TW201420601A - 抗ｔｓｌｐ抗體之安定調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗人類TSLP抗體或其抗原結合片段之安定調配物。

Description

抗TSLP抗體之安定調配物
本發明係關於抗TSLP抗體或其抗原結合片段之安定調配物。
TSLP係一種細胞介素，其在與異位性皮膚炎、氣喘及食物過敏有關之過敏性發炎反應的開始、傳播及維持中扮演關鍵作用。遺傳學證據證實，TSLP基因內或附近之DNA突變體及單核苷酸多態性(SNP)與異位性皮膚炎、氣喘及其他過敏性發炎特狀有強烈關聯性。總的說來，TSLP係用於開發過敏性疾病之抗體療法之有效標靶。TSLP阻斷抗體業經發現且已開發用於治療過敏性疾病(諸如氣喘及異位性皮膚炎)。
用於人類個體之抗體使用前必須儲存，並運輸至投與點。在個體中要能重複性地達到所需濃度的抗體藥物需要將該藥物儲存在能維持該藥物之膠體、生物物理及生化安定性及生物活性之調配物中。用於醫藥用途之抗-TSLP抗體之安定調配物有此需求。較佳地，此等調配物會展現長半衰期、當儲存及運輸時係安定的，且能以高濃度投與(例如用於皮下投與)及以低濃度投與(例如用於靜脈內投與)。
本發明係關於抗TSLP抗體或其抗原結合片段之安定醫藥調配物。本發明另外提供以抗TSLP抗體或其抗原結合片段之安定調配物治療過敏性疾病(諸如氣喘及異位性皮膚炎)之方法。
在特定實施例中，本發明係關於抗-TSLP抗體或其抗原結合片段之醫藥調配物，其包含：a)該抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；b)pH範圍約pH 5.0-6.0之組胺酸緩衝液；及(c)界面活性劑。界面活性劑之實例包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20及泊洛尼克(pluronic)F68。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少0.01%之聚山梨醇酯80。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為0.01%至0.10%之聚山梨醇酯80。在另一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少0.01%之聚山梨醇酯20。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為0.01%至0.10%之聚山梨醇酯20。在另一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少0.10%之泊洛尼克F68。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為0.10%至1.0%之泊洛尼克F68。在一些實施例中，該調配物進一步包含離子或非離子安定劑(其可充當張力劑)。非離子安定劑之實例包括蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇及海藻糖。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該安定劑係濃度為約7%之蔗糖。在另一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該安定劑係濃度為約5%之山梨糖醇。在特定實施例中，該調配物當復水時具有5.0與6.0間之pH。在一實施例中，該調配物當復水時具有約5.5之pH。
在特定實施例中，本發明係關於抗-TSLP抗體或其抗原結合片段之醫藥調配物，其包含：a)該抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；b)組胺酸緩衝液；c)界面活性劑；及d)蔗糖。在一實施例中，該調配物係可用於與無菌注射用水進行復水之冷凍乾燥調配物。界面活性劑之實例包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20及泊洛尼克F68。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少 0.01%之聚山梨醇酯80。在另一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少0.01%之聚山梨醇酯20。在另一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，該界面活性劑係濃度為至少0.10%之泊洛尼克F68。
在特定實施例中，本發明係關於抗-TSLP抗體或其抗原結合片段之醫藥調配物，其包含：a)該抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；b)組胺酸緩衝液；c)聚山梨醇酯80；及d)蔗糖。在一實施例中，該調配物係可用於與無菌注射用水進行復水之冷凍乾燥調配物。
在特定實施例中，該調配物當復水時具有5.0與6.0間之pH。在一實施例中，該調配物當復水時具有約5.5之pH。
在特定實施例中，該冷凍乾燥調配物能復水成濃度介於約25mg/mL與100mg/mL之間之該抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，該冷凍乾燥調配物係復水成40mg/mL之該抗體。在另一實施例中，該冷凍乾燥調配物係復水成100mg/mL之該抗體。
在特定實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，聚山梨醇酯80係以超過0.01%之重量比存在。在一實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，聚山梨醇酯80係以約0.02%存在。
在特定實施例中，相對於該抗體或其抗原結合片段，蔗糖係以約7%(7.25%)之重量比存在。
在另一項實施例中，本發明係關於一種抗-TSLP抗體或其抗原結合片段之冷凍乾燥醫藥調配物，其係藉由使包含以下之水溶液冷凍乾燥而製得：a)40mg/mL抗-抗體或其抗原結合片段；b)約70mg/mL蔗糖；c)約0.2mg/mL聚山梨醇酯80；及d)約10mM pH為5.0-6.0之組胺酸緩衝液。在一實施例中，該調配物係復水成40mg/mL之濃度，以供靜脈內投與。
在其他實施例中，本發明係關於一種抗-TSLP抗體或其抗原結合 片段之冷凍乾燥醫藥調配物，其係藉由使包含如下之水溶液冷凍乾燥而製得：a)40mg/mL抗-抗體或其抗原結合片段；b)約28-29mg/mL蔗糖；c)約0.08mg/mL聚山梨醇酯80；及d)約4mM pH為5.0-6.0之組胺酸緩衝液。在一實施例中，該調配物係復水成100mg/mL之濃度，以供皮下投與。
在另一項實施例中，本發明係關於一種抗-TSLP抗體或其抗原結合片段之冷凍乾燥醫藥調配物，其復水時包含：a)40-100mg/mL抗-抗體或其抗原結合片段；b)約7%蔗糖；c)約0.02%聚山梨醇酯80；及d)約10mM pH為5.5之組胺酸緩衝液。在一實施例中，該復水調配物包含40mg/mL，且該調配物係用於靜脈內投與。在一實施例中，該復水調配物包含100mg/mL，且該調配物係用於皮下投與。在一實施例中，其中該調配物包含100mg/mL，該調配物包含低於4cP之黏度。
在一實施例中，該調配物在約5℃至約25℃之溫度下可安定至少12個月、18個月、24個月或36個月。在一實施例中，該調配物在約25℃之溫度下可安定至少24個月。在另一實施例中，該調配物在約25℃之溫度下可安定至少36個月。在一實施例中，該調配物在至少10次凍融週期後係安定的。在一實施例中，該調配物在約5℃至約25℃之溫度下儲存至少12個月時包含98.5%之抗-TSLP單體。在一實施例中，該調配物在約25℃之溫度下儲存至少12個月時包含98.5%之抗-TSLP單體。在一實施例中，該調配物在約5℃至約25℃之溫度下儲存至少36個月時包含95.0%之抗-TSLP單體。在一實施例中，該調配物在約25℃之溫度下儲存至少36個月時包含95.0%之抗-TSLP單體。在一實施例中，抗-TSLP單體百分比量係藉由SEC-HPLC測定。在一實施例中，當該抗體係以100mg/mL之濃度存在時，該調配物在20℃下具有低於4cP之黏度(如藉由MiniVis II黏度計(Grabner Instruments)所 測定)。
在另一項實施例中，本發明係關於一種治療有此需要之哺乳動物個體中過敏性疾病之方法，其包括：投與有效量之本文所述之任何調配物。
在以上任何實施例中，該抗-TSLP抗體可包含含有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5之CDR序列之輕鏈及含有SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8之CDR序列之重鏈。在一實施例中，該調配物包含SEQ ID NO：1之輕鏈及SEQ ID NO：2之重鏈。
圖1.各種緩衝液條件在40℃下8週(IEX HPLC)後及13週(SEC-HPLC及RP-HPLC)後之分析結果。
圖2. aTSLP在40℃下於pH為5.0之檸檬酸鹽、pH為5.0之乙酸鹽及10mM pH為5.5之組胺酸(緩衝液B4、B5及B6)8週(IEX-HPLC)及13週(SEC-HPLC及RP-HPLC)之安定性時程之比較結果。
圖3.各種緩衝液條件在25℃下13週後(IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC)之分析結果。
圖4. aTSLP在25℃下於pH為5.0之檸檬酸鹽、pH為5.0之乙酸鹽及10mM pH為5.5之組胺酸(緩衝液B4、B5及B6)中13週後(IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC)之安定性時程之比較結果。
