TW201706301A - 利用雙特異性ｃｄ３３及ｃｄ３結合蛋白之方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述特異性結合至人類CD33之結合蛋白，及特別是特異性結合至人類CD33及人類CD3之雙特異性結合蛋白。本文亦描述結合至CD33及CD3之雙特異性串聯雙功能抗體(diabodies)及其等用於CD33+癌症、疾病及病症(諸如急性骨髓性白血病(AML))之免疫療法之用途。

Description

利用雙特異性CD33及CD3結合蛋白之方法
急性骨髓性白血病(AML)係成人及兒童中之急性白血病。CD33係於AML中之大多數骨髓母細胞上表現。CD33(在一些報告中)通常侷限於早期多譜系骨髓祖細胞且在正常多潛能造血幹細胞中不存在。
本文提供特異性結合至人類CD33之結合蛋白，及提供特異性結合至人類CD33及人類CD3之雙特異性結合蛋白。本文亦提供用於產生許多雙特異性CD33/CD3結合蛋白(諸如串聯雙功能抗體(diabodies))之抗CD33可變域及抗CD3可變域。本文亦進一步提供結合至CD33及CD3之雙特異性串聯雙功能抗體及其等用於急性骨髓性白血病(AML)及其他血液惡性腫瘤、疾病或病症之免疫療法之用途。
特定言之，提供顯示結合至人類及食蟹猴CD33兩者之結合蛋白。以實例證實此等CD33/CD3串聯雙功能抗體可重定向來自健康供體之多株CD3+ T細胞及來自AML病患之自體T細胞從而以低E：T細胞比率有效溶解CD33+ AML細胞。在取決於CD33+靶細胞及T細胞兩者之存在之此過程中，經重定向之T細胞經活化(如藉由誘導CD25及CD69顯示)且經刺激以增殖。顯示此等串聯雙功能抗體之抗AML效應取決於所用抗體之濃度及E：T細胞比率。該串聯雙功能抗體係四價的且具有兩個CD33結合位點及兩個CD3結合位點。本文描述之 CD33/CD3串聯雙功能抗體之特定特徵係其等由於賦予對各抗原(即，CD33及CD3)之結合性之二價結合而促進強效及高效之細胞凋亡。
總而言之，所提供之本文描述之CD33/CD3結合蛋白(特定言之，串聯雙功能抗體)包括活體外CD33+白血病細胞及原代AML細胞之強效細胞溶解。呈串聯雙功能抗體之抗體形式之雙特異性CD33/CD3結合蛋白之實例在細胞系(原代AML細胞)中及在具有AML細胞系及具有病患衍生之原代AML細胞之活體內模型中證實活體內細胞溶解活性。此指示在嚴格之AML PDX模型中，高活體內活性尤其值得注意。此外，呈串聯雙功能抗體之抗體形式之雙特異性CD33/CD3結合蛋白之實例在來自處於AML之所有階段之病患(包括新診斷之病患、復發性病患及難治性病患)之樣品中證實活體外細胞溶解活性。
此外，本文描述之此等CD33/CD3結合蛋白能夠在約四小時內達成CD33表現細胞之顯著溶解。CD33/CD3結合蛋白因此在細胞表面上之低CD33密度下顯示高細胞毒性及在低效應細胞：靶細胞(E：T)比率下顯示高細胞毒性。另外，本文描述之CD33/CD3結合蛋白不僅顯示對人類蛋白之強效CD33及CD3結合親和力，但亦顯示與各自食蟹猴蛋白之極佳交叉反應性(例如以5至0.2之人類：食蟹猴KD比率)。此外，本文描述之CD33/CD3結合蛋白顯示在缺乏CD33+靶細胞之情況下不顯著誘導細胞介素釋放，此係此等分子之安全概況之基本要素。此外，本文描述之CD33/CD3串聯雙功能抗體屬於具有在8至24h之近似範圍(其應容許方便之給藥)內之半衰期之分子之類別。
在一個態樣中，本文提供特異性結合至人類CD33之抗原決定基之CD33結合蛋白。在一些實施例中，該等結合蛋白包含衍生自人類之重鏈可變域及輕鏈可變域。
在一些實施例中，CD33結合蛋白具有至少一個包含輕鏈可變域及重鏈可變域之結合位點，其中該輕鏈可變域包含由選自由SEQ ID NO：21至27組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：28至34組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：35至41組成之群之序列組成之CDR3。
在一些實施例中，CD33結合蛋白具有至少一個包含輕鏈可變域及重鏈可變域之結合位點，其中該重鏈可變域包含由選自由SEQ ID NO：42至48組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：49至55組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：56至63組成之群之序列組成之CDR3。
在某些實例中，該輕鏈可變域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：21、28及35；SEQ ID NO：22、29及36；SEQ ID NO：23、30及37；SEQ ID NO：24、31及38；SEQ ID NO：25、32及39；SEQ ID NO：26、33及40；及SEQ ID NO：27、34及41。
在某些實例中，該重鏈可變域之CDR1、CDR2及CD3係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：42、49及56；SEQ ID NO：43、50及57；SEQ ID NO：43、50及58；SEQ ID NO：43、50及59；SEQ ID NO：43、50及60；SEQ ID NO：44、51及61；SEQ ID NO：45、52及62；SEQ ID NO：46、53及63；SEQ ID NO：47、54及63；及SEQ ID NO：48、55及63。
在某些實例中，可變重鏈域及可變輕鏈域之人類CD33結合位點係選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19；及SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：20。
在一些實施例中，該CD33抗原決定基係在人類CD33之 62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內。
在上文實施例之任何一者中，該CD33結合蛋白包含至少一個其他功能域。在一些實例中，該功能域係結合至效應細胞之效應域。在某些實例中，該效應域係包含形成人類CD3抗原結合位點之至少一個抗體可變重鏈域及至少一個可變輕鏈域之CD3結合位點。
在某些實例中，該CD3結合位點包含重鏈可變域，該重鏈可變域包含STYAMN(SEQ ID NO：72)之CDR1序列、RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：73)之CDR2序列及HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：74)之CDR3序列。在其他實例中，該CD3結合位包含輕鏈可變域，該輕鏈可變域包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：90)之CDR1序列、GTNKRAP(SEQ ID NO：91)之CDR2序列及ALWYSNL(SEQ ID NO：92)之CDR3序列。
在某些實例中，該CD3結合位點包含SEQ ID NO：64之重鏈可變域及SEQ ID NO：68之可變輕鏈域；SEQ ID NO：65之重鏈可變域及SEQ ID NO：69之可變輕鏈域；SEQ ID NO：66之重鏈可變域及SEQ ID NO：70之可變輕鏈域；或SEQ ID NO：67之重鏈可變域及SEQ ID NO：71之可變輕鏈域。
在上文實施例之任何一者中，該CD33結合蛋白係二聚蛋白。在上文實施例之任何一者中，該CD33結合蛋白係多功能的。
在某些實例中，該多功能CD33結合蛋白具有針對CD33及CD3之雙特異性，其中該等結合特異性係藉由針對CD33及CD3之選自由以下組成之群之重鏈可變域及輕鏈可變域提供：SEQ ID NO：2、12、65及69；SEQ ID NO：3、13、65及69；SEQ ID NO：4、14、65及69；SEQ ID NO：5、15、65及69；SEQ ID NO：1、11、64及68；SEQ ID NO：2、12、64及68；SEQ ID NO：2、12、66及70；SEQ ID NO：4、 14、66及70；SEQ ID NO：5、15、66及70；SEQ ID NO：3、13、64及68；SEQ ID NO：3、13、67及71；SEQ ID NO：4、14、64及68；SEQ ID NO：5、15、64及68；SEQ ID NO：7、17、64及68；SEQ ID NO：6、16、64及68；SEQ ID NO：6、16、67及71；SEQ ID NO：8、18、64及68；SEQ ID NO：9、19、64及68；SEQ ID NO：9、19、67及71；及SEQ ID NO：10、20、64及68。
在另一態樣中，本文提供對人類CD3及人類CD33具有特異性之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體。在一些實施例中，該等串聯雙功能抗體包含第一多肽及第二多肽，各多肽具有至少四個彼此相連之可變鏈域，其中各多肽包含對人類CD33具有特異性之可變重鏈域；對人類CD33具有特異性之可變輕鏈域；對人類CD3具有特異性之可變重鏈域及對人類CD3具有特異性之可變輕鏈域且其中在各多肽中，該等四個可變鏈域藉由肽連接子L1、L2及L3按以下順序彼此相連：VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3)；VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3)；VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33)；或VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)。
在一些實施例中，對人類CD33具有特異性之VL域包含由選自由SEQ ID NO：21至27組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：28至34組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：35至41組成之群之序列組成之CDR3。
在一些實施例中，對人類CD33具有特異性之VH域包含由選自由SEQ ID NO：42至48組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：49至55組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：56至63組成之群之序列組成之CDR3。
在一些實施例中，對人類CD33具有特異性之VL域之CDR1、 CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：21、28及35；SEQ ID NO：22、29及36；SEQ ID NO：23、30及37；SEQ ID NO：24、31及38；SEQ ID NO：25、32及39；SEQ ID NO：26、33及40；及SEQ ID NO：27、34及41。
在一些實施例中，對人類CD33具有特異性之VH域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：42、49及56；SEQ ID NO：43、50及57；SEQ ID NO：43、50及58；SEQ ID NO：43、50及59；SEQ ID NO：43、50及60；SEQ ID NO：44、51及61；SEQ ID NO：45、52及62；SEQ ID NO：46、53及63；SEQ ID NO：47、54及63；及SEQ ID NO：48、55及63。
在一些實施例中，對CD33具有特異性之VL及VH域係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19；及SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：20。
在一些實施例中，對人類CD3具有特異性之VH域包含STYAMN(SEQ ID NO：72)之CDR1序列、RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：73)之CDR2序列及HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：74)或HGNFGNSYVSYFAY(SEQ ID NO：75)之CDR3序列。
在一些實施例中，對人類CD3具有特異性之VL域包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：90)之CDR1序列、GTNKRAP(SEQ ID NO：91)之CDR2序列及ALWYSNL(SEQ ID NO：92)之CDR3序列。
在一些實施例中，對CD3具有特異性之VL及VH域係選自由以下各物組成之群之序列：SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：70；及SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：71。
在一些實施例中，各多肽包含四個選自由以下組成之群之可變鏈域：SEQ ID NO：2、12、65及69；SEQ ID NO：3、13、65及69；SEQ ID NO：4、14、65及69；SEQ ID NO：5、15、65及69；SEQ ID NO：1、11、64及68；SEQ ID NO：2、12、64及68；SEQ ID NO：2、12、66及70；SEQ ID NO：4、14、66及70；SEQ ID NO：5、15、66及70；SEQ ID NO：3、13、64及68；SEQ ID NO：3、13、67及71；SEQ ID NO：4、14、64及68；SEQ ID NO：5、15、64及68；SEQ ID NO：7、17、64及68；SEQ ID NO：6、16、64及68；SEQ ID NO：6、16、67及71；SEQ ID NO：8、18、64及68；SEQ ID NO：9、19、64及68；SEQ ID NO：9、19、67及71；及SEQ ID NO：10、20、64及68。
在一些實施例中，連接子L1、L2及L3由約12個或更少之胺基酸殘基組成。在某些實例中，連接子L1、L2及L3各獨立地係GGSGGS(SEQ ID NO：95)、GGSG(SEQ ID NO：96)或GGSGG(SEQ ID NO：97)。在其他實例中，連接子L1及L3係GGSGGS(SEQ ID NO：95)且連接子L2係GGSG(SEQ ID NO：96)或GGSGG(SEQ ID NO：97)。
在一些實施例中，具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之雙特異性串聯雙功能抗體包含選自由SEQ ID NO：98至121組成之群之序列。在其他實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：98)、02(SEQ ID NO：99)、03(SEQ ID NO：100)、04(SEQ ID NO：101)、05(SEQ ID NO：102)、06(SEQ ID NO：103)、07(SEQ ID NO：104)、08(SEQ ID NO：105)、09(SEQ ID NO：106)、10(SEQ ID NO：107)、11(SEQ ID NO：108)、12(SEQ ID NO：109)、13(SEQ ID NO：110)、14(SEQ ID NO：111)、15(SEQ ID NO：112)、16(SEQ ID NO：113)、17(SEQ ID NO：114)、18(SEQ ID NO：115)、19(SEQ ID NO：116)、20(SEQ ID NO：117)、21(SEQ ID NO：118)、22(SEQ ID NO：119)、23(SEQ ID NO：120)或24(SEQ ID NO：121)。
在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體包含選自由SEQ ID NO：123至146組成之群之序列。在其他實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)、02(SEQ ID NO：124)、03(SEQ ID NO：125)、04(SEQ ID NO：126)、05(SEQ ID NO：127)、06(SEQ ID NO：128)、07(SEQ ID NO：129)、08(SEQ ID NO：130)、09(SEQ ID NO：131)、10(SEQ ID NO：132)、11(SEQ ID NO：133)、12(SEQ ID NO：134)、13(SEQ ID NO：135)、14(SEQ ID NO：136)、15(SEQ ID NO：137)、16(SEQ ID NO：138)、17(SEQ ID NO：139)、18(SEQ ID NO：140)、19(SEQ ID NO：141)、20(SEQ ID NO：142)、21(SEQ ID NO：143)、22(SEQ ID NO：144)、23(SEQ ID NO：145)或24(SEQ ID NO：146)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體02(SEQ ID NO：124)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體03(SEQ ID NO：125)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體04(SEQ ID NO：126)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體05(SEQ ID NO：127)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體06(SEQ ID NO：128)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體07(SEQ ID NO：129)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體08(SEQ ID NO：130)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體09(SEQ ID NO：131)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體10(SEQ ID NO：132)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體11(SEQ ID NO： 133)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體12(SEQ ID NO：134)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體13(SEQ ID NO：135)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體14(SEQ ID NO：136)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體15(SEQ ID NO：137)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體16(SEQ ID NO：138)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體17(SEQ ID NO：139)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體18(SEQ ID NO：140)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體19(SEQ ID NO：141)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體20(SEQ ID NO：142)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體21(SEQ ID NO：143)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體22(SEQ ID NO：144)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體23(SEQ ID NO：145)。在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體24(SEQ ID NO：146)。
在一些實施例中，該等雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體對選自HL-60、KG-1及U-937之CD33+腫瘤細胞上之CD33具有50nM或更小之結合KD。在一些實施例中，該等雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體具有對選自HL-60、KG-1及U-937之CD33+腫瘤細胞上之CD33具有10nM或更小之結合KD。在一些實施例中，該等雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體對CD33+ HL-60腫瘤細胞上之CD33具有15nM或更小之結合KD。
