TWI721020B

TWI721020B - 一種抗ｐｄ-１抗體製劑及其在醫藥上的應用

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Publication number: TWI721020B
Application number: TW105131263A
Authority: TW
Inventors: 李�杰; 顏貞; 王萍萍; 方言; 陶維康; 張連山; 孫飄揚
Original assignee: 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2021-03-11
Also published as: MX2018003306A; JP2018532730A; US20210000954A1; RU2018110333A; BR112018005349A2; JP6921062B2; AU2016329960A1; US10786567B2; EP3357508A4; UA124259C2; CN106999591B; CA2999079A1; WO2017054646A1; RU2731418C2; EP3357508A1; US20180339045A1; RU2018110333A3; CN106999591A; KR20180054791A; TW201711699A

Abstract

本發明涉及一種抗PD-1抗體製劑及其在醫藥上的應用。具體而言，本發明涉及一種穩定的抗PD-1抗體藥物製劑，含有抗PD-1抗體、緩衝劑，還可以含有至少一種穩定劑，視需要的還可以含有表面活性劑。本發明穩定的抗PD-1抗體藥物製劑可以有效抑制抗體的聚集和脫醯胺作用，從而阻止其中抗體產品的降解，得到穩定性的注射藥物製劑。

Description

一種抗PD-1抗體製劑及其在醫藥上的應用

本發明涉及包含抗PD-1抗體及其抗原結合片段的藥物製劑、其製備方法以及該製劑的用途。

腫瘤的免疫逃逸機制與有機體對腫瘤的免疫反應之間存在著極為複雜的關係。腫瘤免疫治療早期腫瘤特異性的殺傷性T細胞是有其生物活性的，但隨著腫瘤生長後期失去了殺傷的功能。所以腫瘤免疫治療是為了最大限度的提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，它不但要在體內啟動原有的免疫系統反應，更要維持免疫系統反應的持續時間和反應強度，才是免疫治療腫瘤的關鍵。

程式性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)是1992年發現的表現在T細胞表面的一個蛋白受體，參與到細胞的凋亡過程之中。PD-1屬於CD28家族，與細胞毒性T淋巴細胞抗原4(cytotoxic T Iymphocyte antigen 4,CTLA-4)具有23%的胺基酸同源性，但其表現卻與CTLA不同，主要表現在活化的T細胞、B細胞和髓系細胞上。PD-1有兩個配體，分別為PD-L1和PD-L2。新的研究發現乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤等人類腫瘤組織中檢測到高PD-L1蛋白的表現，且PD-L1的表現程度和患者的臨床及預後緊密相關。由於PD-L1起到了第二信號路徑抑制T細胞增殖的作用，所以阻斷PD-L1/PD-1之間結合成為了腫瘤免疫治療領域一個非常有潛力的新興靶點。

WO2015/085847公開了一類新的抗PD-1抗體，所述的抗體具有親和力高、半衰期長的特點，預期其對上述疾病具有更好的療效。然而這些新的抗PD-1抗體極不穩定，難以製成臨床可用的製劑，PCT對於它們如何製成製劑沒有任何具體的描述。因此，有必要對這些抗體進行深入研究，以得到穩定、方便臨床使用的製劑。

本發明的目的在於提供一種穩定的抗PD-1抗體製劑。

本發明的穩定的藥物製劑含有抗PD-1抗體及其抗原結合片段、緩衝劑。所述藥物製劑還可以含有至少一種穩定劑，視需要的還可以含有表面活性劑。

本發明所述的藥物製劑中，所述的抗PD-1抗體及其抗原結合片段其包含任意1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少85%序列同源性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6。

所述胺基酸序列如下表所示：

所述的序列同源性可以是為了改進抗體的親和性或免疫源性或穩定性或其他常規的理化特性及生物活性，以常規方法篩選而得。

進一步較佳的抗PD-1抗體具有SEQ ID NO：7的重鏈和SEQ ID NO：8的輕鏈胺基酸序列：SEQ ID NO：7

SEQ ID NO：8

該抗PD-1抗體的濃度可以是1-60mg/ml，較佳係20-50mg/ml，更佳係35-45mg/ml，最佳係40mg/ml。

本發明所述的緩衝劑選自醋酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、以及磷酸鹽中的一種或多種，所述的磷酸鹽可選自磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀；較佳的緩衝劑為醋酸鹽，其用量沒有特別限制，在本發明的實施方案中，例如是1至50mM，較佳係2至20mM，更佳係5-15mM，最佳係10mM。

