CN116396386A - Cd3抗体及其药物用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及CD3抗体及其药物用途。具体涉及CD3抗体分子与其他靶点的结合分子形成多特异性抗体。多特异性抗体能够同时与CD3和其他肿瘤相关抗原相结合,结合肿瘤相关抗原表达细胞的同时,结合并激活CD3阳性的T细胞,进而促进T细胞对表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞特异性的杀伤。同时,本公开还提供多特异性抗体的制备、应用。
Description
本申请是申请号为201980072290.1,申请日为2019年12月06日,发明名称为“CD3抗体及其药物用途”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及CD3抗体,如CD3的人源化抗体以及同时结合CD3和肿瘤相关抗原的多特异性抗体。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息,而不必然地构成现有技术。
CD3是由四条不同的链组成的T细胞共受体(Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T cell Receptor:Insights Into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation Of Signaling,”Cold SpringHarb.Perspect.Biol.2(4):a005140;1-14页;Chetty,R.等(1994)“CD3:Structure,Function,And Role Of Immunostaining In Clinical Practice,”J.Pathol.173(4):303-307;Guy,C.S.等(2009)“Organization Of Proximal Signal Initiation At TheTCR:CD3 Complex,”Immunol.Rev.232(1):7-21)。
在哺乳动物中,CD3多亚基形成的复合物与T细胞受体(TCR)的分子缔合,以便在T淋巴细胞中产生激活信号(Smith-Garvin,J.E.等(2009)“T Cell Activation,”Annu.Rev.Immunol.27:591-619)。在没有CD3的情况下,TCR不能适当组装并且降解(Thomas,S.等(2010)“Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T cellReceptor Gene Transfer,”Immunology 129(2):170-177)。研究发现CD3结合所有成熟的T细胞的膜,并且几乎不与其他细胞类型结合(Janeway,C.A.等(2005):Immunobiology:TheImmune System In Health And Disease,”第六版,Garland Science Publishing,NY,pp.214-216;Sun,Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell ReceptorSignaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An EctodomainFragment Of The CD3ε:γHeterodimer,”Cell 105(7):913-923;Kuhns,M.S.等(2006)“Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex,”Immunity.2006Feb,24(2):133-139)。
T细胞上T细胞受体(TCR)复合物的恒定的CD3ε信号传导组分已经被用作靶,以促使在T细胞和肿瘤细胞之间形成免疫学突触。CD3和肿瘤抗原的共接合(co-engagement)激活了T细胞,引起表达肿瘤抗原的肿瘤细胞的裂解(Baeuerle等(2011)“Bispecific T CellEngager For Cancer Therapy,”In:Bispecific Antibodies,Kontermann,R.E.(Ed.)Springer-Verlag;2011:273-287)。该方法允许双特异性抗体以对肿瘤细胞的高特异性与T细胞小室(compartment)全面相互作用并且广泛适用于大量的细胞表面肿瘤抗原。
B7H3是B7家族的成员之一,属于Ⅰ型跨膜蛋白,包含氨基端的一个信号肽,一个细胞外的免疫球蛋白样可变区(IgV)和恒定区(IgC)、一个跨膜区和一个含有45个氨基酸的胞质尾区(Tissue Antigens.2007Aug;70(2):96-104)。目前,B7H3主要存在2种剪切体,B7H3a和B7H3b。B7H3a胞外段由IgV-IgC 2个免疫球蛋白结构域组成,又称为2IgB7H3,而B7H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4个免疫球蛋白结构域组成,又称为4IgB7H3。
B7H3蛋白质在正常组织、细胞中不表达或极低表达,却高表达于多种肿瘤组织,并与肿瘤的进展、患者的生存及预后密切相关。临床上已经报道,B7H3在许多癌症类型中、特别是在非小细胞肺癌、肾癌、泌尿道上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中过表达(Lung Cancer.2009Nov;66(2):245-249;Clin CancerRes.2008Aug 15;14(16):5150-5157)。此外,也有文献报道,在前列腺癌中,B7H3的表达强度与临床病理学恶性(诸如肿瘤体积、前列腺外侵袭或Gleason评分)正相关,且也与癌症进展相关(Cancer Res.2007Aug 15;67(16):7893-7900)。类似地,在多形性胶质母细胞瘤中,B7H3的表达与无事件存活负相关,且在胰腺癌中,B7H3的表达与淋巴结转移和病理学进展相关。因此,B7H3被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点。
发明内容
本公开提供能特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段。
一方面,本公开提供一种特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:所述轻链可变区包含分别如SEQ IDNO:48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,以及
所述重链可变区为选自以下i)至v)任一项的重链可变区:
i)包含分别如SEQ ID NO:37、38和39所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区;
ii)包含分别如SEQ ID NO:37、40和41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区;
iii)包含分别如SEQ ID NO:37、40和42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区;
iv)包含分别如SEQ ID NO:37、40和43所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区;或
v)包含分别如SEQ ID NO:37、47和45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区。
在一些实施方式中,所述特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,其中所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段包含选自如SEQ ID NO:36所示的轻链可变区和/或选自如SEQ ID NO:29、30、31、32和35中任一项所示的重链可变区。
在一些实施方式中,其中所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段进一步包含抗体的轻链恒定区和/或重链恒定区;任选地,所述轻链恒定区为人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,所述重链恒定区为人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
在一些实施方式中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。
在另一方面,本公开提供一种单链抗体,含有如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段中的轻链可变区和重链可变区。
在一些实施方式中,所述单链抗体的序列如SEQ ID NO:55、56、57、58、61、62、63、64、65或68所示。
在另一方面,本公开提供一种多特异性抗体,所述多特异性抗体特异性结合人CD3和肿瘤相关抗原(TAA),所述多特异性抗体包含如前所述的单链抗体或如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,其中所述的多特异性抗体,所述肿瘤相关抗原选自AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原(Thompson-nouvelle antigen;Tn)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、尿溶蛋白-3和5T4(Trophoblast glycoprotein)。优选地,所述肿瘤相关抗原选自B7H3、BCMA、CEA、CD19、CD20、CD38、CD138、Claudin18.2、PSMA和间皮素。
在另一方面,本公开提供一种药物组合物,其含有治疗有效量的根据前述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体,以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。在一些实施方案中,所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg(更优选为1-1000mg)的如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体。
在另一方面,本公开提供一种分离的核酸分子,其编码如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、编码如前所述的单链抗体,或编码如前所述的多特异性抗体。
在另一方面,本公开提供一种重组载体,其包含如前所述的分离的核酸分子。
在另一方面,本公开提供一种用如前所述的重组载体转化的宿主细胞,所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞,优选为真核细胞,更优选哺乳动物细胞或昆虫细胞。
在另一方面,本公开提供一种用于生产如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体的方法,所述方法包括将如前所述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体,以及从培养物回收所述抗体或其抗原结合片段、所述单链抗体或所述多特异性抗体的步骤。
在另一方面,本公开提供作为药物的如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子。在一些实施方案中,所述药物为激活T细胞药物;在一些实施方案中,所述药物为治疗癌症的药物、或治疗自身免疫性或炎性疾病的药物。
在另一方面,本公开提供如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子在制备激活T细胞的药物中的用途。
在另一方面,本公开提供一种激活T细胞的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子。在一些实施方案中,所述方法包括向受试者施用包含单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg(更优选为1-1000mg)的如前所述的多特异性蛋白分子或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子。
在另一方面,本公开提供一种治疗癌症或自身免疫性或炎性疾病的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子。在一些实施方案中,所述方法包括向受试者施用包含单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg(更优选为1-1000mg)的如前所述的多特异性蛋白分子或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子。
在另一方面,本公开提供如前所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如前所述的单链抗体,或如前所述的多特异性抗体或如前所述的药物组合物,或如前所述的分离的核酸分子在制备治疗癌症、或自身免疫性或炎性疾病的药物中的用途。
在一些实施方式中,前面任一所述癌症选自癌瘤,淋巴瘤,胚细胞瘤(blastoma),肉瘤,和白血病或淋巴样恶性。所述癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、咽喉癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。在一些实施方案中,其中所述的癌症为B7-H3阳性细胞相关的癌症;优选为乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
在一些实施方式中,前面任一所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自:类风湿关节炎、牛皮癣、克罗恩病、强硬性脊柱炎、多发性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren综合征、移植排斥后的自体免疫性溶血性贫血、水疱性类天疱疮、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血。
附图说明
图1A和图1B:图1A为双价双特异性抗体示意图,图1B为单价双特异性抗体示意图。
