KR102140113B1 - 인간 호흡기 세포융합 바이러스를 중화시키는 항체 - Google Patents

인간 호흡기 세포융합 바이러스를 중화시키는 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 항-RSV 중화 역가를 갖는 모노클로날 항체에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 항체를 코딩하는 단리된 핵산 및 그로 형질전환된 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항체 및 핵산을, 특히 영아 및 노인에서 수동 면역요법제로서, 사용하는 진단, 예방 및 치료 방법을 추가로 제공한다.

Description

인간 호흡기 세포융합 바이러스를 중화시키는 항체
본 발명은 높은 항-RSV 중화 역가를 갖는 인간 모노클로날 항체뿐만 아니라 영아 및 노인에서 수동 면역요법제로서의 이들 항체의 용도에 관한 것이다.
파라믹소바이러스는 유의한 인간 및 동물 병원체인 외피보유 음성-가닥 RNA 바이러스이다. 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (hRSV, RSV)는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 패밀리, 뉴모비리나에(Pneumovirinae) 서브패밀리에 속한다. 2종의 하위유형, 유형 A 및 유형 B가 확인되었고, 이는 6개월령 미만의 소아에서 중증 및 때때로 심지어 치명적 호흡기 감염의 주요 원인이다. 기저 질환, 예컨대 COPD, 천식, 암, HIV 또는 이식후를 포함하는 면역손상 상태를 갖는 성인이 또한 중증 RSV 감염의 발병 위험이 있다. 50년 동안 급성 호흡기 감염으로 인한 성인의 연간 입원의 15%는 RSV에 의해 유발된다. 미국에서, RSV는 해마다 100,000명 초과의 입원을 유발하고, 전세계적으로 매년 약 160,000명의 사망을 유발하는 것으로 추정된다. 현재 RSV에 대한 백신은 없고, 포르말린-불활성화 바이러스를 사용한 시험이 RSV로 감염 시 영아에서 증가된 질환 중증도와 연관되었다. hRSV와 유사한 인간 메타뉴모 바이러스 (hMPV) 및 인간 파라인플루엔자 바이러스 (hPIV)를 포함하는 다른 패밀리 구성원이 또한 급성 호흡기 질병을 유발한다.
hRSV 게놈은 11개의 단백질을 코딩하는 대략 15 kb의 단일-가닥 음성-센스 RNA 분자이다. 이들 단백질 중 2종은 비리온의 주요 표면 당단백질이다. 이들은 (i) 세포에 대한 바이러스 결합을 매개하는 부착 (G) 단백질, 및 (ii) 감염 주기의 초기 단계에서의 바이러스 및 세포 막의 융합 및 특징적인 세포융합을 형성하기 위한 인접한 세포의 막과의 감염된 세포의 막의 융합 둘 다를 촉진하는 융합 (F) 단백질이다. 부착 단백질 G는 세포 표면 수용체에 결합하고 F와 상호작용한다. 이 상호작용은 F에서 입체형태적 변화를 촉발하여 막 융합을 유도하고, 이에 의해 바이러스 리보핵단백질 복합체를 숙주 세포 세포질 내로 방출한다.
F 단백질 또는 G 단백질에 대한 모노클로날 항체는 시험관내에서 중화 효과 및 생체내에서 예방적 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Beeler and Coelingh 1989, J. Virol. 63:2941-50; Garcia-Barreno et al., 1989, J. Virol. 63:925-32; Taylor et al., 1984, Immunology 52: 137-142; Walsh et al., 1984, Infection and Immunity 43:756-758]; 및 미국 특허 번호 5,842,307 및 6,818,216을 참조한다. F 당단백질 상의 중화 에피토프는 원래 항체 회피 변이체에서 변경된 아미노산을 확인하고 RSV F-유래 펩티드에 결합하는 항체를 평가함으로써 맵핑되었다. 이들 연구는 중화 항체가 종종 2개의 별개의 선형 에피토프에 표적화된다는 것을 입증하였다. 융합전 및 융합후 F 형태에 대한 항원 부위의 검토를 위해 문헌 [Graham et al., 2015, Curr Opin Immunol 35:30-38]을 참조한다. 항원 부위 II (또한 부위 A로 칭해짐)는 잔기 255 내지 275를 포함하고 팔리비주맙 (시나기스(SYNAGIS)®, 아스트라제네카(AstraZeneca))의 표적이다. 이 에피토프는 입체형태적으로 의존적인 것으로 예측되었고, 이 에피토프와 복합체화된, 팔리비주맙의 보다 강력한 유도체의 구조는 선형 에피토프가 헬릭스-루프-헬릭스 입체형태를 채택한다는 것을 밝혀냈다. 항원 부위 IV (또한 부위 C로 칭해짐)는 잔기 422 내지 438을 포함하고 항체 MAb19 및 101F의 표적이다. 이 에피토프는 시스테인-풍부 영역에 대해 C-말단이고 상동 파라믹소바이러스에서 F 당단백질이 융합전과 융합후 입체형태 사이에서 구조적으로 변화되지 않는 도메인 II의 일부이다. 5C4, AM22 및 D25는 단지 융합전 F 단백질 상에만 존재하는 부위 0으로 지정된 에피토프를 기술하고 팔리비주맙보다 50배 더 강력하였다. 문헌 [McLellan et al., 2013, Science 340:1113-1117]; 국제 특허 출원 번호 WO 2008/147196 및 미국 특허 번호 8,568,726을 참조한다. 다른 hRSV 항체는 국제 특허 출원 번호 WO94/06448 및 WO92/04381 및 미국 특허 번호 8,221,759에 기재되어 있다.
가능한 경우 능동 면역화를 위한 RSV 백신은 미성숙 면역계를 갖는 신생아 또는 면역억제된 환자의 치료에 이용될 수 없다. 질환의 보다 만성 형태의 결과로서 예방적 수동 면역요법이 요구되는 환자에서, 현행 요법은 풀링된 혈장으로부터 제조된 인간 IgG의 주기적 정맥내 접종을 통해 이루어진다. 이러한 유형의 요법은, 중화 항-RSV 항체의 낮은 역가로 인해, 다량의 글로불린 (예를 들어, kg당 0.75 gm)을 수반하고 결과적으로 고위험 달 (가을, 겨울 및 초봄) 동안 월별 기준으로 장기간 (2 내지 4시간)에 걸친 클리닉 또는 병원에서의 정맥내 투여를 필요로 한다.
본 발명은 하기 명시된 구조적 및 기능적 특색을 포함하는 항-RSV F-단백질 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호(SEQ ID NO): 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV F-단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어(BIACORE)) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사(KinExa) 또는 옥테트(OCTET))에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-6 M 내지 약 1 x 10-9 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV F-단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 또는 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 회합되지 않는다. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 회합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV F-단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 또는 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 회합되지 않는다. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 회합된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV F-단백질에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7로 이루어진 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8로 이루어진 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 이들 상기 언급된 실시양태에서, 서열 변이는 프레임워크 영역에서 발생한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 또한 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 CDR (서열식별번호: 1-3) 및/또는 경쇄 CDR (서열식별번호: 4-6)에서의 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 서열식별번호: 7의 VH 서열은 서열식별번호: 1-3의 CDR을 갖고; 서열식별번호: 8의 VL 서열은 서열식별번호: 4-6의 CDR을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 RSV F 단백질에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 중쇄 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 경쇄를 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 RSV F 단백질에 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 23의 중쇄 및 서열식별번호: 25의 경쇄를 포함하는 항체와 동일한 인간 RSV F 단백질의 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 한 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 7 및 8의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7의 중쇄 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 8의 경쇄 가변 영역에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 23의 중쇄 및 서열식별번호: 25의 경쇄를 포함하는 항체의 인간 RSV에 대한 결합을 교차-차단하는 (또는 그와 경쟁하는) 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특징; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특징. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7의 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 8의 경쇄 가변 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7의 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 8의 경쇄 가변 영역에서의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 중쇄 CDR (서열식별번호: 1-3) 및/또는 경쇄 CDR (서열식별번호: 4-6)에서의 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 최대 30개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄, 및/또는 최대 12개의 아미노산 치환을 포함하는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 RSV F 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 RSV F 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 항체는 하기 상호작용 중 1개 이상 또는 하기 상호작용 모두를 통해 인간 RSV F 단백질에 결합한다:
1) 경쇄 CDR3 루프가, 잔기 Phe 91 및 Leu 92를 통해, CDR3 루프의 Phe 91 및 Leu 92의 카르보닐 산소와 인간 RSV F 단백질의 Arg 429의 구아니디노 질소 사이의 2개의 수소 결합의 형성을 통해 인간 RSV F 단백질의 Arg 429의 측쇄와 상호작용하는 것;
2) 경쇄 CDR2 루프가, 잔기 Asp 50 및 Glu 55를 통해, 인간 RSV F 단백질의 Asn 426 및 Lys 445와 수소 결합을 형성하는 것;
3) 중쇄 CDR3 루프가, 잔기 Tyr 104 및 Tyr 110을 통해, 인간 RSV F 단백질 상의 Ile 432와 반 데르 발스 상호작용을 위한 표면을 형성하는 것;
4) 중쇄 CDR3 루프가, Asn 107을 통해, 인간 RSV F 단백질의 Lys 433과 수소 결합을 형성하는 것; 및
5) 경쇄가 RSV 융합전 삼량체의 이웃 단량체의 Glu 161 및 Ser 182에 대해 패킹하는 것.
상기 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단리된다.
상기 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 재조합 항체이다.
상기 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 전장 항체이다.
상기 언급된 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 상기 기재된 가변 중쇄 중 임의의 것 및 (b) 리더 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 10의 리더 펩티드)로 이루어진 중쇄 영역 가변 영역을 포함할 수 있다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 상기 기재된 가변 경쇄 중 임의의 것 및 (b) 리더 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 10의 리더 펩티드)로 이루어진 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
상기 언급된 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 가변 중쇄 중 임의의 것 및 임의의 인간 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IgG 이소형의 것이고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 인간 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 중쇄 IgG1 불변 도메인을 포함하며 여기서 IgG1 불변 도메인은 아푸코실화(afucosylated)된다.
상기 언급된 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 가변 경쇄 중 임의의 것 및 인간 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 카파 경쇄 불변 도메인 또는 그의 변이체를 포함하며, 여기서 변이체는 최대 20, 10, 5, 3, 2, 또는 1개의 변형된 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 람다 경쇄 불변 도메인 또는 그의 변이체를 포함하며, 여기서 변이체는 최대 20, 10, 5, 3, 2, 또는 1개의 변형된 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 사량체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 8을 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 불변 도메인 (서열식별번호: 14)을 포함하고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 7을 포함하는 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 도메인 (서열식별번호: 13)을 포함한다.
상기 언급된 실시양태 중 임의의 것의 특정 측면에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 1종의 예방제 또는 치료제에 접합될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료제는 제2 항체 또는 그의 단편, 면역조정제, 호르몬, 세포독성제, 효소, 방사성핵종, 적어도 1종의 면역조정제, 효소, 방사성 표지, 호르몬, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 세포독성제에 접합된 제2 항체, 또는 그의 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 서열식별번호: 1-8, 23 또는 25 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 임의의 상기 서열의 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1-8, 23 또는 25의 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 1-8, 23 또는 25의 폴리펩티드 (여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있음) 중 어느 하나를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 이들 단리된 핵산 및 그를 포함하는 발현 벡터는 재조합 숙주 세포에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 서열식별번호: 1-8, 23 또는 25의 폴리펩티드 (여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있음) 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체 또는 희석제는 L-히스티딘이다. 이러한 실시양태의 한 측면에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 10 mM L-히스티딘, 7% (w/v) 수크로스, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트-80, pH 6.0 중에 제제화된다. 항체 또는 항원 결합 단편은 전형적으로 이러한 제제 중에서 약 100 mg/mL로 존재한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하고 추가의 예방제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 추가의 예방제 또는 치료제는 제2 항-hRSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제2 항-hRSV 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 용기 또는 주사 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하고; 임의로, 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상이한 벡터 내에 있다. 한 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 hRSV 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 예방제 또는 치료제 또는 치료 절차와 함께 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 hRSV 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료될 대상체는 인간 대상체이다. 한 실시양태에서, 추가의 예방제 또는 치료제는 제2 항-hRSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 항-RSV F 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산, 또는 항체 접합체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 hRSV 감염의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 예방제 또는 치료제 또는 치료 절차와 조합하여 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 hRSV 감염을 예방하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 백신, 또는 면역원성 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
한 실시양태에서, 백신, 또는 면역원성 조성물은 RSV F 단백질 및 RSV G 단백질 및 그의 단편으로부터 선택된 항원을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 샘플을 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키고 항체 또는 단편과 펩티드 사이의 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함하며; 여기서 복합체의 검출은 RSV F 단백질의 존재를 나타내는 것인, 샘플에서 RSV의 존재를 검출하는 방법 (F 단백질 또는 그의 단편의 검출에 의함)을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
본 발명은 또한 모 항-hRSV F-단백질 항체를 수득하고 모 항-hRSV F-단백질 항체의 이펙터 기능을 증가시키는 것을 포함하며; 여기서 생성된 항-hRSV F-단백질 항체의 활성은 모 항-hRSV F-단백질 항체와 비교하여 증가되는 것인, 항-hRSV F-단백질 항체의 항-hRSV 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본원에 사용된 "모 항체"는 야생형 Fc 영역 및/또는 야생형 글리코실화 (즉, 조작되지 않은 포유동물 숙주 세포에서의 폴리펩티드의 발현으로부터 생성된 글리코실화 패턴)를 갖는 항체를 지칭한다. 모 항체의 이펙터 기능은 그의 Fc 영역을 돌연변이시키거나 또는 그의 글리코실화를 변경시킴으로써, 예를 들어 아푸코실화된 항체를 제조함으로써 증가될 수 있다 (하기 추가로 상세하게 논의된 바와 같음). 한 실시양태에서, 모 항-hRSV F-단백질 항체의 이펙터 기능은 모 항-hRSV F-단백질 항체의 Fc 영역에서의 돌연변이를 만듦으로써 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 모 항-hRSV F-단백질 항체의 이펙터 기능은 항체로부터 푸코스 잔기를 제거하거나, 또는 푸코스를 당단백질에 부가하는 효소의 활성을 제거하도록 유전자 조작된 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 증가된다.
도 1a-b는 (ELISA로부터의) 인간 RSV-F 융합전 (a) 및 융합후 (b) 단백질에 대한 인간 RSV 항체 D25, 팔리비주맙, 및 RB1의 결합 곡선을 나타낸다.
도 2a-b는 RSV A 롱(Long) 균주 (a) 및 RSV B 워싱턴(Washington) 균주 (b)에서의 인간 RSV 항체에 대한 중화 곡선을 나타낸다.
도 3a-b는 융합 F 단백질의 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의한 RB1의 에피토프 맵핑 (a) 및 융합전 F 결정 구조 상의 에피토프 맵팽된 잔기 (b)를 나타낸다.
도 4a-d는 항체의 농도에 대해 플롯팅된 RSV A의 코튼 래트 챌린지 모델 (a) 및 항체의 농도에 대해 플롯팅된 RSV B 챌린지 (b)의 폐에서의 D25 대비 RB1의 효능 또는 RSV A 챌린지 (c) 및 RSV B 챌린지 (d)에 대한 항체의 용량에 대해 플롯팅된 조직에 존재하는 바이러스 입자 (PFU/g)를 나타낸다.
도 5a-d는 항체의 농도에 대해 플롯팅된 RSV A의 코튼 래트 챌린지 모델 (a) 및 항체의 농도에 대해 플롯팅된 RSV B 챌린지 (b)의 코에서의 D25 대비 RB1의 효능 또는 RSV A 챌린지 (c) 및 RSV B 챌린지 (d)에 대한 항체의 용량에 대해 플롯팅된 조직에 존재하는 바이러스 입자 (PFU/g)를 나타낸다.
도 6은 (ELISA로부터의) 인간 RSV A F 단백질에 대한 인간 RSV 항체 RB1+YTE의 결합 곡선을 나타낸다.
도 7은 레서스에서의 RB1-YTE (RB1+YTE) 대 YTE 돌연변이 세트를 갖는 모타비주맙의 약동학적 특성을 나타낸다.
약어
본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐 하기 약어가 사용될 것이다:
ADCC 항체-의존성 세포성 세포독성
CDC 보체-의존성 세포독성
CDR 카바트(Kabat) 넘버링 시스템을 사용하여 정의된, 이뮤노글로불린 가변 영역 내의 상보성 결정 영역
CHO 중국 함스터 난소
ELISA 효소-연결 면역흡착 검정
FR 항체 프레임워크 영역: CDR 영역을 제외한 이뮤노글로불린 가변 영역
HRP 양고추냉이 퍼옥시다제
IC50 50% 억제를 일으키는 농도
IgG 이뮤노글로불린 G
카바트 문헌 [Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)]에 의해 개척된 이뮤노글로불린 정렬 및 넘버링 시스템
mAb 또는 Mab 또는 MAb 모노클로날 항체
V 영역 상이한 항체 사이의 서열에 있어서 가변적인 IgG 쇄의 절편. 이는 경쇄 내의 카바트 잔기 109 및 중쇄 내의 113까지 연장된다.
VH 이뮤노글로불린 중쇄 가변 영역
VK 이뮤노글로불린 카파 경쇄 가변 영역
정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 기술 과학 용어가 하기 구체적으로 정의되어 있다. 이 문헌의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 바와 같은 단수 형태의 단어는, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용된 바와 같은 "투여" 및 "치료"는 외인성 제약, 치료제, 진단제, 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체의 접촉을 지칭한다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉뿐만 아니라 시약과 세포와 접촉되어 있는 유체의 접촉을 포괄한다. "투여" 및 "치료"는 또한, 예를 들어, 세포의, 시약, 진단, 결합 화합물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한, 시험관내 및 생체외 치료를 의미한다.
