CN113853387B - 能结合胸腺基质淋巴细胞生成素的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

能结合胸腺基质淋巴细胞生成素的抗体及其应用。一种抗TSLP抗体，包含所述抗TSLP抗体轻链和重链可变区的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体及其抗原结合片段，或其可药用盐或溶剂化合物，以及其作为治疗哮喘药物的用途，尤其在制备用于治疗TSLP阳性疾病或病症的药物中的用途。

Description

能结合胸腺基质淋巴细胞生成素的抗体及其应用
技术领域
本公开涉及抗体药物领域。具体地本公开涉及抗TSLP抗体药物以及其应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
哮喘是严重的气道慢性炎症疾病，全球约有3.34亿哮喘病人，中国有约3千万哮喘患者，且死亡率远高于发达国家。随着环境恶化和空气污染加剧，可能会有更多人罹患此病，严重危害人类的生命健康。
胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP)是响应促炎症刺激而产生的上皮细胞衍生的细胞因子，主要通过其对树突细胞和肥大细胞的活性来促进过敏性炎症反应。TSLP是一种类白细胞介素7(IL-7)细胞因子，最早从小鼠的胸腺基质细胞条件培养基中发现。TSLP主要在肺、皮肤和肠道上皮细胞中表达。TSLP由4个α-螺旋以及AB和CD两个环组成，分子内有三对由六个半胱氨酸组成的二硫键，有两个N糖基化位点，分子量约为15-20kD。TSLP的受体是个复合物，包括两部分，一部分为TSLPR，另一部分为IL7Rα。TSLP先与TSLPR以相对较低的亲和力结合，然后以高亲和力招募IL7Rα的结合，最终以stat5等信号通路的激活，导致DC的成熟和T细胞的分化。
骨髓源性树突状细胞(mDC)是TSLP最主要的效应细胞，TSLP作用于未成熟的mDC，mDC分泌细胞因子IL-8，eotaxin-2，TARC和MDC，同时高表达OX40L，在没有IL-12的前提下，OX40L与天然CD4+T细胞结合，使其分化成Th2细胞，进而Th2细胞分泌IL-5、IL-4、IL-9，IL-9和TNF等Th2细胞因子，诱导机体Th2炎症反应。另外，TSLP还可以诱导DC细胞产生细胞因子IL-8，进而招募嗜中性粒细胞，导致嗜中性粒细胞天然免疫炎症。TSLP还可以诱导DC产生eotaxin-2，eotaxin-2招募嗜酸性粒细胞，和IL5一起作用，使机体迅速进入嗜酸性粒细胞浸润的炎症状态。TSLP也作用于肥大细胞、自然杀伤细胞，通过诱导产生IL-4、IL-6、IgE等来介导天然炎症。综上，TSLP可同时导致天然炎症和Th2炎症，进而使组织黏液增多，气道重塑导致气管狭窄，细胞纤维化严重，进而逐步演变成哮喘、过敏性皮炎和过敏性鼻炎等三大过敏性疾病。因此，阻断TSLP对治疗哮喘、过敏性皮炎等疾病是一个潜在的有效策略。
目前，WO2008155365、WO2009035577、WO2011056772、WO2016142426、WO2017004149公开了抗TSLP的抗体，但并没有相应的抗体上市，因此，有必要继续开发有效的治疗TSLP相关疾病的药物。
发明内容
本公开提供一种抗TSLP抗体。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：
i)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示的LCDR1、LCDR2和如SEQ ID NO：48或55所示的LCDR3；
其中，所述的SEQ ID NO：47的序列为：EDYDYDGYAMDX1，SEQ ID NO：48的序列为QQWSSX2RT，SEQ ID NO：55的序列为：QQSDX3X4RX5，其中X1为H或Y，X2为N或D，X3为N或S，X4为V或G，X5为G或E；或
ii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中，所述的SEQ ID NO：76的序列为：RASESVDX6SGLSFMH，其中，X6选自N、S或Q；或
iii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中，所述的SEQ ID NO：96的序列为：VIDPGX7X8DTNYNE，所述的SEQ ID NO：118的序列为：X9VX10X11X12X13T，其中所述的X7选自N，Q和V，X8为G或V；X9为Y或E，X10选自S、D和E，X11选自N，Q，D和E，X12选自H，Y，D和E，X13为E或Y；或
iv)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iv)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
v)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
vi)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
vii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
viii)重链可变区包含如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28所示的HCDR1和HCDR3，以及如SEQ ID NO：27、93、94或95所示的HCDR2，其轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：31所示的LCDR1和LCDR3，以及如SEQ ID NO：30、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117所示的LCDR2。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
a)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
b)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：93和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
c)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：94和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
d)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
e)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
f)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
g)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
h)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
i)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
j)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
k)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
l)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
m)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
n)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：31所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体包含来源自人抗体的框架区，或所述抗TSLP抗体包含选自以下(a)、(b)、(c)或(d)所述的轻链可变区和/或重链可变区：
a)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的HCDR1和HCDR2，以及如SEQ ID NO：16或45所示的HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自38K、48I、67A、69L、71V和73K中的一个或更多个；和/或轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示的LCDR1和LCDR2，以及如SEQ ID NO：19、46、53或54所示的LCDR3，且其框架区包含至多10个氨基酸回复突变，优选地，所述回复突变选自46P、47W、58V、70S和71Y中的一个或更多个；
b)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自2A、27F、38K、39H、48I、67A、69L、71V和76R中的一个或更多个；和/或轻链可变区包含分别如SEQID NO：24、SEQ ID NO：25所示的LCDR2和LCDR3，以及如SEQ ID NO：23、70或71所示的LCDR1，且其框架区包含至多10个氨基酸回复突变，优选地，所述回复突变1D、4L、43P、48L和58I中的一个或更多个；
c)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28所示的HCDR1和HCDR3，以及如SEQ ID NO：27、93、94或95所示的HCDR2，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自27Y、28A、38K、48I、66K、67A、69L、80I和82b R中的一个或更多个；和/或轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31所示的LCDR1和LCDR3，以及如SEQ IDNO：30、108、109、110、111、112、113、114、115、116或117所示的LCDR2，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自1S、43S、67Y和73F中的一个或更多个；或
d)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自38K、48I、66K、67A、69L、71V、73K和78A中的一个或更多个；和/或轻链可变区包含分别如SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变，优选地，所述回复突变选自43S、45Q、48V、66V和70Q中的一个或更多个。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：6、42、43、44或50所示的重链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，和所述轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：7、38、39、40、41、49、51或52所示的轻链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或
ii)所述重链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：8、62、63、64、65、66、67、68或69所示的重链可变区有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，和所述轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：9、56、57、58、59、60、61、72、73、74或75所示的轻链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或
iii)所述重链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：10、85、86、87、88、89、90、91、92或97所示的重链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，和所述轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：11、77、78、79、80、81、82、83、84、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或119所示的轻链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；或