圖5.各種緩衝液條件在4℃下13週後(IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC)之分析結果。
圖6.比較pH為5.5及pH為6.0之組胺酸緩衝液在40℃下8週後(IEX-HPLC)及13週後(SEC-HPLC及RP-HPLC)之安定性數據。紅色跡線及藍色跡線分別對應pH為5.5及pH為6.0之緩衝液。
圖7.比較pH為5.5及pH為6.0之組胺酸緩衝液在25℃下13週後之安定性數據。紅色跡線及藍色跡線分別對應pH為5.5及pH為6.0之緩衝 液。
圖8.振盪抗-TSLP後之濁度。(注意：未測量A320nm(承受壓力之C1)。所示數據係基於觀察到該溶液似乎與承受壓力之C0一樣混濁。)
圖9.抗-TSLP注射用粉劑批次NB-liyun-0321710-0010在各種安定性條件下之HP-SEC%單體安定性曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。單體%之驗收準則係95.0%(虛線)。
圖10.抗-TSLP注射用粉劑批次NB-liyun-0321710-0010在各種安定性條件下之HP-IEX%主要物質安定性曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。
圖11.抗-TSLP注射用粉劑批次NB-liyun-0321710-0010在各種安定性條件下之HP-IEX%酸性物質曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。
圖12.抗-TSLP注射用粉劑批次NB-liyun-0321710-0010在各種安定性條件下之HP-IEX%鹼性物質曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。
圖13.抗-TSLP注射用粉劑批次89782-101在各種安定性條件下之HP-SEC%單體安定性曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。單體%之驗收準則係95.0%(虛線)。
圖14.抗-TSLP注射用粉劑批次89782-101在各種安定性條件下之HP-IEX%主要物質安定性曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。
圖15.抗-TSLP注射用粉劑批次89782-101在各種安定性條件下之HP-IEX%酸性物質曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨勢。
圖16.抗-TSLP注射用粉劑批次89782-101在各種安定性條件下之HP-IEX%鹼性物質曲線。根據數據擬合出之實線至12個月係呈線性趨 勢。
本發明提供抗-TSLP抗體之調配物及其用於治療過敏性疾病(諸如氣喘及異位性皮膚炎)之用途。
按照本發明，可採用屬於此項技術之技藝之習知分子生物技術、微生物技術、蛋白質表現及純化技術、抗體技術及重組DNA技術。文獻中充分闡明此等技術。參見，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.3rd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor,New York；Ausubel等人主編(2005)Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ；Bonifacino等人主編(2005)Current Protocols in Cell Biology.John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ；Coligan等人主編(2005)Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ；Coico等人主編(2005)Current Protocols in Microbiology,John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ；Coligan等人主編(2005)Current Protocols in Protein Science,John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ；及Enna等人主編(2005)Current Protocols in Pharmacology,John Wiley and Sons,Inc.：Hoboken,NJ.；Nucleic Acid Hybridization,Hames & Higgins主編(1985)；Transcription And Translation,Hames & Higgins，主編(1984)；Animal Cell Culture Freshney主編(1986)；Immobilized Cells And Enzymes,IRL Press(1986)；Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；及Harlow and Lane.Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1988)。
I. 定義
如本文所用，術語「抗體」係指可展現所需生物活性之任何形 式之抗體。因此，其係以最廣泛意義使用，且特定地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體等，只要其等可展現所需所需生物活性即可。
如本文所用，術語「TSLP結合片段」、「其抗原結合片段」、「其結合片段」或「其片段」涵蓋一抗體之片段或衍生物，其仍實質上保有該抗體結合至抗原(人類TSLP)之生物活性並可抑制該抗體活性之生物活性(例如，阻止TSLP結合至TSLPR)。因此，術語「抗體片段」或TSLP結合片段係指全長抗體之一部份，通常係其抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線抗體；單鏈抗體分子(例如，sc-Fv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。通常，結合片段或衍生物保有該抗體TSLP抑制活性之至少10%。雖然任何親和力足以發揮所需生物效應之結合片段均係有效的，但較佳地，結合片段或衍生物係保有該抗體TSLP抑制活性之至少25%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%(或更多)。亦希望TSLP結合片段可包括具有不會實質上改變其生物活性之保守胺基酸取代之突變體。
如本說明書及申請專利範圍中所用，片語「大體上由...組成(consists essentially of)」或變體(諸如「大體上由...組成(consist essentially of)」或「大體上由...組成(consisting essentially of)」暗示包括任何列舉元素或元素群組，且視情況包括性質與所列舉元素類似或不同，且不會實質上改變指定劑量療程、方法或組合物之基本性質或新穎性質之其他元素。就非限制性實例而言，大體上由所列舉胺基酸序列組成之結合化合物亦可包括一或多種含有一或多個不會實質上影響該結合化合物之性質之胺基酸殘基取代之胺基酸。
醫藥組合物定義
術語「增積劑」包括提供冷凍-乾燥產品之結構之製劑。用於增積劑之常見實例包括甘露糖醇、甘胺酸、乳糖及蔗糖。除可提供藥用精製塊狀物以外，增積劑亦可賦予關於改變瓦解溫度、提供凍融保護及提高蛋白質在長期儲存期間之安定性之有益品質。此等製劑亦可充當張力調節劑。
術語「緩衝劑」涵蓋彼等在冷凍乾燥前將溶液pH維持在可接受範圍內之製劑，且可包括琥珀酸(鈉或鉀)、組胺酸、磷酸(鈉或鉀)、Tris(叁(羥甲基)胺基甲烷)、二乙醇胺、檸檬酸(鈉)及類似物。本發明緩衝劑具有於約5.0至約6.0範圍內之pH；及較佳具有約5.5之pH。
術語「低溫保護劑」通常包括可提供給蛋白質對抗冷凍誘導壓力(據推測係藉由優先排除蛋白質表面冷凍誘導壓力)之安定性之製劑。其等亦可在第一次及第二次乾燥及產品長期儲存期間提供保護。實例為聚合物(諸如聚葡萄糖及聚乙二醇)；糖類(諸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖及乳糖)；界面活性劑(諸如聚山梨醇酯)；及胺基酸(諸如甘胺酸、精胺酸及絲胺酸)。
術語「冷凍乾燥」、「經冷凍乾燥」及「凍-乾」係指一種藉由首先將待乾燥材料冷凍，然後藉由在真空環境中昇華而移除冰或冷凍溶劑之過程。預先冷凍乾燥調配物中可包括賦形劑，以提高冷凍乾燥產品在儲存後之安定性。
術語「凍乾保護劑」包括在乾燥或「脫水」過程(第一及第二乾燥週期)期間，據推測藉由提供非晶玻璃狀基質及藉由透過氫鍵結與蛋白質結合、置換乾燥過程期間所移除之水分子而為該蛋白質提供安定性之製劑。此有助於在冷凍乾燥週期間維持蛋白質構型、最小化蛋白質降解，及提高產品長期安定性。實例包括多元醇或糖(諸如蔗糖及海藻糖)。
術語「醫藥調配物」係指呈允許活性成分起作用之形式之製備 物，但該製備物不包含對經投與該調配物之個體有毒性之其他組分。
「醫藥上可接受的」賦形劑(媒劑、添加劑)係彼等可適當地投與至哺乳動物個體以提供有效劑量之所用活性成分之物質。
「復水時間」係使用溶液將冷凍乾燥調配物再水化至無顆粒澄清溶液所需之時間。