"RSV 질환"은 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)에 의한 감염에 의해 직접 또는 간접적으로 유발된 임의의 질환뿐만 아니라 환자가 RSV에 의한 감염에 대한 소인이 있는 질환 또는 상태를 의미한다. 전자 카테고리에 속하는 질환의 예는 폐렴 및 세기관지염을 포함한다. 후자 카테고리의 질환 및 상태 (즉, 환자를 중증 RSV 감염의 위험에 놓이게 하는 것)는 낭성 섬유증, 선천성 심장 질환, 암, 연령 관련 면역억제, 이식 수용자 및, 일반적으로, 면역억제 또는 면역계의 감소된 기능의 상태를 유발하는 임의의 상태 예컨대 수술적 기관 이식 요법 후 또는 조산을 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료하는"은 치료제, 예컨대 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 중 임의의 것을 함유하는 조성물을, 내적으로 또는 외적으로, 그에 대해 작용제가 치료 활성을 갖는 1종 이상의 질환 증상을 갖거나, 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 작용제는 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로써 1종 이상의 질환 증상(들)의 퇴행의 유도에 의해서든 또는 그의 진행의 억제에 의해서든, 치료된 대상체 또는 집단에서 이러한 질환 증상을 완화시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정한 질환 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양은 인자 예컨대 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 도출하는 약물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 완화되었는 지의 여부는 이러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 통상의 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다. 항-RSV 항체를 사용한 치료는 또한 다른 개입 (항체, 핵산, 백신 및 소분자 화합물)과 조합되어 다른 호흡기 병원체를 치료할 수 있다.
"예방하다" 또는 "예방하는"은 예방제, 예컨대 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 중 임의의 것을 함유하는 조성물을, 내적으로 또는 외적으로, 그에 대해 작용제가 예방적 활성을 갖는 hRSV에 의해 감염될 위험이 있는 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 예방하는 것은 후속 RSV 감염의 가능성 또는 중증도를 감소시키는 것, RSV 감염 시 하기도 감염 (LRI)과 연관된 증상을 호전시키는 것, 및 면역을 유도하여 RSV 감염에 대해 보호하는 것을 포함한다. 전형적으로, 작용제는 감염을 차단하기 위해 폐 및/또는 코에서 RSV를 중화시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정한 질환 증상을 호전시키는 데 효과적인 예방제의 양은 인자 예컨대 환자의 연령, 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 도출하는 작용제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 호전되었는지의 여부는 이러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 통상의 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있거나 또는 특정 경우에서 입원에 대한 필요를 호전시킬 것이다.
hRSV F 단백질
인간 RSV F 단백질은 공유 회합된 F1 및 F2 서브유닛으로 단백질분해적으로 절단되는 준안정 삼량체 전구체 (F0)로서 합성된다. 융합전 형태의 F 삼량체의 원자 구조는 파라믹소비리다에 과의 PIV5 및 RSV 구성원에 대해 결정되었다. 문헌 [McLellan et al., 2011, J Virol. 85:7788-7796 (RSV) 및 Welch et al., 2012, Proc Natl Acad Sci 109:16672-16677 (PIV)]을 참조한다. 융합전 F는 짧은 C-말단 세포질 꼬리, 단일 막횡단 도메인, 나선형 줄기, 및 구상 헤드 도메인을 갖는다. 융합후 형태의 NDV, hPIV3, 및 RSV F의 원자 구조는 융합전 F를 구상 헤드 도메인의 일부가 재배열되어 6개의 헬릭스 다발을 형성한 융합후 F로 전환시키기 위해 큰 재폴딩 사건이 발생한다는 것을 밝혀낸다. 이들 구조는, 펩티드 억제 데이터와 함께, 활성화 시, F1/F2가 재배열되어 F1의 N-말단으로부터의 소수성 융합 펩티드를 표적 세포 막 내로 삽입하여 프리-헤어핀 중간체를 형성하는 F 매개된 막 융합에 대한 모델을 시사한다. 이러한 상대적으로 연장된 구조는 바이러스를 세포 막에 테더링하고 융합후 구조의 안정한 6개의 헬릭스 다발을 형성하기 위해 붕괴된다. 준안정 융합전으로부터 프리헤어핀 중간체로, 융합후 입체형태로의 전이는 융합후 형태가 가장 안정한 상태를 나타내는 에너지 구배로 아래로 진행되고, F 재폴딩 동안 방출된 에너지는 막 융합과 커플링된다.
용어 hRSV F 단백질은 인간 RSV F 단백질뿐만 아니라 그의 단편 예컨대 신호 펩티드가 결여된 그의 성숙 단편을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 인간 RSV F 단백질의 아미노산 서열은 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 AAR14266 (hRSV B 균주 9320)에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
항-hRSV 항체 및 그의 항원-결합 단편
본 발명은 바람직하게는 RSV A 균주 및 B 균주 둘 다로부터의 인간 RSV F 단백질에 결합하고, 융합전 F 단백질 및 융합후 F 단백질 둘 다에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 이러한 항체 또는 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-RSV F-단백질 항체는 단리된다. 본원에 기재된 항체는 F 단백질의 부위 IV에서 에피토프에 결합한다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태 중 임의의 것에서, 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않고/거나 경쇄 또는 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 중쇄는 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지고 경쇄는 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다.
바람직한 실시양태에서, 항-RSV F-단백질 항체는 완전 인간이다. 본 발명의 모노클로날 항체의 주요 이점은 이들이 인간 CDR3 서열을 포함하고, 일부 실시양태에서, 완전히 인간 모노클로날 항체일 수 있다는 사실로부터 유래한다. 따라서 RSV 질환의 면역예방 및 면역요법을 위한 본 발명의 완전 인간 모노클로날 항체의 생체내 사용은 수동적으로 투여된 항체에 대한 숙주 면역 반응의 문제를 매우 감소시킨다. 이러한 문제는 이종 또는 키메라 유래의 선행 기술 모노클로날 항체가 이용되는 경우에 통상적으로 직면한다. 이러한 이점의 제2 중요한 측면은 비-인간 서열을 함유하는 이종 또는 키메라 단백질의 발현은 종결될 수 없는, 유전자 요법 적용에 대한 이들 인간 모노클로날 항체의 잠재적 안전성이다.
본원에 사용된 바와 같은 항-RSV F-단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. "인간 RSV에 특이적으로 결합하는" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 약 1 nM 또는 그 초과의 친화도 (예를 들어, 1 nM-2 pM, 1 nM, 100 pM, 10 pM 또는 2 pM)의 Kd로 융합전 또는 융합후 인간 RSV F 단백질에 결합하지만, RSV F 단백질 서열이 결여된 다른 단백질에 결합하지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 한 실시양태에서, 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 또한 소 RSV F 단백질과 교차-반응성이다. 본원에 사용된 "교차-반응성"은 다른 종으로부터의 상동 단백질과 반응하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체가 인간 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하는지 여부는 관련 기술분야에 공지된 임의의 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 관련 기술분야에 공지된 검정의 예는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)을 포함한다.
본 발명은 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 모노클로날 항체 (2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화 항체, 완전 인간 항체, 및 키메라 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 항-hRSV F-단백질 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 항체의 항원-결합 단편, 즉 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어, 1개 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 Fab 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fab 단편"은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단의 생성물일 수 있다.
본 발명은 Fc 영역을 포함하는 항-RSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 Fab' 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fab' 단편"은 1개의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개의 중쇄의 부분 또는 단편을 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 F(ab')2 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄, 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')2 단편"은 항체의 펩신 절단의 생성물일 수 있다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 Fv 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 결여된다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 scFv 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. 용어 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 scFv가 항원-결합을 위한 목적하는 구조를 형성하게 하는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 번호 4,946,778 및 5,260,203을 참조한다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 도메인 항체 및 그의 사용 방법을 포함한다. "도메인 항체"는 단지 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학상 기능적 이뮤노글로불린 단편이다. 일부 경우에, 2개 이상의 VH 영역은 펩티드 링커로 공유 연결되어 2가 도메인 항체를 형성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 영역은 동일하거나 또는 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
본 발명은 항-RSV F-단백질 2가 항체 및 그의 사용 방법을 포함한다. "2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조).
본 발명은 항-RSV F-단백질 디아바디 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 완전히 기재되어 있다. 조작된 항체 변이체의 검토를 위해 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조한다.
전형적으로, 일부 방식으로 변형된 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 그의 결합 활성이 몰 기준으로 표현된 경우에, (모 항체와 비교하여) 적어도 10%의 그의 결합 활성을 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 모 항체와 비교하여 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 초과의 RSV F-단백질 결합 친화도를 보유한다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 그의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환 (항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보조된 변이체"로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 또한 의도된다.
본 발명은 단리된 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "단리된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이들이 생산된 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질 예컨대 세포 파편 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 발현 시스템 성분 예컨대 숙주 세포로부터의 생물학적 분자 또는 그의 성장 배지가 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제의 성분을 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 모노클로날 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편뿐만 아니라 복수의 단리된 모노클로날 항체를 포함하는 모노클로날 항체 조성물을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단, 즉, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 아미노산 서열이 동일한 집단을 포함하는 항체 분자를 지칭한다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 그의 가변 도메인, 특히 종종 상이한 에피토프에 특이적인 그의 CDR이 상이한 아미노산 서열을 갖는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종 집단의 항체로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 재조합 DNA 방법에 따라 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조).
일반적으로, 기본 (또는 "전장") 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 가변 영역 또는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 도메인을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 불변 영역 또는 주로 이펙터 기능을 담당하는 도메인을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 또한, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 항체의 이소형을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 더 많은 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))을 참조한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 관련하여, 용어 도메인 및 영역은 적절한 경우에 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 2개의 결합 부위는, 일반적으로, 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치한, 또한 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭해지는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 통상적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특정한 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에의 아미노산의 할당은, 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat, 1978, Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., 1977, J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia et al., 1987, J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" (즉 경쇄 가변 도메인 내의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] (서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조하고; 또한 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917] (구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)을 참조한다. 본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR 잔기로 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.
"단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않거나, 또는 자연에서 이에 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드와 연결되는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그의 일부 조합을 의미한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정한 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"가 무손상 염색체를 포괄하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 명시된 서열에 더하여, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개 또는 그 초과의 다른 단백질 또는 그의 부분 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 열거된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는, 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
어구 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치되는 경우에 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA에 그가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 그가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열에 그가 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 리딩 상 내에 있다는 것을 의미하지만, 항상 그런 것은 아니다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
본원에 사용된 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 전달의 수와 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 또는 부주의한 돌연변이로 인해, 모든 자손이 정확하게 동일한 DNA 내용물을 갖지 않을 것으로 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우에, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.
본원에 사용된 "배선 서열"은 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 DNA 서열의 서열을 지칭한다. 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 서열의 임의의 적합한 공급원이 사용될 수 있다. 인간 배선 서열은, 예를 들어, 미국 국립 보건원 산하 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)에 대한 웹사이트 상의 조인솔버(JOINSOLVER) 배선 데이터베이스로부터 수득될 수 있다. 마우스 배선 서열은, 예를 들어, 문헌 [Giudicelli et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33:D256-D261]에 기재된 바와 같이 수득될 수 있다.
예시적인 항-RSV F-단백질 항체의 물리적 및 기능적 특성
본 발명은 명시된 구조적 및 기능적 특색을 갖는 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 RSV 감염과 연관된 질환/상태의 치료 또는 예방에 있어서 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용 방법을 제공한다.
"본 발명의 항-RSV F-단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편"은 본원에 논의된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1) 또는 그의 변이체 (예를 들어, 서열 변이체 또는 기능적 변이체); 표 7에 제시된 CDR 중 임의의 1개 이상을 포함하는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편; 본원에 논의된 항체 (예를 들어, RB1)와 동일한 인간 RSV F-단백질의 에피토프에 결합하는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편; 및 RSV 결합에 대해 본원에 논의된 항체 (예를 들어, RB1)를 (부분적으로 또는 완전히) 교차-차단하거나 또는 이에 의해 (부분적으로 또는 완전히) 교차-차단되는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
교차-차단 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표준 결합 검정 (예를 들어, 비아코어, ELISA, 유동 세포측정법)에서 본 발명의 항체와 교차-경쟁하는 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 재조합 RSV F 단백질이 플레이트 상에 고정되고, 항체 중 1종이 형광 표지되고 표지된 항체의 결합과 경쟁하는 비-표지된 항체의 능력이 평가되는 표준 ELISA 검정이 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 비아코어 분석이 교차-경쟁하는 항체의 능력을 평가하는 데 사용될 수 있다. RSV F-단백질에 대한 또 다른 항체 (예를 들어, 항체 D25)의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 RSV F 단백질에 대한 결합에 대해 또 다른 항체 (예를 들어, D25)와 경쟁할 수 있기 때문에, 일부 경우에, 항체 D25와 동일한 RSV F 단백질 상의 에피토프, 중첩된 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 항-RSV F-단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 그의 단편은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 또한, 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-RSV F-단백질 항체 중 임의의 것에 의해 결합된 에피토프와 중첩된 에피토프에 결합하는 항체가 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 표적 항원 상의 항체 에피토프를 맵핑하는 데 이용가능한 여러 방법이 존재하고, H/D-Ex 질량 분광측정법, X선 결정학, 펩스캔(pepscan) 분석 및 부위 지정 돌연변이유발을 포함한다. 예를 들어, 단백질분해 및 질량 분광측정법과 커플링된 HDX (수소 중수소 교환)는 특정한 항원 Y 상의 항체의 에피토프를 결정하는 데 사용될 수 있다. HDX-MS는 다양한 시간 간격으로 그 자체 및 그의 항체의 존재 하에 D2O에서 인큐베이션된 경우에 항원에 의한 중수소 혼입의 정도의 정확한 측정 및 비교에 의존한다. 중수소는 노출된 영역의 단백질의 아미드 백본 상의 수소로 교환되는 반면에 항체에 결합된 항원의 영역은 보호될 것이고 단백질분해 단편의 LC-MS/MS에 의한 분석 후 교환을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 것이다.
본 발명의 항-RSV F-단백질 항체의 이뮤노글로불린 쇄뿐만 아니라 그의 CDR의 예는 표 7에 개시된 것 (서열식별번호: 1-8, 23 및 25)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 서열식별번호: 1-8, 23, 및 25의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 임의의 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 범주는 본원에 제시된 이뮤노글로불린 쇄, 예를 들어, 서열식별번호: 7, 8 중 임의의 것의 변이체를 포함하는 단리된 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함하며; 여기서 변이체는 하기 특성 중 1개 이상을 나타낸다: (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특성; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특성. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 hRSV F-단백질에 결합하고 서열식별번호: 8 (VL) 및 7 (VH)과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 변이체는 목적하는 결합 및 특성, 예를 들어, (i) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 특성; 또는 (ii) 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-11 M의 Kd 값으로 인간 RSV 융합후 F 단백질에 결합하는 특성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 변화가 빈번하게 발생할 수 있도록 단백질의 아미노산을 유사한 특징 (예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 일반적으로, 폴리펩티드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다. 예시적인 보존적 치환이 표 1에 제시된다.
표 1. 예시적인 보존적 아미노산 치환
Figure 112018050793063-pct00001
본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체는 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 "기능-보존적 변이체"는 1개 이상의 아미노산 잔기가 항원 친화도 및/또는 특이성과 같은 목적하는 특성을 변경시키지 않으면서 변화된 항체 또는 단편을 지칭한다. 이러한 변이체는 아미노산의 유사한 특성을 갖는 것으로의 대체, 예컨대 표 1의 보존적 아미노산 치환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체의 VL 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 8)을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 및 프레임워크 영역에서 배타적으로 발생할 수 있거나 또는 그 중 1개 이상이 1개 이상의 CDR에 위치할 수 있는 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 본 발명의 항-hRSV 항체의 VH 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 7)을 포함하는 단리된 폴리펩티드가 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, hRSV F-단백질에 결합하고 본원에 기재된 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 1개 이상에 대해 적어도 99% 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖고, hRSV F-단백질에 대한 특이적 결합을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 프레임워크 영역에서 배타적으로 발생할 수 있거나 또는 그 중 1개 이상이 1개 이상의 CDR에 위치할 수 있는 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 VL 및 VH 도메인 (신호 서열 포함 및 포함하지 않음)을 포함하고, hRSV F-단백질에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 중쇄 또는 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본 발명은 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 쇄 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 적어도 1개의 성숙 이뮤노글로불린 경쇄 가변 (VL) 도메인 및/또는 본 발명에 따른 적어도 1개의 성숙 이뮤노글로불린 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 분자 상의 경쇄 및 중쇄 둘 다를 코딩하고, 다른 실시양태에서 경쇄 및 중쇄는 별개의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 코딩된다. 또 다른 실시양태에서 폴리뉴클레오티드는 신호 서열을 추가로 코딩한다. 예를 들어, 본 발명은 서열식별번호: 1-8, 23 및 25에 기재된 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 그에 혼성화된 폴리뉴클레오티드 및, 또한, 이러한 혼성화 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 15 (가변 중쇄) 또는 서열식별번호: 16 (가변 경쇄)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 코돈 최적화는 핵산의 특성, 예를 들어, 특정 숙주에서의 발현을 증진시키는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 17 (코돈 최적화된 가변 중쇄) 또는 서열식별번호: 18 (코돈 최적화된 가변 경쇄)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리더 서열이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 중쇄 또는 경쇄와 연결되어 각각 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22를 제공하는 서열식별번호: 19 (리더 서열 및 중쇄) 또는 서열식별번호: 20 (리더 서열 및 경쇄)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 핵산 서열을 포함한다.
