抗體。親本抗體之效應功能可藉由使其Fc區突變或藉由改變其糖基化，例如藉由使抗體去岩藻糖基化(如下文進一步詳細論述)來增加。在一個實施例中，親本抗hRSV F蛋白抗體之效應功能係藉由使親本抗hRSV F蛋白抗體之Fc區中發生突變來增加。在另一實施例中，親本抗hRSV F蛋白抗體之效應功能係藉由自抗體移除岩藻糖殘基，或在已經基因工程改造之宿主細胞中表現抗體以移除添加岩藻糖至糖蛋白之酶之活性來增加。
圖1A至圖1B顯示人類RSV抗體D25、帕利珠單抗及RB1與人類RSV-F融合前蛋白(A)及人類RSV-F融合後蛋白(B)之結合曲線(根據ELISA)。
圖2A至圖2B顯示RSV A Long病毒株(A)及RSV B Washington病毒株(B)中人類RSV抗體之中和曲線。
圖3A至圖3B顯示藉由融合F蛋白之丙胺酸掃描突變誘發進行的RB1之抗原決定基定位(A)及融合前F結晶結構上之抗原決定基定位殘基(B)。
圖4A至圖4D顯示相對於抗體之濃度繪製的RSV A之棉鼠攻擊模型(A)中及相對於抗體之濃度繪製的RSV B攻擊(B)中或相對於針對RSV A 攻擊(C)及RSV B攻擊(D)的抗體劑量繪製之組織中所存在的病毒粒子(PFU/g)之棉鼠攻擊模型中RB1與D25在肺中相比之功效。
圖5A至圖5D顯示相對於抗體之濃度繪製的RSV A之棉鼠攻擊模型(A)中及相對於抗體之濃度繪製的RSV B攻擊(B)中或相對於針對RSV A攻擊(C)及RSV B攻擊(D)的抗體劑量繪製之組織中所存在的病毒粒子(PFU/g)之棉鼠攻擊模型中RB1與D25在鼻中相比之功效。
圖6顯示人類RSV抗體RB1+YTE與人類RSV A F蛋白之結合曲線(根據ELISA)。
圖7顯示RB1-YTE(RB1+YTE)與具有YTE突變設定之莫維珠單抗(motavizumab)的恆河猴中藥物動力學特性。
縮寫
在本發明之詳細描述及實例中，將使用以下縮寫：
ADCC 抗體依賴性細胞毒性
CDC 補體依賴性細胞毒性
CDR 免疫球蛋白可變區中之互補決定區，使用Kabat編號系統
定義
CHO 中國倉鼠卵巢
ELISA 酶聯結免疫吸附劑分析法(Enzyme-linked immunosorbant assay)
FR 抗體構架區：排除CDR區之免疫球蛋白可變區
HRP 辣根過氧化酶
IC50 產生50%抑制之濃度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 藉由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)開創之免疫球蛋白比對及編號系統
mAb或Mab或MAb 單株抗體
V區 不同抗體之間序列可變之IgG鏈之片段。其延伸至輕鏈中之Kabat殘基109及重鏈中之Kabat殘基113。
VH 免疫球蛋白重鏈可變區
VK 免疫球蛋白κ輕鏈可變區
定義
為使本發明可較容易理解，在下文中特定地定義某些技術及科學術語。除非在本文件中其他地方特定地定義，否則本文所用之所有其他技術及科學術語均具有本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之含義。
除非上下文另外清楚地規定，否則如本文所用，包括隨附申請專利範圍，諸如「一(a/an)」及「該(the)」之詞語之單數形式包括其對應複數個提及物。
「投與」及「治療」在應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時係指外源性醫藥、治療、診斷劑或組合物與該動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞處理涵蓋使試劑接觸細胞，以及使試劑接觸流體，其中該流體與細胞接觸。「投與」及「治療」亦意謂藉由試劑、診斷劑、結合化合物或藉由另一細胞對例如細胞進行活體外及離體處理。
「RSV疾病」意謂由具有呼吸道融合病毒(RSV)之感染直接或間接引 起的任何疾病，以及使患者易由RSV導致感染的疾病或病狀。屬於前一類別的疾病之實例包括肺炎及細支氣管炎。後一類別中之疾病及病狀(亦即，使患者處於重度RSV感染之風險下的疾病及病狀)包括囊腫性纖維化、先天性心臟病、癌症、年齡相關性免疫抑止、移植接受及一般而言，引起免疫抑止之狀態或免疫系統功能降低之任何病狀，諸如術後器官移植療程或早產。
「治療(treat)」或「治療(treating)」意謂以內部或外部方式向具有一或多種疾病症狀或懷疑患有疾病之個體或患者投與治療劑，諸如含有本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者的組合物，其中該治療劑具有治療活性。通常，藥劑以有效緩解經治療之個體或群體中一或多種疾病症狀之量投與，誘發此類症狀消退或抑制其進展達任何臨床上可量測之程度。有效緩解任何特定疾病症狀之治療劑之量可根據諸如疾病病況、患者年齡及體重以及藥物在個體中引發所期望反應之能力之因素而變化。疾病症狀是否已緩解可藉由醫師或其他熟練醫療保健提供者通常用以評定彼症狀之嚴重程度或進展狀態的任何臨床量測來評定。用抗RSV抗體之治療亦可與其他介入(抗體、核酸、疫苗及小分子化合物)組合以治療其他呼吸道病原體。
「預防(prevent)」或「預防(preventing)」意謂以內部或外部方式向處於變得由hRSV感染之風險下之個體或患者投與預防劑，諸如含有本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者的組合物，其中該預防劑具有預防活性。預防包括降低後續RSV感染之可能性或嚴重強度，改善RSV感染後與下呼吸道感染(LRI)相關聯之症狀及誘導保護免受RSV感染之免疫性。通常，藥劑以有效中和肺部及/或鼻中之RSV以阻斷感染之量投與。有效改 善任何特定疾病症狀之預防劑之量可根據諸如患者年齡及體重以及藥物在個體中引發所期望反應之能力之因素而變化。疾病症狀是否已改善可藉由醫師或其他熟練醫療保健提供者通常用以評定彼症狀之嚴重強度或進展狀態的任何臨床量測來評定或在某些情況下將改善住院需求。
hRSV F蛋白
人類RSV F蛋白經合成而呈介穩態三聚前驅體(F0)形式，其以蛋白分解方式分解成共價締合之F1及F2次單位。已針對副黏液病毒科家族之PIV5及RSV成員測定呈融合前形式的F三聚體之原子結構。參見McLellan等人，2011,J Virol.85：7788-7796(RSV)及Welch等人，2012,Proc Natl Acad Sci 109：16672-16677(PIV)。融合前F具有短C端細胞質尾、單一跨膜域、螺旋莖及球狀頭域。呈融合後形式的NDV、hPIV3及RSV F之原子結構展現發生大再摺疊事件以將融合前F轉形成融合後F，其中球狀頭域之一部分重排形成六螺旋束。此等結構，連同肽抑制性資料一起，表明經F介導之膜融合之模型，其中活化後，F1/F2重排以將來自F1之N端的疏水性融合肽插入至形成髮夾結構前中間體之靶細胞膜中。此相對延長之結構將病毒繫栓至細胞膜且崩塌以形成穩定的融合後結構之六螺旋束。介穩態融合前至髮夾結構前中間體、至融合後構形之過渡沿能量梯度向下行進，其中融合後形式表示最穩定狀態，且F再摺疊期間所釋放的能量伴隨有膜融合。
術語hRSV F蛋白包括人類RSV F蛋白以及其片段，諸如其缺少信號肽之成熟片段。在本發明之實施例中，人類RSV F蛋白之胺基酸序列包含Genbank寄存編號AAR14266(hRSV B病毒株9320)中所揭示之胺基酸序列。
抗hRSV抗體及其抗原結合片段
本發明提供結合較佳來自RSV A病毒株及RSV B病毒株之人類RSV F蛋白，結合融合前F蛋白與融合後F蛋白的抗體或其抗原結合片段，及此類抗體或片段之用途。在一些實施例中，抗RSV F蛋白抗體經分離。本文所述之抗體與F蛋白之位點IV處之抗原決定基結合。在本文所述之本發明之實施例中之任一者中，在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列，及/或輕鏈或輕鏈可變區不包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列。在某些實施例中，重鏈包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且輕鏈包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列，基本上由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成或由SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
在較佳實施例中，抗RSV F蛋白抗體為全人類抗體。本發明之單株抗體之主要優點源自以下事實：其包括人類CDR3序列，且在一些實施例中，其可為全人類單株抗體。因此，活體內使用本發明之全人類單株抗體進行RSV疾病之免疫預防及免疫治療大大減少宿主對經被動投與之抗體之免疫反應的問題。當利用異種或嵌合衍生之先前技術單株抗體時通常會碰到此問題。此優點之第二重要態樣在於此等人類單株抗體用於基因療法應用之潛在安全性，其中含有非人類序列之異種或嵌合蛋白之表現不能終止。
如本文所用，抗RSV F蛋白抗體或其抗原結合片段係指與人類RSV F蛋白特異性結合之抗體或其抗原結合片段。「與人類RSV特異性結合」之抗體或其抗原結合片段為與融合前或融合後人類RSV F蛋白以約1nM或更高親和力(例如，1nM至2pM、1nM、100pM、10pM或2pM)之Kd 結合但不與缺少RSV F蛋白序列之其他蛋白質結合之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，與人類RSV F蛋白特異性結合之本發明之抗體亦與牛RSV F蛋白交叉反應。如本文所用，「交叉反應性」係指抗體與來自其他物種之同源蛋白質反應之能力。可使用此項技術中已知的任何分析來判定抗體是否與人類RSV F蛋白特異性結合。此項技術中已知測定結合親和力之分析之實例包括表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)。
本發明包括抗hRSV F蛋白抗體及其使用方法。如本文所用，術語「抗體」係指展現所期望之生物活性的抗體之任何形式。因此，其以最廣泛含義使用且特定地涵蓋(但不限於)單株抗體(包括包含兩個輕鏈及兩個重鏈之全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、人類化抗體、全人類抗體及嵌合抗體。
本發明包括抗hRSV F蛋白抗原結合片段及其使用方法。如本文所用，除非另有指示，否則「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結合片段，亦即保留特異性結合於全長抗體所結合之抗原之能力的抗體片段，例如，保留一或多個CDR區之片段。抗原結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
本發明包括抗RSV F蛋白Fab片段及其使用方法。「Fab片段」包含一個輕鏈及一條重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fab片段」可為抗體之木瓜蛋白酶裂解產物。
本發明包括抗RSV F蛋白抗體及其包含Fc區之抗原結合片段及其使用方法。「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2域的重鏈片段。兩個重 鏈片段藉由兩個或大於兩個二硫鍵及CH3域之疏水性相互作用保持在一起。
本發明包括抗RSV F蛋白Fab'片段及其使用方法。「Fab'片段」含有一個輕鏈及一個重鏈之含有VH域及CH1域以及CH1與CH2域之間的區域的一部分或片段，使得在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
本發明包括抗RSV F蛋白F(ab')2片段及其使用方法。「F(ab')2片段」含有兩個輕鏈及兩個含有CH1域與CH2域之間的一部分恆定區的重鏈，使得在兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')2片段由藉由兩個重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。「F(ab')2片段」可為抗體之胃蛋白酶裂解產物。
本發明包括抗RSV F蛋白Fv片段及其使用方法。「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。
本發明包括抗RSV F蛋白scFv片段及其使用方法。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之VH及VL域之抗體片段，其中此等域存在於單一多肽鏈中。一般而言，該Fv多肽進一步在VH與VL域之間包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269至315頁。亦參見國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。
本發明包括抗hRSV F蛋白域抗體及其使用方法。「域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況 下，兩個或大於兩個VH區與肽連接子共價接合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同的抗原。
本發明包括抗hRSV F蛋白二價抗體及其使用方法。「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可具有雙特異性(參見下文)。
本發明包括抗RSV F蛋白雙功能抗體及其使用方法。如本文所用，術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含連接於同一多肽鏈(VH-VL或VL-VH)中之輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)。藉由使用過短以使得同一鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體較全面地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。關於經工程改造之抗體變異體的綜述，一般參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。
通常，以一定方式修飾之本發明之抗體或抗原結合片段在活性以莫耳計時保留其結合活性之至少10%(與親本抗體相比時)。較佳地，本發明之抗體或抗原結合片段保留親本抗體之RSV F蛋白結合親和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或大於100%。亦預期本發明之抗體或抗原結合片段可包括不實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」)。
本發明包括經分離之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段及其使用方法。「經分離」之抗體或其抗原結合片段至少部分不含來自產生其之細胞或細胞培養物的其他生物分子。此類生物分子包括核酸、蛋白質、脂 質、碳水化合物或其他物質，諸如細胞碎片及生長培養基。經分離之抗體或抗原結合片段可進一步至少部分不含表現系統組分，諸如來自宿主細胞或其生長培養基之生物分子。一般而言，術語「經分離」不欲指此類生物分子完全不存在或水、緩衝液或鹽不存在，或包括該等抗體或片段之醫藥調配物之組分不存在。
本發明包括單株抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段以及包含複數種經分離之單株抗體的單株抗體組合物。如本文所用，術語「單株抗體」係指實質上均質之抗體群體，亦即，除了可少量存在之可能性天然存在之突變以外，包含胺基酸序列一致之群體的抗體分子。相比之下，習知(多株)抗體製劑通常包括在可變域、尤其CDR中具有不同胺基酸序列之眾多不同抗體，其通常對不同抗原決定基具有特異性。修飾語「單株」指示抗體自實質上均質之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由重組DNA法(參見例如，美國專利第4,816,567號)製得。
一般而言，基本(或「全長」)抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩個一致多肽鏈對，各對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括約100至110或大於110個之胺基酸之可變區或域，其主要負責抗原識別。重鏈之羧基端部分可界定主要負責效應功能之恆定區或域。通常，人類輕鏈分類為κ輕鏈及λ輕鏈。此外，人類重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或大於12個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約10個或大於10個胺基酸之「D」區。一般參見，Fundamental Immunology，第7章 (Paul,W.編，第2版Raven Press,N.Y.(1989)。在抗體或其抗原結合片段之情形下，適當時術語域及區域可互換使用。
各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了在雙功能或雙特異性抗體中，兩個結合位點通常相同。
通常，重鏈及輕鏈之可變域包含三個高變區，亦稱為互補決定區(CDR)，其位於相對保守構架區(FR)內。該等CDR通常由該等構架區比對，使得能夠結合於特異性抗原決定基。一般而言，自N端至C端，輕鏈與重鏈可變域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。一般根據以下之定義將胺基酸分配至各域：Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.第91-3242號(1991)；Kabat,1978,Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人，1977,J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人，1987,J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人，1989,Nature 342：878-883。
如本文所用，術語「高變區」係指負責抗原結合之抗體或其抗原結合片段之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」(亦即輕鏈可變域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈可變域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)之胺基酸殘基。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(藉由序列定義抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-917(藉由結構定義抗體之CDR區)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除在 本文中定義為CDR殘基之高變區殘基外的彼等可變域殘基。