图2A至图2D:流式细胞术对抗体与表达或不表达相应抗原的细胞结合活性检测。图2A为不同抗体与表达人B7H3的A498细胞的结合活性检测,图2B为不同抗体与过表达人B7H3的CT26细胞的结合活性检测,图2C为不同抗体与不表达人B7H3的CT26细胞的结合活性检测,结果显示各抗体均不与不表达人B7H3的CT26细胞结合,图2D为不同抗体与表达CD3的Jurkat重组细胞结合活性检测。图2A至图2D中纵坐标表示荧光信号的几何平均值。
图3A至图3B:含有不同CD3 scFv的双特异性抗体对A498的杀伤活性检测。图3A为B7H3单价双特异性抗体的杀伤活性。图3B为B7H3双价双特异抗体的杀伤活性。除了155、156、185和186对A498的杀伤活性较弱之外,其余双特异抗体,无论B7H3单价还是双价,均显示出较明显的杀伤活性。
图4A至图4B:含有相同CD3 scFv的B7H3单双价双特异性抗体对A498杀伤活性比较。图4A为含HRH1的B7H3单价(181)和双价(131)双特异抗体的杀伤活性比较。图4B为含HRH7的B7H3单价(187)和双价(177)的杀伤活性比较。实验结果均显示B7H3双价双特异性抗体较B7H3单价双特异性抗体都具有明显的A498杀伤活性,同时,B7H3双价双特异性抗体较B7H3单价双特异性抗体的杀伤活性显著增强。
图5A至图5C:含有相同CD3重链可变区,不同结构顺序的B7H3双价双特异性抗体对A498的杀伤活性检测。图5A为含HRH2的第一多肽链排列顺序不同的(AFF1、AFF2、AFF3、AFF4)B7H3双价双特异性抗体间的杀伤活性比较。图5B为含HRH2的第二多肽链排列顺序不同的(AFF3、AFF3-B)B7H3双价双特异性抗体间的杀伤活性比较。结果显示序列相同,VH和VL排列顺序不同的B7H3双价双特异性抗体均具有显著的A498细胞杀伤活性,并且不同结构顺序的分子间杀伤活性相近。图5C为包含相同B7H3 scFv和CD3 scFv的不同结构的双特异性抗体的杀伤活性比较,三个待测双特异抗体127与201、202均具有杀伤A498肿瘤细胞的活性,其中双特异性抗体127的杀伤活性优于201和202。
图6A至图6B:不同抗体对Jurkat重组细胞的激活检测。图6A是抗体在含A498细胞的情况下,抗体介导的B7H3靶点特异的Jurkat重组细胞激活;图6B是抗体在不含A498细胞的情况下,介导的非B7H3靶点特异的Jurkat重组细胞激活。图6A和图6B中的图例所指示的抗体一致。
图7A至图7B:含有相同CD3scFv不同价双特异性抗体对Jurkat重组细胞的激活检测。图7A是B7H3单/双价双特异性抗体在含A498细胞的情况下,抗体介导的B7H3靶点特异的Jurkat重组细胞激活;图7B是B7H3单/双价双特异性抗体在不含A498细胞的情况下,介导的非B7H3靶点特异的Jurkat重组细胞激活。
图8A至图8C:不同抗体在有A498细胞存在时,刺激PBMC产生B7H3靶点特异的细胞因子分泌测试。图8A为不同抗体刺激PBMC的IFNγ分泌水平比较,图8B为不同抗体刺激PBMC的TNFα分泌水平比较,图8C为不同抗体刺激PBMC的IL-2分泌水平比较。图8A-图8C显示118、127和132抗体能显著刺激PBMC产生B7H3靶点特异的细胞因子分泌。图8A至图8C中的图例所指示的抗体一致。
图9A至图9C:不同抗体在CHOK1细胞(不表达B7H3)存在时,刺激PBMC产生非B7H3靶点特异的细胞因子分泌测试。图9A为不同抗体刺激PBMC分泌的IFNγ水平比较,图9B为不同抗体刺激PBMC分泌的TNFα水平比较,图9C为不同抗体刺激PBMC分泌细胞的IL-2水平比较。图9A-图9C显示118、127和132抗体不能刺激PBMC进行非B7H3靶点特异的细胞因子分泌,具有很强的安全性。图9A至图9C中的图例所指示的抗体一致。
图10A至图10E:双特异抗体在人PBMC重建的小鼠A498模型中的抗肿瘤疗效检测。图10A为低剂量B7H3双价双特异性抗体的抑瘤活性检测,低剂量的118和119抗体仍显示出一定的抑瘤活性,并且显示出一定的剂量依赖性。图10B为0.3mpk和0.6mpk剂量B7H3双价双特异性抗体的抑瘤活性检测,113抗体显示出剂量依赖的肿瘤体内抑制活性。图10C为0.12mpk和0.36mpk剂量B7H3双价双特异性抗体的抑瘤活性检测,两剂量下118抗体显示出显著的抑瘤活性。图10D为0.36mpk剂量下B7H3双价双特异性抗体的抑瘤活性检测,126、127和128抗体均显示出显著的抑瘤活性。图10E为127抗体在不同剂量和不同给药频次下的抑瘤活性。图10A至图10E中,Vehicle表示PBS给药的阴性对照组。
图11A至图11B:双特异抗体在hCD3 KI小鼠模型中的抗肿瘤疗效。图11A和图11B分别为118和132在hCD3 KI小鼠模型中的抑瘤效果。
发明详述
术语(定义)
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
术语“多特异性蛋白分子”指能够与两个或两个以上的目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子。能够对两个目标抗原或目标抗原表位特异性结合的蛋白分子称为双特异性蛋白分子,包含抗体或抗体的抗原结合片段(如单链抗体)。“双特异性蛋白分子”在本文中可以与“双特异性抗体”互换。
术语针对抗原的“结合区”或“结合区域”是指在多特异性蛋白分子或在抗体分子中,能够与抗原特异性结合的区域或部分(part),抗原结合区可以是能直接与抗原结合的配体结合结构域部分、也可以是能直接与抗原结合的包含抗体可变区的结构域。
术语“抗体(antibody,Ab)”包含任何包括至少一个与具体抗原(例如CD3)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包含:包括通过双硫键相互连接的四条多肽链,二条重(H)链和二条轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。各重链包含重链可变区(文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。这一重链恒定区包含三个区(结构域),CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个区(结构域,CL1)。VH和VL区可进一步细分为高变区,称为互补决定区(CDR),其间散布着较保守性区域,称为框架区(framework region,FR,也称骨架区、构架区)。各VH和VL是由三个CDR和四个FR所组成,以下列顺序由氨基端排列到羧基端:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开的不同实施例中,抗CD3抗体(或其抗原结合部分)、抗B7H3抗体(或其抗原结合部分)或抗其他目标抗原的FR可与人类生殖系序列相同,或可经自然或人工修饰。抗体可以是不同亚类(subclass)的抗体,例如,IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4亚类)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
术语“抗体”还包含完全抗体分子的抗原结合片段。术语抗体的“抗原结合部分”、“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”等,如文中所用,包含任何与抗原特异性结合形成复合物的天然生成、酶制得、合成或基因工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可使用任何适合的标准技术,例如蛋白质水解消化作用或涉及编码抗体可变区和(视需要)恒定区的DNA操作和表达的重组基因工程技术,来源于例如全抗体分子。这一DNA是已知的和/或可容易地从例如市售来源、DNA资料库(包含,例如噬菌体-抗体资料库)取得或可经合成。这一DNA可用化学或通过使用分子生物技术来定序和操作,例如将一个或多个可变和/或恒定区排列成适合的配置,或导入密码子,产生半胱氨酸残基、修饰、增添或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限定示例包含:(i)Fab片段;(ii)F(ab′)2片段;(iii)Fd片段;(iv)Fv片段;(v)单链Fv(scFv)分子;(vi)dAb片段。其它工程改造分子,例如区域特异性抗体、单域抗体、区域删除抗体、嵌合抗体、CDR-植入抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、双价纳米抗体等)、小模块免疫医药(SMIP)和鲨可变IgNAR区,也涵盖在文中所用的“抗原结合片段”的词语内。
抗体的抗原结合片段典型地将包含至少一个可变区。可变区可以是任何大小或氨基酸组成的区域且一般将包含与一个或多个框架序列相邻或在其框架内的CDR。在具有VH区与VL区结合的抗原结合片段中,VH和VL区可以任何适合的排列位于彼此相对处。例如可变区可为二聚化并含有VH-VL或VL-VH二聚体。
在某些实施例中,抗体的抗原结合片段在任何可变区和恒定区的配置中,可变区和恒定区可直接彼此相连接或可通过完整或部分的绞链或连接子区相连接。绞链区可由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸所组成,使其在单一多肽分子中于相邻的可变和/或恒定区之间产生柔性和半柔性连结。再者,在本发明的抗体的抗原结合片段可包含以非共价彼此相互连结和/或与一个或多个单体VH或VL区相连结(例如以双硫键)的任何上列的可变区和恒定区配置的同源二聚体或异源二聚体(或其它多聚体)。
“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的来源于小鼠的单克隆抗体。制备时用抗原注射试验对象,然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤,当所注射的试验对象为小鼠时,所产生的抗体为鼠源抗体。
“嵌合抗体(chimeric antibody)”,是将鼠源抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体,要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤,然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因,再根据需要克隆人抗体的恒定区基因,将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中,最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中,所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区,优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变,L234A和/或L235A突变,或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”,包括CDR移植抗体(CDR-graftedantibody),是指将动物来源抗体,例如鼠源抗体的CDR序列移植到人的抗体可变区框架区(或构架区,framework region)中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量异源蛋白成分,从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网http://www.vbase2.org/获得),以及在Kabat,E.A.等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时,引起的活性下降,可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少的反向突变或回复突变,以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。
由于抗原的接触残基,CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以可能是体细胞高度突变的结果。因此,可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查动物单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系,那么可将序列与亚类共有序列或具有高相似性百分数的动物抗体序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果,从而在结合中起着重要作用。
在本公开一个的实施方案中,所述的抗体或其抗原结合片段,可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
“人抗体”与“人源抗体”可以互换使用,可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体,该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中,将人重链和轻链基因座的元素元件引入到源于胚胎干细胞系的生物体的细胞株中,这些细胞系中的内源性重链和轻链基因座被靶向破坏这些细胞系中包含靶向的内源性重链和轻链基因座破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体,并且该生物可以用于产生人抗体-分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体,其中重链和轻链是由源于一个或多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建,或者由体外活化的B细胞构建,所有的这些都是本领域已知的。
“单克隆抗体”是指从基本上均质抗体的群体获得的抗体,即除可能的变体抗体(例如含有天然存在的突变或在制造单克隆抗体制剂的期间产生的突变,这些变体通常以少量存在)之外,构成所述群体的个别抗体相同和/或结合相同表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物(制剂)的每个单克隆抗体是针对抗原上的单一决定簇的。因此,修饰语“单克隆”指示如从基本上均质抗体群体获得的抗体的特性,且不应解释为需要通过任何特定方法来制造抗体。例如,根据本公开使用的单克隆抗体可通过各种技术制备,所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,此类方法以及用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中进行描述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、“完全抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用,指基本上完整形式的抗体,与下文定义的抗原结合片段相区分。该术语特别指重链包含Fc区的抗体。
