TW201722417A - 降低膚色暗黃用的皮膚外用劑 - Google Patents

Abstract

本發明以提供使用於減低已生成的肌膚暗黃之皮膚外用劑作為課題。該解決手段為藉由提供含有橙皮素及/或糖基橙皮素作為有效成分而成的使用於減低已生成的肌膚暗黃之皮膚外用劑而解決前述課題。

Description

降低膚色暗黃用的皮膚外用劑

本發明係關於使用於減低已生成的肌膚暗黃之皮膚外用劑。

近年來對於該技術領域，隨著老化肌膚會逐漸暗黃，所謂對於肌膚之暗黃(以下若無特別說明時，僅稱為「暗黃」)由美容觀點來看成為一問題。作為暗黃之誘發要因，雖被認為於肌膚中之蛋白質的變性(糖化或梅拉德反應)為主要原因，於今日認為在肌膚深部之真皮中的蛋白質會因過氧化物質等而產生變性(羰基化)為該要因。

隨著肌膚暗黃的增加，肌膚的透明感會逐漸損失，會有比實際年齡更老的傾向，暗黃的對策對於想要保持年輕上為極重要的事。作為該暗黃對策的實例，於專利文獻1中揭示由南瓜種子之萃取物所成的暗黃抑制劑，專利文獻2、3中記載含有具有暗黃抑制作用之植物萃取物的皮膚外用劑。如此，含有專利文獻1至3中所揭示的 劑的過去公知之各種用劑為藉由抑制於肌膚中之蛋白質的變性(糖化或梅拉德反應)，使肌膚不會產生暗黃的用劑。

又，專利文獻4中揭示含有作為有效成成分的選自橄欖葉萃取物、水解豌豆蛋白質及檸檬萃取物的1種或2種以上而成的蛋白質羰基化抑制劑，該劑並非抑制糖化或梅拉德反應，其為抑制羰基化，其為藉此欲使肌膚不會產生暗黃之用劑。

如此在過去所進行的暗黃對策為可抑制於肌膚中之蛋白質的糖化或梅拉德反應，或藉由抑制羰基化而使肌膚不會產生暗黃的用劑(所謂暗黃預防劑)。如此過去對於該技術領域，認為一旦生成之暗黃無恢復至原來狀態，故著重於不使肌膚上生成暗黃的作法上。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]特開2007-254345號公報

[專利文獻2]特開2006-273811號公報

[專利文獻3]特開2007-254344號公報

[專利文獻4]特開2012-31106號公報

[專利文獻5]特開平10-70994號公報

本發明並非在未產生肌膚暗黃前加以抑制，其為提供使用於減低已經生成肌膚暗黃的皮膚外用劑作為課題者，本發明之課題本身即為具有新穎性者。

欲解決上述課題，本發明者等重複進行詳細研究努力結果，將橙皮素及/或糖基橙皮素使用於人類皮膚之外用時，發現在過去認為困難的將已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低之新穎技術，確立該用途而完成本發明。且，在本案說明書所謂的外用為表示將本發明之暗黃減低用皮膚外用劑與對象者之所望皮膚部位接觸，將含於該暗黃減低用皮膚外用劑中的有效成分浸透於表皮、真皮及/或皮下組織的意思。且，所謂皮膚表示作為附屬器官具有汗腺、皮脂腺、爪、毛等包覆人類體表面的包膜之意思。作為將本發明之暗黃減低用皮膚外用劑與對象者之所望皮膚部位接觸的手段，可例示出塗佈、噴霧、載置、貼合、接著、密著、壓著、浸漬等。

即，本發明係以提供橙皮素及/或糖基橙皮素作為有效成分，使用於減低已經生成的肌膚暗黃之皮膚外用劑(以下若無特別說明僅稱為「本發明之暗黃減低用皮膚外用劑」)而解決上述課題者。

所謂本案說明書所記載的橙皮素係如下述化學式1所示結構式表示的化合物，其為含於橘子屬果實之 成分，已知其為在少量下即可發揮血流改善效果等生理功能之化合物。

又，在本案說明書所謂糖基橙皮素表示於橙皮素上鍵結糖類的所有化合物而言，換言之，表示具有橙皮素骨架之所有化合物而言，作為該具體例子，可舉出橙皮苷、具有構成橙皮苷之芸香的鼠李糖基經離脫的結構之7-O-β-糖基橙皮素、及於橙皮苷上鍵結糖類(例如D-葡萄糖、D-果糖、或D-半乳糖等糖類)以等莫耳以上經α-鍵而得之α-糖基橙皮苷等。

更詳細為，橙皮苷亦稱為維他命P，其為具有由鼠李糖與葡萄糖所成的芸香上與橙皮素鍵結的結構之下述化學式2所示結構式所示化合物，多含於柑橘類之果皮 等的成分。

又，7-O-β-糖基橙皮素為以下述化學式3所示結構式所表示的化合物，與橙皮苷相比，具有較高水溶性之特徴。7-O-β-糖基橙皮素，例如專利文獻5所示，於含有α-糖基橙皮苷與橙皮苷之溶液中可使α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)等起作用而製造。

化學式3：

且，α-糖基橙皮苷為於橙皮苷上糖類(例如D-葡萄糖、D-果糖或D-半乳糖等糖類)以等莫耳以上經α-鍵所成的化合物。作為α-糖基橙皮苷之代表例，於橙皮苷之芸香結構中之葡萄糖上葡萄糖以1分子α-鍵結之下述化學式4所示結構式所表示的α-糖基橙皮苷(別名：酵素處理橙皮苷、糖轉移橙皮苷、水溶性橙皮苷、或糖轉移維他命P)可舉出。

化學式4：

以上所示橙皮素及糖基橙皮素在過去作為各種飲食品等原料而廣泛被使用，其為安全上泛用性高的化合物。糖基橙皮素之內，α-糖基橙皮苷為與橙皮苷或7-O-β-糖基橙皮素相比其水溶性高，處理性優良，對於活體內，與橙皮苷或7-O-β-糖基橙皮素同樣地，受到活體內酵素作用而水解至橙皮素，發揮橙皮素原先的生理活性。

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑為在過去認為不可能之減低已經生成的肌膚暗黃之用劑，其為作為有效成分含有橙皮素及/或糖基橙皮素之膚外用劑。又，所 謂本發明之暗黃減低用皮膚外用劑，不僅可減低肌膚暗黃，亦可藉由作為有效成分所含有的橙皮素及/或糖基橙皮素，發揮肌膚之質地改善作用、肌膚乾燥、紅斑、刺激感及搔癢感等改善肌膚質地等優良效果。特別為本發明之暗黃減低用皮膚外用劑不僅對於肌膚暗黃有效，對於對肌膚質地的粗糙或肌膚質的降低在意的對象者而言，不僅對於在意肌膚暗黃的皮膚部位，對於在意肌膚質地粗糙或肌膚質降低的皮膚部位上作為外用時，可具有比預期作用效果更明顯發揮的優良特徴。且，本發明之暗黃減低用皮膚外用劑對於人類可日常持續、安全且容易下使用，另外可無不舒服感下使用，同時該皮膚外用劑之有效成分為提供安全且工業上簡單且安定之成分，故本發明之暗黃減低用皮膚外用劑具有可在工業上簡單且安定下提供的優點。

[圖1]表示在具有抗氧化作用之物質共存下的羰基化牛血清白蛋白(BSA)之殘存比例圖。

[圖2]表示糖基橙皮素含有組成物單用或併用糖基橙皮素含有組成物與糖基柚皮素含有組成物時的羰基化BSA之殘存比例圖。

[圖3]表示糖基橙皮素含有組成物單用或併用糖基橙皮素含有組成物與L-抗壞血酸2-葡萄糖苷時的羰基化BSA之殘存比例圖。

[圖4]表示於使用試驗液(本發明)或對照液(對照)所進行的羰基化蛋白質減低作用試驗中，對於各被驗者求得「試驗終了後之角層蛋白質」或「試驗終了後之對照角層蛋白質」中的羰基化蛋白質之量與「試驗開始時之角層蛋白質」中的羰基化蛋白質之量的差，將所得之數據經統計學處理〔t檢定(片側)〕(p<0.05)之結果圖。

[圖5]表示於使用試驗液(本發明)或對照液(對照)所進行的羰基化蛋白質減低作用試驗，對於各被驗者，求得「試驗終了後之角層蛋白質」或「試驗終了後之對照的角層蛋白質」中的羰基化蛋白質之量中，這些比〔(試驗終了後之角層蛋白質中的羰基化蛋白質之量)/(試驗開始時之角層蛋白質中的羰基化蛋白質之量)〕，將所得之數據經統計學處理〔t檢定(片側)〕(p<0.05)之結果圖。

[實施發明的形態]

以下對於本發明之實施形態做說明，但這些為實施本發明上的較佳態樣，僅為例示，本發明並未受到這些實施態樣的任意限定。

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中作為有效成分含有的橙皮素及/或糖基橙皮素為，人類在日常可繼續、安全、容易且不會有不舒服的外用，僅可達到本發明之所期的作用效果即可，該來源、製法、純度等可無特別 限制下使用。且，本發明並非有關橙皮素或糖基橙皮素自體的製造方法之發明，故這些製造方法之詳細內容並未記載於本案說明書中，但其概要內容如下所示。

作為於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中之有效成分的橙皮素，不僅可使用市售品，亦可適用藉由公知製造方法由橘子屬的水果調製者。又，於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中的有效成分之糖基橙皮素如上述，表示於橙皮素上鍵結糖類的所有化合物之意思。具體為，藉由活體內酵素之作用生成橙皮素的橙皮苷、7-O-β-糖基橙皮素及α-糖基橙皮苷，這些為人類可安全且容易，並對皮膚無刺激或不舒服的外用，在工業上可簡單且安定地提供者，僅為可達到本發明之所期待的作用效果者即可，不僅可使用市售品，亦可使用藉由過去公知製造方法所得之任一糖基橙皮素。

其次，作為於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中之其他有效成分的糖基橙皮素，可例示出橙皮苷、α-糖基橙皮苷、7-O-β-糖基橙皮素等化合物。前述橙皮苷為藉由含有橙皮苷之植物的柑橘類果實、果皮、種子、未熟果等作為原料，使用水或醇等溶劑進行萃取後，可得到工業上所望量。又，前述α-糖基橙皮苷，例如特開平11-346792號公報等揭示，於含有橙皮苷與α-糖基糖化合物之溶液中與糖轉移酵素作用，生成α-糖基橙皮苷，藉由採用此，可簡單地得到工業上所望量。且，前述7-O-β-糖基橙皮素，例如專利文獻5等所揭示，於含有使糖轉移酵素 作用所得之α-糖基橙皮苷與橙皮苷的酵素反應液中，使α-L-鼠李糖苷酶作用，生成7-O-β-糖基橙皮素，藉由採取此可簡單地製造出工業上所望量。

作為在本發明所使用的橙皮素及糖基橙皮素，如上述所記載，不僅可使用市售品，亦可使用藉由過去公知製造方法所得之任一者，但雜質較少的高純度品為較佳。以下對於該理由，將糖基橙皮素作為例子說明。

即，作為本發明者等的新見解，過去公知之糖基橙皮素係與經由結晶化步驟所得之試藥級的糖基橙皮素相異，與糖基橙皮素同時，含有來自該製造原料的共雜物、未反應原料，以及不管量的多寡的在該製造過程中產生的副產物之生理學上可被許可的離子性化合物，換言之，其為糖基橙皮素含有組成物，該組成物中含有成為雜味、著色、臭氣等原因物質的成分。且，對於本案說明書，以下若無特別說明，將糖基橙皮素作為主體，將含有來自該製造原料的共雜物、未反應原料或該製造過程中產生的副產物之生理學上可被許可的離子性化合物之糖基橙皮素含有成物僅以糖基橙皮素稱呼，在本發明所使用的糖基橙皮素當然亦包含經過結晶化步驟所得之高純度糖基橙皮素。

又，本發明者等以解除在過去公知糖基橙皮素的缺點之雜味、著色等目的下，欲減低含於過去糖基橙皮苷的共雜物含量，藉由改良過去方法的一部分，確立雜味與著色經減低的糖基橙皮素(以下若無特別說明，稱為 「改良糖基橙皮素」)與其製造方法，揭示於特願2014-41066號說明書及國際專利申請號碼第PCT/JP2015/056230號手冊。改良糖基橙皮素可為人類日常可繼續、安全且容易，並無不舒服的外用之同時，具有於工業上可簡單且安定地提供之優點。因此，改良糖基橙皮素為實施本發明時最佳的糖基橙皮素。

以下對於改良糖基橙皮素之製造方法與其物性做說明。

改良糖基橙皮素可藉由含有(甲)調製含有橙皮苷及澱粉部分分解物之水溶液的步驟、(乙)於所得之水溶液中使糖轉移酵素作用，生成含有α-糖基橙皮苷的糖基橙皮素含有組成物之步驟、及(丙)採取生成之糖基橙皮素含有組成物的步驟之製造方法，前述(甲)至(丙)的1或2以上之步驟在還原劑存在下實施，或可於前述(甲)至(丙)之1或2以上的步驟之前的起始原料及/或後結果物中添加還原劑後製造。以下逐次對於藉由使用前述還原劑的製造方法所得之改良糖基橙皮素(以下，將經由前述還原劑處理步驟所調製的糖基橙皮素有時稱為「還原劑處理品」)之製造原料、酵素反應(糖轉移反應等)、還原劑處理、及純化方法做說明。

且，詳細內容如後述，所謂前述還原劑處理品表示實質上不含有糠醛的糖基橙皮素之意思，對於本案說明書所謂實質上不含有糠醛的意思表示與過去品相比較，糠醛含量為顯著低水準之糖基橙皮素。具體為，使用 後述實驗4之「(1)糠醛之含量」所示氣體層析法質量分析裝置(GC/MS)的分析手法(以下簡稱為『GC/MS分析法』)進行測定時，通常未達200ppb(且1ppb為10億分之1)，以未達100ppb為佳，較佳為未達50ppb，更佳為未達30ppb，更較佳為未達20ppb，特佳為未達15ppb，更特佳為未達10ppb。且，在本發明所使用的糖基橙皮素之內，糠醛含量減低至GC/MS分析法的檢測極限以下者為，過去品相比較為顯著減低，同時著色亦顯著減低的極高品質之糖基橙皮素。但，作為在本發明所使用的糖基橙皮素並非需要最高純度之糖基橙皮素，故糠醛含量減低至檢測極限以下的水準之必要性、或不含有糠醛之必要性並非一定。因此，在本發明所使用的糖基橙皮素僅為實質上不含有糠醛即可，僅可達到本發明之所期待的目的即可，與過去品相比較下顯著地少量，或者亦可為含有檢測極限以下之糠醛。

(製造原料)