일반적으로, 폴리뉴클레오티드는 낮은, 중등도의 또는 높은 엄격도 조건 하에 혼성화되고, hRSV F-단백질에 결합하는 능력을 유지하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩한다. 제1 폴리뉴클레오티드 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에 제2 폴리뉴클레오티드 분자와 어닐링할 수 있는 경우에 제1 폴리뉴클레오티드 분자는 제2 폴리뉴클레오티드 분자에 "혼성화가능"하다 (상기 문헌 [Sambrook, et al.] 참조). 온도 및 이온 강도의 조건은 혼성화의 "엄격도"를 결정한다. 전형적인 낮은 엄격도 혼성화 조건은 55℃, 5X SSC, 0.1% SDS 및 포름아미드 없음; 또는 42℃에서의 30% 포름아미드, 5X SSC, 0.5% SDS를 포함한다. 전형적인 중등도의 엄격도 혼성화 조건은 42℃에서의 40% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS이다. 높은 엄격도 혼성화 조건은 42℃ 또는, 임의로 보다 높은 온도 (예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃)에서의 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC이다. 일반적으로, SSC는 0.15M NaCl 및 0.015M Na-시트레이트이다. 혼성화는 2개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 함유하는 것을 필요로 하지만, 혼성화의 엄격도에 따라, 염기 사이의 미스매치가 가능하다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하기 위한 적절한 엄격도는 관련 기술분야에 널리 공지된 변수인 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성의 정도에 따라 달라진다. 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 더 클수록, 핵산이 혼성화될 수 있는 엄격도는 더 높아진다. 100개 초과의 뉴클레오티드 길이의 혼성화에 대해, 용융 온도를 계산하기 위한 방정식이 유래되었다 (상기 문헌 [Sambrook et al., supra, 9.50-9.51] 참조). 보다 짧은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 갖는 혼성화의 경우, 미스매치의 위치는 보다 중요해지고, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다 (상기 문헌 [Sambrook, et al., supra, 11.7-11.8] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명은 CDR-H1 (서열식별번호: 1), CDR-H2 (서열식별번호: 2) 및 CDR-H3 (서열식별번호: 3)을 포함하는 항체 중쇄 가변 (VH) 도메인 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CDR-L1 (서열식별번호: 4), CDR-L2 (서열식별번호: 5) 및 CDR-L3 (서열식별번호: 6)을 포함하는 항체 경쇄 가변 (VL) 도메인 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 (VH) 도메인 또는 서열식별번호: 23의 중쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8의 이뮤노글로불린 중쇄 가변 (VL) 도메인 또는 서열식별번호: 25의 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대 플라스미드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포가 벡터로 형질감염된 경우에 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 발현 벡터 또는 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산을 보유하는 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 포함하는, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법이 또한 제공된다.
본원에 제공된 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75% 동일한, 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한 (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 이뮤노글로불린 폴리펩티드가 또한 본 발명에 포함되며, 이 때 비교는 BLAST 알고리즘에 의해 수행되고, 여기서 알고리즘의 파라미터는 각각의 참조 서열의 전체 길이 전반에 걸쳐 각각의 서열 간의 가장 큰 매치를 제공하도록 선택된다 (예를 들어 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 코스트: 실재 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정).
서열 동일성은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 경우에 2개의 폴리펩티드의 아미노산이 동등한 위치에서 동일한 정도를 지칭한다.
하기 참고문헌은 서열 분석에 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: 문헌 [BLAST ALGORITHMS: Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; 및 Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].
결합 친화도
예로서, 및 비제한적으로, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 적어도 약 1 x 10-9 M의 KD 값 (즉, 1 x 10-9 M 이하의 KD 값)으로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 적어도 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 KD 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시에 약 1 x 10-9 M 내지 약 1 x 10-12 M의 KD 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 비아코어 또는 유사한 기술에 의해 결정 시에 적어도 약 100 pM의 KD 값 (즉, 약 100 pM 이하의 KD 값)으로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 비아코어 또는 유사한 기술에 의해 결정 시에 적어도 약 10 pM의 KD 값 (즉, 약 10 pM 이하의 KD 값)으로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 비아코어 또는 유사한 기술에 의해 결정 시에 약 1 pM 내지 약 100 pM의 KD로 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 융합후 F 단백질에 결합할 수 있다.
항체 및 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법
본 발명은 본 발명의 항-hRSV F-단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 포함하며, 이는 항체 또는 단편을 발현하는 세포주를 이러한 발현에 유리한 조건 하에 배양하고, 임의로, 세포 및/또는 성장 배지 (예를 들어 세포 배양 배지)로부터 항체 또는 단편을 단리하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 항-hRSV F-단백질 항체는 또한 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)/T7 발현 시스템, 포유동물 세포 발현 시스템 또는 하등 진핵생물 발현 시스템에서) 재조합적으로 생산될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본 발명의 항체 이뮤노글로불린 분자 (예를 들어, VH 또는 VL)를 코딩하는 핵산은 pET-기반 플라스미드 내로 삽입되고 이. 콜라이/T7 시스템에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에서 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키는 것을 포함하는, 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 예컨대 BL21 또는 BL21DE3)에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 이뮤노글로불린 쇄를 발현시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이는 lac 프로모터에 작동가능하게 연결된 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 폴리머라제 및 쇄의 발현은 숙주 세포를 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)와 함께 인큐베이션함으로써 유도된다.
관련 기술분야에 공지된, 재조합 항체를 생산하는 여러 방법이 존재한다. 항체의 재조합 생산 방법의 한 예는 미국 특허 번호 4,816,567에 개시되어 있다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 실시될 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 바이오리스틱 주사 및 핵 내로의 DNA의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항-hRSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 이뮤노글로불린 쇄를 제조하는 재조합 방법을 포함하며, 이는 항체 또는 단편의 1개 이상의 이뮤노글로불린 쇄 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하고; 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 피키아 또는 피키아 파스토리스)를 이러한 발현에 유리한 조건 하에 배양하고, 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 항체 또는 단편 또는 쇄를 단리하는 것을 포함한다.
항-hRSV F-단백질 항체는 또한 미국 특허 번호 6,331,415에 제시된 방법 중 임의의 것에 의해 합성될 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 단편 또는 이뮤노글로불린 쇄의 발현을 위한 숙주로서, 포유동물 세포를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은, 특히, 중국 함스터 난소 세포 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 다수의 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지를 결정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는, 예를 들어 하기를 포함하는 효모 및 사상 진균 세포를 포함한다: 피키아 파스토리스, 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta) (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피즈페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 종, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 종(Saccharomyces sp.), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 룩크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 피키아 종, 임의의 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로미세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스 종, 트리코더마 레에세이, 크리소스포리움 룩크노웬세, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 및 뉴로스포라 크라사. 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분 또는 단편, 경쇄 및/또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입된 경우에, 항체는 숙주 세포에서 항체 또는 단편 또는 쇄의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다.
항체 및 그의 항원-결합 단편 및 이뮤노글로불린 쇄는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 추가로, 생산 세포주로부터의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 이뮤노글로불린 쇄 (또는 그로부터의 다른 모이어티)의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증진될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건 하에 발현을 증진시키기 위한 통상의 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 번호 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다. 따라서, 본 발명의 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되고 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장되지만, 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 글루타민 신테타제 유전자를 포함하고, 이는 숙주 세포에서의 유전자의 결여를 보충한다.
본 발명은 본 발명의 항-hRSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 정제하는 방법을 포함하며, 이는 항체 또는 단편을 포함하는 샘플을 정제 배지 (예를 들어, 양이온 교환 배지, 음이온 교환 배지, 소수성 교환 배지, 친화도 정제 배지 (예를 들어, 단백질-A, 단백질-G, 단백질-A/G, 단백질-L))에 도입하고, 배지에 결합하지 않은 상기 샘플의 관통 분획으로부터 정제된 항체 또는 단편을 수집하는거나; 또는 관통 분획을 폐기하고 배지로부터 결합된 항체 또는 단편을 용리하고 용리액을 수집하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시양태에서, 배지는 샘플이 적용되는 칼럼 내에 있다. 본 발명의 실시양태에서, 정제 방법은 숙주 세포에서의 항체 또는 단편의 재조합 발현 후 수행되고, 예를 들어, 숙주 세포가 먼저 용해되고, 임의로, 용해물이 배지 상에서 정제 전에 불용성 물질로 정제된다.
일반적으로, 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대해 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, 항체의 특정한 글리코실화 패턴은 항체를 생산하는 데 사용된 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 따라 달라질 것이다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체가 가질 수 있는 글리코실화 패턴과 무관하게 본 발명에 포함된다. 유사하게, 특정한 실시양태에서, 단지 비-푸코실화(non-fucosylated) N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴을 갖는 항체는 이들 항체가 전형적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 그의 푸코실화 대응물보다 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 번호 6,946,292 및 7,214,775 참조). 비-푸코실화 N-글리칸을 갖는 이들 항체는 그의 탄수화물 구조가 인간 혈청 IgG에 존재하는 집단의 정상 성분이기 때문에 면역원성일 가능성이 없다.
본 발명은 hRSV F 단백질 및 또 다른 항원 예컨대, 예를 들어, hRSV G 단백질에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 및 이중기능적 항체 및 항원-결합 단편, 및 그의 사용 방법을 포함한다. 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai, et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, et al., (1992) J Immunol. 148:1547- 1553]을 참조한다. 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디" (Holliger, et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448) 또는 "야누신" (Traunecker, et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659 및 Traunecker, et al., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52)으로서 형성될 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 항-hRSV 항체의 항-hRSV F-단백질 항원-결합 단편을 추가로 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, 펩신에 의한 IgG의 효소적 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab)2 단편을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어, 디티오트레이톨 또는 메르캅토에틸아민을 사용한 F(ab)2의 환원에 의해 생산될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 배정될 수 있다. 적어도 5종의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 본 발명은 이들 부류 또는 하위부류의 항체 중 임의의 것의 항체 및 항원-결합 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 불변 영역, 예컨대 γ1, γ2, γ3, 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 람다 또는 카파 인간 경쇄 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 예로서, 및 비제한적으로 인간 중쇄 불변 영역은 γ4일 수 있고 인간 경쇄 불변 영역은 카파일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 갖는 γ4이다 (Schuurman, J et al., 2001, Mol. Immunol. 38: 1-8).
한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상이한 불변 도메인은 본원에 제공된 CDR로부터 유래된 VL 및 VH 영역에 첨부될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 (또는 단편)의 특정한 의도된 용도가 변경된 이펙터 기능을 필요로 하는 경우에, 인간 IgG1 이외의 중쇄 불변 도메인이 사용될 수 있거나, 또는 하이브리드 IgG1/IgG4가 이용될 수 있다.
인간 IgG1 항체가 긴 반감기 및 이펙터 기능, 예컨대 보체 활성화 및 항체-의존성 세포성 세포독성을 제공하지만, 이러한 활성은 항체의 모든 용도에 바람직하지 않을 수 있다. 이러한 경우에, 예를 들어, 인간 IgG4 불변 도메인이 사용할 수 있다. 본 발명은 IgG4 불변 도메인을 포함하는 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편, 예를 들어, 길항제, 인간화 항-hRSV F-단백질 항체 및 단편, 및 그의 사용 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, IgG4 불변 도메인은 EU 시스템에서의 위치 228 및 카바트 시스템에서의 위치 241에 상응하는 위치에서 천연 인간 IgG4 불변 도메인 (스위스-프롯(Swiss-Prot) 수탁 번호 P01861.1)과 상이할 수 있고, 여기서 적절한 쇄내 디술피드 결합 형성을 방해할 수 있는 Cys106과 Cys109 (EU 시스템에서의 위치 Cys 226 및 Cys 229 및 카바트 시스템에서의 위치 Cys 239 및 Cys 242에 상응함) 사이의 잠재적 쇄간 디술피드 결합을 방지하기 위해 천연 Ser108은 Pro로 대체된다. 문헌 [Angal et al. (1993) Mol. Imunol. 30:105]을 참조한다. 다른 경우에, 반감기를 증가시키거나 또는 이펙터 기능을 감소시키도록 변형된, 변형된 IgG1 불변 도메인이 사용될 수 있다.
항체 조작
본 발명의 항체는 항체의 특성을 개선시키기 위해 프레임워크 돌연변이될 수 있다. 1종의 이러한 프레임워크 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키도록 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되고 미국 특허 번호 7,125,689에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 최종 항체의 보다 큰 화학적 안정성을 제공하기 위해 노출된 측쇄를 함유하는 특정 아미노산을 또 다른 아미노산 잔기로 변화시켜 탈아미드화 또는 이성질화를 회피하는 것이 바람직할 것이다. 아스파라긴의 탈아미드화는 NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG 또는 QS 서열에서 발생하고 킹크를 폴리펩티드 쇄 내로 도입하고 그의 안정성을 감소시키는 (이소아스파르트산 효과) 이소아스파르트산 잔기의 생성을 일으킬 수 있다. 이성질화는 DG, DS, DA 또는 DT 서열에서 발생할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 탈아미드화 또는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다.
예를 들어, 아스파라긴 (Asn) 잔기는, Gln 또는 Ala로 변화되어 특히 CDR 내의 임의의 Asn-Gly 서열에서의 이소아스파르테이트의 형성에 대한 가능성을 감소시킬 수 있다. 유사한 문제가 Asp-Gly 서열에서 발생할 수 있다. 문헌 [Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281]. 이소아스파르테이트 형성은 그의 표적 항원에 대한 항체의 결합을 약화시키거나 또는 완전히 제거할 수 있다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734]을 참조한다. 한 실시양태에서, 아스파라긴은 글루타민 (Gln)으로 변화된다. 소형 아미노산이 아스파라긴 또는 글루타민에 인접하여 존재하는 경우에 보다 큰 비율로 발생하는 탈아미드화의 가능성을 감소시키도록 아스파라긴 (Asn) 또는 글루타민 (Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 문헌 [Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261]을 참조한다. 또한, CDR 내의 임의의 메티오닌 잔기 (전형적으로 용매 노출된 Met)는 항원-결합 친화도를 감소시키고 또한 최종 항체 제제에서의 분자 불균질성에 기여할 수 있는, 메티오닌 황이 산화될 가능성을 감소시키기 위해 Lys, Leu, Ala, 또는 Phe 또는 다른 아미노산으로 변화될 수 있다. Id. 또한, 잠재적인 절단가능한 Asn-Pro 펩티드 결합을 방지하거나 또는 최소화하기 위해, CDR에서 발견되는 임의의 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro, 또는 Asn-Ala로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치환을 갖는 항체는 후속적으로 치환이 hRSV F-단백질에 대한 항체의 친화도 또는 특이성, 또는 다른 목적하는 생물학적 활성을 허용되지 않는 수준으로 감소시키지 않는다는 것을 보장하는지에 대해 스크리닝된다.
표 2. 예시적인 안정화 CDR 변이체
Figure 112018050793063-pct00002
Fc 영역의 항체 조작
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작되어, 전형적으로 항체의 1개 이상의 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능 (예를 들어, 항원-의존성 세포성 세포독성)을 변경시킬 수 있다. 또한, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 항체 또는 단편의 1개 이상의 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티는 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화를 변경시키도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기 추가로 상세하게 기재되어 있다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 변경된 이펙터 기능을 제공하도록 변형된 (또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702를 참조한다. 이러한 변형은 진단 및 요법에서 가능한 유익한 효과를 갖는 면역계의 다양한 반응을 증진시키거나 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화 (치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc 영역의 부가를 포함한다. Fc에 대한 변화는 또한 치료 항체에서 항체의 반감기를 변경시킬 수 있고, 이는 보다 덜 빈번한 투여를 가능하게 하고 따라서 편의성을 증가시키고 물질의 사용을 감소시킨다. 문헌 [Presta, 2005, J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35]을 참조한다.
본 발명의 한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 증가되거나 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다. 한 실시양태에서, M252Y/S254T/T256E (YTE) 돌연변이가 도입된다. 예를 들어, 문헌 [Oganesyan et al., Mol. Immunol. 2009, 46:1750]을 참조한다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체 또는 항원-결합 단편의 이펙터 기능(들)을 변경시키도록 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산은 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖고 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산은 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 또는 폐지된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기는 변경되어 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경시킨다. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역은 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)의 능력을 감소시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체 또는 단편의 친화도를 감소시키도록 하기 위치의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 변형된다: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근법은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 더욱이, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었고 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되었다 (문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 이펙터 기능을 매개하는 본 발명의 항체 (예를 들어, RB1)의 능력을 감소시키고/거나 항염증 특성을 증가시키도록 잔기 243 및 264를 변형시킴으로써 변형된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편의 Fc 영역은 위치 243 및 264의 잔기를 알라닌으로 변화시킴으로써 변형된다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 이펙터 기능을 매개하는 항체 또는 단편의 능력을 감소시키고/거나 항염증 특성을 증가시키도록 잔기 243, 264, 267 및 328을 변형시킴으로써 변형된다.
이펙터 기능 증강
일부 실시양태에서, 항-hRSV 항체의 Fc 영역은 이펙터 기능을 매개하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 증가시키고/거나 Fc감마 수용체 (FcγR)에 대한 그의 결합을 증가시키도록 변형된다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 기능"은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 활성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성 (CDC) 매개 반응, Fc-매개 식세포작용 또는 항체 의존성 세포성 식세포작용 (ADCP) 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재순환 중 하나 이상을 지칭하는 것으로 의도된다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 Fc감마RI (CD64), Fc감마RII (CD32) 및 Fc감마RIII (CD16)을 포함하는 다양한 Fc 수용체 (FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 CDC를 매개하는 것으로 여겨진다. Fc 수용체는 또한 항-종양 면역에 중요할 수 있는 항체 가교에 중요하다.
이펙터 기능은 ADCC 이펙터 기능을 측정하기 위해 예를 들어 자연 킬러 세포에 대한 FcγRIII의 결합 또는 단핵구/대식세포에 대한 FcγRI의 결합을 통한 방식을 포함하는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연 킬러 세포 검정에서 ADCC 이펙터 기능에 대해 평가될 수 있다. 이러한 검정의 예는 문헌 [Shields et al., 2001 J. Biol. Chem., Vol. 276, p 6591-6604; Chappel et al., 1993 J. Biol. Chem. 268: 25124-25131; Lazar et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명의 항체의 ADCC 또는 CDC 특성, 또는 그의 가교 특성은 다수의 방식으로 증진될 수 있다.