iv)所述重链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：12、126、127、128、129、130、131或132所示的重链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，和所述轻链可变区与氨基酸序列SEQ ID NO：13、120、121、122、123、124或125所示的重链可变区具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体为人源化抗体，所述人源化抗体包含来源自人抗体的框架区或其框架区变体，所述框架区变体为在人抗体的轻链框架区和/或重链框架区上分别具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸回复突变。
在一些实施方案中，如前所述的抗TSLP抗体，其中所述框架区变体包含选自以下(a)、(b)、(c)或(d)所述的回复突变：
a)在如SEQ ID NO：38、49、51或52所示的轻链可变区的框架区中包含选自46P、47W、58V、70S和71Y中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或在如SEQ ID NO：42或50所示的重链可变区的框架区中包含选自38K、48I、67A、69L、71V和73K中的一个或更多个氨基酸回复突变；
b)在如SEQ ID NO：56、59、72、73、74或75所示轻链可变区的框架区中包含选自1D、4L、43P、48L和58I中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或在如SEQ ID NO：62所示的重链可变区的框架区中包含选自2A、27F、38K、39H、48I、67A、69L、71V和76R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
c)在如SEQ ID NO：77、81、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或119所示的轻链可变区的框架区中包含选自1S、43S、67Y和73F中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或在如SEQ ID NO：85、90、91、92或97所示的重链可变区的框架区中包含选自27Y、28A、38K、48I、66K、67A、69L、80I和82b R中的一个或更多个氨基酸回复突变；
d)在如SEQ ID NO：120所示的轻链可变区的框架区中包含选自43S、45Q、48V、66V和70Q中的一个或更多个氨基酸回复突变，和/或如SEQ ID NO：126所示的重链可变区的框架区中包含选自38K、48I、66K、67A、69L、71V、73K和78A中的一个或更多个氨基酸回复突变。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6、42、43、44或50所示，和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7、38、39、40、41、49、51或52所示；或
ii)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8、62、63、64、65、66、67、68、或69所示，和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9、56、57、58、59、60、61、72、73、74或75所示；或
iii)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：10、85、86、87、88、89、90、91、92或97所示，和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11、77、78、79、80、81、82、83、84、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107或119中所示；或
iv)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12、126、127、128、129、130、131或132中所示，和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13、120、121、122、123、124或125中所示。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
(a)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：6所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：7所示；
(b)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：42、43或44所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：39、40或41示；
(c)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：43所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：38示；
(d)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：50所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：49、51或52示；
(e)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：8所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：9所示；
(f)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：62、63、64或65所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：56、57或58所示；
(g)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：64、66、67、68或69所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：59、60或61所示；
(h)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：64所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：72或73所示；
(i)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：69所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：74所示；
(j)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：10所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：11所示；
(k)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：85所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：77、78、102或104所示；
(l)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：86或88所示和所述轻链可变区序列如SEQID NO：77或78所示；
(m)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：87所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：77、78、79、81、82、83、84、98、99、100、101、103、105、106或107所示；
(n)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：89所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：79、81、82、83或84所示；
(o)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：90、91或92所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：78所示；
(p)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：97所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：119所示；
(q)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：12所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：13所示；
(r)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：127、128、129、130、131或132所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：120、121、123、124或125所示；或
(s)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：132所示和所述轻链可变区序列如SEQ IDNO：125所示。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述抗体的轻链可变区和重链可变区组合如下所示：
表1.mAb3人源化抗体的轻链和重链可变区的组合
抗体 VH(SEQ ID NO) VL(SEQ ID NO)
hu3-01 42 39
hu3-02 42 40
hu3-03 42 41
hu3-04 43 38
hu3-05 43 39
hu3-06 43 40
hu3-07 43 41
hu3-08 44 39
hu3-09 44 40
hu3-10 44 41
hu3-11 50 49
hu3-12 50 51
hu3-13 50 52
表2.mAb119人源化抗体的轻链和重链可变区的组合
Figure GPA0000313351660000091
Figure GPA0000313351660000101
表3.mAb179人源化抗体的轻链和重链可变区的组合
Figure GPA0000313351660000102
Figure GPA0000313351660000111
表4.mAb199人源化抗体的轻链和重链可变区的组合
Figure GPA0000313351660000112
Figure GPA0000313351660000121
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述抗体进一步包含抗体恒定区；优选地，所述抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述抗体恒定区的轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体；更优选地，所述抗体包含序列如SEQ ID NO：133所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO：134所示的轻链恒定区。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述的抗体包含如下所示的重链和轻链：
(a)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：135所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：136所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
(b)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：137所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：138所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；
(c)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：139所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：140所示或与其具有至少90％序列同一性；或
