TW201406778A

TW201406778A - 用於ｖｅｇｆ之ｅｌｉｓａ

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Publication number: TW201406778A
Application number: TW102139875A
Authority: TW
Inventors: Yu-Ju G Meng; Kyu H Hong; Johnny Gutierrez
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2014-02-16
Also published as: EP2069798A2; IL197374A; HRP20140675T1; AU2007319654A1; PT2069798E; EP2457929A1; KR20150038444A; CN103454434A; MX2009003562A; KR101720887B1; MX342791B; ZA200901518B; JP2010506171A; NZ613646A; PL2457929T3; TWI541251B; RS53387B; US20170276683A1; CN103454434B; ES2584322T3

Abstract

患者血流或其他生物試樣中的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)活性可充當癌症、糖尿病、心臟病狀及其他病變之診斷及預後指標。本發明提供用於VEGF作為抗原之抗體夾心ELISA法及套組來偵測來自動物模型及人類患者之生物試樣中之VEGF含量類型且其可用作診斷/預後指標。

Description

用於VEGF之ELISA

本發明係關於用於偵測某些VEGF群體的免疫檢定，其可用作患有癌症、心血管或其他病變之患者的診斷及預後方法。

目前明確血管生成與多種病症之發病機制有關。此等病症包括實體腫瘤、諸如增生性視網膜病或年齡相關之黃斑變性(AMD)之眼內新生血管性症候群、類風濕性關節炎及牛皮癬(Folkman等人，J.Biol.Chem.267：10931-10934(1992)；Klagsbrun等人，Annu.Rev.Physiol.53：217-239(1991)；及Garner A,Vascular diseases.In：Pathobiology of ocular disease.A dynamic approach.Garner A,Klintworth GK編，第二版(Marcel Dekker,NY,1994)，第1625-1710頁)。在實體腫瘤之情況下，新血管生成使腫瘤細胞與正常細胞相比獲得生長優勢及增生自主性。因此，已觀測到腫瘤切片中之微血管密度與乳癌以及數種其他腫瘤中患者存活率之間的相關性(Weidner等人，N Engl J Med 324：1-6(1991)；Horak等人，Lancet 340：1120-1124(1992)及Macchiarini等人，Lancet 340：145-146(1992))。

對血管生成之正調節劑的尋找已獲得許多候選者，包括(例如)aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8等(Folkman等人，前述及Klagsbrun等人，前述)。迄今為止所鑑別之某些負調節劑包括凝血栓蛋白(Good等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.87：6624-6628(1990))、16千道爾頓促乳素N末端片段(Clapp等人，Endocrinology,133：1292-1299(1993))、血管生長抑素(O'Reilly等人，Cell 79：315-328(1994))及內皮生長抑素(O'Reilly等人，Cell 88：277-285(1996))。

最近幾年中完成的研究已明確血管內皮生長因子(VEGF)在調節正常及異常血管生成中起關鍵作用(Ferrara等人，Endocr.Rev.18：4-25(1997))。即使單個VEGF等位基因缺失亦產生胚胎致死性的觀測結果表明此因子在血管系統之發育及分化中起不可替代之作用(Ferrara等人，前述)。

此外，已展示VEGF為與腫瘤及眼內病症相關之新血管生成的關鍵介體(Ferrara等人，前述)。大多數經檢驗之人類腫瘤過度表現VEGF mRNA(Berkman等人，J Clin Invest 91：153-159(1993)；Brown等人，Human Pathol.26：86-91(1995)；Brown等人，Cancer Res.53：4727-4735(1993)；Mattern等人，Brit.J.Cancer.73：931-934(1996)及Dvorak等人，Am J.Pathol.146：1029-1039(1995))。又，在患有糖尿病性視網膜病及其他局部缺血性相關視網膜病之患者中，眼液中之VEGF濃度與血管增生活躍之存在高度相關(Aiello等人，N.Engl.J.Med.331：1480-1487(1994))。此外，研究已證明在受急性黃斑變性(AMD)侵襲之患者中VEGF於脈絡膜新生血管膜中之定位(Lopez等人，Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855-868(1996))。