잔기 Asn297 상의 특이적 돌연변이 또는 변경된 글리코실화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 결합을 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 일부 경우에 이들 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (Lazar et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103:4005-4010; Shields et al., J Biol Chem 2001, 276:6591-6604; Nechansky et al., Mol Immunol 2007, 44:1815-1817).
본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 돌연변이는 239, 332 및 330 (IgG1)으로부터 선택된 선택된 위치 중 1개 이상, 또는 다른 IgG 이소형의 동등한 위치 내에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 위치 239 및 332에서, 예를 들어 S239D 및 I332E로 돌연변이되거나 또는 추가 실시양태에서 이는 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서, 예를 들어 S239D 및 I332E 및 A330L로 돌연변이된다. (EU 인덱스 넘버링).
본 발명의 대안적 실시양태에서, 항원 결합 단백질이 증진된 이펙터 기능을 갖도록 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체가 제공된다. 예를 들어, 여기서 항체는 증진된 ADCC 또는 증진된 CDC를 갖거나 또는 증진된 ADCC 및 CDC 이펙터 기능 둘 다를 갖는다. 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생산하는 적합한 방법론의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO2003011878 및 WO2006014679 및 유럽 특허 출원 번호 EP1229125에 기재되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 "비-푸코실화" 또는 "아푸코실화" 항체를 제공한다. 비-푸코실화 항체는 푸코스 잔기가 없는 Fc의 복합-유형 N-글리칸의 트리-만노실 코어 구조를 보유한다. Fc N-글리칸으로부터의 코어 푸코스 잔기가 결여된 이들 당조작된 항체는 FcγRIIIa 결합 능력의 증강으로 인해 푸코실화 등가물보다 더 강력한 ADCC를 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한, a) 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 재조합 숙주 세포는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 포함하지 않는 것인 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 생산 방법을 제공한다. 재조합 숙주 세포는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 정상적으로 함유하지 않을 수 있거나 (예를 들어 효모 숙주 세포 예컨대 피치아 종) 또는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 불활성화시키도록 유전자 변형될 수 있다. 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자를 불활성화시키도록 유전자 변형된 재조합 숙주 세포가 이용가능하다. 예를 들어, FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 CHOK1SV 세포가 기능적 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생산된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된, 증진된 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 바이오와, 인크.(BioWa, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터 입수가능한 포텔리젠트(POTELLIGENT)™ 기술 시스템을 참조한다. 포텔리젠트™ 기술 시스템의 양상은 미국 특허 번호 7,214,775; 6,946,292; 및 국제 특허 출원 번호 WO0061739 및 WO0231240에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 다른 적절한 시스템을 인식할 것이다.
이러한 변형이 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이펙터 기능을 추가로 증진시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
변형된 글리코실화를 갖는 항체의 생산
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 특정한 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 아푸코실화 또는 아글리코실화(aglycosylated) 항체 또는 단편이 제조될 수 있다 (즉, 항체는 각각 푸코스 또는 글리코실화가 결여됨). 항체 또는 단편의 글리코실화 패턴은, 예를 들어, hRSV F-단백질 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체 또는 단편 서열 내의 글리코실화 부위 중 1개 이상을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산 치환은 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위 중 1개 이상을 제거하는 결과를 만들고, 이에 의해 그 부위의 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 포유동물- 또는 인간-유사 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 유전자 조작된, 하등 진핵생물 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포 예컨대 효모 및 사상 진균에서 생산된 것을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Choi et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5022-5027; Hamilton et al., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton et al., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett et al., (2011) Yeast 28(3):237-52; Hamilton et al., (2007) Curr Opin Biotechnol. Oct;18(5):387-92] 참조). 이들 유전자 변형된 숙주 세포는 특정한 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성물이 생산될 수 있도록, 세포에서 생산된 당단백질의 글리코실화 프로파일을 제어하는 능력을 갖는다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,029,872 및 미국 특허 번호 7,449,308 참조). 이들 유전자 변형된 숙주 세포는 우세하게 특정한 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산하는 데 사용되었다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215] 참조).
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 하등 진핵 숙주 세포에서 생산되고, N-글리칸 예컨대 GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1- 4)Man3GlcNAc2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 이등분된 및 다중안테나 종을 포함하는 푸코실화 및 비-푸코실화 하이브리드 및 복합 N-글리칸을 포함하는 것을 추가로 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; 및 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정한 측면에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물 중에서 우세한 N-글리칸 종이다.
특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 복합 N-글리칸을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 특정한 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물 중에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물 중 복합 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 포함하는 특정한 N-글리칸 종이다. 한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 복합 N-글리칸을 포함하며, 여기서 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 복합 N-글리칸은 구조 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 포함하고, 이러한 구조는 아푸코실화된다. 이러한 구조는, 예를 들어, 조작된 피키아 파스토리스 숙주 세포에서 생산될 수 있다.
특정한 실시양태에서, N-글리칸은 푸코실화된다. 일반적으로, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에 GlcNAc를 갖는 α1,3-연결, N-글리칸의 환원 말단에 GlcNAc를 갖는 α1,6-연결, N-글리칸의 비-환원 말단에 Gal을 갖는 α1,2-연결, N-글리칸의 비-환원 말단에 GlcNac를 갖는 α1,3-연결, 또는 N-글리칸의 비-환원 말단에 GlcNAc를 갖는 α1,4-연결로 존재한다.
따라서, 상기 당단백질 조성물의 특정한 측면에서, 당형태는 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,3-연결 또는 α1,6-연결 푸코스; GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,3-연결 또는 α1,4-연결 푸코스; 또는 Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,2-연결 푸코스로 존재한다.
추가 측면에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 고 만노스 N-글리칸, 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조로 이루어진 N-글리칸을 포함한다.
상기의 추가 측면에서, 복합 N-글리칸은 푸코실화 및 비-푸코실화 이등분된 및 다중안테나 종을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 용어 "N-글리칸" 및 "당형태"는 상호교환가능하게 사용되고 N-연결된 올리고사카라이드, 예를 들어, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결되어 있는 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다. 당단백질 상에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 (예를 들어, N-아세틸-뉴라민산 (NANA))이다. 당 기의 프로세싱은 ER의 내강에서 번역과 동시에 발생하고 N-연결된 당단백질의 경우에 골지체에서 번역 후 계속된다.
N-글리칸은 Man3GlcNAc2 ("Man"은 만노스를 지칭하고; "Glc"는 글루코스를 지칭하고; "NAc"는 N-아세틸을 지칭하고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭함)의 공통의 펜타사카라이드 코어를 갖는다. 통상적으로, N-글리칸 구조는 비-환원 말단이 왼쪽으로 및 환원 말단이 오른쪽으로 제시된다. N-글리칸의 환원 말단은 단백질 상의 글리코실화 부위를 포함하는 Asn 잔기에 부착된 말단이다. N-글리칸은 또한 "트리만노스 코어", "펜타사카라이드 코어" 또는 "소수-만노스 코어"로 지칭되는 Man3GlcNAc2 ("Man3") 코어 구조에 부가된 말초 당 (예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스 및 시알산)을 포함하는 분지 (안테나)의 수와 관련하여 상이하다. N-글리칸은 그의 분지 구성성분 (예를 들어, 고 만노스, 복합 또는 하이브리드)에 따라 분류된다. "고 만노스" 유형 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는다. "복합" 유형 N-글리칸은 전형적으로 "트리만노스" 코어의 1,3 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc 및 1,6 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc를 갖는다. 복합 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체 (예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc", 여기서 "Neu"는 뉴라민산을 지칭하고 "Ac"는 아세틸을 지칭함)로 임의로 변형된 갈락토스 ("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민 ("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "이등분된" GlcNAc 및 코어 푸코스 ("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환을 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "트리만노스 코어" 상에 다중 안테나를 가질 수 있고, 이는 또한 종종 "다중 안테나 글리칸"으로 지칭된다. "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 아암의 말단 상에 적어도 1개의 GlcNAc 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 아암 상에 0개 이상의 만노스를 갖는다. 다양한 N-글리칸은 또한 "당형태"로 지칭된다.
복합 N-글리칸과 관련하여, 용어 "G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", 및 "A2"는 하기를 의미한다. "G-2"는 Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G-1"은 GlcNAcMan3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G0"은 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G1"은 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G2"는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "A1"은 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "A2"는 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", 및 "A2"는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 푸코스가 결여된 N-글리칸 종을 지칭한다. 용어가 "F"를 포함하는 경우에, "F"는 N-글리칸 종이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기 상에 푸코스 잔기를 함유한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, G0F, G1F, G2F, A1F, 및 A2F는 모두 N-글리칸이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 푸코스 잔기를 추가로 포함한다는 것을 나타낸다. 하등 진핵생물 예컨대 효모 및 사상 진균은 일반적으로 푸코스를 생산하는 N-글리칸을 생산하지 않는다.
다중안테나 N-글리칸과 관련하여, 용어 "다중안테나 N-글리칸"은 N-글리칸의 1,6 아암 또는 1,3 아암의 비-환원 말단을 포함하는 만노스 잔기 상에 GlcNAc 잔기 또는 N-글리칸의 1,6 아암 및 1,3 아암의 비-환원 말단을 포함하는 각각의 만노스 잔기 상에 GlcNAc 잔기를 추가로 포함하는 N-글리칸을 지칭한다. 따라서, 다중안테나 N-글리칸은 화학식 GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, 또는 NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있다. 용어 "1-4"는 1, 2, 3, 또는 4개의 잔기를 지칭한다.
이등분된 N-글리칸과 관련하여, 용어 "이등분된 N-글리칸"은 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있는 N-글리칸을 지칭한다. 이등분된 N-글리칸은 화학식 GlcNAc3Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있고 여기서 각각의 만노스 잔기는 그의 비-환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 연결된다. 대조적으로, 다중안테나 N-글리칸이 GlcNAc3Man3GlcNAc2를 특징으로 하는 경우에, 화학식은 2개의 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 2개의 아암 중 1개의 비-환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있고 1개의 GlcNAc 잔기는 N-글리칸의 다른 아암의 비-환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있다는 것을 나타낸다.
항체 물리적 특성
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 경쇄 또는 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역에서 1개 이상의 글리코실화 부위를 추가로 함유할 수 있다. 특정 글리코실화 부위는 변경된 항원-결합으로 인해 항체 또는 단편의 감소된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 일으킬 수 있다 (Marshall et al., 1972, Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison, 2004, J Immunol 172:5489-94; Wallick et al., 1988, J Exp Med 168:1099-109; Spiro, 2002, Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., 1985, Nature 316:452-7; Mimura et al., 2000, Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 공지되었다.
각각의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 특유한 등전점 (pI)을 가질 것이고, 이는 일반적으로 6 내지 9.5의 pH 범위에 속한다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로 7-9.5의 pH 범위 내에 속하고 IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로 6-8의 pH 범위 내에 속한다.
각각의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 특징적인 용융 온도를 가질 것이고, 보다 높은 용융 온도는 생체내에서 보다 큰 전반적인 안정성을 나타낸다 (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 일반적으로, TM1 (초기 언폴딩의 온도)은 60℃ 초과, 65℃ 초과, 또는 70℃ 초과일 수 있다. 항체 또는 단편의 융점은 시차 주사 열량측정 (Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52) 또는 원형 이색성 (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 사용하여 측정될 수 있다.
추가 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)이 선택된다. 항체 또는 단편의 분해는 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정될 수 있다 (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
추가 실시양태에서, 원치 않는 면역 반응의 촉발 및/또는 변경되거나 또는 불리한 약동학적 특성을 초래할 수 있는 최소한의 응집 효과를 갖는 항체 (예를 들어, RB1) 및 그의 항원-결합 단편이 선택된다. 일반적으로, 항체 및 단편은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 응집이 허용된다. 응집은 크기-배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 광 산란을 포함하는 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.
항체 접합체
본원에 개시된 항-hRSV F-단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 화학적 모이어티는, 특히, 중합체, 방사성핵종 또는 세포독성 인자일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 화학적 모이어티는 대상체의 체내에서 항체 또는 단편의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는 PEG), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 친수성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)]은 PEG 접합된 단일쇄 항체를 개시한다. 문헌 [Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)]은 항체를 방사성금속 킬레이트화제 (디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA))에 부착된 PEG와 접합시키는 것을 개시한다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 표지 예컨대 99Tc,90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 및 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe와 접합될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한, 예를 들어 그의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키도록 PEG화될 수 있다. 항체 또는 단편을 PEG화하기 위해, 항체 또는 단편은 전형적으로, 1개 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에, 반응성 형태의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응한다. 특정한 실시양태에서, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용된 형태의 PEG 중 임의의 것, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하도록 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화될 항체 또는 단편은 아글리코실화 항체 또는 단편이다. 단백질을 PEG화하는 방법 관련 기술분야에 공지되어 있고 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 번호 EP 0 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 형광단 예컨대 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레사민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 에쿼린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 자유 라디칼을 포함하는 형광 또는 화학발광 표지와 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 세포독성 인자 예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토이아카 아메리카나(Phytoiacca americana) 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신에 접합될 수 있다.
문헌 [Hunter et al., 1962, Nature 144:945; David et al., 1974, Biochemistry 13:1014; Pain et al., 1981, J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, 1982, Histochem. and Cytochem. 30:407]에 기재된 방법을 포함하는, 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)을 다양한 모이어티에 접합시키는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 항체 및 단편을 접합시키는 방법은 통상적이고 관련 기술분야에 매우 널리 공지되어 있다.
항-hRSV 항체의 예방 및 치료 용도
본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)을 사용한 RSV 감염의 증상의 예방, 치료, 또는 호전을 필요로 하는 인간 대상체를 포함하는 대상체에서 RSV 감염의 증상을 예방하거나, 치료하거나 또는 호전시키는 방법이 추가로 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 대상체는 RSV 감염을 앓고 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 대상체는 RSV 감염의 발병 위험이 있다.
구체적 실시양태에서, 포유동물, 바람직하게는 인간은 RSV 감염과 연관된 1종 이상의 증상의 치료, 예방 또는 호전을 위해 RSV 역가를 감소시키는 데 효과적인 양으로 1종 이상의 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물이 투여된다. 이러한 실시양태에 따라, 유효량의 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어, 포유동물로부터의 객담 샘플 또는 폐로부터의 세척액 중 RSV의 농도에 의해 측정된 바와 같은 폐에서의 RSV 역가를 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물, 바람직하게는 인간은 RSV 감염과 연관된 증상의 치료, 예방 또는 호전을 위해 포유동물에서 RSV를 중화시키고/거나 RSV 감염을 차단하는 데 효과적인 양으로 1종 이상의 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물이 투여된다.
모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 인간 및 다른 동물 둘 다에서 RSV 질환을 위해 면역요법적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "면역요법적으로" 또는 "면역요법"은 예방적뿐만 아니라 치료적 투여 둘 다 및 실질적으로 정제된 폴리펩티드 생성물을 사용한 수동 면역화뿐만 아니라 그의 생성물 또는 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전달에 의한 유전자 요법 둘 다를 나타낸다. 수동 면역화는 능동 체액성 면역의 전달 또는 항체를 필요로 하는 대상체에게 항체를 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명은 RSV 감염의 발병 위험이 있는 환자에게 능동 체액성 면역을 전달하는 방법 및 RSV 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대 IgG 항체를 제공하는 방법을 제공한다. 따라서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 RSV 질환의 가능성 및/또는 중증도를 경감시키기 위해 고위험 대상체에게 투여되거나 또는 활성 RSV 감염이 이미 입증된 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 조직, 기관, 동물, 또는 환자에서, 하기도 감염, 폐렴, 기관기관지염, 세기관지염, 기관지염, 및 임의의 관련 감염 또는 염증성 장애, 예컨대 비제한적으로, 전신 염증 반응 증후군, 패혈증 증후군, 그람 양성 패혈증, 그람 음성 패혈증, 배양물 음성 패혈증, 진균 패혈증, 호중구감소성 열, 요로성패혈증, 수막구균혈증, 성인 호흡 곤란 증후군, 알레르기성 비염, 통년성 비염, 천식, 전신 아나필락시스, 수용체 과민 반응, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 과민성 폐장염, 세포내 유기체로 인한 육아종, 약물 감수성, 악액질, 낭성 섬유증, 신생아 만성 폐 질환와 관련된 적어도 1종의 염증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 적어도 1종의 성인 또는 소아 RSV 관련 질환을; 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에서, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염, HIV 감염, HIV 신경병증, 수막염, 간염 (A,B 또는 C 등), 패혈성 관절염, 복막염, 폐렴, 후두개염, 이. 콜라이 0157:h7, 용혈성 요독 증후군, 혈전용해 혈소판감소성 자반증, 말라리아, 뎅기 출혈열, 리슈마니아증, 나병, 독성 쇼크 증후군, 스트렙토코쿠스 근염, 가스 괴저, 미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis), 미코박테리움 아비움 인트라셀룰라레(mycobacterium avium intracellulare), 뉴모시스티스 카리니이(pneumocystis carinii) 폐렴, 골반 염증성 질환, 고환염, 부고환염, 레지오넬라, 라임병, 인플루엔자 A, 엡스타인-바르 바이러스, 바이러스-연관 혈구탐식 증후군, 바이러스 뇌염, 무균 수막염 등을 포함하는 급성 또는 만성 박테리아 감염, 급성 및 만성 기생충 또는 감염 과정 중 적어도 1종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 적어도 1종의 감염성 질환을 조정하거나 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 임의로 이러한 조정, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 적어도 1종의 RSV 항체 또는 그의 항원 단편을 포함하는 조성물 또는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물은 RSV 감염과 연관된 1종 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 호전시키기 위해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물은 RSV 감염과 연관된 1종 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 호전시키기 위해 낭성 섬유증, 기관지폐 이형성증, 선천성 심장 질환, 선천성 면역결핍 또는 후천성 면역결핍을 갖는 인간, 또는 이식 (예를 들어, 골수, 폐, 또는 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT))을 받은 인간에게 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물은 RSV 감염과 연관된 1종 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 또는 호전시키기 위해 인간 영아, 바람직하게는 조기에 태어난 인간 영아 또는 RSV 감염으로 인한 입원의 위험이 있는 인간 영아에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 예방, 치료 또는 제약 조성물은 노인 또는 그룹 홈 (예를 들어, 요양원 또는 재활 센터)에 있는 사람 또는 면역손상 개체에게 투여된다.