本發明所述藥物製劑的pH值範圍可以在4.5-6.0，較佳係4.8-5.6，最佳pH值是5.2。

本發明所述的至少一種穩定劑選自糖或胺基酸。其中所述的糖較佳係雙糖，選自蔗糖、乳酸、海藻糖、麥芽糖，較佳係海藻糖，最佳係α,α-二水合海藻糖。所述雙糖的用量無需特別限制，在本發明的實施方案中，例如是30至120mg/ml，較佳係60至100mg/ml，更佳係85至95mg/ml，最佳係90mg/ml。

本發明所述的表面活性劑可以選自聚氧乙烯氫化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，所述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯可以選自聚山梨酯20、40、60或80。所述表面活性劑的用量無需特別限制，在本發明的實施方案中，例如是0.01至1mg/ml，較佳係0.05至0.5mg/ml，更佳係0.1至0.4mg/ml，最佳係0.2mg/ml。

本發明所述的穩定的藥物製劑是一種可注射的藥物製劑。

在本發明的一個實施方案中，所述穩定的藥物製劑由抗PD-1抗體、緩衝劑、雙糖，表面活性劑組成，視需要包括水。

在本發明的一個實施方案中，所述穩定的藥物製劑包含：抗PD-1抗體，所述人抗體包含SEQ ID NO：7的重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：8的輕鏈胺基酸序列；和(i)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(ii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(iii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.4的20mM醋酸鹽緩衝液；或者(iv)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.0的20mM醋酸鹽緩衝液；或者(v)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.1mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的20mM醋酸鹽緩衝液；或者 (vi)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(vii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH4.8的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(viii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的30mM醋酸鹽緩衝液；或者(ix)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.6的10mM醋酸鹽緩衝液。

該可注射的藥物製劑可以是注射液或者進一步製備成凍乾粉形式。該凍乾粉可以由本領域的常規方法製備。

本發明還提供了一種經凍乾粉複溶後重建形成的注射液，可直接用於注射。

本發明的藥物製劑可以有效抑制抗體的聚集和脫醯胺作用，從而阻止其中抗體產品的降解，得到穩定性的注射組合物，在25℃條件下可以穩定性存放6個月，2-8℃條件下可以穩定存放12個月。並且，本發明的藥物組合物對於蛋白氧化降解具有保護作用，還能夠與玻璃、不鏽鋼容器相容，在這些容器中也能夠穩定存在。

本發明所述的藥物製劑，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，該疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤；最佳為非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌。

本發明所述的藥物製劑用於製備藥物的用途，該藥物用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，該疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤；最佳為非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌。

一種方法，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，該疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤；最佳為非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌，該方法包括施用本發明所述的藥物製劑。

[術語]

本發明涉及一種穩定的藥物液體製劑，其包含高濃度的針對PD-1的抗體。

本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳係人源化抗體。

術語抗體的“抗原結合片段”(或簡稱“抗體片段”)是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，PD-1)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈可變結構域的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤，然後從鼠雜交瘤細胞中複製可變區基因，再根據需要複製人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表現載體中，最後在真核系統或原核系統中表現嵌合抗體分子。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA資料庫或公開的參考文獻獲得。