「經分離之核酸分子」或「經分離之聚核苷酸」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成起點之DNA或RNA或其某一組合，其不與在自然界中發現經分離之聚核苷酸的聚核苷酸之全部或一部分締合，或連接於其在自然界中不連接之聚核苷酸。出於本發明之目的，應理解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。除指定序列之外，「包含」指定核酸序列之經分離之核酸分子亦可包括多達十種或甚至多達二十種或大於二十種其他蛋白質之編碼序列或其部分或片段，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調節序列，及/或可包括載體序列。
片語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適合於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。
當核酸或聚核苷酸置於與另一核酸序列之功能關係中時，其為「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，但未必總是，「可操作地連接」意謂連接之DNA序列相鄰，且在分泌前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相中。然而，強化子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制性位點處接合來實現。若此類位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換 使用且所有此類名稱均包括子代。因此，詞語「轉形體」及「轉形細胞」包括主要個體細胞及衍生於其之培養物，與轉移數目無關。亦應理解歸因於有意或無意突變，並非所有子代均具有準確一致之DNA內含物。包括具有與最初轉形細胞中所篩選相同之功能或生物活性的突變子代。在意欲不同名稱之情況下，自上下文將清楚。
如本文所用，「生殖系序列」係指未經重排之免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用未經重排之免疫球蛋白序列的任何適合來源。人類生殖系序列可例如在美國國家衛生研究院(the United States National Institutes of Health)之美國國立關節炎及肌肉骨骼及皮膚病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)的網站自JOINSOLVER生殖系資料庫獲得。小鼠生殖系序列可例如如Giudicelli等人，2005,Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所述來獲得。
例示性抗RSV F蛋白抗體之物理及功能特性
本發明提供具有指定結構及功能特徵的抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段，及該抗體或其抗原結合片段在治療或防止與RSV感染相關聯之疾病/病狀中的使用方法。
「本發明之抗RSV F蛋白抗體或其抗原結合片段」包括：本文所論述之任何抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)或其變異體(例如序列變異體或功能變異體)；包含表7中所列舉之CDR中之任何一或多者的任何抗體或抗原結合片段；與本文所論述之抗體(例如，RB1)結合於人類RSV F蛋白中之相同抗原決定基的任何抗體或抗原結合片段；及(部分或完全)交叉阻斷或藉由本文所論述之抗體(例如，RB1)(部分或完全)交叉阻斷RSV結合之任何抗體或抗原結合片段。
交叉阻斷抗體及其抗原結合片段可基於在標準結合分析(例如BIACore、ELISA、流動式細胞量測術(flow cytometry))中其與本發明之抗體交叉競爭之能力來鑑別。舉例而言，可使用標準ELISA分析，其中將重組RSV F蛋白固定於滴定盤上，螢光標記抗體中之一者且評估未標記之抗體競爭斷開經標記抗體之結合的能力。另外地或可替代地，可使用BIAcore分析來評定抗體交叉競爭之能力。測試抗體抑制另一抗體(例如抗體D25)與RSV F蛋白結合之能力說明，該測試抗體可與另一抗體(例如，D25)競爭與RSV F蛋白結合且因此在一些情況下，可與抗體D25結合於RSV F蛋白上之相同抗原決定基，結合於重疊抗原決定基。
如上所述，與本發明之抗RSV F蛋白抗體中之任一者或其抗原結合片段結合於相同抗原決定基之抗體及其片段亦形成本發明之一部分。此外，在某些實施例中，結合於與本發明之抗RSV F蛋白抗體中之任一者所結合之抗原決定基重疊的抗原決定基之抗體亦形成本發明之一部分。存在若干方法可用於定位靶抗原上之抗體抗原決定基，包括：H/D-Ex質譜分析(H/D-Ex Mass spec)、X射線晶體分析、pepscan分析及定點突變誘發。舉例而言，氫氘交換(HDX)與蛋白分解及質譜分析一起可用於測定特異性抗原Y上抗體之抗原決定基。HDX-MS依賴於準確量測及當在D2O自身中及在其抗體存在下以各種時間間隔培育時氘併入程度之比較。氘與暴露區域中蛋白質之醯胺主鏈上之氫交換，而結合於抗體之抗原區域將受到保護，且將在藉由蛋白分解片段之LC-MS/MS分析之後展示較少或不交換。
本發明之抗RSV F蛋白抗體之免疫球蛋白鏈以及其CDR之實例包括(但不限於)表7中所揭示之實例(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：25)。本發明包括包含以下各者、基本上由以下各者 組成或由以下各者組成之任何多肽：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：25之胺基酸序列，及編碼此類多肽之重組核苷酸。
本發明之範疇包括經分離之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段，其包含本文所闡述之免疫球蛋白鏈之變異體，例如，SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8中之任一者；其中該變異體展現以下特性中之一或多者：(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明提供結合人類hRSV F蛋白且具有與SEQ ID NO：8(VL)及SEQ ID NO：7(VH)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL域及VH域的抗體或其抗原結合片段；其中變異體展現所期望之結合及特性，例如，(i)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-12M之Kd值與人類RSV融合前F蛋白結合；或(ii)如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，以約1×10-9M至約1×10-11M之Kd值與人類RSV融合後F蛋白結合。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
「保守修飾變異體」或「保守取代」係指蛋白質中之胺基酸經具有 相似特徵(例如電荷、側鏈尺寸、疏水性/親水性、主鏈構形及剛性等)之其他胺基酸取代，使得可時常進行該等變化，而不改變蛋白質之生物活性。熟習此項技術者認識到，一般而言，多肽之非必需區中的單一胺基酸取代實質上不會改變生物活性(參見例如，Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結構上或功能上相似之胺基酸之取代不大可能破壞生物活性。例示性保守取代闡述於表1中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。如本文所用，「功能保守變異體」係指其中一或多個胺基酸殘基已改變，但不改變所需特性，諸如抗原親和力及/或特異性之抗體或片段。此類變異體包括(但不限於)具有一個相似特性之胺基酸之替代物，諸如表1之保守胺基酸取代。亦提供 包含本發明之抗hRSV F蛋白抗體之VL域(例如，SEQ ID NO：8)的經分離之多肽，及包含本發明之抗hRSV抗體之VH域(例如，SEQ ID NO：7)的經分離之多肽，其具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大於30個胺基酸取代，其可僅出現在構架區中或其中之一或多者可位於一或多個CDR中。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
在另一實施例中，提供一種結合hRSV F蛋白且具有與本文所述之VL域或VH域中之一或多者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或75%序列一致性的VL域及VH域，且展現與hRSV F蛋白特異性結合的抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明之結合抗體或其抗原結合片段包含VL域及VH域(在存在及不存在信號序列下)，其具有至多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或大於30個胺基酸取代，其可僅出現在構架區中或其中之一或多者可位於一或多個CDR中，且展現與hRSV F蛋白特異性結合。在某些實施例中，重鏈或重鏈可變區不包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列。
聚核苷酸及多肽
本發明進一步包含編碼本發明之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段之多肽或免疫球蛋白鏈中之任一者的聚核苷酸。在一個實施例中，經分離之聚核苷酸編碼包含至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域及/或至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白重鏈可變(VH)域的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，經分離之聚核苷酸編碼單一聚核 苷酸分子上之輕鏈與重鏈，且在其他實施例中，編碼分開的聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈。在另一實施例中，聚核苷酸進一步編碼信號序列。舉例而言，本發明包括編碼SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：23及SEQ ID NO：25中描述之胺基酸的聚核苷酸，以及與其雜交之聚核苷酸，及此外，藉由此類雜交聚核苷酸編碼之任何多肽。在一個實施例中，本發明包含一種核酸序列，其包含以下各者、基本上由以下各者組成或由以下各者組成：SEQ ID NO：15(可變重鏈)或SEQ ID NO：16(可變輕鏈)。在某些實施例中，可使用密碼子最佳化來提昇核酸之特性，例如，在特定宿主中之表現。在一個實施例中，本發明包含一種核酸序列，其包含以下各者、基本上由以下各者組成或由以下各者組成：SEQ ID NO：17(密碼子最佳化可變重鏈)或SEQ ID NO：18(密碼子最佳化可變輕鏈)。在某些實施例中，可使用前導序列。在一個實施例中，本發明包含一種核酸序列，其包含以下各者、基本上由以下各者組成或由以下各者組成：SEQ ID NO：19(前導序列及重鏈)或SEQ ID NO：20(前導序列及輕鏈)，其與重鏈或輕鏈連接，分別得到SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。
一般而言，聚核苷酸在低嚴格度、中等嚴格度或高嚴格度條件下雜交，且編碼維持結合於hRSV F蛋白之能力的抗體或其抗原結合片段。當第一聚核苷酸分子之單股形式可在適當溫度及溶液離子強度條件下黏接於第二聚核苷酸分子時，第一聚核苷酸分子與第二聚核苷酸分子「可雜交」(參見Sambrook等人，上文)。溫度及離子強度之條件決定雜交之「嚴格度」。典型的低嚴格度雜交條件包括55℃、5×SSC、0.1% SDS且無甲醯胺；或30%甲醯胺、5×SSC、0.5% SDS、42℃。典型中等嚴格度雜交條件為40%甲醯胺、5×或6×SSC及0.1% SDS、42℃。高嚴格度雜交條件為 50%甲醯胺、5×或6×SSC、42℃或視情況在較高溫度(例如57℃、59℃、60℃、62℃、63℃、65℃或68℃)下。一般而言，SSC為0.15M NaCl及0.015M檸檬酸鈉。雜交要求兩個聚核苷酸含有互補序列，但視雜交之嚴格度而定，鹼基之間的錯配為可能的。用於雜交聚核苷酸之適當嚴格度視聚核苷酸之長度及互補程度、此項技術中熟知之變數而定。兩個核苷酸序列之間的相似性或同源性程度愈大，核酸可雜交之嚴格度愈高。對於長度超過100個核苷酸之雜交物，已推導出用於計算熔融溫度之方程式(參見Sambrook等人，上文，9.50-9.51)。對於較短聚核苷酸，例如寡核苷酸之雜交，錯配位置變得較為重要，且寡核苷酸長度決定其特異性(參見Sambrook等人，上文，11.7-11.8)。
在一個實施例中，本發明包含一種編碼抗體重鏈可變(VH)域或其抗原結合片段的經分離之聚核苷酸，該域包含CDR-H1(SEQ ID NO：1)、CDR-H2(SEQ ID NO：2)及CDR-H3(SEQ ID NO：3)。
在一個實施例中，本發明包含編碼抗體輕鏈可變(VL)域或其抗原結合片段的經分離之聚核苷酸，該域包含CDR-L1(SEQ ID NO：4)、CDR-L2(SEQ ID NO：5)及CDR-L3(SEQ ID NO：6)。
在一個實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO：7之免疫球蛋白重鏈可變(VH)域或SEQ ID NO：23之重鏈的經分離之聚核苷酸。
在一個實施例中，本發明包含編碼SEQ ID NO：8之免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域或SEQ ID NO：25之輕鏈的經分離之聚核苷酸。
本發明亦提供載體，例如表現載體，諸如質體，其包含本發明之經分離之聚核苷酸，其中該聚核苷酸可操作地連接於當宿主細胞經載體轉染時宿主細胞所識別之控制序列。亦提供包含本發明之載體的宿主細胞及產 生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段或多肽的方法，該等方法包含在培養基中培養具有編碼抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之表現載體或核酸的宿主細胞，且自宿主細胞或培養基分離抗原或其抗原結合片段。
本發明中亦包括當藉由BLAST演算法進行比較時，胺基酸序列與本文所提供之抗體的胺基酸序列至少約75%一致、80%一致、更佳至少約90%一致且最佳至少約95%一致(例如95%、96%、97%、98%、99%、100%)的多肽，例如免疫球蛋白多肽，其中演算法之參數經選擇以在相應參考序列之整個長度上在相應序列之間得到最大匹配(例如預期臨限值：10；字尺寸：3；查詢範圍中最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；間隙成本：存在11、伸展1；條件性組成評分矩陣調整)。
序列一致性係指當兩個序列最佳比對時兩個多肽之胺基酸在同等位置相同的程度。
以下參考文獻係關於通常用於序列分析的BLAST演算法：BLAST演算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul等人(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul,S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton,J.C.等人，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock,J.M.等人，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；比對評分系統(ALIGNMENT SCORING SYSTEMS)：Dayhoff,M.O.等人，「A model of evolutionary change in proteins.」,Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(編)，第345-352頁，Natl. Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人，「Matrices for detecting distant relationships.」,Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，suppl.3.M.O.Dayhoff(編)，第353-358頁，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States,D.J.等人，(1991)Methods 3：66-70；Henikoff,S.等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul,S.F.等人，(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；比對統計(ALIGNMENT STATISTICS)：Karlin,S.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin,S.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo,A.等人，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；及Altschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」,Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編)，(1997)第1-14頁，Plenum,New York。
結合親和力
舉例而言且不限於，如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以至少約1×10-9M(亦即，KD值為1×10-9M或低於1×10-9M)之KD值結合人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。在一個實施例中，如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以至少約1×10-9M至約1×10-12M之KD值結合人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。在一個實施例中，如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或 0CTET)所測定，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以約1×10-9M至約1×10-12M之KD值結合人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。在一個實施例中，如藉由BIACORE或類似技術所測定，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以至少約100pM(亦即，KD值為約100pM或低於約100pM)之KD值結合人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。在一個實施例中，如藉由BIACORE或類似技術所測定，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以至少約10pM(亦即，KD值為約10pm或低於約10pm)之KD值結合人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。在一個實施例中，如藉由BIACORE或類似技術所測定，本發明之抗體及抗原結合片段可以約1pM至約100pM之KD結合於人類RSV融合前F蛋白或融合後F蛋白。