在一些實施例中，該等雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體特異性結合至人類CD33之抗原決定基，其係在人類CD33之 62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內。
在另一態樣中，本文提供編碼上文實施例中任一項之CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體之多核苷酸。在另一態樣中，本文提供包含所描述之多核苷酸之載體。在另一態樣中，本文提供經所描述之載體轉形之宿主細胞。
在又另一態樣中，本文提供包含上文實施例中任一項之CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。
在又另一態樣中，本文提供產生上文實施例中任一項之CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體之方法，該方法包括將編碼上文實施例中任一項之CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體之多核苷酸或包含所描述之多核苷酸之載體引入宿主細胞內，在使該CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體表現之條件下培養該宿主細胞，及純化該經表現之CD33結合蛋白或雙特異性串聯雙功能抗體。
本文亦提供用於治療CD33+癌症之方法，該等方法包括向患有CD33+癌症之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙功能抗體。在一些實施例中，該CD33+癌症係急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、前體B細胞淋巴母細胞白血病、髓樣肉瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴瘤、急性淋巴母細胞淋巴瘤或慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。在一些實施例中，該CD33+癌症係急性骨髓性白血病(AML)。在一些實施例中，該CD33+癌症係多發性骨髓瘤。在一些實施例中，該CD33+癌症係急性淋巴母細胞白血病(ALL)。
本文亦提供用於治療急性骨髓性白血病(AML)之方法，該等方法包括向患有AML之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙 功能抗體。在一些實施例中，該AML係具有復發性基因異常之AML、具有與骨髓發育不良相關聯之變化之AML、與療法相關聯之骨髓腫瘤、髓樣肉瘤、與唐氏症侯群相關聯之骨髓增殖、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或不另外分類之AML。在一些實施例中，該AML係AML-M0、AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5、AML-M6或AML-M7。在其他實施例中，該AML係新診斷、復發性或難治性。
本文亦提供用於治療骨髓發育不良症候群(MDS)之方法，該等方法包括向患有MDS之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙功能抗體。
本文亦提供用於治療骨髓增生性疾病(MPD)之方法，該等方法包括向患有MPD之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙功能抗體。
本文亦提供用於治療慢性骨髓單核球性白血病(CMML)之方法，該等方法包括向患有CMML之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙功能抗體。
本文亦提供用於藉由髓源性抑制細胞(MDSC)治療免疫抑制之方法，該等方法包括向患有免疫抑制之個體投與上文實施例中任一項之雙特異性串聯雙功能抗體。
在上文用於治療之方法中，在某些實例中，該等方法進一步包括投與阿糖胞苷(cytarabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、地西他濱(decitabine)、蒽環類抗生素(anthracycline)(例如，道諾黴素(daunorubicin)、伊達比星(idarubicin)、多柔比星(doxorubicin)及類似物)、安吖啶(amsacrine)、氟達拉濱(fludarabine)、氯法拉濱(clofarabine)、克拉屈濱(cladribine)、奈拉濱(nelarabine)、胺甲喋呤(methotrexate)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、黴法 蘭(melphalan)、依魯替尼(ibrutinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、阿普斯特(apremilast)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(例如，依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)及類似物)、蒽二酮(anthracenedione)(例如，米托蒽醌(mitoxantrone)、馬來酸匹杉瓊(pixantrone)、洛索蒽醌(losoxantrone)、吡咯蒽醌(piroxantrone)、阿美蒽醌(ametantrone)及類似物)、抗CD20劑(例如，利妥昔單抗(rituximab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧法木單抗(ofatumumab)及類似物)或其組合。
本文提供用於治療已接受造血幹細胞移植之病患中之急性骨髓性白血病(AML)之方法，該等方法包括投與治療有效量之結合至人類CD33及人類CD3之蛋白質。在一些實施例中提供方法，其中該移植係同種異體移植。在一些實施例中提供方法，其中該移植係自體移植。在一些實施例中提供方法，其中該病患未接受調節方案。在一些實施例中提供方法，該等方法進一步包括向該病患投與調節方案。在一些實施例中提供方法，其中該調節方案係清髓性調節方案。在一些實施例中提供方法，其中該調節方案係非清髓性調節方案。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在該調節方案後投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該病患係完全緩解。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該病患患有微量殘餘疾病。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該病患經歷了失敗的化學療法或放射療法。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該病患經歷了失敗的誘導化學療法。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該病患經歷了失敗的鞏固或維持(緩解後)化學療法。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該AML係復發性。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該AML係難治性。在上 文實施例之任何一者中提供方法，其中該AML係高風險的且處於緩解中。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後立即投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後三天投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後七天投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後兩週投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後四週投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係投與選自由以下組成之群之一段時間：四週、八週、三個月、四個月、六個月、八個月、十個月、十二個月、十八個月及二十四個月。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在同種異體移植進展時與供體淋巴球一起投與。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係在同種異體移植進展時投與，且不投與供體淋巴球。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質包含對人類CD33及人類CD3具有特異性之重鏈域及輕鏈域。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係抗體或抗體衍生物。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質包含Fab、Fab’或F(ab’)2片段。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係單鏈Fv、串聯單鏈Fv、雙特異性T細胞接合子、雙重親和力重靶向抗體、雙功能抗體或雙特異性串聯雙功能抗體。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該蛋白質係雙特異性串聯雙功能抗體。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該串聯雙功能抗體包含第一多肽及第二多肽，各多肽具有至少四個彼此相連之可變鏈域，其中各多肽包含對人類CD33具有特異性之可變重鏈(VH)域；對人類CD33具有特異性之可變輕鏈(VL)域；對人類CD3具有特異性之VH域及對人類CD3具有特 異性之VL域。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中在各多肽中，該等四個可變鏈域係藉由肽連接子L1、L2及L3按以下順序彼此相連：VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3)；VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3)；VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33)；或VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對人類CD33具有特異性之VL域包含由選自由SEQ ID NO：21至27組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：28至34組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：35至41組成之群之序列組成之CDR3。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對人類CD33具有特異性之VH域包含由選自由SEQ ID NO：42至48組成之群之序列組成之CDR1、由選自由SEQ ID NO：49至55組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：56至63組成之群之序列組成之CDR3。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對人類CD33具有特異性之VL域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：21、28及35；SEQ ID NO：22、29及36；SEQ ID NO：23、30及37；SEQ ID NO：24、31及38；SEQ ID NO：25、32及39；SEQ ID NO：26、33及40；及SEQ ID NO：27、34及41。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對CD33具有特異性之VH域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：42、49及56；SEQ ID NO：43、50及57；SEQ ID NO：43、50及58；SEQ ID NO：43、50及59；SEQ ID NO：43、50及60；SEQ ID NO：44、51及61；SEQ ID NO：45、52及62；SEQ ID NO：46、53及63；SEQ ID NO：47、54及63；及SEQ ID NO：48、55及63。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對CD33具有特異性之VL及VH域係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19；及SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：20。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對人類CD3具有特異性之VH域包含STYAMN(SEQ ID NO：72)之CDR1序列、RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：73)之CDR2序列及HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：74)或HGNFGNSYVSYFAY(SEQ ID NO：75)之CDR3序列。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對人類CD3具有特異性之VL域包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：90)之CDR1序列、GTNKRAP(SEQ ID NO：91)之CDR2序列及ALWYSNL(SEQ ID NO：92)之CDR3序列。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中對CD3具有特異性之VL及VH域係選自由以下組成之群之序列：SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：68；SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：70；及SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：71。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中各多肽包含四個選自由以下組成之群之可變鏈域：SEQ ID NO：2、12、65及69；SEQ ID NO：3、13、65及69；SEQ ID NO：4、14、65及69；SEQ ID NO：5、15、65及69；SEQ ID NO：1、11、64及68；SEQ ID NO：2、12、64及68；SEQ ID NO：2、12、66及70；SEQ ID NO：4、14、66及70；SEQ ID NO：5、15、66及70；SEQ ID NO：3、13、64及68；SEQ ID NO：3、13、67及71；SEQ ID NO：4、14、64及68；SEQ ID NO：5、15、64及68；SEQ ID NO：7、17、64及68；SEQ ID NO：6、16、64及68；SEQ ID NO：6、16、67及71；SEQ ID NO：8、18、64及68；SEQ ID NO：9、19、64及68；SEQ ID NO：9、19、67及71；及SEQ ID NO：10、20、64及68。在上文實施例之任何 一者中提供方法，其中連接子L1、L2及L3由約12個或更少之胺基酸殘基組成。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中連接子L1、L2及L3係各獨立地選自GGSGGS(SEQ ID NO：95)、GGSG(SEQ ID NO：96)或GGSGG(SEQ ID NO：97)。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體具有選自由SEQ ID NO：98至121組成之群之序列。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：98)、02(SEQ ID NO：99)、03(SEQ ID NO：100)、04(SEQ ID NO：101)、05(SEQ ID NO：102)、06(SEQ ID NO：103)、07(SEQ ID NO：104)、08(SEQ ID NO：105)、09(SEQ ID NO：106)、10(SEQ ID NO：107)、11(SEQ ID NO：108)、12(SEQ ID NO：109)、13(SEQ ID NO：110)、14(SEQ ID NO：111)、15(SEQ ID NO：112)、16(SEQ ID NO：113)、17(SEQ ID NO：114)、18(SEQ ID NO：115)、19(SEQ ID NO：116)、20(SEQ ID NO：117)、21(SEQ ID NO：118)、22(SEQ ID NO：119)、23(SEQ ID NO：120)或24(SEQ ID NO：121)。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該串聯雙功能抗體具有選自由SEQ ID NO：123至146組成之群之序列。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)、02(SEQ ID NO：124)、03(SEQ ID NO：125)、04(SEQ ID NO：126)、05(SEQ ID NO：127)、06(SEQ ID NO：128)、07(SEQ ID NO：129)、08(SEQ ID NO：130)、09(SEQ ID NO：131)、10(SEQ ID NO：132)、11(SEQ ID NO：133)、12(SEQ ID NO：134)、13(SEQ ID NO：135)、14(SEQ ID NO：136)、15(SEQ ID NO：137)、16(SEQ ID NO：138)、17(SEQ ID NO：139)、18(SEQ ID NO：140)、19(SEQ ID NO：141)、20(SEQ ID NO：142)、21(SEQ ID NO：143)、22(SEQ ID NO：144)、23(SEQ ID NO：145)或24(SEQ ID NO：146)。
在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該方法進一步包括投與阿糖胞苷、阿紮胞苷、地西他濱、蒽環類抗生素、氟達拉濱、氯法拉濱、克拉屈濱、奈拉濱、胺甲喋呤、硼替佐米、卡非佐米、黴法蘭、依魯替尼、沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺、阿普斯特、表鬼臼毒素、蒽二酮、抗CD20劑或其組合。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該AML係具有復發性基因異常之AML、具有與骨髓發育不良相關聯之變化之AML、與療法相關聯之骨髓腫瘤、髓樣肉瘤、與唐氏症侯群相關聯之骨髓增殖、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或不另外分類之AML。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中該AML係AML-M0、AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5、AML-M6或AML-M7。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中在接受清髓性調節方案後在已接受同種異體造血幹細胞移植之病患中投與該蛋白質導致對使用該蛋白質之療法之經改善之整體反應速率。在上文實施例之任何一者中提供方法，其中在接受非清髓性調節方案後在已接受同種異體造血幹細胞移植之病患中投與該蛋白質導致對使用該蛋白質之療法之經改善之整體反應速率。
[參引合併]
本說明書中提及之所有公開案、專利案及專利申請案以引用之方式全部併入本文中，該引用之程度就如同各公開案、專利案或專利申請案明確地及個別地指示以引用之方式併入一般。
以隨附申請專利範圍中之特殊性闡述本發明之新穎特徵。藉由參考闡述其中利用本發明之原理之說明性實施例之下列詳細描述及具有以下說明之隨附圖式將獲得對本發明之特徵及優點之更好瞭解：圖1 CD3/CD33串聯雙功能抗體(TandAb®)之基因組織及域順序之示意性代表圖。串聯雙功能抗體表示為由四個經由短肽連接子L1、 L2及L3連接之可變域組成之單一多肽。表現後，兩個單體多肽首尾非共價連接以形成功能同源二聚串聯雙功能抗體分子。L1、L2、L3：連接子；VH：重鏈可變域；VL：輕鏈可變域。