(d)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：141所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：142所示或与其具有至少90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一些实施方案中，如前所述抗TSLP抗体，其中所述的抗体包含如下所示的重链和轻链：
(a)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：135所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：136所示；
(b)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：137所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：138所示；
(c)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：139所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：140所示；或
(d)重链氨基酸序列如SEQ ID NO：141所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：142所示。
在一些实施方案中，所述抗体与如前所述的抗TSLP抗体或其抗原结合片段竞争性结合人TSLP。
本公开的另一方面还提供一种核酸分子，其编码如前所述的抗TSLP抗体。
本公开的另一方面还提供一种表达载体，其包含如前所述的核酸分子。
本公开的另一方面还提供一种宿主细胞，其包含如如前所述的核酸分子或如前所述的表达载体，优选所述细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫动物细胞或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，本公开提供一种制备如前所述的TSLP抗体的方法。
在一些实施方案中，本公开提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据如前所述的抗TSLP抗体，或根据如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主细胞，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂，优选地，所述治疗有效量为单位剂量的组合物中含有0.1-3000mg或1-1000mg如前所述的抗TSLP抗体。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于体外或离体免疫检测或测定TSLP的方法，所述方法包括使用如前所述的抗TSLP抗体的步骤。
在一些实施方案中，本公开提供如前所述的抗TSLP抗体在制备免疫检测人TSLP的试剂中的用途。
在一些实施方案中，本公开提供一种用于免疫检测或测定TSLP的如前所述的抗TSLP抗体。
在一些实施方案中，本公开提供一种试剂盒，其包含根据如前所述的抗TSLP抗体。
在一些实施方案中，本公开提供如前所述的抗TSLP抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主细胞或如前所述的药物组合物在制备用于治疗与TSLP相关的疾病的药物中的用途；其中所述的与TSLP相关的疾病包括但不限于哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、变应性鼻炎、过敏性鼻窦炎、荨麻疹、内塞顿综合征、嗜酸性粒细胞性食管炎、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性真菌鼻窦炎、慢性瘙痒、癌症、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、全身性硬化、多发性硬化症、瘢痕瘤、溃疡性结肠炎、鼻息肉病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性粒细胞性支气管炎、腹腔病、Churg-Strauss综合征、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴随多血管炎、炎性肠病、硬皮病、间质性肺病、B型或C型慢性肝炎引发的纤维化、辐射诱发的纤维化和伤口愈合引发的纤维化。
在一些实施方案中，本公开提供一种治疗与TSLP相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如前所述的抗TSLP抗体，或如前所述的核酸分子，或如前所述的宿主细胞或如前所述的药物组合物；哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、变应性鼻炎、过敏性鼻窦炎、荨麻疹、内塞顿综合征、嗜酸性粒细胞性食管炎、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性真菌鼻窦炎、慢性瘙痒、癌症、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、全身性硬化、多发性硬化症、瘢痕瘤、溃疡性结肠炎、鼻息肉病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性粒细胞性支气管炎、腹腔病、Churg-Strauss综合征、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴随多血管炎、炎性肠病、硬皮病、间质性肺病、B型或C型慢性肝炎引发的纤维化、辐射诱发的纤维化和伤口愈合引发的纤维化。
在一些实施方案中，本公开提供一种用作药物的抗TSLP抗体，其中所述的抗TSLP抗体用于治疗与TSLP相关的疾病，其中所述的TSLP相关疾病包括但不限于哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、变应性鼻炎、过敏性鼻窦炎、荨麻疹、内塞顿综合征、嗜酸性粒细胞性食管炎、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性真菌鼻窦炎、慢性瘙痒、癌症、乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、全身性硬化、多发性硬化症、瘢痕瘤、溃疡性结肠炎、鼻息肉病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性粒细胞性支气管炎、腹腔病、Churg-Strauss综合征、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴随多血管炎、炎性肠病、硬皮病、间质性肺病、B型或C型慢性肝炎引发的纤维化、辐射诱发的纤维化和伤口愈合引发的纤维化。
附图说明
图1：抗体阻断TSLP与TSLP受体结合活性的结果。
图2：抗体阻断TSLP与细胞表面TSLP受体结合活性的结果。
图3：抗体抑制TSLP诱导的BaF3细胞的增殖活性。
图4A为抗体抑制TSLP诱导的趋化因子TARC产生的活性；图4B为抗体抑制TSLP诱导的趋化因子OPG产生的活性。
图5A为抗体抑制Th2细胞因子IL-13产生的活性；图5B为抗体抑制Th2细胞因子IL-4产生的活性；图5C为抗体抑制Th2细胞因子TNF-α产生的活性；图5D为抗体抑制Th2细胞因子IL-5产生的活性。
具体实施方式
发明详述
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin，TSLP)”是四α-螺旋束I型细胞因子，也是响应促炎症刺激而产生的上皮细胞衍生的细胞因子，与白细胞介素-7(IL-7)密切相关，其通过刺激树突细胞(DC)起始变态反应，是调节人体免疫反应的重要因子。术语“TSLP”包括TSLP的变体、同种型、同系物、直系同源物和旁系同源物。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，通常完整抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的针对人TSLP的单克隆抗体。制备时用TSLP抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源抗TSLP抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的TSLP嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的TSLP嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A和/或L235A突变，和/或S228P突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由酵母菌展示对CDR进行亲和力成熟突变后的人源化抗体。
CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基的改变而导致产生的抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可能是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查动物单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚类共有序列或具有高相似性百分数的动物抗体序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
在本公开一个的实施方案中，所述的抗体或其抗原结合片段，可进一步包含人源或鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含人源或鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区；优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(例如L234A/L235A突变、S228P突变、YTE突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。
本公开中所述人抗体重链恒定区和人抗体轻链恒定区的“常规变体”是指现有技术已公开的来源于人的不改变抗体可变区结构和功能的重链恒定区或轻链恒定区的变体，示例性变体包括对重链恒定区进行定点改造和氨基酸替换的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定区变体，具体替换如现有技术已知的YTE突变，L234A和/或L235A突变，S228P突变，和/或获得knob-into-hole结构的突变(使得抗体重链具有knob-Fc和hole-Fc组合)，这些突变已被证实使得抗体具有新的性能，但不改变抗体可变区的功能。
“人抗体”(HuMAb)、“人源抗体”、“全人抗体”、“完全人抗体”可以互换使用，可以是源于人的抗体或者是从一种转基因生物体中获得的抗体，该转基因生物体经“改造”以响应于抗原刺激而产生特异性人抗体，并且可以通过本领域已知的任何方法产生。在某些技术中，将人重链和轻链基因座的元素元件引入到源于胚胎干细胞系的生物体的细胞株中，这些细胞系中的内源性重链和轻链基因座被靶向破坏。转基因生物可以合成对人抗原特异的人抗体，并且该生物可以用于产生人抗体-分泌杂交瘤。人抗体还可以是一种抗体，其中重链和轻链是由源于一个或更多个人DNA来源的核苷酸序列编码的。完全人抗体还可以通过基因或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，或者由体外活化的B细胞构建，所有的这些都是本领域已知的。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、“完全抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，与下文定义的抗原结合片段相区分。该术语特别指轻链和重链包含恒定区的抗体。本公开“抗体”包含“全长抗体”及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本公开的全长抗体包括由以下表1-表4中轻重链可变区组合中的轻链可变区与轻链恒定区连接和重链可变区与重链恒定区连接后所形成的全长抗体。本领域技术人员可以根据实际需要选择不同的抗体来源的轻链恒定区、重链恒定区，例如人抗体来源的轻链恒定区和重链恒定区。
术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，TSLP)的能力的一个或更多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)dsFv，由VH和VL经链间二硫键形成的稳定的抗原结合片段；(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的双抗体、双特异性抗体和多特异性抗体。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且使用与完整抗体的方式相同的方式进行筛选。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