VEGF係由組織產生且不必進入循環來發揮其生物效應，而實際上局部充當旁分泌調節劑。Yang等人，J._Pharm.Exp.Ther.284：103(1998)之最近研究發現rhVEGF₁₆₅自循環中之清除極其迅速，其暗示循環中之內源性VEGF很可能為連續合成VEGF之結果。此外，多種研究已嘗試使循環中VEGF之含量與所患腫瘤相關聯且已提出VEGF含量作為潛在性預後標記(Ferrari及Scagliotti,Eur.J.Cancer 32A：2368 (1996)；Gasparini等人，J.Natl.Cancer Inst.89：139(1997)；Kohn,Cancer 80：2219(1997)；Baccala等人，Urology 51：327(1998)；Fujisaki等人，Am.J.Gastroenterol.93：249(1998))。精確量測VEGF之能力明顯將對理解其在許多生物進程(諸如維持血管開放、月經週期、局部缺血、糖尿病、癌症、眼內病症等)中之潛在作用很重要。

文獻報導在正常及患病患者中內源性VEGF之濃度變化較大，其範圍介於不可偵測至高含量之間。量測內源性VEGF含量之能力視敏感性及特異性檢定之可用性而定。已報導用於VEGF之基於比色、化學發光及螢光之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)。Houck等人，前述，(1992)；Yeo等人，Clin.Chem.38：71(1992)；Kondo等人，Biochim.Biophys.Acta 1221：211(1994)；Baker等人，Obstet.Gynecol.86：815(1995)；Hanatani等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.59：1958(1995)；Leith及Michelson,Cell Prolif.28：415(1995)；Shifren等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.81：3112(1996)；Takano等人，Cancer Res.56：2185(1996)；Toi等人，Cancer 77：1101(1996)；Brekken等人，Cancer Res.58：1952(1998)；Obermair等人，Br.J.Cancer 77：1870-1874(1998)；Webb等人，Clin.Sci.94：395-404(1998)。

舉例而言，Houck等人，前述(1992)描述一種似乎具有ng/ml敏感度之比色ELISA，其可能不具有足夠敏感度來偵測內源性VEGF含量。Yeo等人，前述(1992)描述一種兩位點時間分辨免疫螢光檢定，然而在正常血清中未偵測到VEGF(Yeo等人，Cancer Res.53：2912(1993))。Baker等人，前述(1995)使用此免疫螢光檢定之改進形式報導來自孕婦之血漿中之可偵測VEGF含量，且在處於子癇前期之婦女中觀測到更高含量。Anthony等人，Ann.Clin.Biochem.34：276(1997)使用放射免疫檢定報導孕婦中所觀測到之類似數據。Hanatani等人，前述(1995)開發一種能夠量測循環中VEGF的化學發光ELISA且報導來自30個正常個體(男性及女性)之血清中之VEGF含量介於8-36pg/ml之間。Brekken等人，前述(1998)描述使用僅對VEGF或對VEGF：Flk-1複合體具有結合偏好之抗體的ELISA檢定。

一種用於VEGF偵測之ELISA套組可購自R&D Systems(Minneapolis,MN)。該R&D VEGF ELISA套組已用於夾心檢定，其中使用單株抗體捕集靶VEGF抗原且使用多株抗體偵測VEGF。Webb等人，前述(1998)。亦參見例如Obermair等人，前述(1998)。

Keyt等人，J.Biol.Chem.271：7788-7795(1996)；Keyt等人，J.Biol.Chem.271：5638(1996)及Shifren等人，前述(1996)亦開發一種基於雙單株抗體對之比色ELISA。儘管此ELISA能夠偵測癌症患者中之高VEGF含量，但其缺乏量測正常個體中之VEGF內源性含量所需之敏感度。Rodriguez等人，J.Immunol.Methods 219：45(1998)描述一種提供在純血漿或血清中10pg/ml VEGF之敏感度的兩位點螢光VEGF ELISA。然而，此螢光檢定偵測極其完整165/165及165/110種類之VEGF(已報導VEGF 165/165可以蛋白分解方式裂解成三種其他形式：165/110異二聚體、110/110均二聚體及55-胺基酸C末端片段(Keyt等人，J.Biol.Chem.271：7788-7795(1996)；Keck等人，Arch.Biochem.Biophys.344：103-113(1997)))。