抗體及其抗原結合片段之製備方法
本發明包括用於製備本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段之方法，該等方法包含在有利於此類表現之條件下培養表現該抗體或片段之細胞株，且視情況自細胞及/或生長培養基(例如細胞培養基)分離該抗體或片段。
本文所揭示之抗hRSV F蛋白抗體亦可以重組方式產生(例如在大腸桿菌/T7表現系統、哺乳動物細胞表現系統或低級真核生物表現系統中)。在此實施例中，編碼本發明之抗體免疫球蛋白分子(例如，VH或VL)的核酸可插入基於pET之質體中且在大腸桿菌/T7系統中表現。舉例而言，本發明包括用於在宿主細胞(例如細菌宿主細胞，諸如大腸桿菌，諸如BL21或BL21DE3)中表現抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈的方法，其包含在亦包括編碼可操作地連接於T7啟動子之免疫球蛋白鏈之聚核苷酸的細胞中表現T7 RNA聚合酶。舉例而言，在本發明之一實施例中，細菌宿 主細胞，諸如大腸桿菌，包括編碼可操作地連接於lac啟動子之T7 RNA聚合酶基因的聚核苷酸，且聚合酶及鏈之表現藉由宿主細胞與IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)一起培育來誘發。
存在若干種產生重組抗體之方法，其為此項技術中已知。重組產生抗體之方法的一個實例揭示於美國專利第4,816,567號中。
轉形可藉由任何已知用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法進行。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞之方法為此項技術中熟知，且包括葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原生質體融合、電致孔、聚核苷酸封裝在脂質體中、基因槍注射及DNA直接顯微注射至細胞核中。此外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。細胞轉形方法為此項技術中熟知。參見例如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號及第4,959,455號。
因此，本發明包括用於製備本發明之抗hRSV抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈的重組方法，其包含將編碼抗體或片段之一或多種免疫球蛋白鏈(例如免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈)的聚核苷酸引入；在有利於此類表現之條件下培養宿主細胞(例如CHO或畢赤酵母或甲醇酵母)，且視情況自宿主細胞及/或其中宿主細胞生長之培養基分離抗體或片段或鏈。
抗hRSV F蛋白抗體亦可藉由美國專利第6,331,415號中所闡述之任一方法合成。
真核及原核宿主細胞，包括哺乳動物細胞作為用於表現本文所揭示之抗體或片段或免疫球蛋白鏈之宿主，為此項技術中熟知，且包括許多可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得之永生化細胞株。此等細胞株尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、 SP2細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株經由確定其細胞株具有高表現水準來選擇。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞，包括例如甲醇酵母(Pichia pastoris)、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta)(甲醇誘導型酵母(Ogataea minuta)、林氏畢赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、松櫟畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普氏畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麴菌(Aspergillus niger)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、里氏木菌(Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、鐮孢黴(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)及粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)。畢赤酵 母屬，任何酵母屬、多形漢遜酵母、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌、任何麴菌屬、里氏木菌、金孢子菌、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及粗厚神經胞子菌。當編碼重鏈或抗原結合部分或其片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體藉由宿主細胞培養一段足以允許抗體或片段或鏈在宿主細胞中表現或分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間來產生。
抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收。此外，可使用多種已知之技術增強本發明之抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈(或來自其之其他部分)自產生細胞株之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)為用於增強在某些條件下表現之常用方法。GS系統整體或部分結合歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號論述。因此，在本發明之一實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺酸合成酶基因且在培養基中不存在麩醯胺酸下生長，其中然而，編碼免疫球蛋白鏈之聚核苷酸包含彌補宿主細胞中基因缺乏之麩醯胺酸合成酶基因。
本發明包括用於純化本發明之抗hRSV抗體或其抗原結合片段的方法，其包含將包含抗體或片段之樣本引入純化培養基(例如陽離子交換培養基、陰離子交換培養基、疏水性交換培養基、親和力純化培養基(例如蛋白質-A、蛋白質-G、蛋白質-A/G、蛋白質-L))且自不結合於培養基之該樣本之流過部分收集純化抗體或片段；或丟棄流過部分且溶離來自培養基之細胞結合性抗體或片段且收集溶離液。在本發明之一實施例中，培養基在施加樣本之管柱中。在本發明之一實施例中，在抗體或片段在宿主細胞中重組表現之後進行純化方法，例如其中宿主細胞首先溶解且視情況在 培養基上純化前純化溶解產物以除去不溶物質。
一般而言，在特定細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白將具有為細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗體之特定糖基化模式將視用於產生抗體之特定細胞株或轉殖基因動物而定。然而，由本文所提供之核酸分子編碼或包含本文所提供之胺基酸序列的所有抗體構成本發明，與抗體可具有之糖基化模式無關。類似地，在特定實施例中，具有僅僅包含未岩藻糖基化N-聚糖之糖基化模式之抗體可為有利的，因為此等抗體已展示通常在活體外與活體內顯示比其岩藻糖基化對應物更有效之功效(參見例如Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。具有未岩藻糖基化N-聚糖之此等抗體可能不為免疫原性，因為其碳水化合物結構為人類血清IgG中存在之群體之正常組分。
本發明包括具有針對hRSV F蛋白及另一抗原，諸如hRSV G蛋白之結合特異性的雙特異性及雙功能抗體及抗原結合片段，及其使用方法。雙特異性或雙功能抗體為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。雙特異性抗體可藉由包括融合融合瘤或連接Fab'片段之多種方法產生。參見例如，Songsivilai等人，(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321，Kostelny等人，(1992)J Immunol.148：1547-1553。此外，雙特異性抗體可形成為「雙功能抗體」(Holliger等人，(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或形成為「Janusins」(Traunecker等人，(1991)EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人，(1992)Int.J.Cancer Suppl.7：51-52)。
本發明進一步包括本文所揭示之抗hRSV抗體之抗hRSV F蛋白抗原結合片段。抗體片段包括F(ab)2片段，其可藉由例如胃蛋白酶對IgG進行 酶裂解來產生。Fab片段可藉由例如用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab)2來產生。
免疫球蛋白可視其重鏈恆定域之胺基酸序列而分為不同類別。存在至少五個主要免疫球蛋白類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且若干此等類別可進一步劃分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。本發明包含抗體之任一此等類別或亞類的抗體及抗原結合片段。
在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，例如人類恆定區，諸如γ1、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變異體。在另一實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區，諸如λ或κ人類輕鏈區或其變異體。舉例而言且不限於，人類重鏈恆定區可為γ4，且人類輕鏈恆定區可為κ。在一替代性實施例中，抗體之Fc區為具有Ser228Pro突變之γ4(Schuurman,J等人，2001,Mol.Immunol.38：1-8)。
在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含IgG1次型之重鏈恆定區。
在一些實施例中，不同恆定域可附接至衍生自本文所提供之CDR之VL及VH區。舉例而言，若本發明之抗體(或片段)特定預期用途為需要改變效應功能，則可使用除人類IgG1以外之重鏈恆定域，或可利用雜交IgG1/IgG4。
儘管人類IgG1抗體提供長半衰期及效應功能，諸如補體活化及抗體依賴性細胞毒性，但此類活性可能並非抗體所有用途所需。在此等情況下，可使用例如人類IgG4恆定域。本發明包括包含IgG4恆定域之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段，例如拮抗性、人類化抗hRSV F蛋白抗體及 片段，及其使用方法。在一個實施例中，IgG4恆定域可在對應於EU系統中之位置228及KABAT系統中之位置241的位置處不同於天然人類IgG4恆定域(Swiss-Prot寄存編號P01861.1)，其中天然Ser108經Pro置換，以防止Cys106與Cys109(對應於EU系統中之位置Cys 226與Cys 229及KABAT系統中之位置Cys 239與Cys 242)之間可干擾適當鏈內二硫鍵形成之潛在鏈間二硫鍵形成。參見Angal等人(1993)Mol.Imunol.30：105。在其他情況下，可使用經修飾以增加半衰期或降低效應功能之經修飾之IgG1恆定域。
抗體工程改造
本發明之抗體可進行構架突變以改良抗體特性。一種此類構架修飾涉及使構架區內，或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細地描述於美國專利第7,125,689號中。
在特定實施例中，需要將含有暴露側鏈之某些胺基酸變成另一胺基酸殘基，以提供最終抗體之較高化學穩定性，以避免去醯胺或異構化。天冬醯胺之去醯胺可在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上進行，且產生異天冬胺酸殘基，該殘基將扭結引入多肽鏈中且降低其穩定性(異天冬胺酸作用)。異構化可在DG、DS、DA或DT序列進行。在某些實施例中，本發明之抗體不含去醯胺或天冬醯胺異構位點。
舉例而言，天冬醯胺(Asn)殘基可變成Gln或Ala以降低任何Asn-Gly序列處，尤其CDR內形成異天冬胺酸之可能性。可在Asp-Gly序列處產生類似問題。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。異天冬胺酸可減弱或完全消除抗體與其靶抗原之結合。參見，Presta(2005)J. Allergy Clin.Immunol.116：731第734頁。在一個實施例中，天冬醯胺變成麩醯胺酸(Gln)。亦可能需要改變與天冬醯胺(Asn)或麩醯胺酸(Gln)殘基相鄰之胺基酸以減小去醯胺之可能性，當小胺基酸與天冬醯胺或麩醯胺酸相鄰出現時去醯胺以較大速率發生。參見，Bischoff及Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。此外，CDR中任何甲硫胺酸殘基(通常溶劑暴露之Met)可變成Lys、Leu、Ala或Phe或其他胺基酸以減小甲硫胺酸之硫氧化之可能性，此可降低抗原結合親和力且亦有助於最終抗體製備中之分子異質性。同上。此外，為預防潛在易裂開之Asn-Pro肽鍵或將其降至最低，可能需要將在CDR中發現之任何Asn-Pro組合變成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。具有此類取代之抗體隨後進行篩選以確保取代不降低抗體對hRSV F蛋白之親和力或特異性或其他所需生物活性至不可接受之程度。
Fc區之抗體工程改造
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦可經工程改造以包括Fc區內之修飾，以通常改變抗體之一或多個特性，諸如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或效應功能(例如，抗原依賴性細胞毒性)。此外，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)可經化學修飾(例如，一或多個化學部分可附接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，此外改 變抗體或片段之一或多個特性。此等實施例中之每一者進一步詳細地描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦包括具有經修飾(或經阻斷)之Fc區的抗體及片段以提供經改變之效應功能。參見例如美國專利第5,624,821號；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此類修飾可用於增強或抑止免疫系統之各種反應，在診斷及療法中可能具有有益作用。Fc區之改變包括胺基酸變化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化及添加多個Fc區。Fc之改變亦可改變治療抗體中抗體之半衰期，實現較不頻繁之給藥且因此增加便利性且減少物質使用。參見Presta,2005,J.Allergy Clin.Immunol.116：731第734-35頁。
在本發明之一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數增加或減少。此方法進一步描述於美國專利第5,677,425號中。CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數經改變以例如促進輕鏈與重鏈組配或提高或降低抗體之穩定性。
在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段(例如，RB1)經修飾以增加其生物半衰期。可進行多種方法。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利第6,277,375號中所述。或者，如美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述，為了增加生物半衰期，抗體可在CH1或CL區內改變以含有獲自IgG之Fc區之CH2域之兩個環的救助受體結合抗原決定基。在一個實施例中，引入M252Y/S254T/T256E(YTE)突變。參見例如，Oganesyan等人，Mol.Immunol.2009,46：1750。
在其他實施例中，Fc區藉由將至少一個胺基酸殘基用不同胺基酸殘基置換來改變以改變抗體或抗原結合片段之效應功能。舉例而言，選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體對效應配位體之親和力改變且保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細地描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實例中，選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細地描述於美國專利第6,194,551號中。
在另一實例中，胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基改變，藉此改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於國際專利申請公開案第WO 94/29351號。
在另一實例中，Fc區藉由在以下位置處修飾一或多個胺基酸而經修飾以降低本發明之抗體或抗原結合片段(例如，RB1)介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之能力及/或降低抗體或片段對Fcγ受體之親和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法進一步描述於國際 專利申請公開案第WO 00/42072號。此外，已定位人類IgG1上對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述結合改良之變異體(參見Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。