Fab是通过用木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100，000并具有抗原结合活性，并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50，000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别TSLP并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域，VH)和抗体轻链可变结构域(或区域，VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
双抗体是其中scFv或Fab被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
双特异性抗体和多特异性抗体是指能同时结合两个或多个抗原或抗原决定簇的抗体，其中包含能结合TSLP的scFv或Fab片段。
本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人TSLP并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开的全长抗体或抗原结合片段可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人TSLP并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体的编码cDNA，构建编码全长抗体或抗原结合片段的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达。
术语“氨基酸差异”或“氨基酸突变”是指相较于原蛋白质或多肽，变体蛋白质或多肽存在氨基酸的改变或突变，包括在原蛋白质或多肽的基础上发生1个、2个、3个或更多个氨基酸的插入、缺失或替换。
术语“抗体框架”或“FR区”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“互补决定区”、“CDR”或“高变区”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各种公知方案中的任何一种来确定CDR的氨基酸序列边界，包括“Kabat”编号规则(参见Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”编号规则(参见Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)编号规则(Leffanc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Leffanc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，对于经典格式，遵循Kabat规则，所述重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia规则，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia两者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)构成。遵循IMGT规则，VH中的CDR氨基酸残基编号大致为26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR氨基酸残基编号大致为27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT规则，抗体的CDR区可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，TSLP分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M或更小的亲和力(KD)结合。
术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M或10-9M的解离平衡常数(KD)结合TSLP，例如，在本公开中抗体与细胞表面抗原的亲和力采用FACS或Biacore法测定KD值。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如TSLP抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常所述测定法涉及使用未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的结合在固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，优选是双链DNA或单链mRNA或修饰的mRNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
氨基酸序列“同一性”指在比对氨基酸序列及必要时引入间隙，以达成最大序列同一性百分比，且不将任何保守性取代视为序列同一性的一部分，第一序列中与第二序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比的目的，比对可以通过属于本领域技术的范围内的多种方式来实现，例如使用公开可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适用于测量比对的参数，包括在所比较的序列全长上达成最大比对所需的任何算法。
术语“表达载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人TSLP或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。本公开所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或更多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、293细胞和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人TSLP特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
表5.示例性氨基酸保守取代
Figure GPA0000313351660000221
Figure GPA0000313351660000231
“有效量”或“有效剂量”指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或更多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。通常，当比对两个序列时进行比较以给出最大百分比同源性。例如，可以通过BLAST算法执行比较，其中选择算法的参数以在各个参考序列的整个长度上给出各个序列之间的最大匹配。以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法(BLAST ALGORITHMS)：Altschul，S.F.等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish，W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden，T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.等人，(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402；Zhang，J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656。其他如NCBI BLAST提供的常规BLAST算法也为本领域技术人员所熟知。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“分离的”指纯化状态，并且在这种情况下意味着在指定的分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并不意图指完全不存在这些材料或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以显著干扰如本文所述的化合物的实验或治疗用途的量存在。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的示例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
此外，本公开包括用于治疗与TSLP相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的抗TSLP抗体或其抗原结合片段作为活性成分。
本公开中与TSLP相关的疾病没有限制，只要它是与TSLP相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类TSLP，然后阻遏TSLP与其受体结合，或杀伤过表达TSLP的细胞。
此外，本公开涉及用于免疫检测或测定目标抗原(例如TSLP)的方法、用于免疫检测或测定目标抗原(例如TSLP)的试剂、用于免疫检测或测定表达目标抗原(例如TSLP)的细胞的方法和用于诊断与目标抗原(例如TSLP)阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别目标抗原(例如人TSLP)并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定目标抗原(例如TSLP)的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与TSLP相关的疾病可以通过用本公开的抗体或抗体片段检测或测定表达TSLP的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定目标抗原(例如TSLP)的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达目标抗原(例如TSLP)的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
在以上说明书中提出了本公开一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本发明，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本公开的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书限定。
实施例
以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。
本公开实施例或测试例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。参见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室；当代分子生物学方法，Ausubel等著，Greene出版协会，Wiley Interscience，NY。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.TSLP和TSLP受体的表达
编码带His标签的人TSLP、食蟹猴TSLP、带人IgG1-Fc标签的人TSLP、食蟹猴TSLP、TSLP受体胞外区序列装到phr载体上，构建成表达质粒，然后转染HEK293。具体转染步骤为：前一天将HEK293E细胞以0.8×106/ml接种于Freestyle表达培养基(含有1％FBS)中，放置于37℃恒温摇床(120rpm)继续培养24小时。24小时后，将转染质粒和转染试剂PEI用0.22μm的滤器除菌，然后将转染质粒调整为100μg/100ml细胞，用PEI(1mg/ml)和质粒的质量比为3∶1，以200ml HEK293E细胞的转染为例，取10ml的Opti-MEM和200μg质粒混匀，静置5min；另取10ml的Opti-MEM和600μg PEI混匀，静置5min。将质粒和PEI进行混匀，静置15min，不宜超过20min。将质粒和PEI混合物缓慢加入200ml HEK293E的细胞中，放入8％CO2，120rpm，37℃的摇床中培养。转染第3天，补充10％体积的补料培养基。待转染第6天，取样4500rpm离心10min收集细胞上清，过滤，将重组的TSLP和TSLP受体蛋白上清通过实施例2进行纯化，纯化的蛋白可用于下述各实施例实验中。相关序列如下所示。
1.带his标签的人TSLP抗原(huTSLP-his)氨基酸序列
Figure GPA0000313351660000261
注释：下划线为信号肽序列；斜体部分为Flag-His6-tag标记。
                                                          SEQ ID NO：1
2.带Fc标签的人TSLP抗原(huTSLP-Fc)氨基酸序列
Figure GPA0000313351660000262