術語“藥物製劑”表示這樣的製品：其處於允許活性成分的生物活性明確有效的形式，且其不含有對所述製劑要施用的受試者有毒的額外組分。

本文中結合根據本發明的製劑使用的術語“液體”表示，在大氣壓下在至少約2℃至約8℃的溫度為液體的製劑。

術語"穩定劑"表示藥學可接受的賦形劑，其在製造，儲存和應用過程中保護活性藥物成分和/或製劑免受化學和/或物理降解。由Cleland,J.L.,M.F.Powell，等人(1993)."The development of stable protein fomulations：a close look at protein aggregation,deamidation,and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4)：307-77,Wang,W.(1999).“Instability,stabilization,and formulation of liquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2)：129-88.,Wang,W.(2000)."Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int J Ph arm203(1-2)：1-60.和Chi,E.Y.,S.Krishnan，等人(2003)."Physical stability of proteins in aqueous solution：mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation." Pharm Res 20(9)：1325-36綜述了蛋白質藥物的化學和物理降解途徑。穩定劑包括但不限於如以下定義的糖，胺基酸，多元醇，表面活性劑，抗氧化劑，防腐劑，環糊精，聚乙二醇，例如PEG 3000、3350、4000、6000，白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)，鹽，例如氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣，螯合劑，例如 EDTA，如在後面定義的。在本發明中具體地使用的穩定劑選自糖。更具體地，所述穩定劑選自蔗糖、海藻糖、山梨糖醇。穩定劑可以以下述量存在於製劑中：30mg/ml至100mg/ml的量，較佳係60mg/ml至90mg/ml的量。更具體地，以90mg/ml的量使用蔗糖或海藻糖作為穩定劑。

“穩定的”製劑是這樣的製劑：其中所含的蛋白(例如抗體)在貯存後基本上保留它的物理和化學穩定性，且因而保留它的生物活性。

“穩定的液體藥物抗體製劑”是在冷藏溫度(2-8℃)至少12個月，特別是2年，並且更特別是3年觀察不到顯著改變的液體抗體製劑。穩定性的標準如下：當藉由粒徑排阻層析(SEC-HPLC)測量時，不多於10%，特別是5%的抗體單體被降解。此外，藉由視覺分析，溶液無色或清澈到輕微的乳白色。製劑的蛋白質濃度具有不多於+/-10%的改變。形成不多於10%，特別是5%的聚集。藉由本領域已知的方法比如UV光譜法，粒徑排阻層析(SEC-HPLC)，離子交換層析(IE-HPLC)，比濁法和肉眼檢查測量穩定性。

術語“程式性死亡1”、“程式性細胞死亡1”、“蛋白PD-1”、“PD-1”、“PD1”、“PDCD1”、“hPD-1”和“hPD-I”和互換使用，包括人PD-1的變體、同種型(isoform)、物種同系物，及與PD-1具有至少一個共同表位的類似物。完整的PD-1序列可以根據NCBI Reference Sequence：NM_005018.1查到。

術語“抗PD-1抗體”、“針對PD-1的抗體”和“針對PD-1蛋白的抗體”指能夠以足夠的親和力結合PD-1蛋白，使得所述抗體可在靶向PD-1蛋白中用作診斷劑和/或治療劑。本文中使用的術語“結合PD-1蛋白”是指，在BIAcore測定(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)中或在ELISA中抗體對PD-1蛋白的結合，其中將經純化的PD-1蛋白或PD-1蛋白CHO轉染子包被在微量滴定板上。

藥物製劑所含的針對PD-1蛋白的抗體的濃度是在1mg/ml至60mg/ml的範圍內，較佳是在20mg/ml至50mg/ml的範圍內，最佳係40mg/ml。

本文中使用的術語“表面活性劑”表示，用於保護蛋白製劑抵抗物理應力(如攪拌和剪切)的藥學上可接受的賦形劑。藥學上可接受的表面活性劑的例子包括：聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(吐溫)、聚氧乙烯烷基醚(例如在商標Brij^TM下銷售的那些)和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)。聚氧乙烯脫水山梨糖醇-脂肪酸酯的例子是聚山梨酯20(在商標吐溫20^TM下銷售)和聚山梨酯80(在商標吐溫80^TM下銷售)。