「安定」調配物係其中蛋白質在儲存後大體上保留其物理安定性及/或化學安定性及/或生物活性之調配物。此項技術中有各種用於測定蛋白質安定性之分析技術，並概述於Peptide and Protein Drug Delivery,247-301、Vincent Lee編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)及Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)中。可在選定溫度下歷時選定時間段測定穩定性。例如，在一實施例中，「穩定」冷凍乾燥抗體調配物係在冷藏溫度(2-8℃)下持續至少12個月，較佳2年及更佳3年而觀察不到顯著變化之冷凍乾燥抗體調配物。在另一實施例中，「穩定」冷凍乾燥抗體調配物以在室溫(23-27℃)下持續至少3個月、6個月、1年、2年或3年而觀察不到顯著變化之冷凍乾燥抗體調配物。安定性標準如下。藉由SEC-HPLC測定未超過10%(較佳係5%)之抗體單體經降解。再水化溶液以肉眼分析係無色或澄清至輕微乳白色。該調配物之濃度、pH及滲透壓度未超過+/-10%之變化。效價係在控制組的70-130範圍內，較佳為80-120%。所觀察到之切割(clipping)不超過10%，較佳係5%。所形成的聚集體不超過10%(較佳係5%)。
以肉眼檢查顏色及/或澄清度或藉由UV光散射、尺寸排除層析法(SEC)及動態光散射測定時，若抗體之聚集、沈澱及/或變性沒有明顯增加，則該抗體在醫藥調配物中係「保持其物理安定性」。蛋白質構型之變化可藉由測定蛋白質三級結構之螢光光譜法及藉由測定蛋白質二級結構之FTIR光譜法加以評估。
若抗體未展現明顯化學變化，則該抗體在醫藥調配物中係「保持其化學安定性」。化學安定性可藉由化學性方式偵測及定量經改變蛋白質之形式加以評估。通常改變蛋白質化學結構之降解過程包括水解或切割(藉由諸如尺寸排除層析法及SDS-PAGE之方法評估)、氧化(藉由諸如肽圖分析連同質譜分析或MALDI/TOF/MS之方法評估)、脫醯胺(藉由諸如離子交換層析法、毛細管等電聚焦、肽圖分析、異天冬胺酸測量之方法評估)及異構化(藉由測量異天冬胺酸含量、肽圖分析等評估)。
若抗體在某一給定時間之生物活性係在製備醫藥調配物時所展現之預定生物活性範圍內，則該抗體在該醫藥調配物中係「保持其生物活性」。抗體之生物活性可藉由(例如)抗原結合分析加以測定。
術語「等滲」意指所關注的調配物具有大體上與人類血液相同的滲透壓力。等滲調配物通常具有約270-328mOsm之滲透壓力。輕微地低滲壓力係250-269mOsm，且輕微地高滲壓力係328-350mOsm。滲透壓力可藉由(例如)使用蒸汽壓力或冰冷凍式滲透壓力計測量。
張力調節劑：使用鹽(NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2等)作為張力調節劑以控制滲透壓力。此外，低溫保護劑/凍乾保護劑及/或增積劑(諸如蔗糖、甘露糖醇、甘胺酸等)可充當張力調節劑。
分析方法
適合評估產品安定性之分析方法包括尺寸排除層析法(SEC)、動態光散射測試(DLS)、差示掃描熱量法(DSC)、異天冬胺酸定量法、效力、340nm UV、UV光譜法及FTIR。SEC(J.Pharm.Scien.,83：1645-1650,(1994)；Pharm.Res.,11：485(1994)；J.Pharm.Bio Anal.,15：1928(1997)；J.Pharm.Bio.Anal.,14：1133-1140(1986))可測定產品中之單體百分比，並定出可溶性聚集體之含量資訊。DSC (Pharm.Res.,15：200(1998)；Pharm.Res.,9：109(1982))可定出關於蛋白質變性溫度及玻璃轉移溫度之資訊。DLS(American Lab.,November(1991))可測定平均擴散係數，並定出可溶性及不溶性聚集體之含量資訊。340nm UV可測定340nm下之散射光強度，並定出可溶性及不溶性聚集體之含量資訊。UV光譜法可測定278nm下之吸光率，並定出蛋白質濃度資訊。FTIR(Eur.J.Pharm.Biopharm.,45：231(1998)；Pharm.Res.,12：1250(1995)；J.Pharm.Scien.,85：1290(1996)；J.Pharm.Scien.,87：1069(1998))可測定醯胺一區之IR光譜，並定出蛋白質二級結構資訊。
樣品中之異天冬胺酸含量係利用等量異天冬胺酸檢測系統(Isoquant Isoaspartate Detection System)(Promega)測得。該套組使用酶蛋白質異天冬胺醯基甲基轉移酶(Protein Isoaspartyl Methyltransferase)(PIMT)來特異性地檢測異天冬胺酸殘基在目標蛋白質中之存在。PIMT會催化甲基自S-腺苷-L-甲硫胺酸轉移至異天冬胺酸之α-羧基位置，在此過程中會產生S-腺苷-L-高半胱胺酸(SAH)。此為相當小的分子，且通常可藉由逆相HPLC使用套組中所提供之SAH HPLC標準品分離出並加以定量。
可依據抗體結合至其抗原之能力測定其效價或生物同一性。抗體特異性結合至其抗原可藉由熟習此項技術者所知之任何方法(例如，免疫分析(諸如ELISA(酶聯免疫吸附劑分析法)))定量測定。
「復水」調配物係藉由將冷凍乾燥蛋白質調配物溶於稀釋劑中以使該蛋白質分散於復水調配物中之調配物。復水調配物適用於例如非經腸投與，且可視情況適用於皮下投與。
抗-TSLP抗體
任何抗-TSLP抗體均可用於本發明調配物中。在較佳實施例中，欲連同所主張調配物使用之抗-TSLP抗體係彼等描述於 WO2008/076321及WO2011/056772中之抗-TSLP抗體。
人源化抗-TSLP之生物活性
本發明調配物包括當復水時具有生物活性之抗-TSLP抗體及其片段。如本文所用，術語「生物活性」係指可結合所需抗原性抗原決定基並直接或間接發揮生物效應之抗體或抗體片段。通常，此等效應係導因於TSLP無法結合至其受體。如本文所用，術語「特異性」係指該抗體可選擇性結合至目標抗原的抗原決定基。藉由在一組給定條件下比對結合至TSLP與結合至不相關抗原或抗原混合物可測定出抗體之結合特異性。
冷凍乾燥醫藥組合物
治療性蛋白質之冷凍乾燥調配物可提供若干優點。一般而言，冷凍乾燥調配物提供比溶液調配物更佳的化學安定性，且因而提供了經增加半衰期。冷凍乾燥調配物亦可復水成不同的濃度，端看臨床因素(諸如投與途徑或劑量)而定。例如，若需皮下投與，則冷凍乾燥調配物可復水成高濃度(亦即以小體積復水)，或若進行靜脈內投與，則復水成較低的濃度。若某一特定個體需要高劑量(尤其是進行必須使注射體積最小化的皮下投與)，則高濃度亦係必要的。一種此類冷凍乾燥抗體調配物揭示於美國專利案第6,267,958號中，其以全文引用的方式將其併入本文中。另一種治療性蛋白質之冷凍乾燥調配物揭示於美國專利案第7,247,707號中，其以全文引用的方式將其併入本文中。
通常，冷凍乾燥調配物係製備成期望復水成高濃度藥品(DP，在示例性實施例中為人源化抗-TSLP抗體或其抗原結合片段)，亦即期望以少量體積的水進行復水。然後，可便捷性地以水或等滲緩衝液進行隨後稀釋，以將DP稀釋成較低濃度。通常，本發明冷凍乾燥調配物中包含的賦形劑濃度是為當復水成高DP濃度時(例如供皮下投與之用)，會得到大致等滲調配物的濃度。以較大體積的水進行復水會得 到較低DP濃度，必將會降低復水溶液之張力，但該降低以非皮下投與(例如靜脈內)影響極小。若較低DP濃度下需要等滲性，則冷凍乾燥粉末可以標準低體積水進行復水，然後以等滲稀釋劑(諸如0.9%氯化鈉)進一步稀釋。
在本發明之一實施例中，抗-TSLP抗體(或其抗原結合片段)係調配成供靜脈內投與之冷凍乾燥粉末。在本發明之另一實施例中，抗-TSLP抗體(或其抗原結合片段)係調配成供皮下投與之冷凍乾燥粉末。在特定實施例中，該抗體(或其抗原結合片段)係以約40-300mg/小瓶提供，並在使用前使用無菌注射用水進行復水。在其他實施例中，該抗體(或其抗原結合片段)係以約40-100mg/小瓶提供，並在使用前使用無菌注射用水進行復水。該復水調配物之目標pH為5.5。在各種實施例中，本發明冷凍乾燥調配物可將抗-TSLP抗體復水成高濃度，諸如約20、25、30、40、50、60、75、100、150、200、250或更高mg/mL。
在特定實施例中，本發明提供一種冷凍乾燥調配物，其包含人源化抗-TSLP抗體、pH約為5.5或pH約為5.0(例如約5.1、5.2、5.3、5.4、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0)之組胺酸緩衝液。
當列舉pH值範圍時，諸如「pH 5.5與6.0間之pH」，該範圍意欲包括所列舉數值。除非另有說明，否則pH係指本發明冷凍乾燥調配物在復水後之pH。pH通常係在25℃下使用標準玻璃球pH計測得。如本文所用，包含「pH為X之組胺酸緩衝液」之溶液係指pH為X且包含組胺酸緩衝液之溶液，亦即pH係用於指溶液之pH。
按照定義，冷凍乾燥調配物基本上係乾物，且因此無法以濃度概念說明。比較適合依據單位劑量瓶中之組分重量來描述冷凍乾燥調配物，但亦存在問題，因為其隨不同劑量或瓶尺寸而有所不同。在描述本發明冷凍乾燥調配物時，某一組分之量適合以該組分之重量相對 於相同樣品(例如小瓶)中原料藥(DS)之重量之比例來表示。該比例可依百分比表示，此等比例可反映本發明冷凍乾燥調配物之固有性質，而不受瓶子尺寸、劑量及復水步驟的影響。
在其他實施例中，抗-TSLP抗體或抗原結合片段之冷凍乾燥調配物係依據用以製備該冷凍乾燥調配物之預冷凍乾燥溶液(諸如預冷凍乾燥溶液)而定義。在一實施例中，該預冷凍乾燥溶液包含濃度為約40mg/mL之抗體或其抗原-結合片段。此等預冷凍乾燥溶液之pH可為約5.5，或在約pH 5.0至約6.0之範圍內。