Figure GPA0000313351660000271
注释：下划线为信号肽序列；斜体部分为接头-人Fc-tag标记。
                                                          SEQ ID NO：2
3.带his标签的食蟹猴TSLP抗原(cynoTSLP-his)氨基酸序列
Figure GPA0000313351660000272
注释：下划线为信号肽序列；斜体部分为flag-His6-tag标记。
                                                          SEQ ID NO：3
4.带Fc标签的食蟹猴TSLP抗原(cyno TSLP-Fc)氨基酸序列
Figure GPA0000313351660000273
注释：下划线为信号肽序列；斜体部分为接头-人Fc-tag标记。
                                                          SEQ ID NO：4
5.带Fc标签的人TSLP受体胞外区(人-TSLPR-Fc-ECD)氨基酸序列：
Figure GPA0000313351660000274
注释：下划线部分为人-TSLPR的胞外区，斜体部分为接头-人Fc-tag。
                                                          SEQ ID NO：5
实施例2.TSLP和TSLP受体(TSLPR)重组蛋白的纯化
2.1带His标签的各种属TSLP重组蛋白的纯化
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，过滤，PBS溶液平衡镍柱，冲洗10倍柱体积。将过滤后的上清样品上柱。用含有30mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。PBS浓缩换液，LC-MS鉴定为正确后分装备用。得到带His标签的人TSLP和食蟹猴TSLP。
2.2带人Fc标签的各种属TSLP和人TSLP受体胞外区重组蛋白的纯化
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，重组抗体表达上清用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸pH3.5洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。浓缩换液，所得到的蛋白经电泳，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
实施例3.重组TSLP受体和IL7Rα受体细胞系的构建和鉴定
为筛选可以阻断TSLP结合TSLP受体的抗体，构建了同时表达人TSLP受体和人IL7Rα(TSLPR/IL7Rα)的CHO-K1和BaF3细胞株。采用慢病毒包装目的基因TSLPR/IL7Rα克隆至目的细胞株内形成稳定高表达细胞株。首先分别将人TSLPR和人IL7Rα基因克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-puro和pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo(SBI，CD500B-1)质粒内，然后通过慢病毒感染的方法将人TSLPR克隆至CHO-K1和BaF3细胞株内，经10μg/ml嘌呤霉素(puromycin，Gibco，US)筛选压力下选择培养三周。在此基础上进行第二轮感染，再将人IL7Rα基因克隆进去，用1mg/ml G418(Gibco，US)和10μg/ml嘌呤霉素时筛选两至三周。最后通过流式分选的方法，筛选出同时高表达TSLPR和IL7 Rα的CHO-K1和BaF3单克隆细胞株。
实施例4.抗人TSLP单克隆抗体的制备和筛选
抗人TSLP单克隆抗体通过免疫小鼠产生，实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠用重组蛋白huTSLP-Fc(25μg)，huTSLP-his(12.5μg)和cynoTSLP-his(12.5μg)与TiterMax、Alum或CpG佐剂免疫。在第4-5次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠，处死后，取脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GPA0000313351660000281
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。
初次筛选用针对人和猴TSLP的ELISA结合实验，阻断人TSLP结合其受体TSLPR的实验，抑制TSLP诱导的BaF3细胞的增殖实验进行。当将杂交瘤细胞转移到24孔板后，对其上清进行复筛。筛选出的阳性克隆经过两轮亚克隆后，得到杂交瘤克隆，用于抗体生产，并通过亲和方法纯化。
筛选得到活性好的单克隆杂交瘤细胞株3号，119号，179号和199号，分别收集对数生长期杂交瘤细胞，用NucleoZol(MN)提取RNA，并进行反转录(PrimeScriptTM ReverseTranscriptase，Takara，cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。经测序得到鼠源抗TSLP抗体：mab3、mab119、mab179和mab199序列，其可变区氨基酸序列如下：
>mab3鼠源重链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000291
>mab 3鼠源轻链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000292
>mab119鼠源重链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000293
>mab119鼠源轻链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000294
>mab179鼠源重链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000295
>mab179鼠源轻链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000296
>mab199鼠源重链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000297
>mab199鼠源轻链可变区序列：
Figure GPA0000313351660000301
根据Kabat编号规则获得的CDR区氨基酸序列如下表所示：
表6.杂交瘤克隆来源抗体重链及轻链的CDR区序列
Figure GPA0000313351660000302
将上述鼠源抗体的轻重链可变区与人源抗体的轻、重链恒定区(如SEQ ID NO：134所示的kappa恒定区和如SEQ ID NO：133所示的IgG1-YTE恒定区)连接后形成嵌合抗体，mab3号克隆对应的嵌合抗体命名为Ch3，其他抗体类推。
实施例5.抗人TSLP单克隆抗体的人源化设计
为了降低鼠源抗体的免疫原性，将已筛选出的体内外活性优异的mab3、mab119、mab179和mab199抗体进行了人源化。鼠源单克隆抗体的人源化根据本领域许多文献公示的方法进行。简言之，使用人抗体恒定结构域替代亲本(鼠源抗体)恒定结构域，根据鼠源抗体和人抗体的同源性选择人种系抗体序列，进行CDR移植。然后以鼠源抗体的三维结构为基础，通过对VL和VH的氨基酸残基进行回复突变，将鼠源抗体的恒定区替换为人恒定区，得到最终的人源化分子。
5.1 mab3的人源FR区的选择和回复突变
(1)人源FR区的选择和回复突变
mab3的人源化VH模板为IGHV1-3*01+IGHJ6*01，人源化VL的模板为IGKV3-20+IGKJ4*01，将mab3的CDR移植到人源模板上，移植后获得的可变区序列如下：
Figure GPA0000313351660000311
mab3人源化抗体的回复突变设计如下表：
表7.mab3人源化抗体的回复突变
Figure GPA0000313351660000312
注：Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列，L46P表示依照Kabat编号系统，将46位L突变回P。
mab3人源化抗体的可变区序列如下：
Figure GPA0000313351660000313
Figure GPA0000313351660000321
注：单下划线为CDR区，双下划线为回复突变位点。
将上述轻、重链可变区与人种系轻链、重恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。示例性的，本公开中mab3人源化抗体的重链恒定区为SEQID NO：133所示IgG1-YTE恒定区，轻链恒定区为SEQ ID NO：134所示的kappa链恒定区，但也可以更换为其他本领域内公知的恒定区。
获得的mab3人源化抗体重、轻链可变区的序列见下表：
表8.mab3人源化抗体重、轻链可变区序列
抗体 VH(序列号) VL(序列号)
hu3-01 42 39
hu3-02 42 40
hu3-03 42 41
hu3-04 43 38
hu3-05 43 39
hu3-06 43 40
hu3-07 43 41
hu3-08 44 39
hu3-09 44 40
hu3-10 44 41
通过ELISA方法检测mab3人源化抗体与人TSLP的结合活性，结果显示，mab3人源化抗体与人TSLP具有很好的结合能力。
(2)hu3抗体的点突变
经检测发现，mab3人源化抗体的HCDR3的MDH序列和LCDR3的NTR序列上存在热点，因此，将相应的热点位点突变。突变后得到mab3人源化抗体的CDR区序列如下：
表9.突变后的HCDR3、LCDR3序列
Figure GPA0000313351660000331
注：表9中突变位点的位置采用的是根据可变区序列的自然顺序编号。
由此可得出，mab3人源化抗体CDR序列如下表：
表10.mab3人源化抗体突变后的CDR
Figure GPA0000313351660000332
其中，X1选自H或Y，X2选自N或D。
示例性的，突变后得到的人源化抗体hu3-11的CDR及重、轻链可变区如下：
表11.hu3-11的CDR区
Figure GPA0000313351660000341
>hu3-11的轻链可变区(hu3VL4-N93D)
Figure GPA0000313351660000342
>hu3-11的重链可变区(hu3VH2-H110Y)
Figure GPA0000313351660000343
将热点突变后的轻、重链可变区与人种系轻链、重恒定区序列重组形成完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。
使用ELISA方法检测突变后得到的抗体与人TSLP结合活性，结果显示，hu3-11与人TSLP的亲和活性依然较高，说明mab3人源化抗体的HCDR3和LCDR3上的热点突变，并不会影响抗体的活性。
(3)hu3-11抗体的亲和力成熟
对hu3-11的分子进行了亲和力成熟。亲和力成熟的过程如下：
酵母文库的构建：设计简并引物，通过PCR的方法将设计的突变氨基酸引入到抗体hu3-11的scFv突变体文库中，每个文库的大小约109左右，构建好的酵母菌文库通过测序的方法验证文库的多样性。
在第一轮筛选中，将来自hu3-11-scFv突变体文库的约5×1010个细胞与生物素化的TSLP-Fc蛋白(1-10μg/ml)在50m1含0.1％牛血清白蛋白(BSA)-磷酸盐缓冲液(PBSA)中于室温下孵育1小时。然后，混合物用0.1％PBSA洗涤，以去除未结合的抗体片段。然后往结合生物素化TSLP-Fc的hu3-11-scFv抗体突变体文库中加入100μl链菌素微珠(MilenviBiotec，Auburn，CA)，并使其负载于AutoMACS系统上用于分选。收集具有对TSLP-Fc的高亲和力的抗体文库的细胞，于250rpm和20℃下诱导18h。将所得到的富集文库进行针对与生物素化的重组TSLP-Fc蛋白的第二轮筛选。
对于第三轮和第四轮的筛选，将来自前一轮的文库细胞与生物素化的重组TSLP-Fc蛋白(0.1-1μg/ml)和10μg/ml Mouse Anti-cMyc(9E10，sigma)抗体在0.1％PBSA中于室温下孵育1h，混合物用0.1％PBSA洗涤，以去除未结合的抗体片段。加入Goat anti-mouse-Alexa488(A-11001，life technologies)和Strepavidin-PE(S-866，Life technologies)于4℃下孵育1h，混合物用0.1％PBSA洗涤，以去除未结合的抗体片段。最后，通过FACS筛选(BD FACSAriaTM FUSION)出亲和力高的抗体。
hu3-11-scFv突变体文库利用生物素化的TSLP-Fc抗原，经过2轮MACS筛选和2轮FACS筛选。再挑选400个左右的酵母单克隆培养和诱导表达，使用FACS检测酵母单克隆对TSLP-Fc抗原的结合，挑选出亲和力高的酵母单克隆进行测序验证，对测序克隆进行比对分析，去除冗余序列之后，将非冗余序列转换成全长抗体后进行哺乳动物细胞表达。