在本發明之一個實施例中，Fc區藉由修飾殘基243及264而經修飾以降低本發明之抗體(例如，RB1)介導效應功能之能力及/或增加消炎特性。在一個實施例中，抗體或片段之Fc區藉由將位置243及264處之殘基改變成丙胺酸來修飾。在一個實施例中，Fc區藉由修飾殘基243、264、267及328而經修飾以降低抗體或片段介導效應功能之能力及/或增加消炎特性。
效應功能增強
在一些實施例中，抗hRSV抗體之Fc區經修飾以增加抗體或抗原結合片段介導效應功能之能力及/或增加其與Fcγ受體(FcγR)之結合。
如本文所用，術語「效應功能」意指以下中之一或多者：抗體依賴性細胞介導之細胞毒活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒活性(CDC)介導之反應、Fc介導之吞噬作用或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及抗體經由FcRn受體之再循環。
咸信抗原結合蛋白之恆定區與包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之各種Fc受體(FcR)之間的相互作用介導抗原結合蛋白之效應功能，諸如ADCC及CDC。Fc受體對抗體交聯而言亦為重要的，抗體交聯對抗腫瘤免疫性而言可為重要的。
效應功能可用多種方式，包括例如經由FcγRIII與自然殺手細胞之結合或經由FcγRI與單核細胞/巨噬細胞之結合量測以量測ADCC效應功能。舉例而言，可在自然殺手細胞分析中評定本發明之抗原結合蛋白的ADCC效應功能。此類分析之實例可見於Shields等人，2001 J.Biol.Chem.，第 276卷，第6591-6604頁；Chappel等人，1993 J.Biol.Chem.268：25124-25131；Lazar等人，2006,Proc Natl Acad Sci USA 103：4005-4010中。
本發明之抗體之ADCC或CDC特性或其交聯特性可用多種方式增強。
已展示在殘基Asn297上含有特異性突變或改變之糖基化的人類IgG1恆定區增強與Fc受體之結合。在一些情況下，亦顯示此等突變提昇ADCC及CDC(Lazar等人，Proc Natl Acad Sci USA 2006,103：4005-4010；Shields等人，J Biol Chem 2001,276：6591-6604；Nechansky等人，Mol Immunol 2007,44：1815-1817)。
在本發明之一個實施例中，此類突變在選自239、332及330(IgG1)之一或多個位置中，或其他IgG同型中之同等位置中。適合突變之實例為S239D及I332E及A330L。在一個實施例中，本文所述之本發明之抗原結合蛋白在位置239及332處突變，例如S239D及I332E，或在另一實施例中，其在選自239及332及330之三個或大於三個位置處突變，例如S239D及I332E及A330L。(EU索引編號)。
在本發明之一替代實施例中，提供一種抗體，其包含具有改變之糖基化型態的重鏈恆定區，使得該抗原結合蛋白具有增強之效應功能。舉例而言，其中抗體具有增強之ADCC或增強之CDC或其中其具有增強之ADCC及CDC效應功能兩者。產生具有改變之糖基化型態的抗原結合蛋白之適合方法之實例描述於國際專利申請公開案第WO2003011878號及第WO2006014679號及歐洲專利申請案第EP1229125號中。
在另一態樣中，本發明提供「未岩藻糖基化」或「去岩藻糖基化」抗體。未岩藻糖基化抗體具有無岩藻糖殘基的Fc之複合型N-聚糖之三甘 露糖基核心結構。歸因於FcγRIIIa結合能力之增強，此等缺乏來自Fc N-聚糖之核心岩藻糖殘基的經糖基工程改造之抗體可顯示比岩藻糖基化等效物更強的ADCC。
本發明亦提供一種產生根據本發明之抗體的方法，其包含以下步驟：a)培養包含含有如本文所述之經分離之核酸的表現載體之重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞不包含α-1,6-岩藻糖基轉移酶；及b)回收抗原結合蛋白。重組宿主細胞通常可不含編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之基因(例如酵母宿主細胞，諸如畢赤酵母屬)或可經遺傳修飾以使α-1,6-岩藻糖基轉移酶失活。可獲得經遺傳修飾以使編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之FUT8基因不活化的重組宿主細胞。參見例如可獲自BioWa,Inc.(Princeton,N.J.)之POTELLIGENTTM技術系統，其中缺乏FUT8基因之功能複本的CHOK1SV細胞產生具有增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的單株抗體，該ADCC活性相對於在具有功能FUT8基因之細胞中產生的相同單株抗體增加。POTELLIGENTTM技術系統之態樣描述於美國專利第7,214,775號；第6,946,292號；及國際專利申請案第WO0061739號及第WO0231240號中。一般熟習此項技術者亦將認識到其他合適系統。
熟習此項技術者將顯而易見，此類修飾不僅可單獨使用，且亦可彼此組合使用，以進一步增強效應功能。
具有經修飾之糖基化之抗體的產生
在再一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段(例如，RB1)包含特定糖基化模式。舉例而言，可製備去岩藻糖基化或去糖基化抗體或片段(亦即抗體分別缺乏岩藻糖或糖基化)。抗體或片段之糖基化模式可經改變，以例如增加抗體或片段對hRSV F蛋白抗原之親和力或親合力。此類 修飾可藉由例如改變抗體或片段序列內糖基化位點中之一或多者來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而移除可變區構架糖基化位點中之一或多者，藉此消除該位點處之糖基化。此類去糖基化可增加抗體或片段對抗原之親和力或親合力。參見例如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如，RB1)可進一步包括產生於低級真核生物宿主細胞中之抗體及抗原結合片段，詳言之，諸如酵母及絲狀真菌之真菌宿主細胞已經基因工程改造而產生具有哺乳動物樣或人類樣糖基化模式之糖蛋白(參見例如，Choi等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：5022-5027；Hamilton等人，(2003)Science 301：1244-1246；Hamilton等人，(2006)Science 313：1441-1443；Nett等人，(2011)Yeast 28(3)：237-52；Hamilton等人，(2007)Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5)：387-92)。此等經遺傳修飾之宿主細胞具有控制細胞中產生的糖蛋白之糖基化型態之能力，使得可產生糖蛋白之組合物，其中特定N-聚糖結構占主導(參見例如，美國專利第7,029,872號及美國專利第7,449,308號)。此等經遺傳修飾之宿主細胞已用於產生主要具有特定N-聚糖結構之抗體(參見例如Li等人，(2006)Nat.Biotechnol.24：210-215)。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)進一步包括產生於低級真核宿主細胞中之抗體及其抗原結合片段，且其包含岩藻糖基化及未岩藻糖基化雜交及複合N-聚糖，包括二等分及多觸角物質，包括(但不限於)諸如以下之N-聚糖：GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1) 可包含具有至少一種選自由以下組成之群的雜交N-聚糖之抗體或片段：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2；及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定態樣中，雜交N-聚糖為組合物中之主要N-聚糖物質。
在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)包含具有至少一種選自由以下組成之群的複合N-聚糖之抗體及片段：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定態樣中，複合N-聚糖為組合物中之主要N-聚糖物質。在其他態樣中，複合N-聚糖為一種特定N-聚糖物質，其在組合物中包含約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%複合N-聚糖。在一個實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段包含複合N-聚糖，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚糖包含結構NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中此類結構為去岩藻糖基化的。此類結構可例如在經工程改造之甲醇酵母宿主細胞中產生。
在特定實施例中，N-聚糖經岩藻糖基化。一般而言，岩藻糖在N-聚糖之還原末端與GlcNAc之α1,3-鍵中，在N-聚糖之還原末端與GlcNAc之α1,6-鍵中，在N-聚糖之非還原末端與Gal之α1,2-鍵中，在N-聚糖之非還原末端與GlcNac之α1,3-鍵中，或在N-聚糖之非還原末端與GlcNac之α1,4-鍵中。
因此，在以上醣蛋白組合物之特定態樣中，糖型呈α1,3-鍵或α1,6-鍵岩藻糖，以產生選自由以下組成之群的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；呈α1,3-鍵或α1,4-鍵岩藻糖，以產生選自由以下組成之群的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或呈α1,2-鍵岩藻糖，以產生選自由以下組成之群的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其他態樣中，抗體或其抗原結合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括(但不限於)Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖結構組成之N-聚糖。
在上述其他態樣中，複合N-聚糖進一步包括岩藻糖基化及未岩藻糖基化二等分及多觸角物質。
如本文所用，術語「N-聚糖」及「糖型」可互換使用且係指N連接之寡醣，例如藉由天冬醯胺-N-乙醯基葡糖胺鍵附接至多肽之天冬醯胺殘基 的寡醣。N連接之糖蛋白含有在蛋白質中連接於天冬醯胺殘基之醯胺氮的N-乙醯基葡糖胺殘基。在糖蛋白上發現之主要糖為葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)及唾液酸(例如N-乙醯基-神經胺酸(NANA))。對於N連接之糖蛋白，糖基團之處理與轉譯同時在ER之內腔中發生，且在轉譯後在高基氏體(Golgi apparatus)中繼續。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2之常用五碳醣核心(「Man」係指甘露糖；「Glc」係指葡萄糖；且「NAc」係指N-乙醯基；GlcNAc係指N-乙醯基葡糖胺)。通常，N-聚糖結構以非還原末端在左邊且還原末端在右邊來呈現。N-聚糖之還原末端為附接至蛋白質上包含糖基化位點之Asn殘基的末端。N-聚糖在包含添加至Man3GlcNAc2(「Man3」)核心結構(其亦稱為「三甘露糖核心」、「五碳糖核心」或「寡甘露糖核心」)之周圍糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖及唾液酸)的分枝(觸角)數目方面不同。N-聚糖根據其分枝組分(例如高度甘露糖、複合物或雜交)分類。「高甘露糖」型N-聚糖具有五個或大於五個甘露糖殘基。「複合」型N-聚糖通常具有至少一個附接至「三甘露糖」核心之1,3甘露糖臂之GlcNAc及至少一個附接至1,6甘露糖臂之GlcNAc。複合N-聚糖亦可具有視情況經唾液酸或衍生物(例如「NANA」或「NeuAc」，其中「Neu」係指神經胺酸且「Ac」係指乙醯基)修飾之半乳糖(「Gal」)或N-乙醯基半乳胺糖(「GalNAc」)殘基。複合N-聚糖亦可具有包含「二等分」GlcNAc及核心岩藻糖(「Fuc」)之鏈內取代。複合N-聚糖亦可在「三甘露糖核心」上具有多個觸角，通常稱為「多觸角聚糖」。「雜交」N-聚糖在三甘露糖核心之1,3甘露糖臂之末端上具有至少一個GlcNAc且在三甘露糖核心之1,6甘露糖臂上具有零或 多個甘露糖。各種N-聚糖亦稱為「糖型」。
關於複合N-聚糖，術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」意謂如下。「G-2」係指可表徵作為Man3GlcNAc2之N-聚糖結構；術語「G-1」係指可表徵為GlcNAcMan3GlcNAc2之N-聚糖結構；術語「G0」係指可表徵為GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚糖結構；術語「G1」係指可表徵為GalGlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚糖結構；術語「G2」係指可表徵為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚糖結構；術語「A1」係指可表徵為NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚糖結構；且術語「A2」係指可表徵為NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚糖結構。除非另外指明，否則術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」係指缺乏在N-聚糖之還原末端附接至GlcNAc殘基之岩藻糖的N-聚糖物質。當術語包括「F」時，「F」指示N-聚糖物質在N-聚糖之還原末端的GlcNAc殘基上含有岩藻糖殘基。舉例而言，G0F、G1F、G2F、A1F及A2F均指示N-聚糖進一步包括在N-聚糖之還原末端附接至GlcNAc殘基的岩藻糖殘基。諸如酵母及絲狀真菌之低級真核生物通常不產生可產生岩藻糖之N-聚糖。
關於多觸角N-聚糖，術語「多觸角N-聚糖」係指在構成N-聚糖之1,6臂或1,3臂之非還原末端的甘露糖殘基上進一步包含GlcNAc殘基或在構成N-聚糖之1,6臂及1,3臂之非還原末端的各甘露糖殘基上包含GlcNAc殘基的N-聚糖。因此，多觸角N-聚糖可由以下式表徵：GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。術語「1-4」係指1、2、3或4個殘基。
關於二等分N-聚糖，術語「二等分N-聚糖」係指其中GlcNAc殘基在N-聚糖之還原末端連接於甘露糖殘基之N-聚糖。二等分N-聚糖可由式GlcNAc3Man3GlcNAc2表徵，其中各甘露糖殘基在其非還原末端連接至GlcNAc殘基。相比之下，當多觸角N-聚糖表徵為GlcNAc3Man3GlcNAc2時，該式指示兩個GlcNAc殘基在N-聚糖之兩個臂之一的非還原末端連接於甘露糖殘基，且一個GlcNAc殘基在N-聚糖之另一個臂之非還原末端連接於甘露糖殘基。
抗體物理特性
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)可在輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區中進一步含有一或多個糖基化位點。某些糖基化位點可引起抗體或片段之免疫原性降低，或歸因於改變抗原結合而改變抗體之pK(Marshall等人，1972,Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala及Morrison,2004,J Immunol 172：5489-94；Wallick等人，1988,J Exp Med 168：1099-109；Spiro,2002,Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人，1985,Nature 316：452-7；Mimura等人，2000,Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列之基元處進行。
各抗體或抗原結合片段(例如，RB1)將具有特有等電點(pI)，其一般在6與9.5之間的pH範圍內。IgG1抗體之pI通常在7至9.5之pH值範圍內且IgG4抗體之pI通常在6至8之pH值範圍內。
各抗體或抗原結合片段(例如，RB1)將具有特徵性熔融溫度，其中較高熔融溫度指示較高總活體內穩定性(Krishnamurthy R及Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。一般而言，TM1(初始展開溫度)可超過60℃、超過65℃或超過70℃。可使用以下來量測抗體或片段之 熔點：差示掃描熱量測定(Chen等人，(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人，(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性(Murray等人，(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。
在另一實施例中，選擇不會快速降解之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)。抗體或片段之降解可使用毛細電泳法(CE)及MALDI-MS(Alexander AJ及Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)量測。
在另一實施例中，選擇具有極小聚集作用之抗體(例如，RB1)及其抗原結合片段，該作用可能會導致觸發不合需要之免疫反應及/或改變之或不利之藥物動力學特性。一般而言，聚集為25%或小於25%、20%或小於20%、15%或小於15%、10%或小於10%或5%或小於5%之抗體及片段為可接受的。聚集可藉由若干技術，包括尺寸排阻管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射量測。
抗體共軛物
本文所揭示之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦可共軛於化學部分。化學部分可尤其為聚合物、放射性核種或細胞毒性因子。在特定實施例中，化學部分為增加抗體或片段在個體體內半衰期之聚合物。適合聚合物包括(但不限於)親水性聚合物，其包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)(例如分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa之PEG)、葡聚糖及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人，(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)揭示PEG共軛之單鏈抗體。Wen等人，(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)揭示共軛抗體與PEG，該PEG附接至放射金屬螯合劑(二伸乙三胺五乙酸(DTPA))。