RSV 감염의 예방 및 RSV 감염에 대한 요법 둘 다를 위해 RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 고친화도 및/또는 강력한 생체내 억제 항체 및/또는 중화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하는 것이 바람직하다. RSV 감염의 예방 및 RSV 감염에 대한 요법 둘 다를 위해 RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 고친화도 및/또는 강력한 생체내 억제 항체 및/또는 중화 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 또한 바람직하다. 이러한 항체 또는 그의 단편은 바람직하게는 F 당단백질의 RSV F 당단백질 및/또는 단편에 대한 친화도를 가질 것이다.
본 발명에 따른 항체 및 기능적 등가물 (예컨대 그의 항원 결합 단편)은 RSV F 단백질 내의 에피토프를 인식한다. 상기 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 그의 기능적 등가물은 이미 공지된 상이한 에피토프에 결합하는 RSV-특이적 항체, 예컨대 팔리비주맙, D25, AM14, AM16 및 AM23과 조합될 수 있다. 상기 에피토프를 특이적으로 인식하는 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물을 기지의 RSV-특이적 항체와 조합함으로써, 2종 이상의 RSV의 상이한 에피토프가 동일한 요법 동안 인식된다. 이러한 방식으로, RSV에 대한 보다 강력한 면역원성 반응 및/또는 RSV에 대한 보다 높은 항체 특이성이 도달될 수 있다. RSV에 대한 보다 강력한 면역원성 반응 및 보다 높은 특이성으로, 이러한 조합은 RSV-관련 장애의 보다 효과적인 치료 및/또는 예방을 일으킬 수 있다.
1종 이상의 RSV 항원에 면역특이적으로 결합하는 1종 이상의 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 예방제로서 체내에서 국부로 또는 전신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 다른 모노클로날 또는 키메라 항체, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자 (예컨대, 예를 들어, IL-2, IL-3, IL-7, 및 IL-15)와 조합되어 유리하게 이용될 수 있고, 이는, 예를 들어, 항체와 상호작용하는 이펙터 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 다른 모노클로날 또는 키메라 항체, 또는 림포카인 또는 조혈 성장 인자 (예컨대, 예를 들어, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 조합되어 유리하게 이용될 수 있고, 이는, 예를 들어, 면역 반응을 증가시키는 역할을 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 또한 RSV 감염을 치료하는 데 사용되는 1종 이상의 약물 예컨대, 예를 들어 항바이러스제와 조합되어 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편은 하기 약물 중 1종 이상과 조합되어 사용될 수 있다: NIH-351 (제미니 테크놀로지스(Gemini Technologies)), 재조합 RSV 백신 (아비론(Aviron)), RSVf-2 (인트라셀(Intracel)), F-50042 (피에르 파브르(Pierre Fabre)), T-786 (트리메리스(Trimeris)), VP-36676 (비로파마(ViroPharma)), RFI-641 (아메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products)), VP-14637 (비로파마), PFP-1 및 PFP-2 (아메리칸 홈 프로덕츠), RSV 백신 (아반트 이뮤노테라퓨틱스(Avant Immunotherapeutics)), 및 F-50077 (피에르 파브르).
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단독으로 또는 다른 유형의 치료 (예를 들어, 호르몬 요법, 면역요법, 및 항염증제)와 조합되어 투여될 수 있다. 일반적으로, 환자의 것과 동일한 종의 종 기원 또는 종 반응성 (항체의 경우)의 생성물의 투여가 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 인간 또는 인간화 항체, 단편 유도체, 유사체, 또는 핵산은 요법 또는 예방을 위해 인간 환자에게 투여된다.
"대상체"는 포유동물 예컨대 인간, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 래트, 원숭이 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) 또는 토끼일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 단독으로, 또는 항바이러스 요법과 함께 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 단독으로, 또는 또 다른 RSV 모노클로날 항체와 함께 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 단독으로, 또는 또 다른 RSV 백신과 함께 사용될 수 있다.
용어 "와 함께"는 본 발명의 방법에서 투여된 성분 (예를 들어, 팔리비주맙과 함께 예를 들어, 항-hRSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1))이 동시 전달을 위해 단일 조성물로 제제화되거나 또는 2개 이상의 조성물 (예를 들어, 키트)로 개별적으로 제제화될 수 있다는 것을 나타낸다. 각각의 성분은 다른 성분이 투여되는 시간과 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있고; 예를 들어, 각각의 투여는 주어진 기간에 걸쳐 여러 간격으로 비-동시에 (예를 들어, 개별적으로 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 더욱이, 별개의 성분은 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
실험 및 진단 용도
본원에 개시된 항-hRSV F 단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 친화도 정제 작용제로서 사용될 수 있다. 이러한 과정에서, 항-hRSV F 단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 세파덱스(Sephadex)®, 유리 또는 아가로스 수지 또는 여과지와 같은 고체 상에 고정된다. 고정된 항체 또는 단편은 정제될 hRSV F 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉되고, 그 후 지지체를 적합한 용매로 세척하고, 이는 고정된 항체 또는 단편에 결합된 hRSV F 단백질을 제외하고 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거할 것이다. 최종적으로, 지지체를 용매로 세척하여, 결합된 hRSV F 단백질 (예를 들어, 단백질 A)을 용리한다. 이러한 고정된 항체 및 단편은 본 발명의 일부를 형성한다.
예를 들어 웨스턴 블롯 및 본원에 논의된 다른 면역검정을 수행하는 데 유용한 2차 항체를 생성하기 위한 항원이 추가로 제공된다. 특히, 본원에 개시된 치료 항체 (예를 들어, RB1)의 가변 영역 및/또는 CDR 서열을 포함하고, 예를 들어, 치료의 맥락에서 항체의 존재를 특이적으로 검출하는 데 사용하기 위한 항-이디오타입 항체를 생성하는 데 사용될 수 있는 폴리펩티드가 개시된다.
항- hRSV F 단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편은 또한 hRSV F 단백질에 대한 진단 검정에서, 예를 들어, 특정한 세포, 조직, 또는 혈청에서의 그의 발현을 검출하는 데 유용할 수 있다. 이러한 진단 방법은 다양한 질환 진단에 유용할 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)의 사용을 포함하는 ELISA 검정 (효소-연결 면역흡착 검정)을 포함한다.
예를 들어, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 기질 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트 웰, 예를 들어, 플라스틱 플레이트의 표면)을 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 코팅하는 단계;
(b) 기질에 RSV F 단백질의 존재에 대해 시험될 샘플을 적용하는 단계;
(c) 샘플 내의 미결합 물질이 제거되도록 플레이트를 세척하는 단계;
(d) RSV F 단백질 항원에 또한 특이적인, 검출가능하게 표지된 항체 (예를 들어, 효소-연결 항체)를 적용하는 단계;
(e) 미결합, 표지된 항체가 제거되도록 기질을 세척하는 단계;
(f) 표지된 항체가 효소 연결된 경우에, 효소에 의해 형광 신호로 전환되는 화학물질을 적용하는 단계; 및
(g) 표지된 항체의 존재를 검출하는 단계.
기질과 회합된 표지의 검출은 hRSV F 단백질의 존재를 나타낸다.
추가 실시양태에서, 표지된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 ABTS (예를 들어, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 반응하여 검출가능한 색 변화를 생성하는 퍼옥시다제로 표지된다. 대안적으로, 표지된 항체 또는 단편은 섬광의 존재 하에 섬광 계수기에 의해 검출될 수 있는 검출가능한 방사성동위원소 (예를 들어, 3H)로 표지된다.
본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 웨스턴 블롯 또는 면역-단백질 블롯 과정에 사용될 수 있다. 이러한 과정은 본 발명의 일부를 형성하고 예를 들어 하기를 포함한다:
(1) 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어, 반-건조 블롯팅 또는 탱크 블롯팅)을 사용하여, 임의로 (예를 들어, 샘플 내의 단백질의 PAGE 또는 SDS-PAGE 전기영동 분리로부터의) hRSV F 단백질의 존재에 대해 시험될 샘플로부터의 단백질을 막 또는 다른 고체 기질 상으로 옮기고; 결합된 hRSV F 단백질 또는 그의 단편의 존재에 대해 시험될 막 또는 다른 고체 기질을 본 발명의 항-hRSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것.
이러한 막은 비-변성 PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔 또는 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔에서 hRSV의 존재에 대해 시험될 단백질이 옮겨진 (예를 들어, 겔에서의 전기영동 분리 후) 니트로셀룰로스 또는 비닐-기재 (예를 들어, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)) 막의 형태를 취할 수 있다. 막을 항-hRSV 항체 또는 단편과 접촉시킨 후, 막은 임의로 막 상의 비-특이적 단백질 결합 부위에 결합하기 위해, 예를 들어, 탈지 분유 등으로 차단된다.
(2) 막을 1회 이상 세척하여 미결합 항-hRSV F 단백질 항체 또는 단편 및 다른 미결합 물질을 제거하는 것; 및
(3) 결합된 항-hRSV F 단백질 항체 또는 단편을 검출하는 것.
결합된 항체 또는 단편의 검출은 hRSV 단백질이 막 또는 기질 상에 및 샘플 내에 존재한다는 것을 나타낸다. 결합된 항체 또는 단편의 검출은 항체 또는 단편을 검출가능하게 표지된 2차 항체 (항-이뮤노글로불린 항체)와 결합시킨 다음, 2차 항체의 존재를 검출함으로써 실시될 수 있다.
본원에 개시된 항-hRSV F 단백질 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 또한 면역조직화학에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 일부를 형성하고, 예를 들어, 하기를 포함한다.
(1) hRSV F 단백질의 존재에 대해 시험될 세포를 본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
(2) 세포 상 또는 내의 항체 또는 단편을 검출하는 것.
항체 또는 단편 그 자체가 검출가능하게 표지된 경우에, 이는 직접적으로 검출될 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 단편은 검출되는, 검출가능하게 표지된 2차 항체에 의해 결합될 수 있다.
제약 조성물 및 투여
본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)의 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.
치료제 및 진단제의 제제는 담체, 부형제, 또는 안정화제와 혼합함으로써, 예를 들어, 동결건조 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 적절한 농도로 1-20 mM의 히스티딘 완충제 pH 5-7 중에 희석하고, NaCl 또는 수크로스 (예를 들어, 2-15 % (w/v))를 긴장성을 위해 첨가한다. 0.01 내지 0.10% (w/v)의 추가의 작용제, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80을 첨가하여 안정성을 증진시킬 수 있다. 대표적인 제제는 10 mM L-히스티딘, 7% (w/v) 수크로스, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트-80, pH 6.0이다.
단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50 (집단의 50%에서 치사적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 과정에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 간의 용량 비가 치료 지수 (LD50/ ED50)이다. 이들 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 제제화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 다양할 수 있다.
투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 수질내, 척수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피, 또는 동맥내를 포함한다. 바람직한 투여 방식은 근육내, 정맥내 및 비강내이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 침습성 경로 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 제약 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 동맥내로, 종양내로, 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비-침습성 경로 (예를 들어, 경구로; 예를 들어, 환제, 캡슐 또는 정제)에 의한 투여가 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1) 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 용기 (예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 칼럼, 속이 빈 바늘 또는 시린지 실린더를 포함한, 예를 들어, 플라스틱 또는 유리 바이알)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1) 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 물질을 비경구 경로, 예를 들어, 근육내, 피하 또는 정맥내를 통해 환자의 신체 내로 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어, 주사될 유체 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편 또는 제약 조성물)를 유지하기 위한 실린더 또는 배럴, 피부를 찌르기 위한 바늘 및/또는 유체의 주사를 위한 혈액관; 및 실린더로부터 및 바늘 구멍을 통해 유체를 밀어내기 위한 플런저를 포함하는 시린지 (예를 들어, 제약 조성물로 미리 채워진 주사기, 예컨대 자동 주사기)일 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치는 정맥내 (IV) 주사 장치이다. 이러한 장치는 캐뉼라 또는 투관침/바늘을 통해 환자의 체내로 도입되는 유체 (예를 들어, 염수; 또는 NaCl, 락트산나트륨, KCl, CaCl2를 포함하고 임의로 글루코스를 포함하는 락테이트화 링거액)를 유지하기 위한 백 또는 저장소에 부착될 수 있는 튜브에 부착될 수 있는 캐뉼라 또는 투관침/바늘 내에 항체 또는 그의 단편 또는 제약 조성물을 포함한다. 항체 또는 그의 단편 또는 제약 조성물은, 본 발명의 실시양태에서, 투관침 및 캐뉼라가 대상체의 정맥 내로 삽입되고 삽입된 캐뉼라로부터 투관침이 제거되면, 장치 내로 도입될 수 있다. IV 장치는, 예를 들어, 말초 정맥 (예를 들어, 손 또는 팔) 내로; 상대 정맥 또는 하대 정맥, 또는 심장의 우심실 내에 (예를 들어, 중앙 IV); 또는 쇄골하, 내경 정맥, 또는 대퇴 정맥 내로, 및 예를 들어, 상대 정맥 또는 우심방 (예를 들어, 중심 정맥 라인)에 도달할 때까지 심장쪽으로 전진시켜 삽입될 수 있다. 본 발명의 실시양태에서, 주사 장치는 자동 주사기; 제트 주사기 또는 외부 주입 펌프이다. 제트 주사기는 항체 또는 그의 단편 또는 제약 조성물을 환자의 체내로 도입하기 위해 표피에 침투하는 액체의 고압의 좁은 제트를 사용한다. 외부 주입 펌프는 항체 또는 그의 단편 또는 제약 조성물을 환자의 체내로 제어된 양으로 전달하는 의료 장치이다. 외부 주입 펌프는 전기적으로 또는 기계적으로 구동될 수 있다. 상이한 펌프는 상이한 방식으로 작동하고, 예를 들어, 시린지 펌프는 시린지의 저장소에 유체를 유지하고, 이동가능한 피스톤은 유체 전달을 제어하고, 엘라스토머 펌프는 신축성 있는 풍선 저장소에 유체를 유지하고, 풍선의 탄성 벽으로부터의 압력은 유체 전달을 유도한다. 연동 펌프에서, 롤러 세트는 소정의 길이의 가요성 튜빙에 끼어 유체를 앞으로 밀어낸다. 다중 채널 펌프에서, 유체는 여러 속도로 다수의 저장소로부터 전달될 수 있다.
본원에 개시된 제약 조성물은 또한 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대 미국 특허 번호 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 제약 조성물을 포함하는 이러한 무바늘 장치는 또한 본 발명의 일부이다. 본원에 개시된 제약 조성물은 또한 주입에 의해 투여될 수 있다. 제약 조성물을 투여하기 위한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는 하기에 개시된 것을 포함한다: 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식형 미세주입 펌프를 개시하는 미국 특허 번호 4,487,603; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식형 주입 장치를 개시하는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 번호 4,439,196. 많은 다른 이러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다.
투여 요법은 치료 항체 또는 항원-결합 단편의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 예방/치료 항체의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내의 표적 세포의 접근성을 포함하는 여러 인자에 따라 달라진다. 바람직하게는, 투여 요법은 바람직하지 않은 부작용은 최소화하면서, 이와 동시에 표적 질환 상태의 개선을 가져오기에 충분한 치료 항체 또는 단편을 전달한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로는 특정한 예방/치료 항체 및 치료될 상태의 중증도에 따라 달라진다. 치료 항체 또는 단편의 적절한 용량의 선택에 대한 지침이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak, (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
적절한 용량의 결정은, 예를 들어, 예방 및 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있거나 의심되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고 그 후 임의의 부정적 부작용에 비해 목적하는 또는 최적 효과가 달성될 때까지 소량 증분으로 증가된다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어, 염증의 증상 또는 생산된 염증성 시토카인의 수준의 것을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물제제는 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래되어, 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다. 인간 대상체의 경우에, 예를 들어, 인간화 및 완전 인간 항체가 바람직할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)은 연속적 주입에 의해, 또는, 예를 들어, 매일, 1주에 1-7회, 매주, 격주, 매월, 격월, 분기마다, 6개월마다, 매년 등으로 투여되는 용량에 의해 제공될 수 있다. 용량은, 예를 들어, 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내, 뇌내로, 척수내로, 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 총 1주 용량은 일반적으로 적어도 0.05 μg/kg 체중, 보다 일반적으로 적어도 0.2 μg/kg, 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0.25 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과이다 (예를 들어, 문헌 [Yang, et al., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al., 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al., 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52:151-144] 참조). 용량은 또한 대상체의 혈청에서 항-hRSV 항체의 미리 결정된 목표 농도, 예컨대 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml 또는 그 초과를 달성하도록 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-hRSV 항체는, 예를 들어, 피하로 또는 정맥내로, 매주, 격주, "4주마다", 매월, 격월, 또는 매분기 기준으로 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 2500 mg/대상체로 투여된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 세포, 조직, 또는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 치료제/예방제와 조합되어 투여되는 경우에, RSV를 중화시키고/거나 RSV 감염과 연관된 질환 또는 상태의 1종 이상의 증상을 예방하거나 또는 그의 측정가능한 개선을 유발하는 데 효과적인 본 발명의 항-hRSV 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)의 양을 지칭한다. 유효 용량은 증상의 적어도 부분적인 예방 또는 호전을 일으키기에 충분한 항체 또는 단편의 양을 추가로 지칭한다. 단독으로 투여되는 개별 활성 성분에 적용되는 경우에, 유효 용량은 그러한 성분 단독을 지칭한다. 조합물로 적용되는 경우에, 유효 용량은 연속적으로 또는 동시에 조합되어 투여되는지의 여부와 관계없이, 예방 또는 치료 효과를 일으키는 활성 성분의 합한 양을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 유효량은 5개월 동안 10 μg/mL - 30 μg/mL의 임상 목표 혈청 농도를 제공하는 양이다. 한 실시양태에서, 유효량은 표준 전-임상 코튼 래트 모델에서 결정된 바와 같이 10 μg/ml - 30 μg/ml의 C최저 목표를 제공하는 인간 용량이다.