本文中使用的術語“緩衝液”表示穩定藥物製劑的pH的藥學上可接受的賦形劑。合適的緩衝液是本領域眾所周知的，且可以在文獻中找到。較佳的藥學上可接受的緩衝液包括但不限於：組胺酸緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液、精胺酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液或其混合物。特別感興趣的緩衝液包含檸檬酸鹽緩衝液或醋酸鹽緩衝液，其用本領域已知的酸或鹼進行pH調節。上述的緩衝液通常以約1mM至50mM、較佳係約10mM至30mM、最佳係10mM的量使用。獨立於使用的緩衝液，用本領域已知的酸或鹼(例如鹽酸、乙酸、磷酸、硫酸和檸檬酸、氫氧化鈉和氫氧化鉀)可以將pH調至在4.5-6.0範圍內的值，特別是調至在4.8-5.6範圍內的值，最特別地是調至pH5.2。

在某些實施方案中，本發明的穩定的抗PD-1抗體藥物製劑還可以包含抗氧化劑作為第二種穩定劑。“抗氧化劑”是阻止活性藥物成分的氧化的藥學上可接受的賦形劑。抗氧化劑包括、但不限於：螯合劑諸如EDTA、檸檬酸、抗壞血酸、丁羥甲苯(BHT)、丁羥茴香醚(BHA)、亞硫酸鈉、對胺基苯甲酸、谷胱甘肽、沒食子酸丙酯、半胱胺酸、甲硫胺酸、乙醇、苯甲醇和正乙醯基半胱胺酸。

本文中使用的術語“糖”表示單糖或寡糖。單糖是不可被酸水解的單體碳水化合物，包括單糖和它們的衍生物，例如胺基糖。單糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、去氧核糖、神經胺酸。寡糖是由超過一個經由糖苷鍵連接的單體糖單元組成的支鏈或直鏈碳水化合物。在寡糖內的單體糖單元可以是相同的或不同的。取決於單體糖單元的數目，寡糖是雙糖、三糖、四糖、五糖諸如此類。與多糖不同，單糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。具體地，糖選自蔗糖和海藻糖。

本文中使用的術語“胺基酸”表示，具有位於羧基的α-位元的胺基部分的藥學上可接受的有機分子。胺基酸的例子包括精胺酸、甘胺酸、鳥胺酸、賴胺酸、組胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸、甲硫胺酸、絲胺酸、脯胺酸。通常以下述量使用胺基酸：約5-500mM的量，特別是約5至約200mM的量，更特別是約100至約150mM的量。

術語“穩定劑”也包括冷凍保護劑。術語“冷凍保護劑”表示，在冷凍乾燥過程、隨後的貯存和重構中保護不穩定的活性成分(例如蛋白)抵抗失穩條件的藥學上可接受的賦形劑。冷凍保護劑包括、但不限於糖、多元醇(例如糖醇)和胺基酸。具體地，冷凍保護劑可以選自：糖類諸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神經胺酸，胺基糖類諸如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺(“葡甲胺”)，多元醇類諸如甘露醇和山梨糖醇，和胺基酸類諸如精胺酸和甘胺酸或其混合物。該冷凍保護劑較佳係雙糖。本發明驚奇地發現，雙糖對製劑的穩定性優於單糖，多元醇，胺基酸。

藥物製劑還可以含有張力劑。本文中使用的術語“張力劑”表示用於調節製劑的張力的藥學上可接受的張力劑。該製劑可以是低滲的、等滲的或高滲的。等滲性通常涉及溶液的相對滲透壓，經常是相對於人血清的滲透壓。根據本發明的製劑可以是低滲的、等滲的或高滲的，但是較佳地是等滲的。等滲製劑是液體或從固體形式(例如從低壓凍乾形式)重構的液體，且表示具有與它所對比的某種其他溶液(諸如生理學的鹽溶液和血清)相同的張力的溶液。合適的張力劑包括、但不限於氯化鈉、氯化鉀、甘油和選自以下的任意組分：胺基酸，糖，尤其是葡萄糖。通常以約5mM至約500mM的量使用張力劑。在穩定劑和張力劑內，存在一組可以以兩種方式起作用的化合物，即它們可以同時為穩定劑和張力劑。其例子可以在以下集合中找到：糖、胺基酸、多元醇、環糊精、聚二醇和鹽。可以同時為穩定劑和張力劑的糖的一個例子是海藻糖。