作為還原劑處理品之製造原料的橙皮苷，可使用在過去糖基橙皮素的製造上所使用的所有橙皮苷，不僅可使用高純度橙皮苷，亦可使用來自較低純度的含有橙皮苷之植物的萃取物、搾汁液或該部分純化物等1種或2種以上之組合。

所謂前述含有橙皮苷之植物，具體，例如可例示出橘子類、柳橙類、香酸柑橘類、雜柑橘類、Tangor 類、Tanzero類、文旦類、金桔類等橘子科橘子屬的柑橘類，作為橙皮苷含有部位，可例示出這些柑橘類之果實、果皮、種子、未熟果等。

作為製造原料之澱粉部分分解物，使後述糖轉移酵素作用時，於橙皮苷進行糖轉移，生成作為糖基橙皮素之α-糖基橙皮苷者即可，例如適宜地選自直鏈澱粉、糊精、環糊精、麥芽寡聚醣等澱粉部分分解物，進一步可適宜地選自液化澱粉、糊化澱粉等1種或2種以上澱粉部分分解物。

又，對於後述酵素反應中所使用的澱粉部分分解物之使用量，對於原料橙皮苷之質量而言，通常使用選自約0.1至約150倍，較佳為約1至約100倍，更佳為約2至約50倍之範圍的量。對於酵素反應，將來自澱粉部分分解物的糖對橙皮苷進行糖轉移，有效率地生成α-糖基橙皮苷，而且欲於酵素反應系中儘可能地不要殘留未反應橙皮苷，使用對於橙皮苷為過剩量的澱粉部分分解物為佳。該理由為對於後述純化步驟，澱粉部分分解物及來自此的糖類等可與α-糖基橙皮苷比較容易分離，對於此，橙皮苷與α-糖基橙皮苷作為相同操作，因與α-糖基橙皮苷的分離困難，故水溶性極低，若未反應橙皮苷的殘存量多時，作為全體會產生所得之糖基橙皮素的水溶性變低之不佳情況。

(酵素反應)

在本案說明書中所謂的酵素反應表示，作為前述製造原料的橙皮苷與澱粉部分分解物與糖轉移酵素作用，生成α-糖基橙皮苷之酵素反應。

作為使用於前述酵素反應的糖轉移酵素，可例示出α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、環麥芽糊精‧葡聚醣轉移酶(EC 2.4.1.19，以下稱為「CGTase」)、α-澱粉酶(EC 3.2.1.1)等。作為前述α-葡萄糖苷酶，可例示豬的肝臟、蕎麥的種子等來自動植物組織的酵素或毛黴菌(Mucor)屬、青黴菌(Penicillium)屬、黑曲霉(Aspergillus niger)等之曲黴菌(Aspergillus)屬等所屬的來自黴菌培養物者，或酵母菌(Saccharomyces)屬等所屬的將酵母等來自微生物以營養培養基進行培養後所的之培養物者，作為CGTase，例如可例示來自桿菌(Bacillus)屬、土芽孢桿菌(Geobacillus)屬、克雷伯菌(Klebsiella)屬、類芽孢桿菌(Paenibacillus)屬、熱球菌(Thermococcus)屬、熱球菌腸桿菌(Thermoanaerobacter)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、熱球菌(Pyrococcus)屬、短芽孢桿菌(Brevibacillus)屬、及酵母菌(Saccharomyces)屬者。作為前述α-澱粉酶，可使用來自土芽孢桿菌屬等所屬的細菌或黑曲霉(Aspergillus niger)等曲黴菌(Aspergillus)屬所屬的黴菌培養物之1種或2種以上者的適宜組合。這些糖轉移酵素僅可達到本發明之目的即可，可採用天然或基因重組型的任一種，若為市售品時，亦可使用這些。 又，前述糖轉移酵素中任一種皆非必須使用經純化者，通常可為粗酵素，僅可達到本發明之目的者即可，可使用任一種。

又，使用前述天然或基因重組型的糖轉移酵素時，藉由採用適用於這些糖轉移酵素之澱粉部分分解物，可提高α-糖基橙皮苷之生成率。

使用前述α-葡萄糖苷酶時，麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖等麥芽寡聚醣或葡萄糖．當量(DE)約10至約70的澱粉部分分解物為使用CGTase時，自α-、β-、或γ-環糊精或DE1以下的澱粉糊化物可使用DE約60的澱粉部分分解物，且使用α-澱粉酶時，自DE1以下的澱粉糊化物可使用DE約30之糊精等澱粉部分分解物為佳。

作為酵素反應時的橙皮苷含有溶液，儘可能含有高濃度的橙皮苷者為佳，例如使用將橙皮苷以懸浮狀態含有之懸浮液、或於水等溶劑中在室溫以上之高溫下溶解、或者使用鹼劑，在超過pH7.0之鹼側pH下進行溶解的含有高濃度橙皮苷之溶液為佳。作為前述鹼劑，可適宜地使用約0.1至約1.0當量之氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液、碳酸鈉水溶液、氫氧化鈣水溶液、氨水等1種或2種以上的強鹼性水溶液。

將橙皮苷使用鹼劑以溶液狀下使用時的橙皮苷濃度，通常約0.005w/v%以上，以約0.05至約10w/v%為佳，較佳為約0.5至約10w/v%，佳為約1至約 10w/v%。

另一方面，將橙皮苷在不使用鹼劑的懸浮狀下使用時，將橙皮苷以水等溶劑懸浮後作為懸浮狀橙皮苷，此時的橙皮苷濃度通常約0.1至約2w/v%，較佳為約0.2至約2w/v%，更佳為約0.3至約2w/v%。

於橙皮苷與澱粉部分分解物使糖轉移酵素作用時的溫度與時間，雖取決於在酵素反應所使用的橙皮苷與澱粉部分分解物之濃度及糖轉移酵素的種類、最適溫度、做適pH或作用量等而不同，通常約50至約100℃，較佳為約60至約90℃，更佳為約70至約90℃及約5至約100小時，較佳為約10至約80小時，更佳為約20至約70小時的範圍。

又，將糖轉移酵素與含有高濃度橙皮苷之鹼性溶液起作用時的pH與溫度取決於糖轉移酵素之種類、最適pH、最適溫度或作用量及橙皮苷的濃度等而變化，但僅可使糖轉移酵素起作用為高pH、高溫，具體為pH約7.5至約10，以pH約8至約10及約40至約80℃為佳，較佳為約50至約80℃之範圍。且，鹼性溶液中之橙皮苷因容易引起分解，故欲防止此，儘可能遮光下且厭氣下保存橙皮苷為佳。

且，將糖轉移酵素在懸浮狀橙皮苷中起作用時的pH雖依據糖轉移酵素之種類、最適溫度、最適pH或作用量、及懸浮狀橙皮苷之濃度等而不同，但通常pH約4至約7，較佳為pH約4.5至約6.5之範圍。

又，進一步若必要提高酵素反應前之橙皮苷的溶解度，欲使對橙皮苷之糖轉移反應可容易進行，將橙皮苷高含有溶液，特別為於橙皮苷高含有水溶液中，亦可適量共存水與相溶性高之有機溶劑，例如甲醇、乙醇、n-丙醇、異丙醇、n-丁醇、丙酮醇、丙酮等之低級醇、低級酮等1種或2種以上。

酵素量與反應時間有著密切關係，通常由經濟性觀點來看，約5至約150小時，較佳為約10至約100小時，更佳為約20至約80小時，將使酵素反應終了的酵素量可配合所使用的糖轉移酵素種類而做適宜設定。又，使用經固定化的糖轉移酵素，以分批式重複反應或以連續式進行反應亦隨意。

於前述糖轉移酵素反應後所得之含有α-糖基橙皮苷與橙皮苷之酵素反應液，視必要可直接或藉由多孔性合成吸著樹脂進行純化後，藉由葡萄澱粉酶(EC 3.2.1.3)或β-澱粉酶(EC 3.2.1.2)等澱粉酶進行部分水解後，可減低α-糖基橙皮苷之α-D-糖基的數目。例如，使葡萄澱粉酶作用時，水解α-麥芽糖基橙皮苷以上之高分子，生成葡萄糖之同時，生成α-糖基橙皮苷，可使其累積。又，使β-澱粉酶作用時，將α-麥芽三糖基橙皮苷以上的高分子進行水解，生成麥芽糖之同時，生成含有α-糖基橙皮苷與α-麥芽糖基橙皮苷之混合物，使其累積。

另一方面，於含有於糖轉移酵素反應後所得之α-糖基橙皮苷與橙皮苷之酵素反應液中，同時將葡萄澱 粉酶與α-L-鼠李糖苷酶或其中任一種先進行的依序下作用後，於α-糖基橙皮苷之芸香結構中的葡萄糖上，脫離等莫耳以上α-鍵結的葡萄糖，將α-糖基橙皮苷改為α-糖基橙皮苷，提高α-糖基橙皮苷含量之同時，將水溶性低的橙皮苷改為水溶性高的7-O-β-單糖基橙皮素後，作為全體可成為水溶性高的糖基橙皮素。

與糖轉移酵素同樣地，對於葡萄澱粉酶與α-L-鼠李糖苷酶亦同樣地，這些酵素量與酵素反應時間有著密切關係，通常由經濟性觀點來看，約5至約150小時，較佳為約10至約100小時，更佳為約20至約80小時下將使酵素反應終了的酵素量，配合酵素種類做適宜設定即可。又，使用經固定化的α-L-鼠李糖苷酶以分批式重複反應，或以連續式無中斷下進行反應亦可適宜地實施。

(還原劑處理)

在本案說明書中所謂的還原劑處理表示，使用所定還原劑，將糖基橙皮素之雜味與著色(以下有時簡稱為「雜味‧著色」)，以及臭氣減低至顯著或明顯減低之意思，將後述還原劑，使用(甲)調製含有橙皮苷及澱粉部分分解物之水溶液的步驟、(乙)於所得之水溶液中使糖轉移酵素作用生成含有α-糖基橙皮苷的糖基橙皮素含有組成物之步驟、及(丙)採取所生成的糖基橙皮素含有組成物之步驟的1或2以上步驟，或前述(甲)至(丙)的1或2以上之步驟前的起始原料及/或前述步驟後之結果物中添 加該所定量的意思。

作為使用在改良糖基橙皮素的製造方法之還原劑，僅可達到本發明之所期待的目的者即可，並無特別限制，可使用於該技術領域中廣泛被使用的無機系及有機系還原劑。然而，含還原劑處理品，在本發明所使用的糖基橙皮素或高純度糖基橙皮素主要以適用於人類作為前提者，故對於該製造，使用安全性高、安定性、處理性優良的還原劑為佳。

作為適用於本製造方法的還原劑之具體例子，例如可舉出羥基胺類、二酸化氯、氫、氫化合物(硫化氫、氫化硼鈉、氫化鋁鋰、氫化鋁鉀等)、硫化合物(二氧化硫、二氧化硫脲、硫代硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫酸鐵、過硫酸鈉、過硫酸鉀、過硫酸銨、亞硫酸鈣等)、亞硝酸鹽、氯化錫、氯化鐵、碘化鉀、過氧化氫、稀釋過氧化苯甲醯基、過氧化氫、亞氯酸鈉等亞氯酸鹽等無機系還原劑；及酚類、胺類、醌類、聚胺類、甲酸與其鹽類、草酸與其鹽類、檸檬酸與其鹽類、二氧化硫脲、肼系化合物、還原性糖質、過氧化苯甲醯基、過硫酸苯甲醯基、氫化二異丁基鋁、兒茶素、槲皮素、生育酚、没食子酸與其酯、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫蘇糖醇、還原型穀胱甘肽、及聚酚類等有機系還原劑。前述無機系及有機系的還原劑可使用此等1種或適宜地組合2種以上後使用。

前述無機系及有機系還原劑之中，前者的還原劑為可提供更顯著地減低未經還原劑處理所調製的糖基 橙皮素所具有的雜味，著色或異臭亦更顯著地被減低的高品質糖基橙皮素。且，該理由雖無被確定，但可推論為以下。即，在本製造方法的目的下使用時，有機系還原劑與無機系還原劑相比較，雜味‧著色之減低作用為低或有機系還原劑因其為有機物，故恐怕本身成為雜味或著色之原因下，有機系還原劑的分解物或修飾物等在還原劑處理品之純化步驟中未完全被除去而殘存時，這些可能對於最終製品之糖基橙皮素的品質產生負面影響。

無機系還原劑之中，由SO₂ ^-離子、HSO₃ ^-離子、SO₃ ^2-離子、S₂O₄ ^2-離子、或S₂O₇ ^2-離子與金屬離子所成，所謂亞硫酸鹽(亦稱為硫酸鹽類)因具有優良的安全性、安定性及處理性的優點，故對於本製造方法，其為可更適用的還原劑。特別為無機系還原劑之亞硫酸鈉、亞硫酸鉀、亞硫酸氫鈉、次亞硫酸鈉、次亞硫酸鉀、焦亞硫酸鈉、焦亞硫酸鉀、偏亞硫酸鈉、偏亞硫酸鉀、偏重亞硫酸鈉及偏重亞硫酸鉀等亞硫酸鹽對於本發明為最適合使用者。

又，前述還原劑雖對於改良糖基橙皮素的製造步驟中之1步驟或該步驟前之起始原料及/或後之結果物為適用，但對於2以上的步驟、或此等步驟前的起始原料及/或後之結果物，適宜地小分出該適量使用時，較少量還原劑可有效率地達到本製造方法所期待的目的。

作為前述還原劑的添加量，在合計下在前述(甲)至(丙)的各步驟中，對於在前述(乙)酵素反應 後(使用糖轉移酵素以外的其他酵素時，表示這些所有酵素反應終了後的意思)所得之酵素反應液質量，通常為0.001質量%以上(以下若無特別說明，將「質量%」簡稱為「%」)，以0.01至3%為佳，較佳為0.01至1%，更佳使用選自相當於0.01至0.5%的範圍之量。且，藉由將還原劑在前述(丙)的步驟之前添加時，通常殘存之還原劑在純化步驟中可實質地除去，故作為最終製品所得之改良糖基橙皮素中實質無法檢測出來。在前述全步驟所添加的還原劑之量對於在酵素反應後所得之酵素反應液質量，通常合計為0.001%以上，以0.01%以上為佳，較佳為0.01至1%之範圍，可分為1次或複數次添加。添加時的溫度通常為在前述(甲)至(丙)的步驟中所採用的溫度，另外亦可提高該溫度。具體為室溫以上的溫度，以50℃以上為佳，較佳為70℃以上，更佳為80℃以上，特佳為90至120℃可例示。

(純化方法)

該所得之酵素反應溶液可直接作為適用於本發明的改良糖基橙皮素。但通常酵素反應溶液為，使用在該技術領域中為公知分離方法、過濾方法、多孔性合成樹脂等進行純化方法、濃縮方法、噴霧方法、乾燥方法等1種或2種以上的手段做適宜組合後形成液狀、固狀、粉末狀等還原劑處理品。