亲和力成熟获得的轻链可变区序列如下：
Figure GPA0000313351660000351
将获得的轻链可变区与mab3人源化抗体的重链可变区重组，得到新的mab3人源化抗体，示例性的，将huVL5和huVL6分别与hu3VH2-H110Y组合，得到新的抗体分子hu3-12和hu3-13，具体如下所示：
表12.亲和力成熟获得的抗体
抗体 hu3VH hu3VL
hu3-12 hu3VH2-H110Y hu3VL5
hu3-13 hu3VH2-H110Y hu3VL6
亲和力成熟后，得到的mab人源化抗体的CDR序列如下所示：
表13.亲和力成熟获得的mab3人源化抗体抗体的CDR
Figure GPA0000313351660000352
Figure GPA0000313351660000361
对得到的新的mab3人源化抗体抗体进行ELISA检测其结合人TSLP活性。结果显示，hu3-12、hu3-13与人TSLP依然具有较高的结和能力。说明，LCDR3的改变，并不会影响hu3系列抗体的活性。
综上，mab3人源化抗体的CDR具有如下所示的序列：
表14.mab3人源化抗体的CDR区通式序列
Figure GPA0000313351660000362
其中，X1为H或Y，X3为N或S，X4为V或G，X5为G或E。
mab3人源化抗体热点突变亲和力成熟后的抗体重轻链可变区组合见下表：
表15.亲和力成熟抗体的序列
抗体 VH(序列号) VL(序列号)
hu3-11 50 49
hu3-12 50 51
hu3-13 50 52
5.2 mab119的人源FR区的选择和回复突变
mab119的VH选取IGHV1-69*02和HJ6*01作为模板，VL选取IGKV4-1*01和IGKJ2*01以及IGKV3-11*01和IGKJ2*01作为模板，将鼠源抗体的CDR区移植到选择的人源化模板上，并对FR区进行回复突变，得到不同的轻链和重链可变区，CDR移植得到的可变区序列如下：
Figure GPA0000313351660000371
mab119人源化抗体的回复突变见下表：
表16.mab119回复突变
Figure GPA0000313351660000372
Figure GPA0000313351660000381
注：如M4L表示依照Kabat编号系统，将4位M突变回L。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
mab119人源化抗体可变区具体序列如下：
Figure GPA0000313351660000382
Figure GPA0000313351660000391
Figure GPA0000313351660000401
注：单下划线为可变区，双下划线为回复突变。
将上述轻、重链可变区与人种系轻、重链恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。示例性的，本公开中mab119人源化抗体的重链恒定区为SEQ ID NO：133所示IgG1-YTE恒定区，轻链恒定区为SEQ ID NO：134所示的kappa链恒定区，但也可以更换为其他本领域内公知的恒定区。
mab119人源化抗体的重、轻链可变区见表17。
表17.mab119人源化抗体的重、轻链可变区
Figure GPA0000313351660000402
Figure GPA0000313351660000411
使用ELISA方法检测人源化抗体与人TSLP结合活性，结果显示，mab119人源化抗体可与人TSLP特异性结合。
(2)hu119的突变
经检测发现，mab119人源化抗体的LCDR1 DNS序列存在热点，因此，将相应的位点突变为N31S或N31Q。突变后得到的LCDR1序列如下：
表18.mab119人源化抗体点突变后的LCDR1
Figure GPA0000313351660000412
注：表19中突变位点的位置采用的是自然顺序编号。
示例性的，突变后得到的hu119VL2、hu119VL6突变体序列如下：
Figure GPA0000313351660000413
Figure GPA0000313351660000421
注：单下划线为可变区，双下划线为回复突变。
将得到的hu119VL2、hu119VL6突变体与hu119VH组合，得到新的人源化hu119抗体，示例性的，hu119VL2-N31S、hu119VL2-N31Q分别与hu119VH3组合，得到的抗体hu119-28和hu119-29；hu119VL3-N31S与hu119VH8组合，得到抗体hu119-30，示例性的突变后抗体的可变区组合如下：
表19.热点突变后的人源化抗体可变区组合
hu119VH hu119VL
hu119-28 hu119VH3 hu119VL2-N31S
hu119-29 hu119VH3 hu119VL2-N31Q
hu119-30 hu119VH8 hu119VL6-N31S
使用ELISA方法检测突变后得到的抗体与人TSLP的亲和力，结果显示，hu119-28、hu119-29抗体依然与人TSLP具有较高的亲和力，这说明，LCDR2的N31S、N31Q的突变并不会影响抗TSLP抗体活性。
综上，mab119人源化抗体的CDR具有如下所示的序列：
表20.mab119人源化抗体的CDR
Figure GPA0000313351660000422
其中，X6选自N、S和Q。
5.3 mab179的人源化
(1)mab179鼠源抗体人源化模板选择及回复突变
mab179的VH选取IGHV1-69*02和IGHJ6*01作为模板，VL选取IGKV4-1*01和IGKJ2*01或IGKV2-29*02和IGKJ2*01作为模板，将鼠源抗体的CDR区移植到选择的人源化模板上，并对FR区进行回复突变，得到不同序列的轻链和重链可变区。人源化可变区序列及回复突变如下：
Figure GPA0000313351660000431
表21.mab179人源化模板及回复突变
Figure GPA0000313351660000432
Figure GPA0000313351660000441
注：如P43S表示依照Kabat编号系统，将43位P突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
mab179人源化抗体的可变区如下所示：
Figure GPA0000313351660000442
Figure GPA0000313351660000451
Figure GPA0000313351660000461
注：单下划线部分为CDR，双下划线处回复突变位点。
将上述轻、重链可变区与人种系轻、重链恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列，进而得到全长序列的抗体。示例性的，本公开中mab199人源化抗体的重链恒定区为SEQ ID NO：133所示IgG1-YTE恒定区，轻链恒定区为SEQ ID NO：134所示的kappa链恒定区，但也可以更换为其他本领域内公知的恒定区。
表22.mab179人源化抗体的重、轻链可变区组合
抗体 VH(序列号) VL(序列号)
hu179-01 85 77
hu179-02 85 78
hu179-03 86 77
hu179-04 86 78
hu179-05 87 77
hu179-06 87 78
hu179-07 87 79
hu179-08 87 81
hu179-09 87 82
hu179-10 87 83
hu179-11 87 84
hu179-12 88 77
hu179-13 88 78
hu179-14 89 79
hu179-15 89 80
hu179-16 89 81
hu179-17 89 82
hu179-18 89 83
hu179-19 89 84
使用ELISA方法检测mab179人源化抗体与人TSLP的亲和力，结果显示mab179人源化抗体与人TSLP具有很好的亲和力。
(2)hu179抗体的突变
经检测发现，mab179人源化抗体的HCDR2和LCDR2序列上存在热点，因此，将相应的位点突变以消除分子修饰风险。
在其中一个实施例中，对hu179VH1的HCDR2的GNG进行氨基酸突变，hu179VH1突变后的序列如下：
Figure GPA0000313351660000462
Figure GPA0000313351660000471
注：单下划线部分为CDR，双下划线处回复突变位点。
突变后得到mab179人源化抗体的HCDR2区序列如下：
表23.mab179人源化抗体的HCDR2突变体
Figure GPA0000313351660000472
注：表24中突变点的位置采用的是自然顺序编号。
由上可获得mab179人源化抗体突变后的CDR区，如下所示：
表24.mab179人源化抗体突变后CDR
Figure GPA0000313351660000473
其中，X7选自N，Q或V，X8选自G或V。
将突变后得到的hu179VH1突变体与人源化的hu179VL组合，得到新的mab179人源化抗体，示例性的hu179VH1突变体与hu179VL2组合的抗体如下所示：
表25.突变后抗体可变区组合
可变区 hu179VH1-N55Q hu179VH1-N55V hu179VH1-G56V
hu179VL2 hu179-20 hu179-21 hu179-22
使用ELISA方法检测突变后得到的抗体与人TSLP的亲和力，结果显示，HCDR2突变后的抗体与人TSLP依然保持较高的亲和力。这表明mab179人源化抗体的HCDR2的点突变N55Q、N55V和G56V基本不影响抗体与TSLP的亲和活性。
按照同样的方法，在hu179VH2、hu179VH3、hu179VH4、hu179VH5上分别进行N55Q、N55V和G56V点突变(自然顺序编号)，并将突变获得重轻链可变区重新组合，得到新的mab179人源化抗体。示例性的，hu179VH3突变的序列如下所示：
Figure GPA0000313351660000481
注：单下划线部分为CDR，双下划线处回复突变位点。
在另一些实施例中，对mab179人源化抗体的LCDR2进行氨基酸突变，示例性的，hu179VL2突变后的序列如下：
Figure GPA0000313351660000482
Figure GPA0000313351660000491
注：单下划线部分为CDR，双下划线处回复突变位点。
突变后获得的mab179人源化抗体LCDR2的序列如下：
表26.mab179人源化抗体LCDR2突变体
Figure GPA0000313351660000501
由上可知，mab179人源化抗体LCDR2通式为：X9VX10X11X12X13T(SEQ ID NO：118)，其中X9选自Y或E，X10选自S、D或E，X11选自N，Q，D或E；X12选自H，Y，D或E；X13选自E或Y。mab179人源化抗体的CDR区如下表所示：
表27.mab179人源化抗体的CDR
Figure GPA0000313351660000502
其中，X7选自N，Q或V，X8选自G或V；X9选自Y或E；X10选自S、D或E；X11选自N，Q，D或E；X12选自H，Y，D或E；X13选自E或Y。
将突变后得到的hu179VL2突变体与人源化的hu179重链可变区组合，得到新的mab179人源化抗体，示例性的hu179VL2突变体与hu179VH1、hu179VH3组合，获得的mab179人源化抗体的CDR及重轻链可变区组合如下所示：
表28.LCDR2突变后mab179人源化抗体CDR区序列
Figure GPA0000313351660000511
其中，X5选自Y或E；X6选自S、D或E；X7选自N，Q，D或E；X8选自H，Y，D或E；X9选自E或Y。
表29.LCDR2突变后mab179人源化抗体的重、轻链可变区组合
抗体 VH(序列号) VL(序列号)
hu179-23 85 102
hu179-24 85 104
hu179-25 87 98
hu179-26 87 99
hu179-27 87 100
hu179-28 87 101
hu179-29 87 103
hu179-30 87 105
hu179-31 87 106
hu179-32 87 107
使用ELISA的方法检测LCDR2突变后获得的mab179人源化抗体与人TSLP的亲和力，结果显示，对LCDR2的热点位点突变后，得到的抗体与人TSLP依然具有较好的亲和力。说明LCDR2的热点位点的突变也不会影响mab179人源化抗体的结合活性。
按照同样的方法，对hu179VL3、hu179VL4、hu179VL5、hu179VL6、hu179VL7和hu179VL8的LCDR2进行N53Q，N53D，N53S，H54Y，Y50E，S52D，S52E，N53E，H54D，H54E，Y55E的突变。将突变后的轻链可变区与重链可变区组合，形成新的mab人源化抗体。在一种实施方案中，hu179VL8突变后的序列如下所示：
Figure GPA0000313351660000521
将突变得到的hu179VL8-N53E与hu179VH3-N55V组合，得到新的抗体分子hu179-33，该分子的CDR序列如下所示：
表30.hu179-33抗体的CDR区
Figure GPA0000313351660000522
Biacore检测突变后得到的抗体与人TSLP结合活性，示例性的抗体的结合活性如下所示：
表31.hu179-33与人TSLP的亲和力