因此，存在開發一種診斷及預後檢定的需要，該檢定偵測動物模型或患者之生物試樣中比現有ELISA更高之可量測含量的VEGF且/或可量測不同VEGF同功異型物。

開發用於VEGF作為抗原之抗體夾心ELISA法以便偵測生物試樣中之VEGF形式。本文中所提供之VEGF ELISA能夠偵測110以上之VEGF同功異型物及VEGF片段("VEGF₁₁₀₊")。亦提供其套組。

舉例而言，用於偵測生物試樣中之110以上胺基酸之選擇性血管內皮生長因子(VEGF)形式(VEGF₁₁₀₊)的方法包含以下步驟：(a)使該生物試樣與固定於固體支撐物上之捕集試劑接觸且一起培育，其中該捕集試劑為與抗人類VEGF之抗體5C3識別相同抗原決定基之抗體，該單株抗體與人類VEGF之110以上之殘基特異性結合；(b)將該生物試樣與經固定之捕集試劑中分離；(c)使該經固定之捕集試劑-靶分子複合體與可偵測抗體接觸，該可偵測抗體與VEGF之KDR及/或FLT1受體結合域結合；及(d)使用用於可偵測抗體之偵測工具量測與捕集試劑結合之VEGF₁₁₀₊的含量。在某些實施例中，該可偵測抗體與VEGF 1-110中之抗原決定基結合。在某些實施例中，可進行比較ELISA以偵測不同類型之VEGF。在某些實施例中，自人類受檢者中分離生物試樣(例如腫瘤試樣或腫瘤溶胞物、血漿、血清或尿液等)。

在一實施例中，該捕集試劑為5C3單株抗體。在一實施例中，將經固定之捕集試劑塗佈於微量滴定板上。在某些實施例中，該可偵測抗體為單株抗體。在一實施例中，該可偵測抗體為鼠類單株抗體。在一實施例中，該經固定之單株抗體為MAb 5C3且該可偵測抗體為MAb A4.6.1。在某些實施例中，該可偵測抗體為直接可偵測的。在一實施例中，藉由比色試劑放大可偵測抗體。在一實施例中，該可偵測抗體經生物素標記且偵測工具為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素過氧化酶及3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。

在本發明之某些實施例中，人類受檢者為血管病、糖尿病或癌症患者且量測步驟(d)進一步包含與標準曲線進行比較以便測定與正常個體相比的VEGF含量。

亦提供套組。舉例而言，一種用於偵測在生物試樣中110以上胺基酸之血管內皮生長因子(VEGF)形式(VEGF₁₁₀₊)的免疫檢定套組可包含：(a)作為捕集試劑之抗人類VEGF之抗體，其中該單株抗體與人類VEGF之110以上之殘基特異性結合及(b)作為偵測試劑之可偵測抗體，該抗體與VEGF之KDR及/或FLT1受體結合域結合。在某些實施例中，該可偵測抗體與VEGF 1-110中之抗原決定基結合。在某些實施例中，該套組進一步包含用於捕集試劑之固體支撐物。舉例而言，可將該等捕集試劑固定於固體支撐物(例如微量滴定板)上。在某些實施例中，該套組進一步包含一種用於可偵測抗體之偵測工具(例如比色工具、螢光測定工具等)。在某些實施例中，該套組進一步包含經純化之VEGF作為抗原標準物。在本發明之某些實施例中，可提供另外一或多種VEGF ELISA用於與VEGF₁₁₀₊ ELISA進行比較研究。在一實施例中，該套組包括為鼠類單株抗體MAb 5C3之捕集試劑單株抗體及為MAb A4.6.1之可偵測抗體。