作為前述多孔性合成樹脂，具有多孔性且廣 吸著表面積，且表示非離子性的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、酚-甲醛樹脂、丙烯酸酯樹脂、甲基丙烯酸酯樹脂等合成樹脂，例如市售的Rohm & Haas公司製商品名：AmberliteXAD-1、AmberliteXAD-2、AmberliteXAD-4、AmberliteXAD-7、AmberliteXAD-8、AmberliteXAD-11、及AmberliteXAD-12等樹脂；三菱化學股份有限公司製之商品名：DiaionHP-10、DiaionHP-20、DiaionHP-30、DiaionHP-40、DiaionHP-50、DiaionHP-2MG、DiaionSP70、Sepah beadsSP207、Sepah beadsSP700、Sepah beadsSP800等樹脂；及IMACTI公司製之商品名：ImaktiSyn-42、ImaktiSyn-44、及ImaktiSyn-46等樹脂可例示。

藉由使用多孔性合成吸著劑之純化方法時，若將酵素反應液填充於多孔性合成吸著劑的管柱進行通液時，對於糖基橙皮素吸附於多孔性合成吸著劑，殘存的澱粉部分分解物或水溶性糖類等不會被吸附，會直接自管柱流出。此時，糖基橙皮素之橙皮苷、7-O-β-糖基橙皮素及α-糖基橙皮苷通常下，無法藉由多孔性合成吸著劑各別分離此等。但操作變的煩雜，使得收率降低，將填充多孔性合成吸著劑的管柱中選擇性地吸附的糖基橙皮素以稀鹼、水等溶劑進行洗淨後，比較少量的有機溶劑或有機溶劑與水之混合液，例如僅將甲醇水溶液、乙醇水溶液等通液時，α-糖基橙皮苷自管柱在最初溶離出，其次增加通液量，或藉由提高有機溶劑濃度而使未反應橙皮苷溶離。將 該所得之糖基橙皮素含有溶離液以蒸餾處理，將有機溶劑餾去後，濃縮至所望濃度，即可減低橙皮苷含量，得到雜味等經減低的糖基橙皮素。且，藉由前述有機溶劑的糖基橙皮素之溶離操作，同時亦可成為多孔性合成吸著劑之再生操作，故具有可重複使用多孔性合成吸著劑之優點。

又，酵素反應終了後，至將酵素反應液與多孔性合成吸著劑接觸之期間，例如將加溫反應液所產生的不溶物經過濾除去，或以矽酸鋁酸鎂、鋁酸鎂等處理後吸附除去反應液中之蛋白性物質等，組合強酸性離子交換樹脂(H型)、中鹼性或弱鹼性離子交換樹脂(OH型)等處理之脫鹽等純化方法，可製造出提高糖基橙皮素之純度，液狀還原劑處理品。

且，亦可隨意將前述液狀糖基橙皮素藉由公知乾燥方法進行乾燥後成為粉末化，成為適用於本發明的粉末狀糖基橙皮素。

未經過前述還原劑處理步驟所調製的糖基橙皮素(以下有時稱為「還原劑非處理品」)的特有雜味可顯著地減低，且可製造出著色或臭氣可有效果地減低之還原劑處理品。又，由本發明者等確認可得知，於還原劑非處理品，特有雜味‧著色或臭氣若僅使用前述純化方法並未能實質地變化。即，對於還原劑非處理品之製造步驟中廣泛被使用的例如使用前述多孔性合成吸著劑的純化方法不僅可除去澱粉部分分解物或水溶性糖類，亦可有同時除去水溶性鹽類等夾雜物的優點，但即使使用該純化方法， 亦難以顯著或明顯地減低還原劑非處理品中特有雜味‧著色或臭氣。作為該預測的理由，含於糖基橙皮素中之雜味等原因物質奇對多孔性合成吸著劑的吸脫著舉動與糖基橙皮素相同，故無法與糖基橙皮素分離。

又，適用於本發明的改良糖基橙皮素，特別為還原劑處理品與還原劑非處理品相比較，雜味可顯著地減低，電傳導度亦低，有關電傳導度的離子性化合物含量亦被減低。且，作為離子性化合物，例如考慮為作為原材料的橙皮苷上原先所含有narirutin、Geosmin、Neoponshirin或酵素反應生成物之glucosyl narirutin、glucosyl neoponshirin等化合物或其分解物或與該分解物具有密切關連性的化合物，進一步來自改良糖基橙皮素的製造原料或在該製造步驟產生副產物，對於本發明，作為指標以糠醛為主，糠基醇、及羥基甲基糠醛等糠醛類或其鹽類等其他在溶液狀態、鈣、鉀、鎂、及鈉等金屬陽離子游離的化合物等可舉出。且，前述narirutin、Geosmin、Neoponshirin、glucosyl narirutin、glucosyl neoponshirin等成分通常以微量方式含於使用於本發明的還原劑處理品中。且，將前述離子性化合物在本申請說明書中稱為生理學被許可的離子性化合物。

對於上述的還原劑處理品之製造方法，使用還原劑時可得到減低雜味與著色，特別為顯著減低雜味之改良糖基橙皮素的機制雖無確定，但可推測如下述。

(1)製造還原劑處理品時，來自該製造原料 而存在雜味之原因物質，對這些使還原劑起作用，使該原因物質經遮蔽、分解或修飾後可得到雜味顯著被減低之改良糖基橙皮素。

(2)對於還原劑處理品之製造步驟，還原劑可減低或抑制雜味的原因物質之生成，或將所生成的雜味之原因物質經遮蔽、分解或修飾後得到雜味顯著被減低的改良糖基橙皮素。

(3)前述(1)及(2)所示雜味的原因物質藉由還原劑經修飾後，藉由多孔性合成吸著劑等可以純化步驟與糖基橙皮素容易地分離，該結果可得到雜味顯著被減低的還原劑處理品。

且作為適用於本發明的改良糖基橙皮素，可例示出將糖基橙皮素含有物與還原劑接觸後，可顯著減低糖基橙皮素含有物的雜味或臭氣者。該糖基橙皮素含有物亦包含於本案說明書所記載的還原劑處理品中。又，若將糖基橙皮素含有物與還原劑進行接觸後，可顯著減低糖基橙皮素含有物之雜味的同時，亦可顯著有效地減低著色或臭氣。糖基橙皮素含有物與還原劑之接觸與其以固狀下接觸，使用水等適宜溶劑，可在溶液狀態或懸浮狀態下進行。又，作為接觸前述還原劑的糖基橙皮素含有物，可例示出含有選自橙皮苷、α-糖基橙皮苷及7-O-β-糖基橙皮素的1種或2種以上之糖基橙皮素。作為前述糖基橙皮素含有物，乾燥固體物每單位下，含有糖基橙皮素通常50%以上，未達100%，較佳為含有60%以上，未達100%，更佳 為含有70%以上未達100%，特佳為含有80%以上，未達100%，最佳為含有90%以上，未達100%之糖基橙皮素可例示。

又，將前述糖基橙皮素含有物與還原劑進行接觸時，所使用的還原劑可使用與製造還原劑處理品時的相同者。又，還原劑之使用量為，糖基橙皮素的乾燥固體物每單位，通常0.00001%以上，以0.0001至0.5%為佳，較佳為0.001至0.4%，更佳為0.001至0.3%之範圍下添加，將此均勻地混合後，藉由將糖基橙皮素與還原劑進行接觸，即使為無經前述還原劑處理所調製之還原劑非處理品，亦可顯著或明確地減低該特有雜味等。

且，將前述液狀還原劑處理品藉由公知濃縮方法進行濃縮後使其成為糖漿狀或糊狀還原劑處理品，同時進一步藉由公知乾燥方法，使其乾燥後成為固狀、顆粒狀、或粉末狀之還原劑處理品亦為隨意。

如上述，藉由將經前述還原劑處理的酵素反應液提供於前述純化方法中，可得到顯著或明確地減低還原劑非處理品之缺點的特有雜味等之還原劑處理品。

且，藉由前述製造方法所得之還原劑處理品，實質上不含有糠醛之同時，亦實質上不含有酚醚之一種的4-乙烯基苯甲醚(別名：4-甲氧基苯乙烯)(以下簡稱為「4-VA」)者，在使用於本發明的改良糖基橙皮素之中亦可更顯著地除去雜味以外，著色或臭氣亦更顯著地被減低，故最適用於本發明中。前述4-VA被推測為因改 良糖基橙皮素之製造原料上所引起的生成之成分，對於所得之糖基橙皮素中的含量通常為乾燥固體物每單位下未達30ppb，4-VA含量對於糠醛含量未達200ppb者而言，通常與糠醛含量為平行(parallel)關係。且，所謂實質上不含有4-VA的意思為，與糠醛之情況相同，與還原劑處理品以外的還原劑非處理品等其他糖基橙皮素含有組成物相比較，表示4-VA含量為顯著低水準的意思。更具體為於還原劑處理品中之4-VA含量可由使用後述實驗4之「(2)4-VA之含量」所示GC/MS分析裝置之分析手法進行測定，通常為乾燥固體物每單位下未達30ppb，以未達15ppb為佳，以未達10ppb為較佳，以未達5ppb為更佳，更較佳為未達3ppb，特較佳為未達2ppb。

又，還原劑處理品與還原劑非處理品相比，其為具有著色(以下有時稱為「著色度」)亦顯著減低的優良特徴。糖基橙皮素之著色度可藉由後述實驗4的「(3)色調與著色度」所示方法進行測定，若要敘述其概要則如下述。即，將糖基橙皮素在含有所定濃度之水溶液以密閉容器中進行加熱處理後，將處理液的色調以肉眼觀察之同時，藉由分光光度計，測定於波長420nm中之吸光度(OD_420nm)及於波長720nm中之吸光度(OD_720nm)，求得於兩波長中之吸光度差(OD_420nm-OD_720nm)，將該測定值作為著色度。作為在本發明所使用的糖基橙皮素之較佳態樣，前述吸光度之差未達0.24，以0.20以下為佳，較佳為0.17以下，更佳為超過0且 0.15以下者可例示。且，對於本測定法，加熱糖基橙皮素之水溶液為，將還原劑非處理品藉由加熱，會有著色度顯著增大的缺點，故糖基橙皮素經加熱使其著色為使用於評估為目的所設定者。

還原劑處理品為含有糖基橙皮素與含有生理學上被許可的離子性化合物之糖基橙皮素含有組成物，將此作為1w/v%水溶液，在密閉容器中以100℃進行30分鐘加熱後，至20℃時的電傳導度未達10μS/cm，以未達8μS/cm為佳，較佳為未達6μS/cm，更佳為超過0μS/cm而未達4.5μS/cm之糖基橙皮素含有組成物。

又，藉由前述製造方法所得之還原劑處理品為將選自橙皮苷、α-糖基橙皮苷及7-O-β-糖基橙皮素的1種或2種以上糖基橙皮素作為主體之組成物，較佳為該組成物之乾燥固體物每單位的糖基橙皮素含量在合計下通常90%以上未達100%，以93%以上未達100%為佳，較佳為95%以上未達100%，更佳為97%以上未達100%，98%以上未達100%。

在本案說明書所記載的α-糖基橙皮苷含量為，將α-糖基橙皮苷含有組成物作為試料，將此藉由純化水稀釋或溶解至0.1%(w/v)，藉由0.45μm膜過濾器進行過濾後，提供於藉由下述條件的高速液體層析法(HPLC)分析，將試藥橙皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)作為標準物質使用，於UV280nm中之層析中出現的吸收峰面積與橙皮苷、α-糖基橙皮苷(α-糖基橙皮 苷等)等各成分之分子量為準下計算，對於無水物質量換算之組成的各成分含量。藉由該HPLC分析之糖基橙皮素的定量概要如下述(1)至(4)所示。

<HPLC分析條件>

HPLC裝置：『LC-20AD』(島津製作股份有限公司所製)

脫氣機：『DGU-20A3』(島津製作股份有限公司所製)

管柱：『CAPCELL PAK C18 UG 120』(資生堂股份有限公司製)

試樣注入量：10μl

溶離液：水/乙腈/乙酸(80/20/0.01(容積比))

流速：0.7ml/分

溫度：40℃

檢出：UV檢測器『SPD-20A』(島津製作股份有限公司所製)

測定波長：280nm

數據處理裝置：『Chromatographic packC-R7A』(島津製作股份有限公司所製)

(1)橙皮苷含量：以HPLC進行分析，依據該吸收峰面積與所定濃度的標準物質之試藥橙皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)的吸收峰面積之比而算出。

(2)α-糖基橙皮苷含量：以HPLC進行分析，依據該吸收峰面積與所定濃度的標準物質之試藥橙皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)的吸收峰面積之比、及α-糖基橙皮苷與橙皮苷之分子量比而算出。

(3)7-O-β-糖基橙皮素含量：以HPLC進行分析，依據該吸收峰面積與所定濃度之標準物質的試藥橙皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)之吸收峰面積的比、及7-O-β-糖基橙皮素與橙皮苷之分子量比而算出。

(4)其他糖基橙皮素含量：以HPLC進行分析，依據該吸收峰面積與所定濃度之標準物質的試藥橙皮苷(和光純藥工業股份有限公司販賣)之吸收峰面積的比、及其他糖基橙皮素與橙皮苷之分子量比而算出。

又，藉由前述製造方法所得的還原劑處理品之內，α-糖基橙皮苷為α-糖基橙皮苷之糖基橙皮素可顯著發揮本發明之所期待的作用效果，即，對於已經生成的肌膚暗黃有著更顯著改善效果故較佳。且，對於前述糖基橙皮素中之α-糖基橙皮苷的較佳含量通常為該組成物之固體物每單位下60至90%，以70至90%為佳，較佳為75至90%，這些隨著α-糖基橙皮苷之含量的下限增加，可更顯著地達到上述作用效果故較佳。

且，藉由前述製造方法所得的還原劑處理品之內，作為1w/v%水溶液，在密閉容器中以100℃進行30分鐘加熱後，調整至室溫，放入寬1cm的容器，藉由分光光度計測定在波長420nm(OD_420nm)及波長720nm (OD_720nm)中之吸光度時的兩波長之吸光度差(OD_420nm-OD_720nm)未達0.24，以0.20以下為佳，較佳為0.17以下，更佳為0以上0.15以下者可發揮本發明中所期待的作用效果，即可更顯著地達到已經生成的肌膚暗黃減低作用故較佳。又，與藉由未經過所定還原劑處理步驟的製造方法所得之糖基橙皮素相比較，具有顯著或明確減低雜味‧著色及臭氣之優點。