本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦可與諸如以下之 標記共軛：99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th及40K、157Gd、55Mn、52Tr及56Fe。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如，RB1)亦可經聚乙二醇化，例如以增加其生物(例如，血清)半衰期。為將抗體或片段聚乙二醇化，通常使抗體或片段與聚乙二醇(PEG)之反應形式，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物在其中一或多個PEG基團附接至抗體或抗體片段之條件下反應。在特定實施例中，聚乙二醇化經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之任一種PEG形式，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體或片段為去糖基化抗體或片段。蛋白質聚乙二醇化方法在此項技術中已知且可應用於本發明之抗體。參見例如，歐洲專利申請案第EP 0 154 316號及第EP 0 401 384號。
本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如，RB1)亦可與螢光或化學發光標記共軛，該等標記包括螢光團諸如稀土螯合劑、螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、胺螢、152Eu、丹醯基(dansyl)、傘酮(umbelliferone)、螢光素、魯米諾標記(luminal label)、異魯米諾標記、芳族吖錠酯標記、咪唑標記、吖錠鹽標記、草酸酯標記、水母發光蛋白標記(aequorin label)、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。
本發明之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦可共軛於細胞毒性因 子，諸如白喉毒素、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白及化合物(例如，脂肪酸)、康乃馨蛋白、美洲商陸蛋白(Phytoiacca americana protein)PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素及伊諾黴素。
可採用此項技術中已知的用於將本發明之抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)共軛至不同部分之任何方法，包括以下所述之彼等方法：Hunter等人，1962,Nature 144：945；David等人，1974,Biochemistry 13：1014；Pain等人，1981,J.Immunol.Meth.40：219；及Nygren,1982,Histochem.and Cytochem.30：407。用於共軛抗體及片段之方法為此項技術中習知且極熟知。
抗hRSV抗體之預防性及治療性用途
進一步提用於預防、治療或改善個體，包括人類個體中的RSV感染之症狀的方法，其需要此類使用本文所揭示之經分離之抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)的預防、治療或改善。在本發明之一個實施例中，此類個體遭受RSV感染。在本發明之一個實施例中，此類個體處於RSV感染之風險下。
在一特定實施例中，以有效降低RSV力價之量向哺乳動物，較佳人類投與包含一或多種本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物，以用於治療、預防或改善一或多種與RSV感染相關聯之症狀。根據此實施例，如例如藉由痰樣本或來自哺乳動物之肺部之灌洗物中的RSV濃度所量測，有效量之抗體或抗體片段會降低肺部中之RSV力價。在另一實施 例中，以有效中和RSV及/或阻斷哺乳動物中之RSV感染之量向哺乳動物，較佳人類投與包含一或多種本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物，以用於治療、預防或改善與RSV感染相關聯之症狀。
亦可以免疫治療方式將單株抗體或其抗原結合片段用於人類及其他動物中之RSV疾病。如本文所用，術語「以免疫治療方式」或「免疫療法」結合本發明之單株抗體或其抗原結合片段表示預防性以及治療性投藥及使用實質上純化之多肽產物之被動免疫接種，以及藉由轉移編碼產物或其部分之聚核苷酸序列的基因療法。被動免疫接種包括轉移自動體液免疫或向需要其之個體提供抗體。因此，在本發明之某些實施例中，本發明提用於轉移自動體液免疫之方法及向處於RSV感染風險下之患者提供RSV抗體或其抗原結合片段，諸如IgG抗體之方法。因此，單株抗體或其抗原結合片段可向高風險個體投與以降低RSV疾病之可能性及/或嚴重強度或向已證實患有活性RSV感染之個體投與。
本發明亦提供一種方法，其用於在細胞、組織、器官、動物或患者中調變或治療至少一種成年或兒科RSV相關疾病，該疾病包括(但不限於)下呼吸道感染、肺炎、氣管支氣管炎、細支氣管炎、支氣管炎及任何相關感染或發炎性病症，諸如(但不限於)以下各者中之至少一者，或與以下各者相關之至少一種炎症：全身性發炎反應症候群、敗血症症候群、革蘭氏陽性敗血症(gram positive sepsis)、革蘭氏陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、嗜中性粒細胞減少性發燒、尿路性敗血症、腦膜炎球菌血症、成人呼吸窘迫症候群、過敏性鼻炎、常年性鼻炎、哮喘、全身性過敏反應、受體過敏反應、慢性阻塞性肺病(COPD)、過敏性肺炎、因細胞內生物體所致之肉芽腫、藥物敏感性、惡病質、囊腫性纖維化、新生兒慢 性肺病；在細胞、組織、器官、動物或患者中調變或治療至少一種感染性疾病，該感染性疾病包括(但不限於)以下各者中之至少一者：急性或慢性細菌感染、急性及慢性寄生或感染過程(包括細菌、病毒及真菌感染)、HIV感染、HIV神經病變、腦膜炎、肝炎(A、B或C或其類似者)、敗血性關節炎、腹膜炎、肺炎、會厭炎、大腸桿菌0157：h7、溶血性尿毒症症候群、栓塞性血小板減少性紫癲、瘧疾、出血性登革熱、利什曼體病(leishmaniasis)、麻風、毒性休克症候群、鏈球菌肌炎、氣性壞疽、結核分枝桿菌、鳥細胞內分枝桿菌、肺炎肺囊蟲肺炎、骨盆發炎疾病、睾丸炎、副睾炎、退伍軍人桿菌、萊姆病(lyme disease)、A型流行性感冒、艾伯斯坦-巴爾病毒、病毒相關性噬血細胞症候群、病毒性腦炎、無菌性腦膜炎以及類似者。此類方法可視情況包含向需要此類調變、治療或療法之細胞、組織、器官、動物或患者投與有效量之包含至少一種RSV抗體或其抗原片段之組合物或醫藥組合物。
在一個實施例中，向哺乳動物，較佳人類投與包含本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物以治療、預防或改善一或多種與RSV感染相關聯之症狀。在另一實施例中，向患有囊腫性纖維化、支氣管與肺發育不良、先天性心臟病、先天性免疫缺乏症或後天性免疫缺乏症之人類，或向接受移植(例如，骨髓、肺或造血幹細胞移植(HSCT))之人類投與包含本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物以治療、預防或改善一或多種與RSV感染相關聯之症狀。
在另一實施例中，向人類嬰兒，較佳人類早產嬰兒或處於因RSV感染而住院之風險下的人類嬰兒投與包含本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物以治療、預防或改善一或多種與RSV感染相關聯之症 狀。在又一實施例中，向老年人或群居(例如，安養院或復健中心)人群或免疫功能不全個體投與包含本發明之抗體或其片段之預防性、治療性或醫藥組合物。
較佳使用高親和力及/或強效活體內抑制性抗體及/或中和抗體或其抗原結合片段來預防RSV感染且治療RSV感染，該等抗體或其抗原結合片段免疫特異性地結合於RSV抗原。亦較佳使用編碼高親和力及/或強效活體內抑制性抗體及/或中和抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸來預防RSV感染且治療RSV感染，該等抗體或其抗原結合片段免疫特異性地結合於RSV抗原。該等抗體或其片段將較佳具有對RSV F糖蛋白及/或F糖蛋白之片段的親和力。
根據本發明之抗體及功能等效物(諸如其抗原結合片段)識別RSV F蛋白內之抗原決定基。特異性地識別該抗原決定基之抗體或其功能等效物可與結合於不同抗原決定基之已知RSV特異性抗體，諸如帕利珠單抗、D25、AM14、AM16及AM23組合。藉由使特異性地識別該抗原決定基的根據本發明之抗體或功能等效物與已知RSV特異性抗體組合，RSV之兩個或大於兩個不同抗原決定基在同一療法期間均會得到識別。以此方式，可達到對RSV之較強免疫原性響應及/或對抗RSV之較高抗體特異性。伴隨對RSV之較強免疫原性響應及對抗RSV之較高特異性，該組合可產生對RSV相關性病症之較有效治療及/或預防。
免疫特異性地結合於一或多種RSV抗原之一或多種本發明之抗體或其片段可作為一種預防措施局部或全身性地在體內使用。本發明之抗體或其片段亦可適宜地與其他單株抗體或嵌合抗體，或與淋巴介質或造血生長因子(諸如IL-2、IL-3、IL-7及IL-15)組合利用，例如用以增加與抗體相互 作用之效應細胞的數目或活性。本發明之抗體或其片段亦可適宜地與其他單株抗體或嵌合抗體，或與淋巴介質或造血生長因子(諸如IL-2、IL-3及IL-7)組合利用，例如用以增加免疫反應。本發明之抗體或其片段亦可適宜地與一或多種用於治療RSV感染之藥物，諸如抗病毒劑組合利用。
本發明之抗體或片段可與以下藥物中之一或多者組合使用：NIH-351(Gemini Technologies)、重組RSV疫苗(Aviron)、RSVf-2(Intracel)、F-50042(Pierre Fabre)、T-786(Trimeris)、VP-36676(ViroPharma)、RFI-641(American Home Products)、VP-14637(ViroPharma)、PFP-1及PFP-2(American Home Products)、RSV疫苗(Avant Immunotherapeutics)及F-50077(Pierre Fabre)。
本發明之抗體或其抗原結合片段可單獨或與其他類型之治療(例如，激素療法、免疫療法及消炎劑)組合投與。一般而言，與患者之物種屬於相同物種的物種起源或物種反應性(在抗體之情況下)之產品的投藥為較佳的。因此，在一較佳實施例中，向人類患者投與人類或人類化抗體、片段衍生物、類似物或核酸以用於治療或預防。
「個體」可為哺乳動物，諸如人類、犬、貓、馬、牛、小鼠、大鼠、猴(例如獼猴，例如食蟹猴)或兔。在本發明之較佳實施例中，個體為人類個體。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)可單獨或與抗病毒療法結合使用。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)可單獨或與另一RSV單株抗體結合使用。
在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如，RB1) 可單獨或與另一RSV疫苗結合使用。
術語「與......結合」指示本發明之方法中所投與之組分(例如，抗hRSV抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)以及例如帕利珠單抗)可調配於用於同步遞送之單一組合物中或分開地調配於兩個或大於兩個組合物(例如，套組)中。各組分可在不同於其他組分投與時之時間投與個體；舉例而言，各投藥可在既定時段內以若干時間間隔非同時給與(例如分開或依序)。此外，分開的組分可藉由相同或不同途徑投與個體。
實驗及診斷用途
本文所揭示之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)可用作親和純化劑。在此過程中，抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段使用此項技術中熟知之方法固定在諸如Sephadex®、玻璃或瓊脂糖樹脂或濾紙之固相上。使固定抗體或片段與待純化之含有hRSV F蛋白(或其片段)之樣本接觸，且其後用將移除樣本中除hRSV F蛋白以外之實質上全部物質的適合溶劑洗滌支撐物，該支撐物會與固定抗體或片段結合。最後，用溶離經結合之hRSV F蛋白(例如，蛋白A)的溶劑洗滌支撐物。此類固定抗體及片段形成本發明之一部分。
進一步提用於產生適用於例如進行西方墨點法(Western blot)及本文所論述之其他免疫分析之二級抗體之抗原。詳言之，揭示包含本文所揭示之治療性抗體(例如，RB1)之可變區及/或CDR序列，且可例如在治療性情形下，用於產生適用於特定偵測該抗體之存在的抗個體基因型抗體的多肽。
抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段亦可適用於hRSV F蛋白之診斷性分析，例如，偵測其在特定細胞、組織或血清中之表現。此類診斷方 法可適用於各種疾病診斷。
本發明包括結合使用本文所揭示之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)之ELISA分析(酶聯結免疫吸附劑分析法)。
舉例而言，此類方法包含以下步驟：(a)用抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段塗佈受質(例如，微量滴定盤孔，例如，塑膠盤之表面)；(b)將待測試RSV F蛋白之存在之樣本施加至受質；(c)洗滌該盤，使得樣本中之未結合物質移除；(d)施加亦對RSV F蛋白抗原具有特異性之可偵測地標記之抗體(例如酶聯結抗體)；(e)洗滌受質，使得未結合之標記抗體移除；(f)若標記之抗體為酶聯結的，則施加由酶轉形成螢光信號之化學物質；及(g)偵測標記抗體之存在。
偵測與受質相關聯之標記指示hRSV F蛋白之存在。
在另一實施例中，標記之抗體或其抗原結合片段用過氧化酶標記，該過氧化酶與ABTS(例如2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺反應，產生可偵測之顏色改變。或者，標記之抗體或片段用可偵測之放射性同位素(例如3H)標記，該放射性同位素可藉由閃爍計數器在閃爍體存在下偵測。
本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)可用於西方墨點法或免疫蛋白墨點程序中。此類程序形成本發明之一部分且包括例如： (1)視情況使用此項技術中已知之方法(例如，半乾燥墨點法或槽式墨點法)將蛋白質自待測試hRSV F蛋白之存在的樣本(例如，自樣本中之蛋白質的PAGE或SDS-PAGE電泳分離)轉移至膜或另一固體受質上；使待測試經結合之hRSV F蛋白或其片段之存在的膜或另一固體受質與本發明之抗hRSV抗體或其抗原結合片段接觸。
此類膜可呈硝化纖維素或基於乙烯基(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))之膜的形式，待在非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠或SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠中測試hRSV之存在的蛋白質已轉移至該膜中(例如在凝膠中電泳分離後)。在膜與抗hRSV抗體或片段接觸之前，該膜視情況用例如脫脂奶粉或其類似物阻斷以便結合膜上非特異性蛋白結合位點。
(2)洗滌膜一或多次以移除未結合之抗hRSV F蛋白抗體或片段及其他未結合物質；及(3)偵測經結合之抗hRSV F蛋白抗體或片段。
結合之抗體或片段之偵測指示hRSV蛋白存在於膜或受質上及樣本中。結合之抗體或片段之偵測可藉由將抗體或片段與可偵測地標記之二級抗體(一種抗免疫球蛋白抗體)結合，且隨後偵測該二級抗體之存在來進行。
本文所揭示之抗hRSV F蛋白抗體及其抗原結合片段(例如，RB1)亦可用於免疫組織化學。此類方法形成本發明之一部分，且包含例如，(1)使待測試hRSV F蛋白之存在的細胞與本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段接觸；及(2)偵測細胞上或細胞中之抗體或片段。
若抗體或片段本身可偵測地標記，則其可直接得到偵測。或者，抗體或片段可由可偵測地標記之二級抗體結合，偵測到二級抗體。
醫藥組合物及投藥
為了製備本發明之抗hRSV F蛋白抗體及抗原結合片段(例如，RB1)之醫藥或滅菌組合物，使該抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑摻合。參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治療劑及診斷劑之調配物可藉由與呈例如凍乾粉末、漿液、水溶液或懸浮液形式的可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(參見例如，Hardman等人(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。在一個實施例中，將本發明之抗體或其抗原結合片段在pH 5至pH 7之組胺酸緩衝液中稀釋至呈1mM至20mM之合適濃度，且出於張力視情況添加NaCl或蔗糖(例如，2%至15%(w/v))。可添加其他試劑，諸如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80(0.01%至0.10%(w/v))以增強穩定性。代表 性調配物為10mM L-組胺酸，7%(w/v)蔗糖及0.02%(w/v)聚山梨醇酯-80，pH 6.0。
單獨或與另一治療劑組合投與的本發明之抗體或其抗原結合片段在細胞培養物或實驗動物中之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序測定，例如，用以測定LD50(使群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%有效治療之劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比率為治療指數(LD50/ED50)。自此等細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配適用於人類之劑量範圍。此類化合物之劑量較佳處於循環濃度之範圍內，包括毒性很小或無毒性之ED50。劑量可視所採用劑型及投與途徑而在此範圍內變化。
投與模式可有所變化。投與途徑包括經口、直腸、經黏膜、經腸、非經腸；肌肉內、皮下、皮內、髓內、鞘內、直接室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、經皮或動脈內。較佳投與模式為肌肉內、靜脈內及鼻內。