抗体 huTSLP亲和力KD(M)
AMG157 8.12E-12
hu179-33 9.03E-13
结果显示，hu179-33抗体与人TSLP具有较高的特异性结合活性。这表明同时在HCDR2和LCDR2上进行热点的点突变，并不会影响mab179人源化抗体与人TSLP亲和力。由此可知，在mab179人源化抗体分子中，同时在HCDR2上做N55Q、N55V、G56V突变，在LCDR2中做N53Q，N53D，N53S，H54Y，Y50E，S52D，S52E，N53E，H54D，H54E，Y55E的突变，并不会影响抗体与人TSLP的结合，即不会影响抗TSLP抗体的活性。
5.4 mab199抗体人源FR区的选择和回复突变
mab199的VH选取IGHV1-46*01和HJ6*01为模板，VL选取IGKV1-39*01和IGKJ4*01为模板，将鼠源抗体的CDR区移植到选择的人源化模板上，并对FR区进行回复突变，得到具有不同序列的轻链和重链可变区，回复突变如表32所示。
表32.mab199的回复突变设计
Figure GPA0000313351660000531
注：如I48V表示依照Kabat编号系统，将48位I突变回V。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
mab199人源化抗体的可变区如下所示：
Figure GPA0000313351660000532
Figure GPA0000313351660000541
Figure GPA0000313351660000551
注：单下划线部分为CDR，双下划线处回复突变位点。
将上述轻、重链可变区与人种系轻、重链恒定区序列组合形成最终的完整轻、重链序列进而得到全长序列的抗体。在本公开中如无明确说明时，mab199人源化抗体的轻链恒定区为SEQ ID NO：134所示恒定区，重链恒定区为SEQ ID NO：133所示的恒定区。
得到的mab199人源化抗体如下所示：
表33.mab199人源化抗体的重、轻链可变区序列
Figure GPA0000313351660000552
Figure GPA0000313351660000561
使用ELSA方法的检测mab199人源化抗体阻断TSLP结合TSLP受体的活性，检测结果如下：
表34.mab199人源化抗体阻断TSLP结合TSLP受体的活性
抗体 IC50(nM) 抗体 IC50(nM) 抗体 IC50(nM) 抗体 IC50(nM)
hu199-01 0.1912 hu199-10 0.3910 hu199-191 0.6584 hu199-28 0.4619
hu199-02 0.2193 hu199-11 0.3648 hu199-20 0.4001 hu199-29 0.5543
hu199-03 0.2077 hu199-12 0.3700 hu199-21 0.5353 hu199-30 0.3493
hu199-04 0.4242 hu199-13 0.2395 hu199-22 0.3449 hu199-31 0.3044
hu199-05 0.4726 hu199-14 0.3112 hu199-23 0.3370 hu199-32 0.2870
hu199-06 0.3806 hu199-15 0.2866 hu199-24 0.4960 hu199-33 0.2055
hu199-07 0.2834 hu199-16 0.7367 hu199-25 0.2460 hu199-34 0.7107
hu199-08 0.2828 hu199-17 0.6111 hu199-26 0.3651 hu199-35 0.4849
hu199-09 0.2732 hu199-18 0.4806 hu199-27 0.3544 hu199-36 0.7273
Ch199 0.4266  
结果显示，mab199人源化抗体依然具有较高的阻断人TSLP与TSLP受体结合的活性。
5.5.抗体恒定区
人源化抗体及嵌合抗体重链恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG4及其变体的恒定区，示例性的，本公开中使用了IgG1-YTE恒定区，其序列如SEQ ID NO：133所示。轻链恒定区可选自人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，示例性的，本公开中使用了人源κ链的恒定区，其序列如SEQ ID NO：134所示。
>IgG1-YTE重链恒定区：
Figure GPA0000313351660000571
注：下划线为设计的M252Y，S254T，T256E突变
>κ轻链恒定区：
Figure GPA0000313351660000572
将本公开中的人源化的重轻链可变区与上述恒定区重组，得到重、轻链的全长序列，示例性的，抗体的序列如下所示：
hu3-13抗体重链：
Figure GPA0000313351660000573
Figure GPA0000313351660000581
hu3-13抗体轻链：
Figure GPA0000313351660000582
hu119-30抗体重链
Figure GPA0000313351660000583
hu119-30抗体轻链
Figure GPA0000313351660000584
hu179-33抗体重链
Figure GPA0000313351660000585
Figure GPA0000313351660000591
hu179-33抗体轻链
Figure GPA0000313351660000592
hu199-36抗体重链
Figure GPA0000313351660000593
hu199-36抗体轻链：
Figure GPA0000313351660000594
注：下划线部分为CDR，斜体部分为恒定区。
本公开将AMG157作为阳性对照，其序列如SEQ ID NO：143和SEQ ID NO：144所示。
AMG157的重链序列
Figure GPA0000313351660000601
AMG157的轻链序列
Figure GPA0000313351660000602
此外，在测试抗体活性时，本公开还使用了人TSLP受体和人IL7Rα构建细胞系，其序列如下所示：
人TSLP受体全长序列氨基酸序列：
Figure GPA0000313351660000603
注释：下划线部分为信号肽
                                                        SEQ ID NO：145
人IL7Rα全长序列氨基酸序列(Uniprot编号：P16871)
Figure GPA0000313351660000604
Figure GPA0000313351660000611
注释：下划线部分为信号肽
                                                        SEQ ID NO：146
本公开的抗体可用常规基因克隆、重组表达的方法进行克隆、表达和纯化。
测试例：
体外活性生物学评价
测试例1：ELSA测定抗TSLP抗体与人TSLP的结合
用pH7.4的PBS(上海源培，B320)缓冲液将人TSLP-his(SEQ ID NO：1)稀释至1μg/ml，以100μg/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，CLS3590-100EA)中，于4℃孵育过夜。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，用PBST缓冲液(pH 7.4PBS含0.1％tween-20)洗板3次后，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体和阳性抗体AMG157，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板3次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，115-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育10-15min，加入50μl/孔1MH2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算TSLP抗体对TSLP的结合EC50值，结果见下表。
表35.抗体与人TSLP结合活性结果
Figure GPA0000313351660000612
Figure GPA0000313351660000621
结果显示，本公开中的抗体与人的TSLP有很好的结合活性。
测试例2：Biacore测定抗TSLP人源化抗体与不同种属TSLP的亲和力
用Biacore T200(GE)仪器测定待测人源化TSLP抗体和人和猴TSLP的亲和力。
用Protein A生物传感芯片(Cat.#29127556，GE)亲和捕获待测分子，然后于芯片表面流经抗原(huTSLP-his，cynoTSLP-his，实施例1制备所得)，用Biacore T200仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5Cat.#BR-1003-54，GE)将生物传感芯片洗净再生。用BIAevaluation version 4.1，GE软件以(1∶1)Langmuir模型拟合数据，得出亲和力数值，如下表所示。
表36.抗TSLP抗体与不同种属TSLP的亲和力
Figure GPA0000313351660000622
结果显示，本公开中的抗TSLP抗体与人TSLP的亲和力较高，也可和猴TSLP结合。
测试例3：基于ELSA的抗TSLP抗体阻断TSLP结合TSLP受体实验
TSLP受体有两个亚基，TSLPR和IL7R，其中TSLPR为TSLP特异性受体，IL7R为TSLP与IL7的共用受体。TSLP先与TSLPR结合，再与IL7R结合。本测试例用来鉴定TSLP抗体是否可以阻断TSLP结合到重组表达的TSLPR受体蛋白胞外区。
将人-TSLPR-Fc-ECD(2μg/ml，SEQ ID NO：5)包被ELISA板，4℃孵育过夜，弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板3次，将生物素标记的huTSLP-Fc抗原配制成3nM，待测抗体从200nM开始梯度稀释，抗原和抗体1∶1混匀后37℃放置15min，100μl每孔加入酶标板中，37℃放置1h，用PBST洗板3次后，加入100μl/孔用样品稀释液以1∶4000浓度稀释的Streptavidin-Peroxidase Polymer，于37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入100μl/孔TMB显色底物(KPL，52-00-03)，于室温孵育3-10min，加入100μl/孔1MH2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在450nm处读取吸收值，计算TSLP抗体阻断TSLP与TSLPR结合的IC50值，结果见表37和附图1。
表37.抗体阻断活性结果
抗体 hu179-33 hu119-30 hu3-13 hu199-36
IC50(nM) 0.5038 0.5192 0.4975 0.5693
结果显示，本公开抗体均可较强地抑制TSLP与其受体TSLPR的结合。
测试例5：基于FACS的TSLP抗体阻断TSLP结合TSLP受体实验
本测试例用来鉴定抗TSLP抗体可以分别阻断TSLP结合到CHOK1细胞系表面的TSLPR/IL7R受体。
具体方法是：用含10％FBS，1mg/ml G418，10μg/ml puromicine的DME/F12来培养CHOK1-TSLPR/IL7R，将状态良好的CHOK1-TSLPR/IL7R细胞离心(1000rpm，5min)，用2％FBS的PBS洗一遍，并且计数，将细胞浓度调整浓度至1×106/ml，取50μl加入到圆底的96孔板中。用含2％BSA的PBS溶液稀释待测抗体，初始浓度为20nM，按1∶4倍比稀释8个梯度。生物素标记的TSLP-Fc抗原配制成2nM，抗原和抗体1∶1混匀后37℃放置15min，50μl每孔加到已铺细胞的96孔板中，在4℃孵育1小时。孵育结束后，4℃离心(800g，5min)，弃掉上清，用200μl的预冷PBS离心洗涤，重复两次后加入1∶1000稀释的PE-SA二抗，4℃避光孵育40min后，4℃离心(800g，5min)，弃掉上清，加入200μl的预冷PBS，吹起细胞，4℃离心洗涤，重复三次，加入100μlPBS，上机读板，根据荧光信号值计算TSLP抗体阻断TSLP与TSLPR/IL7R结合的IC50值。结果如表38所示。
表38.抗体阻断细胞表面TSLPR结果
抗体 AMG157 hu179-33 hu119-30 hu3-13 hu199-36
IC50(nM) 0.2068 0.1867 0.1368 0.1325 0.2270
结果显示，本公开抗体均可较强地阻断TSLP与细胞表面的TSLPR/IL7R结合。
测试例6：抗TSLP抗体抑制TSLP诱导的趋化因子的产生
TSLP可以诱导初始髓样树突状细胞(mDC)成熟并分泌趋化因子胸腺激活调节趋化因子(TARC)和破骨细胞抑制因子(OPG)，从而进一步介导先天和适应性免疫炎症反应。本测试例用来验证所得抗体可以阻断TSLP诱导mDC产生趋化因子，进而阻断先天和适应性炎症反应的发生。