此外,虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码,但可使用重组方法,通过合成的接头连接它们,从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv);参见,例如,Bird等人(1988)Science242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段,并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选的片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。
抗原结合片段还可并入至包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中,该对串联Fv片段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人,1995ProteinEng.8(10):1057-1062;及美国专利US5641870)。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000Da的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段,其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab')2是通过用胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000Da并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab'是通过切割上述F(ab')2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000Da并具有抗原结合活性的抗体片段。Fab'可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理特异性识别并结合抗原的F(ab')2来生产。
此外,可以通过将编码抗体的Fab'片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab'来生产所述Fab'。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域;VH)和抗体轻链可变结构域(或区域;VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成,例如使用1-4个(包括1个、2个、3个或4个)重复的变体(Holliger等人(1993),Proc Natl Acad Sci USA.90:6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur J Immuno.31:94-106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999),J Mol Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol Immunother.50:51-59.描述。
“多特异性抗体”是指包含两个或更多个抗原结合结构域,能够结合两个或更多个不同的表位(例如,两个、三个、四个或更多个不同的表位),表位可以在相同或不同的抗原上的抗体。多特异性抗体的示例包括结合两个不同表位的“双特异性抗体”。
术语肿瘤相关抗原的“双价双特异性抗体”是指双特异性抗体中针对某个肿瘤相关抗原靶点具有两个抗原结合区,例如B7H3双价双特异性抗体指在该双特异性抗体中包含两个针对B7H3的抗原结合区。术语“单价双特异性抗体”是指双特异性抗体中针对某个靶点只有一个抗原结合区,例如B7H3单价双特异性抗体指在该双特异性抗体中包含一个针对B7H3的抗原结合区。
“Linker”或“接头”或“连接子”或用于连接两个蛋白质结构域中间的“L1”指用于连接蛋白质结构域的连接性多肽序列,通常具有一定的柔性,linker的使用不会使蛋白质结构域原有的功能丧失。
双抗体(diabody)是指scFv被二聚体化的抗体片段,是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中,两个抗原可以是相同或不同的。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering.7:697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开一些实施例中抗原结合片段可以通过以下步骤来生产:获得本公开的特异性识别并结合抗原的单克隆抗体的VH和/或VL及所需的其他结构域的编码cDNA,构建编码抗原结合片段的DNA,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达抗原结合片段。
"Fc区"可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化,但人IgG重链Fc区通常被定义成从位置Cys226上的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基端。Fc区中的残基的编号为如Kabat中的EU索引的编号。Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白的Fc区通常具有两个恒定区结构域CH2和CH3。文中“第一Fc”也称作“Fc1”,第二Fc也称作“Fc2”。
“Va1-L1-Vb1-L2-Vc2-L2-Vd2-L4-Fc1”与“Ve3-L5-Vf3-L6-Fc2”中Va1、Vb1、Vc2、Vd2、Ve3和Vf3为抗体的轻链可变区或重链可变区,Va1和Vb1结合第一抗原表位,Vc2和Vd2结合第二抗原表位,Ve3和Vf3结合第三抗原表位,第一抗原表位、第二抗原表位和第三抗原表位可以相同或不同。
类似“VHTAA-L1-VLTAA-L2-VHCD3-L3-VLCD3-L4-Fc1”中,VHTAA和VLTAA表示抗体可变区结合肿瘤相关抗原的表位,VHCD3和VLCD3表示抗体可变区结合CD3的表位。
本公开“knob-Fc”指在抗体Fc区包含T366W的点突变,以形成类似knob的空间结构。相对应地,“hole-Fc”指在抗体Fc区包含T366S,L368A,Y407V的点突变,以形成类似hole的空间结构。Knob-Fc和hole-Fc由于空间位阻的原因,更易形成异二聚体。为进一步地促进异二聚体的形成,还可在knob-Fc和hole-Fc分别引入S354C和Y349C的点突变,通过二硫键进一步促进异二聚体的形成。同时,为消除或减弱抗体Fc引起的ADCC效应,还可向Fc引入的234A和235A的取代突变。例如,本公开优选的knob-Fc和hole-Fc分别如SEQ ID NO:69和70所示。在双特异性抗体中,knob-Fc或hole-Fc既可以作为第一多肽链的Fc区域,也可以作为第二多肽链的Fc区域,在同一双特异性抗体中,第一多肽链和第二多肽链的Fc区不同时为knob-Fc或hole-Fc。
术语“氨基酸差异”或“氨基酸突变”是指相较于原蛋白质或多肽,变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变,包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个或数个氨基酸的插入、缺失或替换。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。如在本领域中已知的,重链和轻链的可变区各自由通过3个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的4个框架区(FR)组成。每一条链中的CDR通过FR紧密地保持在一起并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合部位的形成。存在至少2个用于确定CDR的技术:(1)基于跨种序列变异性的方法(即,Kabat等Sequences of Proteins ofImmunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,BethesdaMD));和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-Lazikani等,J.Molec.Biol.273:927-948(1997))。如本文中所用,CDR可指由任一方法或由两种方法的组合确定的CDR。
术语“抗体框架”或“FR区”,是指可变结构域VL或VH的一部分,其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲,其是不具有CDR的可变结构域。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人,(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中一些实施方式中使用的,CDR可以以Kabat规则(Kabat等Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))定义轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(LCDR1、LCDR2、LCDR3),以及重链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(HCDR1、HCDR2、HCDR3),例如在对本公开中CD3抗体CDR的定义。在另一些实施方式中,还可以采用IMGT等规则进行抗体的CDR的定义,例如在对B7H3抗体CDR即采用的是IMGT规则进行定义。
术语“肿瘤抗原”是指由肿瘤细胞产生的物质,任选是蛋白质,包括“肿瘤相关抗原”或“TAA”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中差异表达的蛋白质)以及“肿瘤特异性抗原”或“TSA”(其是指在肿瘤细胞中产生的且与相应的正常组织相比在癌症中特异性表达或异常表达的肿瘤抗原)。
“肿瘤相关抗原”的非限定示例包含,例如AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5(存活素)、BIRC7、β-连环蛋白(β-catenin)、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8(caspase-8)、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白(例如GAGE-1、-2)、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3)、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白(例如MAGE-1、-2、-3、-4、-6和-12)、MART-1、间皮素(mesothelin)、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、Muc16(CA-125)、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白质、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原(Thompson-nouvelle antigen;Tn)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、尿溶蛋白-3和5T4(Trophoblast glycoprotein)。
“CD3”,指表达在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分的抗原,且其是由下列四条受体链中的二条链所形成的同源二聚体或异源二聚体所组成:CD3-ε、CD3-δ、CD3-ζ和CD3-γ。人类CD3-ε(hCD3ε)包含UniProtKB/Swiss-Prot:P07766.2中所述的氨基酸序列。人类CD3-δ(hCD3δ包含UniProtKB/Swiss-Prot:P04234.1中所述的氨基酸序列。因此,除非明确地指出是来自非人类物种,例如“小鼠CD3”、“猴CD3”等,否则“CD3”一词指人类CD3。
“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。表位通常以独特的空间构象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或非连续的氨基酸。参见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,G.E.Morris,Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体以大约小于10-8M,例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“亲和力”是指在单一表位处,抗体与抗原之间相互作用的强度。在各抗原位点内,抗体“臂”的可变区通过弱非共价力与抗原在多个氨基酸位点处相互作用;相互作用愈大,亲和力愈强。如本文所用,抗体或其抗原结合片段(例如Fab片段)的术语“高亲和力”通常是指具有1E-9M或更小的KD(例如1E-10M或更小的KD、1E-11M或更小的KD、1E-12M或更小的KD、1E-13M或更小的KD、1E-14M或更小的KD等)的抗体或抗原结合片段。
术语"KD"或“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常,抗体以小于大约1E-8M,例如小于大约1E-9M、1E-10M或1E-11M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原,例如,如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。KD值越小,亲和力越大。