該藥物製劑還可以含有佐劑諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。藉由滅菌操作和藉由包含不同的抗細菌劑和抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等)，可以確保阻止微生物的存在。通常以約0.001至約2%(w/v)的量使用防腐劑。防腐劑包括、但不限於：乙醇、苯甲醇、苯酚、間甲酚、對氯-間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、氯化苄烷銨。

根據本發明的針對PD-1蛋白的抗體的穩定的藥物製劑可以用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，該疾病較佳為癌症；更佳為表現PD-L1的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤；最佳為非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌。

藉由靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)或任意其他胃腸外施用方式(如藥學領域中已知的那些方式)，可以施用根據本發明的穩定的抗PD-1抗體藥物製劑。

考慮到它們的高穩定性，根據本發明的藥物製劑可以在不需要管線過濾器(in-line filter)的情況下靜脈內施用，且因而比需要用管線過濾器才能施用的常規製劑遠遠更方便地操作。必須將管線過濾器諸如Sterifix®安裝在靜脈內藥物的輸注線中，以防止可能存在於靜脈內溶液或線中的任何顆粒、空氣或微生物的施用。5-20微米尺寸和更大的顆粒具有阻塞穿過肺毛細血管的血流的能力，這會導致併發症諸如肺栓塞。外來顆粒還可以在注射部位處造成靜脈炎，並且過濾器可以幫助降低靜脈炎的發病率。

要用於體內施用的穩定製劑必須是無菌的。這藉由穿過無菌過濾膜的過濾容易地實現。

藉由本領域已知的方法，例如超濾-透析過濾、透析、添加和混合、冷凍乾燥、重構及其組合，可以製備根據本發明的穩定的抗PD-1抗體藥物製劑。可以在下文中找到根據本發明的製劑的製備例子。

根據本發明的穩定的抗PD-1抗體藥物製劑還可以呈低壓凍乾形式或呈從低壓凍乾形式重構的液體形式。藉由本領域已知的冷凍乾燥方法，製備“低壓凍乾形式”。所述凍乾粉劑經常具有約0.1-5%(w/w)的殘餘含水量，且作為粉末或物理上穩定的餅狀物存在。藉由在加入重構介質以後的快速溶解，可以從凍乾粉劑得到“重構形式”。合適的重構介質包括、但不限於：注射用水(WFI)、抑制細菌注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%(w/v)葡萄糖)、含有表面活性劑的溶液(例如0.01%(w/v)聚山梨酯20)和pH緩衝溶液(例如醋酸鹽緩衝溶液)。

第1圖顯示緩衝體系對於抗PD-1抗體熱穩定性的影響。

第2圖顯示糖對於抗PD-1抗體熱穩定性的影響。

藉由以下實施例進一步詳細說明本發明。這些實施例僅用於說明性目的，而並不用於限制本發明的範圍。

本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

[實施例]

本發明製備技術如下：第一步：抗PD-1抗體原液過濾前中控取樣檢測抗體蛋白濃度。中控合格後，將原液過0.22μm PVDF濾芯，收集濾液。該PD-1抗體具有SEQ ID NO：7的重鏈和SEQ ID NO：8的輕鏈胺基酸序列，其按照WO2015/085847公開的方法製備。