且，藉由前述製造方法所得的還原劑處理品之內，以高頻率誘導結合電漿發光分光分析法進行測定時的還原劑處理品之固體物每單位下之鈣、鉀、鎂、及鈉含量為下述數值範圍之糖基橙皮素含有組成物，即鈣、鉀、鎂、及鈉含量各為1ppm以下、0.1ppm以下、0.2ppm以下、及0.4ppm以下；較佳的鈣、鉀、鎂、及鈉含量各為0.6ppm以下、0.06ppm以下、0.1ppm以下、及0.3ppm以下；更佳的鈣、鉀、鎂、及鈉含量各為0ppm以上0.5ppm以下、0ppm以上0.05ppm以下、0ppm以上0.08ppm以下、及0ppm以上0.2ppm以下者，可達到本發明所期待的作用效果，即可達到更明確改善已經生成的肌膚暗黃之效果故較佳。又，與藉由過去製造方法所得之糖基橙皮素含有組成物相比較，具有顯著或明確減低雜味‧著色及臭氣的優點。

還原劑處理品的雜味以及著色或臭氣皆已顯著地被減低，且因熱安定性亦優良，故例如即使將此在80至100℃之高溫，加熱30分鐘以上，又即使含有還原 劑處理品之步驟或將此含有之本發明的暗黃減低用皮膚外用劑在室溫或比室溫稍高的溫度下保持數十分鐘至數個月的保存，因還原劑處理品所引起的雜味‧著色，甚至所引起的臭氣與製造後相比較並無變化而保持，或可有效地抑制這些之增大。且還原劑處理品亦具有優良耐酸性、耐熱性等優點。

如上述，在本發明所使用的糖基橙皮素即使為還原劑處理品或還原劑非處理品，通常含有具有橙皮素骨架之化合物的(1)α-糖基橙皮苷(α-糖基橙皮苷等)及(2)橙皮苷及7-O-β-糖基橙皮素之一方或雙方作為主成分含有的組成物，換言之為糖基橙皮素混合物，其他含有來自該製造原料者或在該製造步驟中產生的副產物之(3)narirutin、Geosmin、Neoponshirin、glucosyl narirutin等類黃酮、及(4)鹽類等微量成分者。該糖基橙皮素之中，作為適用於本發明的改良糖基橙皮素，前述(1)及(2)之成分合計比例(%)(=糖基橙皮素含量)通常為乾燥固體物每單位下，90%以上未達100%，以93%以上未達100%為佳，較佳為95%以上未達100%，更佳為97%以上未達100%，98%以上未達100%者可舉出。且改良糖基橙皮素可為含有橙皮素者。

在本發明所使用的改良糖基橙皮素之純度，換言之，乾燥固體物每單位下的糖基橙皮素含量的上限通常為工業上的較大量，可簡單且容易提供者為99%，較簡單提供者為98%，更簡單提供者為至97%以下的低含量者 亦可。且，該改良糖基橙皮素的乾燥固體物每單位下的糖基橙皮素含量為低時，與高含量者相比較，必然變得使用多量，其結果操作變得煩雜，處理性變差，故糖基橙皮素含量之下限通常為90%以上，以93%以上為佳，較佳為95%以上，更佳為97%以上，更較佳為98%以上。

作為在本發明所使用的改良糖基橙皮素之較佳實施態樣為，糖基橙皮素為α-糖基橙皮苷等α-糖基橙皮苷時，乾燥固體物每單位下的α-糖基橙皮苷含量為50%以上未達100%者可例示。

又，作為在本發明所使用的改良糖基橙皮素中之α-糖基橙皮苷含量的上限，更簡單提供本發明之暗黃減低用皮膚外用劑時，通常為工業上的較大量，可簡單且容易地提供者為90%以下，較簡單者為85%以下，更簡單者為80%以下之低含量者亦可。又，α-糖基橙皮苷含量之下限與上述糖基橙皮素含量同樣理由，通常為60%以上，65%以上或70%以上為佳。

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中，可添加除有效成分之橙皮素及/或糖基橙皮素以外的其他成分。作為前述其他成分，可例示柚皮素、糖基柚皮素(柚皮甙、糖基柚皮甙等)；L-抗壞血酸、L-抗壞血酸之鹽類、L-抗壞血酸衍生物(L-抗壞血酸2-葡萄糖苷等)等之L-抗壞血酸類；白藜蘆醇、槲皮素、綠原酸、花色素苷、薑黃素、山奈酚、類黃酮類等之聚酚；朝鮮薊葉萃取物、明日葉萃取物、草莓種子萃取物、銀杏葉萃取物、溫州蜜柑 萃取物、黑醋栗萃取物、奇異果種子萃取物、酸果蔓萃取物、西印度櫻桃萃取物、阿姆拉萃取物、野櫻萃取物等之植物萃取物；蝦青素、β-胡蘿蔔素等之類胡蘿蔔素；具有抑制糖化反應自體作用(以下稱為「糖化反應抑制作用」)之植物萃取物或化合物；糖質；有機酸；及胺基酸。特別為本發明之暗黃減低用皮膚外用劑的有效成分之橙皮素及/或糖基橙皮素為併用柚皮素、糖基柚皮素(柚皮甙、糖基柚皮甙等)、L-抗壞血酸類、甘露醇、N-乙醯葡萄糖胺、麥芽糖、麥芽三糖醇、棉子糖、麥芽四糖等之糖質、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、水楊酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸內酯、山梨酸、及安息香酸等之有機酸、及甘胺酸及谷胺酸鈉等胺基酸等1種或2種以上的成分時，與這些成分共同作用，有效達到暗黃減低作用，或本發明之暗黃減低用皮膚外用劑之有效成分的橙皮素及/或糖基橙皮素可達到的暗黃減低作用藉由前述其他成分可增強效果，這些其他成分可達到的暗黃減低作用可相生、相加或相乗地發揮暗黃減低作用。

作為前述具有糖化反應抑制作用之植物萃取物或化合物，可舉出小米草、透莖冷水麻、小葉胡頹子、龍芽草、荊瀝果實、木通、嫩葉甘藍椰子果實、睡茄、羅漢柏、兒茶、栓皮櫟、絞股藍、尖齒茴香、北美金縷梅、阿里斯芋、淫羊藿、虎杖、銀杏、日本鹿蹄草、草莓、山丹、海蘿、假枇杷、黃鐘木樹皮、紅葉槭、番山丹、茴香、美國金縷梅、矮冬青、鬱金、梅、狹葉櫟、短角淫羊 藿、營實、紫花金光菊、刺五加、金雀花、龍膽、接骨木、微脈冬青、扇椰子、黃檗、黃連、乳薊、燕麥、圓齒碎米薺、豬毛菜、玫瑰百合、黃鵪菜、鬼百合、牛至、橙、南瓜種子、卡圖巴樹皮、鹿子百合、瓜拿納、洛神葵、細辛、熱河蒲公英、桔梗、酸模、海州常山、菲島桐、浙江百合、胡桃、越橘、鴨舌草、佐賀褐藻、石榴、甘藷、撒爾沙根、野山楂、山椒草、紫蘇、翼豆、蚊子草屬、芍藥、掌葉大黃、白山菊、藜、山白蘭、大車前草、積雪草、蕎麥、麝香百合、碎米薺、葡萄藤(Davilla rugosa)、高貴百合、科迪亞柳葉(Cordia salicifolia)、丁香、狹葉番瀉樹、雷公根、雛菊、蒔蘿、吊鏈鉤、山菊、鐵砲百合、吊鏈鉤根、懸鉤子、桃仁、魚腥草、棘梨、杜仲茶葉、蕃茄、洋委陵菜、皺葉酸模、接骨木、旱金蓮科、野紺菊、薄荷、博多百合、胡枝子、大野芋、西番蓮、百香果、巴西人蔘根、菠蘿蜜、緋寒櫻、向日葵、姬蟒蛇草、姬百合、大花黃鵪菜、檳榔、款冬、鵲豆、總狀花升麻、昭和草、木天蓼、香楠、松、馬刀葉椎、馬黛茶、白花百合、小飛雉之朔果、省沽油、野木瓜、海蘊、柳、萱草、山刺番荔枝、山百合、蘿菜、嫁菜、荔枝種子、岷江百合、琉球矢竹、琉球薔薇草莓、蘋果未熟果、椴木花、赤其、萵苣、檸檬、檸檬香茅、百里香、檸檬葉馬鞭草、香蜂草、玫瑰果、淡紅洋薔薇、迷迭香、短刺野薔薇、月桂、紅景天、墨西哥蘇木、地榆、紫雲英、柿葉、甘草葉、黑大豆種皮、紫米種子、月桃葉、細葉百 合、西洋柳、杜仲葉之葉以等植物萃取物；小海蘿、海蘿、鹿角海蘿等海藻萃取物、生咖啡豆、甘藷燒酒粕、傘菌屬菌絲體等萃取物、及雌馬酚、異黃酮、1,4-蒽醌、1-胺基-2-羥基甲基蒽醌、4-胺基苯酚、1,3,5-三羥基苯、麴酸、3,4-二羥基苯基乙酸、咖啡酸、艾芬地爾(ifenprodil)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基二氫苯并哌喃-2-羧酸、6-羥基吲哚、7-羥基-4,6-二甲基酞內酯、α-硫辛酸、4-羥基查耳酮、真珠蛋白質水解物、胺基胍、赤藻辛鈉、麥角硫醇、白藜蘆醇、3,3’,5,5’-四羥基二苯乙烯等之羥基二苯乙烯類、合氧吲哚、肌肽、水楊酸、去甲豬毛菜鹼溴化氫酸鹽、芥籽酸、菸鹼酸生育酚酯、菸鹼酸醯胺、降二氫癒創木酸、花青素、甘露醇、水解酪蛋白、水解性單寧、兒茶酚、綠原酸、異綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡醯奎寧酸等之綠原酸類、白矢車菊素、野樺素、前花青二醇寡聚物、葡糖基芸香苷等。前述成分之中，作為在本發明中可較適用的具有糖化反應抑制作用之植物萃取物或化合物，可例示出睡茄、羅漢柏、兒茶、銀杏、矮冬青、黃檗、橙、南瓜種子、卡圖巴樹皮、菲島桐、葡糖基芸香苷、越橘、紫蘇、蕎麥葉、葡萄藤(Davilla rugosa)、魚腥草、姬蟒蛇草、昭和草、木天蓼、琉球矢竹、琉球薔薇草莓、蘋果未熟果、柿葉、甘草葉、月桃葉、杜仲葉的萃取物、及雌馬酚、異黃酮、艾芬地爾(ifenprodil)、真珠蛋白質水解物、兒茶酚、咖啡酸、及野樺素等。可添加於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑之前 述其他成分的配合量在該暗黃減低用皮膚外用劑之全質量每單位下，通常為0.001%以上，以0.01至50%為佳，較佳為0.01至30%，更佳為0.01至20%，更較佳為0.01至10%。

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑之劑形可為任意，例如可例示粉末狀、固狀、液狀、乳霜狀、及糊狀等形態者。具體例如可例示出軟膏、乳液、乳霜劑、錠劑、顆粒劑、粉劑、噴霧劑、懸浮劑、糊劑、凝膠劑、液劑、凝膠劑、浴用劑、乳液、潤膚油、美容液、粉餅、面膜等。作為將橙皮素及/或糖基橙皮素添加於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑的方法，在這些皮膚外用劑完成為止的步驟中，例如可例示混合、混捏、混合、添加、溶解、浸漬、浸透、散布、塗佈、噴霧、注入等公知1種或2種以上之方法。

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑可例示前述形態之化妝品、醫藥品、或醫藥部外品，於各種化妝品中添加適量後使用亦為隨意

於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中之橙皮素及/或糖基橙皮素的配合量依據本發明之暗黃減低用皮膚外用劑的適用頻度或對象者的肌膚狀態等可做適宜設定。但通常在本發明之暗黃減低用皮膚外用劑中，將選自橙皮素及/或糖基橙皮素的1種或2種以上的所有成分以橙皮素為準進行質量換算(以下對於本案說明書中僅以「橙皮素換算」表示)時，乾燥固體物每單位下，在合計 下添加超過0.0001%未達100%，較佳為超過0.001%未達100%，更佳為超過0.01%未達100%，更較佳為0.01至60%，較更佳為0.01至40%，較更適合為0.01至20%。又，將本發明之暗黃減低用皮膚外用劑對對象者以外用方式進行的頻度及期間通常一日1至5次，較佳為一日1至3次(早、午或晚(夜))，經數天以上，較佳為數週以上，更佳為1個月以上，較更佳為2個月以上，更較佳為3個月以上，連日或個1日以上，繼續使用為佳。且，在前述使用量的下限以下時，有時無法發揮所期待的顯著作用效果，又若為前述使用量之上限以上時，無法發揮配合使用量的作用效果，故由經濟性之觀點來看亦不佳。作為本發明之暗黃減低用皮膚外用劑之適用部位，外皮，特別以黏膜以外的皮膚為較佳。

如此所得的本發明之暗黃減低用皮膚外用劑在室溫或比室溫稍高的溫度下，保持或保存數十分鐘至數個月時，不僅對於該本身，甚至對於添加此的各種組成物，不僅可顯著減低該暗黃減低劑所引起的著色，且可完全沒有臭氣或顯著減低至無知覺的程度。

以下對於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑依據實驗做更詳細說明。

<實驗1：羰基化蛋白質減低物質之篩選> (1)概要

已知肌膚深部所具有的真皮蛋白質藉由過氧化物質等 而變性(羰基化)時會產生羰基化蛋白質，肌膚會變得暗黃色，所謂引發暗黃。對於本實驗，使用後述羰基化蛋白質模型，篩選具有暗黃減低作用之物質。

(2)羰基化蛋白質模型

作為羰基化蛋白質模型，調製牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」)經羰基化的羰基化蛋白質(以下稱為「羰基化BSA」)使用於試驗。

<羰基化BSA之調製>

於將含有作為羰基化誘發劑之次亞氯酸鈉100μM的磷酸緩衝生理食鹽水(以下稱為「PBS(-)」)中，溶解BSA至最終濃度為40mg/mL，在37℃經一夜後，生成作為肌膚的暗黃原因物質之羰基化蛋白質模型的羰基化BSA，將殘存次亞氯酸鈉藉由極限過濾膜(商品名『Amicon Ultra10K』、Merck Millipore股份有限公司)除去，得到羰基化BSA。對於本實驗，將該羰基化BSA作為羰基化蛋白質模型使用。

(3)被驗試料

將在後述實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物(以下僅稱為「糖基橙皮素含有組成物」)、糖基柚皮素含有組成物(含有藉由專利第3967563號的方法所調製之單糖基柚皮甙67.6%及柚皮甙22.4%之組成物)、L-抗 壞血酸2-葡萄糖苷(商品名『AA2G』、股份有限公司林原販賣)、煙醯胺(純度98.0%以上、試藥特級、和光純藥工業股份有限公司販賣)、及還原型穀胱甘肽(純度99%以上、sigmaAldrich公司製)作為被驗試料使用。