术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的,但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时,核酸是“有效连接的”。例如,如果启动子或增强子影响编码序列的转录,那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语"载体"意指能够递送一个或多个目标基因或序列并且优选地在宿主细胞中表达其的构建体。载体的示例包括,但不限于,病毒载体、裸露DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂缔合的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体和某些真核生物细胞诸如生产细胞。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法,如冷泉港的抗体实验技术指南,5-8章和15章。例如,鼠可以用抗原或其片段免疫,所得到的抗体能被复性、纯化,并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件,从网站http://www.imgt.org/得到,或者从免疫球蛋白杂志,2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员,例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株;芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);肺炎球菌(Pneumococcus);链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、HEK293细胞(非限制性实施例如HEK293E细胞)和NS0细胞。
工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如,编码重链和轻链的cDNA序列,可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种可选的现有技术,哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化,特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如,用含调整过的缓冲液的蛋白A或蛋白G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体,用SDS-PAGE检测抗体片段,收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体,也可以用常规方法去除,比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻,如-70℃,或者冻干。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时,是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触,以及试剂与流体的接触,其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时,是指治疗处理、预防或预防性措施,研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂,例如包含本公开实施例的任一种化合物的组合物,所述患者具有一种或多种疾病症状,而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常,在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂,以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化,例如患者的疾病状态、年龄和体重,以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法,可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)可能无法在缓解每个目标疾病症状方面都有效,但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定,其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“氨基酸保守修饰”或“氨基酸保守取代”指蛋白质或多肽中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代,从而使得在不改变蛋白质或多肽的生物活性或其他所需特性(例如抗原亲和力和/或特异性)的情况下,可以经常进行改变。本领域技术人员认识到,通常,多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见,例如,Watson等人,(1987)Molecular Biology ofthe Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页(第4版))。此外,结构上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破坏生物活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
示例性氨基酸保守取代
原始残基 | 保守取代 |
Ala(A) | Gly;Ser |
Arg(R) | Lys;His |
Asn(N) | Gln;His;Asp |
Asp(D) | Glu;Asn |
Cys(C) | Ser;Ala;Val |
Gln(Q) | Asn;Glu |
Glu(E) | Asp;Gln |
Gly(G) | Ala |
His(H) | Asn;Gln |
Ile(I) | Leu;Val |
Leu(L) | Ile;Val |
Lys(K) | Arg;His |
Met(M) | Leu;Ile;Tyr |
Phe(F) | Tyr;Met;Leu |
Pro(P) | Ala |
Ser(S) | Thr |
Thr(T) | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe |
Tyr(Y) | Trp;Phe |
Val(V) | Ile;Leu |
“有效量”、“有效剂量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途,有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作,包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用,有益的或所需的结果包括临床结果,诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状,减少治疗病症所需的其它药剂的剂量,增强另一种药剂的疗效,和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性””、“同一性”在本文中可以互换,是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源;如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源,那么两个序列为95%同源。通常,当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如,可以通过BLAST算法执行比较,其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法:BLAST算法(BLASTALGORITHMS):Altschul,S.F.等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;Gish,W.等人,(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,T.L.等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402;Zhang,J.等人,(1997)Genome Res.7:649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
“分离的”指纯化状态,并且在这种情况下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子,例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料,例如细胞碎片和生长培养基。通常,术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐,除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本公开所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物,所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药,利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
术语“癌症”、“癌的”或“恶性的”指或描述哺乳动物中一般以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤,胚细胞瘤(blastoma),肉瘤,和白血病或淋巴样恶性。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。
“炎性病症”是指其中过度或不受调节的炎症反应导致过度炎性症状、宿主组织损伤或组织功能丧失的任何疾病、病症或综合征。“炎性疾病”也是指由白细胞或嗜中性粒细胞趋化性的汇集而介导的病理状态。
“炎症”是指由于组织损伤或破坏而引起的局部保护性反应,其用来破坏、削弱或杜绝(隔离)有害物质和受伤组织。炎症与白细胞或中性粒细胞趋化性的汇集显著相关。炎症可以由病原生物体和病毒以及非感染性原因引起,所述非感染性原因如创伤或心肌梗塞后的再灌注或中风、对外源性抗原的免疫应答和自身免疫应答。
“自身免疫性疾病”是指其中组织损伤与体液或细胞介导的对身体自身成分的反应相关的任何一组疾病。自身免疫疾病的非限制性示例包括类风湿关节炎、牛皮癣、克罗恩病、强硬性脊柱炎、多发性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren综合征、移植排斥后的自体免疫性溶血性贫血、水疱性类天疱疮、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血等。
此外,本公开另一方面涉及用于免疫检测或测定目标抗原的方法、用于免疫检测或测定目标抗原的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原的细胞的方法和用于诊断与目标抗原阳性细胞相关的疾病的诊断剂,其包含本公开的特异性识别并结合目标抗原的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中,用于检测或测定目标抗原的量的方法可以是任何已知方法。例如,它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的示例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与目标抗原阳性细胞相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达目标抗原的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞,可以使用已知的免疫检测方法,并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外,可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中,对用于检测或测定目标抗原的活体样品没有特别限制,只要它具有包含表达目标抗原的细胞的可能性即可,例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法,含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂,例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
在以上说明书中提出了本发明一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本发明,但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书,本发明的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中,除非上下文中有清楚的另外指明,单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明的范围,本发明的范围由权利要求书限定。
具体实施方式
抗体的制备和筛选
制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等人,(1975)“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of PredefinedSpecificity,”Nature256:495-497的方法或其修改形式。典型地,单克隆抗体在非人物种,诸如小鼠中形成。通常,小鼠或大鼠被用于免疫,但其他动物,如兔、羊驼也可被使用。通过用免疫原性量的包含人CD3或其他目标抗原(如人B7H3)的细胞、细胞提取物或蛋白制剂免疫小鼠来制备抗体。免疫原可以是但不限于,原代细胞、培养的细胞系、癌性细胞、核酸或组织。
在一个实施方案中,通过使用过量表达目标抗原作为免疫原的宿主细胞获得与目标抗原结合的单克隆抗体。此类细胞包括,例如且不限于,人T细胞、过表达人B7H3的细胞。
为了监测抗体应答,可从动物获得小的生物样品(例如,血液)并测试针对免疫原的抗体滴度。可移除脾和/或一些大的淋巴结并离解为单细胞。如需要,可通过(在非特异性粘附细胞去除之后)将细胞悬液施加至抗原涂覆的平板或孔筛选脾细胞。表达膜结合的抗原特异性的免疫球蛋白的B细胞,将与平板结合,并不会被剩余的悬液冲洗掉。随后,可将所得B细胞或所有离解的脾细胞与骨髓瘤细胞(例如,X63-Ag8.653和来自SaIk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,CA的细胞)融合。聚乙二醇(PEG)可被用于融合脾或淋巴细胞与骨髓瘤细胞以形成杂交瘤。随后在选择性培养基(例如,次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷培养基,另外称为“HAT培养基”)中培养杂交瘤。随后,通过有限稀释将所得杂交瘤铺板,并使用例如FACS(荧光激活细胞分选术)或免疫组织化学(IHC)筛选分析与免疫原特异性结合的抗体的产生。随后,体外(例如,在组织培养瓶或中空纤维反应器)或体内(例如,在小鼠中作为腹水)培养选择的单克隆抗体-分泌杂交瘤。