在另一項實施例中，抗-TSLP抗體或抗原結合片段之冷凍乾燥調配物係依據由該冷凍乾燥調配物所產生之復水溶液而定義。復水溶液可包含濃度為約10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100mg/mL或更高濃度(諸如150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或至多約300mg/mL)之抗體或其抗原-結合片段。在一實施例中，該復水調配物可包含40mg/mL之抗體或其抗原-結合片段。在另一實施例中，該復水調配物可包含100mg/mL之抗體或其抗原-結合片段。此等復水溶液之pH可為約5.5，或在約pH 5.0至約6.0之範圍內。
本發明冷凍乾燥調配物係藉由使預冷凍乾燥溶液冷凍乾燥(凍乾)而形成。冷凍-乾燥係藉由使調配物冷凍，及隨後在適於第一次乾燥之溫度下使水昇華而達成。在該條件下，該產品溫度係低於該調配物之共熔點或瓦解溫度。通常，通常在介於約50至250mTorr之範圍內之適宜壓力下，用於第一次乾燥之擱板溫度係介於約-30至25℃之範圍內(前提係該產品在第一次乾燥期間保持冷凍狀態)。調配物、容納樣品之容器(例如，玻璃瓶)之尺寸及類型及液體體積將決定乾燥所需時間，時間可介於數小時至若干天(例如40-60小時)之範圍內。第二次乾燥階段可在約0-40℃下進行，主要端看容器之類型及尺寸及所用蛋白質之類型而定。第二次乾燥時間係由產品中所需殘留水分程度決 定，且通常需至少約5小時。通常，冷凍乾燥調配物之水分含量少於約5%，及較佳少於約3%。壓力可與第一次乾燥步驟期間所採用的壓力相同。冷凍-乾燥條件可依據調配物及瓶子尺寸而變化。
在某些情形下，可能需要在欲使蛋白質復水之容器中進行蛋白質調配物冷凍乾燥，以便避免轉移步驟。在該情形下，該容器可為(例如)3、5、10、20、50或100cc小瓶。
本發明冷凍乾燥調配物需在投與前進行復水。蛋白質可復水成約10、15、20、25、30、40、50、60、75、80、90或100mg/mL之濃度或更高濃度(諸如150mg/mL、200mg/mL、250mg/mL或300mg/mL上至約500mg/mL)。欲以皮下方式遞送復水調配物時，高蛋白質濃度係尤為有益的。然而，就其他投與途徑(諸如靜脈內投與)而言，則宜使用較低蛋白質濃度(例如約5-50mg/mL)。
復水通常係在約25℃之溫度下發生，以確保完全水化，但可視需要採用其他溫度。復水所需時間將取決於(例如)稀釋劑類型、賦形劑及蛋白質之量。示例性稀釋劑包括無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。
可使用各種參考文獻來協助選擇醫藥上可接受的載劑或賦形劑。參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)；Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis等人(主編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(主編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(主編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY。
選擇治療劑(諸如人源化抗-TSLP抗體(或其抗原結合片段))之適當劑量時，毒性係考量因素。抗體組合物在單獨投與或與免疫抑制劑組合時之毒性及療效可藉由標準醫藥程序，於細胞培養物或實驗動物中(例如)測定LD50(致使50%群體死亡之劑量)及ED50(對50%群體有治療效果之劑量)而判定。毒性效應與治療效果之劑量比係治療指數，且其可以LD50對ED50之比例表示。以展現高治療指數之抗體為佳。得自此等細胞培養試驗及動物研究之數據可用於劃定用於人類之劑量範圍。此等化合物之劑量較佳處於毒性極小或沒有毒性之循環濃度(包括ED50)範圍內。劑量可在此範圍內變化，端看所採用的劑型及所採用的投與途徑而定。
適宜的投與途徑可包括(例如)非經腸遞送，包括肌肉內、皮內、皮下、髓內注射及鞘內、直接腦室內、靜脈內、腹膜內。藥物可以各種習知方式投與，諸如腹膜內、非經腸、動脈內或靜脈內注射。其中必須限制溶液體積之投與模式(例如皮下投與)需要求冷凍乾燥調配物復水成高濃度。
或者，可以局部而非系統方式投與抗體，例如，直接將通常呈長效或持續釋放調配物之抗體注入至經免疫病理學表徵之病原菌所誘發的病灶中。此外，可以投與存於靶向給藥系統之抗體，例如，可靶向經免疫病理學表徵之(例如)病原菌所誘發的病灶之經組織特異性抗體包覆之脂質體。該等脂質體將被靶定，並會被受害組織選擇性溶解。
選擇治療投與療程取決於若干因素，包括個體之血清或組織更 新速率、個體之症狀程度、免疫原性及生物基質內靶細胞之可達性。較佳地，投與療程係符合可接受的副作用程度並能最大化遞送至患者之治療總量。因此，生物方式遞送之含量有部份係取決於特定個體及所治療的病狀之嚴重性。可參考選擇抗體、細胞介素及小分子之適宜劑量之指南。參見，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(主編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(主編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602；Physicians' Desk Reference 2003(Physicians' Desk Reference，第57版)；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；第57版(11月，2002)。
適宜劑量係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或預測會影響治療或預計會影響治療的參數或因素加以確定。蛋白質之適宜劑量(「治療有效量」)將取決於(例如)待治療病狀、病狀之嚴重性及病程(不論該蛋白質係出於預防或治療目的而投與)、先前療法、患者臨床病史及對該蛋白質之反應、所用蛋白質之類型及主治醫師之判斷。一般而言，劑量係以稍低於最佳劑量開始，此後以小增量增加，直至相對於任何負性副作用達到所需效果或最佳效果。重要的診斷標準包括(例如)炎症之症狀或所產生的炎性細胞介素之濃度。該蛋白質係適宜地一次性或反覆性地投與至患者。該蛋白質可單獨投與或與其他藥物或療法聯合使用。
抗體或抗體片段可以連續輸注提供或以(例如)一天、1-7次/週、一週、兩週、三週、每月一次、每兩月一次等之間隔用藥。較佳用藥程序係牽涉到避免明顯非所需副作用之最大劑量或用藥頻率之程序。
在特定實施例中，給藥係包括在療程內向個體投與遞增劑量為1.0、3.0及10mg/kg之醫藥調配物。只要可達到所需效果，時程可有所變化且可持續。
在特定實施例中，本發明醫藥調配物係藉由靜脈內(IV)輸注方式投與。
在其他實施例中，本發明醫藥調配物係藉由皮下投藥方式投與。可藉由使用注射器或使用其他注射裝置(例如Inject-ease®裝置)；筆式注射器；或無針裝置(例如MediJector及BioJector®)注射進行皮下投與。
最好參照一下實例理解本發明之寬廣範圍，該等實例意不在於將本發明限制在具體實施例。提供本文所述之具體實施例僅係為了舉例，且本發明受隨附申請專利範圍之條款及此等申請專利範圍所賦予之等效項之完整範圍之限制。
實例
實例1：生產抗體
用於該等實例中之抗-TSLP抗體係描述於國際專利申請案第WO2011/056772號中之人源化單株抗體(mAb)，本文將其稱為「aTSLP」。其係由人類γ1重鏈及κ輕鏈組成，且包含下文所述序列。
該輕鏈包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列(EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQPIS ISVHWYQQKP GQAPRLLIYF ASQSISGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP EDFAVYYCQQ TFSLPYTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC)。
該重鏈包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列(QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYIFT DYAMHWVRQA PGQGLEWMGT FIPLLDTSDY AQKFQGRVTM TADTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARMG VTHSYVMDAW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK)。
構建用於開發生產細胞系之表現質體pATSLPV1
構建可表現抗體重鏈及輕鏈之表現質體。隨後使用pATSLPV1表現載體轉染CHO-DXB-11細胞。
自哥倫比亞大學(Columbia University)之Dr.Larry Chasin獲得用於表現抗-TSLP抗體之CHO-DXB-11宿主細胞系。
為建立生產抗-TSLP抗體之細胞系，以質體pATSLPV1轉染經適應懸浮之CHO-DXB-11細胞。監測懸浮培養中候選選殖體之生長性質及抗體生產。挑選出選殖體W3-5B作為生產候選者，並製備名為 「aTSLP-W3-5B-MSB」之主種子庫(Master Seed Bank(MSB))。自MSB所建立之培養物在至少2個月之延長培養期內顯示出穩定生長及生產力。在用於製造供毒性研究用之原料藥前，先測試MSB之黴漿菌。MSB亦可用於製備主細胞庫(MCB)。
主細胞庫係在優良製造規範(GMP)條件下製備。