(4)具有羰基化蛋白質減低作用(暗黃減低作用)之物質的篩選(單用試驗)

本發明者等應用作為篩選羰基化蛋白質生成抑制物質的方法所使用的公知抗羰基化試驗法，對於前述表1所示被驗試料，藉由下述程序，對這些化合物的羰基化蛋白質減低作用進行調查。即，在前述(2)所調製的含有羰基化BSA10mg/mL之溶液100μL與含有作為具有暗黃減低作用之候補物質的前述(3)所示被驗試料中任一種0.1w/v%而溶解於PBS(-)(全量1ml)。在前述(2)所調製的羰基化BSA與被驗試料以1：1的質量比含有的溶液(以下稱為「羰基化蛋白質減低試驗用被驗溶液」)之全量在37℃下保持16小時後，使用前述極限過濾膜進行過濾，除去殘存的抗氧化物質。其次，依據免疫印跡法解析，使用可解析蛋白質的氧化水準之套組(商品名『OxyBlot^TM Protein Oxidation Detection Kit』、Merck Millipore股份有限公司製)，將羰基化BSA的濃度藉由斑點雜交法(Dot Blot)進行測定。且，測定值(發光強度)為藉由在美國國立衛生研究所(NIH)所開發的圖像處理軟體以『Image J』進行解析。另一方面，不使用被 驗試料以外與前述同樣下處理所得之羰基化BSA含有PBS(-)溶液(以下稱為「對照」)的羰基化BSA之濃度與前述同樣下測定，各求得共存相對於此的各被驗試料時的測定值之比例。結果如表1及圖1所示。且，與被驗物質無添加之對照的羰基化BSA之比例相比較，顯示羰基化BSA的比例越低者，羰基化蛋白質減低作用越大。且，表中之數值將被驗試料無添加之對照中的羰基化BSA之測定值作為1，各表示相對於此的各被驗試料在單獨下的羰基化BSA之比例。

由表1及圖1可得知，將對照的羰基化BSA之比例作為1時，糖基橙皮素含有組成物、糖基柚皮素含有組成物、及L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之羰基化BSA的比例各為0.46、0.77、及0.73，與對照相比較，羰基化BSA的比例明顯地為低值。此表示糖基橙皮素含有組成物、糖基柚皮素含有組成物、及L-抗壞血酸2-葡萄糖苷具有羰基化BSA減低作用，即具有羰基化蛋白質減低作用者。 其中得知亦以糖基橙皮素含有組成物的羰基化蛋白質減低作用為最高。另一方面，煙醯胺及還原型穀胱甘肽皆與對照相比較，由羰基化BSA的比例高可判斷於煙醯胺及還原型穀胱甘肽中不具有羰基化蛋白質減低作用。

(5)羰基化蛋白質減低試驗-其1(糖基橙皮素含有組成物與其他成分之併用試驗)

對於前述(4)，羰基化BSA減低作用為最高的糖基橙皮素含有組成物與不及該糖基橙皮素含有組成物者，進行與確認有羰基化蛋白質減低作用之糖基柚皮素含有組成物或L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之併用試驗。即取代在前述(4)所使用的羰基化蛋白質減低試驗用被驗溶液，使用糖基橙皮素含有組成物之濃度為0.1、0.5、或1.0w/v%、及糖基柚皮素含有組成物或L-抗壞血酸2-葡萄糖苷的濃度為0.1w/v%之羰基化蛋白質減低試驗用被驗溶液以外，進行與前述(4)同樣試驗。結果各表示於下述表2與表3、及圖2與圖3。且，表中未有「%」的數字為，將無添加糖基橙皮素含有組成物及糖基柚皮素含有組成物中任一的對照中的羰基化BSA(以下稱為「對照」)之測定值作為1，相對於此，各表示將各被驗試料單用或併用時的羰基化BSA之比例。

由表2與圖2的結果得知，併用糖基橙皮素含有組成物(0.1w/v%)與糖基柚皮素含有組成物(0.1w/v%)時，在糖基橙皮素含有組成物單獨之羰基化BSA的比例為0.53者降至0.40。同樣地，併用糖基橙皮素含有組成物(0.5w/v%或1.0w/v%)與糖基柚皮素含有組成物(0.1w/v%)時，在糖基橙皮素含有組成物單獨時的羰基化BSA之比例為0.24或0.07者各降低至0.10或0.06。由這些結果得知，併用糖基橙皮素含有組成物與糖基柚皮素含有組成物時，判斷糖基橙皮素含有組成物之羰基化BSA減低作用，換言之羰基化蛋白質減低作用被增 強。

又，由表3與圖3之結果得知，併用糖基橙皮素含有組成物(0.1w/v%)與L-抗壞血酸2-葡萄糖苷(0.1w/v%)時，在糖基橙皮素含有組成物單獨之羰基化BSA的比例為0.53者增加至0.81，在該條件下，藉由糖基橙皮素含有組成物與L-抗壞血酸2-葡萄糖苷之併用的羰基化BSA減低作用並未被確認。然而，併用糖基橙皮素含有組成物(0.5w/v%或1.0w/v%)與L-抗壞血酸2-葡萄糖苷(0.1w/v%)時，在糖基橙皮素含有組成物單獨下的羰基化BSA之比例為0.24或0.07者，各降低至0.04或0.02。由這些結果，併用糖基橙皮素含有組成物與L-抗壞血酸2-葡萄糖苷時，判斷出糖基橙皮素含有組成物之羰基化BSA減低作用，即羰基化蛋白質減低作用被增強。

這些見解皆為本發明者等獨自發現的新穎見解。

且，雖無表示具體數據，後述實施例2至6所示糖基橙皮素含有組成物皆與在本實驗所使用的糖基橙皮素含有組成物具有同樣作用。

(6)羰基化蛋白質減低試驗-其2(糖基橙皮素含有組成物與各種糖質之併用試驗)

對於前述(5)，併用糖基橙皮素含有組成物與糖基柚皮素含有組成物或L-抗壞血酸2-葡萄糖苷時，這些會 共同地作用，顯示羰基化蛋白質減低作用。繼續對於本實驗，併用糖基橙皮素含有組成物時，作為提高該羰基化蛋白質減低作用之化合物以糖質為顯著，並進一步檢索。

即，如下述表4所示，將甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、麥芽糖(商品名『麥芽糖HHH』)、棉子糖、麥芽四糖、或糖基海藻糖(將商品名『Tornare^®』、糖基海藻糖作為主成分之化妝用基材)中任一者取代為在前述(4)所使用的糖基柚皮素含有組成物及L-抗壞血酸2-葡萄糖苷，將以無水物換算為0.1w/v%含有之溶液作為羰基化蛋白質減低試驗用被驗溶液使用以外，與前述(4)同樣下，對於併用前述糖質與糖基橙皮素含有組成物時的羰基化蛋白質減低作用進行調查。結果如表5所示。

由表5所示結果可得知，在糖基橙皮素含有組成物單獨之羰基化BSA的比例為0.51者，併用糖基橙皮素含有組成物與麥芽糖、麥芽四糖、或糖基海藻糖時，顯著減低至0.11、0.13、及0.13。該結果表示於麥芽糖、麥芽四糖、及糖基海藻糖中具有顯著增強糖基橙皮素含有組成物之羰基化BSA減低作用的作用。另一方面，各單獨使用甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺、麥芽糖、棉子糖、麥芽四糖、及糖基海藻糖時的羰基化BSA的比例各為0.51、0.48、0.18、0.23、0.71、及0.37，得知麥芽糖及棉子糖之該本身具有羰基化BSA減低作用。將糖基橙皮素含有組成物與麥芽四糖併用時，在麥芽四糖單獨之羰基化BSA的比例僅為0.71，但併用糖基橙皮素含有組成物時，可由0.71減至0.13，其判斷發揮顯著羰基化BSA減低作用。

(7)羰基化蛋白質減低試驗-其3(糖基橙皮素含有組成物與各種有機酸或胺基酸之併用試驗)

在本實驗中，作為與糖基橙皮素含有組成物併用之化合物，著重於有機酸及胺基酸，進行試驗。如表6所示，將乳酸、酒石酸、檸檬酸、水楊酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸、及谷胺酸鈉中任一取代為前述(4)使用的糖基柚皮素含有組成物或L-抗壞血酸2-葡萄糖苷，將0.05w/v%含有之溶液作為羰基化蛋白質減低試驗用被驗溶液使用以外，與前述(4)同樣下，對於糖基橙皮素含有組成物與前述有 機酸或前述胺基酸中任1種併用時的羰基化蛋白質減低作用做調查。其結果如表7表示。

由表7所示結果得知，在糖基橙皮素含有組成物單獨的羰基化BSA之比例為0.59，但糖基橙皮素含有組成物與乳酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸、或谷胺酸鈉併用時，顯著降低為0.35、0.35、0.16、0.49、0.25、0.26、0.44、0.32、及0.28。由此可得知，於乳酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸、及谷胺酸鈉中具有顯著增強糖基橙皮素含有組成物之羰基化BSA減低作用的作用。且，提供於試驗之有機酸及胺基酸中任一在單獨下使用時的羰基化BSA的比例在0.71至1.08之範圍，與在糖基橙皮素含有組成物單獨之羰基化BSA的比例相比為較高值。

由上述的實驗結果可得知，將糖基橙皮素含有組成物與糖基柚皮素含有組成物、L-抗壞血酸2-葡萄糖苷、麥芽糖、麥芽四糖、糖基海藻糖、乳酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸、或谷胺酸鈉併用時，這些會共同作用，與在糖基橙皮素含有組成物單獨使用時相比較，發揮顯著羰基化蛋白質減低作用。特別併用麥芽四糖、乳酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸、或谷胺酸鈉時，發揮顯著高的羰基化蛋白質減低作用。

且雖具體數據顯示，但後述實施例2至6所示糖基橙皮素含有組成物皆與在本實驗所使用的糖基橙皮 素含有組成物顯示同樣作用。

<實驗2：人類外用試驗-其1> (1)概要

對於在實驗1所進行的活體外試驗，在糖基橙皮素含有組成物確認到顯著羰基化蛋白質減低作用，故實際上將糖基橙皮素含有組成物於人類肌膚上外用時，調查對於已經生成的羰基化蛋白質是否有作用。

(2)塗佈試驗

將24至38歳的健康者11名(男性7名、女性4名)作為被驗者，將各被驗者之慣用邊的手腕與相反邊的上腕內側之皮膚(3cm×3.5cm)3處作為被驗部位(以下自被驗者的頭部側依序稱為被驗部位A、B、及C)，各自將由表8所示配合組成所成的試驗液(pH5.7)以綿棒進行1天2次〔早晚(晚上為入浴後)〕於被驗部位B塗布7天，試驗開始後第8天，塗布被驗試料之各被驗部位貼付角層膠帶剝離用膠帶(商品名『角層checker AST-01』、Asahi Biomed有限公司販賣)，並進行膠帶剝離，採取角層蛋白質(以下稱為「試驗終了後之角層蛋白質」)。且，對於對照，將表8所示對照液(pH5.7)塗布於被驗部位C以外，與前述同樣下進行，採取角層蛋白質(以下稱為「對照之角層蛋白質」)。又，對於被驗部位A，預先於試驗開始時使用角層膠帶剝離用膠帶進行膠 帶剝離，採取角層蛋白質(以下稱為「試驗開始時之角層蛋白質」)。

<判定方法>

羰基化蛋白質減低作用的評估為對各被驗者，塗布試驗液之被驗部位B的「試驗終了後之角層蛋白質」及被驗部位A的「試驗開始時之角層蛋白質」中之羰基化蛋白質(肌膚暗黃之原因物質)，與實驗1的「(2)羰基化蛋白質減低試驗(單用試驗)」所示羰基化BSA濃度的測定方法同樣下定量。又，作為對照，對於塗布對照液之被驗部位C亦以前述同樣下定量羰基化蛋白質(以下稱為「對照之角層蛋白質」)。

又，對於各被驗者，塗布試驗液之「試驗後之角層蛋白質」或塗布對照液之「對照之角層蛋白質」中 的羰基化蛋白質之量與於「試驗開始時之角層蛋白質」中之羰基化蛋白質量的差〔(試驗終了後之角層蛋白質或對照之角層蛋白質中的羰基化蛋白質之量)-(試驗開始時的角層蛋白質中之羰基化蛋白質的量)〕、及比〔(試驗終了後之角層蛋白質中之羰基化蛋白質的量)/(試驗開始時之角層蛋白質中的羰基化蛋白質之量)〕的值各進行統計學處理〔t檢定(單側)〕。

<結果>

對於各被驗者，對塗布試驗液之被驗部位中的羰基化蛋白質(肌膚暗黃之原因物質)量的進行調查的結果如圖4及圖5所示。如圖4所示，塗布對照液之被驗者的情況，試驗終了後的角層蛋白質中之羰基化蛋白質量與試驗開始時相比有增加，此隊於本試驗期間中，顯示被驗者之肌膚的羰基化蛋白質量增加。相對於此，塗布試驗液之被驗者的情況，試驗終了後之角層蛋白質中的羰基化蛋白質量與試驗開始時相比為減低。又，由圖5得知，塗布對照液之被驗者，與試驗開始時相比約1.1倍羰基化蛋白質的量增加，相對於此塗布試驗液之被驗者的情況，與試驗開始時相比，羰基化蛋白質的量為減少，由此得知塗布試驗液之被驗者，羰基化蛋白質之量有顯著且明確地減低。即，判斷將糖基橙皮素含有組成物塗布於皮膚時，可顯著地減低已經生成的肌膚之羰基化蛋白質。

本實驗即使為僅7天的短期間之塗佈試驗， 皆得到顯著且明確的結果之事實表示糖基橙皮素可顯著且明確地有效果減低已經生成肌膚的羰基化蛋白質。又，本試驗終了後對於全被驗者而言，由無顯示本試驗所引起的對皮膚等的異常可判斷糖基橙皮素對於人類為安心且可日常繼續外用的安全物質。且，雖無具體的數據表示，除後述實施例2至6所示糖基橙皮素含有組成物以外，本案說明書中所示其他糖基橙皮素及橙皮素中任一者皆與在本實驗所使用的糖基橙皮素含有組成物同樣地，具有減低已經生成之肌膚的羰基化蛋白質減低作用。

本實驗為使用24至38歳的健康被驗者，明確顯示糖基橙皮素具有減低已經生成之肌膚的羰基化蛋白質之作用者。另一方面，與本實驗相異的另外進行的試驗結果為，糖基橙皮素所達成的羰基化蛋白質減低作用，比使用於年輕層，對於高齡層(40歳以上)更具有顯著效果。此為隨著加齡使得皮膚代謝降低，暗黃之原因物質的羰基化蛋白質徐徐地在肌膚上累積，若考慮到於肌膚產生暗黃，可得知對於羰基化蛋白質量多之高齡層使用糖基橙皮素時，糖基橙皮素所達成的羰基化蛋白質減低作用可更顯著地表現。