作为细胞融合技术的另一个替代方式,可使用Epstein-Barr病毒(EBV)永生化的B细胞以制备本发明的单克隆抗体。如需要,增殖并亚克隆杂交瘤,并通过传统的分析方法(例如,FACS、IHC、放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析,等)分析上清液的抗免疫原活性。
在另一个替代方式中,可通过本领域已知的任何方法(例如,人源化、使用转基因小鼠制备全人抗体、噬菌体展示技术,等)测序和重组制备抗目标抗原(如CD3、B7H3)单克隆抗体和任何其他等同抗体。在一个实施方案中,抗目标抗原(如CD3、B7H3)单克隆抗体被测序且随后多核苷酸序列被克隆进入载体用于表达或增殖。编码目的抗体的序列可被保持在宿主细胞中的载体中且随后该宿主细胞可被增殖并冷冻用于以后使用。
抗CD3单克隆抗体和任何其他等同抗体的多核苷酸序列可被用于遗传操作以产生“人源化”抗体,以改进抗体的亲和力或其他特征。人源化抗体的一般原理包括保留抗体的抗原结合部分的基本序列,同时将该抗体的非人剩余部分置换为人抗体序列。存在人源化单克隆抗体的四个一般步骤。这些步骤为:(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列,(2)设计人源化抗体,即,决定在人源化过程中使用哪一个抗体构架区,(3)实际的人源化方法/技术和,(4)人源化抗体的转染和表达。参见,例如,美国专利号US4816567、US5807715、US5866692和US6331415。
1.B7H3抗体的制备和筛选
利用人PBMC、脾脏、淋巴结组织分离B细胞,并提取RNA,构建天然单链噬菌体抗体库。将构建的天然单链噬菌体抗体文库经过包装形成噬菌体颗粒后,采用液相法进行淘筛,噬菌体与生物素化的B7H3液相结合,再采用链霉亲和素磁珠分离。为了获得与人B7H3结合的阳性序列,采用生物素化的人B7H3进行淘筛,挑取若干个单克隆菌落包装成噬菌体单链抗体,用于噬菌体ELISA测试。分别测试单克隆噬菌体与人B7H3和鼠B7H3的结合活性,经筛选获得B7H3抗体。
检测用B7H3相关抗原如下所示:
检测用人B7H3抗原
商业化产品(SinoBiological cat#11188-H08H)
序列如下:
注释:划横线部分为B7H3胞外区;斜体部分为His标签(His-tag)。
检测用猴B7H3抗原
商业化产品(SinoBiological cat#90806-C08H)
序列如下:
注释:划横线部分为B7H3胞外区;斜体部分为His标签。
检测用鼠B7H3抗原
商业化产品(SinoBiological cat#50973-M08H)
序列如下:
注释:划横线部分为B7H3胞外区;斜体部分为His标签。
人B7H3全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–28);
划横线部分为B7H3胞外区(Extracellular domain:29-466),其中29-139为Ig-like V-type 1Domain,145–238为Ig-like C2-type 1Domain;243-357为Ig-like V-type2Domain,363–456为Ig-like C2-type 2Domain;
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:467-487);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:488-534)。
猴B7H3全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–28);
划横线部分为B7H3胞外区(Extracellular domain:29-466),其中29-139为Ig-like V-type 1Domain,145–238为Ig-like C2-type 1Domain;243-357为Ig-like V-type2Domain,363–456为Ig-like C2-type 2Domain;
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:467-487);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:488-534)。
>鼠B7H3全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–28);
划横线部分为B7H3胞外区(Extracellular domain:29-248);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:249-269);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:270-316)。
筛选获得的B7H3抗体h1702序列及其经IMGT编号规则定义的CDR序列如下所示:
注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。
表1B7H3抗体h1702的轻链、重链CDR序列表
为了进一步提高双特异性抗体的性能,在B7H3抗体h1702的VH和VL中分别进行半胱氨酸取代突变,在轻链可变区中引入G103C(氨基酸自然顺序编号,在SEQ ID NO:16的第103位)突变,在重链可变区中引入G44C(氨基酸自然顺序编号,在SEQ ID NO:15的第44位)突变,以形成一对二硫键,突变后的抗B7H3单链抗体的重链和轻链可变区序列如下所示:
2.CD3抗体的制备和筛选
在鼠源CD3抗体基础上,经突变、建库、人源化改造及筛选等手段可获得人源化的CD3抗体。
CD3抗原相关序列信息如下
检测用人CD3抗原
商业化产品(SinoBiological cat#CT038-H2508H)
序列如下:
注释:
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:23-126);斜体部分为His标签
Human CD3δ
注释:
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);斜体部分为Flag标签。
检测用猴CD3抗原
商业化产品(Acro biosystem cat#CDD-C52W4-100ug)
序列如下:
猴CD3ε
注释:
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:22-117);斜体部分为His标签
猴CD3δ
注释:
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);斜体部分为Flag标签
检测用鼠CD3抗原
商业化产品(SinoBiological cat#CT033-M2508H)序列如下:
鼠CD3ε
注释:
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:22-108);斜体部分为His标签
鼠CD3δ
注释:
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);斜体部分为Flag标签
人CD3ε全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–22);
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:23-126),其中32-112为Ig-like Domain;
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:127-152);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:153-207)。
人CD3δ全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–21);
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:106-126);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:127-171)。
猴CD3ε全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–21);
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:22-117);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:118-138);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:139-198)。
猴CD3δ全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–21);
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:106-126);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:127-171)。
鼠CD3ε全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1-21);
划横线部分为CD3ε胞外区(Extracellular domain:22-108);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:109-134);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:135-189)。
鼠CD3δ全长氨基酸序列
注释:
双横线部分为信号肽(Signal peptide:1–21);
划横线部分为CD3δ胞外区(Extracellular domain:22-105);
点划线部分为跨膜区部分(Transmembrane domain:106-126);
斜体部分为胞内区(Cytoplasmic domain:127-173)。
经过反复分析和优化,获得一系列抗CD3的人源化抗体序列,重链可变区序列如下:
表2CD3人源化抗体重链可变区序列表
轻链可变区序列如下:
注:顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4,序列中斜体为FR序列,下划线为CDR序列。此处和下表3中CD3人源化抗体的轻链和重链可变区中的CDR(LCDR1-LCDR3和HCDR1-HCDR3)氨基酸残基在数量和位置上符合已知的Kabat编号规则。
表3CD3抗体CDR序列表
单链抗体的构建和制备
来源自上述B7H3抗体的轻重链可变区和来源于CD3抗体的轻重链可变区可分别经连接后形成针对B7H3的scFv和针对CD3的scFv,其中接头(linker)可选自本领域内公知的接头序列,示例性的接头可选自:(GGGGS)n或(GGGGS)nGGG,其中n可为1、2、3或4。
示例性的抗B7H3的scFv如下:
表4不同抗B7H3单链抗体(scFv)序列表
示例性的抗CD3的scFv如下:
表5不同抗CD3单链抗体(scFv)序列表
双特异性抗体的构建和制备
B7H3双价双特异性抗体和B7H3单价双特异性抗体
本公开的一些实施方式中B7H3双价双特异抗体的结构如图1A所示,其C末端可以连接His标签,也可以不连接His标签。采用含Fc的两条链非对称结构设计,共有两个B7H3抗原结合域和一个CD3抗原结合域,其中B7H3抗原结合域在两条链上各一个,抗原结合域均为scFv的形式。Fc区能维持抗体正常半衰期和良好稳定性,两条链的设计大大降低了错配的几率,提高了样品的均一性和目的抗体的得率。具体的双特异性抗体的分子结构(Format)见下表6,此外,本公开一些实施方式中使用的B7H3单价双特异性抗体的分子结构在第二多肽链中仅有Fc结构域,不包含抗原结合结构域,结构示意见图1B。
表6双特异性抗体的结构示意表
注:此表第一多肽链或第二多肽链的羧基端可以连接His标签,也可以不连接His标签。L1、L2、L3、L4、L5和L6表示接头,用于连接各抗原结合结构域以及Fc区。
表7接头(linker)序列的选择
接头 | 结构或序列 |
L1 | (GGGGS)n或(GGGGS)n GGG |
L2 | (GGGGS)n |
L3 | (GGGGS)n |
L4 | GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:98) |
L5 | (GGGGS)n |
L6 | GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:98) |
其中n选自1、2、3或4;优选的,L1中的n为2或3,更优选为3;L2中的n为1或2,更优选为1;L3或L5中的n为3。可选地,用于连接抗原结合结构域以及Fc区的接头可选自其他任何可用于连接抗体功能结构域的接头,而不仅限于上述序列所限制的接头。
上述表6中的Fc1和Fc2可为相同序列的Fc,也可分别为knob-Fc和hole-Fc或分别为hole-Fc和knob-Fc,在本公开一些实施例中,knob-Fc和hole-Fc的序列优选表8所示序列:
表8不同Fc序列表
上述轻重链可变区、单链抗体、双特异性抗体可通过VH和/或VL及所需的其他结构域的编码cDNA,构建编码上述多肽或抗原结合片段的DNA,将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中,然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述多肽或抗原结合片段。
实施例1、双特异性抗体分子及阳性对照分子、阴性对照分子的制备
根据本公开双特异性抗体分子的设计方法,设计并制备具体双特异性抗体分子,示例性分子氨基酸序列如下表9所示:
表9双特异性抗体序列表
注:上表B7H3双价双特异性抗体分子113、118、119、126、127、128、131、132、154、155、156、161、162、171、172和177的第二多肽链均为SEQ ID NO:71所示的VLB7H3-L5-VHB7H3-L6-hole-Fc;B7H3单价双特异性抗体分子181-187的第二多肽链均为SEQ ID NO:70所示的hole-Fc。
本公开中使用的阴性对照(NC1、NC2、NC3)及阳性对照(MGD009)的双特异性抗体的氨基酸序列如下:
NC1:B7H3结合域被替换成非相关抗体(抗荧光素抗体,anti-fluorescein),但保留CD3结合域),其氨基酸序列参照文献:The anti-fluorescein antibody used to formthe control DART diabody was antibody 4-4-20(Gruber.M.et al.(1994).