第二步：調節裝量至5.3ml，將濾液灌裝於20ml西林瓶中，半加塞，分別於灌裝開始、灌裝中間、灌裝結束時取樣中控檢測裝量差異。

第三步：將灌裝加塞後的藥液裝入凍乾箱中，按以下凍乾技術凍乾。凍乾程式結束後，真空加塞。

第四步：開啟軋蓋機，加鋁蓋，進行軋蓋。

第五步：目檢，確認產品無塌陷、裝量不准等缺陷。列印、粘貼西林瓶標籤；打印紙盒標籤，折疊紙盒，裝盒，貼紙盒標籤。

中控蛋白濃度的測定用紫外分光光度計檢測280nm處吸收峰(生產商：Thermo，型號Nanodrop 2000)。

0.22μm PVDF濾芯採用密理博Millipak-100。

灌裝機為楚天科技KGS8/2-X2直線式灌裝加塞機。

中控裝量差異檢測使用電子天平稱量(生產商：Sartorius，型號BSA423S)。

冷凍乾燥使用東富龍Lyo-B(SIP.CIP)真空冷凍乾燥機。

軋蓋機用山東蓬萊DZG-130型刀式自動軋蓋機。

目檢外觀採用天津精拓YB-2A澄明度檢測儀。

實施例中HPLC(SEC和IEC)的檢測使用安捷倫1200DAD高壓液相層析儀(TSK gel SuperSW mAb HR 300×7.8mm層析柱和ProPac^TM WCX-10 BioLC ^TM,250×4mm層析柱)。

蛋白熱變性溫度(Tm)的測定使用GE公司MicroCal VP-Capillary DSC差示掃描熱量計。

DLS(Dynamic Light Scattering)平均粒徑的測定用馬爾文Zetasizer Nano ZS奈米粒度電位儀。

實施例1

將抗PD-1抗體分別配製為pH 4.8-5.6的含10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，0.2mg/mL聚山梨酯20的製劑，抗體蛋白濃度為40mg/mL。過濾每種製劑並以5mL/瓶填充入20mL中性硼矽玻璃管製注射劑瓶中進行凍乾，所述玻璃瓶用注射液用冷凍乾燥無菌粉末用鹵化丁基橡膠塞封口。將凍乾品保存於25℃和40℃進行穩定性分析。結果顯示抗PD-1抗體在pH 4.8-5.6均非常穩定。

實施例2

在下列緩衝液中，配置蛋白濃度為1mg/mL的抗PD-1抗體製劑：1)緩衝液1：10mM醋酸(鈉)，pH 5.0；2)緩衝液2：10mM磷酸氫二鈉(檸檬酸)，pH 5.0；3)緩衝液3：10mM琥珀酸(鈉)，pH 5.0；4)緩衝液4：10mM檸檬酸(鈉)，pH 5.0。

用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)測量抗PD-1抗體在每種製劑中的熱穩定性。藥品的熱變性中點溫度(Tm)分析顯示，如第1圖所示，抗PD-1抗體在醋酸緩衝鹽體系中的穩定性明顯優於琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和磷酸氫二鈉、檸檬酸鹽緩衝體系。

實施例3

使用DSC技術篩選PD-1抗體製劑蛋白濃度為1mg/mL，含不同糖及濃度的處方：1)緩衝液1：10mM醋酸(鈉)，90mg/mL蔗糖，pH 5.2；2)緩衝液2：10mM醋酸(鈉)，30mg/mL α,α-二水合海藻糖，pH 5.2；3)緩衝液3：10mM醋酸(鈉)，60mg/mL α,α-二水合海藻糖，pH 5.2；4)緩衝液4：10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，pH 5.2；參照第2圖，Tm值表明，當α,α-二水合海藻糖濃度達到90mg/mL時抗PD-1抗體的熱穩定性最好。

實施例4

在含下列不同濃度表面活性劑的緩衝液中，製備PD-1抗體蛋白濃度為40mg/mL，含10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，pH 5.2的抗PD-1抗體製劑：1)不含表面活性劑；2)0.1mg/mL聚山梨酯20；3)0.2mg/mL聚山梨酯20；；4)0.3mg/mL聚山梨酯20；5)0.4mg/mL聚山梨酯20；6)0.2mg/mL聚山梨酯80；將每種製劑填充入以5mL/瓶填充入20mL西林瓶中，並用覆膜膠塞封口。藥品置於25℃恆溫搖床上，以500rpm的速度振搖。穩定性結果表明，0.1-0.4mg/mL聚山梨酯20，有效防止了抗PD-1抗體的聚集和團聚大顆粒物的形成。

實施例5

抗PD-1抗體以40mg/mL配製在10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，0.2mg/mL聚山梨酯20，pH 5.2中。將抗體以5mL/瓶填充入20mL西林瓶中凍乾，並用凍乾膠塞封口。凍乾後的樣品分別置於4500±500Lx強光照射或40±2℃高溫放置10天，或4℃~40℃低溫循環3次，或-20℃~40℃凍融循環3次。藉由蛋白含量，純度與活性檢測評估藥品穩定性，結果證明抗PD-1抗體在該處方中是比較穩定的，經強光、高溫或低溫、凍融循環後仍能夠符要求。