圖2 CD3接合串聯雙功能抗體及其作用模式。串聯雙功能抗體係經由結合至CD3而可接合細胞毒性T細胞之四價雙特異性蛋白。該串聯雙功能抗體使用四個結合域中之兩者結合至CD33+腫瘤細胞及使用另外兩個結合域結合至CD3。此T細胞/靶細胞結合(交聯)事件促進T細胞之活化且經由ADCC促進腫瘤細胞之後續破壞。
圖3 CD33/CD3串聯雙功能抗體之域順序變體。編碼串聯雙功能抗體之基因序列內之可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)之域順序之變化容許產生具有位於該分子之內部或外部上之CD33及CD3特異性之抗體。指示域特異性、訊息序列(ss)及連接子(L1、L2、L3)及親和標誌(His)之位置以及5'-及3'-末端。
圖4 陽性富集相比於陰性選擇之健康供體T細胞之比較。如圖指示，KG-1a細胞用10pM(約1ng/mL)及25pM(約2.5ng/mL)之10種經選擇之串聯雙功能抗體中之一者及陰性選擇之健康供體T細胞或陽性選擇之健康供體T細胞以1：1或3：1之E：T細胞比率進行培養。48小時後，測定細胞計數並使用DAPI染色評估細胞毒性。結果顯示為來自3個在一式兩份孔中進行之獨立實驗之死細胞之百分率(上圖)及特異性細胞毒性之百分率(下圖)之平均值±SEM。
圖5 分析策略。自一個健康供體T細胞等分試樣及1種典型AML細胞系(HL-60)及原代AML樣本(AMP002)繪製之散射及直方圖，各者圖解說明致力測定串聯雙功能抗體誘導之細胞毒性之策略。FSC(前向散射)；SSC(側向散射)。
圖6 對CD33+ AML細胞系進行之篩選細胞毒性分析。如圖指示，親代HL-60(A、B)及KG-1a(C、D)細胞用10pM(約1ng/mL)及25 pM(約2.5ng/mL)之22種CD33/CD3串聯雙功能抗體分子中之一者或非結合對照串聯雙功能抗體(00)及健康供體T細胞以1：1(A、C)或5：1(B、D)之E：T細胞比率培養。48小時後，測定細胞計數並用DAPI染色評估細胞毒性以量化藥物-特異性細胞毒性。結果顯示為來自3個在一式兩份孔中進行之獨立實驗之DAPI+細胞之百分率之平均值±SEM。當細胞毒性表示為特異性細胞毒性之百分率時獲得定性類似結果。
圖7 選擇原代AML樣本以用於研究。獲得來自總計原代人類AML樣本之冰凍等分試樣以用於分析。藉由流動式細胞測量術基於CD45/側向散射性質測定解凍時之AML母細胞之百分率。經由流動式細胞測量術使用DAPI作為活/死細胞標誌物在解凍時及48小時後於含有細胞介素之液體培養物(不添加串聯雙功能抗體分子或健康供體T細胞)中測定該樣本之存活率。針對所有樣本(其具有>58% AML母細胞)繪製用於解凍後及48小時後之存活率之結果。正方形：於含有細胞介素之液體培養物中在解凍時顯示>50%及48小時後顯示>50%之存活率之原代AML樣本，其包括於最終分析中。
圖8 原代AML樣本中串聯雙功能抗體誘導之細胞毒性。如圖指示，原代AML樣本用2.5pM(約250pg/mL)、10pM(約1ng/mL)及25pM(約2.5ng/mL)之9種串聯雙功能抗體分子中之一者及不添加健康供體T細胞(A)或添加健康供體T細胞以1：3(B)或1：1(C)之E：T細胞比率來培養。48小時後，測定細胞計數並用DAPI染色評估細胞毒性以定量藥物-特異性細胞毒性。結果顯示為來自在一式兩份孔中進行之實驗之特異性細胞毒性之百分率之平均值±SEM。
圖9 人類CD33之細胞外域之胺基酸序列(aa 18至259)(SEQ ID NO：93)；圖10 胺基酸序列
(A)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體1之完整序 列(SEQ ID NO：98)；(B)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體2之完整序列(SEQ ID NO：99)；(C)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體3之完整序列(SEQ ID NO：100)；(D)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體4之完整序列(SEQ ID NO：101)；(E)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體5之完整序列(SEQ ID NO：102)；(F)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體6之完整序列(SEQ ID NO：103)；(G)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體7之完整序列(SEQ ID NO：104)；(H)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體8之完整序列(SEQ ID NO：105)；(I)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體9之完整序列(SEQ ID NO：106)；(J)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體10之完整序列(SEQ ID NO：107)；(K)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體11之完整序列(SEQ ID NO：108)；(L)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體12之完整序列(SEQ ID NO：109)；(M)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體13之完整序列(SEQ ID NO：110)；(N)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體14之完整序 列(SEQ ID NO：111)；(O)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體15之完整序列(SEQ ID NO：112)；(P)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體16之完整序列(SEQ ID NO：113)；(Q)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體17之完整序列(SEQ ID NO：114)；(R)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體18之完整序列(SEQ ID NO：115)；(S)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體19之完整序列(SEQ ID NO：116)；(T)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體20之完整序列(SEQ ID NO：117)；(U)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體21之完整序列(SEQ ID NO：118)；(V)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體22之完整序列(SEQ ID NO：119)；(W)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體23之完整序列(SEQ ID NO：120)；及(X)具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體24之完整序列(SEQ ID NO：121)。加下劃線之序列表示連接子L1、L2及L3。
圖11 胺基酸序列
(A)串聯雙功能抗體1之完整序列(SEQ ID NO：123)；(B)串聯雙功能抗體2之完整序列(SEQ ID NO：124)；(C)串聯雙功能抗體3之完整序列(SEQ ID NO：125)；(D)串聯雙功能抗體4之完整序列(SEQ ID NO：126)； (E)串聯雙功能抗體5之完整序列(SEQ ID NO：127)；(F)串聯雙功能抗體6之完整序列(SEQ ID NO：128)；(G)串聯雙功能抗體7之完整序列(SEQ ID NO：129)；(H)串聯雙功能抗體8之完整序列(SEQ ID NO：130)；(I)串聯雙功能抗體9之完整序列(SEQ ID NO：131)；(J)串聯雙功能抗體10之完整序列(SEQ ID NO：132)；(K)串聯雙功能抗體11之完整序列(SEQ ID NO：133)；(L)串聯雙功能抗體12之完整序列(SEQ ID NO：134)；(M)串聯雙功能抗體13之完整序列(SEQ ID NO：135)；(N)串聯雙功能抗體14之完整序列(SEQ ID NO：136)；(O)串聯雙功能抗體15之完整序列(SEQ ID NO：137)；(P)串聯雙功能抗體16之完整序列(SEQ ID NO：138)；(Q)串聯雙功能抗體17之完整序列(SEQ ID NO：139)；(R)串聯雙功能抗體18之完整序列(SEQ ID NO：140)；(S)串聯雙功能抗體19之完整序列(SEQ ID NO：141)；(T)串聯雙功能抗體20之完整序列(SEQ ID NO：142)；(U)串聯雙功能抗體21之完整序列(SEQ ID NO：143)；(V)串聯雙功能抗體22之完整序列(SEQ ID NO：144)；(W)串聯雙功能抗體23之完整序列(SEQ ID NO：145)；及(X)串聯雙功能抗體24之完整序列(SEQ ID NO：146)。加下劃線之序列表示連接子L1、L2及L3。
圖12 串聯雙功能抗體16及12對NOD/scid小鼠中之HL-60細胞之生長之影響。藉由在第0天皮下注射4x106個HL-60細胞之懸浮液對八個免疫缺陷NOD/scid小鼠之實驗組進行異種移植。注射前，使HL-60細胞與來自健康供體之3x106個經純化之T細胞混合。經腫瘤細胞及T細胞移植之實驗組之所有動物在第0、1、2、3及4天接受在所指示之 三個不同劑量水平(0.1μg、1μg及10μg)下的媒劑(對照)或串聯雙功能抗體16或12之靜脈內推注。一個無效應細胞及媒劑治療之組充當額外陰性對照。
圖13 在AML異種移植模型中串聯雙功能抗體16之抗腫瘤活性。對NOD/scid小鼠進行亞致死照射(2 Gy)並皮下接種4x106個HL-60細胞。在第9天，該等動物接受抗去唾液酸GM1兔Ab之單一推注。當腫瘤在第10天達成50至150mm3(平均值73±11mm3)之體積時，將動物分配至3個治療組。組2及組3(n=8)腹腔內注射1.5x107個經擴增及經活化之人類T細胞。第13天至第21天(qdxd9)，動物在側尾靜脈內接受串聯雙功能抗體16(組3)或媒劑(組1及組2)。
圖14 在用5μg(0.25mg/kg)或50μg(2.5mg/kg)CD33/CD3串聯雙功能抗體12及16治療後第38天，NSG小鼠之骨髓(BM)及脾臟中之人類AML母細胞之相對量(A)及絕對計數(B)。
圖15 CD33/CD3串聯雙功能抗體16介導之靶細胞溶解之動力學。將1x104個經鈣黃綠素標記之HL-60靶細胞與作為效應細胞之原代人類T細胞以25：1之E：T比率在串聯雙功能抗體16之連續稀釋液之存在下或無抗體(w/o)之情況下培養30min、1h、2h、3h、4h或5h。在各時間點，使用自經溶解之靶細胞釋放之螢光鈣黃綠素以計算特異性溶解。對三次重複之平均值及SD作圖。
圖16 CD33/CD3串聯雙功能抗體16之EC50及特異性溶解值之動力學。EC50值(黑色實心圓)及串聯雙功能抗體16介導之靶細胞溶解(空心正方形)係在釋放鈣黃綠素之細胞毒性分析中在指示之培養時間下藉由非線性回歸/s形劑量-反應測定且對其等作圖。
圖17 在新診斷、復發性及難治性AML病患樣品中之細胞毒性活性。
根據第一態樣，本文描述對至少CD33(較佳人類CD33)具有特異性之結合蛋白。在一些實施例中，該等CD33結合蛋白對人類及食蟹猴CD33具有特異性(即，係交叉反應性的)。在一些實施例中，此等交叉反應性結合蛋白以類似之親和力結合至人類及食蟹猴CD33。
CD33表現於骨髓細胞上，例如，諸如急性骨髓性白血病(AML)之母細胞。就對CD33(諸如人類CD33)具有特異性之抗體域之分離而言，可篩選抗體庫。例如IgM噬菌體顯示庫可藉由採用(例如)含有人類CD33之細胞外域之胺基酸1至243(圖9，SEQ ID NO：93)之重組CD33-Fc融合蛋白進行篩選。
在一些實施例中，該CD33結合蛋白具有至少一個包含輕鏈可變域及重鏈可變域之CD33結合位點。該輕鏈可變域包含輕鏈CDR1、CDR2及CDR3及該重鏈可變域包含重鏈CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，此等輕鏈CDR(CDR1、CDR2及CDR3)係選自顯示於表1(SEQ ID NO：21至41)中之人類CDR序列。在某些實例中，該輕鏈CDR1係選自SEQ ID NO：21至27。在某些實例中，該輕鏈CDR2係選自SEQ ID NO：28至34。在某些實例中，該輕鏈CDR3係選自SEQ ID NO：35至41。
在一些實施例中，此等重鏈CDR(重鏈CDR1、CDR2及CDR3)係選自顯示於表2(SEQ ID NO：42至63)中之人類CDR序列。在某些實例中，該重鏈CDR1係選自SEQ ID NO：42至48。在某些實例中，該重鏈CDR2係選自SEQ ID NO：49至55。在某些實例中，該重鏈CDR3係選自SEQ ID NO：56至63。
在一些實施例中，選擇無各自可變域之周圍框架序列之輕鏈及重鏈CDR，其等包括來自其他免疫球蛋白或一致框架區之框架序列，視需要經進一步突變及/或經其他合適之框架序列置換。因此本文在一些實施例中提供包含輕鏈可變域之CD33結合蛋白，其中該輕鏈 CDR1係SEQ ID NO：21；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：28且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：35。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：22；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：29且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：36。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：23；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：30且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：37。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：24；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：31且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：38。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：25；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：32且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：39。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：26；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：33且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：40。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含輕鏈可變域，其中該輕鏈CDR1係SEQ ID NO：27；該輕鏈CDR2係SEQ ID NO：34且該輕鏈CDR3係SEQ ID NO：41。
本文在一些實施例中亦提供包含重鏈可變域之CD33結合蛋白，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：42；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：49且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：56。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：43；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：50且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：57。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：43；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：50且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：58。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：43；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：50且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：59。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：43；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：50且該重鏈 CDR3係SEQ ID NO：60。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：44；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：51且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：61。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：45；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：52且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：62。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：46；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：53且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：63。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：47；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：54且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：63。在一些實施例中，CD33結合蛋白包含重鏈可變域，其中該重鏈CDR1係SEQ ID NO：48；該重鏈CDR2係SEQ ID NO：55且該重鏈CDR3係SEQ ID NO：63。
在其他實施例中，CD33結合蛋白包含選自顯示於表3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1至10之可變輕鏈域。在其他實施例中，CD33結合蛋白包含選自顯示於表4中之胺基酸序列SEQ ID NO：11至20之可變重鏈域。在又其他實施例中，CD33結合蛋白包含選自顯示於表3中之胺基酸序列SEQ ID NO：1至10之可變輕鏈域及選自顯示於表4中之胺基酸序列SEQ ID NO：11至20之可變重鏈域。
術語「結合蛋白」係指具有抗原結合性質之免疫球蛋白衍生物，即含有抗原結合位點之免疫球蛋白多肽或其片段。該結合蛋白包含抗體或其片段之可變域。各抗原結合域係藉由結合至相同抗原決定基之抗體(即免疫球蛋白)可變重鏈域(VH)及抗體可變輕鏈域(VL)形成，而該可變重鏈域(VH)包含三個重鏈互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3；且該可變輕鏈域(VL)包含三個輕鏈互補決定區(CDR)：CDR1、CDR2及CDR3。在一些實例中，本文中一些實施例之結合蛋白缺乏免疫球蛋白恆定域。在一些實例中，形成抗原結合位 點之可變輕鏈及重鏈域係例如藉由肽連接子彼此共價相連，或在其他實例中，該等可變輕鏈及重鏈域彼此非共價相連以形成抗原結合位點。術語「結合蛋白」亦係指抗體片段或抗體衍生物，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、單鏈Fv、串聯單鏈Fv(scFv)2、雙特異性T細胞接合子(BiTE®)、雙重親和力重靶向抗體(DARTTM)、雙功能抗體及串聯雙功能抗體(TandAb®)。此外，在某些實例中，該結合蛋白係多價的，即具有兩個、三個或更多個針對CD33之結合位點。
表4：抗CD33可變重鏈域之胺基酸序列(將可變重鏈CDR1、CDR2及CDR3之胺基酸序列加粗且加下劃線)