在另一實施例中，本發明提供一種抗VEGF抗體5C3(可自以ATCC編號PTA-7737寄存之融合瘤獲得或由其產生)。本發明亦提供一種不結合VEGF 1-110而與由融合瘤細胞株PTA-7737產生之單株抗體結合相同之VEGF₁₁₀₊抗原決定基的抗體。在某些實施例中，本發明之抗體與可偵測標記物結合。在一實施例中，提供以ATCC寄存編號PTA-7737寄存之融合瘤5C3.1.1。

圖1(圖A、B及C)說明藉由不同VEGF ELISA偵測重組VEGF165、VEGF121(1)(根據製造商R&D systems可能自羧基末端缺少約9個胺基酸之截短形式)、VEGF121(2)(來自Pepro Tech)、VEGF110(藉由纖溶酶消化VEGF所產生之N末端片段)及VEGF8-109(具有VEGF165之胺基酸8-109的人造VEGF)分子。(A)ELISA A使用3.5F8來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1來偵測。(B)ELISA B使用A4.6.1來塗佈且使用經生物素標記之2E3來偵測。(C)ELISA C使用5C3來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1來偵測。

圖2說明使用3.5F8(左)或A4.6.1(右)探測由A673細胞產生之VEGF 的蛋白質轉漬。試樣為由A673細胞之改良性培養基使用A4.6.1親和柱純化之VEGF(色帶1)及重組VEGF蛋白VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁(根據製造商R&D systems自羧基末端可能缺少約9個胺基酸)及由大腸桿菌產生之VEGF8-109(分別為色帶2、3及4)。

圖3說明VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁及VEGF₁₁₀(藉由纖溶酶消化VEGF所產生之N末端片段)之簡圖，其展示三種VEGF ELISA中所用抗體之建議結合位點。

定義

在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明並不侷限於特定組合物或生物系統，其當然可有所不同。亦應瞭解本文中所用術語僅為達成描述特定實施例之目的且不意欲具有限制性。如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非內容另外明確規定，否則單數形式"一"及"該"包括複數指示物。因此，舉例而言，"一分子"視情況包括兩個或兩個以上該等分子之組合及其類似情況。

如本文中所用，術語"VEGF"係指165個胺基酸之血管內皮細胞生長因子及相關之121個、145個、189個及206個胺基酸之血管內皮生長因子(如由Leung等人，Science 246：1306(1989)、Houck等人，Mol.Endocrin.5：1806(1991)及Neufeld等人，前述所描述)以及彼等生長因子之天然存在的等位基因形式及加工形式。亦參見(例如)美國專利第6,057,428號之圖1A及B。可由ECM結合之VEGF藉由纖溶酶裂解而釋放活性VEGF片段以產生前110個胺基酸(參見例如Keyt BA等人：The carboxyl-terminal domain(111-165)of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency.J Biol Chem.271：7788-7795(1996))。如本文中所用，"VEGF₁₁₀₊"係指110以上胺基酸(自N末端)但不包括前110個胺基酸或較小片段(例如VEGF_8-109)的VEGF片段。

以最廣泛意義使用術語"偵測"以便包括靶分子之定性及定量量測。在一態樣中，如本文所述之偵測方法僅僅用以鑑別VEGF₁₁₀₊或VEGF於生物試樣中之存在。在另一態樣中，該方法用以測試試樣中之VEGF₁₁₀₊或VEGF是否處於可偵測含量下。在又一態樣中，該方法可用於量化試樣中VEGF₁₁₀₊或VEGF的量且進一步比較來自不同試樣之VEGF₁₁₀₊或VEGF含量。

術語"生物試樣"係指來自任何動物之身體試樣，但較佳係來自哺乳動物，更佳來自人類。在某些實施例中，該生物試樣係來自血管病、糖尿病或癌症患者。該等試樣包括生物液，諸如血清、血漿、玻璃狀液、淋巴液、滑液、濾泡液、精液、羊水、乳液、全血、尿液、腦脊髓液、唾液、痰、眼淚、汗、黏液、腫瘤溶胞物及組織培養基以及組織提取物，諸如均化組織、腫瘤組織及細胞提取物。在某些實施例中，該試樣為來自任何動物之身體試樣，在一實施例中其係來自哺乳動物，在一實施例中其係來自人類受檢者。在一實施例中，該生物試樣係來自臨床患者。