链1(VHCD3-VLCD3-VLctrl-VHctrl-knob-Fc)
链2(VLctrl-VHctrl-hole-Fc)
NC2:保留B7H3结合域,仅是CD3结合域被替换成抗fluorescein的非相关抗体
链1(VHctrl-VLctrl-VLB7H3-VHB7H3-knob-Fc)
链2
注:顺序为VLB7H3-linker-VHB7H3-linker-Fc。序列中下划线部分为B7H3抗体序列,斜体部分为hole-Fc序列。
NC3
链1(VLctrl-VHctrl-VHCD3-VLCD3-knob-Fc-His tag)
链2(VLctrl-VHctrl-hole-Fc)
阳性对照MGD009包含三条链,制备及氨基酸序列参照已公开专利申请WO2017030926A1,其氨基酸序列如下:
链1(B7H3VL-CD3VH-Fc)
链2(CD3VL-B7H3VH)
链3(Fc)
201(DART-Fc三链结构)201链1(B7H3VL-CD3VH-E-Fc)
201链2(CD3VL-B7H3VH-K)
201链3
202(四链结构,其中四条链的物质的量比例关系是链1:链2:链3:链4=1:2:1:1)
202链1(B7H3VH-CH1-Fc)
202链2(B7H3VL-CL)
202链3(B7H3VH-CH1-CD3VH-CL)
202链4(CD3VL-CH1)
实施例2、CD3-B7H3双特异性抗体的表达与纯化
表达双特异性抗体的质粒(链1:链2为1:1)转染HEK293E细胞,6天后收集表达上清,高速离心去除杂质。澄清的上清用Ni Sepharose excel柱(GE Healthcare)进行纯化。用PBS冲洗柱子,至A280读数降至基线,再用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱,除去非特异结合的杂蛋白,并收集流出液,最后用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白,并收集洗脱峰。洗脱样品适当浓缩后,利用550缓冲液(10mM乙酸,pH5.5,135mM NaCl)平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化,收集目的峰。样品经脱盐柱或超滤离心管换液至559缓冲液中(10mM乙酸,pH5.5,9%蔗糖),分装后于-80度冻存。
测试例1、BIAcore检测双特异抗体对B7H3和CD3的亲和力实验
抗体对B7H3和CD3亲和力的检测,采用捕获(capture)抗体的形式。用偶联有Anti-Human IgG Antibody(Cat.#BR-1008-39,Lot.#10260416,GE)的CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1005-30,GE)或Protein A(Cat.#29127556,GE)生物传感芯片亲和捕获BsAb,然后于芯片表面流经各抗原,用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后,用再生缓冲液Glycine1.5(Cat#BR100354,GE)或3M MgCl2(来自Human antibody capture kit,Cat.#BR100839,GE)将芯片洗净再生。实验结束后用GEBiacore T200 Evaluation version 3.0软件以(1:1)Langmuir模型拟合数据,得出亲和力数值。
固定不同V区的排列顺序,采用不同CD3抗体VH序列时,双特异抗体对CD3的亲和力略有不同,当采用HRH-6和HRH-5序列时,抗体与CD3的亲和力最弱,在Biacore上无法检测到与CD3的结合。
表10AFF3结构的双特异性抗体的抗原亲和力Biacore检测结果
示例性的选择包含HRH3作为CD3抗原结合结构域的重链可变区的抗体进行测试,其中测试抗体118,127,132与人(human)B7H3和human CD3的亲和力分别为10-9和10-8M水平,与MGD009的亲和力相当,且与猴(cyno)B7H3和human CD3均具有很强的交叉结合活性。
表11包含HRH3的不同结构顺序双特异性抗体的抗原亲和力Biacore检测结果
测试例2、细胞水平抗体结合能力测定
采用FACS的方法对双特异抗体与细胞表面抗原结合能力进行检测。对细胞表面抗原B7H3和CD3的结合,分别用A498(ATCC,HTB-44),CT26/hB7H3(在鼠细胞CT26中过表达人B7H3的重组细胞系,内部构建,CT26来源于中科院细胞库,TCM37)和Jurkat重组细胞系(Jurkat细胞来源于ATCC,PTS-TIB-152,重组细胞系是在Jurkat细胞基础上过表达荧光素酶(luciferase)基因,在基因上游插入NFAT的应答元件)。
在96孔U型底板(corning,3795)中加入FACS缓冲液(buffer)(98% PBS,2%FBS)重悬的细胞,并加入梯度稀释的抗体,4℃孵育1h,FACS缓冲液清洗2次,随后每孔加入APCanti-human IgG Fc Antibody(biolegend,Cat#409306,1:50稀释),4℃孵育30min,清洗2次后用FACS缓冲液重悬细胞,最后用FACS CantoII(BD)读取荧光信号值。
结果显示,B7H3双价的双特异抗体118、127和132以及阴性对照抗体NC2(保留B7H3结合域,仅是CD3结合域被替换成非相关抗体)均能与高表达B7H3的A498细胞系结合(见图2A),呈梯度依赖效应,结合能力强于MGD009,且是B7H3靶点特异的,阴性对照抗体NC1(B7H3结合域被替换成非相关抗体,但保留CD3结合域)不与A498结合。同样地,双特异抗体118、127和132,MGD009以及NC2与CT26/hB7H3有强结合(见图2B),而不与未表达B7H3的CT26细胞系(见图2C)结合,也充分说明测试的双特异抗体特异地与细胞膜表面B7H3靶点结合。抗体118、127和132与MGD009结合能力的差别,在B7H3过表达细胞系CT26/hB7H3上比A498细胞系上更加明显,预示着B7H3双价的双特异抗体,相比起B7H3单价的双特异抗体MGD009,在高表达B7H3细胞上的结合优势更为显著,会有更好的安全窗口。
双特异抗体118、127和132以及阴性对照抗体NC1均能与Jurkat重组细胞系结合(见图2D),呈梯度依赖效应。其中118和NC1与Jurkat重组细胞结合能力与MGD009相当,而127和132的结合能力略弱,可能由于CD3结合域在B7H3结合域和FC之间,与Jurkat重组细胞结合受到一定空间位阻的影响。不含CD3结合域的阴性对照抗体NC2不与Jurkat重组细胞结合,说明双特异抗体与Jurkat的结合是CD3靶点特异的。
测试例3、体外PBMC杀伤实验
双特异抗体介导的PBMC对肿瘤细胞的杀伤实验通过定量检测细胞增殖情况来实现的。利用Cell Titer-glo检测细胞中ATP的含量,而ATP是活细胞新陈代谢的一个指标,直接与培养物中的细胞数量成正比。
共用了四种不同的靶细胞(target cell,T),包括三种不同B7H3表达水平的肿瘤细胞系(A498,U87(中科院细胞库,TCHu138),Detroit562(ATCC,CCL-138)),和一种不表达B7H3的阴性对照细胞系CHOK1(ATCC,CCL-61)。效应细胞(effector cell,E)是来自健康志愿者的PBMC。将靶细胞接种在96孔板中,过夜培养,次日,每孔加入等量的新鲜抽提的PBMC和梯度稀释的待测双特异抗体(最高终浓度为300nM,1:3稀释),或PBS(对照(control),有效应细胞和靶细胞,无抗体)。设置空白对照(blank,只有培养基,没有细胞或抗体),E:T的比例,对于A498,U87,Detroit562和CHOK1细胞,分别为10:1,5:1,5:1,5:1。培养48小时,用Cell Titer-glo检测(参照说明书),酶标仪读取信号值,并最终换算成抑制率,用GraphpadPrism 5对数据进行处理分析。
抑制率%(Inhibition%)=100%-(信号值样本-信号值空白)/(信号值对照-信号值空白)
(Inhibition%=100%-(Signalsample-Signalblank)/(Signalcontrol-Signalblank))
3.1含不同亲和力CD3抗原结合结构域的抗体比较
使用不同亲和力的CD3 scFv,构建的不同双特异抗体,呈现出不同的体外靶细胞杀伤疗效(见图3A和图3B),以分别含有HRH5和HRH6的双特异性抗体155、156、185和186的杀伤疗效最弱,这点与Biacore亲和力的检测结果一致。
3.2B7H3单价和双价双特异性抗体的比较
对于含有不同抗CD3抗体重链可变区的scFv构建成的双特异性抗体,以AFF3(该结构示例性抗体为131和177)和AF3(该结构示例性抗体为181和187)结构比较为例(见图4A和图4B),CD3-B7H3的AFF3结构B7H3双价双特异性抗体,比AF3结构的B7H3单价双特异性抗体,在体外细胞杀伤活性上明显增强。这一点适用于所有含不同CD3 VH的双特异性抗体。
表12抗体结构顺序
3.3B7H3双价双特异性抗体不同结构排序分子结构对肿瘤杀伤活性的影响