在一些實施例中，對CD33具有特異性之結合蛋白係選自顯示於表3及表4中之形成人類CD33結合位點之可變重鏈域及可變輕鏈域之下列組合中之一者。非限制性實例包括(i)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：11；(ii)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：12；(iii)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：13；(iv)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：14；(v)SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：15；(vi)SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：16；(vii)SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：17；(viii)SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：18；(ix)SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19及(x)SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：20。
本文亦描述不僅對CD33具有特異性，但亦具有至少一個其他功能域之結合蛋白。在另一實施例中，至少一個其他功能域係效應域。 「效應域」包含抗體之對效應細胞具有特異性之結合位點，其可刺激或觸發細胞毒性、胞噬作用、抗原呈現、細胞介素釋放。此等效應細胞係(例如，但不限於)T細胞。特定言之，該效應域包含形成針對T細胞(諸如，例如，人類CD3)上之抗原之抗原結合位點之至少一個抗體可變重鏈域及至少一個可變輕鏈域。
因此，在一些實施例中，該CD33結合蛋白係多功能結合蛋白。如本文使用之術語多功能意謂結合蛋白顯示兩種或更多種不同之生物功能。例如，該等不同之生物功能係針對不同抗原之不同特異性。在某些實例中，該多功能CD33結合蛋白係多特異性的，即，對CD33及一或更多種其他抗原具有結合特異性。在某些實例中，該結合蛋白係對CD33及CD3具有特異性之雙特異性蛋白。此等雙特異性結合蛋白包括(例如)類別IgA、IgD、IgE、IgG或IgM之雙特異性單株抗體、雙功能抗體、單鏈雙功能抗體(scDb)、串聯單鏈Fv(scFv)2(例如雙特異性T細胞接合子(BiTE®))、雙重親和力重靶向抗體(DARTTM)、串聯雙功能抗體(TandAb®)及撓性抗體(flexibody)。
在某些實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點對人類CD3及(在一些實例中)對食蟹猴CD3具有特異性。此結合位點之實例係包含來自顯示於表5(SEQ ID NO：64至67)中之序列之VH域CDR1、CDR2及CDR3及來自顯示於表6(SEQ ID NO：68至71)中之序列之VL域CDR1、CDR2及CDR3之多肽。在某些實例中，CD3結合位點係SEQ ID NO：64之可變重鏈域及SEQ ID NO：68之可變輕鏈域之組合。在某些實例中，CD3結合位點係SEQ ID NO：65之可變重鏈域及SEQ ID NO：69之可變輕鏈域之組合。在某些實例中，CD3結合位點係SEQ ID NO：66之可變重鏈域及SEQ ID NO：70之可變輕鏈域之組合。在某些實例中，CD3結合位點係SEQ ID NO：67之可變重鏈域及SEQ ID NO：71之可變輕鏈域之組合。
在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含STYAMN(SEQ ID NO：72)之CDR1序列之可變重鏈域。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：73)之CDR2序列之可變重鏈域。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：74)之CDR3序列之可變重鏈域。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含HGNFGNSYVSYFAY(SEQ ID NO：75)之CDR3序列之可變重鏈域。在又其他實施例中，該CD3結合位點具有包含分別SEQ ID NO：72至74之CDR1、CDR2及CDR3序列之可變重鏈域。在又其他實施例中，該CD3結合位點具有包含分別SEQ ID NO：72、73及75之CDR1、CDR2及CDR3序列之可變重鏈域。
在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含選自由以下組成之群之CDR1序列之可變重鏈域：NTYAMN(SEQ ID NO：76)、NTYAMH(SEQ ID NO：77)及NKYAMN(SEQ ID NO：78)。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含選自由以下組成之群之CDR2序列之可變重鏈域：RIRNKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：79)、RIRNKYNNYATEYADSVKD(SEQ ID NO：80)、RIRSKYNNYATEYAASVKD(SEQ ID NO：81)、RIRNKYNNYATEYAASVKD(SEQ ID NO：82)、RIRSKYNNYATYYADSVKG(SEQ ID NO：83)及RIRSKYNNYATEYADSVKS(SEQ ID NO：84)。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含選自由以下組成之群之CDR3序列之可變重鏈域：HGNFGDSYVSWFAY(SEQ ID NO：85)、HGNFGNTYVSWFAY(SEQ ID NO：86)、HGNFGCSYVSWFAY(SEQ ID NO：87)、HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO：88)及HGNFGNSYVSFFAY(SEQ ID NO：89)。
在又其他實施例中，該CD3結合位點具有包含分別SEQ ID NO：76、73及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、79及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、80及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、81及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、82及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、83及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：72、83及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：72、83及85之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：76、83及86之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：77、83及74之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：72、83及87之CDR1、CDR2及CDR3序列；包含分別SEQ ID NO：78、73及88之CDR1、CDR2及CDR3序列或分別包含SEQ ID NO：78、84及89之CDR1、CDR2及CDR3序列之可變重鏈域。
在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：90)之CDR1序列之可變輕鏈域。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含GTNKRAP(SEQ ID NO；91)之CDR2序列之可變輕鏈域。在其他實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白之CD3結合位點具有包含ALWYSNL(SEQ ID NO：92)之CDR3序列之可變輕鏈域。在又其他實施例中，該CD3結合位點具有包含分別SEQ ID NO：90至92之CDR1、CD2及CD3序列之可變輕鏈域。
在某些實例中，該CD3結合位點對CD3具有高親和力。或者，在其他實例中，來自重鏈域及輕鏈域或(視需要)可變輕鏈域及可變重鏈域之CDR1、CDR2、CDR3係衍生自其他CD3抗體，諸如(例如)UCHT1、莫羅單抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奧昔珠單抗(otelixizumab)(TRX4)、替利珠單抗(teplizumab)(MGA031)、維西珠單抗(visilizumab)(Nuvion)及類似物。
在另一態樣中，本文描述經人類化或完全人類(即，具有人類起源)之CD33結合蛋白及雙特異性CD33及CD3結合蛋白。
在一些實施例中，雙特異性CD33及CD3結合蛋白具有藉由可變輕鏈及重鏈域對CD33及CD3提供CD33及CD3特異性之下列組合中之一者，該等組合包括但不限於：(i)SEQ ID NO：2、12、65及69；(ii) SEQ ID NO：3、13、65及69；(iii)SEQ ID NO：4、14、65及69；(iv)SEQ ID NO：5、15、65及69；(v)SEQ ID NO：1、11、64及68；(vi)SEQ ID NO：2、12、64及68；(vii)SEQ ID NO：2、12、66及70；(viii)SEQ ID NO：4、14、66及70；(ix)SEQ ID NO：5、15、66及70及(x)SEQ ID NO：3、13、64及68；(xi)SEQ ID NO：3、13、67及71；(xii)SEQ ID NO：4、14、64及68；(xiii)SEQ ID NO：5、15、64及68；(xiv)SEQ ID NO：7、17、64及68；(xv)SEQ ID NO：6、16、64及68；(xvi)SEQ ID NO：6、16、67及71；(xvii)SEQ ID NO：8、18、64及68；(xviii)SEQ ID NO：9、19、64及68；(xix)SEQ ID NO：9、19、67及71及(xx)SEQ ID NO：10、20、64及68。
CDR序列及重鏈及輕鏈域之保守變體
在替代實施例中，該等重鏈及輕鏈域合併本文描述之CDR序列之免疫活性同源物或變體。因此在一些實施例中，重鏈域或輕鏈域中之結合至CD33或CD3之CDR序列類似但不同於描述於SEQ ID NO：21至63或72至92中之胺基酸序列。在某些實例中，CDR變體序列相較於SEQ ID NO：21至63或72至90之序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性且其係免疫活性的。
在其他實例中，CDR變體序列合併1、2、3、4或5個保守胺基酸取代。保守取代包括以具有類似特徵之另一胺基酸取代給定胺基酸之胺基酸取代且進一步包括在脂族胺基酸中丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之互換；羥基殘基絲胺酸及蘇胺酸之互換；酸性殘基天冬胺酸及麩胺酸之交換；在醯胺殘基天冬醯胺酸與麩醯胺酸間之取代；鹼性殘基離胺酸及精胺酸之交換及在芳族殘基苯丙胺酸與酪胺酸間之置換。
在又其他實例中，CDR變體序列合併增強CDR之性質(諸如穩定性、對蛋白酶之抗性及/或對CD33或CD3之結合親和力之增加)之取代。
在其他實例中，CDR變體序列係經改性以變化非關鍵殘基或非關鍵區中之殘基。非關鍵之胺基酸可藉由已知方法(諸如親和力成熟、CDR步移(CDR walking)、定點突變形成、結晶、核磁共振、光親和標記或丙胺酸-掃描突變形成)來鑑別。
在其他替代實施例中，該等CD33及CD3結合蛋白包含係本文提供之重鏈及輕鏈域序列之免疫活性同源物或變體之重鏈及輕鏈域。因此，在一些實施例中，CD33及CD3結合蛋白包含與SEQ ID NO：1至20或64至71中描述之胺基酸序列類似於但不同的重鏈或輕鏈域序列。在某些實例中，變體重鏈或輕鏈域序列相較於SEQ ID NO：1至20或64至71之序列具有99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性且其係免疫活性的。
在其他實例中，變體重鏈或輕鏈域序列合併1、2、3、4或5個保守胺基酸取代。保守取代包括以具有類似性質之另一胺基酸置換給定胺基酸之胺基酸取代且其進一步包括在脂族胺基酸中丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸之互換；羥基殘基絲胺酸及蘇胺酸之互換；酸性殘基天冬胺酸及麩胺酸之交換；醯胺殘基天冬醯胺酸及麩醯胺酸之取代；鹼性殘基離胺酸及精胺酸之交換及芳族殘基苯丙胺酸與酪胺酸間之置換。
在又其他實例中，變體重鏈或輕鏈域序列合併增強CDR之性質(諸如穩定性、對蛋白酶之抗性及/或對CD33或CD3之結合親和力之增加)之取代。
在其他實例中，變體重鏈或輕鏈域序列係經改性以變化非關鍵 殘基或非關鍵區中之殘基。非關鍵之胺基酸可藉由已知方法(諸如親和力成熟、CDR步移、定點突變形成、結晶、核磁共振、光親和標記或丙胺酸-掃描突變形成)來鑑別。
CD33及CD3雙特異性及串聯雙功能抗體
在另一態樣中，CD33結合蛋白或雙特異性CD33及CD3結合蛋白係二聚物，即，包含兩個具有針對CD33及CD3之抗原結合位點之多肽。
本文在另一態樣中亦提供呈串聯雙功能抗體(TandAb®)之形式之二聚及雙特異性CD33及CD3結合蛋白。此等串聯雙功能抗體係藉由在能夠同源二聚化之單一基因構築體(圖1)中連接四個抗體可變結合域(兩個重鏈可變域(VH)及兩個輕鏈可變域(VL))而構築。在此等串聯雙功能抗體中，該連接子長度係使得其阻止該等可變域之分子內配對以使該分子無法自身回折以形成單鏈雙功能抗體，而是被迫與另一鏈之互補域配對。該等域亦可經配置使得相應VH及VL域在此二聚化期間配對。自單一基因構築體表現後，兩個相同多肽鏈首尾折疊以形成約105kDa之功能非共價同源二聚物(圖1)。儘管缺乏分子間共價鍵，但該同源二聚物一經形成即高度穩定，保持完整且不恢復至單體形式。
串聯雙功能抗體具有許多提供優於傳統單株抗體及其他較小雙特異性分子之優點之性質。串聯雙功能抗體僅含有抗體可變域且因此預期缺乏可與Fc部分相關聯之副作用或非特異性相互作用。例如，可結合至Fc域之Fc受體發現於許多細胞類型上，諸如白血球(例如，嗜鹼性球、B細胞、嗜酸性球、自然殺手細胞、嗜中性球及類似物)或Kuppfer細胞。因為串聯雙功能抗體容許二價結合至CD33及CD3中之各者，因此該結合性與IgG之結合性相同。串聯雙功能抗體之大小(約105kDa)係小於IgG之大小，此可容許增強之腫瘤滲透。然而，此大 小遠高於首關廓清率之腎臨限值，從而相較於基於抗體結合域或非抗體支架之較小雙特異性形式提供藥物動力學優點。此外，基於此藥物動力學及結合性性質導致較長固有半衰期及快速細胞毒性，串聯雙功能抗體優於其他雙特異性結合蛋白(諸如BiTE或DART分子)。串聯雙功能抗體充分表現於宿主細胞(例如，哺乳動物CHO細胞)中。預期穩健之上游及下游製造方法可用於串聯雙功能抗體。
本文描述之CD33及CD3雙特異性串聯雙功能抗體係經設計以容許藉由募集細胞毒性T細胞來特異性靶向CD33+腫瘤細胞。此相較於針對唯一抗原之全長抗體改良ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)且不能直接募集細胞毒性T細胞。相比之下，藉由接合特異性表現於此等細胞上之CD3分子，該串聯雙功能抗體可使細胞毒性T細胞與CD33+腫瘤細胞以高度特異性方式交聯，藉此顯著增加此等分子之細胞毒性潛力。此機制概述於圖2中。該串聯雙功能抗體顯示強勁、特異性且高效之ADCC。據報道，T細胞可在控制腫瘤生長中發揮作用。例如，細胞毒性T細胞在來自NHL病患之結腸直腸腫瘤及淋巴結中之存在顯示與較佳臨床結果相關。此外，已針對黑色素瘤疫苗及針對CTLA-4(T細胞活化之負調節子)之抗體證實經設計以誘導T細胞反應之療法之潛力。本文描述之串聯雙功能抗體經由結合至表面表現之CD3(其形成T細胞受體之一部分)而接合細胞毒性T細胞。此串聯雙功能抗體對CD3及表現於特定腫瘤細胞之表面上之CD33之同時結合會引起T細胞活化並介導該腫瘤細胞之後續溶解(圖2)。
因此，在另一態樣中係多特異性串聯雙功能抗體。在一些實施例中，多特異性串聯雙功能抗體對兩個、三個或更多個不同抗原決定基具有特異性，其中兩個或更多個抗原決定基可具有相同抗原目標或具有不同抗原目標。在某些實施例中，該多特異性串聯雙功能抗體係雙特異性且四價的，即，包含四個抗原-結合位點。此雙特異性串聯 雙功能抗體以至少一個抗原-結合位點結合至人類CD3且結合至人類CD33，其中在某些實例中，該串聯雙功能抗體以兩個抗原-結合位點結合至人類CD3且以兩個其他抗原-結合位點結合至人類CD33，即，該串聯雙功能抗體二價結合至各抗原。
在一些實施例中，雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體對人類CD33及人類CD3具有特異性，其中該串聯雙功能抗體包含第一多肽及第二多肽，各多肽具有至少四個彼此相連之可變鏈域，其中各多肽包含：(i)對人類CD33具有特異性之可變重鏈(VH)域；(ii)對人類CD33具有特異性之可變輕鏈(VL)域；(iii)對人類CD3具有特異性之VH域，及(iv)對人類CD3具有特異性之VL域。
在特定實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體特異性結合至人類CD33之抗原決定基，其係在人類CD33之62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內。在特定實例中，此串聯雙功能抗體包含第一多肽及第二多肽，各多肽具有至少四個彼此相連之可變鏈域，其中各多肽包含：(i)對人類CD33之抗原決定基(其係在人類CD33之62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內)具有特異性之可變重鏈域；(ii)對人類CD33之抗原決定基(其係在人類CD33之62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內)具有特異性之可變輕鏈域；(iii)對人類CD3具有特異性之可變重鏈域，及(iv)對人類CD3具有特異性之可變輕鏈域。
在其他實施例中，本文描述對CD33+細胞上之CD33具有10nM或 更小、5nM或更小、1nM或更小或0.5nM或更小之KD之親和力之CD33/CD3串聯雙功能抗體。該等CD33+細胞可選自腫瘤細胞，諸如(例如)HL-60或KG-1。
在另一實施例中，本文描述之CD33/CD3串聯雙功能抗體以10nM或更小、5nM或更小或2nM或更小之KD結合CD3及(在某些實例中)結合CD3+細胞(特定言之，T細胞)上之CD3之ε鏈。
在一些實施例中，雙特異性串聯雙功能抗體之各多肽包含四個可變鏈域之下列組合中之一者：(i)SEQ ID NO：2、12、65及69；(ii)SEQ ID NO：3、13、65及69；(iii)SEQ ID NO：4、14、65及69；(iv)SEQ ID NO：5、15、65及69；(v)SEQ ID NO：1、11、64及68；(vi)SEQ ID NO：2、12、64及68；(vii)SEQ ID NO：2、12、66及70；(viii)SEQ ID NO：4、14、66及70；(ix)SEQ ID NO：5、15、66及70、and(x)SEQ ID NO：3、13、64及68；(xi)SEQ ID NO：3、13、67及71；(xii)SEQ ID NO：4、14、64及68；(xiii)SEQ ID NO：5、15、64及68；(xiv)SEQ ID NO：7、17、64及68；(xv)SEQ ID NO：6、16、64及68；(xvi)SEQ ID NO：6、16、67及71；(xvii)SEQ ID NO：8、18、64及68；(xviii)SEQ ID NO：9、19、64及68；(xix)SEQ ID NO：9、19、67及71及(xx)SEQ ID NO：10、20、64及68。
如本文使用，「二聚物」係指兩個多肽之複合物。在某些實施例中，該等兩個多肽彼此非共價相連，特定言之，限制條件為該等兩個多肽間無共價鍵。在某些實例中，該等兩個多肽具有共價結合，諸如經形成以有助於穩定化該二聚物之雙硫鍵。在某些實施例中，該二聚物係同源二聚物，即，包含兩個相同多肽。術語「多肽」係指藉由醯胺鍵相連之胺基酸殘基之聚合物。該多肽(在某些實例中)係非分支單鏈融合蛋白。在該多肽中，該等可變抗體域彼此相連。該多肽(在某些實例中)除可變域N端及/或C端殘基外亦可具有連續胺基酸殘基。例 如，此等連續胺基酸殘基可(在一些實例中，在C端處)包含Tag序列，預期其適用於該多肽之純化及偵測。