<實驗3：人類外用試驗-其2> (1)概要

繼續實驗2之「人類外用試驗-其1」，將人類的眼睛周圍的皮膚作為被驗部位，對於糖基橙皮素對人類皮膚之 暗黃的影響作調查。

(2)塗佈試驗

將25至49歳的健康但在日常生活感到精神壓力之女性16名作為被驗者，無作為各8名之2群(稱為A群、B群)，對於兩群各被驗者，將左右任一相同側的眼睛周圍作為被驗部位，於該被驗部位將由表9所示配合組成而成的本發明之化妝水A(A群用)或對照的化妝水B(B群用)做1天2次〔早與晚(晚上入浴時，於入浴後塗布化妝水A或B〕對被驗部位每1次使用3mL以手進行塗佈處理(以下稱為「使用」)，經過合計8週期間指示連日實施，於使用開始前、使用4週後、及使用8週後進行下述的皮膚色測定，調查化妝水A及化妝水B對暗黃之影響。且，本試驗期間中對於被驗者全員，嚴守(a)避開擦拭被驗部位等物理刺激、(b)避開過度的日曬、(c)避開過度運動、(d)作為肌膚保養劑，不使用化妝水A、B以外者、及(e)使用開始前、使用4週後、及使用8週後進行皮膚色測定前夜不飲酒。

<判定方法：色差測定(皮膚色測定)>

將被驗部位的皮膚色使用色差計(商品名『Konica Minolta分光測色計CM-2600d』、Konica Minolta公司製)進行測定。對於色差測定之解析對象以L*a*b*表示系中之「L*值」及「b*值」表示。且L*值表示明度，b* 值表示肌膚的黃色程度的指標。

A群的8名內之2名因被驗者個人的狀況而在試驗途中離開，故A群之數據解析係依據6名測定結果進行。又，B群為依據8名測定結果進行數據解析。藉由被驗者之眼睛周圍的皮膚中之色差測定(皮膚色測定)所得之L*值測定值與自使用開始後的變化量(△L*值)各表示於表10及表11。又，藉由被驗者的眼睛周圍之皮膚中的色差測定之b*值的測定值與自使用開始前的變化量(△L*值)各如表12及表13所示。

<結果>

如表10所示，使用對照之化妝水B的被驗者之眼睛周圍的皮膚中的L*值之平均值自使用開始前為63.37者經使用4週後為63.77，使用8週後之時間點為63.70，並未確認到L*值的實質變化。相對於此，使用含有糖基橙皮 素之化妝水A的被驗者之眼睛周圍的皮膚中之L*值的平均值為使用開始前63.42者，經使用4週後之時間點為64.31，在使用8週後之時間點為64.27，與使用開始前比較顯示明確高L*值。又，如表11所示，使用對照的化妝水B之被驗者的L*值之變化量(△L*值)以使用開始前的0作為基準時，使用4週後及使用8週後的時間點各為0.40及0.33。相對於此，使用本發明之化妝水A的被驗者之△L*值以使用開始前之0為基準，在使用4週後及使用8週後之時間點各為0.90及0.86。如此使用前述化妝水A的被驗者之△L*值的0.90及0.86皆顯示對照之化妝水B的△L*值之0.40及0.33的約2倍以上之高值。其中，L*值若考慮為肌膚明亮度的指標時，含有本發明之糖基橙皮素含有組成物的化妝水A可被判斷為具有有效改善人類肌膚的明亮度之作用。

又，如表12所示，使用對照的化妝水B之被驗者的眼睛周圍之皮膚中，使用開始前、使用4週後、及使用8週後的b*值各為17.33、17.03、及17.25，此與使用開始前與後無實質上變化。相對於此，使用含有本發明之糖基橙皮素的化妝水A之被驗者的眼睛周圍之皮膚的b*值之平均值為使用開始前18.41，但使用4週後及使用8週後之時間點各為17.84、及17.70，此與使用開始前比較顯示有顯著減少。而該減少程度如表13所示，使用對照的化妝水B之被驗者的b*值之變化量(△b*值)的平均值為-0.30及-0.08，相對於此，使用含有本發明之糖基橙 皮素含有組成物之化妝水A的被驗者，在使用4週後及使用8週後之時間點各為-0.57及-0.70。如此使用化妝水A之被驗者的△b*值之變化量與對照的化妝水B相比較，使用4週後約變成2倍，又使用8週後，實際上成為約9倍。如此可判斷化妝水A具有極顯著改善人類肌膚的暗黃之作用。

由本實驗結果得之，本發明之暗黃減低用皮膚外用劑使用於人類肌膚時，對於色差測定(皮膚色測定)，可顯著降低肌膚之暗黃指標的b*值，同時可改善肌膚明亮指標之L*值，故本發明之暗黃減低用皮膚外用劑可改善肌膚暗黃，賦予透明感之健康色調的肌膚。且，本發明之暗黃減低用皮膚外用劑所達到的人類肌膚暗黃改善作用對於本劑使用開始前之肌膚暗黃的高值之被驗者，皆顯示更顯著的傾向。

<實驗4：糖基橙皮素之物性>

作為糖基橙皮素，對於後述實施例2、4、5及6的方法，使用還原劑以外，與這些實施例所記載的方法同樣地所調製的4種類粉末狀糖基橙皮素(被驗試料1至4)與對於實施例2之方法，作為還原劑使用焦亞硫酸鈉0.1、0.09、0.07或0.04%以外，使用與實施例2之相同方法所調製的4種類粉末狀糖基橙皮素(被驗試料5至8)。且，被驗試料1為未使用所定還原劑所調製者，故α-糖基橙皮苷、橙皮苷、及其他成分含量與實施例1所得之粉末 狀糖基橙皮素幾乎同等，與實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素為同等品。

(1)糠醛之含量

對於各被驗試料1至8，使用下述程序及裝置並求得糠醛含量。

<A.試料之調製>

(甲)於50mL附有共栓的三角燒瓶中採取作為被驗試料之糖基橙皮素0.5g。

(乙)其次，加入脫離子水5.0mL並溶解糖基橙皮素，作為替代物質(分析時欲調查被驗試料之回收率的指標)，加入濃度0.0025%之環己醇20μL。

(丙)進一步加入氯化鈉1.5g並溶解後加入二乙基醚3mL，以700rpm攪拌10分鐘。

(丁)將全量移至分液漏斗中，靜置10分鐘後，回收二乙基醚相，以硫酸鈉進行脫水後，氮氣流下濃縮至約200μL。

(戊)採取濃縮液1μL，提供GC/MS分析裝置。

(己)作為對照，取代糖基橙皮素使用試藥級糠醛以外與被驗試料同樣地進行(甲)至(戊)的處理。

<GC/MS分析條件>

GC/MS分析裝置：『Clarus 680 GC』及『Clarus SQ8T』(皆為Perkin Elmer公司製)

管柱：VF-WAXms〔30m(管柱長)×0.25mm(內徑)、膜厚0.25μm〕(AGILENT J&W公司製)

檢測器：質量分析器

載體：氦氣

線速度35cm/秒

昇溫條件：在40℃保持3分鐘，至40℃~80℃以5℃/分的比例昇溫，至80℃~200℃以10℃/分的比例昇溫，在200℃保持7分鐘，至200℃~220℃以10℃/分的比例昇溫，進一步在220℃保持8分鐘。

替代物質：環己醇

內部標準物質：二十一烷

萃取溶劑：二乙基醚

<B.試料中之糠醛定量>

對於在GC/MS分析法所得之對照的試藥特級糠醛(和光純藥工業股份有限公司製)，依據測定數據作成校對曲線，依據此，求得被驗試料之糠醛含量。

(2)4-VA之含量

對於各被驗試料1至8，測定使用下述試藥、程序及裝置的4-VA含量。且，該測定為依據平成18年7月28日的食安基發第0728008號厚生勞働省醫藥食品局食品安全部基準審査課長通知『對於清涼飲料水中之苯』進行。

<A.試藥、各種溶液之調製>

(甲)氯化鈉(水質試驗用、和光純藥工業股份有限公司販賣)

(乙)環己醇標準原液之調製

將環己醇(試藥一級，片山化學工業股份有限公司販賣)溶解於甲醇(局方一般試驗法用)調製出0.01質量%環己醇溶液(以下稱為「環己醇標準原液」)。

(丙)內部標準液

使用前述環己醇標準原液與甲醇，調製出0.0004質量%環己醇溶液(以下稱為「內部標準液1」)及0.00004質量%環己醇溶液(以下稱為「內部標準液2」)。

(丁)標準原液之調製

將4-VA(和光純藥工業股份有限公司販賣)溶解於甲醇，各調製出0.0005質量%4-VA溶液(以下稱為「標準液A」)及0.00005質量%4-VA溶液(以下稱為「標準液B」)。

(戊)標準曲線作成用標準原液之調製

使用前述標準液A、B、前述內部標準液1、及甲醇，調製為4-VA濃度為0.05、0.1、0.2、0.5或1.0μg/mL之5種類標準曲線作成用混合標準原液。

(己)標準曲線作成用標準液之調製

於20mL容頂空樣品瓶5瓶中各加入超純水10mL，再加入前述5種類的標準曲線作成用混合標準原液之任一 10μL，進一步添加氯化鈉3.0g，直接密栓並攪拌溶解後調製出5種類標準曲線作成用標準液。

<B.被驗試料之調製>

於20mL容頂空樣品瓶8瓶中稱取被驗試料1至8中任一的乾燥固體物換算的0.20g，於此加入超純水使全量成為10.0g，進行攪拌溶解。於所得之水溶液中加入10μL之前述內部標準液2，進一步添加氯化鈉3.0g，馬上密栓並攪拌溶解，調製出含有被驗試料1至8中任一的8種類被驗試料。

<C.4-VA之定量方法> (甲)測定條件 <GC/MS分析條件>

‧GC/MS分析裝置：『Clarus SQ8TGC/MS』(Perkin Elmer公司製)

‧頂空取樣器：『TurboMatrix Trap 40』Perkin Elmer公司製)

‧管柱：VF-WAXms〔管柱長30m×內徑0.25mm、膜厚0.25μm)(AGILENT J&W公司製)

‧檢測器：質量分析器

‧載體：氦氣

‧線速度：35cm/秒

‧管柱注入口溫度：200℃

‧昇溫條件：在40℃保持3分鐘，至40℃~80℃以5℃/分的比例下昇溫，至80℃~200℃以10℃/分的比例下昇溫，在200℃保持7分鐘，至200℃~220℃以10℃/分的比例下昇溫，進一步在220℃保持8分鐘。

‧樣品瓶烤箱溫度：60℃

‧針溫度：140℃

‧轉移線路溫度：205℃

‧樣品瓶加熱時間：30分鐘

<檢測法>

‧離子化〔Electron Impact(EI)〕法

‧SIM選擇離子(Selected Ion Monitoring)

m/z 134,119(4-VA)

m/z 82,57〔環己醇(試藥一級、片山化學工業股份有限公司販賣)〕

(乙)4-VA之定量

前述5種類的標準曲線作成用標準液與前述8種類的被驗試料中之4-VA與內部標準(環己醇)的吸收峰高度比，與另外作成的4-VA之標準曲線為基礎，求得於前述被驗試料中之4-VA濃度，依據此算出被驗試料1至8中之4-VA含量。

(3)色調與著色度

對各被驗試料1至8之水溶液，將色調以肉眼觀察的 同時，藉由下述程序求得著色度。即，對於各被驗試料1至8，作為1%水溶液，將該40mL在密閉容器(50mL容)中以100℃進行30分鐘加熱後，成為27℃放入寬1cm的容器中，藉由分光光度計(商品名『UV-2600』、島津製作股份有限公司所製)測定在波長420nm(OD_420nm)及波長720nm(OD_720nm)中之吸光度，求得兩波長中之吸光度的差(OD_420nm-OD_720nm)，將該值作為著色度。且，吸光度差的數值越小表示著色度越低。

(4)電傳導度

其次對於各這些被驗試料1至8，溶解於純水中至1w/v%水溶液，在密閉容器中以100℃進行30分鐘加熱後，將所得之被驗試料1至8的水溶液各冷卻至20℃，將在20℃之電傳導度藉由電傳導度計(商品名『CM-50AT』、東亞DKK股份有限公司製)進行測定。

(5)離子性化合物之含量

定量離子性化合物雖非容易，作為簡便法，藉由下述方法，求得陽離子金屬元素之含量。即，對於各被驗試料1至8，將約0.5g以50mL容器(商品名『Falcon試管』、日本Becton Dickinson股份有限公司製)精秤，於超純水20mL加熱溶解，於此添加精密分析用60%硝酸水溶液0.54mL，在70℃進行14小時加熱，冷卻至室溫後，以超純水使全量成為50mL，在下述分析裝置與測定條件 下求得金屬元素含量。且，對照為僅使用超純水者。

<裝置及測定條件>

‧誘導結合電漿發光分光分析裝置：『CIROS-120』(Spectro公司製)

‧電漿電力：1,400W

‧電漿氣體(Ar)：13.0L/分

‧補助氣體(Ar)：1.0L/分

‧霧化氣(Ar)：1.0L/分

‧幫浦動作：1.0mL/分

‧金屬元素含量(ppm)之算出方法：{(被驗試料之測定值)-(對照之測定值)}×稀釋倍率

將前述(1)至(5)的結果如表14所示。且，被驗試料1至8的糖基橙皮素之組成與實施例1、3、4或5所示者在實質上為同等，故於表14中省略該組成記載。

由表14可得知，對於被驗試料1至4的糠醛含量皆超過300ppb，被驗試料5至8皆為約10ppb。又，對於被驗試料1至4的4-VA含量皆超過40ppb，被驗試料5至8皆為約2ppb以下。

又，如表14所示，被驗試料1至4(還原劑非處理品)的水溶液之色調(藉由肉眼觀察)為淡黃色，但被驗試料5至8(還原劑處理品)之水溶液與被驗試料1至4相比較，明顯為淡色調。又，對於藉由分光光度計之著色度為被驗試料1至4的水溶液之著色度皆為0.24以上，被驗試料5至8的水溶液皆為0.20以下之低值。且被驗試料5至8之著色度為所使用的還原劑量越多，越顯示低值。

且由表14可得知，對於被驗試料1至4之水溶液的電傳導度約11至約12μS/cm與超過10μS/cm，被驗試料5至8的水溶液約3至約7μS/cm與未達10μS/cm。