在特定實施例中，可藉由侵入性途徑，諸如藉由注射來投與本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)。在本發明之其他實施例中，抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物係經靜脈內、皮下、肌肉內、動脈內、瘤內或藉由吸入、氣溶膠遞送來投與。藉由非侵入性途徑(例如經口；例如在丸劑、膠囊或錠劑中)投與亦在本發明之範疇內。
本發明提供一種包含本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者(例如，RB1)或其醫藥組合物的容器(例如，塑膠或玻璃瓶，例如具有蓋或層析管柱、中空孔針或注射器筒)。本發明亦提供一種包含本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者(例如，RB1)或其醫藥組合物的注射裝置。注射 裝置為一種經由非經腸途徑(例如肌肉內、皮下或靜脈內)，將物質引入患者體內之裝置。舉例而言，注射裝置可為注射器(例如預填有醫藥組合物，諸如自動注射器)，其例如包括用於容納待注射之流體(例如抗體或片段或其醫藥組合物)的針筒或圓筒、用於刺穿皮膚及/或血管以注射流體之針；及用於將流體推動至針筒之外且穿過針孔之推桿。在本發明之一實施例中，包含本發明之抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物之注射裝置為靜脈內(IV)注射裝置。此類裝置包括於套管或套管針/針中之抗體或片段或其醫藥組合物，其可附接至管，該管可附接至用於容納經由套管或套管針/針引入患者體內的流體(例如生理鹽水；或包含NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl2且視情況包括葡萄糖之乳酸化林格氏溶液(lactated ringer solution))之袋或儲集器。在本發明之一實施例中，在套管針及套管插入個體靜脈中後，抗體或片段或其醫藥組合物可引入裝置中，且自插入套管移除套管針。IV裝置可例如插入周邊靜脈(例如，手或臂中)；上腔靜脈或下腔靜脈，或心臟右心房內(例如，中心IV)；或鎖骨下、頸內靜脈或股靜脈，且例如前進至心臟，直至其達到上腔靜脈或右心房(例如，中心靜脈導管)。在本發明之一實施例中，注射裝置為自動注射器；噴射注射器或外部輸注泵。噴射噴射器使用液體之高壓狹窄噴嘴，其穿透表皮以將抗體或片段或其醫藥組合物引入患者體內。外部輸注泵為將抗體或片段或其醫藥組合物以控制量遞送至患者體內的醫療裝置。可以電方式或以機械方式對外部輸注泵供以動力。不同泵以不同方式操作，例如注射泵將流體保持在注射器之儲集器中，且可移動活塞控制流體遞送，彈性泵將流體保持在可拉伸氣囊儲集器中，且來自氣囊之彈性壁的壓力驅動流體遞送。在蠕動泵中，一組滾筒沿可撓性導管長度向下夾捏，推動流體向前。在多通道泵中，流體 可自多個儲集器以多個速率遞送。
本文所揭示之醫藥組合物亦可用無針皮下注射裝置投與；諸如美國專利第6,620,135號；第6,096,002號；第5,399,163號；第5,383,851號；第5,312,335號；第5,064,413號；第4,941,880號；第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。此類包含醫藥組合物之無針裝置亦為本發明之一部分。本文所揭示之醫藥組合物亦可藉由輸注投與。熟知用於投與醫藥組合物的植入物及模組之實例包括以下中所揭示者：美國專利第4,487,603號，其揭示以控制速率分配藥物之可植入微輸注泵；美國專利第4,447,233號，其揭示以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔室隔室之滲透藥物遞送系統。許多其他此類植入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者熟知，且包含本發明之醫藥組合物的彼等植入物、遞送系統及模組在本發明之範疇內。
投與方案視若干因素而定，包括治療抗體或抗原結合片段之血清或組織轉換率、症狀程度、預防抗體/治療抗體之免疫原性及生物基質中靶細胞之可接近性。較佳地，投與方案遞送足夠治療抗體或片段以實現目標疾病病況之改良，同時使不希望之副作用降至最低。因此，所遞送之生物制劑量部分地視特定預防抗體/治療抗體及所治療之病狀嚴重程度而定。可獲得關於選擇治療抗體或片段之適當劑量的指導(參見例如，Wawrzynczak,(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編) (1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人，2003,New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人，1999,New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人，2001,New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人，2000,New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人，2003,New Engl.J.Med.348：24-32，Lipsky等人，2000,New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
適當劑量之測定係藉由臨床醫師，例如使用此項技術中已知或疑似影響預防或治療之參數或因素進行。一般而言，初始劑量為略小於最佳劑量之量，且隨後以較小增量遞增，直至達成所期望或最佳作用(相對於任何負面的副作用而言)。重要診斷量測包括例如炎症或所產生的炎性細胞激素之含量的量測。一般而言，需要將使用之生物製劑衍生自與靶向治療之動物相同的物種，由此使對試劑之任何免疫反應降至最低。在人類個體之情況下，例如人類化及全人類抗體可為所期望的。
可藉由連續輸注或藉由例如，每天一次、每週1次至7次、每週一次、每兩週一次、每月一次、兩月一次、每季度一次、每半年一次、每年一次等投與之劑量提供本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)。劑量可例如經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、肌肉內、顱內、脊椎內或藉由吸入提供。一般而言，每週一次之總劑量為至少0.05微克/公斤體重，更一般而言，為至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或大於50mg/kg(參見例如，Yang等人，2003,New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人，2002, New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，1999,J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人，2003,Cancer Immunol.Immunother.52：151-144)。亦可提供劑量以在個體血清中達成抗hRSV抗體之預定目標濃度，諸如0.1μg/ml、0.3μg/ml、1μg/ml、3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml或大於300μg/ml。在其他實施例中，本發明之抗hRSV抗體例如皮下或經靜脈內，在每週一次、兩週一次、「每4週一次」、每月一次、兩月一次或每季度一次之基礎上以10毫克/個體、20毫克/個體、50毫克/個體、80毫克/個體、100毫克/個體、200毫克/個體、500毫克/個體、1000毫克/個體或2500毫克/個體投與。
如本文所用，術語「有效量」係指當向細胞、組織或個體單獨或與其他治療/預防劑組合投與時，本發明之抗hRSV或其抗原結合片段(例如，RB1)之量有效中和RSV及/或預防或產生對一或多種與RSV感染相關聯之疾病或病狀之症狀的可量測改良。有效劑量進一步係指足以引起症狀之至少部分預防或改善的抗體或片段之量。當應用於單獨投與之個別活性成分時，有效劑量僅指該成分。當應用於組合時，有效劑量係指無論以組合形式連續還是同時投與，產生預防或治療作用之活性成分之組合量。在某些實施例中，有效量為提供10μg/mL至30μg/mL之臨床目標血清濃度持續5個月之量。在一個實施例中，如在標準臨床前棉鼠模型中所測定，有效量為出於功效提供10μg/ml至30μg/ml之谷濃度(Ctrough)目標的人類劑量。
套組
進一步提供包含一或多種組分之套組，該等組分包括(但不限於)如本文所論述之抗hRSV F蛋白抗體或抗原結合片段(例如，RB1)，該等組分與 一或多種其他組分結合，該等其他組分包括(但不限於)如本文所論述之醫藥學上可接受之載劑及/或預防/治療劑。抗體或片段及/或預防/治療劑可調配為純組合物或與醫藥學上可接受之載劑組合於醫藥組合物中。
在一個實施例中，套組包括在一個容器中(例如，在滅菌玻璃或塑膠瓶中)之本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)或其醫藥組合物及在另一容器中(例如，在滅菌玻璃或塑膠瓶中)之其醫藥組合物及/或預防/治療劑。
在另一實施例中，套組包含本發明之組合，其包括本發明之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)以及醫藥學上可接受之載劑，視情況與在單一常見容器中調配在一起之一或多種預防/治療劑組合，視情況呈醫藥組合物形式。
若套組包括用於非經腸投與個體之醫藥組合物，則該套組可包括用於進行此類投藥之裝置。舉例而言，套組可包括如上文所論述之一或多種皮下針或其他注射裝置。
套組可包括藥品說明書，其包括關於套組中之醫藥組合物及劑型之資訊。一般而言，此類資訊輔助患者及醫師有效且安全地使用所密封之醫藥組合物及劑型。舉例而言，以下關於本發明之組合的資訊可供應於該藥品說明書中：藥物動力學、藥效學、臨床研究、功效參數、適應症及用法、禁忌、警告、注意事項、不良反應、過量、適當劑量及投與、如何供應、適當儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商資訊及專利資訊。
偵測套組及預防/治療套組
出於便利性，本發明之抗hRSV抗體或其抗原結合片段(例如，RB1)可提供於套組，亦即，根據用於進行診斷或偵測分析之說明書呈預定量之 試劑之封裝組合中。在抗體或片段用酶標記之情況下，套組將包括酶所需之受質及輔因子(例如，提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。此外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝劑(例如阻斷緩衝液或分解緩衝液)等等。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供實質上最佳化分析靈敏度之溶液中試劑濃度。特定言之，試劑可以乾燥粉末(通常凍乾)形式提供，包括賦形劑，其一旦溶解將提供具有適當濃度之試劑溶液。
亦提供包含一或多種此類試劑之診斷或偵測試劑及套組，用於多種偵測分析中，包括例如免疫分析，諸如ELISA(夾心型或競爭格式)。套組組分可預附接至固體支撐物，或可在使用套組時施加至固體支撐物之表面。在本發明之一些實施例中，信號產生構件可預先與本發明之抗體或片段相關，或在使用前可能需要組合一或多種組分，例如緩衝劑、抗體-酶共軛物、酶受質或其類似物。套組亦可包括其他試劑，例如用於減少與固相表面之非特異性結合的阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及其類似物。固相表面可呈管、珠粒、微量滴定盤、微球體或適合於固定蛋白質、肽或多肽之其他材料的形式。在特定態樣中，催化化學發光或發色產物形成或化學發光或發色受質還原的酶為信號產生構件之組分。此類酶為此項技術中所熟知。套組可包含本文所述之捕捉劑及偵測試劑中之任一者。視情況套組亦可包含用於進行本發明之方法的說明書。
亦提供一種包含封裝在容器，諸如小瓶或瓶中之抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段的套組，且該套組進一步包含附接至或與容器一起封裝之標籤，該標籤描述容器內含物且提供適應症及/或關於容器之內含物對於預防/治療一或多種如本文所述之疾病病況之使用的說明書。
在一個態樣中，套組用於預防或治療與RSV感染相關聯之疾病/病狀 且包含抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段及另一預防/治療劑或疫苗。套組可視情況進一步包括用於非經腸，例如靜脈內投與之注射器。在另一態樣中，套組包含抗hRSV F蛋白抗體或其抗原結合片段及描述抗體或片段與疫苗或另一預防/治療劑之使用的附接至容器或與容器一起封裝的標籤。在又一態樣中，套組包含疫苗或另一預防/治療劑及描述該疫苗或另一預防/治療劑與抗hRSV F蛋白抗體或片段之使用的附接至或與容器一起封裝的標籤。在某些實施例中，抗hRSV F蛋白抗體及疫苗或其他預防/治療劑處於獨立小瓶中或一起合併在同一醫藥組合物中。
對於組合預防或療法而言，兩種預防/治療劑之並行投與不需要同時或藉由同一途徑投與該等試劑，只要在該等試劑發揮其預防/治療作用期間存在時間段之重疊即可。涵蓋同時或依序投與，如在不同日或週投與。
亦可製備本文所揭示之預防/治療及偵測套組，其包含以下各者中之至少一者：本文所揭示之抗體、肽、抗原結合片段或聚核苷酸及針對將組合物用作偵測試劑或預防/治療劑之說明書。適用於此類套組之容器可通常包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他適合之容器，偵測及/或預防/治療組合物中之一或多者可置放於該容器中且較佳為適當等分的。在亦提供第二預防/治療劑之情況下，套組亦可含有第二不同容器，此第二偵測及/或預防/治療組合物可置放於該容器中。或者，複數種化合物可製備成單一醫藥組合物，且可封裝在單一容器構件，諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其他適合單一容器中。本文所揭示之套組通常亦將包括用於嚴密地容納小瓶以便商業出售之構件，諸如使所需小瓶保持在內之注塑或吹塑塑膠容器。在放射性標記、發色、螢光生成或其他類型可偵測標記或偵測構件包括在套組內之情況下，標記試劑可提供於與偵測或預防/ 治療組合物本身相同之容器中，或者可置於其中可置放且適當等分此第二組合物之第二不同容器構件中。或者，偵測試劑及標記可製備於單一容器構件中，且在大多數情況下，套組亦通常包括用於嚴密地容納小瓶以便商業出售及/或便於封裝及遞送之構件。
亦提用於進行本文所述之偵測或監測方法的裝置或設備。此類設備可包括其中可輸入樣本之腔室或管、視情況包括閥或泵以導引樣本流穿過裝置之流體處理系統、視情況將血漿或血清與血液分離的過濾器、用於添加捕捉劑或偵測試劑之混合腔室及視情況偵測與捕捉劑免疫複合物結合的可偵測標記之量的偵測裝置。樣本流動可為被動(例如，藉由毛細管、流體靜力或一旦樣本施加則不需要裝置進一步操縱的其他力)或主動(例如，藉由施加經由機械泵、電滲透泵、離心力或增加氣壓所產生之力)或藉由主動力與被動力之組合。
在其他實施例中，亦提供處理器、電腦可讀記憶體及儲存在電腦可讀記憶體上且經調適以在處理器上執行，從而進行本文所述之方法中之任一者的常式。適合計算系統、環境及/或組態之實例包括個人電腦、伺服器電腦、手持式或膝上型裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、機上盒、可程式化消費型電子裝置、網路PC、小型電腦、大型電腦、包括以上系統或裝置中之任一者之分散式計算環境或此項技術中已知之任何其他系統。
一般方法
分子生物學中之標準方法描述於以下文獻中：Sambrook,Fritsch及Maniatis(1982,1989第2版及2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)。標準方法亦呈現在Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，該文獻描述細菌細胞中之選殖及DNA突變誘發(第1卷)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(第2卷)、糖共軛物及蛋白質表現(第3卷)及生物資訊(第4卷)。
描述用於蛋白質純化之方法，該等方法包括免疫沈澱、層析法、電泳、離心及結晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白產生、蛋白質糖基化(參見例如，Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391頁)。描述多株及單株抗體之產生、純化及片段化(Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow及Lane，同上)。可獲得用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術(參見例如，Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。
描述單鏈抗體及雙功能抗體(參見例如，Malecki等人，2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等人，2001,J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等人，2001,J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson及Kortt,1999,J.Immunol.Methods 231：177-189；及美國專利第4,946,778號)。提供雙功能抗體(參見例如，Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等人(1985)Science 229：81-83；Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10：3655-3659；及美國專利第5,932,448號、第5,532,210號及第6,129,914號)。
亦提供雙特異性抗體(參見例如，Azzoni等人(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。
抗體可共軛於例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體適用於治療、診斷、套組或其他目的，且包括例如與染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠態金)偶合之抗體(參見例如，Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811； Everts等人(2002)J.Immunol.168：883-889)。
可獲得用於流動式細胞量測術之方法，包括螢光活化之細胞分選(FACS)(參見例如，Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。可獲得用作例如診斷試劑之適合於修飾核酸，包括核酸引子及探針、多肽及抗體之螢光試劑(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述免疫系統之組織學之標準方法(參見例如，Muller-Harmelink(編)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