在一個態樣中，該雙特異性串聯雙功能抗體之各多肽包含四個可變域：CD3結合蛋白之可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)以及CD33結合蛋白之可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)。在某些實施例中，四個可變域係藉由肽連接子L1、L2及L3相連且在一些實例中如下自N端至C端配置：域順序：(1)VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3)；或(2)VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3)；或(3)VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33)；或(4)VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)。
據所報導研究，該等連接子之長度影響抗原結合串聯雙功能抗體之可撓性。因此，在一些實施例中，該等肽連接子L1、L2及L3之長度係使得一個多肽中之該等域可與另一多肽之該等域分子間結合以形成二聚抗原結合串聯雙功能抗體。在某些實施例中，此等連接子係「短」的，即由0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基組成。因此，在某些實例中，該等連接子由約12個或更少之胺基酸殘基組成。在0個胺基酸殘基之情況下，該連接子係肽鍵。此等短連接子藉由在不同多肽之抗體可變輕鏈域與抗體可變重鏈域間結合並形成正確抗原-結合位點而有利於該等兩個多肽之分子間二聚化。將該連接子縮短至約12個或更少之胺基酸殘基通常阻止相同多肽鏈之相鄰域彼此發生分子內相互作用。在一些實施例中，此等連接子由約3至約10(例如，4、5或6)個連續胺基酸殘基組成。
關於該等連接子之胺基酸組成，選擇不干擾該等兩個多肽之二聚化之肽。例如，包含甘胺酸及絲胺酸殘基之連接子通常提供蛋白酶 抗性。該等連接子之胺基酸序列可經最佳化(例如，藉由噬菌體顯示方法)以改良抗原結合及該抗原結合多肽二聚物之產率。適用於串聯雙功能抗體之肽連接子之實例在一些實施例中係GGSGGS(SEQ ID NO：95)、GGSG(SEQ ID NO：96)或GGSGG(SEQ ID NO：97)。
如本文描述之串聯雙功能抗體之非限制性實例係具有根據表7之抗CD33 VL及VH域、抗CD3 VL及VH域、域順序及連接子之串聯雙功能抗體。
在一些實施例中，串聯雙功能抗體係結合至C端六-組胺酸(6xHis)-標誌。在一些實施例中，具有C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之串聯雙功能抗體係如描述於圖10A至10X中之串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：98)、02(SEQ ID NO：99)、03(SEQ ID NO：100)、04(SEQ ID NO：101)、05(SEQ ID NO：102)、06(SEQ ID NO：103)、07(SEQ ID NO：104)、08(SEQ ID NO：105)、09(SEQ ID NO：106)、10(SEQ ID NO：107)、11(SEQ ID NO：108)、12(SEQ ID NO：109)、13(SEQ ID NO：110)、14(SEQ ID NO：111)、15(SEQ ID NO：112)、16(SEQ ID NO：113)、17(SEQ ID NO：114)、18(SEQ ID NO：115)、19(SEQ ID NO：116)、20(SEQ ID NO：117)、21(SEQ ID NO：118)、22(SEQ ID NO：119)、23(SEQ ID NO：120)或24(SEQ ID NO：121)。
在一些實施例中，串聯雙功能抗體係如描述於圖11A至11X中之串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)、02(SEQ ID NO：124)、03(SEQ ID NO：125)、04(SEQ ID NO：126)、05(SEQ ID NO：127)、06(SEQ ID NO：128)、07(SEQ ID NO：129)、08(SEQ ID NO：130)、09(SEQ ID NO：131)、10(SEQ ID NO：132)、11(SEQ ID NO：133)、12(SEQ ID NO：134)、13(SEQ ID NO：135)、14(SEQ ID NO：136)、15(SEQ ID NO：137)、16(SEQ ID NO：138)、17(SEQ ID NO：139)、18(SEQ ID NO：140)、19(SEQ ID NO：141)、20(SEQ ID NO：142)、21(SEQ ID NO：143)、22(SEQ ID NO：144)、23(SEQ ID NO：145)或24(SEQ ID NO：146)。
本文描述之CD33結合蛋白及CD33/CD3雙特異性結合蛋白(例 如，CD33/CD3雙特異性串聯雙功能抗體)係(在一些實施例中)藉由表現編碼該串聯雙功能抗體之多肽(其與另一相同多肽結合以形成該抗原結合串聯雙功能抗體)之多核苷酸來產生。因此，另一態樣係編碼如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體之多肽之多核苷酸(例如，DNA或RNA)。
該多核苷酸係藉由已知方法構築，諸如藉由將編碼至少四個由肽連接子分隔或(在其他實施例中)由肽鍵直接連接之抗體可變域之基因組合成可操作連接至合適啟動子及視需要合適轉錄終止子之單一基因構築體，且使其於細菌或其他適當之表現系統(諸如例如CHO細胞)中表現。取決於利用之載體系統及宿主，可使用任何數量之合適轉錄及轉譯元件(其等包括組成型及可誘導型啟動子)。該啟動子係經選擇使得其驅動該多核苷酸在各自宿主細胞中之表現。
在一些實施例中，將該多核苷酸嵌入載體(較佳表現載體)內，此表示另一實施例。此重組載體可根據已知方法構築。
可利用各種表現載體/宿主系統以含有編碼所描述之抗原結合串聯雙功能抗體之多肽之多核苷酸並表現。用於在大腸桿菌(E.coli)中表現之表現載體之實例係pSKK(Le Gall等人，J Immunol Methods.(2004)285(1)：111-27)或用於在哺乳動物細胞中表現之pcDNA5(Invitrogen)。
因此，在一些實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係藉由將編碼如上文描述之多肽之載體引入宿主細胞中並在使該等多肽鏈表現之條件下培養該宿主細胞來產生，可經分離且視需要經進一步純化。
在其他態樣中，本文描述之CD33結合蛋白或CD33/CD3雙特異性結合蛋白(例如，CD33/CD3雙特異性串聯雙功能抗體)具有改性。典型之改性包括(但不限於)乙醯化、醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、黃 素之共價附接、原血紅素部分之共價附接、核苷酸或核苷酸衍生物之共價附接、脂質或脂質衍生物之共價附接、磷脂酸肌醇之共價附接、藥物共軛、交聯、環化、雙硫鍵形成、去甲基化、共價交聯之形成、胱胺酸之形成、焦麩胺酸之形成、甲醯化、γ羧基化、醣基化、GPI錨定物形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、聚異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、胺基酸至蛋白質之傳遞RNA介導之添加(諸如精胺醯化)及泛素化。在其他實施例中，該CD33結合蛋白或該CD33/CD3雙特異性結合蛋白係經額外胺基酸(諸如前導序列或分泌序列或用於純化多肽之序列)改性。
在其他態樣中，本文提供包含CD33結合蛋白、抗原結合串聯雙功能抗體、包含編碼該抗原結合串聯雙功能抗體之多肽之多核苷酸之載體或藉由此載體轉形之宿主細胞及至少一種醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物。術語「醫藥上可接受之載劑」包括(但不限於)不干擾該等成分之生物活性之效應且對投與之病患無毒性之任何載劑。合適醫藥載劑之實例係此項技術中熟知且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。此等載劑可藉由習知方法調配且可以合適之劑量投與給個體。較佳地，該等組合物係無菌的。此等組合物亦可含有佐劑，諸如防腐劑、乳化劑及分散劑。可藉由包含各種抗菌劑及抗真菌劑來確保阻止微生物之作用。
對CD33及CD3具有高親和力結合之雙特異性CD33/CD3結合蛋白在大量原代AML樣本中具有高度活性，此表明此等分子可具有對抗跨整個細胞遺傳/分子疾病譜的人類AML的活性，甚至在最小CD33表現之情況下亦如此。注意，藥物-特異性細胞毒性在剩餘自體T細胞之存在下亦觀察到且藉由添加可控量之健康供體T細胞顯著加強(參見實例6)。
該等CD33/CD3雙特異性結合蛋白(特定言之，串聯雙功能抗體) 可誘導活體外CD33+白血病細胞之強效細胞溶解。該資料指示對CD33及CD3兩者之高親和力結合最大化雙特異性蛋白誘導之T細胞活化及抗AML效用。高親和力CD33/CD3定向之雙特異性結合蛋白(諸如本文描述之串聯雙功能抗體)在活體外原代AML中顯示細胞溶解活性。因此，此等雙特異性結合蛋白及串聯雙功能抗體適用於以治療急性骨髓性白血病(AML)或其他血液惡性腫瘤(例如，骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓增生疾病(MPD))之治療方法。
因此，本文提供方法，其中如本文上文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係以有效劑量投與給個體(例如，病患)以治療CD33+癌症(例如，急性骨髓性白血病(AML))、疾病或病症。CD33+癌症包括(但不限於)急性白血病(諸如急性骨髓性白血病)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)(包括前體B細胞淋巴母細胞白血病)、髓樣肉瘤、多發性骨髓瘤、急性淋巴瘤(諸如急性淋巴母細胞淋巴瘤)、慢性骨髓單核球性白血病及類似物。CD33+疾病及病症包括在某些癌症及慢性炎症中歸因於髓源性抑制細胞(MDSC)之免疫抑制狀態或環境。
在一些實施例中，投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體以治療急性骨髓性白血病(AML)。在某些實施例中，投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體以治療急性骨髓性白血病亞型。
法國-美國-英國分類系統將AML分為八個亞型：AML-M0(微分化型)、AML-M1(未成熟)、AML-M2(具有顆粒球性成熟)、AML-M3(前髓細胞性或急性前髓細胞性白血病)、AML-4(急性骨髓單核球性白血病)、AML-M5(急性單核母細胞性或單核球性白血病)、AML-M6(急性類紅血球性白血病)及AML-M7(急性巨核母細胞性白血病)。在某些實例中，投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體以治療AML-M0、AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5、AML-M6或AML-M7。
WHO AML分類方案根據下列亞型組織AML：具有復發性基因異常之AML、具有與骨髓發育不良相關聯之變化之AML、與療法相關聯之骨髓腫瘤、髓樣肉瘤、與唐氏症侯群相關聯之骨髓增殖、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤及不另外分類之AML。在某些其他實例中，投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體以治療具有復發性基因異常之AML、具有與骨髓發育不良相關聯之變化之AML、與療法相關聯之骨髓腫瘤、髓樣肉瘤、與唐氏症侯群相關聯之骨髓增殖、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或不另外分類之AML。
在一些其他實施例中，投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體以治療新診斷、復發性或難治性AML。
在一些實施例中，向已接受造血幹細胞移植(HCT)之病患投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白(例如，抗原結合串聯雙功能抗體)以治療復發性或難治性AML。已接受HCT之病患係特異性病患群體，該群體適合進行用於治療AML之CD33及CD3結合蛋白。預期接受HCT之病患重建他或她的免疫系統(包括淋巴球)，藉此容許該CD33及CD3結合蛋白更有效接合細胞毒性T細胞並殺死腫瘤細胞。
在許多或大多數情況下，接受HCT中之病患經歷了失敗的用於治療AML之先前療法(諸如化學療法或放射療法)且現處於緩解中。在一些實施例中，接受HCT中之病患經歷了失敗的一線化學療法或放射療法。在一些實施例中，接受HCT中之病患經歷了失敗的單線化學療法或放射療法。在一些接受HCT中之AML病患中，該等病患處於第一完全緩解(CR1)中。在一些實施例中，接受HCT中之AML病患係處於第二完全緩解(CR2)中之復發性AML病患。
在一些實施例中，該造血幹細胞移植係同種異體移植(allo-HCT)。在Allo-HCT中，幹細胞源自其他人(即，除病患外之具有人類白血球抗原(HLA)-抗原匹配之供體)。匹配之供體可與該病患為親屬 關係或非親屬關係。在一些情況下，部分匹配之供體(一個抗原不匹配)可用於allo-HCT。來自供體之細胞之常見來源包括骨髓及外周血液幹細胞。就彼等不能獲得HLA匹配或部分匹配之親屬關係或非親屬關係的供體之病患而言，可使用替代供體來源。例示性替代供體選擇包括臍帶移植或單倍同一性移植。allo-HCT之優點包括使用無腫瘤移植及免疫介導之移植物抗白血病效應。當該等供體免疫細胞輸液至身體中時，其等可識別相對其等而言為外來者之任何剩餘白血病細胞並攻擊其等。allo-HCT之缺點包括查找匹配或部分匹配之供體之困難及移植物抗宿主疾病，在移植物抗宿主疾病中，由該供體之細胞建立之免疫系統將該病患自身之組織識別為外來者並攻擊其等。
在一些其他實施例中，該造血幹細胞移植係自體(atuo-HCT)的。自體HCT要求自病患抽取(通常藉由血球分離)造血幹細胞並將獲得之細胞儲存於冷凍庫中。該病患然後經高劑量化學療法以及放射療法或不加放射療法來治療，旨在以部分或完全之骨髓摘除作為代價而根除該病患之惡性T細胞群體，或換而言之，破壞病患之骨髓功能以生長新血液細胞。然後將該病患自身儲存之幹細胞輸入他/她的血流中，在血流中，其等置換經破壞之組織並恢復該病患之正常血液細胞產生。因為免疫功能之恢復快速，所以自體移植具有在治療之免疫功能不全之部分期間感染風險較低之優點。同樣，因為供體與受體係相同個體，所以病患經歷排斥(其係急性或慢性移植物抗宿主疾病)之發病率非常罕見。
在其他實施例中，該病患在HCT前接受調節方案。在一些實施例中，在HCT前之該調節方案能夠提供足夠之免疫抑制以保證移植物植入且無顯著毒性。該調節方案係清髓性或非清髓性，亦稱為減小之強度調節(RIC)方案。
在一些實施例中，該調節方案係清髓性的。清髓性調節方案摘 除骨髓中之細胞(包括AML細胞)且通常藉由全身照射(TBI)、環磷醯胺之投與、硫酸布他卡因之投與或其組合進行。例示性環磷醯胺包括endoxan、cytoxan、neosar、procytox、revimmune及cycloblastin。在一些實施例中，該調節方案係非清髓性的，即，減小之強度調節(RIC)。RIC方案包括低於清髓性療法之化學療法及/或放射療法之劑量。因此認為RIC方案係較溫和之方案，其未根除所有骨髓細胞且可用於諸如無法經受清髓性調節方案之老年人之病患中。
在一些實施例中，本文描述之CD33及CD3結合蛋白(例如，抗原結合串聯雙功能抗體)係投與給在骨髓母細胞性調節方案後接受自體HCT之AML病患。在一些實施例中，該抗原結合串聯雙功能抗體係投與給在骨髓母細胞性調節方案後已接受allo-HCT之AML病患。在一些實施例中，在清髓性調節方案後接受allo-HCT之該等病患正處於完全緩解(CR)中，且在allo-HCT後投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白會減小復發性或難治性AML發生之可能性。在一些實施例中，在清髓性調節方案後正接受allo-HCT之該等病患正處於CR中，但患有微量殘餘疾病(MRD)，且在allo-HCT後投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白會減小復發性或難治性AML發生之可能性。在一些實施例中，在清髓性調節方案後正接受allo-HCT之該等病患患有MRD，且在allo-HCT後投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白會減小復發性或難治性AML發生之可能性。
某些臨床前研究已指示更大強度之調節方案導致促炎性細胞介素環境，其有利於急性移植物抗宿主疾病之發展。例示性強化調節方案包括非常高劑量之TBI方案。在一些實施例中，向在強化調節方案後已接受allo-HCT之AML病患投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白不導致促炎性細胞介素環境且減小急性移植物抗宿主疾病發生之可能性。
在其他實施例中，CD33及CD3結合蛋白(例如抗原結合串聯雙功能抗體)係投與在RIC方案後已接受自體HCT之AML病患。在一些實施例中，該抗原結合串聯雙功能抗體係投與在RIC方案後已接受allo-HCT之AML病患。例示性最小強度調節方案包括投與氟達拉濱與TBI之組合。在一些實施例中，該氟達拉濱係以30mg/m2/天之劑量投與3天，與2 Gy TBI一起。一些研究已報告非清髓性或RIC調節方案係與以下相關聯：34%至50%之兩年總體存活率、22%至34%之兩年非復發死亡(NRM)率、33%至35%之急性移植物抗宿主疾病率及41%至53%之慢性移植物抗宿主疾病率。在一些實施例中，如本文描述之CD33及CD3結合蛋白係投與在RIC調節方案後已接受allo-HCT之AML病患。在一些實施例中，向在RIC調節方案後已接受allo-HCT之AML病患投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體導致改善之總體存活率、減小之NRM率及/或減小之急性或慢性移植物抗宿主疾病之發病率。
在一些實施例中，該CD33及CD3結合蛋白係投與在RIC方案後接受allo-HCT之AML病患。在一些實施例中，在RIC方案後接受allo-HCT之病患處於完全緩解(CR)中，且在allo-HCT後投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白減小復發性或難治性AML發生之可能性。在一些實施例中，在RIC方案後接受allo-HCT之病患處於CR中但患有微量殘餘疾病(MRD)，且在allo-HCT後投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體減小復發性或難治性AML發生之可能性。在一些實施例中，在RIC方案後接受allo-HCT之病患患有MRD，且在allo-HCT後投與如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體減小復發性或難治性AML發生之可能性。
在一些實施例中，如本文描述之CD33及CD3結合蛋白係在AML進展期間與供體淋巴球一起投與已接受allo-HCT之病患。在一些實施 例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係在AML進展期間投與已接受allo-HCT之病患但不投與供體淋巴球。
在一些實施例中，在allo-HCT後投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白之AML病患中之總體反應率高於投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白而無先前allo-HCT之AML病患中之總體反應率。在一些實施例中，在清髓性或減小之強度調節方案後接受allo-HCT之AML病患具有用於結合如本文描述之CD33及CD3結合蛋白之功能T細胞，且在功能T細胞之存在下投與如本文描述之CD33及CD3結合蛋白導致改善之AML之治療成功率。
在其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療白血病前期血液疾病，諸如骨髓發育不良症候群(MDS)或骨髓增生性疾病(MPD)。在某些實例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療MDS。在某些實例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療MPD。
在其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療多發性骨髓瘤。在其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。
在其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以抑制或消除髓源性抑制細胞(MDSC)。MDSC在某些經分離之患病組織中高度過表現CD33且具有強免疫抑制活性。在某些人類癌症(CD33+及非CD33+)中，MDSC增殖且經活化以抑制腫瘤特異性CD4+ T細胞反應並誘導Treg細胞，以容許腫瘤或癌症在微環境中活躍。在慢性炎症中，據報告MDSC經擴增且發現於炎症部位以抑制T細胞免疫功能。在其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療與MDSC相關聯之病症。在又其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療免疫抑制。在又其他實施 例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療由MDSC抑制之炎症。在又其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療由MDSC引起之減少之免疫反應。在又其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療由MDSC促進之癌症之血管形成、腫瘤入侵或轉移。在又其他實施例中，如本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係經投與以治療由MDSC增強、擴張、惡化或增加之癌症或腫瘤。