用於生產aTSLP抗體之上游製造程序係懸浮細胞培養程序，其使用市售無動物組分培養基。增殖來自MCB之細胞，並擴大規模以接種於2700-公升生物反應器中。該生產用生物反應器之收穫時機主要取決於培養物存活率。在生物反應器收穫時，將磷酸鹽緩衝液添加至該生物反應器中，以在冷藏期間維持pH。藉由離心、深層過濾處理該生物反應器之內容物，以移除完整細胞及細胞碎片，然後經0.2微米濾膜過濾於預先滅菌的袋中。純化前，將澄清培養液儲存在冷藏條件下。在發酵結束時，檢測各批次未處理的主體材料之無菌性、黴漿菌及外來病毒。
使用標準程序純化aTSLP抗體。藉由超過濾/透析過濾步驟，將經純化抗體透析過濾於其調配物緩衝液中，並與賦形劑複合成具有下文所述調配物之原料藥。然後將該等抗體調配物經0.2微米濾膜過濾，以控制生物負荷，隨後儲存在冷藏條件(2-8℃)下。
實例2：調配物研究
材料及方法
在12種不同調配物中，將實例1中所述抗-TSLP抗體(「aTSLP」)稀釋成1mg/ml之最終濃度，該等調配物包括：
˙20mM pH為3.0之檸檬酸鈉(「B1」)
˙20mM pH為4.0之檸檬酸鈉(「B2」)
˙20mM pH為4.0之乙酸鈉(「B3」)
˙20mM pH為5.0之檸檬酸鈉(「B4」)
˙20mM pH為5.0之乙酸鈉(「B5」)
˙20mM pH為5.5之組胺酸(「B6」)
˙20mM pH為6.0之磷酸鈉(「B7」)
˙20mM pH為6.0之組胺酸(「B8」)
˙20mM pH為6.5之磷酸鈉(「B9」)
˙20mM pH為7.0之檸檬酸鈉(「B10」)
˙20mM pH為7.0之磷酸鈉(「B11」)
˙20mM pH為8.0之Tris-HCl(「B12」)
建立各種緩衝調配物中抗-TSLP抗體在2-8℃、25℃及40℃下歷時至多3個月之安定性。在此期間，在各個時間點上分析該等樣品。
分析步驟
RP-HPLC：簡而言之，使樣品在Agilent 1200系統上之Poros R2/10管柱(2.1mm x 30.0mm,cat # 1-1112-12)上移動。使用溶液A(0.2% TFA含於水)使該管柱平衡，並使用溶液B梯度(0.2% TFA含於90%乙腈)展開，其在5分鐘內自25% B緩衝液過渡至60%，流速為2ml/min。
SEC-HPLC：在Agilent 1100系統上之GE S200管柱(10mm x 300mm,cat#17-5175-01)上進行尺寸排除HPLC層析。S200管柱之移動相為1x PBS pH 7.4(Sigma cat# P-3813)。在室溫下以0.5ml/min之流速層析60分鐘。
IEX-HPLC：在研究過程中，使用離子交換HPLC評估樣品之電荷異質性。使樣品在Dionex WCX-10管柱上移動。使用20mM pH為5.5之檸檬酸鈉使該管柱平衡，並使用pH為8.0之磷酸鈉線性梯度展開：在15分鐘內自20過渡至60.5% B。緩衝液B之組成為95mM NaCl、20mM磷酸鹽，pH為8.0。
還原及非還原SDS-PAGE：使用還原及非還原SDS-PAGE監測樣品中小型肽之存在及高分子量物質之形成。
差示掃描熱量法(DSC)：在具有0.142ml細胞體積之VP-DSC微熱量計(MicroCal LLC)上進行DSC。將蛋白質溶液自20℃加熱至95℃，加熱速率為1℃/min。在開始溫度掃描前，使樣品在20℃下平衡5分鐘。一個數據點係為16秒之平均值。所有樣品均進行二重複實驗。使用MicroCal Origin 7軟體獲得表觀Tm分析結果。蛋白質掃描結果減去緩衝液掃描結果後，將掃描結果標準化成蛋白質濃度。注意，Tm必須理解為表觀Tm，因為轉變係不可逆的。
動態光散射(DLS)：在Malvern Zetasizer Nano ZS，型號ZEN3600(UK)上進行動態光散射。所用散射室係來自Hellma(Quartz Suprasil，3mm光路徑，填充體積：45μL)。通過該散射室後，以90°固定角檢測散射光強度。自相關器計算出強度-強度自相關函數G(τ)=〈I(t)I(t+τ)〉，其中τ為取樣時間。由該強度-強度自相關函數，透過以下函數確定擴散係數：G(τ)-A(1+Bexp(-2D t qτ))，其中A為該相關函數之基線，B為該相關函數之截距，且q為散射矢量：q=(4πn/λ 0)sin(θ/2)。n為折射率，λ0為雷射波長(633nm)，且θ為散射角(90°)。假定黏度及折射率接近水。
圓二色光譜(CD)：在圓二色分光偏振計(JASCO,Easton,MD)，型號JASCO J-810-150S上進行CD。針對緩衝液及蛋白質溶液，以0.2nm之數據螺距及50nm/min之掃描速率在250nm-350nm區間內監測橢圓度。求得5次掃描結果，以得到最終光譜。使用1mm比色槽。就數據分析而言，用緩衝液掃描結果減去蛋白質掃描結果。使用以下等式將減去緩衝液的掃描結果標準化成剩餘分子量(molecular rest weight)：，其中Θ係以度計之測量橢圓度，c係以 mg/ml計之蛋白質濃度，d係以cm計之路徑長度，MW係以道爾頓計之蛋白質分子量，且NA係胺基酸數量。所用MW及NA分別為148099Da及1328。
結果
研究原理：進行預調配物研究，以確定調配在長時間內安定之抗體的最佳緩衝液條件。就aTSLP預調配物研究而言，吾人使用五種不同緩衝系統(檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鈉、組胺酸及Tris-HCl)，pH介於3.0至8.0之範圍內。在上述12種緩衝液中將aTSLP抗體調配為1mg/ml。
在起始時間點下之生物化學及生物物理性質
評估稀釋於各12種調配物中之aTSLP分子在起始時間點下之生物化學及生物物理性質。
HPLC：所有樣品在起始時間點下均呈現相同的IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC層析圖。
近UV CD：aTSLP之近UV光譜係複雜的。對於所有不同緩衝液而言，所有aTSLP的近UV CD光譜均有重疊。與其他pH緩衝液相比，觀察到pH為4之檸檬酸鹽緩衝液中之aTSLP在270nm-280nm內略有變化。
動態光散射(「DLS」)：使用動態光散射來測定aTSLP在不同調配物中之流體動力半徑。對各樣品再測定三次，發現單一樣品測量之實驗誤差大約為±0.5nm。就大多數調配物而言，aTSLP之流體動力直徑相似，介於11.5nm至12.8nm之間。aTSLP在pH為4之乙酸鹽緩衝液中之流體動力直徑似乎略低於其他調配物(10.2nm)。沒有跡象顯示任何樣品中會有聚集體形成。
差示掃描熱量法：差示掃描熱量法係用以確定用於評估在加熱不同調配物中之aTSLP後之熱安定性。一般而言，隨著pH之增加， aTSLP之展開轉變會向較高溫度移動，意味著至aTSLP在較高pH值下更為安定。所有調配物中均觀察到兩次完全獨立的展開轉變，pH為3之檸檬酸鹽例外。在pH為3之檸檬酸鹽緩衝液中，aTSLP顯示第三次完全的展開轉變。基於所獲得的其他抗體之DSC數據，第一次轉變應該係FC-片段之CH2-結構域在展開，而第二次轉變應該係FAB-片段及FC-片段之CH3-結構域同時在展開。觀察到pH為4之乙酸鹽及pH為4之檸檬酸鹽之aTSLP安定性存在差異，此可歸因於離子強度之差異。參見上文DLS數據。
40℃下之安定性
藉由IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC分析調配於12種不同溶液中之aTSLP單株抗體。在第2、3、4、6及8週時，藉由IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC分析樣品，並在第13週藉由SEC-HPLC及RP-HPLC分析樣品。
比較所有12種調配物條件：在40℃下13週後所得到之疊加層析圖譜顯示IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC層析圖有很大差異。
藉由IEX-HPLC監測樣品，aTSLP之表面電荷分佈呈現很大差異。正如預期，在極酸性及極鹼性條件(亦即pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]及pH為8.0之Tris-HCl[B12])下觀察到最顯著變化。在pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]中儲存8週後，導致層析圖呈現劇烈驟增及後期洗脫峰，與物質之正電荷之淨增長一致。在pH範圍之另一端，在40℃下於pH為8.0之Tris-HCl[B12]中儲存8週後，會導致鹼性變異體減少，主峰大幅下降及酸性變異體增加。
鹼性峰面積會隨著pH而變化。aTSLP鹼性變異體之相對量在極酸性條件下係最高(在pH為4.0之檸檬酸[B2]中上升至16.7%；在起始時間點為14.8%)，在pH為5.0之檸檬酸鹽[B4]至pH為6.0之組胺酸(約10%，[B8])之調配物中明顯下降，且在pH為6.5至8.0之調配物([B9]至 [B12])中進一步減少至5%及以下。在所有測試條件下，調配於pH為5.5之組胺酸緩衝液[B6]中之aTSLP保持相對面積最高之主峰(約35%)，係鹼性變異體下降最小者之一，且因而係酸性變異體增加最小者之一。參見圖1。
IEX-HPLC層析圖中所觀察到之巨大變化在於高溫下儲存13週之aTSLP樣品之RP-HPLC層析圖中亦係明顯的。aTSLP在40℃下儲存於所有調配物中會導致形成比主抗體峰溶離更快的物質(峰前溶離：2.55min對2.85min)，此係藉由RP-HPLC判定。
儲存在極酸性及極鹼性條件下之樣品觀察到之變化最劇烈。aTSLP於pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]中儲存會導致在13週後形成佔積分峰面積超過30%之RP-HPLC前峰。13週後，就儲存在pH為4.0之檸檬酸鹽[B2]、pH為7.0之磷酸鹽[B11]及PH為8.0之Tris-HCl[B12]中之樣品而言，RP-HPLC峰前面積構成總積分面積之15至25%，而儲存在pH為4.0之乙酸鹽[B3]至pH為7.0之檸檬酸鹽[B10](pH介於4.0至6.5之範圍內)中之樣品之RP-HPLC峰前面積仍低於總積分面積之10%。峰前面積之增加係對應主抗體峰之峰高度及峰面積之減小。藉由RP-HPLC分析，pH為5.5之組胺酸調配物[B6]保持相對面積最高之主峰(上至91%)，且係RP-HPLC前峰變異體增加最小者之一(增加至約6.9%)。