且，由表14可得知，被驗試料5至8的金屬元素(鈣、鉀、鎂、及鈉)含量皆與被驗試料1至4相比較其明顯低，該結果表示電傳導度的測定結果皆為良好。

由以上結果得知，還原劑處理品與還原劑非處理品相比，糠醛含量為顯著被減低，4-VA含量、著色度、電傳導度、及金屬元素含量亦顯著被減低。

<實驗5：糖基橙皮素之雜味及著色與糠醛及4-VA之含量 的關係>

以調查糖基橙皮素之雜味及著色與糠醛及4-VA之含量的關係為目的而進行下述試驗。

(1)被驗試料之調製

依據後述實施例5的方法及實施例1之方法，各調製出還原劑處理品之糖基橙皮素(以下稱為「試料A」)與還原劑非處理品之糖基橙皮素(以下稱為「試料B」)。其次簡單上將試料A、B以適宜比例而配合，糠醛含量為階段式相異，調製出表16所示3種類糖基橙皮素試料(以下稱為「被驗試料9至11」)。

(2)糠醛及4-VA之含量

依據實驗4的「(1)糠醛之含量」及「(2)4-VA之含量」所示測定方法，各測定被驗試料9至11之糠醛含量與4-VA含量。

(3)著色判定試驗

將28至57歳的健康男女9人(女性2人、男性7人)作為評估組，使用被驗試料9至11及試料B(以下稱為「對照」)，對於著色進行評估試驗。即，將各被驗試料9至11及對照在室溫下溶解於蒸餾水中至1%水溶液，將此等由各評估人員以肉眼觀察，各評估人員對於各 被驗試料與對照相比下評估為「著色減低」者則為「判定A1」，評估為「未減低著色」者則為「判定B1」，其結果如表15所示。

(4)官能試驗

將前述男女9人作為評估組，對於被驗試料9至11及對照的雜味進行官能試驗。即，將被驗試料9至11及對照在室溫下溶解於蒸餾水至1%水溶液，將此等由各評估人員試飲後，各評估人員對於各被驗試料與對照相比，評估為「雜味有改善」者為「判定A2」，評估為「雜味未改善」者為「判定B2」，該結果如表15所示。

由表15的結果得知，糖基橙皮素的雜味在糠 醛含量為200ppb附近時有顯著的改善，對於4-VA含量，在30ppb附近顯示顯著的改善。又，對於糖基橙皮素之著色亦同樣。

由這些結果得知，糠醛含量為未達200ppb，4-VA含量為30ppb以下的糖基橙皮素與過去品相比，雜味顯著地被減低，著色亦顯著地被減低的糖基橙皮素。換言之，得知可作為欲區分糠醛含量及4-VA含量為雜味顯著減低，著色顯著減低的糖基橙皮素之指標。即，糠醛含量未達200ppb且4-VA含量為30ppb以下之糖基橙皮素作為指標時，可容易得到本發明之糖基橙皮素。

因此，表示既述實驗4之結果的表14、及表示後述實施例1至8的粉末狀糖基橙皮素含有組成物之雜味與糠醛含量及4-VA含量之關係經歸納者為下述表16所示。表16中，還原劑處理品之被驗試料5至8(前述表14參照)、及實施例2至8之粉末狀糖基橙皮素含有組成物(以下歸納為「還原劑處理試料」)的糠醛含量為191ppb以下，4-VA含量為28.7ppb以下，於還原劑非處理品的特有雜味經顯著地減低。對於此，還原劑非處理品之被驗試料1至5的粉末狀糖基橙皮素(以下歸納為「還原劑非處理試料」)的糠醛含量為308ppb以上，4-VA含量為40.0ppb以上，於還原劑非處理品具有特有雜味。

由下述表16所示結果，實驗4的結果經整合，依據這些一連串結果，可將糠醛含量及/或4-VA含量作為指標，可區分糠醛含量為未達200ppb及/或4-VA含 量未達30ppb者，與還原劑非處理品相比較，可判斷雜味有顯著減低的糖基橙皮素。

由表16的結果得知，還原劑處理品與還原劑非處理品相比較，雜味顯著被減低，且著色或臭氣亦顯著 被減低，故可適用於有關本發明之暗黃減低劑上。

<實驗6：官能試驗> (1)被驗試料之調製

在實驗4所使用的還原劑處理品之被驗試料5至8之中，表示糠醛含量、著色度、電傳導度、及金屬元素含量之各中間位置的值之被驗試料6與還原劑非處理品之被驗試料1至4之中，表示糠醛含量、著色度、電傳導度、及金屬元素含量最低值的使用被驗試料1，將28至59歳的健康男女8名(女性2名、男性6名)作為評估組進行下述(2)所示官能試驗。即，將還原劑非處理品(被驗試料1)與還原劑處理品(被驗試料6)各成為1w/v%水溶液下在室溫溶解於RO水(通過逆浸透膜之水)，作為非加熱被驗試料1、6，將這些供給於下述試驗前於密閉容器中保管。又，將非加熱被驗試料1、6各放入容器中並密閉，在沸騰水浴中進行30分鐘加熱，冷卻至室溫者作為加熱被驗試料1、6。

(2)官能試驗

對於各評估人員，在室溫下調整的在前述(1)所得之非加熱被驗試料1、6(各10mL)及加熱被驗試料1、6(各10mL)，於試飲前各自評估(a)著色與(b)臭氣。其後，對於各評估人員，在試飲各被驗試料前，先以開水漱口後，對於(c)苦味(含有澀味、辛辣、收斂 味)、(d)後味及(e)試飲時的臭氣進行各自評估。評估基準如下述表17所示。且對於非加熱被驗試料6，將非加熱被驗試料1作為對照，對於加熱被驗試料6，將加熱被驗試料1作為對照，對於前述(a)至(e)之各評估項目，經各評估人員進行評估。結果各如表18及表19所示。

(評估基準)

(3)官能試驗之結果

且，於表18、19所示評估結果中，雖無顯示對於還原劑非處理品(加熱/非加熱被驗試料1)自體的(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味、及(e)臭氣之評估結果，但如評估基準所示，表18、19所示評估結果為將還原劑非處理品作為基準，評估還原劑處理品者，故還原劑非處理品自體之評估結果對於各評估項 目而言，評估基準所示分數(5階段評估)為中間的「3」。

另一方面，由表18之評估結果得知，非加熱被驗試料6，即未經過加熱處理的還原劑處理品，對於(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味、及(e)臭氣的各評估項目，在5階段評估中最高評估為「1」之評估組數各為8人中、4人、3人、0人、3人、及4人(合計14人)另一方面，於表18的評估結果所示加熱被驗試料6，即經熱處理的還原劑處理品，對於(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味及(e)臭氣的各評估項目，在5階段評估評估為「1」的評估組各為8人中，6人、4人、3人、4人、及5人(合計22人)。該結果表示還原劑處理品中，其為不僅有效果地減低於還原劑非處理品之固有苦味、著色，對於臭氣亦有效果地減低之高品質糖基橙皮素。

同樣地，由表19之評估結果得知，非加熱被驗試料6(未經加熱處理的還原劑處理品)，對於(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味、及(e)臭氣之評估項目，在5階段評估中最低的「5」及評估為比最低水準更高1階段之「4」之評估組數皆為0人(合計0人)。另一方面，由表18的評估結果得知，加熱被驗試料6(經加熱處理的還原劑處理品)對於(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味、及(e)臭氣之評估項目，在5階段評估為最低之「5」及評估為比最低水準 更高1階段的「4」之評估組數皆為0人(合計0人)。該結果得知，還原劑處理品與還原劑非處理品相比，其為不僅為有效減低雜味‧著色，對於臭氣亦有效果地減低之高品質糖基橙皮素含有組成物。

由這些結果得知，還原劑處理品與還原劑非處理品相比較，無論是否經過加熱/非加熱，對於還原劑非處理品之特有的(a)著色、(b)臭氣、(c)苦味、(d)後味、及(e)臭氣之所有評估項目中，具有顯著優良者，該優劣之差在加熱後並無更顯著的差異。

且，對於前述實驗4所示的被驗試料5、7及8，提供於本實驗6之「(2)官能試驗」時，得到與前述被驗試料6幾乎同等結果。

如此還原劑處理品中對於還原劑非處理品之特有的苦味與後味，換言之雜味則有顯著的減低，同時與還原劑非處理品相比，其著色與臭氣亦顯著減低。

以下將本發明依據實施例做詳細說明，但本發明並未受到這些的任何限制。

[實施例1] <暗黃減低用皮膚外用劑>

作為原料，與特開平11-346792號公報之實施例A-2所記載的相同方法，對於橙皮苷1質量份使用糊精(DE20)7質量份，將來自桿菌‧嗜熱脂肪芽孢的環麥芽 糊精‧葡聚醣轉移酶(股份有限公司林原製)以糊精每公克中加入20單位，維持在pH6.0、75℃下，進行24小時反應，得到糖漿狀糖基橙皮素含有組成物，於此將葡萄澱粉酶(商品名『Gluco Team』、Nagase Chemtex股份有限公司製)以糖基橙皮素含有組成物固體物每公克為100單位下加入，在50℃進行5小時反應。其次，減壓濃縮所得之糖漿狀糖基橙皮素含有組成物，經粉末化後，得到粉末狀糖基橙皮素含有組成物以每固體物單位下以對原料橙皮苷質量之約60%的收率下得到。本品為含有α-糖基橙皮苷77.0質量%、橙皮苷15.5質量%、其他成分7.5質量%。

本品之糠醛含量為310ppb、4-VA含量為40.0ppb、著色度為0.24、及電傳導度約11μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下，鈣、鉀、鎂、及鈉各以約3ppm、約0.2ppm、約0.4ppm、及約1ppm。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。

[實施例2] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將1當量氫氧化鈉水溶液4質量份在80℃加溫，維 持該溫度下，加入橙皮苷1質量份及糊精(DE20)7質量份，進行30分鐘攪拌後使其溶解，將pH設定在9.0，於此將來自土芽孢桿菌‧嗜熱脂肪芽孢Tc-91株(獨立行政法人產業技術総合研究所、專利生物寄存中心 寄存號碼FERM BP-11273、寄存日：1973年7月30日)的CGTase以糊精每公克為30單位下加入，維持在pH6.9、50℃下進行18小時反應，將橙皮苷的約70%轉換為α-糖基橙皮苷。其次，對於所得之酵素反應液，添加作為還原劑的焦亞硫酸鈉0.05質量%，在100℃加熱30分鐘，同時加熱使殘存酵素失活後，將葡萄澱粉酶(商品名『Gluco Team』、Nagase Chemtex股份有限公司製)以酵素反應液之固體成分每公克加入100單位，維持在pH5.0、55℃下進行5小時反應，生成α-糖基橙皮苷。將所得之酵素反應液經加熱使殘存酵素失活，經過濾後將濾液以填充多孔性合成吸著劑、商品名『DiaionHP-10』(三菱化學股份有限公司販賣)之管柱以空間速度(SV)2進行通液。該結果為溶液中之α-糖基橙皮苷與未反應橙皮苷於多孔性合成吸著劑被吸附，D-葡萄糖、鹽類等不會被吸附下流出。其次，於管柱通過純化水，洗淨管柱後，將乙醇水溶液濃度以階段性的提高下進一步進行通液，採取α-糖基橙皮苷含有部分，經減壓濃縮並粉末化後，以淡黃色粉末狀糖基橙皮素含有組成物之固體物每單位對於原料橙皮苷質量為約70%之收率得到。且，在本例所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物其含有α-糖基橙皮苷 80.0質量%、橙皮苷12.3質量%、其他成分7.7質量%。

本品之糠醛含量為12ppb、4-VA含量為2ppb、著色度為0.19、及電傳導度約6μS/cm。又，本品中以乾燥固體物每單位下，含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.4ppm、約0.05ppm、約0.1ppm、及約0.1ppm。

又，本品與未使用所定還原劑所製造之在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比，其為雜味與著色皆顯著被減低，臭氣亦顯著被減低下，即使在90至100℃的比較高溫之條件下進行30分鐘加熱後，亦具有不僅雜味‧著色有效地減低，臭氣亦有效地被減低之優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例3] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將1當量氫氧化鈉水溶液4質量份於80℃加溫，維持該溫度下，於此依序添加橙皮苷1質量份、糊精 (DE10)4質量份及亞硫酸鈉0.06質量份，進行30分鐘攪拌使其溶解，於0.01當量鹽酸溶液中和後，馬上將來自土芽孢桿菌‧嗜熱脂肪芽孢Tc-91株(獨立行政法人產業技術総合研究所、專利生物寄存中心 寄存號碼FERM BP-11273)的CGTas以糊精每公克之20單位加入，維持在pH6.0、75℃，攪拌下使其進行24小時反應。取代所得之酵素反應液，以高速液體層析法進行分析後，橙皮苷約69%轉換為α-糖基橙皮苷。其次，於所得之酵素反應液中加入作為還原劑之焦亞硫酸鈉0.03%，在90℃加熱120分鐘後，將葡萄澱粉酶(商品名『Gluco Team』、Nagase Chemtex股份有限公司製)以該中間生成物每公克之50單位加入，維持pH5.0、55℃下進行10小時反應，生成α-糖基橙皮苷。將所得之酵素反應液經加熱使殘存酵素失活，經過濾將濾液於填充多孔性合成吸著劑、商品名『DiaionHP-10』(三菱化學股份有限公司販賣)的管柱中以SV2進行通液。其結果，溶液中之α-糖基橙皮苷與未反應橙皮苷吸附於多孔性合成吸著劑，糖類或鹽類等並未被吸附下流出。其次，於管柱通過純化水，洗淨管柱後，將乙醇水溶液濃度以階段式提高下進一步通液，採取α-糖基橙皮苷含有部分，經減壓濃縮使其粉末化，淡黃色之粉末狀糖基橙皮素含有組成物以固體物每單位對原料的橙皮苷質量約68%的收率得到。且，本例所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物為含有α-糖基橙皮苷79.0%、橙皮苷14.0%、其他成分7.0%。

本品之糠醛含量為11ppb，4-VA含量為1.5ppb，著色度為0.14及電傳導度約4μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.4ppm、約0.06ppm、約0.1ppm、及約0.1ppm。