預期本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體用作藥劑。投與係藉由不同方式實現，例如，藉由靜脈內、腹腔內、皮下、肌內、局部或皮內投與。在一些實施例中，投與途徑取決於療法之類型及該醫藥組合物中所含有之化合物之類型。劑量方案將由主治醫師及其他臨床因素判定。用於任何一名病患之劑量取決於許多因素，該等因素包括該病患之大小、身體表面積、年齡、性別、待投與之特定化合物、時間及投與途徑、療法之類型、一般健康情況及同時投與之其他藥物。「有效劑量」係指足以影響該病程及該疾病之嚴重性之活性成分之量，該量可導致此病理學之減少或緩解。適用於治療及/或預防AML之「有效劑量」可使用已知方法測定。
在其他實施例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與用於CD33+癌症、疾病或病症之標準療法組合投與。標準療法包括化學療法、免疫療法、激素療法、放射療法、外科手術、基因療法及類似方法。在某些實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與標準AML療法組合投與。在某些實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與以下組合投與：阿糖胞苷、阿紮胞苷、地西他濱、蒽環類抗生素(例如，道諾黴素、伊達比星、多柔比星及類似物)、安吖啶、氟達拉濱、氯法拉濱、克拉屈濱、奈拉濱、胺甲喋呤、硼替佐米、卡非佐米、黴法蘭、依魯替尼、沙利度胺、來那度胺、泊馬度胺、阿普 斯特、表鬼臼毒素(例如，依託泊苷、替尼泊苷及類似物)、蒽二酮(例如，米托蒽醌、馬來酸匹杉瓊、洛索蒽醌、吡咯蒽醌、阿美蒽醌及類似物)、抗CD20劑(例如，利妥昔單抗、奧瑞珠單抗、奧法木單抗或其組合)。在某些實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與阿糖胞苷(ara-C)組合投與。在某些實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與阿紮胞苷組合投與。在某些實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與地西他濱組合投與。在其他實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與蒽環類抗生素(例如，道諾黴素、伊達比星、多柔比星及類似物)組合投與。在其他實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與查核點抑制劑(例如，PD-1抑制劑、CTLA-4抑制劑及類似物)組合投與。在又其他實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與表鬼臼毒素(例如，依託泊苷、替尼泊苷及類似物)組合投與。在又其他實例中，本文描述之抗原結合串聯雙功能抗體係與蒽二酮(例如，米托蒽醌、馬來酸匹杉瓊、洛索蒽醌、吡咯蒽醌、阿美蒽醌及類似物)組合投與。
下文實例進一步繪示所描述之實施例而不限制本發明之範圍。
實例1
編碼單鏈Fv抗體之DNA表現構築體之選殖
就抗CD33單鏈Fv(scFv)抗體於大腸桿菌中之細菌表現而言，將所有分子之DNA編碼序列選殖至細菌表現載體內。所有表現構築體係經設計以含有用於N端訊息肽及C端六-組胺酸(6xHis)-標誌之編碼序列以分別促進抗體分泌至周質內並純化。來自所有抗CD33 scFv純系之VL及VH域之胺基酸序列顯示於表3及表4中。
重組抗CD33 scFv抗體於大腸桿菌中之表現
使重組scFv抗體於大腸桿菌周質中表現為可溶分泌蛋白。在第一步驟中，以安比西林(ampicillin)補充之小培養基用經轉形之細菌接種 並在28℃下培養16h。接著，藉由添加以安比西林補充之第二培養基調節光學密度並在28℃下再培養一次直至光學密度在600nm下達成0.6至0.8之範圍。通過添加50μM IPTG誘導蛋白質表現且在21至28℃及200rpm下將培養物培養長達16h。培養後，使細胞集結成粒(30min，4℃，7500rpm)且儲存於-20℃下直至進一步處理。
抗CD33單鏈Fv抗體之純化
在離心細菌細胞培養物後藉由將細胞集結粒重懸浮於緩衝液中並在室溫下在溫和攪拌下培養30min以自大腸桿菌周質中提取重組scFv。使細胞集結成粒並保留含有重組蛋白之上清液。該程序再重複一次，接著彙集上清液並藉由超音波處理均質化。將均質物稀釋，補充低濃度之咪唑並裝於經預填充之固定化金屬親和力層析術(IMAC)管柱(GE Healthcare)上。清洗該管柱，直至達成基線，且然後用咪唑緩衝液溶離結合的蛋白。彙集含有抗體之溶離份且接著藉由粒徑排阻層析術(SEC)純化。最後，藉由超過濾濃縮蛋白質溶離液並針對儲存緩衝液透析。低pH處理(在pH 3.0下在37℃下培養20至24h)後，使用Tris中和樣品。經純化之蛋白質以等分試樣形式儲存在-80℃下直至使用。
實例2
編碼串聯雙功能抗體(TandAb®)之DNA表現構築體之選殖
就雙特異性串聯雙功能抗體於CHO細胞中之表現而言，將所有分子之編碼序列選殖至哺乳動物表現載體系統內。使用實例1之抗CD33 scFv域以構築CD33/CD3串聯雙功能抗體與抗CD3 scFv域之組合，其中域如表7及圖3中所示般組織。簡而言之，合成編碼由肽連接子分隔之抗CD33 VH及VL域之基因序列(VH-連接子-VL或VL-連接子-VH)並亞選殖。消化所得之構築體以利用位於該連接子序列內之Bam HI限制位點產生單獨VH及VL編碼序列。此等VH及VL片段然後經編 碼抗CD3之VH及VL域之DNA片段(VH-連接子-VL或VL-連接子-VH)連接以產生最終值構築體。CD33/CD3串聯雙功能抗體之域順序變體1至3顯示於圖3中。所有表現構築體係經設計以含有用於N端訊息肽及C端六組胺酸(6xHis)-標誌之編碼序列以分別促進抗體分泌及純化。
串聯雙功能抗體於經穩定轉染之CHO細胞中之表現
使用CHO細胞表現系統(Flp-In®，Life Technologies)(CHO-K1中國倉鼠卵巢細胞(ATCC，CCL-61)(Kao及Puck，Proc.Natl.Acad Sci USA 1968；60(4)：1275-81)之衍生物)。根據由Life Technologies提供之標準細胞培養方案再培養貼附細胞。
為適應懸浮生長，將細胞自組織培養瓶分離並放置於無血清培養基中。將懸浮適應細胞冷凍保存於具有10% DMSO之培養基中。
穩定表現經分泌之串聯雙功能抗體之重組CHO細胞系係藉由轉染懸浮適應細胞來產生。在以抗生素勻黴素B選擇期間，每週兩次量測活細胞密度，且細胞經離心並以0.1x106個活細胞/mL之最大密度重懸浮於新鮮選擇培養基中。穩定表現串聯雙功能抗體之細胞池在選擇之2至3週後進行回收，同時將細胞轉移至搖瓶中之標準培養基中。經重組分泌之蛋白質之表現藉由進行蛋白質凝膠電泳或流動式細胞測量術證實。穩定之細胞池冷凍保存於含有DMSO之培養基中。
串聯雙功能抗體藉由分泌至細胞培養物上清液中而產生於經穩定轉染之CHO細胞系之10天分批補料式培養物中。10天後以通常>75%之培養存活率收穫細胞培養物上清液。樣品每隔一天收集自生產培養物並評估細胞密度及存活率。在收穫當天，細胞培養物上清液藉由離心進行清除且在進一步使用前經真空過濾。
細胞培養物上清液中之蛋白質表現滴定度及產品完整度藉由SDS-PAGE分析。
串聯雙功能抗體之純化
於兩個步驟之程序中自CHO細胞培養物上清液純化串聯雙功能抗體。在第一步驟中，使His6-標誌構築體經受Ni-NTA超流動層析術，接著在第二步驟中於Superdex 200上經受製備型粒徑排阻層析術(SEC)。經溶離之串聯雙功能抗體關於其等同源二聚物(串聯雙功能抗體)含量加以表徵，及若該同源二聚物含量係90%或更高，則彙集。最後，對彙集之樣品進行緩衝液交換並藉由超過濾濃縮至>1mg/mL之典型濃度。最終樣品之純度及均質性(通常>90%)藉由SDS PAGE在還原及非還原之條件下接著分別藉由免疫印漬術使用抗His-標誌抗體及藉由分析型SEC來評估。經純化之蛋白質以等分試樣的形式儲存在-80℃下直至使用。
CD33/CD3串聯雙功能抗體之多肽顯示於表7及圖3中。各串聯雙功能抗體由兩個相同之多肽組成(圖1)。外部連接子L1及L3均由六個胺基酸GGSGGS(SEQ ID NO：95)組成，而中央肽連接子2之長度(4至6個胺基酸)分別隨序列GGSG(SEQ ID NO：96)、GGSGG(SEQ ID NO：97)或GGSGGS(SEQ ID NO：95)而變化。
使用一系列抗CD33可變域及抗CD3可變域，產生大量可於經轉染之細胞系中穩定產生且在體溫下及在重複之冷凍/解凍循環後維持穩定性之串聯雙功能抗體分子。為促進進一步發展及臨床前毒理學研究，重點在於選擇顯示結合至人類及食蟹猴CD33兩者之串聯雙功能抗體分子。分別在圖10L、10N及10P中針對串聯雙功能抗體12(SEQ ID NO：109)、14(SEQ ID NO：111)及16(SEQ ID NO：113)之單鏈顯示完整胺基酸序列之實例。在此實例中，用於該結構之該等可變域及其等連接子之順序係：VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3)。該C端六-組胺酸(6xHis)-標誌在純化期間裂解。用於上文提及之串聯雙功能抗體之完整胺基酸序列在移除六-組胺酸標誌後係串聯雙功能抗體12(SEQ ID NO：134)、串聯雙功能抗體14(SEQ ID NO：136)及串聯雙功能抗體16(SEQ ID NO：138)，分別顯示於圖11L、11N及11P中。
實例3
藉由流動式細胞測量術測定抗體親和力
細胞用CD33/CD3串聯雙功能抗體之100μL連續稀釋液培養。在用FACS緩衝液清洗三次後，該等細胞用0.1mL之10μg/mL小鼠單株抗His抗體在相同緩衝液中於冰上培養45min。第二清洗循環後，該等細胞在如之前之相同條件下用0.1mL之15μg/mL經FITC共軛之山羊抗小鼠IgG抗體培養。作為對照，細胞用抗His IgG培養，接著用無抗CD33串聯雙功能抗體之經FITC共軛之山羊抗小鼠IgG抗體培養。然後再次清洗該等細胞並重懸浮於0.2mL含有2μg/mL碘化丙啶(PI)之FACS緩衝液中以排除死細胞。以使用MXP軟體(Beckman-Coulter,Krefeld,Germany)之Beckman-Coulter FC500 MPL流式細胞儀或使用Incyte軟體(Merck Millipore,Schwalbach,Germany)之Millipore Guava EasyCyte流式細胞儀量測1x104個活細胞之螢光。使用CXP軟體(Beckman-Coulter,Krefeld,Germany)或Incyte軟體(Merck Millipore,Schwalbach,Germany)計算該等細胞樣品之平均螢光強度。減去經第二及第三試劑單獨染色之細胞之螢光強度值後，該等值憑藉用於GraphPad Prism(用於Windows之6.00版，GraphPad軟體，La Jolla California USA)之一個位點結合(雙曲線)之等式而用於計算KD值。
測試該等串聯雙功能抗體之對人類CD3+及CD33+細胞及食蟹猴CD3+及CD33+細胞之結合親和力。用於所選串聯雙功能抗體之例示性結合資料匯總於表8中：
#KD比率食蟹猴CD33/人類CD33係基於對分別表現食蟹猴CD33及人類CD33之CHO細胞量測之KD值來計算。‡KD比率hu CD3/hu CD33係基於對Jurkat細胞(hu CD3)量測之KD值及三個人類CD33+腫瘤細胞系(HL-60、KG-1、U937)之平均KD來計算。
CD3結合親和力及交叉反應性係在滴定及流式細胞儀實驗中針對CD3+ Jurkat細胞(由Dr.Moldenhauer提供，DKFZ Heidelberg；人類急 性T細胞白血病)及食蟹猴CD3+ HSC-F細胞系(JCRB，cat.：JCRB1164)來評估。CD33結合及交叉反應性係針對以下人類CD33+腫瘤細胞系來評估：HL-60(DSMZ，cat.：ACC 3，人類B細胞前體白血病)、U-937(DSMZ，cat.：ACC5；人類組織細胞淋巴瘤)及KG-1(DSMZ，cat.：ACC14；急性骨髓性白血病)。交叉反應性之KD比率係使用針對表現重組人類或重組食蟹猴抗原之CHO細胞系測定之KD值來計算。
該等串聯雙功能抗體對大多數經測試之腫瘤細胞系上之人類CD33+顯示低於1nM之相當高親和力。對人類CD3之親和力係經測定等於或小於2nM。
實例4
細胞毒性分析
就細胞毒性分析而言，收穫在標準條件下培養之靶細胞，清洗並以2x107個細胞/mL之密度重懸浮於稀釋液C(提供於PKH67綠螢光細胞連接子迷你套組中)中。將該細胞懸浮液然後與相等體積之經雙倍濃縮之PKH67標記之溶液混合且在RT下培養2至5min。染色反應藉由添加相等體積之FCS並培養1min來進行。用完全RPMI培養基清洗經標記之靶細胞後，計數細胞並以2x105個細胞/mL之密度重懸浮於完全RPMI培養基中。然後將2x104個靶細胞與作為效應細胞之經富集之人類T細胞以5：1之E：T比率在漸增濃度之所指示串聯雙功能抗體之存在下一起接種在微量滴定板之個別孔中，且總體積為200μL/孔。針對各板中至少三組重複測定在缺乏抗體之情況下之自發性細胞死亡及藉由T細胞殺死目標。離心後，將該等分析板在37℃下在具有5% CO2之潮濕氣氛中培養一段指定時間。培養後，培養物用FACS緩衝液清洗一次及然後重懸浮於150μL以2μg/mL PI補充之FACS緩衝液中。使用Beckman-Coulter FC500 MPL流式細胞儀(Beckman-Coulter)或Millipore Guava EasyCyte流式細胞儀(Merck Millipore)藉由使用 PKH67之陽性綠染色及用於PI之陰性染色量測活靶細胞之絕對量。基於經量測之剩餘活靶細胞，根據下式計算特異性細胞溶解之百分率：[1-(活目標(樣品)之數量/活目標(自發性))之數量]x 100%。使用GraphPad軟體藉由非線性回歸/4個參數邏輯擬合計算S形劑量反應曲線及EC50值。使用針對給定抗體濃度獲得之溶解值以使用Prism軟體藉由4個參數邏輯擬合分析來計算s形劑量-反應曲線。
於20至24小時分析中對CD33+ U-937(DSMZ，cat.：ACC5；人類組織細胞淋巴瘤)靶細胞利用經富集之人類T細胞作為效應細胞以5：1之比率測定EC50值。亦對CD33+ KG-1(DSMZ，cat.：ACC14；急性骨髓性白血病)及HL-60靶細胞於細胞毒性分析中測試一些串聯雙功能抗體。具體言之，選擇HL-60細胞作為具有CD33之相當高細胞表面表現之AML之模型(任意MFI[平均值±SEM]：3,133±215；n=3)，及選擇KG-1a作為具有非常有限之CD33表現之AML之模型(任意MFI：277±11；n=3)。所選擇之串聯雙功能抗體之例示性細胞毒性資料匯總於表9中。針對HL-60細胞系之額外細胞毒性資料發現於表8(最後一欄)上。
於基於FACS之細胞毒性分析中利用原代人類T細胞作為效應細胞以5：1之E：T比率對經培養20至24小時之所指示靶細胞系測定EC50值。在至少兩個獨立實驗中對各腫瘤細胞系測試各串聯雙功能抗體。呈現 平均值。
實例5
在48小時時於人類CD33+ AML細胞系中之其他細胞毒性篩選實驗
如上文描述，早在24小時時偵測到顯著細胞毒性，然而在48小時時可偵測到較高程度之毒性。就後續分析而言，選擇48小時時間點。測試T細胞選擇對串聯雙功能抗體誘導之細胞毒性之影響。為完成此測試，獲得來自健康志願者供體之未經刺激之PBMC，及藉由簡單「陽性富集」經由使用CD3磁珠及藉由更複雜之「陰性選擇」經由抗CD14、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123及CD235a之抗體之磁珠混合物兩者分離CD3+細胞。如圖4中繪示，串聯雙功能抗體誘導之細胞毒性在利用陰性選擇健康供體T細胞時比在利用陽性選擇T細胞時更大。然而，個別串聯雙功能抗體之相對細胞毒性活性不受T細胞選擇之方法之影響。因此以陽性富集之健康供體T細胞進行後續分析。
藉由Fred Hutchinson Cancer Research Center(FHCRC)Hematopoietic Cell Processing Core(Core Center of Excellence)在由FHCRC Institutional Review Board批准之研究協議下經由白細胞分離術自健康成年人志願者中收集未受刺激之單核細胞。T細胞通過磁性細胞分選經由CD3磁珠(「陽性富集」)或經由Pan T細胞分離套組(「陰性選擇」；兩者皆來自Miltenyi Biotec,Auburn,CA)富集，且然後以等分試樣形式冷凍並儲存於液氮中。根據製造商之使用說明書用3μM CellVue Burgundy(eBioscience,San Diego,CA)標記經解凍之細胞等分試樣。在各種濃度之串聯雙功能抗體分子之存在下培養經純化之PBMC。
就藥物誘導之細胞毒性之定量而言，在37℃下(在5% CO2及空氣 中)(如在實例4中)以不同E：T細胞比率培養細胞。24至72小時後，使用LSRII血球計數器(BD Biosciences)測定細胞數量及藥物誘導之細胞毒性(使用DAPI以偵測非活細胞)並用FlowJo進行分析。AML細胞藉由前向/側向散射性質且在其中添加健康供體T細胞之實驗中對CellVue Burgundy染料呈陰性(圖5)來鑑別。藥物誘導之特異性細胞毒性表示為：%細胞毒性=100 x(1-活靶細胞s經治療/活靶細胞對照組)。來自細胞毒性分析之結果表示為平均值±平均值標準誤差(SEM)。Spearman非參數相關性用以計算連續樣品特性間之相關性。所有P值係雙側的。使用GraphPad Prism軟體進行統計學分析。
在缺乏健康供體T細胞之情況下，CD33/CD串聯雙功能抗體中之任一者在缺乏T細胞之情況下對AML細胞系不發揮任何顯著之細胞毒性，此證實T細胞對其細胞毒性效應絕對需要(未顯示資料)。在T細胞之存在下，串聯雙功能抗體誘導之特異性細胞毒性之程度取決於串聯雙功能抗體之濃度及E：T細胞比率。CD33/CD3定向之串聯雙功能抗體分子與一個對照串聯雙功能抗體(00)間之直接頭對頭比較指示在HL-60細胞(圖6A/B及表10)及KG-1a細胞(圖6C/D及表10)兩者中抗體引導之細胞毒性之顯著差異，且該等結果在重複實驗中可高度再現。整體而言，串聯雙功能抗體誘導之細胞毒性之程度與對原代人類T細胞上之CD3之結合親和力相關(就在25pM(約2.5ng/mL)及E：T=5：1下在KG-1a細胞中之細胞毒性而言：r=-0.542，p=0.009；就在25pM及E：T=5：1下在HL-60細胞中之細胞毒性而言：r=-0.391，p=0.07)。串聯雙功能抗體12、14、16對HL-60及KG-1a細胞兩者具有高度細胞毒性。
1串聯雙功能抗體(TandAb)係以漸增CD3親和力之順序列舉。
2在24小時後於未分級分離之PBMC培養物中量測CD25及CD69誘導。
3在存在CD33+細胞之未分級分離之PBMC中由CD33/CD3串聯雙功能抗體誘導之T細胞增殖。
4來自3個在一式兩份孔中進行之獨立實驗、在25pM之串聯雙功 能抗體濃度下、在健康供體T細胞之存在下以5：1之E：T細胞比率DAPI+細胞在48小時後之細胞毒性(%)。
ND：無可偵測之CD25活化
實例6
串聯雙功能抗體於原代人類AML樣本中之其他表徵
就此等候選者之細胞毒性性質之綜合性表徵而言，獲得來自AML病患之樣本以用於來自FHCRC樣本庫之研究。
來自患有AML之成年人病患之治療前(「診斷」)外周血液或骨髓樣本之Ficoll分離之單核細胞之冷凍等分試樣獲得自FHCRC之庫。吾人使用2008 WHO標準定義AML(Vardiman等人；Blood.2009；114(5)：937-951)及使用細化之United Kingdom Medical Research Council(MRC)標準以分配細胞遺傳風險(Grimwalde等人；Blood.2010；116(3)：354-365)。病患提供關於在FHCRC Institutional Review Board批准之協議下採集並使用其等生物樣本用於研究目的之書面知情同意書。遵循臨床資料健康保險可攜性和可歸責性法案去鑑別臨床資料。解凍後，細胞利用識別CD33(純系P67.6；PE-Cy7共軛)、CD3(純系SK7；PerCP共軛)、CD34(純系8G12；APC-共軛；其等全部來自BD Biosciences,San Jose,CA)及CD45(純系HI30；APC-eFluor®780-共軛；eBioscience)之經直接標記之抗體進行染色。為識別非活細胞，樣品用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。在Canto II流式細胞儀(BD Biosciences)上獲取至少10,000個事件，並使用FlowJo(Tree Star,Ashland,OR)分析DAPI細胞。