早期洗脫峰之增加(依據RP-HPLC)與後期洗脫峰之形成(依據SEC-HPLC)(後峰：~26min對32min)及主峰高度之下降具有相關性。就儲存在pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]中之aTSLP樣品而言，此尤其顯著。在此條件下，13週後，SEC-HPLC後峰佔積分峰面積之至多30%。儘管程度較輕，但在調配於pH為4.0之檸檬酸鹽[B2]、pH為7.0之磷酸鹽[B10]及PH為8.0之Tris-HCl[B12]中之aTSLP中亦注意到相同現象；後峰佔總峰面積之5至10%。在pH為4.0之檸檬酸鹽[B3]至pH為7.0之檸檬酸鹽[B10]中，後峰仍遠低於總積分峰面積之5%。藉由SEC- HPLC分析，pH為5.5之組胺酸調配物保持相對面積最高之主峰(97.4%)，且後峰變異體之增加最小(增加至約2.2%)。
後期洗脫峰(依據SEC-HPLC)預示形成分子量低於單株抗單體之物質。使用分子標記對S200 SEC-HPLC管柱進行校準，顯示aTSLP片段之滯留時間與25-30kDa之球狀蛋白質一致。藉由還原SDS凝膠法分析12種在40℃下儲存4週後之aTSLP調配物，結果顯示較小分子量組分可能來自重鏈降解作用。事實上，除預期的重鏈及輕鏈以外，曝露至極酸性或極鹼性條件下之樣品在約30-32kDa處會出現條帶，儲存在較不嚴格條件及/或較低溫度下之樣品則沒有該條帶。
通常由比主抗體峰溶離更快的峰之增加(依據SEC-HPLC)表現之聚集在針對aTSLP之13週研究期間仍相對較低。考慮到該分子之獨特疏水性，該結果有點出乎意料。由於極大的聚集體可潛在地於管柱上過濾掉，故吾人藉由DLS分析樣品。在此等條件下未發現任何聚集體。
比較pH為5.5之組胺酸、pH為5.0之檸檬酸鹽及pH為5.0之乙酸鹽的aTSLP調配物：為自該等三種最佳條件挑選出最具潛力的調配物緩衝液，吾人藉由IEX-、SEC-及RP-HPLC比較主峰隨著時間之演化及分別藉由IEX-、SEC-及RP-HPLC比較鹼性峰、後峰及前峰隨著時間之演化。
該等三種分析方法獨立地顯示，當aTSLP調配於pH為5.5之組胺酸[B6]中時，主峰會保持其最大面積。當在IEX-及SEC-HPLC中依據主峰面積衡量時，次優調配物係pH為5.0之乙酸鹽[B5]。然而，藉由RP-HPLC分析時，pH為5.0之檸檬酸鹽及乙酸鹽[B4及B5]之主峰面積演化係可比較的。藉由IEX-HPLC分析時，aTSLP鹼性變異體之演化所揭示之較佳調配物條件之次序相同：觀察到下降最小的係pH為5.5之組胺酸[B6]，接著係pH為5.0之乙酸鹽[B5]及pH為5.0之檸檬酸鹽 [B4]。當考慮到RP-HPLC前峰及SEC-HPLC後峰之演化時，pH為5.5之組胺酸[B6]又是精選調配物，因為此等變異體之增加比其他兩種調配物要緩慢。pH為5.0之乙酸鹽及檸檬酸鹽[B4 & B5]中aTSLP之RP-HPLC前峰及SEC-HPLC後峰之演化幾乎相同。參見圖2。
在25℃下之安定性
在第2、4、6、8及13週，藉由IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC分析調配於12種不同溶液中之aTSLP。
比較所有12種調配物條件：在25℃儲存13週之樣品之IEX-、SEC-及RP-HPLC層析圖中之改變不及該等樣品在接受40℃儲存時劇烈。參見圖3。然而，變化顯著得足以證實吾人在於40℃下儲存之aTSLP樣品中所觀察到的趨勢；此等趨勢包括(i)形成酸性變異體，主峰及鹼性峰面積減小(依據IEX HPLC)；(ii)形成後峰(依據SEC-HPLC)及(iii)形成前峰(依據RP-HPLC)。
就儲存在40℃下之樣品而言，位於pH範圍兩端之調配物之IEX-、SEC-及RP-HPLC層析圖發生最劇烈變化。依據IEX-HPLC，儲存在PH為8.0之Tris-HCl[B12]及pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]中之樣品之主峰高度及面積減少最為嚴重(減少至約積分面積之40%)。如先前所看到的，主峰面積之減少會由酸性峰面積之增加得到補償。見於40℃下之pH對鹼性峰面積之影響亦得到證實：在極酸性條件鹼性峰面積有所 增加(在pH為3.0之檸檬酸鹽[B1]中增加至約25%)，而在極鹼性條件大為減少(在PH為8.0之Tris-HCl[B12]中小於10%)。依據SEC-HPLC，觀察到pH為3.0之檸檬酸鹽[B1](接近4%)及PH為8.0之Tris-HCl([B12]約3.5%)之後峰之增加最多，在pH 5.0至pH 6.0範圍內之pH下之增幅最小(在pH為5.5之組胺酸[B6]中為2.2%)。依據RP-HPLC，前峰相對面積增加最多的又是pH為3.0之檸檬酸鹽[B1](至高於10%)及PH為8.0之Tris-HCl[B12](至約9%)，介於5.0至6.0範圍內之調配物之增幅又是最小(在pH為5.5之組胺酸[B6]中為1.45%)，因此完全符合儲存在40℃下之樣品中觀察到趨勢。
在某種程度上，與吾人在置於40℃下之樣品中所觀察到的結果一致，pH為5.0之檸檬酸鹽[B4]、pH為5.0之乙酸鹽[B5]及pH為5.5之組胺酸[B6]係最佳調配物，因為調配於此等緩衝液中之aTSLP保持可接受的主峰及鹼性峰面積(依據IEX-HPLC)，同時最大限度減少前峰及後峰之形成(分別依據RP-HPLC及SEC-HPLC)。
比較pH為5.5之組胺酸、pH為5.0之檸檬酸鹽及pH為5.0之乙酸鹽地aTSLP調配物：吾人直接比較在25℃下於三種最佳緩衝液(pH為5.0之檸檬酸鹽[B4]、pH為5.0之乙酸鹽[B5]及pH為6.0之組胺酸[B6])中所得到之安定性數據。如之前一般，吾人藉由IEX-、SEC-及RP-HPLC比較主峰隨著時間之演化，及分別藉由IEX-、SEC-及RP-HPLC比較鹼性峰、後峰及前峰隨著時間之演化。
再次，該等三種分析方法獨立地顯示，當aTSLP調配於pH為5.5之組胺酸[B6]中時，主峰保持其最大面積。當在IEX-及SEC-HPLC中依據主峰面積衡量時，25℃下之次優調配物又是pH為5.0之乙酸鹽[B5]。如在40℃下所見，藉由RP-HPLC分析時，pH為5.0之檸檬酸鹽及乙酸鹽[B4及B5]之主峰面積演化係可比較的。藉由IEX-HPLC分析時，pH為5.5之組胺酸緩衝液[B6]之aTSLP鹼性變異體之減少量最小， 因此係較佳調配物(參見圖4及表3)。與40℃樣品不同，次優調配物係pH為5.0之檸檬酸鹽[B4]，接著係pH為5.0之乙酸鹽[B5]。當考慮到RP-HPLC前峰及SEC-HPLC後峰之演化時，pH為5.5之組胺酸[B6]又是精選調配物，因為此等變異體之增加比其他兩種調配物要緩慢。pH為5.0之乙酸鹽及檸檬酸鹽[B4 & B5]中aTSLP之RP-HPLC前峰及SEC-HPLC後峰之演化相同。
在4℃下之安定性
在第4、6及13週，藉由IEX-HPLC、SEC-HPLC及RP-HPLC分析在4℃下於12種不同溶液中調配之aTSLP。
比較所有12種調配物條件：在4℃下儲存13週之樣品之IEX-、SEC-及RP-HPLC層析圖之改變最小。特定言之，IEX層析圖中未發現顯著趨勢：主峰高度及面積在整個pH範圍內保持平穩，且不同條件下之鹼性峰面積僅有溫和變化。然而，藉由SEC-HPLC及RP-HPLC注意到一些在最極端pH條件下之變化：分別形成後峰及前峰。藉由後兩種分析方法，儲存在4℃下之樣品中亦觀察到在40℃及25℃下所觀察到之一般趨勢。
藉由SEC-HPLC分析，在pH為8.0之Tris-HCl(0.38%)及pH為3.0之檸檬酸鹽[B1](接近0.2%)中觀察到後峰有較大幅度增加，在介於pH 5.0至pH 6.0範圍內之pH下之增幅最小(0.05-0.06%)。藉由RP-HPLC分析，pH為8.0之Tris-HCl[B12](增加至1.3%)及pH為3.0之檸檬酸鹽 [B1](增加至約1%)中之前峰相對面積有較大幅度增加，在介於5.0至6.0範圍內之pH下之增幅最小(增加至0.5%-0.6%)。
與吾人在置於40℃及25℃下之樣品中所觀察到的結果一致，pH為5.0之檸檬酸鹽[B4]、pH為5.0之乙酸鹽[B5]及pH為5.5之組胺酸[B6]係最佳調配物，因為於此等緩衝液中調配之aTSLP保持可接受的主峰及鹼性峰面積(依據IEX-HPLC)，同時前峰及後峰之形成最少(分別依據RP-HPLC及SEC-HPLC)。參見圖5。
比較pH為5.5及pH為6.0之組胺酸緩衝液在40℃及25℃下之安定性數據：吾人預調配物研究顯示，pH為5.5之組胺酸係較佳調配物。在此階段，為形成關於pH範圍之初步概念，吾人比較pH為5.5之組胺酸[B6]及pH為6.0之組胺酸[B8]在40℃及25℃下所產生的安定性研究。0.5個pH單位變化導致層析圖譜發生變化；IEX-HPLC之變化最為顯著。參見圖6。在40℃下8週後，IEX-HPLC主峰自pH為5.5之組胺酸中之33.3%變成pH為6.0之21.3%。因為pH值增加0.5會導致鹼性峰減少約6個百分點(自11.8%減少至5.6%)，故鹼性峰遵循相同趨勢。
使用在25℃下儲存13週之樣品進行的安定性研究中亦觀察到相同趨勢。參見圖7。IEX-HPLC層析圖中觀察到之變化最為顯著。pH自5.5增加至6.0會導致主峰面積自58.6%減少至55.9%，並導致鹼性變異體峰面積減少5.3個百分點(自14.9%減少至9.6%)。在40℃及25℃下，藉由SEC-HPLC及RP-HPLC亦觀察到變化，但變化有限。