키트
본원에 논의된 바와 같은 항-hRSV F 단백질 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 성분을, 본원에 논의된 바와 같은 제약상 허용되는 담체 및/또는 예방제/치료제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 성분과 함께 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 항체 또는 단편 및/또는 예방제/치료제는 순수한 조성물로서 또는 제약상 허용되는 담체와 조합되어 제약 조성물로 제제화될 수 있다
한 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1) 또는 그의 제약 조성물을 하나의 용기 (예를 들어, 멸균성 유리 또는 플라스틱 바이알)에 포함하고 그의 제약 조성물 및/또는 예방제/치료제를 또 다른 용기 (예를 들어, 멸균성 유리 또는 플라스틱 바이알)에 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 단일 공통 용기 내에 본 발명의 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)을 제약상 허용되는 담체와 함께, 임의로 제약 조성물로 함께 제제화된 1종 이상의 예방제/치료제와 임의로 조합하여 포함하는 본 발명의 조합물을 포함한다.
키트가 대상체에게의 비경구 투여를 위한 제약 조성물을 포함하는 경우에, 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 상기 논의된 바와 같은 1종 이상의 피하 바늘 또는 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.
키트는 키트 내에 제약 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 환자 및 의사가 동봉된 제약 조성물 및 투여 형태를 효과적이고 안전하게 사용하는 것을 돕는다. 예를 들어, 본 발명의 조합물에 관한 하기 정보가 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약역학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 예방조치, 유해 반응, 과다 복용, 적절한 투여량 및 투여, 공급 방법, 적절한 저장 조건, 참조, 제조업체/판매업체 정보 및 특허 정보.
검출 키트 및 예방/치료 키트
편의상, 본 발명의 항-hRSV 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, RB1)이 키트, 즉, 진단 또는 검출 검정을 수행하기 위한 지침과 함께 미리 결정된 양으로 시약의 포장된 조합물로 제공될 수 있다. 항체 또는 단편이 효소로 표지된 경우에, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제 예컨대 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적인 양은 검정의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중의 농도를 제공하기 위해 광범위하게 달라질 수 있다. 특히, 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함하는 건조 분말 (통상적으로 동결건조됨)로서 제공될 수 있다.
예를 들어, 면역검정 예컨대 ELISA (샌드위치-유형 또는 경쟁적 포맷)를 포함하는 다양한 검출 검정에 사용하기 위한 진단 또는 검출 시약 및 1종 이상의 이러한 시약을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 키트의 성분은 고체 지지체에 미리-부착될 수 있거나, 또는 키트가 사용될 때 고체 지지체의 표면에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 신호 발생 수단은 본 발명의 항체 또는 단편과 미리-연관될 수 있거나 또는 사용 전에 1종 이상의 성분, 예를 들어, 완충제, 항체-효소 접합체, 효소 기질 등과 조합될 수 있어야 한다. 키트는 또한 추가의 시약, 예를 들어, 고체 상 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위한 차단 시약, 세척 시약, 효소 기질 등을 포함할 수 있다. 고체 상 표면은 튜브, 비드, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로구체, 또는 단백질, 펩티드, 또는 폴리펩티드를 고정시키는 데 적합한 다른 물질의 형태일 수 있다. 특정한 측면에서, 화학발광성 또는 발색원성 생성물의 형성 또는 화학발광성 또는 발색원성 기질의 환원을 촉매하는 효소는 신호 발생 수단의 한 성분이다. 이러한 효소가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 키트는 본원에 기재된 포획제 및 검출 시약 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 임의로 키트는 또한 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
용기, 예컨대 바이알 또는 병 내에 포장된 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 용기에 부착되거나 이와 함께 포장된 라벨을 추가로 포함하는 키트가 또한 제공되며, 라벨은 용기의 내용물을 기재하고 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 질환 상태를 예방/치료하기 위한 용기의 내용물의 사용에 관한 적응증 및/또는 지침을 제공한다.
한 측면에서, 키트는 RSV 감염과 연관된 질환/상태를 예방하거나 또는 치료하기 위한 것이고 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 추가의 예방제/치료제 또는 백신을 포함한다. 키트는 임의로 비경구, 예를 들어, 정맥내, 투여를 위한 시린지를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 키트는 항-hRSV F 단백질 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 백신 또는 추가의 예방제/치료제와 함께 항체 또는 단편을 사용하는 것을 기재하는, 용기에 부착되거나 또는 이와 함께 포장된 라벨을 포함한다. 또 다른 측면에서, 키트는 백신 또는 추가의 예방제/치료제 및 항-hRSV F 단백질 항체 또는 단편과 함께 백신 또는 추가의 예방제/치료제를 사용하는 것을 기재하는, 용기에 부착되거나 또는 이와 함께 포장된 라벨을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-hRSV F 단백질 항체 및 백신 또는 추가의 예방제/치료제는 별개의 바이알 내에 있거나 또는 동일한 제약 조성물로 함께 조합된다.
조합 예방 또는 요법의 경우, 2종의 예방제/치료제의 공동 투여는 작용제가 그의 예방/치료 효과를 발휘하는 동안의 기간이 중복되는 한, 작용제가 동시에 또는 동일한 경로에 의해 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 동시 또는 순차적 투여가 고려되고, 상이한 날 또는 주에 투여하는 것이 고려된다.
본원에 개시된 항체, 펩티드, 항원-결합 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 1종 및 검출 시약 또는 예방제/치료제로서의 조성물의 사용에 대한 지침을 포함하는 본원에 개시된 예방/치료 및 검출 키트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 키트에 사용하기 위한 용기는 전형적으로 검출 및/또는 예방/치료 조성물(들) 중 1종 이상이 위치할 수 있는, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 적어도 1종의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 다른 적합한 용기를 포함할 수 있다. 제2 예방제/치료제가 또한 제공되는 경우에, 키트는 또한 이러한 제2 검출 및/또는 예방/치료 조성물이 위치할 수 있는 별개의 제2 용기를 함유할 수 있다. 대안적으로, 복수의 화합물이 단일 제약 조성물로 제조될 수 있고, 단일 용기 수단, 예컨대 바이알, 플라스크, 시린지, 병, 또는 다른 적합한 단일 용기에 포장될 수 있다. 본원에 개시된 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매를 위해 엄중히 밀폐되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단, 예컨대, 예를 들어, 목적하는 바이알(들)을 보유하는 주사 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 것이다. 방사성표지, 발색원성, 형광발생, 또는 다른 유형의 검출가능한 표지 또는 검출 수단이 키트 내에 포함되는 경우에, 표지제는 검출 또는 예방/치료 조성물 자체와 동일한 용기 내에 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로 이러한 제2 조성물이 위치하고 적합하게 분취될 수 있는 별개의 제2 용기 수단 내에 위치할 수 있다. 대안적으로, 검출 시약 및 표지는 단일 용기 수단 내에서 제조될 수 있고, 대부분의 경우에, 키트는 또한 전형적으로 상업적 판매 및/또는 편리한 포장 및 전달을 위해 엄중히 밀폐되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
본원에 기재된 검출 또는 모니터링 방법을 수행하기 위한 장치 또는 기구가 또한 제공된다. 이러한 기구는 샘플이 유입될 수 있는 챔버 또는 튜브, 임의로 장치를 통한 샘플의 유동을 지시하기 위한 밸브 또는 펌프를 포함하는 유체 취급 시스템, 임의로 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 분리하는 필터, 포획제 또는 검출 시약의 첨가를 위한 혼합 챔버, 및 임의로 포획제 면역복합체와 결합된 검출가능한 표지의 양을 검출하기 위한 검출 장치를 포함할 수 있다. 샘플의 유동은 수동적 (예를 들어, 샘플이 적용되면, 모세관, 유체정역학, 또는 장치의 추가의 조작을 필요로 하지 않는 다른 힘에 의함) 또는 능동적 (예를 들어, 기계식 펌프, 전기삼투압 펌프, 원심력, 또는 증가된 공기압을 통해 발생된 힘의 적용에 의함)일 수 있거나, 또는 능동적 힘 및 수동적 힘의 조합에 의할 수 있다.
추가 실시양태에서, 프로세서, 컴퓨터 판독가능 메모리, 및 컴퓨터 판독가능 메모리에 저장되고 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 수행하기 위해 프로세서 상에서 실행되도록 적응된 루틴이 또한 제공된다. 적합한 컴퓨팅 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는 퍼스널 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 핸드-헬드 또는 랩탑 장치, 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서-기반 시스템, 셋톱 박스, 프로그램가능한 가전 제품, 네트워크 PC, 미니 컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터, 상기 시스템 또는 장치 중 임의의 것을 포함하는 분산 컴퓨팅 환경, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 시스템을 포함한다.
일반적 방법
분자 생물학의 표준 방법이 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982, 1989 2nd Edition, and 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3), 및 생물정보학 (Vol. 4)을 기재하는 문헌 [Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에서 나타난다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제, 및 단편화가 기재되어 있다 (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 문헌). 리간드/수용체 상호작용을 특징화하는 표준 기술이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
단일 쇄 항체 및 디아바디가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Malecki et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt, 1999, J. Immunol. Methods 231:177-189]; 및 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 이중기능적 항체가 제공된다 (예를 들어, 문헌 [Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659]; 및 미국 특허 번호 5,932,448, 5,532,210, 및 6,129,914 참조).
이중특이적 항체가 또한 제공된다 (예를 들어, 문헌 [Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875] 참조).
항체는, 예를 들어, 소형 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하고, 예를 들어, 염료, 방사성동위원소, 효소, 또는 금속, 예를 들어, 콜로이드성 금에 커플링된 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).
형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함하는 유동 세포측정법 방법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 핵산, 폴리펩티드, 및 항체를 변형시키는 데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
면역계 조직학의 표준 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조).
예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (예를 들어, 진뱅크, 벡터 NTI® 스위트(Vector NTI® Suite) (인포맥스, 인크.(Informax, Inc), 메릴랜드주 베데스다); GCG 위스콘신 패키지 (엑셀리스, 인크.(Accelrys, Inc.), 캘리포니아주 샌디에고); 디사이퍼(DeCypher)® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.), 네바다주 크리스털 베이); 문헌 [Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).
실시예
실시예 1: 완전 인간 RSV 중화 항체의 확인
강력한 HRSV 중화 항체를 확인하기 위해, 혈청을 사전 동의 하에 공여자로부터 수득하고 시험관내에서 HRSV 바이러스를 중화시키는 능력에 대해 검정하였다. 중화 검정을 위해, 혈청 샘플을 먼저 연속 희석한 다음, 증가된 녹색 형광 단백질 (RSV-GFP)을 발현하는 600 pfu의 hRSV-A 균주와 함께 인큐베이션하였다. RSV-GFP를 96-웰 U-바닥 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 웰당 200 μl의 총 부피로 혈청 희석물과 1:1 혼합하였다. 이어서, 웰당 100 μl의 혼합물을 HEp-2 세포 시딩된 플레이트 (웰당 15,000개의 세포)로 옮겼다. 플레이트를 아큐멘® 셀리스타(acumen® Cellista) (TTP 랩테크(TTP LabTech), 매사추세츠주 캠브리지) 상에서 스캐닝하고 데이터를 GFP 사건의 수 및 웰당 총 형광 강도로서 내보냈다. NT50 값을 4 파라미터 곡선 피팅에 의해 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 6 (그래프패드 소프트웨어, 인크.(GraphPad Software, Inc.), 캘리포니아주 라호야)을 사용하여 계산하였다. RSV 융합전-F 및 융합후-F 단백질에 대한 ELISA 결합 역가를 하기에 따라 수행하였다. 눈크 C96 맥시소르프® 눈크-이뮤노™(Nunc C96 Maxisorp® Nunc-Immuno™) 플레이트 (써모 사이언티픽, 인크.(Thermo Scientific, Inc.))를 PBS 중 1 μg/ml의 hRSV 융합전-F (문헌 [McLellan et al., 2013, Science 342:592] 참조) 또는 융합후-F 단백질 (융합후 F LZF21 단백질은 융합 펩티드가 없는 wt F 엑토도메인으로 이루어짐 (문헌 [See McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788] 참조))의 웰당 50 μl로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS/트윈 20으로 세척한 다음, PBS 중 3% 탈지유로 차단시켰다. 그 후, 웰당 50 μl의 연속 희석된 혈청 샘플을 첨가하고 실온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (서던바이오테크(SouthernBiotech), 알라바마주 버밍햄)를 1:2,000 희석률로 첨가하였다. 1시간 후, 플레이트를 세척하고 슈퍼블루 터보 TMB(SuperBlu Turbo TMB) 용액 (비로랩스, 인크.(ViroLabs, Inc.), 버지니아주 스털링)으로 현상하였다. OD450nm 판독치를 왈락 1420 빅터2(Wallac 1420 VICTOR2)™ 다중표지 계수기 (퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 수득하였다. EC50 값을 4 파라미터 곡선 피팅에 의해 그래프패드 프리즘 6을 사용하여 계산하였다. 높은 HRSV 중화 및 결합 역가를 입증하는 공여자의 하위세트를 회수하여 PBMC 생성을 위한 보다 큰 혈액 부피를 입수하였다. PBMC 제조를 상업적 판매업체에 의해 수행하고 구입된 PBMC를 추가로 사용할 때까지 액체 질소에서 보관하였다.
한 대상체로부터의 PBMC가 우수한 중화 역가를 입증하였고 또한 융합후 F 단백질에 대한 ELISA 결합 검정에서 가장 높은 역가를 가질 뿐만 아니라 융합전 F 단백질에 대한 엘리트 결합제 중 하나였다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, 이 공여자의 PBMC를 FACS 분류에 의해 융합후-F 특이적 기억 B-세포를 단리하기 위해 선택하였다.
제조업체의 지침에 따라 E-Z 링크(E-Z Link)™ 술포-NHS-LC 비오티닐화 키트 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 사용하여 LZF21을 비오티닐화시킴으로써 비오티닐화 삼량체 융합후 F 단백질 (LZF21)을 제조하였다 (McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788). LZF21 단백질은 융합 펩티드가 없는 야생형 F 단백질 엑토도메인으로 이루어진다 (McLellen et al., 2011, J. Virol 85:7788). 융합 F 단백질 특이적 뮤린 하이브리도마 4D7 (4D7은 Balb/c 마우스를 RSV A2 바이러스로 면역화시킴으로써 생성된 마우스 하이브리도마임). Balb/c 마우스를 복강내로 RSV A2 바이러스로 2회 면역화시키고, 정맥내 주사에 의해 20 μg의 정제된 RSV A2 (어드밴스드 바이오테크놀로지스, 인크.(Advanced Biotechnologies, Inc.), 메릴랜드주 콜럼비아)를 사용하여 융합 3일 전에 부스팅하였다. 비장을 수거하고 비장세포를 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 세포를 배지 D (스템셀 테크놀로지스 인크.(StemCell Technologies Inc.), 브리티쉬콜럼비아주 밴쿠버)에 첨가하고, 245 mm x 245 mm 정사각형 페트리 디쉬에 플레이팅하고 37℃, 5% CO2에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 개별 콜로니를 클론픽스(ClonePix) (제네틱스(Genetix))를 사용하여 고르고, 96 웰 플레이트로 옮기고 상기와 같이 1주 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상청액을 정제된 RSV A2에 대한 ELISA에 의해 항-RSV 활성에 대해 스크리닝하였다. 4D7을 포함하는 양성 클론을 확장시키고 추가로 한계 희석에 의해 서브-클로닝하였다. 서브-클론을 상기 기재된 바와 같이 스크리닝하고 4D7-8을 확인하고 이를 사용하여 FACS에 의한 기억 B-세포에 대한 LZF21-비오틴의 염색을 최적화하였다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 최적화 실험을 통해, 1.5 μg/ml의 LZF21-비오틴이 융합후-F 특이적 기억 B-세포의 염색을 위한 최상의 농도인 것으로 결정되었다. 염색 반응의 특이성을 무관한 뮤린 하이브리도마를 음성 대조군으로 사용하고 결합을 100-1000X 과량의 비표지된 LZF21과 경쟁시킴으로써 입증하였다.
항원 특이적 기억 B-세포를 CD3-CD19+IgG+LZF21+로 기술하였다. 이들 세포를 CD40 리간드 발현 HEK293 세포주 (표준 분자 생물학 기술을 사용하여 제조됨) 및 IL-21 (시노 바이올로지칼 인크.(Sino Biological Inc.), 펜실베니아주 노스 웨일즈)을 함유하는 96 웰 플레이트 (1개 세포/웰)로 분류하였다. 30개의 분류된 샘플 중에서, 6개의 웰로부터의 상청액이 ELISA 검정에서 융합후-F 단백질에 대한 결합을 입증하였다 (상기 기재된 바와 같이 수행됨). 이들 샘플은 또한 융합전-F 단백질에 결합하였다 (데이터는 제시되지 않음). 이어서, 이들 6개의 샘플을 상기 기재된 바와 같은 중화 검정에서 희석 없이 시험하였다. 중화 활성의 존재를 GFP 사건의 감소에 기초하여 결정하였다. 6개의 샘플 중에서, 그 중 2개 (RB1 및 RB11로 지정됨)가 HRSV-A 균주의 완전한 중화를 나타냈다 (표 3 참조).