解凍後，樣本具有>58% AML母細胞，如藉由流動式細胞測量術基於CD45/側向散射性質測定。樣本在含有細胞介素之液體培養物中一經解凍立即具有>50%活細胞且48小時後具有>50%活細胞(圖7)。該等病患之中值年齡係58.1(範圍：23.9至76.2)歲；細胞遺傳疾病風險 在2個患者中係有利的，在18個患者中係中等的及在7個患者中係不利的。NPM1、FLT3及CEBPA之突變狀態之資訊係不完全的；然而，已知一個樣品係CEBPA雙重突變，及另一樣品係NPM1pos/FLT3-ITDneg。經研究之樣本中骨髓母細胞及CD3+ T細胞之中值百分率分別係86.1%(範圍：58.4至97.0%)及2.0%(範圍：0至11.9%)，及培養物中在48小時後於之中值樣本存活率係80.1%(範圍：53.6至93.6%)。該等病患中之十五名患有新診斷AML，而在樣本收集期間12名患有復發性(n=7)或難治性(n=5)疾病。如匯總於表11中，在骨髓母細胞上之CD33表現、自體T細胞之量、骨髓母細胞之比例及培養物存活率方面，來自患有新診斷AML之病患之樣本之基本特性與彼等患有復發性/難治性疾病者類似。
向AML樣本培養物添加串聯雙功能抗體分子導致適度的劑量依賴性細胞毒性(圖8A)，此證實來自患有活性AML之病患之樣本中所含有之自體T細胞可經接合以溶解白血病細胞。在健康供體T細胞之存在下，個別串聯雙功能抗體之細胞毒性嚴格地取決於藥物劑量及E：T細胞比率(圖8B/C)。然而，甚至在一些於AML母細胞上具有非常低之CD33表現之樣本中亦觀察到串聯雙功能抗體之高活性。在串聯雙功能抗體分子中，12似乎最具活性，因為其在低濃度(2.5pM(約250ng/mL)，及至較不明顯之程度，亦係10pM(約1ng/mL))下在E：T=1：3及E：T=1：1兩者下均具有最高細胞毒性。
已於代表性AML病患血液樣品中篩選該等CD33/CD3串聯雙功能抗體，該等血液樣品根據病患性別、年齡、疾病階段(新診斷、復發性、難治性)、CD33表現程度及細胞遺傳風險(表11)而有所不同。顯著地，許多經檢查之串聯雙功能抗體(例如，02、08、09、11、12、14、16、19、22及23)在幾乎跨疾病病譜之所有病患樣品中係高度活性的，如圖17中所示。此外，活性之程度及範圍在AML之所有階段 (包括新診斷、復發性及難治性病患)中係類似的。
實例7
CD33/CD3串聯雙功能抗體12及串聯雙功能抗體16對表現不同含量CD33之各種起源之不同CD33 + 細胞系之效力及效用
為評估CD33/CD3串聯雙功能抗體之效力及效用是否取決於靶細胞上之CD33密度，使用QIFIKIT定量套組及抗CD33 mAb WM53測試各種人類CD33+腫瘤細胞系及表現重組人類CD33之CHO細胞之CD33表現含量。表12中之結果顯示腫瘤細胞系上之CD33密度在~1300 SABC(標準化抗體結合能力)至~46000 SABC之範圍內。CHO-CD33細胞上之表現係~197000 SABC，實質上高於腫瘤細胞系上之表現。在利用人類T細胞作為效應細胞之至少三個獨立基於FACS之細胞毒性分析中在5：1效應細胞相比於靶細胞之比率下在CD33/CD3串聯雙功能抗 體12及串聯雙功能抗體16之連續稀釋液之存在下，使用所有被測CD33+細胞系作為靶細胞。在各分析中，藉由非線性回歸計算EC50及串聯雙功能抗體介導之溶解值。該等結果證實12及16之效力(EC50值)或效用(%溶解)皆與靶細胞表面上之CD33密度無關。
值得注意地，至少12及16亦針對低於1500 SABC之非常低CD33密度之細胞諸如SEM顯示其等細胞毒性活性。
使用QIFIKIT及抗CD33 mAb WM53測定CD33+細胞系上之標準化抗體結合能力(SABC)。在基於FACS之細胞毒性分析中利用作為效應細胞之人類原代T細胞在5：1之E：T比率及且培養20至24h下測定重定向靶細胞溶解之串聯雙功能抗體12及串聯雙功能抗體16之EC50值；使用CD33表現之CHO細胞之分析培養40至48h。顯示至少3個獨立分析之平均值及SD。
實例8
T細胞之TandAb活化及AML細胞之活體外殺死
將TandAb與經純化之人類T細胞及經VPD-450標記之人類CD33+ 白血病細胞系KG-1或CD33-人類ALL細胞系G2(E：T 5：1)一起培養。使用流動式細胞測量術評估藉由TandAb之靶細胞溶解(10-15至10-8M；24h，37℃)。
TandAb 12、16及19與人類T細胞一起培養有效溶解KG-1細胞(IC50分別為~0.01、0.5及5pM)。多達40%之T細胞經活化(CD25+)且細胞毒性活性上升。具有不相關目標之對照TandAb(00)(>10-7M)不導致KG-1之活體外顯著殺死。分別而言，16誘導KG-1細胞之溶解(IC50=5 x 10-12M)，而1 x 10-8M對CD33- G2細胞無影響。該等結果指示當藉由CD33/CD3 TandAb靶向CD33+白血病細胞(KG-1)及原代CD33+ AML母細胞時，T細胞變得活化且強效溶解腫瘤細胞。
實例9
抗原決定基繪圖(mapping)
使用CLIPS技術(Pepscan)使含有不同CD33結合部分之串聯雙功能抗體經受抗原決定基繪圖以鑑別CD33-結合抗原決定基。
CLIPS技術促進將肽結構化成單環、雙環、三環、片狀折疊、螺旋狀折疊及其組合，以提供繪圖靶分子之非連續抗原決定基之可能性。
合成大於7000個獨立肽之陣列且於ELISA中測試各抗體對該等肽之結合。
串聯雙功能抗體12、14、16及22結合至人類CD33之第一類Ig域中之延伸物62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)。圖10及11中加下劃線及加粗顯示各自胺基酸延伸物。預期串聯雙功能抗體01、02、04、06、08、09、13及23亦結合至此抗原決定基，因為此等串聯雙功能抗體共用與串聯雙功能抗體12、14、16及12相同之CD33結合域(SEQ ID NO：2及12、3及13、5及15、9及19)。
實例10
在預防性活體內腫瘤模型中之劑量-反應
在預防性HL-60腫瘤異種移植模型中在以人類T細胞重構之NOD/scid小鼠中以不同劑量水平比較串聯雙功能抗體12及16。為達成劑量-反應，選擇在10、1及0.1μg(0.5、0.05及0.005mg/kg)下之三個劑量水平。
藉由皮下注射4x106個HL-60細胞之懸浮液對八個免疫缺陷NOD/scid小鼠實驗組進行異種移植。在注射前，使細胞與採用陰性選擇自膚色血球層(健康供體)分離之3x106個T細胞混合。為說明該等T細胞之可能供體可變性，將各實驗組細分為三個隊列(cohort)，各隊列僅接受一個個別供體之T細胞。經腫瘤細胞及T細胞移植之實驗組之所有動物在第0、1、2、3及4(qdxd5)天接受在所指示之三個不同劑量水平(0.1μg、1μg及10μg)下的媒劑(對照)或16或12之靜脈內推注。一個無效應細胞及媒劑治療的組充當額外對照。表13匯總組配置及給藥時間表。
用於HL-60異種移植模型中之活體內劑量-反應研究之治療組。對照組中之所有動物均可靠地發展腫瘤且顯示均質腫瘤生長。T細胞之存在對腫瘤發展無影響。在經媒劑治療之對照組中，在T細胞存在之情況下或在缺乏T細胞之情況下，未在HL-60生長中觀察到差異。
使用兩種測試項目之治療顯示明顯之劑量依賴性抗腫瘤效應(圖12)。未在兩種串聯雙功能抗體間發現實質性差異。當大部分治療組完成時，圖12中平均腫瘤體積之繪製限制至第29天。該研究繼續直至第45天為止且觀察動物之無腫瘤存活期。在經10或1μg之16治療之組中，9個動物中有6個在觀察期結束時係無腫瘤的，且接受10μg之12之9個動物中有5個在第45天係無腫瘤的。當經1μg之12治療時，一個動物保持無腫瘤。
對照組中之所有動物均可靠地發展腫瘤且顯示均質腫瘤生長。使用串聯雙功能抗體中任何一者之治療顯示劑量依賴性抗腫瘤效應且直至第29天為止在兩種串聯雙功能抗體間未發現實質性差異。
僅在經延長之觀察(第45天)後觀察到可偵測之差異，此時低劑量及對照組已因大腫瘤之生長而終止。經16治療之組具有更多之無腫瘤動物。
實例11
已建立之腫瘤模型
開發採用16之具有預先建立之HL-60腫瘤之NOD/scid小鼠中之異種移植模型以證實概念驗證。
簡而言之，對雌性免疫缺陷NOD/scid小鼠進行亞致死照射(2 Gy)且皮下接種4x106個HL-60細胞。在第9天，該等動物接受抗去唾液酸GM1兔抗體(Wako,Neuss,Germany)之單一推注以耗盡鼠科自然殺手(NK)細胞。在第10天，當該腫瘤達成50至150mm3(平均值73±11mm3)之體積時，將動物分配至3個治療組中。對組2及組3(每組各8個動物)腹腔內注射1.5x107個經活化之人類T細胞。注射前，採用陰性選擇將T細胞自膚色血球層(健康供體)分離。根據製造商之說明書(Miltenyi Biotech)以T細胞活化/擴增套組擴增T細胞並活化T細胞。為解決可能供體可變性，將組2及組3細分為兩個隊列，各隊列接受來自個別供體之經擴增及經活化之T細胞。各隊列僅接受來自一個個別T細胞供體之T細胞。
在第13天開始，組3中之動物顯示105mm3之平均腫瘤體積且經總計9次50μg串聯雙功能抗體16(qdx9d)之靜脈內劑量治療。表14繪示組分配及給藥時間表。組1及組2僅用媒劑治療。測定體重及腫瘤體積直至第27天為止。
所有動物均可靠地發展腫瘤，其在第6天可觸到。經媒劑治療之組1及2(HL-60)動物之平均腫瘤體積不斷增加直至第27天研究終止(圖13)。在除HL-60腫瘤細胞外亦接受原代經活化之人類T細胞之組2動物中，平均腫瘤體積相較於組1(僅HL-60)增加更快。
第13天至第21天(qdxd9)在人類T細胞之存在下以串聯雙功能抗體16(50μg/動物；2.5mg/kg)重複之靜脈內治療(組3)相對於組1及組2快速延遲腫瘤生長。相較於經媒劑治療之對照組(組2)，在組3中串聯雙功能抗體16延遲腫瘤生長約4至5天。在第22(p<0.05)、23(p<0.01)及27(p<0.01)天在組2(HL-60、T細胞、媒劑)與組3(HL-60、T細胞、16)之間鑑別在第6天至第27天之時間段中之統計學顯著性差異(利用Bonferroni後測試之雙向重複量測ANOVA)。組1與組3間不存在統計學顯著性差異，因為組1中腫瘤異常緩慢之生長。
當比較一組內的接受來自不同供體之T細胞之隊列1及隊列2中之腫瘤發展時，針對T細胞活性未觀察到供體可變性(參見表14)。
實例10顯示成功開發在具有預先建立之HL-60腫瘤(AML)及經腹腔內植入人類T細胞之NOD/scid小鼠中之異種移植模型。相較於經各自媒劑治療之對照組，以單一劑量水平重複給藥串聯雙功能抗體16導致腫瘤生長之統計學顯著延遲。產生之資料堪比針對使用CD33/CD3 BiTETM之類似研究而公開之結果(Aigner等人，2012；Leukemia,2013,Apr；27(5)：1107-15)。
實例12
CD33/CD3串聯雙功能抗體在AML PDX模型中於NSG小鼠中之效應
使用經冷凍保存之來自CD33+白血病含有2至4% CD3+ T細胞之AML病患之細胞以在NSG小鼠中建立AML PDX模型。在向經照射(250 cGy)之NSG小鼠注射腫瘤細胞後一小時，推注200μL的兩個i.v. 劑量(50μg或5μg；n=8個小鼠/組)中任何一者的CD33/CD3串聯雙功能抗體(16或12)。隨後4天內，每天進行串聯雙功能抗體之額外注射。每週一次對小鼠進行稱重，且接著在第38天對小鼠處死以允許收集外周血液、骨髓及脾臟以藉由流動式細胞測量術進行分析(huCD33、huCD34、huCD45、muCD45、huCD14、huCD3、huCD4、huCD8及7AAD)。結果顯示於圖14中。
圖14顯示，第38天後未經治療之小鼠之骨髓及脾臟中具有大量人類母細胞。相比之下，經每日i.v.注射串聯雙功能抗體12或16治療之小鼠之骨髓及脾臟中顯示大體上較低量之人類AML母細胞。在兩個劑量水平(5及50μg/注射)下皆觀察到CD33/CD3串聯雙功能抗體之強大抗AML效應。
針對CD33/CD3串聯雙功能抗體(12及16)兩者觀察到之抗AML效應遠強於靶向AML之CD123/CD3 DART®抗體在相同小鼠模型中之效應(Hussaini等人：「Targeting CD123 In Leukemic Stem Cells Using Dual Affinity Re-Targeting Molecules(DARTs®)，2013年11月15日，Blood：122(21))。與消除骨髓及脾臟中幾乎所有AML母細胞之CD33/CD3串聯雙功能抗體相比，Hussaini等人報告2.5及0.25mg/kg之CD123/CD3 DART®將PDX模型中之骨髓及脾臟中之AML母細胞之數量僅減少50至1000倍，該等作者進一步報告0.5mg/kg之CD123/CD3 DARTTM將PDX模型中之骨髓及脾臟中之AML母細胞之數量僅減少40至78%。
實例13
CD33/CD3串聯雙功能抗體16介導之靶細胞溶解之快速起效
為評估CD33/CD3串聯雙功能抗體介導之靶細胞溶解之動力學，進行具有不同培養時間之鈣黃綠素釋放細胞毒性分析。將經鈣黃綠素標記之CD33+ HL-60靶細胞與串聯雙功能抗體16之連續稀釋液在作為 效應細胞之原代人類T細胞之存在下以25：1之E：T比率培養30min、1h、2h、3h、4h或5h。在各時間點，使用自經溶解之靶細胞釋放之鈣黃綠素以使用非線性回歸/s形劑量-反應計算EC50值及串聯雙功能抗體16介導之靶細胞溶解。圖15顯示串聯雙功能抗體介導之靶細胞溶解之意外快速起效，且以飽和串聯雙功能抗體濃度培養30min後溶解大於40%。培養4小時後，達成大於90%靶細胞之溶解。表15及圖16匯總在30min至5小時之培養時間下針對串聯雙功能抗體16測定之EC50及特異性溶解值。該等結果進一步證實在所用之分析條件下，培養2小時後達成最大效力(最低EC50值)且在培養5小時後幾乎所有靶細胞被溶解。總而言之，此等結果證實藉由CD33/CD3串聯雙功能抗體介導之非常快速、強力及高效之靶細胞溶解。
實例14
用於向AML病患投與CD33/CD3串聯雙功能抗體之概念驗證臨床試驗方案
用於研究CD33/CD3串聯雙功能抗體16作為急性骨髓性白血病(AML)之治療之此I/II期臨床試驗。
研究結果：
主要：CD33/CD3串聯雙功能抗體16之最大耐受性劑量
次要：測定CD33/CD3串聯雙功能抗體16之活體外反應是否與臨床反應相關聯
I期
最大耐受性劑量(MTD)將在該試驗之I期部分中測定。
1.1 最大耐受性劑量(MTD)將在該試驗之I期部分中測定。
1.2 滿足合格標準之病患將參與CD33/CD3串聯雙功能抗體16之試驗。
1.3 目標係鑑別可在參與者中安全投與而無嚴重或難以操縱之副作用之CD33/CD3串聯雙功能抗體16之最高劑量。給定劑量將區取決於先前已登記於本研究中的參與者之數量及該劑量之耐受情況。並非所有參與者將接受相同劑量。
II期
2.1 後續II期部分將以MTD治療，且目標係測定使用CD33/CD3串聯雙功能抗體16之療法之療法是否導致至少20%之反應率。
II期之主要結果：測定CD33/CD3串聯雙功能抗體16之療法是否導致至少20%之病患達成臨床反應(爆炸性反應(blast response)、輕微反應、部分反應或完全反應)
合格：
藉由外周血液及骨髓分析證明之滿足WHO標準之AML，排除患有急性前髓細胞性白血病(APL)之病患
患有因先期誘導化學療法、復發性疾病或年齡60而難治之AML且根據主治醫師判斷因年齡、身體狀態及/或不利之風險因素而不適合標準細胞毒性療法之病患
年齡18歲
卡諾夫斯基(Karnofsky)身體狀態50%或ECOG身體狀態0至2
預期壽命6週
儘管本文已顯示並描述某些實施例，但熟習此項技術者將顯而易見此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者現將獲知許多改變、變化及取代而不背離本發明。應瞭解本文描述之實施例之各種替代物可應用於該等實施例之實務中。下列隨附申請專利範圍旨在界定本發明之範圍且藉此涵蓋此等申請專利範圍內之方法及結構及其等等效物。
<110> 路克 伊夫尼珍瑪麗 古諾特羅利 康凱爾
<120> 利用雙特異性CD33及CD3結合蛋白之方法
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<223> 人造序列之描述：合成肽
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<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
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<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 112
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<211> 492
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 116
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 117
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 118
<210> 119
<211> 494
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 119
<210> 120
<211> 494
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 120
<210> 121
<211> 494
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成多肽
<400> 121
<210> 122
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 人造序列之描述：合成6xHis標誌
<400> 122
<210> 123
<211> 483
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 123
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<211> 483
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<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 127
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<211> 484
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<211> 480
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 129
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<211> 485
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 134
<210> 135
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
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<400> 135
<210> 136
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<213> 人造序列
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<213> 人造序列
<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 140
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 141
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<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 142
<210> 143
<211> 483
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 143
<210> 144
<211> 483
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 144
<210> 145
<211> 483
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 145
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<211> 483
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 146

Claims (80)

  1. 一種結合至人類CD33及人類CD3之蛋白質之用途，其用於製備用於治療已接受造血幹細胞移植病患之急性骨髓性白血病(AML)之組合物。
  2. 如請求項1之用途，其中該移植係同種異體的。
  3. 如請求項1之用途，其中該移植係自體的。
  4. 如請求項1之用途，其中該病患未接受調節方案。
  5. 如請求項1之用途，其進一步包含向該病患投與調節方案。
  6. 如請求項5之用途，其中該蛋白質係在該調節方案後投與。
  7. 如請求項6之用途，其中該調節方案係清髓性的(myeloablative)。
  8. 如請求項6之用途，其中該調節方案係非清髓性的。
  9. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該病患係完全緩解。
  10. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該病患有微量殘餘疾病。
  11. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該病患經歷失敗的化學療法或放射療法。