討論及結論
單株抗體係大型且複雜的分子，其經長時間儲存後會經受多種已確認的降解途徑。此等降解作用通常包括聚集、重鏈或輕鏈解蛋白裂解、氧化、脫醯胺、異構化等。因此，確定原料藥之最佳調配物係首要任務，因為其將控制及減少上述降解產物之出現。吾人在三段溫度(4℃、25℃及40℃)下對大範圍pH及緩衝液類型進行長達13週的預 調配物研究確定20mM pH為5.5之組胺酸作為首選調配物。在此等條件下，SEC-HPLC後峰及RP-HPLC前峰係最小，而IEX-HPLC主峰及鹼性峰之高度依然可接受。
將組胺酸緩衝液pH增加0.5個pH單位至pH 6.0對IEX-HPLC層析圖具有可檢測之影響，表明所推薦的pH範圍應相當狹窄。如同許多其他標準緩衝液一般，已知組胺酸溶液之pH對溫度有強烈相依性(0.02 pH單位/℃)。
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實例3：毒物學研究
該實例描述如何開發抗-TSLP(aTSLP)之毒物學調配物。蛋白質凝集作用是在凍融過程及產品處理及運輸期間主要的降解途徑。為確定最穩健的調配物，透過凍融進行施壓並進行振盪研究。應用分析型尺寸排除層析法及藉由320nm下之吸光率所測定的濁度監測產品聚集及降解。
基於實例2中所述預調配物研究，選擇三種不同緩衝液組分(10mM pH為5.5之組胺酸、20mM pH為5.3之乙酸鹽，及10mM pH為5.3之檸檬酸鹽)，在使用或不使用賦形劑下，進一步測試其等作為抗- TSLP之毒物學調配物之適用性。毒物學調配物係以冷凍材料(<-70℃)提供。
在使用或不使用賦形劑(7%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80)下，在此等緩衝液中測試40.5mg/ml之抗-TSLP(具有實例1中所述之序列)經凍融及振盪壓力後之降解及聚集情況。特定言之，在3天內，進行0、1、2、5-10輪凍融週期，並以300rpm進行振盪研究，以確定最穩健調配物。使用尺寸排除層析法及濁度法評估產品降解及聚集。10mM組胺酸、7%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80(pH 5.5)中之抗-TSLP對凍融及振盪壓力之耐性最佳。
材料
製備以下母液：溶液A=200mM乙酸鹽，pH 5.3
溶液B=100mM組胺酸，pH 5.5
溶液C=100mM檸檬酸鹽，pH 5.3
溶液D=5%聚山梨醇酯80
溶液E=50%蔗糖
以不同比例混合溶液A-溶液E，以得到：緩衝液A0=20mM乙酸鹽，pH 5.3
緩衝液A1=20mM乙酸鹽，7%蔗糖，pH 5.3
緩衝液A2=20mM乙酸鹽，0.02%聚山梨醇酯80，pH 5.3
緩衝液A3=20mM乙酸鹽，7%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯80，pH 5.3
緩衝液H0=10mM組胺酸，pH 5.5
緩衝液H1=10mM組胺酸，7%蔗糖，pH 5.5
緩衝液H2=10mM組胺酸，0.02%聚山梨醇酯80,pH 5.5
緩衝液H3=10mM組胺酸，7%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯80，pH 5.5
緩衝液C0=10mM檸檬酸鹽，pH 5.3
緩衝液C1=10mM檸檬酸鹽，7%蔗糖，pH 5.3
緩衝液C2=10mM檸檬酸鹽，0.02%聚山梨醇酯80，pH 5.3
緩衝液C3=10mM檸檬酸鹽，7%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯80，pH 5.3
抗-TSLP係根據實例1製得：52.4mg/ml抗-TSLP含於10mM檸檬酸鹽，pH 5.3
49mg/ml抗-TSLP含於10mM組胺酸，pH 5.5
473mg/ml抗-TSLP含於20mM乙酸鹽，pH 5.3
將母液A-E添加至各別抗-TSLP溶液中，以得到含於緩衝液A0、A1、A2、A3、C0、C1、C2、C3、H0、H1、H2、H3之5ml 40.5mg/ml抗-TSLP(批次67683-83)。將此等溶液用於進一步凍融及凍融研究。
方法
凍融週期：針對所有緩衝液條件，準備5個裝有500微升溶液之小瓶(2ml，Corning 430915)，一個小瓶對應個別凍融週期(週期0、1、2、5及10)。就週期0而言，將溶液留在冰箱中。就各冷凍週期而言，將溶液置於<-70℃的冷凍箱中，歷時至少1小時。融化時間為至少45分鐘。所有週期均係同一時間完成。將未使用的樣品冷凍在-70℃下，以備可能的進一步分析使用。
振盪設定：將500微升各抗-TSLP溶等分於2ml聚丙烯小瓶(Corning 430915)中。在環境室溫下，將所有小瓶置於振盪器上，設置為水平位置。將振盪器設定為300rpm，歷時3天。
尺寸排除層析法：在具有Superdex 10/300管柱之Agilent HPLC系統上進行尺寸排除層析。流速為0.5ml/min，運行時間為60分鐘。週期0及週期5之注射體積為10微升，且週期10之注射體積為75微升。樣品在注射前不進行稀釋。使用Biorad蛋白質凝膠過濾標記(目錄編號151-1901)(其包括分子量介於1.35kDa至670kDa範圍內之蛋白質)作為估計溶離物質之分子量之標準。
濁度研究：在Agilent分光光度計中使用1cm路徑長度單元監測320nm下之表觀吸光率。以緩衝液吸光率減去抗-TSLP吸光率得到最終讀數。
結果及討論
凍融研究：在凍融週期0、5及10後進行尺寸排除層析及濁度測量。僅在開始(週期0)及週期10後進行濁度研究。典型尺寸排除層析圖會顯示出單體主峰、聚集體峰(峰1)、三聚體-四聚體峰(峰2)及小部份降解產物(後峰)。此等峰之分子量可基於藉由運行蛋白質凝膠過濾標準之滯留時間加以估算(表4)。
表5-7顯示，當藉由尺寸排除層析法分析時，緩衝液對經歷凍融週期0、5及10之抗-TSLP之降解及聚集行為之影響。
藉由比對初始樣品中之聚集體濃度(表2中之前峰1及前峰2)，可以看出，所有組胺酸緩衝液中之抗-TSLP具有最低濃度之聚集體。在不使用賦形劑之調配物及僅含聚山梨醇酯80之調配物中，抗-TSLP會形成較高度的聚集體及三聚體-四聚體。蔗糖顯示在所有調配物中能防止聚集作用達5個凍融週期。
比較最初及凍融週期10，所有調配物在320nm下之吸光率研究顯示，吸光率沒有任何大的增加，檸檬酸鹽緩衝液(C0-緩衝液)例外。
振盪研究：藉由在室溫下以300rpm振盪3天，對含於所有12種調配物中之40.5mg/ml抗-TSLP施加壓力，然後進行濁度分析。結果顯示於圖8中。所有含聚山梨醇酯80之調配物(A2、A3、C2、C4、H2、H3)在藉由振盪施加壓力後均未顯示任何聚集跡象。在該等不含聚山梨醇酯80之調配物中，發現組胺酸調配物比乙酸鹽及檸檬酸鹽調配物更能阻止聚集作用。結果顯示，在未添加賦形劑時，抗-TSLP顯示在檸檬酸鹽調配物有聚集的傾向。
結論
凍融研究顯示，所有受試抗-TSLP調配物中，所有含蔗糖之調配物(A1、A3、C1、C3、H1、H3)抗聚集能力可達5個凍融週期。依據尺寸排除層析法數據，與凍融週期5之組胺酸調配物相比，乙酸鹽調配物起初的聚集體濃度似乎略有增加。
振盪研究顯示，含聚山梨醇酯80之抗-TSLP調配物能抵抗振盪壓力。在不含賦形劑的情況下，組胺酸調配物中的抗-TSLP較乙酸鹽調配物及檸檬酸鹽調配物中的抗-TSLP不易於在振盪壓力期間聚集。
實例4：製備用於皮下及靜脈內投與之冷凍乾燥調配物
將抗-TSLP抗體調配成冷凍乾燥粉末，其在使用前以無菌注射用水加以復水。該調配物係經設計為等滲調配物。
將水分含量、塊狀物外觀及復水時間考慮在內，使冷凍乾燥過程最優化。各種生物化學及生物物理測試顯示，冷凍乾燥材料與預冷凍乾燥溶液具有可比較性。
待用於復水成40mg/mL供靜脈內注射用之冷凍乾燥調配物係由含於10mM組胺酸緩衝液、7%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80(pH 5.5)之約40mg/mL aTSLP組成。aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)產品係儲存在2-8℃下。就40mg/mL溶液而言，該冷凍乾燥產品(表8)係以2.7mL無菌注射用水復水，以提供40mg/mL aTSLP含於10mM組胺酸緩衝液、7%(w/v)蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80且pH為5.5之溶液。aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)產品係儲存在2-8℃下。
待用於復水成100mg/mL供皮下注射用之冷凍乾燥調配物係由4mM組胺酸緩衝液、2.9%蔗糖、0.008%聚山梨醇酯80(pH 5.5)組成。aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)產品係儲存在2-8℃下。就各小瓶而言，將3.4mL上述溶液填裝於10R DIN小瓶中，並進行冷凍乾燥。各冷凍乾燥小瓶在使用前以1.2mL WFI進行復水，以得到100mg/mL aTSLP含於10mM組胺酸、7.25%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯80(pH 5.5)之溶液。該復水溶液係SC注射用等滲溶液。
就100mg/mL溶液而言，該冷凍乾燥產品(表9)以1.2mL無菌注射用水進行復水，以提供100mg/mL aTSLP含於10mM組胺酸緩衝液、7.25%(w/v)蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨醇酯80且pH為5.5之溶液.