本品與未使用所定還原劑所製造之在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比，其為雜味與著色皆顯著被減低，臭氣亦顯著被減低下，即使在90至100℃的比較高溫之條件下加熱30分鐘，亦具有可有效率地減低雜味‧著色以及臭氣之優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例4] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將1當量氫氧化鈉水溶液4質量份於80℃加溫，維持該溫度下，於此作為還原劑依序添加亞硫酸鈉0.1質量份、橙皮苷1質量份、及糊精(DE10)4質量份，經30分鐘攪拌下使其溶解，於此加入0.01當量鹽酸溶液並中 和後，馬賞將來自土芽抱桿菌‧嗜熱脂肪芽孢Tc-91株(獨立行政法人產業技術総合研究所、專利生物寄存中心寄存號碼FERM BP-11273)的CGTase以糊精每公克之20單位加入，維持pH6.0、75℃，攪拌下進行24小時反應，使橙皮苷之約72%轉換為α-糖基橙皮苷。將所得之酵素反應液經加熱使殘存酵素失活、過濾後將濾液以填充多孔性合成吸著劑、商品名『DiaionHP-20』(三菱化學股份有限公司販賣)之管柱以SV2通液。其結果，溶液中之α-糖基橙皮苷與未反應橙皮苷被多孔性合成吸著劑吸附，而D-葡萄糖、鹽類等未吸附下流出。其次，於管柱使純化水通液，洗淨管柱後，將乙醇水溶液濃度以階段方式提高下進一步進行通液，採取α-糖基橙皮苷含有部分，經減壓濃縮使其粉末化後，將淡黃色的粉末狀α-糖基橙皮苷含有組成物以固體物每單位對於原料的橙皮苷質量約71%之收率得到。且，本例中所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物含有α-糖基橙皮苷76.0%、橙皮苷18.5%、其他成分5.5%。

本品的糠醛含量為10ppb，4-VA含量為3.0ppb，著色度為0.17及電傳導度約4μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.3ppm、約0.04ppm、約0.1ppm、及約0.05ppm。

又，本品與未使用所定還原劑所製造之在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比，其為雜味與著色皆顯著被減低，臭氣亦顯著被減低下，即使在 90至100℃的比較高溫之條件下加熱30分鐘，其具有雜味與著色同時與臭氣亦有效果地被減低之優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例5] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將橙皮苷1質量份、糊精(DE8)10質量份、及作為還原劑之焦亞硫酸鈉0.05質量份添加於水500質量份，在pH9.5、90℃進行70分鐘加熱，其次將來自土芽孢桿菌‧嗜熱脂肪芽孢Tc-91株(獨立行政法人產業技術総合研究所、專利生物寄存中心 寄存號碼FERM BP-11273)的CGTase以糊精每公克下加入30單位，維持pH8.2、65℃，進行攪拌下保持40小時，於酵素反應終了前，添加焦亞硫酸鈉0.05質量份，在85℃進行加熱，使酵素失活後，於此將葡萄澱粉酶(商品名『Gluco Team』、Nagase Chemtex股份有限公司製)以酵素反應液固體物每公克為100單位加入，維持於pH5.0、55℃下進行5小時反應， 生成α-糖基橙皮苷。將所得之酵素反應液經加熱使殘存酵素失活。其次，於所得之酵素反應液中，作為α-L-鼠李糖苷酶添加Hesperidinase(商名『可溶性Hesperidinase<田邊>2號』、田邊製藥製)0.5質量份，調整至pH4，在55℃進行24小時反應，於所得之酵素反應液中加入焦亞硫酸鈉0.01質量份，經加熱使酵素失活後過濾，將濾液以填充多孔性合成吸著劑、商品名『DiaionHP-10』(三菱化學股份有限公司販賣)之管柱以SV2進行通液。其結果溶液中之α-糖基橙皮苷、7-O-β-糖基橙皮素、及未反應橙皮苷吸附於多孔性合成吸著劑，而D-葡萄糖、鹽類等未被吸附而流出。其次於管柱將純化水通液，洗淨管柱後，將乙醇水溶液濃度以階段方式提高下進一步進行通液，採取α-糖基橙皮苷部分，經減壓濃縮使其粉末化，將淡黃色粉末狀糖基橙皮素含有組成物以固體物每單位對於原料的橙皮苷質量約70%之收率得到。且本例所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物含有α-糖基橙皮苷81.9%、橙皮苷0.5%、7-O-β-糖基橙皮素8.9%、及其他成分8.7%。

本品之糠醛含量為9ppb，4-VA含量為2.0ppb，著色度為0.16及電傳導度約4μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.3ppm、約0.03ppm、約0.05ppm、及約0.05ppm。

本品與未使用所定還原劑所製造之在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比，其為雜味與著色皆顯著被減低，臭氣亦顯著被減低下，即使在90至 100℃的比較高溫之條件下加熱30分鐘，亦具有雜味與著色及臭氣可有效果地減低之優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例6] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將橙皮苷50質量份與次亞硫酸鈉1質量份於0.25當量氫氧化鈉水溶液0.9質量份中在80℃進行加熱溶解，添加DE8之糊精150質量份並溶解，調整至pH9.0後，將來自土芽孢桿菌‧嗜熱脂肪芽孢Tc-91株(獨立行政法人產業技術総合研究所、專利生物寄存中心 寄存號碼FERM BP-11273)的CGTase以糊精1質量份中加入15單位，加溫至60℃下調整至pH8.3，進行6小時反應。其後調整至pH7.0，於68℃加溫，並進行40小時反應。酵素反應終了後，加熱酵素使其失活後經過濾，得到酵素反應液。將酵素反應液藉由高速液體層析法(HPLC)進行分析後，反應前的溶液中之橙皮苷的72%轉換為α-糖基橙皮 苷，殘留28%為未反應。於酵素反應液添加作為α-L-鼠李糖苷酶之Hesperidinase(商品名『可溶性Hesperidinase<田邊>2號』、田邊製藥製)2質量份，調整至pH4，在55℃進行24小時反應後，加入葡萄澱粉酶(商品名『Gluco Team』、Nagase Chemtex股份有限公司製)1質量份，進一步在55℃進行24小時反應。酵素反應終了後，加熱所得之酵素反應液，加熱使酵素失活，通過以填充中間極性多孔性吸著樹脂(商品名『AmberliteXAD-7』、Rohm & Haas公司製)之管柱，管柱經水洗後，以80v/v%乙醇水溶液溶離樹脂吸著成分。除去溶離液中之乙醇後，冷凍乾燥，得到含有α-糖基橙皮苷82.0%、7-O-β-糖基橙皮素8.0%、橙皮苷1.0%、及其他成分9.0%之粉末狀糖基橙皮素含有組成物。

本品之糠醛含量為10ppb，4-VA含量為1.5ppb，著色度為0.15及電傳導度未達10μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.4ppm、約0.04ppm、約0.1ppm、及約0.2ppm。

本品與未使用所定還原劑所製造之在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比，其為雜味與著色皆顯著被減低，臭氣亦顯著被減低下，即使在90至100℃的比較高溫之條件下加熱30分鐘，亦具有雜味與著色及臭氣可有效果地減低之優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成 的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例7] <暗黃減低用皮膚外用劑>

對於酵素反應液，添加作為還原劑的偏亞硫酸鉀0.001%以外與實施例1同樣地，將淡黃色粉末狀糖基橙皮素以固體物每單位對於原料的橙皮苷質量約69%之收率得到。且，在本例所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物含有α-糖基橙皮苷79.5%、橙皮苷13.8%、其他成分6.7%。

本品的糠醛含量為180ppb，4-VA含量為20.0ppb，著色度為0.23及電傳導度未達10μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.5ppm、約0.08ppm、約0.1ppm、及約0.3ppm。

本品與在實施例2至5所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物相比較為較差者，但與還原劑非處理品相比較，其著色或臭氣亦顯著地減低下，雜味亦顯著地減低，同時在90至100℃的比較高溫之條件下進行30分鐘加熱後，與還原劑非處理品相比該雜味亦顯著被減低，故其具有著色或臭氣亦有效果地顯著減低的優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例8] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將偏亞硫酸鉀由亞硫酸氫鈉取代以外，與實施例7同樣地，將淡黃色粉末狀糖基橙皮素含有組成物以乾燥固體物每單位對於原料橙皮苷質量約65%之收率得到。且，在本例所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物含有α-糖基橙皮苷77.2%、橙皮苷16.5%、其他成分6.3%。

本品之糠醛含量為191ppb，4-VA含量為28.7ppb，著色度為0.23及電傳導度未達10μS/cm。又，本品在乾燥固體物每單位下含有鈣、鉀、鎂、及鈉各約0.5ppm、約0.07ppm、約0.09ppm、及約0.4ppm。

本品雖與在實施例2至6所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物的物性相比為較差者，但但與還原劑非處理品相比較，其著色或臭氣亦顯著地減低下，雜味亦顯著地減低，同時在90至100℃的比較高溫之條件下進行 30分鐘加熱後，與還原劑非處理品相比該雜味亦顯著被減低，故其具有著色或臭氣亦有效果地顯著減低的優良特性。

藉由本品或含有此的化妝品、醫藥部外品、及醫藥品使用在人類外用時，在過去認為困難的已經生成的肌膚暗黃可有效果地減低。又，本品具有可安全且容易地經過長期間使用的優點。又，本品在比前述溫度範圍更低溫度下，經數十分鐘至數月間保持或保存後，亦可發揮來自本品的雜味‧著色與臭氣可有效果地減低之優良作用效果。

[實施例9] <暗黃減低用皮膚外用劑>

添加在實施例2至8所得之7種類粉末狀暗黃減低用皮膚外用劑中任一的1質量份、花色素苷0.001質量份、純化水30質量份、及適量pH調製劑並攪拌，調整為pH7.0，精密過濾後於無菌容器中進行無菌填充，得到7種類本發明之液狀暗黃減低用皮膚外用劑。

本品為實質上無著色、異臭，人類在日常可繼續且容易而無不舒服下外用。本品為一次每單位下，將約0.01至約0.05mL/cm²經人類皮膚之日常外用下，可有效發揮已經生成之肌膚暗黃減低作用。

[實施例10] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將在實施例2至8所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物中任一者0.01質量份及橙皮素0.0001質量份於純化水50質量份中均勻混合，並加熱滅菌後填充於無菌容器中，得到7種類液狀暗黃減低用皮膚外用劑。

本品為實質上無著色、異臭，人類在日常可繼續且容易而無不舒服下外用。本品為一次每單位下，將約0.01至約0.05mL/cm²經人類皮膚之日常外用下，可有效發揮已經生成之肌膚暗黃減低作用。

[實施例11] <暗黃減低用皮膚外用劑>

對於未使用所定還原劑所製造的在實施例1所得之粉末狀糖基橙皮素含有組成物1質量份，選自亞硫酸鈉、次亞硫酸鈉、焦亞硫酸鉀、焦亞硫酸鈉、及二氧化硫的1種或2種以上還原劑以合計下0.0005質量份添加，於純化水50質量份均勻溶解並精密過濾後，填充於無菌容器，得到複數種類之液狀暗黃減低用皮膚外用劑。

本品在室溫至比較的高溫的環境下經數十分鐘至數個月間保存後，亦可使本品所引起的雜味‧著色、臭氣的增大或變化無實質上的認定，其具有優良的保存安 定性及熱安定性。

又，本品為實質上無著色、異臭，人類在日常可繼續且容易而無不舒服下外用。本品為一次每單位下，將約0.01至約0.05mL/cm²經人類皮膚之日常外用下，可有效發揮已經生成之肌膚暗黃減低作用。

[實施例12] <暗黃減低用皮膚外用劑>

將滿足化妝品原料或化妝品規格的以下成分依據以下配合，藉由常法進行混合後製造出8種類噴霧型態之暗黃減低用皮膚外用劑。

<配合>

將本品填充於100mL容噴霧容器中，得到液狀噴霧。本噴霧對於想減低暗黃之所望肌膚部位上，將該適量以每日進行1至5次，連日或隔日之數日至數個月使用後，可有效地減低已經生成之肌膚暗黃，同時對皮膚之水分浸透性亦優良，可保持肌膚之保濕性，且可作為具有清爽性使用感之基礎化妝品使用。又，本噴霧因顯示緩和的清淨作用，故亦可作為低刺激性清淨用噴霧使用。

[產業上可利用性]

本發明之暗黃減低用皮膚外用劑可有效地減低已經生成的肌膚暗黃。作為使用於本發明之暗黃減低用皮膚外用劑之糖基橙皮素，特別使用於使用所定還原劑所調製的糖基橙皮素時，與未使用所定還原劑所調製之過去糖基橙皮素相比，其著色或不舒服的臭氣亦顯著被減低，故在人類之日常上可繼續並安全且容易地使用，且可為無不舒服之外用。如此本發明對於該技術領域上具有遠大的影響力，本發明在產業上可利用性極大。

Claims (15)

1. 一種皮膚外用劑，其特徵為由含有橙皮素及/或糖基橙皮素作為有效成分而成的使用於減低已經生成之肌膚暗黃的皮膚外用劑。
2. 如請求項1之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素為選自橙皮苷、α-糖基橙皮苷及7-O-β-糖基橙皮素的1種或2種以上者。
3. 如請求項1或2之皮膚外用劑，其中α-糖基橙皮苷為α-糖基橙皮苷。
4. 如請求項1至3中任一項之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素為實質上未含有糠醛，於乾燥固體物每單位下，含有糖基橙皮素50質量%以上，未達100質量%者。
5. 如請求項1至4中任一項之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素以GC/MS分析法所測定的糠醛含量為，於乾燥固體物每單位下為未達200ppb之糖基橙皮素。
6. 如請求項1至5中任一項之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素為實質上未含有4-甲氧基苯乙烯者。
7. 如請求項6之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素以GC/MS分析法所測定的4-甲氧基苯乙烯含量為，於乾燥固體物每單位下為未達30ppb者。
8. 如請求項1至7中任一項之皮膚外用劑，其中於乾燥固體物每單位下之α-糖基橙皮苷的含量為50質量%以上，未達100質量%者。
9. 如請求項1至8中任一項之皮膚外用劑，其中糖 基橙皮素在1%水溶液中，將此在密閉容器中以100℃進行30分鐘加熱後，調整為27℃，放入寬1cm的容器(cell)，藉由分光光度計測定於波長420nm及波長720nm中之吸光度時之兩波長中的吸光度差未達0.24。
10. 如請求項1至9中任一項之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素在1w/v%水溶液中，在密閉容器中以100℃進行30分鐘加熱後，在20℃時的電傳導度未達10μS/cm。
11. 如請求項1至10中任一項之皮膚外用劑，其中糖基橙皮素以高頻率誘導結合電漿發光分光分析法進行測定時的組成物之乾燥固體物每單位的鈣、鉀、鎂、及鈉之含量各為1ppm以下、0.1ppm以下、0.2ppm以下及0.4ppm以下者。
12. 如請求項1至11中任一項之皮膚外用劑，其中更含有選自糖質、有機酸及胺基酸的1種或2種以上。
13. 如請求項12之皮膚外用劑，其中有機酸為乳酸、酒石酸、水楊酸、阿魏酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖醛酸內酯、乙酸、山梨酸、安息香酸、甘胺酸及谷胺酸鈉。
14. 如請求項1至13中任一項之皮膚外用劑，其為含有總計的0.0001質量%以上，未達100質量%之橙皮素及/或糖基橙皮素而成者。
15. 如請求項1至14中任一項之皮膚外用劑，其為錠劑、顆粒劑、粉劑、噴霧劑、懸浮劑、糊狀劑、凝膠狀劑或液劑之形態者。