可獲得用於測定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域、糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫(參見例如，GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren等人.(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。
實例 實例1：全人類RSV中和抗體之鑑別
為了鑑別強效HRSV中和抗體，在知情同意下由供體獲得血清及對活體外中和HRSV病毒之能力進行分析。對於中和分析而言，首先連續稀釋血清樣本，且隨後與600pfu之表現增強之綠色螢光蛋白的hRSV-A病毒株(RSV-GFP)一起培育。在37℃下在96孔U形底培養盤中以200微升/孔之總體積以1：1混合RSV-GFP與血清稀釋液1小時。隨後將每孔100微升混合物轉移至HEp-2細胞接種培養盤(15,000個細胞/孔)。在acumen® Cellista(TTP LabTech,Cambridge,MA)上掃描培養盤且資料導出為GFP事件之數目及每孔總螢光強度。使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)藉由四參數曲線擬合計算NT50值。根據以下進行對RSV前F及後F蛋白之結合力價的ELISA。在4℃下以1μg/ml於PBS中用50微升/孔之hRSV前F蛋白(參見McLellan等人，2013,Science 342：592)或hRSV後F蛋白(融合後F LZF21蛋白由不含融合肽之wt F胞外域組成(參見McLellen等人，2011,J.Virol 85：7788))塗佈Nunc C96 Maxisorp® Nunc-ImmunoTM培養盤(Thermo Scientific,Inc.)隔夜。用PBS/Tween 20洗滌培養盤，且隨後用3%脫脂牛奶之PBS溶液封閉。之後，每孔添加50μl連續稀釋之血清樣本，且在室溫下培育90分鐘。洗滌培養盤且以1：2,000稀釋度添加HRP共軛山羊抗人類IgG(SouthernBiotech,Birmingham,AL)。一小時之後，洗滌培養盤且用SuperBlu Turbo TMB溶液(ViroLabs,Inc.,Sterling,VA)使其顯影。使用Wallac 1420VICTOR2TM多標記計數器(Perkin Elmer,Waltham,MA)獲得OD450nm讀數。使用GraphPad Prism 6藉由四參數曲線擬合計算EC50值。將顯示高HRSV中和及結合力價之一小類供體召回以取得用於產生PBMC之較大血液體積。藉由商業供應商進行PBMC製備且所購買之PBMC在進一步使用之前儲存在液氮下。
來自一個個體之PBMC顯示良好中和力價且亦具有對融合後F蛋白之ELISA結合分析中之最高力價且為融合前F蛋白之出色結合子之一(資料未示出)。因此，選擇此供體之PBMC藉由FACS分選來分離後F特異性記憶B細胞。
根據製造商說明書使用E-Z LinkTM Sulfo-NHS-LC生物素化套組(Life Technologies,Grand Island,NY)藉由生物素化LZF21(McLellen等人，2011,J.Virol 85：7788)製備經生物素標記之三聚融合後F蛋白(LZF21)。LZF21蛋白由不含融合肽之野生型F蛋白胞外域組成(McLellen等人，2011,J.Virol 85：7788)。融合F蛋白特異性鼠融合瘤4D7(4D7為藉由用RSV A2病毒使Balb/c小鼠免疫而產生之小鼠融合瘤)。用RSV A2病毒以腹膜內方式使Balb/c小鼠免疫兩次且在融合之前，使用20μg純化之RSV A2(Advanced Biotechnologies,Inc.,Columbia,MD)藉由靜脈內注射追加三天。搜集脾臟且使用聚乙二醇使脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合。將細胞添加至培養基D(StemCell Technologies Inc.,Vancouver,BC)中，塗鋪於245mm×245mm方形培養皿中且在37℃，5% CO2下培育2週。使用ClonePix(Genetix)拾取個別群落，轉移至96孔盤且如上所述培育1週。隨後藉由ELISA針對抗純化之RSV A2之抗RSV活性篩選清液層。擴增陽性純系，包括4D7且藉由限制稀釋法進一步進行次選殖。如上所述篩選次純系且鑑別4D7-8且將其用於最佳化LZF21生物素藉由FACS對記憶B細胞之染色(資料未示出)。經由此等最佳化實驗，測定出，1.5 μg/ml LZF21生物素為用於染色後F特異性記憶B細胞之最佳濃度。藉由使用不相關之鼠融合瘤作為陰性對照且與100-1000×過量之未經標記之LZF21競爭結合來證明染色反應之特異性。
抗原特異性記憶B細胞劃定為CD3-CD19+IgG+LZE21+。在含有表現HEK293細胞株(使用標準分子生物學技術製得)之CD40配位體及IL-21(Sino Biological Inc.,North Wales,PA)的96孔培養盤中對此等細胞進行分選(一個細胞/孔)。在30個分選樣本中，來自6個孔之清液層在ELISA分析(如上所述進行)中證明與後F蛋白結合。此等樣本亦與前F蛋白結合(資料未示出)。隨後不經稀釋在如上所述之中和分析中測試此等六個樣本。基於GFP事件之減少測定中和活性之存在。在六個樣本中，其中之兩者(命名為RB1及RB11)顯示完全中和HRSV-A病毒株(參見表3)。
單一分選之記憶B細胞培養物之RNA提取及RT-PCR 部分1：
根據製造商手冊使用RNeasy® Micro Kit(Qiagen,Inc.,Valencia,CA)自96孔培養盤自RB1 hit分解物提取RNA。在UV 260nm下用NanoDropTM 2000C(Thermo Fisher Scientific Inc.,Wilmington,DE)測定RNA濃度。使用自RB1孔提取之RNA作為使用引子序列使用來自前導序列之序列(正向)及IgG JH，κ恆定區或λ恆定區之C'末端之序列(反向)的 抗體重鏈及輕鏈基因之RT-PCR擴增中之模板。
根據用於擴增抗體序列之製造商說明書使用OneStep RT-PCR套組(Qiagen Inc,Valencia,CA)。PCR條件如下：50℃，30分鐘；95℃，15分鐘；[94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1分鐘]×40；72℃，10分鐘及4℃保持。
使用RT-PCR產物直接作為巢式PCR之模板。
部分2：巢式PCR
使用RT-PCR產物作為巢式PCR中之模板來用pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen，目錄號：12355-012)來擴增抗體可變區。針對巢式PCR引子之設計係基於人類IgG重鏈及輕鏈可變區之構架區1之生殖系序列。
使1μl RT-PCR產物與2.5μl 10×PCR緩衝液、2.5μl 10×PCRX強化子(Invitrogen)、0.5μl dNTP混合物、0.5μl正向引子庫(各呈10μM)、0.5μl反向引子(10μM)、0.5μl pfx50 DNA聚合酶及17μl水混合。巢式PCR條件為：2分鐘，94℃；94℃，30秒，循環10次；50℃，30秒；68℃，1分鐘；接著94℃，30秒，循環30次；60℃，30秒；68℃，1分鐘，隨後在68℃下延長7分鐘，接著4℃保持以短期儲存。
使用VH及VK或VH及VL擴增之PCR產物的RB1巢式PCR產物作為使用用於將抗體輕鏈及重鏈基因黏接在一起的特異性連接子之重疊PCR中之模板以促進下一步驟infusion選殖。
部分3.重疊PCR及Infusion選殖
在此反應中使用pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen)。正向引子及反向引子經設計以促進選殖載體中重疊PCR產物之infusion選殖。使1μl重鏈巢式PCR產物、1μl輕鏈巢式PCR產物及1μl連接子與5μl 10×PCR緩衝 液、5μl 10×PCRX強化子、1μl dNTP混合物、1μl正向引子(10μM)、1μl反向引子(10μM)、1μl pfx50 DNA聚合酶及33μl水混合。
PCR條件如下：94℃，2分鐘；[94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，2分鐘]×10；[94℃，30秒；65℃，30秒；68℃，2分鐘]×30；68℃，7分鐘；4℃保持。
重疊PCR產物經瓊脂糖凝膠純化以用於infusion選殖(獲得約1.2kb之RB1 VH+VK重疊PCR產物)。伴隨infusion選殖之應用，RB1 VH+VK重疊PCR產物選殖於pMab11Exp2(具有針對輕鏈表現之OmpA前導序列，具有針對重鏈表現之PelB前導序列)載體中。使用Infusion HD®選殖套組(Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA)且遵循製造商說明書。拾取轉形體且傳送至GeneWiz,Inc.(South Plainfield,NJ)以供定序。
用Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)分析定序結果。
RB1之核苷酸及胺基酸序列描繪在表7中(經患者分離之RB1可變重鏈及可變輕鏈胺基酸序列分別由SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：8表示)。歸因於具有核苷酸變化之Jh反向引子之設計，天然序列中在位置125處所存在之異白胺酸在表現蛋白中變為蘇胺酸(所得RB1可變重鏈由SEQ ID NO：7表示)。將RB1抗體重鏈及輕鏈可變域基因之胺基酸序列傳送至GenScript USA,Inc.(Piscataway,NJ)以供密碼子最佳化及人類IgG1轉形及CHO短暫表現及產生。針對CHO-3E7細胞表現在pTT5載體中次選殖合成之DNA。編碼各抗體之重鏈及輕鏈的重組質體短暫共轉染於CHO-3E7細胞培養物中。第6天收集之細胞培養物清液層用於經由蛋白A管柱純化。將 純化之RB1人類IgG1用於中和分析及如實例2中所述之其他表徵實驗中。
實例2：抗hRSV抗體之表徵
RB1在如實例1中所述之ELISA分析中與融合前F及融合後F蛋白結合，其中EC50範圍介於1ng/ml至10ng/ml，然而D25抗體(參見Kwakkenbos等人，2010,Nature Medicine 16：123-128)優先與融合前F結合。參見圖1A至圖1B。
在RSV A Long病毒株(ATCC編號VR-26TM)及RSV B Washington病毒株18537病毒株(ATCC編號VR-1580TM)中對RB1、RB 11及文獻中所報導的一些基準抗體(D25、帕利珠單抗、全長[D25抗體係基於公開序列內部製得且SYNAGIS®(帕利珠單抗)購自Myoderm,Norristown,PA])之中和進行比較。針對十一個稀釋點，將測試樣本三倍連續稀釋於補充有2%熱不活化FBS之EMEM中。隨後使經連續稀釋之樣本與相等體積的補充有2%熱不活化FBS之EMEM混合，該FBS含有每孔100pfu RSV A或B病毒株。在37℃下培育1小時之後，將100μl濃度為1.5×105個細胞/毫升之HEp-2細胞轉移至含有病毒/抗體混合物之96孔培養盤。在感染後3天，用PBS洗滌細胞一次，且隨後在室溫下固定於80%丙酮中10分鐘。將RSV F(mAb143-F3-B138)及RSV N(34C9)特異性小鼠mAb(內部獲得)之混合物添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌培養盤且將經生物素標記之馬抗小鼠IgG添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween洗滌培養盤。使用紅外染料-抗生蛋白鏈菌素來 偵測RSV特異性信號且將用於分析標準化之兩個細胞染色添加至96孔培養盤中且在暗處培育1小時。培育1小時之後，洗滌培養盤，在暗處風乾20分鐘且在Licor Aerius®自動成像系統上利用針對細胞標準化之700通道雷射及針對RSV特異性信號之偵測的800通道雷射進行讀取。計算800/700比率及百分比中和度且在GraphPad中藉由四參數曲線擬合測定IC50值。
RB1能夠以相等效力中和RSV-A及RSV-B病毒株(IC50為1ng/ml至5ng/ml)。與基準抗體相比，亦證明RB1具有優良抗RSV中和度。參見圖2A至圖2B及表4。
針對RB1與融合前F蛋白及融合後F蛋白之結合的親和力測定：藉由表面電漿子共振使用Biacore T200系統(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)量測抗人類RSV F蛋白抗體RB1(如實例1中所述製得)之動力學結合活性。經由胺偶合化學法將大約5000RU之抗小鼠IgG，GE Healthcare目錄號BR-1008-38或大約13,000RU之山羊抗大鼠IgG Fcγ片段特異性，Jackson ImmunoResearch目錄號112-006-071固定於Series S CM5感測器晶片，目錄號BR-1005-30上。
背景減法結合感測器圖譜用於分析締合(k a )及解離(k d )速率常數及平衡解離常數K D。所得資料集用1：1朗格繆爾結合模型(Langmuir Binding Model)使用Biacore T200評估軟體(2.0版)擬合。表5概括抗人類RSV F蛋白抗體對RSV F蛋白之融合前及融合後形式的親和力。
RB1為Kd為約31pM之融合前F蛋白之極強效結合子。融合後結合之Kd低至0.41nM之量值。如國際專利申請公開案第WO2014121021 A1號中所報導，D25之Kd為57pM。此外，如與融合後F蛋白相比，1.4×10-4之較慢解離速率所見，抗體RB1在融合前F上比在融合後F上停留要久。
實例3：RB1抗體之抗原決定基定位
藉由進行丙胺酸掃描突變誘發實驗來定位融合F蛋白上的RB1結合抗原決定基。如所述在Integral Molecular藉由鳥槍突變誘發進行抗原決定基定位。(Davidson及Doranz,2014,Immunology 143(1)：13-20)。為了建構鳥槍突變誘發庫，誘變RSV-F蛋白表現載體以建立純系庫，各自表示個別點突變且以累積方式覆蓋蛋白中之全部殘基。使用丙胺酸掃描突變誘發來建構庫，該突變誘發提供界定各殘基之側鏈比重之較受控制之方法。使用半自動機械協定，對各突變質體進行獨立地選殖、定序、小量製備且排列於384孔微量培養盤格式中以用於在人類細胞中重複轉染、表現及抗體結合分析。針對喪失抗體結合之RB1對丙胺酸掃描突變庫進行篩選。兩個殘基──精胺酸-429及異白胺酸-432鑑別為對RB1結合至關重要。參見下文及圖3A。RB1呈現為位點IV mAb(101F樣)且位點IV結合抗體在文獻中經報導與融合前F及融合後F結合。
吾人進一步將RB1 Fab與融合前F蛋白共結晶以較好理解結合抗原決定基。以3.4A°至3.5A°自晶體收集繞射資料。RB1抗體經由與重鏈及輕鏈之CDR環相互作用而與融合前F蛋白結合。輕鏈CDR3環經由在Phe 91及Leu 92之羰基氧與Arg 429之胍基氮之間形成兩個氫鍵而與Arg 429之側鏈相互作用。亦在該輕鏈上，CDR2環上之Asp 50及Glu 55經定位而與RSV之Asn 426及Lys 445形成氫鍵。經由RB1之重鏈之CDR3環，藉由Tyr 104及Tyr 110與RSV上之Ile 432形成凡得瓦爾相互作用表面來進行深入相互作用。RSV之Lys 433與CDR3環之Asn 107形成氫鍵。根據結晶結構，RB1之輕鏈亦包圍RSV融合前三聚體之鄰近單體之Glu 161及Ser 182。
在文獻中所報導之946 F蛋白序列之944中，所鑑別之RB1之結合抗原決定基為高度保守的。此表明抗體對此區域之抗性將預期為低的。
實例4：動物模型中RSV抗體之抗RSV活性
將RB1抗體與D25及帕利珠單抗進行比較以在棉鼠攻擊模型中提供保護。研究包括以2.5mg/k給定且10倍連續稀釋至0.25mg/mk之帕利珠單抗、D25及RB1抗體。在此被動免疫療法之模型中，在d0時以不同濃度將RB1、D25或帕利珠單抗給與棉鼠且一天後用105pfu RSV攻擊棉鼠。經攻擊之RSV病毒的鼻及肺力價為攻擊後四天且用於經由溶菌斑分析測定排毒。
棉鼠： 自SAGE實驗室(Boyertown,PA)獲得至少五隻3週至7週大之棉鼠(Sigmodon hispidus)，其平均體重為大約100公克。任意提供習知嚙齒動物食物及水。
抗體試劑： 將100mg冷凍乾燥之帕利珠單抗(Myoderm,Norristown,PA)以100mg/ml調配於水中。表現其他抗體且加以內部純化。
抗體試劑之調配物： 調配物緩衝液對各抗體具有特異性以穩定化蛋白質且預防沈澱。配方如下：將RB1及D25稀釋於1×磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.2)中。根據製造商建議藉由溶解於蒸餾H2O中調配帕利珠單抗，其將有效地在25mM組胺酸及1.3mM甘胺酸pH6.0中緩衝蛋白。
給藥溶液製備、投與及分析：
隨機稱重五隻動物以測定所使用之群組的平均體重。在投與至動物中之前約一小時製備調配物。以單次解凍在濕冰上解凍抗體之冷凍儲備液。將各抗體稀釋至遞送至各組之恰當劑量濃度。在第0天(研究開始)時，用1%至4%異氟醚麻醉對隨機分到各組之動物進行輕微鎮靜且用26G注射器及針將0.1ml肌肉內投與至右側四頭肌中。在兩分鐘內根據鎮靜效果回收動物。約24小時(+/-2小時)後，用1%至4%異氟醚對棉鼠進行鎮靜，經由眶後叢(retroorbital plexus)抽血，且隨後立即經由鼻孔投加Williams E培養基中之0.1ml 1×105.5pfu RSV A2或RSV B Washington野生型病毒。接種後四天，藉由CO2吸入處死動物且移除肺(左肺葉)及鼻甲骨且在濕冰上均勻化於10體積之含有蔗糖磷酸酯麩醯胺酸緩衝液(SPG)之Hanks平衡鹽溶液(Lonza)中。藉由離心以2000rpm澄清樣本10分鐘，加以等分、快速冷凍且立即冷凍儲存在-70℃下直至在溶菌斑分析中進行測試。
如圖4A至圖4D及圖5A至圖5D中所描繪，在2.5mpk之劑量下，RB1在針對RSV A及RSV B之病毒力價方面能夠在肺及鼻中達成2個對數至3個對數下降量，其與D25類似但比帕利珠單抗好，帕利珠單抗無法影響鼻 中之病毒力價。
實例5：RB1之Fc工程改造
IgG之新生Fc受體(FcRn)已很好地表徵於被動體液免疫自母體至其胎兒之轉移。此外，在壽命中，FcRn保護IgG不受降解，藉此解釋此類別之抗體在血清中之長半衰期。參見例如，Israel等人，1996,Immunology 89：573-8。FcRn與IgG之Fc部分在不同於經典FcγR之結合位點的位點處結合或與補體之C1q組分結合。FcRn-Fc共晶結構揭示，FcRn與IgG抗體之CH2-CH3鉸鏈區結合。IgG-FcRn路徑之突出特徵為專性pH依賴性。IgG-FcRn結合由溶酶體中之酸性pH(6.0)推進，而解離發生在細胞外環境之中性pH(7.4)下。溶酶體中之酸化(pH 6.0至pH 6.5)使得FcRn能夠與IgG之Fc區以低微莫耳親和力結合且保護其不會分解代謝。受保護的經FcRn結合之IgG隨後穿梭至細胞表面且釋放至細胞外環境中。此過程藉由降低抗體曝露於細胞外降解來對其加以保護。