實施例6

抗PD-1抗體以40mg/mL配製在10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，0.2mg/mL聚山梨酯20，pH 5.2中。將製劑分別填充在玻璃瓶和316L不鏽鋼罐中，室溫放置24小時。蛋白含量和純度分析表明，抗PD-1抗體在24小時內是穩定的。該製劑與316L不鏽鋼罐可以相容。

實施例7

抗PD-1抗體以40mg/mL配製在10mM醋酸(鈉)，90mg/mL α,α-二水合海藻糖，0.2mg/mL聚山梨酯20，pH 5.2中。將抗體以5mL/瓶填充入20mL西林瓶中，分別以-15℃、-10℃和-5℃的一次乾燥溫度進行凍乾，並用凍乾膠塞封口。將凍乾品保存於25℃進行穩定性分析。結果表明，-10℃~-5℃為凍乾技術最佳的一次乾燥溫度。

實施例8 其他製劑配方

本發明提供的穩定的藥物製劑包含：抗PD-1抗體(SEQ ID NO：7的重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO：8的輕鏈胺基酸序列)；和視需要自以下的穩定緩衝液的組合：(i)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(ii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(iii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.4的20mM醋酸鹽緩衝液；(iv)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.0的20mM醋酸鹽緩衝液；(v)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.1mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的20mM醋酸鹽緩衝液；(vi)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(vii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH4.8的10mM醋酸鹽緩衝液；(viii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的30mM醋酸鹽緩衝液；或者(ix)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.6的10mM醋酸鹽緩衝液。

以上實施例中，抗PD-1抗體的濃度在1mg/ml至60mg/ml的範圍內，較佳係20-50mg/ml，更佳係35-45mg/ml，最佳係40mg/ml。可實施的方案可選自，但不限於以下組合：(1)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(2)抗PD-1抗體1mg/ml，30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH4.5的10mM醋酸鹽緩衝液；(3)抗PD-1抗體20mg/ml，60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH4.8的1mM醋酸鹽緩衝液；(4)抗PD-1抗體35mg/ml，85mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.6的2mM醋酸鹽緩衝液；(5)抗PD-1抗體45mg/ml，95mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH6.0的5mM醋酸鹽緩衝液；(6)抗PD-1抗體50mg/ml，100mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的15mM醋酸鹽緩衝液；(7)抗PD-1抗體60mg/ml，90mg/ml蔗糖，0.2mg/ml的聚山梨酯400，和pH5.2的30mM醋酸鹽緩衝液；(8)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml乳糖，0.2mg/ml的聚山梨酯60，和pH4.5的50mM醋酸鹽緩衝液；(9)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯80，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(10)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml麥芽糖，0.2mg/ml的聚氧乙烯氫化蓖麻油，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(11)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.01mg/ml的、甘油脂肪酸酯，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(12)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.05mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(13)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(14)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.5mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；(15)抗PD-1抗體40mg/ml，90mg/ml α,α-二水合海藻糖，1mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 一種抗PD-1抗體製劑及其在醫藥上的應用

<130> 760045CPCT

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM HCDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM HCDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM HCDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM LCDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM LCDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM LCDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM重鏈