对具有相同抗原结合结构域组件不同结构顺序的B7H3双价双特异性抗体分子161、162、113和126(见图5A),以及113与143(见图5B)的肿瘤细胞杀伤活性进行平行试验,上述分子都使用HRH2作为CD3抗原结合结构域中的重链可变区。结果显示,不同结构顺序的B7H3双价特异性抗体分子对A498细胞均有显著的杀伤作用。其中161、162、113和126的杀伤活性与MGD009的杀伤活性相当或略优于MGD009。不同结构排列顺序对B7H3双价双特异性抗体的肿瘤细胞杀伤活性影响不大。
表13不同试验抗体的结构比较表
3.4双特异抗体对不同B7H3表达水平的肿瘤细胞系均有杀伤疗效
测试了三个待测双特异抗体118、127和132在A498、U87和Detroit562肿瘤细胞系上的体外杀伤效果。杀伤疗效与B7H3表达水平呈正相关,例如118在A498、U87和Detroit562上的EC50分别为0.34、2.4和14.5nM。三个抗体分子均显示出这一趋势。所有双特异抗体对B7H3阴性的对照细胞系CHOK1均没有杀伤,且阴性对照双特异抗体NC1在所有靶细胞系上也没有杀伤效果,这两点共同说明细胞杀伤需要通过双特异抗体将效应细胞重定向到B7H3阳性的靶细胞,进行靶点特异性杀伤。
表14待测双特异抗体介导的PBMC重定向杀伤不同靶细胞系
3.5不同结构双特异性抗体对A498细胞的杀伤比较
测试了三个待测双特异抗体127与201、202在A498肿瘤细胞系上的体外杀伤效果。结果显示(见图5C)三个结构的双特异性抗体均有肿瘤的杀伤活性,其中双特异性抗体127的杀伤活性优于201和202。
测试例4、体外T细胞活化实验
双特异抗体对T细胞的活化功能的检测,是利用Jurkat重组细胞系,在有或没有A498肿瘤细胞系存在的情况下,检测Jurkat被激活后NFAT驱动的荧光素酶报告基因(luciferase)的表达。
接种A498细胞于96孔细胞培养板上(1×105/ml,100μL/孔),放置于37℃,5%CO2培养箱培养20-24h。次日,移除细胞培养上清后,向每孔加入90μl的Jurkat重组细胞悬液(5.5×105/ml),和10μl梯度稀释的待测双特异抗体(最高500nM的终浓度,1:3梯度稀释),并设置阴性对照(对照(control),有A498和Jurkat重组细胞,无抗体)和空白对照(blank,只有培养基,没有细胞或抗体),置于37℃,5%CO2培养箱培养5-6h。非肿瘤细胞特异的Jurkat重组细胞活化,则是直接向空白96孔培养板中加入Jurkat重组细胞和待测抗体。共培养结束后,每孔中加入100μl的Bright-Glo Reagent(Bright-GloTMLuciferase Assay System,Promega,Cat#:E2620),置于室温放置5-10min,使用多功能酶标仪读取化学发光信号值,荧光增强倍数(Fold increase)的计算公式为:增强倍数=((信号值样本-信号值空白)/(信号值对照-信号值空白)
(Fold increase=(Signalsample-Signalblank)/(Signalcontrol-Signalblank))
4.1不同排列顺序的B7H3双价分子均能有效激活T细胞
将B7H3双价双特异性抗体118、127和132分别在A498存在或或不存在的情况下检测Jurkat重组细胞的激活情况,以验证双特异性抗体对T细胞的特异性和非特异性激活效果。结果显示,不同排列顺序的B7H3双价双特异抗体118、127和132在肿瘤细胞系A498存在的情况下(见图6A),都能有效地激活Jurkat重组细胞系,显著地诱导荧光素酶的表达,因为阴性对照抗体NC1不能诱导荧光素酶的表达,可以证明Jurkat重组细胞的激活是B7H3靶点特异的。Jurkat重组细胞的激活,需要通过双特异抗体共募集表达CD3的Jurkat重组细胞和表达B7H3的肿瘤细胞才能实现,在只有Jurkat重组细胞,没有A498细胞时(见图6B),荧光素酶的表达非常低,只有在最高的几个抗体浓度点能检测到一些弱信号。
表15抗体结构顺序
4.2B7H3单价和双价双特异性抗体的比较
双价CD3-B7H3双特异性抗体较B7H3单价的双特异抗体,在靶点特异的T细胞激活明显增强,这与测试例3中,B7H3双价比B7H3单价分子的体外肿瘤杀伤能力增强相一致。与此同时,非靶点特异的T细胞激活保持不变。因此,B7H3双价分子(131)比B7H3单价分子(181)具有更强的药效(见图7A),但因T细胞非特异激活而带来的副作用并没有增强(见图7B)。
表16抗体结构
抗体 | 第一多肽链 | 第二多肽链 |
131 | VLB7H3-L1-VHB7H3-L2-VHCD3-L3-VLCD3-L4-FC1 | VLB7H3-L5-VHB7H3-L6-FC2 |
181 | VLB7H3-L1-VHB7H3-L2-VHCD3-L3-VLCD3-L4-FC1 | Fc2 |
测试例5、体外细胞因子分泌实验
效应细胞在双特异抗体的介导下重定向靶细胞,在杀伤靶细胞的同时,释放细胞因子。其中细胞因子分泌是通过ELISA的方法定量检测细胞培养上清中的细胞因子含量,包括IL2、IFNγ、TNFα。
实验设计和所用抗体与测试例4所描述相同,在体外杀伤实验的终点收集细胞培养上清,至96孔板中(Corning#3795),放置-20℃保存备用。ELISA实验时,取出冻存的培养上清,室温融化,3500rpm,离心10mins,收集上清用于ELISA实验。ELISA步骤详见试剂盒中的说明书(Human IL-2ELISA kit、Human IFN-γELISA Kit、Human TNF-αELISA kit、欣博盛,Cat#EHC003.96、EHC102g.96,EHC103a.96)。
结果表明,测试双特异抗体在PBMC和B7H3阳性的靶细胞A498共存在时(参见图8A-图8C),均能有效诱导PBMC分泌IL2、IFNγ和TNFα,其中以MGD009和118所诱导的细胞因子分泌水平最高,其次为127和132,而阴性对照抗体NC1所诱导的细胞因子分泌不在检测灵敏度范围内。在PBMC和B7H3阴性细胞CHOK1共存在时(参见图9A-图9C),MGD009在最高的三个浓度点能明显地诱导IFNγ和TNFα的释放,而待测的三个双特异抗体,118、127和132则不能诱导IFNγ和TNFα的释放,预示着三个待测双特异抗体相比起MGD009,在非靶点特异的细胞因子分泌上具有更好的安全性。
测试例6、人PBMC重建的小鼠A498模型的药效实验
本测试例利用人PBMC重建的NOG小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)A498模型(ATCC)来评价本发明测试CD3-B7H3双特异性抗体在小鼠体内的抗肿瘤疗效。
将A498细胞5×106个细胞/小鼠/100μl(含50%matrigel)接种于NOG小鼠右肋部皮下,当荷瘤小鼠肿瘤体积达到130-150mm3左右时将小鼠随机分组,每组5-6只,并将分组当天定义为该实验第0天。于第0天或第1天将新鲜抽提的2名志愿者的PBMC以1:1比例混合,以5×106个细胞/100μl注射到NOG小鼠腹腔,并开始腹腔注射各抗体,每周2次,共给药6次,每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。Vehicle是以PBS缓冲液代替抗体给药的阴性对照组。
抗体118和119在较低的剂量下(图10A)已经呈现出一定的抑瘤疗效,且呈剂量依赖效应。其中抗体118在实验终点时(第20天),0.01mpk和0.03mpk剂量下的抑瘤率(TGI)分别为22.17%和60.39%。
抗体113在第14天时,已经显示出一定的抑瘤效果,0.6mpk和0.3mpk剂量组(图10B)抑瘤率分别达到70.05%(p<0.05)和60.78%(p<0.05),至第20天时,抑瘤效果继续增强且呈剂量依赖性,抑瘤率分别为大于100%(p<0.001)和77.92%(p<0.05)。
在0.12mpk和0.36mpk剂量条件下(图10C),抗体118在第12天时,0.12mpk和0.36mpk的剂量已经分别可以达到39.18%和57.44%(p<0.001),至第21天时的抑瘤率分别增至81.72%(p<0.01)和大于100%(p<0.001),其中0.36mpk剂量下,甚至有一只小鼠的肿瘤完全消退(1/6)。
在0.36mpk剂量条件下(图10D),抗体126在第21天时抑瘤率达到47.78%(p<0.01)。抗体128在第19天已经显示出显著抑瘤效果(TGI=56.37%),至Day21时,抑瘤率升至69.28%(p<0.001)。抗体127mpk,在第12天抑瘤率达到76.20%(p<0.001),至第21天时,抑瘤效果继续增强,抑瘤率大于100%(p<0.001),5只动物中,有3只的肿瘤体积与分组时相比,发生了回缩,另外2只的肿瘤完全消退。
抗体127的抗肿瘤活性,在另一次实验中得到了重复(图10E),第14天时的抑瘤率达到90.6%(p<0.001),至第17天时抑瘤率增到95.80%(p<0.001)。127在较低剂量(0.12mpk)以及较低频率给药(每周1次,127-0.36mpk-qw)时仍旧有效,在第17天的抑瘤率分别达到51.37%(p<0.001)和96.20%(p<0.001)。
测试例7、hCD3 KI小鼠模型的药效实验