표 3
Figure 112018050793063-pct00003
단일-분류된 기억 B 세포 배양물에 대한 RNA 추출 및 RT-PCT
파트 1:
RB1 히트 용해물로부터의 96 웰 플레이트로부터의 RNA를 제조업체의 매뉴얼에 따라 RN이지(RNeasy)® 마이크로 키트 (퀴아젠, 인크.(Qiagen, Inc.), 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 추출하였다. RNA 농도를 UV 260 nm 하에 나노드롭(NanoDrop)™ 2000C (써모 피셔 사이언티픽 인크.(Thermo Fisher Scientific Inc.), 델라웨어주 윌밍톤)로 결정하였다. RB1 웰로부터 추출된 RNA를 리더 서열 (정방향) 및 IgG JH, 카파 불변 영역 또는 람다 불변 영역의 C' 말단 (역방향)으로부터의 서열을 사용하는 프라이머 서열을 사용하는 항체 중쇄 및 경쇄 유전자의 RT-PCR 증폭에서 주형으로서 사용하였다.
원스텝(OneStep) RT-PCR 키트 (퀴아젠 인크., 캘리포니아주 발렌시아)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 항체 서열을 증폭시켰다. PCR 조건은 하기와 같았다: 30분 동안 50℃, 15분 동안 95℃, [30초 동안 94℃, 30초 동안 55℃, 1분 동안 72℃] x 40, 10분 동안 72℃, 및 4℃ 유지.
RT-PCR 생성물을 네스티드 PCR을 위한 주형으로서 직접 사용하였다.
파트 2: 네스티드 PCR
RT-PCR 생성물을 네스티드-PCR에서 주형으로서 사용하여 pfx50 DNA 폴리머라제 (인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호: 12355-012)로 항체 가변 영역을 증폭시켰다. 네스티드-PCR 프라이머에 대한 설계는 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 프레임워크 1 영역의 배선 서열에 기초하였다.
1 μl RT-PCR 생성물을 2.5 μl 10X PCR 완충제, 2.5 μl 10X PCRX 인핸서 (인비트로젠), 0.5 μl dNTP 혼합물, 0.5 μl 정방향 프라이머 풀 (각각 10 μM), 0.5 μl 역방향 프라이머 (10 μM), 0.5 μl pfx50 DNA 폴리머라제 및 17 μl 물과 혼합하였다. 네스티드 PCR 조건은 94℃에서 2분, 30초 동안 94℃, 30초 동안 50℃, 1분 동안 68℃의 10회 사이클에 이어서 30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 1분 동안 68℃의 30회 사이클, 이어서 68℃에서 7분 신장에 이어서, 단기 저장을 위한 4℃ 유지였다.
VH 및 VK의 RB1 네스티드 PCR 생성물 또는 VH 및 VL 증폭된 PCR 생성물을 후속 단계 인퓨전(infusion) 클로닝을 용이하게 하기 위해 특이적 링커와 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 함께 어닐링하기 위한 중첩 PCR에서 주형으로서 사용하였다.
파트 3. 중첩 PCR 및 인퓨전 클로닝
pfx50 DNA 폴리머라제 (인비트로젠)를 이 반응에 사용하였다. 정방향 및 역방향 프라이머를 클로닝 벡터 내로의 중첩 PCR 생성물의 인퓨전 클로닝을 용이하게 하도록 설계하였다. 1 μl 중쇄 네스티드 PCR 생성물, 1 μl 경쇄 네스티드 PCR 생성물 및 1 μl 링커를 5 μl 10x PCR 완충제, 5 μl 10x PCRX 인핸서, 1 μl dNTP 혼합물, 1 μl 정방향 프라이머 (10 μM), 1 μl 역방향 프라이머 (10 μM), 1 μl pfx50 DNA 폴리머라제 및 33 μl 물과 혼합하였다.
PCR 조건은 하기와 같았다: 2분 동안 94℃, [30초 동안 94℃, 30초 동안 60℃, 2분 동안 68℃] x 10, [30초 동안 94℃, 30초 동안 65℃, 2분 동안 68℃] x 30, 7분 동안 68℃, 4℃ 유지.
중첩 PCR 생성물을 인퓨전 클로닝을 위해 아가로스 겔 정제하였다 (대략 1.2 kb의 RB1 VH+VK 중첩 PCR 생성물을 수득함). RB1 VH+VK 중첩 PCR 생성물을 인퓨전 클로닝을 적용하여 pMab11Exp2 (경쇄 발현을 위한 OmpA 리더 서열 포함, 중쇄 발현을 위한 PelB 리더 서열 포함) 벡터 내로 클로닝하였다. 인퓨전 HD® 클로닝 키트 (클론테크 래보러토리즈, 인크.(Clontech Laboratories, Inc.), 마운틴 뷰, 캘리포니아주)를 사용하고 제조업체의 지침을 따랐다. 형질전환체를 고르고 서열분석을 위해 진와이즈, 인크.(GeneWiz, Inc.) (뉴저지주 사우스플레인필드)로 보냈다.
서열분석 결과를 시퀀처(Sequencher) (진 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation), 미시간주 앤 아버)로 분석하였다.
RB1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 표 7에 도시된다 (모 단리된 RB1 가변 중쇄 및 가변 경쇄 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 8에 의해 나타내어짐). 뉴클레오티드 변화를 갖는 Jh 역방향 프라이머의 설계로 인해, 위치 125에서 천연 서열에 존재하는 이소류신은 발현된 단백질에서 트레오닌으로 변화되었다 (생성된 RB1 가변 중쇄는 서열식별번호: 7에 의해 나타내어짐). RB1 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 유전자의 아미노산 서열을 코돈 최적화 및 인간 IgG1 전환 및 CHO 일시적 발현 및 생산을 위해 젠스크립트 USA, 인크.(GenScript USA, Inc.) (뉴저지주 피스카타웨이)로 보냈다. 합성된 DNA를 CHO-3E7 세포 발현을 위해 pTT5 벡터 내로 서브클로닝하였다. 각각의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 재조합 플라스미드를 CHO-3E7 세포 배양물 내로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 제6일에 수집된 세포 배양물 상청액을 단백질 A 칼럼을 통해 정제에 사용하였다. 정제된 RB1 인간 IgG1을 중화 검정 및 실시예 2에 기재된 바와 같은 다른 특징화 실험에 사용하였다.
실시예 2: 항-hRSV 항체의 특징화
RB1은 실시예 1에 기재된 바와 같은 ELISA 검정에서 1-10 ng/ml 범위의 EC50으로 융합전 F 및 융합후 F 단백질 둘 다에 결합하는 반면에, D25 항체 (문헌 [Kwakkenbos et al., 2010, Nature Medicine 16:123-128] 참조)는 융합전 F에 우선적으로 결합하였다. 도 1a-b를 참조한다.
Figure 112018050793063-pct00004
RB1, RB 11, 및 문헌에 보고된 일부 벤치마크 항체 (D25, 팔리비주맙, 전장 [D25 항체는 공개 서열에 기초하여 사내 제조되었고 시나기스® (팔리비주맙)는 미오덤(Myoderm), 펜실베니아주 노리스타운으로부터 구입함])에 대한 중화를 RSV A 롱 균주 (ATCC 번호 VR-26™) 및 RSV B 워싱턴 균주18537 균주 (ATCC 번호 VR-1580™)에서 비교하였다. 시험 샘플을 11개 희석 포인트를 위해 2% 열 불활성화 FBS로 보충된 EMEM 중에 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 샘플을 100 pfu/웰의 RSV A 또는 B 균주를 함유하는 2% 열 불활성화 FBS로 보충된 동등 부피의 EMEM와 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 1.5x105개 세포/ml의 농도의 HEp-2 세포 100 μl를 바이러스/항체 혼합물을 함유하는 96 웰 플레이트로 옮겼다. 감염후 제3일에, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 실온에서 10분 동안 80% 아세톤 중에 고정시켰다. RSV F (mAb143-F3-B138) 및 RSV N (34C9) 특이적 마우스 mAb (사내 수득됨)의 혼합물을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고 비오티닐화 말 항-마우스 IgG를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈으로 세척하였다. 적외선 염료-스트렙타비딘을 사용하여 RSV 특이적 신호를 검출하고 검정 정규화를 위한 2종의 세포 염색액을 96-웰 플레이트에 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 어두운 곳에서 20분 동안 공기 건조시키고 세포 정규화를 위한 700 채널 레이저 및 RSV 특이적 신호의 검출을 위한 800 채널 레이저를 이용하여 리코르 에리우스(Licor Aerius)® 자동화 영상화 시스템 상에서 판독하였다. 800/700 비 및 퍼센트 중화를 계산하고 IC50 값을 그래프패드에서의 4 파라미터 곡선 피트에 의해 결정하였다.
RB1은 동등한 효력 (1-5 ng/ml의 IC50)으로 RSV-A 및 RSV-B 균주를 중화시킬 수 있었다. RB1은 또한 벤치마크 항체와 비교하여 우월한 항-RSV 중화를 입증하였다. 도 2a-b 및 표 4를 참조한다.
표 4: 벤치마크 항체 대비 RB1의 결합 및 중화 효력
Figure 112018050793063-pct00005
융합전 및 융합후 F 단백질에 대한 RB1의 결합에 대한 친화도 결정: 항-인간 RSV F 단백질 항체 RB1 (실시예 1에 기재된 바와 같이 제조됨)의 동역학적 결합 활성을 비아코어 T200 시스템 (비아코어, 지이 헬스케어(GE Healthcare), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 대략 5000 RU의 항-마우스 IgG, 지이 헬스케어 카탈로그 번호 BR-1008-38, 또는 대략 13,000 RU의 염소 항-Rat IgG Fc 감마, 단편 특이적, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 번호 112-006-071을 아민 커플링 화학을 통해 시리즈 S CM5 센서 칩, 카탈로그 번호 BR-1005-30 상에 고정시켰다.
배경 차감 결합 센소그램을 회합률 상수 (ka) 및 해리율 상수 (kd), 및 평형 해리 상수 KD를 분석하는 데 사용하였다. 생성된 데이터 세트를 비아코어 T200 평가 소프트웨어 (버전 2.0)를 사용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델로 피팅하였다. 표 5는 RSV F 단백질의 융합전 및 융합후 형태에 대한 항-인간 RSV F 단백질 항체의 친화도를 요약한다.
표 5: 비아코어를 사용한 RSV 융합전 F 및 융합후 F에 대한 RB1의 친화도의 측정
Figure 112018050793063-pct00006
RB1은 ~31 pM의 Kd를 갖는 융합전 F 단백질의 매우 강력한 결합제이다. 융합후 결합에 대한 Kd는 0.41 nM로 한 자릿수 더 낮았다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014121021 A1에 보고된 바와 같은 D25에 대한 Kd는 57 pM이었다. 또한 항체 RB1은 융합후 F 단백질과 비교하여 1.4 x 10- 4의 보다 느린 오프 레이트(off rate)로 알 수 있는 바와 같이 융합후보다 융합전 F 상에 더 길게 머무른다.
실시예 3: RB1 항체의 에피토프 맵핑
융합 F 단백질 상의 RB1의 결합 에피토프를 알라닌 스캔 돌연변이유발 실험을 수행하여 맵핑하였다. 에피토프 맵핑을 기재된 바와 같이 인테그랄 몰레큘라(Integral Molecular)에서 샷건 돌연변이유발에 의해 수행하였다. (Davidson and Doranz, 2014, Immunology 143(1): 13-20). 샷건 돌연변이유발 라이브러리를 구축하기 위해, RSV-F 단백질 발현 벡터를 돌연변이유발하여 클론의 라이브러리를 형성하며, 각각은 개별 점 돌연변이체를 나타내고 누적적으로 단백질 내의 모든 잔기를 커버한다. 라이브러리를 각각의 잔기의 측쇄 기여를 정하는 보다 제어된 방법을 제공하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 사용하여 구축하였다. 반자동화 로봇식 프로토콜을 사용하여, 각각의 돌연변이된 플라스미드를 개별적으로 클로닝하고, 서열분석하고, 미니-프렙하고 인간 세포에서의 반복된 형질감염, 발현 및 항체 결합 검정을 위한 384-웰 마이크로플레이트 포맷에 배열하였다. 알라닌 스캐닝 돌연변이체 라이브러리를 항체 결합의 상실에 대해 RB1에 대하여 스크리닝하였다. 2개의 잔기 아르기닌-429 및 이소류신-432를 RB1 결합에 중요한 것으로 확인하였다. 하기 및 도 3a를 참조한다. RB1은 부위 IV mAb (101F-유사)인 것으로 보이고 문헌의 부위 IV 결합 항체는 융합전 및 융합후 F 둘 다에 결합하는 것으로 보고되었다.
Figure 112018050793063-pct00007
본 발명자들은 추가로 결합 에피토프를 더 잘 이해하기 위해 융합전 F 단백질과 RB1 Fab를 공-결정화시켰다. 회절 데이터를 3.4-3.5Å에서의 결정으로부터 수집하였다. RB1 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다의 CDR 루프와의 상호작용을 통해 융합전 F 단백질에 결합한다. 경쇄 CDR3 루프는 Phe 91 및 Leu 92의 카르보닐 산소와 Arg 429의 구아니디노 질소 사이의 2개의 수소 결합의 형성을 통해 Arg 429의 측쇄와 상호작용한다. 또한 경쇄 상에서, CDR2 루프 상의 Asp 50 및 Glu 55는 RSV의 Asn 426 및 Lys 445와 수소 결합을 형성하도록 위치한다. 광범위한 상호작용은 RB1의 중쇄의 CDR3 루프를 통해 Tyr 104 및 Tyr 110이 RSV 상의 Ile 432와 반 데르 발스 상호작용을 위한 표면을 형성하면서 이루어진다. RSV의 Lys 433은 CDR3 루프의 Asn 107과 수소 결합을 형성한다. 결정 구조로부터, RB1의 경쇄는 또한 RSV 융합전 삼량체의 이웃 단량체의 Glu 161 및 Ser 182에 대해 패킹한다.
RB1에 대해 확인된 결합 에피토프는 문헌에 보고된 946개 F 단백질 서열 중 944개에서 고도로 보존된다. 이는 이러한 영역에 대한 항체에 대한 저항성이 낮을 것으로 예상된다는 것을 시사한다.
실시예 4: 동물 모델에서의 RSV 항체의 항-RSV활성
RB1 항체를 코튼 래트 챌린지 모델에서의 보호의 제공에 대해 D25 및 팔리비주맙과 비교하였다. 연구는 2.5 mg/k로 및 0.25 mg/mk로 10배 연속 희석하여 주어진 팔리비주맙, D25 및 RB1 항체를 포함하였다. 수동 면역요법의 이 모델에서, 코튼 래트에게 제0일에 다양한 농도로 RB1, D25 또는 팔리비주맙을 제공하고 1일 후 105 pfu의 RSV로 챌린지하였다. 챌린지된 RSV 바이러스의 코 및 폐 역가는 챌린지후 제4일이었고 이를 사용하여 플라크 검정을 통해 바이러스 배출을 결정하였다.
코튼 래트: 3-7령의 대략 100 그램의 평균 체중을 갖는, 적어도 5마리의 코튼 래트 (시그모돈 히스피두스(Sigmodon hispidus))를 세이지 랩스(SAGE Labs) (펜실베니아주 보여타운)로부터 입수하였다. 통상적인 설치류 사료 및 물을 자유롭게 제공하였다.
항체 시약: 동결건조된 팔리비주맙 100 mg (미오덤, 펜실베니아주 노리스타운)을 100 mg/ml로 물 중에 제제화하였다. 다른 항체를 사내 발현시키고 정제하였다.
항체 시약의 제제: 제제 완충제는 단백질을 안정화시키고 침전을 방지하기 위해 각각의 항체에 대해 특이적이었다. 제제는 하기와 같았다: RB1 및 D25를 1x 포스페이트 완충 염수, pH 7.2 중에 희석하였다. 팔리비주맙을 제조업체 제안에 따라 25 mM 히스티딘 및 1.3 mM 글리신 pH6.0 중에서 단백질을 효과적으로 완충시킬 증류된 H2O 중에 용해시킴으로써 제제화하였다.
투여 용액 제조, 투여, 및 분석:
5마리의 동물을 무작위로 칭량하여 사용된 코호트의 평균 체중을 결정하였다. 동물 내로의 투여 약 1시간 전에 제제를 제조하였다. 항체의 동결 스톡을 단일 해동을 위해 젖은 얼음 상에서 해동시켰다. 각각의 항체를 각각의 군으로 전달될 적절한 용량 농도로 희석하였다. 제0일 (연구의 개시)에 각각의 군에 무작위로 할당된 동물을 1-4% 이소플루란 마취로 약하게 진정시키고 26G 시린지 및 바늘을 사용하여 우측 사두근 내로 근육내로 0.1 ml을 투여하였다. 동물은 2분 내에 진정의 효과로부터 회복되었다. 약 24시간 후 (+/- 2시간), 코튼 래트를 1-4% 이소플루란으로 진정시키고, 안와후 신경총을 통해 채혈한 다음, 즉시 비공을 통해 윌리암스 E 배지(Williams E medium) 중 0.1 ml의 1x105.5 pfu의 RSV A2 또는 RSV B 워싱턴 야생형 바이러스를 투여하였다. 접종후 제4일에, 동물을 CO2 흡입에 의해 희생시키고 폐 (좌엽) 및 비갑개를 제거하고 젖은 얼음 상에서 수크로스 포스페이트 글루타민 완충제 (SPG)를 함유하는 10 부피의 행크 평형 염 용액 (론자(Lonza)) 중에 균질화시켰다. 샘플을 2000 rpm에서 10분 동안 원심분리에 의해 정화하고, 분취하고, 급속 동결시키고, 플라크 검정에서 시험될 때까지 즉시 -70℃에서 동결 보관하였다.