實例6：冷凍乾燥的aTSLP調配物之安定性
用於皮下注射之冷凍乾燥aTSLP調配物之安定性研究
aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)係用於皮下注射，且係包裝成含於10mL I型管形玻璃瓶之冷凍乾燥藥品，該瓶具有13mm凍乾塞及13mm Flip-Off®鋁塑蓋。推薦儲存條件係2℃至8℃。玻璃瓶中之一次性冷凍乾燥藥品在使用前經無菌注射用水復水，以在pH 5.5下達到100mg/mL之濃度。
對研究材料(批次NB-liyun-0321710-0010)之穩定性進行研究，歷時36個月。對臨床材料(批次WL00046031)之穩定性進行研究，歷時60個月。當前，可獲得6個月(批次NB-liyun-0321710-0010)及一個月(批次WL00046031)安定性數據。儲存在2-8℃之推薦儲存條件下時，所有結果均在建議規格範圍內。
研究批次NB-liyun-0321710-0010之aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)係於2011年9月製造。開始對該批次進行安定性研究，以評估建議冷凍乾燥調配物之安定性。在5℃/環境R.H.(5C)、25℃/60% R.H.(25H)及40℃/75% R.H.(RH4)下研究小瓶之安定性，其中推薦2-8℃作為長期儲存條件。該研究之持續時間係36個月。圖9中所示之6個月臨 床前HP-SEC(%單體)數據之線性趨勢顯示，在5℃下儲存12個月之變化最小。基於此等預測，預期在2-8℃推薦儲存條件下之樣品可滿足其95.0%單體之驗收準則達至少12個月。圖10、11及12中提供6個月HP-IEX數據之線性趨勢，此等趨勢顯示，在5℃下儲存12個月之變化最小。在25H之加速儲存條件及RH4之壓力條件下，觀察到為期六個月的%水分測試結果略有變化。兩種條件下之水分含量均有所增加，在25H條件下自0.6%增加至0.8%，而在RH4條件下自0.6%增加至1.0%。咸發現HP-SEC單體百分比自最初的99.9%開始減少，在RH4條件下減少至97.8%，而在25H條件下略微減少至99.3%，同時HMW物質會相應增加。咸發現HP-IEX主要物質百分比自最初的72.5%開始減少，在25H及RH4下分別減少至70.3%及64.7%，同時兩種條件下之鹼性變異體及RH4下之酸性變異體均會相應地增加。總體而言，冷凍乾燥藥品之6個月臨床前安定性數據顯示，在冷藏條件下之產品品質沒有明顯變化，而在加速條件(25H)及壓力條件(RH4)下則略有變化。
aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)I期臨床藥品批次WL00046031及批次WL00047366分別係於2011年12月及2012年3月製造。將一次性藥品包裝於10mL I型管形玻璃瓶中，該瓶塞有13mm West 4432/50凍乾塞並經13mm Flip-Off®鋁塑蓋密封。aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)在使用前經無菌注射用水復水。2012年2月開始對批次WL00046031進行安定性研究。將小瓶儲存在5C、25H及RH4下，其中推薦2-8℃作為長期儲存條件。該研究之持續時間為60個月。I期臨床藥品批次WL00046031之一個月安定性結果顯示，在儲存及加速安定條件(5℃，25H)下之HP-SEC單體百分比或HP-IEX主要物質百分比沒有降低。在加壓條件RH4下，HP-SEC單體百分比會自100.0%略微下降至99.0%，而HP-IEX主要物質百分比會自71.2%略微下降至68.2%。該數據在不同批次間顯示出具有一致的安定性。
用於靜脈內注射之冷凍乾燥aTSLP調配物之安定性研究
aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)(FM005575-1-1)係用於靜脈內注射，且係包裝成含於10mL I型管形玻璃瓶之冷凍乾燥藥品，該瓶具有13mm West 4432/50凍乾塞及13mm Flip-Off®鋁塑蓋。預期儲存條件係2℃至8℃。玻璃瓶中之一次性冷凍乾燥藥品在使用前經無菌注射用水復水，以在pH 5.5下達到40mg/mL之濃度。
對研究材料(批次89782-101)之穩定性進行研究，歷時24個月。對臨床材料(批次WL00044338)之穩定性進行研究，歷時60個月，並對來自另一批次的臨床材料(批次WL00044673)之穩定性進行研究，歷時60個月。當前，可獲得6個月(批次89782-101)及一個月(批次WL00044338)安定性數據。儲存在2-8℃之推薦儲存條件下時，所有結果均在建議規格範圍內。基於可獲得的安定性數據，建議最初的存放期為12個月。
對aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)研究批次89782-101進行研究，以評估推薦冷凍乾燥調配物之安定性。在5℃/環境R.H.(5C)、25℃/60% R.H.(25H)及40℃/75% R.H.(RH4)下研究小瓶之安定性，其中推薦2-8℃作為長期儲存條件。該研究之持續時間係24個月。圖13中所示之6個月臨床前HP-SEC(%單體)數據之線性趨勢顯示，在5℃下儲存12個月之變化最小。基於此等預測，預期2-8℃推薦儲存條件下之樣品可滿足其95.0%單體之驗收準則達至少12個月。圖14、15及16中提供6個月HP-IEX數據之線性趨勢。此等趨勢顯示，在5℃下儲存12個月之變化最小。在25H之加速儲存條件及RH4之壓力條件下，觀察到為期六個月的%水分測試結果略有變化。25H及RH4條件下之水分含量均自0.4%增加至0.6%。發現在RH4條件下，HP-SEC單體百分比匯自最初的99.9%略微減少至99.7%，同時HMW物質會相應增加，而在25H條件下並沒有減少。咸發現HP-IEX主要物質百分比會自 最初的70.2%開始減少，在25H及RH4下分別減少至69.5%及66.7%，同時兩種條件下之酸性變異體及RH4下之鹼性變異體均相應地增加。總體而言，冷凍乾燥藥品之6個月BSP安定性數據顯示，在冷藏條件下之產品品質沒有明顯變化，而在加速條件(25H)及壓力條件(RH4)下則略有變化。
aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)I期臨床藥品批次WL00044338及WL00044673係在West Point,PA製造(分別製造於2011年8月25日及2011年11月10日)。將一次性藥品包裝於10mL I型管形玻璃瓶中，該瓶塞有13mm West 4432/50凍乾塞並經13mm Flip-Off®鋁塑蓋密封。aTSLP注射用粉劑(100mg/小瓶)在使用前經無菌注射用水復水。在WAG開始對批次WL00044338進行安定性研究(2011年11月03日)。將小瓶儲存在5C、25H及RH4下，其中推薦2-8℃作為長期儲存條件。該研究之持續時間將為60個月。在WAG對批次WL00044673開始進行另一安定性研究(2012年1月27日)。將小瓶儲存在5C、25H及RH4下，其中推薦2-8℃作為長期儲存條件。該研究之持續時間為60個月。I期臨床藥品批次WL00044338之一個月正式安定性結果顯示，所有安定性條件(5℃、25H及RH4)下之HP-SEC單體百分比或HP-IEX主要物質百分比均沒有下降。該數據在不同批次間顯示具有一致的安定性。
實例7：aTSLP調配物之黏度
在20℃下，藉由NimiVis II黏度計(Grabner Instruments)測定以靜脈內方式及皮下方式投與之上述調配物之黏度。所得數值匯總於表10中。
如本文所用(包括隨附申請專利範圍)，除非上下文中另有明確指示，否則單字之單數形式(諸如「一」及「該」包括其相應複數參考項。除非另有說明，否則本文所提及之蛋白質及個體係人類蛋白質及人類個體，而非另一物種。
本文所引用之所有文獻係以引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別的將各個公開案、資料庫條目(例如基因庫(Genbank)序列或GeneID條目)、專利申請案或專利案之整體以引用的方式併入一般。該以引用的方式併入之聲明係按照申請者之意願，依照37 C.F.R.§1.57(b)(1)規定所作，旨在與各個及每個公開案、資料庫條目(例如基因庫序列或GeneID條目)、專利申請案或專利案(各者確定無疑地符合37 C.F.R.§1.57(b)(2)規定)聯繫起來，即使此等引用並與以引用方式併入的專用聲明不直接相關亦然。本發明書中以引用方式併入之專用聲明(若有的話)並不會以任何方式削弱該以引用方式併入之一般聲明。本文引用文獻既非承認該文獻為相關先前技術，且其亦不構成承認此等公開案或文件之內容或日期。
<110> 容後補呈亞歷山卓 安柏葛利維倫廷 安托席克安妮塔 戴柏拉安潔拉 摩許
<120> 抗TSLP抗體之安定調配物
<130> 23284
<140> 61/692,257
<141> 2012-08-23
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗TSLP輕鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 450
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗TSLP重鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗TSLP輕鏈CDR1
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 抗TSLP輕鏈CDR2
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 抗TSLP輕鏈CDR3
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<210> 6
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 抗TSLP重鏈CDR1
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<212> PRT
<213> 人造序列
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<223> 抗TSLP重鏈CDR2
<400> 7
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 抗TSLP重鏈CDR3
<400> 8

Claims (23)

  1. 一種調配物，其包含抗-TSLP抗體或其抗原結合片段及組胺酸緩衝液。
  2. 如請求項1之調配物，其進一步包含界面活性劑。
  3. 如請求項2之調配物，其進一步包含安定劑。
  4. 如請求項3之調配物，其中該界面活性劑係聚山梨醇酯80，且該安定劑係蔗糖。
  5. 如請求項4之調配物，其中該調配物具有約5.5之pH。
  6. 如請求項5之調配物，其中該調配物係經冷凍乾燥。
  7. 如請求項6之調配物，其中該調配物能使該抗-TSLP抗體或其抗原結合片段復水成介於約40mg/mL至100mg/mL之間之濃度。
  8. 如請求項6之調配物，其中相對於該抗體或其抗原結合片段，聚山梨醇酯80在復水後係以約0.02%之重量比存在。
  9. 如請求項6之調配物，其中相對於該抗體或其抗原結合片段，蔗糖在復水後係以約7%之重量比存在。
  10. 如請求項6之調配物，其中該調配物在復水後包含：a)40-100mg/mL之抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；b)約70mg/mL之蔗糖；c)約0.2mg/mL之聚山梨醇酯80；及d)約10mM pH為約5.0-6.0之組胺酸緩衝液。
  11. 如請求項6之調配物，其係藉由使包含以下物質之水溶液冷凍乾燥而製得：a)100mg/mL之抗-抗體或其抗原結合片段；b)約70mg/mL之蔗糖；c)約0.2mg/mL之聚山梨醇酯80；及 d)約10mM pH為5.0-6.0之組胺酸緩衝液。
  12. 如請求項6之調配物，其係藉由使包含以下物質之水溶液冷凍乾燥而製得：a)40mg/mL之抗-抗體或其抗原結合片段；b)約28-29mg/mL之蔗糖；c)約0.08mg/mL之聚山梨醇酯80；及d)約4mM pH為5.0-6.0之組胺酸緩衝液。
  13. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該抗體或其抗原結合片段包含：(a)含SEQ ID NO：1胺基酸序列之輕鏈及含SEQ ID NO：2胺基酸序列之重鏈；或(b)含SEQ ID NO：3、4及5之CDR序列之輕鏈可變區及含SEQ ID NO：6、7及8之CDR序列之重鏈可變區。
  14. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該調配物在5℃下可安定至少12個月、18個月、24個月或36個月。
  15. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該抗-TSLP抗體包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8。
  16. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該抗-TSLP抗體包含SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2。
  17. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該調配物在約5℃-25℃之溫度下可安定至少36個月。
  18. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該調配物在約5℃-25℃之溫度下儲存至少12個月時，包含98.5%之抗-TSLP單體。
  19. 如請求項18之調配物，其中該調配物在約25℃之溫度下儲存至少12個月時，包含98.5%之抗-TSLP單體。
  20. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中該調配物在約5℃-25℃之溫度下儲存至少36個月時，包含95.0%之抗-TSLP單體。
  21. 如請求項20之調配物，其中該調配物在約25℃之溫度下儲存至少36個月時，包含95.0%之抗-TSLP單體。
  22. 如請求項1至12中任一項之調配物，其中當該抗體以100mg/mL之濃度存在時，該調配物在20℃下具有小於4cP之黏度。
  23. 一種如請求項1至12中任一項之調配物之用途，其係用於製造治療哺乳動物個體之過敏性疾病之藥劑。
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