對RB1抗體進行Fc工程改造以致力於改良半衰期。RB1+YTE為RB1之衍生物，其中三重突變體(M252Y/S254T/T256E(YTE))引入至RB1之Fc部分中。此YTE突變設定改良與新生Fc受體結合之抗體，使得在人類中之半衰期較長。參見例如，Dall'Acqua等人，2006,J Biol Chem.281：23514-24。莫維珠單抗之Fc區中的3個胺基酸中之突變體(YTE：M252Y/S254T/T256E)使得針對人類及猴之活體外FcRn結合在pH 6.0下增加10倍，因此使得猴中之活體內血清半衰期增加4倍。參見Robbie等人，2013,Antimicrob Agents Chemother.57：6147-53。
將RB1+YTE抗體重鏈及輕鏈可變域之胺基酸序列傳送至GenScript USA,Inc.(Piscataway,NJ)以供密碼子最佳化及人類IgG1轉形及CHO短 暫表現及產生。RB1+YTE之核苷酸及胺基酸序列描繪於表7中。
針對CHO-3E7細胞表現在pTT5載體中次選殖合成之DNA。編碼各抗體之重鏈及輕鏈的重組質體短暫共轉染於CHO-3E7細胞培養物中。第6天收集之細胞培養物清液層用於經由蛋白A管柱純化。將純化之RB1+YTE人類IgG1用於中和分析及其他表徵實驗中。
實例6：RB1+YTE之表徵
RB-1+YTE在如實例1中所述進行的ELISA分析中與F蛋白結合，其中EC50範圍介於1.97ng/ml至2.457ng/ml。參見圖6。在RSV A Long病毒株(ATCC編號VR-26TM)及RSV B Washington病毒株18537病毒株(ATCC編號VR-1580TM)中對RB1+YTE及文獻(Motavizumab,MedImmune,Gaithersburg,MD；參見美國專利申請公開案第US20110158985號)中所報導的基於公開序列內部製得的基準抗體之中和進行比較。針對十一個稀釋點，將測試樣本三倍連續稀釋於補充有2%熱不活化FBS之EMEM中。隨後使經連續稀釋之樣本與相等體積的補充有2%熱不活化FBS之EMEM混合，該FBS含有每孔100pfu RSV A或B病毒株。在37℃下培育1小時之後，將100μl濃度為1.5×105個細胞/毫升之HEp-2細胞轉移至含有病毒/抗體混合物之96孔培養盤。在感染後3天，用PBS洗滌細胞一次，且隨後在室溫下固定於80%丙酮中10分鐘。將RSV F(mAb143-F3-B138)及RSV N(34C9)特異性小鼠mAb之混合物(mAb143-F3-B138及34C9為使用融合瘤技術藉由用相應抗原使小鼠免疫及B細胞之不朽化而衍生之內部抗體)添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween 20洗滌培養盤且將經生物素標記之馬抗小鼠IgG添加至培養盤中且在室溫下培育1小時。用PBS/0.05% Tween洗滌培養盤。使用 紅外染料-抗生蛋白鏈菌素來偵測RSV特異性信號且將用於分析標準化之兩個細胞染色添加至96孔培養盤中且在暗處培育1小時。培育1小時之後，洗滌培養盤，在暗處風乾20分鐘且在Licor Aerius®自動成像系統上利用針對細胞標準化之700通道雷射及針對RSV特異性信號之偵測的800通道雷射進行讀取。計算800/700比率及百分比中和度且在GraphPad中藉由四參數曲線擬合測定IC50值。
RB-1+YTE能夠以相等效力中和RSV-A及RSV-B病毒株(IC50為5ng/ml至10ng/ml)。參見表6。
將YTE突變體引入RB1之Fc部分中並未改變抗體中和RSV A及RSV B病毒株之活體外效力。RB1及RB1+YTE對RSV A之活體外中和效力分別為3ng/ml及3.6ng/ml。RB1及RB1+YTE對RSV B之活體外中和效力分別為1.7ng/ml及3.49ng/ml。如藉由Biocore所量測的RB1及RB1+YTE之動力學常數為相似的，其表明將YTE引入抗體之Fc區中未改變其抗原結合特性。
在New Iberia Research Center(UL Lafayette,LA)進行非GLP(良好實驗室操作規範)藥物動力學研究。將8隻未經生物製劑處理之雄性恆河猴隨機化且分到兩個研究組之一(每組n=4)。使每隻動物接受單一靜脈內(i.v.)劑量之RB1+YTE或莫維珠單抗-YTE，該劑量為10mg/kg。在第0天給藥前、給藥之後0.5小時、1小時、3小時、8小時及24小時及給藥之後1天、2天、3天、5天、7天及10天時獲取血液樣本。基於ECL之免疫分析 用於對恆河猴血清中之RB1+YTE(人類×[RSV]mAb(RB1-YTE)IgG1/κ(CE))及莫維珠單抗_YTE(人類化×[RSV]mAb IgG1/κ)進行定量。
該分析使用經生物素標記之小鼠抗人類IgGκ鏈(BD Biosciences,San Jose,CA)作為捕捉試劑且使用sulfoTAG小鼠抗人類IgG Fc(southernBiotech Birmingham,AL)作為偵測試劑。分析之定量下限(LLOQ)測定為1.37ng/ml，且最低要求稀釋度(MRD)為20。
使用相同免疫分析在靜脈內投加10mg/kg之恆河獼猴中評估RB1+YTE及莫維珠單抗-YTE之藥物動力學長達10天以對RB1+YTE及莫維珠單抗-YTE進行定量。對於各動物而言，使用Phoenix Winnonlin 6.3(Certara,NJ)針對各動物之血清濃度資料擬合非室模型以估算曲線下面積(AUC0至10天)。將各處理組之全部4隻動物之AUC0至10天平均化且以平均值±標準差之形式報導。對於RB1+YTE而言，AUC0至10天=1159±116微克/毫升*天，且對於莫維珠單抗-YTE而言，AUC0至10天=1381±63.0微克/毫升*天
RB1+YTE(圖例中描繪為RB1-YTE)及莫維珠單抗-YTE在恆河獼猴中顯示相似血清濃度曲線及藥物動力學。參見圖7。亦發現NHP中之RB1+YTE PK與文獻中所報導的食蟹獼猴中之莫維珠單抗-YTE PK類似。參見Dall'Acqua等人，2006,J Biol Chem,281：23514-24。
本文中所引用之所有參考文獻均以引用的方式併入，引用程度如同各個別公開案、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利特定且個別地指示以引用的方式併入一般。此以引用方式併入之陳述意欲由申請人遵循37 C.F.R.§1.57(b)(1)關於每一個別出版物、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利，其中每一 者均依照37 C.F.R.§1.57(b)(2)明確鑑別，即使此類引用不接近以引用方式併入之專用表述。以引用的方式併入之專用表述(若存在)包括於本說明書內不會以任何方式弱化此以引用方式併入之一般陳述。本文中參考文獻之引用不欲承認該參考文獻為相關先前技術，其亦絕不承認此等出版物或文獻之內容或日期。
本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制。實際上，根據前文描述及附圖，除本文所述之修改之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。此類修飾意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。
<110> 卡彼特A沃拉 卡拉S坎克斯 愛民 湯 稚峰 陳 丹尼爾 迪史黛芬諾 嵐 張 華甫 蘇
<120> 中和人類呼吸道融合病毒之抗體
<130> 24158-US-PCT
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<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<213> 智人
<212> PRT
<400> 1
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<213> 人工序列
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<223> 具有胺基酸取代之RB1重鏈
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<213> 人工序列
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<223> 前導序列
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<213> 人工序列
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<223> 經前導序列取代之RB1 VH胺基酸
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<223> RB1 VL及前導序列
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<212> DNA
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<223> 具有胺基酸取代之RB1
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<213> 人工序列
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<223> 經密碼子最佳化之RB1 VH
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<212> DNA
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<223> 經密碼子最佳化之RB1 VL
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<212> DNA
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<223> 前導序列重鏈
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<212> DNA
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Claims (28)

  1. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其與人類RSV F蛋白結合，其中該抗體或抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。
  2. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其與人類RSV F蛋白結合，其包含輕鏈免疫球蛋白、重鏈免疫球蛋白或輕鏈免疫球蛋白及重鏈免疫球蛋白兩者，該抗體或其抗原結合片段選自由以下組成之群：1)包含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的重鏈可變區及/或包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段；2)包含與SEQ ID NO：7包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：8包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段；及3)包含與SEQ ID NO：7包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的重鏈可變區及/或與SEQ ID NO：8包含至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，其中任何序列變化發生於該抗體之構架區中。
  3. 如請求項1或2之抗體或抗原結合片段，其中如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，該抗體或其抗原結合片段與人類RSV融合前F蛋白以約1×10-9M至約1×10-12M之KD值結合。
  4. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，其與包含SEQ ID NO：7之重鏈可變區及SEQ ID NO：8之輕鏈可變區的抗體結合於人類RSV F蛋白之相同抗原決定基，其中如藉由表面電漿子共振(例如，BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定，該抗體或其片段與人類RSV融合前F蛋白以約1×10-9M至約1×10-12M之KD值結合。
  5. 如請求項4之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體經由以下相互作用中之一或多者與人類RSV F蛋白結合：1)輕鏈CDR3環，經由殘基Phe 91及Leu 92，與人類RSV F蛋白之Arg 429之側鏈經由在該CDR3環中之Phe 91及Leu 92之羰基氧與人類RSV F蛋白之Arg 429之胍基氮之間形成兩個氫鍵相互作用；2)輕鏈CDR2環，經由殘基Asp 50及Glu 55，與人類RSV F蛋白之Asn 426及Lys 445形成氫鍵；3)重鏈CDR3環，經由殘基Tyr 104及Tyr 110，與人類RSV F蛋白上之Ile 432形成凡得瓦爾相互作用(van der Waals interaction)表面；4)重鏈CDR3環，經由Asn 107，與人類RSV F蛋白之Lys 433形成氫鍵；及/或5)輕鏈結合RSV融合前三聚體之鄰近單體之Glu 161及Ser 182。
  6. 如請求項5之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體經由全部以下相互作用與人類RSV F蛋白結合：1)該輕鏈CDR3環，經由殘基Phe 91及Leu 92，與人類RSV F蛋白之Arg 429之側鏈經由在該CDR3環中之Phe 91及Leu 92之羰基氧與人類RSV F蛋白之Arg 429之胍基氮之間形成兩個氫鍵相互作用；2)該輕鏈CDR2環，經由殘基Asp 50及Glu 55，與人類RSV F蛋白之Asn 426及Lys 445形成氫鍵；3)該重鏈CDR3環，經由殘基Tyr 104及Tyr 110，與人類RSV F蛋白上之Ile 432形成凡得瓦爾相互作用表面；4)該重鏈CDR3環，經由Asn 107，與人類RSV F蛋白之Lys 433形成氫鍵；及5)該輕鏈結合RSV融合前三聚體之該鄰近單體之Glu 161及Ser 182。
  7. 如請求項1、2及4至6中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含有包含該SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區及包含該SEQ ID NO：8之胺基酸序列之輕鏈可變區。
  8. 如請求項7之經分離之抗體或抗原結合片段，其為具有兩個輕鏈及兩個重鏈之全長抗體，其中各輕鏈包含：包含SEQ ID NO：8之可變區及人類κ輕鏈(SEQ ID NO：14)；且各重鏈包含：包含SEQ ID NO：7之可變區及人類IgG1恆定區(SEQ ID NO：13)。
  9. 如請求項7之經分離之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的輕鏈。
  10. 如請求項8之經分離之抗體，其中該重鏈之胺基酸序列由該SEQ ID NO：23之胺基酸序列組成，且該輕鏈之胺基酸序列由該SEQ ID NO：25之胺基酸序列組成。
  11. 如請求項1、2及4至6中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其為IgG抗體。
  12. 如請求項1、2及4至6中任一項之經分離之抗體或抗原結合片段，其為一種抗體，其中該抗體產生於CHO細胞中。
  13. 一種經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中之任一者之胺基酸序列。
  14. 如請求項13之經分離之多肽，其包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25中之任一者之該胺基酸序列。
  15. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項13或14中任一項之多肽。
  16. 一種表現載體，其包含如請求項15之經分離之核酸。
  17. 一種宿主細胞，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段、如請求項13或14之多肽、如請求項15之核酸或如請求項16之表現載體。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其為畢赤酵母(Pichia)細胞或中國倉鼠卵巢細胞。
  19. 一種組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  20. 如請求項19之組合物，其進一步包含對抗呼吸道病原體之抗體或其抗原結合片段，該呼吸道病原體選自流行性感冒、人類細胞巨大病毒(hCMV)、人類偏肺病毒(hMPV)、人類副流行性感冒(hPIV)、人類鼻病毒(hRV)、黴漿菌肺炎、肺炎鏈球菌、腺病毒、博卡病毒(bocavirus)、腸病毒、諾羅病毒(norovirus)或BK病毒。
  21. 如請求項20之組合物，其中該呼吸道病原體為流行性感冒、hCMV、hMPV、hPIV、諾羅病毒或BK病毒。
  22. 一種產生抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含：1)將包含編碼如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段的重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸之宿主細胞在有利於該聚核苷酸表現之條件下培 養；及2)視情況，自該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或抗原結合片段。
  23. 一種如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段或如請求項19至21中任一項之組合物之用途，其係用於製造用於預防或治療RSV感染之藥物。
  24. 一種如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段之用途，其係用於製造用於預防或治療移植相關性RSV感染之藥物。
  25. 如請求項23或24之用途，其中該藥物用於與另一預防或治療性藥劑一起投與。
  26. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體或抗原結合片段及選自RSV F蛋白及RSV G蛋白及其片段之抗原。
  27. 一種用於偵測樣本中人類RSV融合前F蛋白或其片段之存在的方法，該方法包含使該樣本與如請求項1至12中任一項之抗體或片段接觸，及偵測該抗體或片段與該肽之間的複合物之存在；其中偵測到該複合物指示存在該RSV融合前F蛋白。
  28. 如請求項1、2及4至6中任一項之抗體或抗原結合片段，其適用於製備用於以下目的之藥物： 1)預防或治療感染或感染性疾病；或2)預防或治療因感染性併發症所致之呼吸道及移植疾病。
TW105134803A 2015-10-29 2016-10-27 中和人類呼吸道融合病毒之抗體 TWI743057B (zh)

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