<400> 7

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1 FORM輕鏈

<400> 8

由於本案的圖為試驗數據，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims

一種穩定的抗PD-1抗體藥物製劑，包含抗PD-1抗體及其抗原結合片段和緩衝劑，其中該抗PD-1抗體具有SEQ ID NO：7的重鏈和SEQ ID NO：8的輕鏈胺基酸序列，該製劑包含：濃度在1mg/ml至60mg/ml的範圍內的抗PD-1抗體；選自醋酸鹽的濃度為1至50mM的緩衝劑；選自α,α-二水合海藻糖的濃度為30至120mg/ml的穩定劑；選自聚山梨酯20的濃度為0.01至1mg/ml的表面活性劑；製劑的pH值範圍是4.5至6.0。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該抗PD-1抗體的濃度在20mg/ml至50mg/ml的範圍內。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該抗PD-1抗體的濃度在35mg/ml至45mg/ml的範圍內。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該抗PD-1抗體的濃度係40mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑係醋酸鈉緩衝劑。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑的濃度為2至30mM。
如申請專利範圍第6項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑的濃度為5至15mM。
如申請專利範圍第7項所述的藥物製劑，其中該緩衝劑的濃度為10mM。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該製劑的pH值範圍是4.8至5.6。
如申請專利範圍第9項所述的藥物製劑，其中該製劑的pH值是5.2。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該穩定劑的濃度為30至90mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該穩定劑的濃度為60至90mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該穩定劑的濃度為60至100mg/ml。
如申請專利範圍第13項所述的藥物製劑，其中該穩定劑的濃度為85至95mg/ml。
如申請專利範圍第14項所述的藥物製劑，其中該穩定劑的濃度為90mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其中該表面活性劑濃度為0.05至0.5mg/ml。
如申請專利範圍第16項所述的藥物製劑，其中該表面活性劑濃度為0.1至0.4mg/ml。
如申請專利範圍第17項所述的藥物製劑，其中該表面活性劑濃度為0.2mg/ml。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，其包含：濃度為40mg/ml的抗PD-1抗體；濃度為10mM的醋酸鈉緩衝劑；濃度為90mg/ml的α,α-二水合海藻糖；濃度為0.1mg/ml至0.4mg/ml的聚山梨酯20；製劑的pH值是5.2。
如申請專利範圍第1所述的藥物製劑，其包含：抗PD-1抗體；和(i)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(ii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(iii)90mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.4的20mM醋酸鹽緩衝液；或者(iv)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.0的20mM醋酸鹽緩衝液；或者(v)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.1mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的20mM醋酸鹽緩衝液；或者(vi)60mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(vii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH4.8的10mM醋酸鹽緩衝液；或者(viii)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.2mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.2的30mM醋酸鹽緩衝液；或者(ix)30mg/ml α,α-二水合海藻糖，0.4mg/ml的聚山梨酯20，和pH5.6的10mM醋酸鹽緩衝液。
如申請專利範圍第1項所述的藥物製劑，該藥物製劑是一種可注射的藥物製劑，其還含有注射用水。
一種由申請專利範圍第21項所述的藥物製劑製得的凍乾粉。
如申請專利範圍第22項所述的凍乾粉，其凍乾技術最佳的乾燥溫度為-10℃至-5℃。
一種由申請專利範圍第22項所述的凍乾粉複溶後得到的注射液。
如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的藥物製劑、如申請專利範圍第22或23項所述的凍乾粉或如申請專利範圍第24項所述的注射液，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症。
如申請專利範圍第25項所述的藥物製劑、凍乾粉或注射液，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，其中該疾病為癌症。
如申請專利範圍第25項所述的藥物製劑、凍乾粉或注射液，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，其中該疾病為表現PD-L1的癌症。
如申請專利範圍第26項所述的藥物製劑、凍乾粉或注射液，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，其中該疾病為癌症，其中該癌症係選自乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤。
如申請專利範圍第26項所述的藥物製劑、凍乾粉或注射液，其用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症，其中該疾病為癌症，其中該癌症係選自非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌。
一種如申請專利範圍第1至21項中的任一項所述的藥物製劑、如申請專利範圍第22或23項所述的凍乾粉或如申請專利範圍第24項所述的注射液的用途，該藥物製劑、凍乾粉或注射液用於預防或治療PD-1介導的疾病或病症。
如申請專利範圍第30項所述的用途，其中該疾病為癌症。
如申請專利範圍第30項所述的用途，其中該疾病為表現PD-L1的癌症。
如申請專利範圍第31項所述的用途，其中該癌症係選自乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤。
如申請專利範圍第31項所述的用途，其中該癌症係選自非小細胞肺癌、黑素瘤和腎癌。