  12. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該病患經歷失敗的誘導化學療法。
  13. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該病患經歷失敗的鞏固(consolidation)或維持(緩解後)化學療法。
  14. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該AML係復發性。
  15. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該AML係難治性。
  16. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該AML係高風險的且處於緩解中。
  17. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係在該造血幹細胞移植後立即投與。
  18. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後三天投與。
  19. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後七天投與。
  20. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後兩週投與。
  21. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係在造血幹細胞移植後四週投與。
  22. 如請求項1至8中任一項之用途，其中該蛋白質係投與選自由以下組成之群之一段時間：四週、八週、三個月、四個月、六個月、八個月、十個月、十二個月、十八個月及二十四個月。
  23. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該蛋白質係在同種異體移植(allogeneic setting)進展時與供體淋巴球一起投與。
  24. 如請求項1至2中任一項之用途，其中該蛋白質係在同種異體移植進展時投與，但不投與供體淋巴球。
  25. 如請求項1之用途，其中該蛋白質包含對人類CD33及人類CD3具有特異性之重鏈及輕鏈域。
  26. 如請求項25之用途，其中該蛋白質係抗體或抗體衍生物。
  27. 如請求項26之用途，其中該蛋白質包含Fab、Fab’或F(ab’)2片段。
  28. 如請求項27之用途，其中該蛋白質係單鏈Fv、串聯單鏈Fv、雙特異性T細胞接合子(engager)、雙重親和力重靶向(retargeting)抗體、雙功能抗體(diabody)或雙特異性串聯雙功能抗體。
  29. 如請求項28之用途，其中該蛋白質係雙特異性串聯雙功能抗體。
  30. 如請求項29之用途，其中該串聯雙功能抗體包含第一多肽及第 二多肽，各多肽具有至少四個彼此相連之可變鏈域，其中各多肽包含：(i)對人類CD33具有特異性之可變重鏈(VH)域；(ii)對人類CD33具有特異性之可變輕鏈(VL)域；(iii)對人類CD3具有特異性之VH域，及(iv)對人類CD3具有特異性之VL域。
  31. 如請求項30之用途，其中在各多肽中，該等四個可變鏈域係藉由肽連接子L1、L2及L3按以下順序彼此相連：VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3)；VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3)；VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33)；或VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)。
  32. 如請求項31之用途，其中對人類CD33具有特異性之VL域包含由選自由SEQ ID NO：21至27組成之群之序列組成之CDR1，由選自由SEQ ID NO：28至34組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：35至41組成之群之序列組成之CDR3。
  33. 如請求項32之用途，其中對人類CD33具有特異性之VH域包含由選自由SEQ ID NO：42至48組成之群之序列組成之CDR1，由選自由SEQ ID NO：49至55組成之群之序列組成之CDR2及由選自由SEQ ID NO：56至63組成之群之序列組成之CDR3。
  34. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對人類CD33具有特異性之VL域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：(i)SEQ ID NO：21、28及35；(ii)SEQ ID NO：22、29及36；(iii)SEQ ID NO：23、30及37；(iv)SEQ ID NO：24、31及38； (v)SEQ ID NO：25、32及39；(vi)SEQ ID NO：26、33及40；及(vii)SEQ ID NO：27、34及41。
  35. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對CD33具有特異性之VH域之CDR1、CDR2及CDR3係選自由以下組成之群之序列：(i)SEQ ID NO：42、49及56；(ii)SEQ ID NO：43、50及57；(iii)SEQ ID NO：43、50及58；(iv)SEQ ID NO：43、50及59；(v)SEQ ID NO：43、50及60；(vi)SEQ ID NO：44、51及61；(vii)SEQ ID NO：45、52及62；(viii)SEQ ID NO：46、53及63；(ix)SEQ ID NO：47、54及63；及(x)SEQ ID NO：48、55及63。
  36. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對CD33具有特異性之VL及VH域係選自由以下組成之群之序列：(i)SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：11；(ii)SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：12；(iii)SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：13；(iv)SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：14；(v)SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：15；(vi)SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：16；(vii)SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：17；(viii)SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：18；(ix)SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19；及 (x)SEQ ID NO：10及SEQ ID NO：20。
  37. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對人類CD3具有特異性之VH域包含STYAMN(SEQ ID NO：72)之CDR1序列、RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO：73)之CDR2序列及HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO：74)或HGNFGNSYVSYFAY(SEQ ID NO：75)之CDR3序列。
  38. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對人類CD3具有特異性之VL域包含RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO：90)之CDR1序列、GTNKRAP(SEQ ID NO：91)之CDR2序列及ALWYSNL(SEQ ID NO：92)之CDR3序列。
  39. 如請求項31至33中任一項之用途，其中對CD3具有特異性之VL及VH域係選自由以下組成之群之序列：(i)SEQ ID NO：64及SEQ ID NO：68；(ii)SEQ ID NO：65及SEQ ID NO：69；(iii)SEQ ID NO：66及SEQ ID NO：70；及(iv)SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：71。
  40. 如請求項31至33中任一項之方法，其中各多肽包含選自由以下組成之群之四個可變鏈域：(i)SEQ ID NO：2、12、65及69；(ii)SEQ ID NO：3、13、65及69；(iii)SEQ ID NO：4、14、65及69；(iv)SEQ ID NO：5、15、65及69；(v)SEQ ID NO：1、11、64及68；(vi)SEQ ID NO：2、12、64及68；(vii)SEQ ID NO：2、12、66及70；(viii)SEQ ID NO：4、14、66及70； (ix)SEQ ID NO：5、15、66及70；(x)SEQ ID NO：3、13、64及68；(xi)SEQ ID NO：3、13、67及71；(xii)SEQ ID NO：4、14、64及68；(xiii)SEQ ID NO：5、15、64及68；(xiv)SEQ ID NO：7、17、64及68；(xv)SEQ ID NO：6、16、64及68；(xvi)SEQ ID NO：6、16、67及71；(xvii)SEQ ID NO：8、18、64及68；(xviii)SEQ ID NO：9、19、64及68；(xix)SEQ ID NO：9、19、67及71；及(xx)SEQ ID NO：10、20、64及68。
  41. 如請求項31之用途，其中連接子L1、L2及L3由約12個或更少之胺基酸殘基組成。
  42. 如請求項41之用途，其中連接子L1、L2及L3係各獨立地選自GGSGGS(SEQ ID NO：95)、GGSG(SEQ ID NO：96)或GGSGG(SEQ ID NO：97)。
  43. 如請求項31、41或42中任一項之用途，其中該串聯雙功能抗體包含選自由SEQ ID NO：98至121組成之群之序列。
  44. 如請求項43之用途，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：98)、02(SEQ ID NO：99)、03(SEQ ID NO：100)、04(SEQ ID NO：101)、05(SEQ ID NO：102)、06(SEQ ID NO：103)、07(SEQ ID NO：104)、08(SEQ ID NO：105)、09(SEQ ID NO：106)、10(SEQ ID NO：107)、11(SEQ ID NO：108)、12(SEQ ID NO：109)、13(SEQ ID NO：110)、14(SEQ ID NO：111)、15(SEQ ID NO：112)、16(SEQ ID NO：113)、17(SEQ ID NO：114)、 18(SEQ ID NO：115)、19(SEQ ID NO：116)、20(SEQ ID NO：117)、21(SEQ ID NO：118)、22(SEQ ID NO：119)、23(SEQ ID NO：120)或24(SEQ ID NO：121)。
  45. 如請求項31、41或42中任一項之用途，其中該串聯雙功能抗體包含選自由SEQ ID NO：123至146組成之群之序列。
  46. 如請求項45之用途，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)、02(SEQ ID NO：124)、03(SEQ ID NO：125)、04(SEQ ID NO：126)、05(SEQ ID NO：127)、06(SEQ ID NO：128)、07(SEQ ID NO：129)、08(SEQ ID NO：130)、09(SEQ ID NO：131)、10(SEQ ID NO：132)、11(SEQ ID NO：133)、12(SEQ ID NO：134)、13(SEQ ID NO：135)、14(SEQ ID NO：136)、15(SEQ ID NO：137)、16(SEQ ID NO：138)、17(SEQ ID NO：139)、18(SEQ ID NO：140)、19(SEQ ID NO：141)、20(SEQ ID NO：142)、21(SEQ ID NO：143)、22(SEQ ID NO：144)、23(SEQ ID NO：145)或24(SEQ ID NO：146)。
  47. 如請求項1之用途，其中該用途進一步包含投與包含以下之組合物：阿糖胞苷(cytarabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、地西他濱(decitabine)、蒽環類(anthracycline)、氟達拉濱(fludarabine)、氯法拉濱(clofarabine)、克拉屈濱(cladribine)、奈拉濱(nelarabine)、胺甲喋呤(methotrexate)、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、黴法蘭(melphalan)、依魯替尼(ibrutinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、阿普斯特(apremilast)、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、蒽二酮(anthracenedione)、抗CD20劑或其組合。
  48. 如請求項1之用途，其中該AML係具有復發性基因異常之AML、 具有骨髓發育不良相關變化之AML、與療法相關之骨髓腫瘤、髓樣肉瘤、與唐氏症侯群相關之骨髓增殖、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤或不另外分類之AML。
  49. 如請求項1之用途，其中該AML係AML-M0、AML-M1、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5、AML-M6或AML-M7。
  50. 如請求項1之用途，其中該用途進一步包含將該蛋白質投與在接受清髓性調節方案後已接受同種異體造血幹細胞移植之病患。
  51. 如請求項50之用途，其中該用途進一步包含將該蛋白質投與在接受非清髓性調節方案後已接受同種異體造血幹細胞移植之病患。
  52. 一種對人類CD33及人類CD3具有特異性之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體包含選自SEQ ID NO：123至146之序列。
  53. 如請求項52之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)、02(SEQ ID NO：124)、03(SEQ ID NO：125)、04(SEQ ID NO：126)、05(SEQ ID NO：127)、06(SEQ ID NO：128)、07(SEQ ID NO：129)、08(SEQ ID NO：130)、09(SEQ ID NO：131)、10(SEQ ID NO：132)、11(SEQ ID NO：133)、12(SEQ ID NO：134)、13(SEQ ID NO：135)、14(SEQ ID NO：136)、15(SEQ ID NO：137)、16(SEQ ID NO：138)、17(SEQ ID NO：139)、18(SEQ ID NO：140)、19(SEQ ID NO：141)、20(SEQ ID NO：142)、21(SEQ ID NO：143)、22(SEQ ID NO：144)、23(SEQ ID NO：145)或24(SEQ ID NO：146)。
  54. 如請求項53之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體對選自HL-60、KG-1及U-937之CD33+腫瘤細胞上之CD33具有50nM或更小之結合KD。
  55. 如請求項54之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體對CD33+ HL-60腫瘤細胞上之CD33具有15nM或更小結合KD。
  56. 如請求項55之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中串聯雙功能抗體特異性結合至人類CD33之抗原決定基，該抗原決定基係在人類CD33之62DQEVQEETQ70(SEQ ID NO：94)(SEQ ID NO：93之胺基酸殘基62至70)內。
  57. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體01(SEQ ID NO：123)。
  58. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體02(SEQ ID NO：124)。
  59. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體03(SEQ ID NO：125)。
  60. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體04(SEQ ID NO：126)。
  61. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體05(SEQ ID NO：127)。
  62. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體06(SEQ ID NO：128)。
  63. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗 體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體07(SEQ ID NO：129)。
  64. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體08(SEQ ID NO：130)。
  65. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體09(SEQ ID NO：131)。
  66. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體10(SEQ ID NO：132)。
  67. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體11(SEQ ID NO：133)。
  68. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體12(SEQ ID NO：134)。
  69. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體13(SEQ ID NO：135)。
  70. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體14(SEQ ID NO：136)。
  71. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體15(SEQ ID NO：137)。
  72. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體16(SEQ ID NO：138)。
  73. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體17(SEQ ID NO：139)。
  74. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體18(SEQ ID NO：140)。
  75. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體19(SEQ ID NO：141)。
  76. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體20(SEQ ID NO：142)。
  77. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體21(SEQ ID NO：143)。
  78. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體22(SEQ ID NO：144)。
  79. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體23(SEQ ID NO：145)。
  80. 如請求項52至56中任一項之雙特異性抗原結合串聯雙功能抗 體，其中該串聯雙功能抗體係串聯雙功能抗體24(SEQ ID NO：146)。
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