采用磁珠分选的方法(CD1c(BDCA-1)+Dendritic Cell Isolation Kit，MiltenyiBiotec)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离纯化初始髓样mDC，将得到的mDC种植于96孔细胞培养板内，梯度稀释的抗体样品和人TSLP(huTSLP-his，终浓度50ng/ml)，预先孵育45分钟左右(37℃)，再分别加入到含有mDC的各细胞培养孔内，体外刺激mDC，置于培养箱中培养48小时。收集细胞培养上清，适当稀释后采用ELISA的方法检测其中趋化因子的含量。TARC采用R&D公司的人CCL17/TARC Quantikine ELISA Kit检测；OPG含量采用人CCL22/MDCQuantikine ELISA Kit(R&D)检测，结果见图4A-4B。
结果显示，本公开中的抗体均可显著抑制TSLP诱导的趋化因子TARC和OPG的产生，说明本公开中的抗体可以阻断先天和适应性炎症反应的发生。
测试例7.抗TSLP抗体阻断天然TSLP诱导的BaF3-TLSPR/IL7R细胞的增殖
BaF3-hTSLPR/hIL7R细胞可在天然(native)TSLP的刺激下增殖，抗体与天然TSLP结合后降低TSLP对BaF3-hTSLPR/hIL7R细胞的刺激作用。
培养NHLF细胞(北纳生物BNCC340764)、HLF1细胞(北纳生BNCC337730)，当细胞生长至80％时，弃掉上清，使用人10ng/ml IL1-β(Sino Biological GMP-10139-HNAE)，20ng/ml IL13(R&D 213-ILB-005)，20ng/ml TNF-α(PEPROTECH 300-01A)刺激人肺成纤维细胞NHLF(北纳生物BNCC340764)和HLF1(北纳生物BNCC337730)72小时，诱导其产生天然TSLP。刺激结束后收集细胞上清，离心去掉细胞碎片，4500rpm，离心5min，收集上清后用浓缩柱进行浓缩，大约浓缩10倍，过滤后备用。
BaF3-hTSLPR/hIL17R细胞培养于10％FBS的RPMI1640(10ng/mL mIL3，R&D 213-ILB-005)中，调整密度为1×104个/ml，于37℃，5％CO2培养箱中培养至对数生长期。收集细胞，800rpm/min，离心5min，弃上清；用PBS洗三遍除去培养基中刺激其增殖的细胞因子。使用4％FBS RPMI1640培养基将细胞重悬，按照4000个细胞/50μl/well接种于96孔板，培养箱中培养2h。使用天然TSLP稀释待测抗体，抗体起始浓度为100nM，10倍比进行梯度稀释，稀释3个梯度100nM，10nM，1nM。将稀释好的抗体/抗原混合物50μl/well加入细胞中，抗体终浓度为50nM，5nM，0.5nM，37℃，5％CO2培养箱中培养72h。然后每孔加入30μL CellTiter-Glo(Promega)室温避光孵育1Omin，用Cytation5细胞成像仪Luminescence程序检测。结果见下表。
表39.抗TSLP抗体抑制BaF3-TLSPR/IL7R细胞的增殖结果
抗体 AMG157 hu179-33 hu3-13 hu119-30
IC50(nM) 3.379 0.02279 0.2888 1.533
结果显示，本公开所得抗体均可以显著抑制天然TSLP刺激BaF3增殖的活性，尤其是hu179-33，其活性是AMG157的100倍以上。
测试例8：抗TSLP抗体抑制TSLP诱导的过表达TSLPR/IL7R的BaF3细胞增殖实验
TSLP可以与BaF3表面的TSLPR/IL7R结合，进而促进BaF3的增殖。本测试例用来鉴定本公开抗体可以阻断TSLP的诱导BaF3增殖的活性。
具体为：过表达TSLPR/IL7R的BaF3细胞培养于10％FBS以及2ng/mL rhIL3(联科生物，Catalog No.96-AF-300-03-20)的RPMI1640，于37℃，5％CO2培养箱中培养，细胞密度不要超过1×106个/ml。检测抗体时，取对数生长期的细胞用PBS洗三遍800rpm离心5min，用RPMI1640(2％FBS，重组人TSLP-Fc：40ng/ml)调整细胞密度8000个/孔/90μl，并加入10μl梯度稀释的待测抗体到96well培养2天后，加入30μl cell titer混匀后进行检测，根据读值计算IC50。结果如表40和图3所示。
表40.抗体抑制BaF3细胞增殖活性
抗体 AMG157 hu179-33 hu119-30 hu3-13 hu199-36
IC50(nM) 0.5730 0.4092 0.4305 0.4436 0.4769
结果显示，本公开的抗体均具有较强的抑制TSLP介导的BaF3细胞增殖的能力。
测试例9：人源化抗TSLP抗体阻断TSLP诱导的天然CD4+T细胞往Th2细胞的分化
TSLP可以诱导原代髓样mDC细胞成熟，成熟的mDC细胞高表达OX40配体，OX40配体可以与天然CD4+T细胞表面的OX40结合，进而使天然CD4+T分化成Th2细胞，产生IL4/IL5/IL13等免疫应答相关因子，使机体发生Th2炎症反应。本测试例用来检测本公开所得抗体可以阻断TSLP诱导的Th2细胞的分化。
采用磁珠分选的方法(CD1c(BDCA-1)+Dendritic Cell Isolation Kit，MiltenyiBiotec)从人外周血单核细胞(PBMC)中分离纯化初始髓样DC，将得到的mDC种植于96孔细胞培养板内，梯度稀释的抗体样品和重组表达的人TSLP(huTSLP-his，终浓度50ng/ml)预先孵育(37℃)45分钟左右，再分别加入到含有mDC的各细胞培养孔内，37℃培养24小时。收集刺激成熟的mDC，用PBS洗两次。用磁珠分离法(Myltenyi，Biotec)从PBMC中提取CD4+CD45RA+天然T细胞。将分离得到的天然T细胞和成熟的mDC以5∶1的比例混合种植于96孔细胞培养板内，共同培养6天。收集细胞，种植于anti-CD3(10μg/ml)预包被的96孔板内，并加入anti-CD28(1μg/mL)，再刺激分化的T细胞，培养24小时，最后收集细胞培养上清。ELISA检测上清中细胞分泌的Th2相关的细胞因子。IL-4和IL-5细胞因子用的是R&D的ELISA试剂盒检测，TNF-α和IL-13用欣博盛的ELISA试剂盒检测。结果如图5A-5D所示。
结果显示，本公开所得抗体可以显著抑制Th2细胞因子IL4、IL5、IL13和TNF-α的产生，表明本公开所得抗体可以阻断TSLP诱导的Th2细胞的分化。

Claims (19)

1.一种抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
i)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
iv)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体是鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求2所述的抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体包含来源自人抗体的框架区，其中所述抗TSLP抗体包含以下所述的轻链可变区和/或重链可变区：
重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；和轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：54所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；或
重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；和轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：53所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；或
重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；和轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；或
重链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变；和轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，且其框架区包含至多10个回复突变。
4.根据权利要求3所述的抗TSLP抗体，其中所述重链可变区的回复突变为在SEQ IDNO：42的基础上选自38K、48I、67A、69L、71V和73K中的一个或更多个；和/或所述轻链可变区的回复突变为在SEQ ID NO：38的基础上选自46P、47W、58V、70S和71Y中的一个或更多个。
5.根据权利要求1所述的抗TSLP抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6、42、43、44或50所示，和所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7、38、39、40、41、49、51或52所示。
6.根据权利要求5所述的抗TSLP抗体，其包含如下所示的重链可变区和轻链可变区：
a)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：50所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：52所示；或
b)所述重链可变区序列如SEQ ID NO：50所示和所述轻链可变区序列如SEQ ID NO：51所示。
7.根据权利要求1所述的抗TSLP抗体，其中所述抗TSLP抗体进一步包含抗体重链恒定区和轻链恒定区。
8.根据权利要求7所述的抗TSLP抗体，所述重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区及其常规变体，所述轻链恒定区选自人抗体κ和λ链恒定区及其常规变体。
9.根据权利要求8所述的抗TSLP抗体，其包含序列如SEQ ID NO:133所示的重链恒定区和序列如SEQ ID NO:134所示的轻链恒定区。
10.根据权利要求1所述的抗TSLP抗体，其中所述的抗TSLP抗体包含如下所示的重链和轻链：
重链氨基酸序列如SEQ ID NO：135所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：136所示。
11.一种核酸分子，其编码权利要求1至10中任一项所述的抗TSLP抗体。
12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的核酸分子。
13.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗TSLP抗体，或根据权利要求11所述的核酸分子，或权利要求12所述的宿主细胞，以及一种或更多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂。
14.一种用于体外或离体免疫检测或测定TSLP的方法，所述方法包括使用权利要求1至10中任一项所述的抗TSLP抗体的步骤。
15.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗TSLP抗体。
16.权利要求1至10中任一项所述的抗TSLP抗体或权利要求11所述的核酸分子或权利要求12所述的宿主细胞或权利要求13所述的药物组合物在制备用于治疗与TSLP相关的疾病的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述与TSLP相关的疾病选自：哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、变应性鼻炎、过敏性鼻窦炎、荨麻疹、内塞顿综合征、嗜酸性粒细胞性食管炎、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸性粒细胞性胃肠炎、过敏性支气管肺曲霉病、过敏性真菌鼻窦炎、慢性瘙痒、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病、全身性硬化、多发性硬化症、瘢痕瘤、溃疡性结肠炎、鼻息肉病、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性粒细胞性支气管炎、腹腔病、Churg-Strauss综合征、嗜酸性粒细胞性肌痛综合征、高嗜酸粒细胞综合征、嗜酸性粒细胞性肉芽肿病伴随多血管炎、炎性肠病、硬皮病、间质性肺病、B型或C型慢性肝炎引发的纤维化、辐射诱发的纤维化和伤口愈合引发的纤维化。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述与TSLP相关的疾病为癌症。
19.根据权利要求16所述的用途，其中所述与TSLP相关的疾病选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌。
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