本实验在Balb/c-hCD3小鼠皮下接种CT26-hB7H3肿瘤细胞系(CT26细胞来源于中科院细胞库,TCM37,经过表达hB7H3,获得CT26-hB7H3细胞),来评价本发明CD3-B7H3双特异性抗体在小鼠体内对肿瘤生长的抑制作用。
雌性hCD3E Balb/c转基因小鼠,购自南大模式所(合格证编号201801374/5/6,许可证SCXK(苏)2015-0001)。
将CT26-hB7H3细胞8×105个细胞/小鼠/100μl接种于hCD3小鼠右肋部皮下。当荷瘤小鼠肿瘤体积达到约80-120mm3左右时将小鼠随机分组,每组7只。将分组当天定义为该实验第0天,并开始腹腔注射各抗体,每周2次,共给药5次,每周2次监测肿瘤体积、动物重量并记录数据。Vehicle是以PBS缓冲液代替抗体给药的阴性对照组。
结果显示,抗体118在1mpk剂量下在初次给药后即显示出较强药效(图11A),第13天抑瘤率为38.34%(p<0.05)。
抗体132在3.6mpk剂量下具有抑制肿瘤生长的趋势(图11B),第13天抑瘤率达到26.35%。
测试例8、大鼠体内PK实验
本实验在SD大鼠尾静脉注射CD3-B7H3双特异性抗体,检测不同时间点大鼠血清中的抗体浓度,以此来评价CD3-B7H3双特异性抗体在SD大鼠体内的代谢。
大鼠尾静脉注射受试药物3mg/kg,给药体积为5mL/kg。于给药前及给药后5min、8h、1d、2d、4d、7d、10d、14d、21d、28d各时间点采血。采用ELISA方法检测血清中的抗体浓度,分别使用两种不同的ELISA方法,B7H3抗原(1μg/mL)或者CD3抗原(1μg/mL)铺板,anti-human Fc-HRP(abcam,ab98624)作为二抗。采用Winnolin软件计算受试药物的药动学参数,所得主要药动学参数见表17。
抗体118、127和132在B7H3抗原结合区域的半衰期在4.9-8.1天,略长于MGD009,达到普通IgG抗体水平,CD3抗原结合区域的半衰期为3.2-5.6天。其中,抗体118在B7H3和CD3两个不同抗原结合区域的动力学参数相差不大,说明该分子在体内的完整性较好,半衰期分别为4.9和4.4天。抗体127在B7H3和CD3两个不同抗原结合区域的半衰期分别为4.9和3.2天,在暴露量和清除速率上相差较为明显,以CD3部分较差,由于CD3部分在该分子结构的内部,更可能由于CD3部分结合功能变弱而不是分子断裂造成。抗体132是在抗体127分子序列的基础上,在B7H3 scFv内部加入了一对二硫键,此改造大大提高了分子的半衰期(65-75%),在暴露量和清除速率上也有较大的改善。
表17大鼠体内的主要药动学参数表
Claims (15)
1.一种特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区,其中:
所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:48、49和50所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3,以及
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO:37、47和45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区。
2.根据权利要求1所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求2所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,包含选自如SEQID NO:36所示的轻链可变区,和/或选自如SEQ ID NO:35所示的重链可变区。
4.根据权利要求3所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,进一步包含抗体轻链恒定区和/或重链恒定区;
任选地,所述轻链恒定区为人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,所述重链恒定区为人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。
5.根据权利要求1至4任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段,所述抗原结合片段为选自Fab、Fab'、F(ab')2、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。
6.一种单链抗体,其含有如权利要求1至3任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。
7.根据权利要求6所述的单链抗体,所述单链抗体的序列如SEQ ID NO:61或68所示。
8.一种多特异性抗体,其特异性结合人CD3和肿瘤相关抗原,所述多特异性抗体包含如权利要求6或7所述的单链抗体或如权利要求1至5中任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的多特异性抗体,所述肿瘤相关抗原选自AFP、ALK、B7H3、BAGE蛋白质、BCMA、BIRC5、BIRC7、β-连环蛋白、brc-ab1、BRCA1、BORIS、CA9、CA125、碳酸酐酶IX、半胱天冬酶-8、CALR、CCR5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD40、CD123、CD133、CD138、CDK4、CEA、Claudin 18.2、周期素-B1、CYP1B1、EGFR、EGFRvIII、ErbB2/Her2、ErbB3、ErbB4、ETV6-AML、EpCAM、EphA2、Fra-1、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GloboH、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、GM3、gp100、Her2、HLA/B-raf、HLA/k-ras、HLA/MAGE-A3、hTERT、IL13Rα2、LMP2、κ-Light、LeY、MAGE蛋白、MART-1、间皮素、ML-IAP、MOv-γ、Muc1、Muc2、Muc3、Muc4、Muc5、CA-125、MUM1、NA17、NKG2D、NY-BR1、NY-BR62、NY-BR85、NY-ESO1、OX40、p15、p53、PAP、PAX3、PAX5、PCTA-1、PLAC1、PRLR、PRAME、PSMA、RAGE蛋白质、Ras、RGS5、Rho、ROR1、SART-1、SART-3、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TGF-β、TMPRSS2、汤-诺氏抗原、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、尿溶蛋白-3和5T4。
10.一种药物组合物,其含有治疗有效量的如权利要求1至5任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、如权利要求6或7所述的单链抗体、或如权利要求8或9所述的多特异性抗体,以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
11.一种分离的核酸分子,其编码如权利要求1至5任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、编码如权利要求6或7所述的单链抗体、或编码如权利要求8或9所述的多特异性抗体。
12.一种重组载体,其包含如权利要求11所述的分离的核酸分子。
13.一种用如权利要求12所述的重组载体转化的宿主细胞,所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞,优选为真核细胞,更优选哺乳动物细胞或昆虫细胞。
14.一种用于生产如权利要求1至5任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求6或7所述的单链抗体,或如权利要求8或9所述的多特异性抗体的方法,所述方法包括将权利要求13所述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累权利要求1至5任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段或权利要求6或7所述的单链抗体,或权利要求8或9所述的多特异性抗体,以及从培养物回收所述抗体或其抗原结合片段、所述单链抗体或所述多特异性抗体的步骤。
15.作为药物的如权利要求1至5任一项所述的特异性结合人CD3的抗体或其抗原结合片段、或如权利要求6或7所述的单链抗体,或如权利要求8或9所述的多特异性抗体或如权利要求10所述的药物组合物,或如权利要求11所述的分离的核酸分子;优选地,所述药物为激活T细胞药物;更优选地,所述药物为治疗癌症、自身免疫性疾病或炎性疾病的药物。
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