도 4a-d 및 도 5a-d에 도시된 바와 같이, RB1은 D25와 유사하지만 코에서의 바이러스 역가에 영향을 미칠 수 없는 팔리비주맙보다 더 우수하게, 2.5 mpk의 용량의 투여 시에 폐 및 코에서 RSV A 및 RSV B 둘 다에 대한 바이러스 역가의 2-3 로그 감소를 달성할 수 있었다.
실시예 5: RB1의 Fc 조작
IgG에 대한 신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 모체로부터 그녀의 태아로의 수동 체액성 면역의 전달에 있어서 잘 특징화되었다. 또한, 일생 동안, FcRn은 IgG를 분해로부터 보호하고, 이에 의해 혈청에서의 이 부류의 항체의 긴 반감기가 설명된다. 예를 들어, 문헌 [Israel et al., 1996, Immunology 89:573-8]을 참조한다. FcRn은 전형적 FcγR 또는 보체의 C1q 성분의 결합 부위와 별개의 부위에서 IgG의 Fc 부분에 결합한다. FcRn-Fc 공-결정 구조는 FcRn이 IgG 항체의 CH2-CH3 힌지 영역에 결합한다는 것을 밝혀냈다. IgG-FcRn 경로의 구별되는 특징은 편성 pH 의존성이다. IgG-FcRn 결합은 리소솜 내에서 산성 pH (6.0)에 의해 유발되는 반면에, 해리는 세포외 환경의 중성 pH (7.4)에서 발생한다. 리소솜 내의 산성화 (pH 6.0-6.5)는 낮은 마이크로몰 친화도로의 IgG의 Fc 영역에 대한 FcRn의 결합을 가능하게 하고 이를 이화작용으로부터 보호한다. 보호된 FcRn-결합된 IgG는 후속적으로 세포 표면으로 운반되고 세포외 환경 내로 방출된다. 이 과정은 항체를 세포외 분해에 대한 그의 노출을 감소시킴으로써 보호한다.
RB1 항체를 반감기를 개선시기 위한 노력으로 Fc 조작에 적용하였다. RB1+YTE는 RB1의 Fc 부분 내로 도입된 삼중 돌연변이 (M252Y/S254T/T256E (YTE))를 갖는 RB1의 유도체이다. 이 YTE 돌연변이 세트는 신생아 Fc 수용체에 대한 항체 결합을 개선시키며 이는 인간에서 보다 긴 반감기로 이어진다. 예를 들어, 문헌 [Dall'Acqua et al., 2006, J Biol Chem. 281:23514-24]을 참조한다. 모타비주맙의 Fc 영역 내의 3개의 아미노산에서의 돌연변이 (YTE: M252Y/S254T/T256E)는 인간 및 원숭이 둘 다에서 pH 6.0에서의 시험관내 FcRn 결합을 10배 증가시켰고 결과적으로 원숭이에서 생체내 혈청 반감기의 4배 증가를 일으켰다. 문헌 [Robbie et al., 2013, Antimicrob Agents Chemother. 57:6147-53]을 참조한다.
RB1+YTE 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열을 코돈 최적화 및 인간 IgG1 전환 및 CHO 일시적 발현 및 생산을 위해 젠스크립트 USA, 인크. (뉴저지주 피스카타웨이)로 보냈다. RB1+YTE의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 표 7에 도시된다.
합성된 DNA를 CHO-3E7 세포 발현을 위해 pTT5 벡터 내로 서브클로닝하였다. 각각의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 재조합 플라스미드를 CHO-3E7 세포 배양물 내로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 제6일에 수집된 세포 배양물 상청액을 단백질 A 칼럼을 통해 정제에 사용하였다. 정제된 RB1+YTE 인간 IgG1을 중화 검정 및 다른 특징화 실험에 사용하였다.
실시예 6: RB1+YTE의 특징화
RB-1+YTE는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된 ELISA 검정에서 1.97 내지 2.457 ng/ml 범위의 EC50으로 F 단백질에 결합하였다. 도 6을 참조한다. RB1+YTE, 및 공개 서열에 기초하여 사내 제조된, 문헌에 보고된 벤치마크 항체 (모타비주맙, 메드이뮨(MedImmune), 메릴랜드주 게이더스버그; 미국 특허 출원 공개 번호 US20110158985 참조)에 대한 중화를 RSV A 롱 균주 (ATCC 번호 VR-26™) 및 RSV B 워싱턴 균주18537 균주 (ATCC 번호 VR-1580™)에서 비교하였다. 시험 샘플을 11개 희석 포인트를 위해 2% 열 불활성화 FBS로 보충된 EMEM 중에 3배 연속 희석하였다. 이어서, 연속 희석된 샘플을 100 pfu/웰의 RSV A 또는 B 균주를 함유하는 2% 열 불활성화 FBS로 보충된 동등 부피의 EMEM와 혼합하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 1.5x105개 세포/ml의 농도의 HEp-2 세포 100 μl를 바이러스/항체 혼합물을 함유하는 96 웰 플레이트로 옮겼다. 감염후 제3일에, 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, 실온에서 10분 동안 80% 아세톤 중에 고정시켰다. RSV F (mAb143-F3-B138) 및 RSV N (34C9) 특이적 마우스 mAb (mAb143-F3-B138 및 34C9는 마우스를 각각의 항원으로 면역화시키고 하이브리도마 기술을 사용하여 B-세포를 불멸화시킴으로써 유래된 사내 항체임)의 혼합물을 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 20으로 세척하고 비오티닐화 말 항-마우스 IgG를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/0.05% 트윈으로 세척하였다. 적외선 염료-스트렙타비딘을 사용하여 RSV 특이적 신호를 검출하고 검정 정규화를 위한 2종의 세포 염색액을 96-웰 플레이트에 첨가하고 어두운 곳에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 어두운 곳에서 20분 동안 공기 건조시키고 세포 정규화를 위한 700 채널 레이저 및 RSV 특이적 신호의 검출을 위한 800 채널 레이저를 이용하여 리코르 에리우스® 자동화 영상화 시스템 상에서 판독하였다. 800/700 비 및 퍼센트 중화를 계산하고 IC50 값을 그래프패드에서의 4 파라미터 곡선 피트에 의해 결정하였다.
RB-1+YTE는 동등한 효력 (5-10 ng/ml의 IC50)으로 RSV-A 및 RSV-B 균주를 중화시킬 수 있었다. 표 6을 참조한다.
표 6: RB1+YTE에 대한 RSV 융합전 F 및 융합후 F에 대한 친화도 및 중화의 측정
Figure 112018050793063-pct00008
RB1의 Fc 부분에의 YTE 돌연변이의 도입은 RSV A 및 B 균주를 중화시키는 항체의 시험관내 효력을 변경시키지 않았다. RSV A에 대한 시험관내 중화 효력은 RB1 및 RB1+YTE에 대해 각각 3 및 3.6 ng/ml였다. RSV B에 대한 시험관내 중화 효력은 RB1 및 RB1+YTE에 대해 각각 1.7 및 3.49 ng/ml였다. 비아코어에 의해 측정 시에 RB1 및 RB1+YTE에 대한 동역학적 상수는 유사하였고, 이는 항체의 Fc 영역에의 YTE의 도입이 그의 항원 결합 특성을 변경시키지 않았다는 것을 시사한다.
비-GLP (우수 실험실 관리기준) 약동학적 연구를 뉴 이베리아 리서치 센터(New Iberia Research Center) (루이지애나주 UL 라파예트)에서 수행하였다. 8마리의 생물제제-나이브 수컷 레서스 원숭이를 무작위화하고 2개의 연구군 중 하나에 할당하였다 (군당 n=4). 각각의 동물은 10 mg/kg의 단일 정맥내 (i.v.) 용량의 RB1+YTE 또는 모타비주맙-YTE를 받았다. 혈액 샘플을 투여 전 제0일, 투여 후 제0.5, 1, 3, 8 및 24시간에, 및 투여 후 제1, 2, 3, 5, 7 및 10일에 채취하였다. ECL-기반 면역검정을 사용하여 레서스 원숭이 혈청에서의 RB1+YTE (인간 x [RSV] mAb (RB1-YTE) IgG1 / 카파 (CE)) 및 모타비주맙_YTE (인간화 x[RSV] mAb IgG1 / 카파) 둘 다를 정량화하였다.
검정은 비오티닐화 마우스 항-인간 IgG 카파 쇄 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세)를 포획 시약으로서 및 술포태그 마우스 항-인간 IgG Fc (서던바이오테크, 알라바마주 버밍햄)를 검출 시약으로서 사용하였다. 검정의 정량 하한치 (LLOQ)는 20의 최소 요구 희석 (MRD)에서 1.37 ng/ml인 것으로 결정되었다.
RB1+YTE 및 모타비주맙-YTE의 약동학을 10 mg/kg으로 정맥내로 투여된 레서스 마카크에서 10일까지 동일한 면역검정을 사용하여 평가하여 RB1+YTE 및 모타비주맙-YTE를 정량화하였다. 각각의 동물에 대해, 비-구획 모델을 포에닉스 윈논린(Phoenix Winnonlin) 6.3 (세르타라(Certara), 뉴저지주)를 사용하여 각각의 동물의 혈청 농도 데이터에 대해 피팅하여 곡선하 면적 (AUC제0일-제10일)을 평가하였다. AUC제0일-제10일을 각각의 처리군에 대해 4마리의 동물에 걸쳐 평균을 내고 평균 ± 표준 편차로 기록하였다. RB1+YTE의 경우, AUC제0일-제10일 = 1159±116 μg/mL*일 및 모타비주맙-YTE의 경우, AUC제0일-제10일 = 1381±63.0 μg/mL*일
RB1+YTE (도면 범례에 RB1-YTE로 도시됨) 및 모타비주맙-YTE는 레서스 마카크에서 유사한 혈청 농도 프로파일 및 약동학을 나타냈다. 도 7을 참조한다. NHP에서의 RB1+YTE PK는 또한 문헌에 보고된 시노몰구스 원숭이에서 모타비주맙-YTE PK와 대등한 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Dall'Acqua et al., 2006, J Biol Chem, 281:23514-24]을 참조한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공개, 데이터베이스 등록물 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 진ID(GeneID) 등록물), 특허 출원 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 바와 동일한 정도로 참조로 포함된다. 이러한 참조로 포함된다는 진술은, 심지어 이러한 인용이 참조로 포함된다는 전용 진술에 바로 인접하지 않은 경우에도, 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 본 출원인에 의해, 각각의 및 모든 개별 공개, 데이터베이스 등록물 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 진ID 등록물), 특허 출원, 또는 특허에 관한 것으로 의도되며, 이들 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명백하게 확인된다. 명세서 내에, 존재하는 경우, 참조로 포함된다는 전용 진술의 포함은 참조로 포함된다는 이 일반적 진술을 어떠한 방식으로도 약화시키지 않는다. 본원의 참고 문헌의 인용은 이러한 참고문헌을 관련 선행 기술로 인정하는 것으로 의도되지 않거나, 또는 이들 공개 또는 문헌의 내용 또는 일자에 대해 어떠한 인정도 하지 않는다.
본 발명은 본원에 기재된 구체적 실시양태에 의해 범주가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재 및 첨부 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하도록 의도된다.
표 7: 서열 정보
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Figure 112018050793063-pct00010
Figure 112018050793063-pct00011
Figure 112018050793063-pct00012
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SEQUENCE LISTING <110> Vora, Kalpit A. Cox, Kara S. Tang, Aimin Chen, Zhifeng DiStefano, Daniel Zhang, Lan Su, Hua-Poo <120> MONOCLONAL ANTIBODY NEUTRALIZING HUMAN RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS <130> 24158-US-PCT <140> US62/247,841 <141> 2015-10-29 <140> US 62/367,359 <141> 2016-07-27 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ser Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Ile Lys Ser Lys Thr Tyr Gly Gly Thr Lys Glu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ala Pro Tyr Gly Gly Asn Ser Asp Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp Val 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Arg Thr Ser Gln Asp Val Arg Gly Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Ser Ser Leu Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Gln Phe Leu Asp Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RB1 heavy chain with amino acid 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gggacgattc caagaacatc 240 gcctatctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcacaaga 300 ggagctcctt acggaggcaa cagcgactac tattacggac tggacgtgtg gggacaggga 360 accacagtga ccgtgagctc c 381 <210> 18 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB1 VL codon optimized <400> 18 gacattcaga tgactcagtc cccttcaagt ctgagcgcct ccgtgggcga cagagtgacc 60 atcacatgcc ggaccagcca ggatgtgcgg ggcgccctgg cttggtacca gcagaagcca 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctttgac gctagctccc tggagaccgg cgtgccctcc 180 aggttttctg gcagcggctc cggcacagtg ttcaccctga caatctctag cctgcagcct 240 gaggactttg ccgcttacta ttgccagcag ttcctggatt tccccttcac cttcggccaa 300 ggcacacggc tggagatcaa gaggacc 327 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence heavy chain <400> 19 atgggttggt cctgtattat cctgttcctg gtcgccactg ctactggggt ccactca 57 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader sequence light chain <400> 20 atgggctggt cctgtattat cctgttcctg gtggcaaccg caactggtgt gcatagc 57 <210> 21 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcctctacaa agggccctag cgtgttccca ctggctccct cttccaagtc taccagcgga 60 ggaacagccg ctctgggatg tctggtgaag gattacttcc cagagcccgt gaccgtgtcc 120 tggaactctg gcgccctgac cagcggagtg cacacatttc cagctgtgct gcagtcctct 180 ggcctgtatt ccctgagctc cgtggtgacc gtgccctcta gctccctggg cacccagaca 240 tacatctgta acgtgaatca caagccaagc aatacaaagg tggacaagaa ggtcgagccc 300 aagtcctgtg ataagaccca cacatgcccc ccttgtcctg ctccagagct gctgggagga 360 cctagcgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaggacaccc tgatgatctc taggaccccc 420 gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggatc ctgaggtgaa gtttaactgg 480 tacgtcgatg gcgtggaggt gcacaatgcc aagacaaagc ccagagagga gcagtataac 540 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgaca gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtgtc caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa gaccatctct 660 aaggccaagg gccagcctag ggagccacag gtgtatacac tgcctccatc cagagacgag 720 ctgaccaaga accaggtgtc tctgacatgt ctggtgaagg gcttctaccc ttctgatatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tggccagcca gagaacaatt ataagaccac accccctgtg 840 ctggacagcg atggctcctt ctttctgtac agcaagctga ccgtggataa gtcccggtgg 900 cagcagggca acgtgttcag ctgttctgtg atgcacgaag ccctgcacaa tcactacact 960 cagaagagcc tgtccctgtc acctggtaaa 990 <210> 22 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtggccgctc cctccgtgtt tatcttcccc ccttctgacg agcagctgaa gtctggcaca 60 gctagcgtgg tgtgcctgct gaacaatttc taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag 120 gtggataacg ctctgcagtc tggcaatagc caggagtccg tgaccgagca ggactctaag 180 gatagcacat attccctgtc ctctaccctg acactgtcta aggccgatta cgagaagcac 240 aaggtgtatg cttgtgaagt cacccaccag gggctgagtt caccagtcac caagtcattc 300 aatcggggcg agtgc 315

Claims (28)

  1. 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, 인간 RSV F 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열식별번호: 7에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 또는 서열식별번호: 8에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이며, 여기서 임의의 서열 변이가 항체의 프레임워크 영역에서 발생하는 것인,
    경쇄 이뮤노글로불린, 중쇄 이뮤노글로불린 또는 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 둘 다를 포함하는 인간 RSV F 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명, 키넥사, 또는 옥테트에 의해 결정 시에 1 x 10-9 M 내지 1 x 10-12 M의 KD 값으로 인간 RSV 융합전 F 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제4항에 있어서, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 전장 항체이며, 여기서 각각의 경쇄가 서열식별번호: 8을 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 (서열식별번호: 14)를 포함하고; 각각의 중쇄가 서열식별번호: 7을 포함하는 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역 (서열식별번호: 13)을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제4항에 있어서, 항체가 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제5항에 있어서, 중쇄의 아미노산 서열이 서열식별번호: 23의 아미노산 서열로 이루어지고 경쇄의 아미노산 서열이 서열식별번호: 25의 아미노산 서열로 이루어진 것인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, IgG 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, CHO 세포에서 생산되는 항체인 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항의 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  11. 제10항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 서열식별번호: 23 또는 서열식별번호: 25를 코딩하는 단리된 핵산.
  13. 제12항의 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편,
    제10항 또는 제12항의 단리된 핵산, 또는
    제11항 또는 제13항의 발현 벡터
    를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제14항에 있어서, 피키아(Pichia) 세포 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포인 숙주 세포.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 인플루엔자, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 파라인플루엔자 (hPIV), 인간 리노바이러스 (hRV), 미코플라스마 뉴모니아(mycoplasma pneumonia), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(streptococcus pneumoniae), 아데노바이러스, 보카바이러스, 엔테로바이러스, 노로바이러스 또는 BK 바이러스로부터 선택된 호흡기 병원체에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 호흡기 병원체가 인플루엔자, hCMV, hMPV, hPIV, 노로바이러스, 또는 BK 바이러스인 조성물.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 RSV F 단백질 및 RSV G 단백질 및 그의 단편으로부터 선택된 항원을 포함하는 면역원성 조성물.
  20. 샘플에서 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 그의 단편의 존재를 검출하는 방법이며, 샘플을 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키고, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 펩티드 사이의 복합체의 존재를 검출하는 것을 포함하고; 여기서 복합체의 검출은 RSV 융합전 F 단백질의 존재를 나타내는 것인, 샘플에서 인간 RSV 융합전 F 단백질 또는 그의 단편의 존재를 검출하는 방법.
  21. 1) 감염 또는 감염성 질환을 예방하거나 또는 치료하거나; 또는
    2) 감염성 합병증으로 인한 호흡기 및 이식 질환을 예방하거나 또는 치료하는 데
    사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 의약.
  22. RSV 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 의약.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
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