術語"可偵測抗體"係指能夠直接經由以偵測工具放大之標記或間接經由(例如)另一經標記之抗體而偵測的抗體。對於直接標記而言，該抗體通常與可以某種工具偵測之部分結合。在一實施例中，該可偵測抗體為經生物素標記之抗體。

術語"偵測工具"係指在本文中之ELISA中用以偵測可偵測抗體之存在的部分或技術且包括放大經固定之標記物(諸如微量滴定板上所捕集之標記物)的偵測劑。在一實施例中，該偵測工具為比色偵測劑，諸如抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素-HRP。

術語"捕集試劑"係指能夠結合且捕集試樣中之靶分子使得在適宜條件下捕集試劑-靶分子複合物可與試樣之其餘部分分離的試劑。一般而言，該捕集試劑經固定或可固定。在夾心免疫檢定中，該捕集試劑較佳為抗靶標抗原之抗體或不同抗體之混合物。

本文中以最廣泛意義使用術語"抗體"且尤其涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段(只要其顯示所需生物活性)。

"抗體片段"包含完整抗體之一部分，較佳包含完整抗體之抗原結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子及由抗體片段形成之多特異性抗體。

為達成本文中之目的，"完整抗體"為包含重鏈及輕鏈可變域以及Fc區域之抗體。

"原生抗體"通常為約150,000道爾頓之異四聚醣蛋白，其包含兩條相同輕(L)鏈及兩條相同重(H)鏈。各輕鏈與重鏈由一共價雙硫鍵鍵聯，而雙硫鍵數目在不同免疫球蛋白同型之重鏈中有所不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔開之鏈內雙硫橋。各重鏈在一末端處具有一可變域(V_H)，接著為大量恆定域。各輕鏈在一末端處具有一可變域(V_L)且在其另一末端處具有一恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且該輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界面。

如本文中所用，術語"單株抗體"係指一種獲自大體上均質之抗體群體的抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然存在之突變外為相同的。單株抗體具有高度特異性，其針對單個抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單個決定子。除其特異性之外，該等單株抗體的有利之處在於其係由未受其他免疫球蛋白污染之融合瘤培養物合成。修飾語"單株"表明抗體係獲自大體上均質之抗體群體的性質且不應理解為需要藉由任何特殊方法來產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可由Kohler等人，Nature,256：495(1975)首次描述之融合瘤法製造或可由重組DNA法(參見例如美國專利第4,816,567號)製造。舉例而言，"單株抗體"亦可使用Clackson等人Nature 352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中所描述之技術自噬菌體抗體庫中分離。

本文中之單株抗體尤其包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白)以及該等抗體之片段(只要其顯示所需生物活性)，在該等抗體中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源，而該(等)鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列相同或同源(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文中所關注之嵌合抗體包括包含源自非人類靈長類(例如舊大陸猴(Old World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或獼猴)之可變域抗原結合序列及人類恆定區序列的"靈長化"抗體(美國專利第5,693,780號)。

非人類(例如鼠類)抗體之"人源化"形式為含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。人源化抗體在很大程度上為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體之高變區之殘基經來自諸如小鼠、大鼠、兔或具有所需特異性、親和性及能力之非人類靈長類之非人類物種(供體抗體)之高變區之殘基置換。在某些情況下，人免疫球蛋白之構架區(FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進一步進行該等修飾以改進抗體效能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之大體上所有抗體，其中所有或大體上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環且所有或大體上所有FR為人免疫球蛋白序列之FR。人源化抗體視情況亦將包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，通常為人免疫球蛋白恆定區之至少一部分。欲知詳情，參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-329(1988)及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。在一實施例中，提供人源化5C3抗體且用於本文中所提供之方法。

術語"可變"係指可變域之某些部分之序列在抗體中廣泛不同且用於各特定抗體對於其特定抗原之結合性及特異性。然而，該可變性並非均勻分布於整個抗體可變域中。其集中於輕鏈與重鏈可變域中之三個稱為高變區的區段中。可變域之更高度保守部分稱作構架區(FR)。原生重鏈及輕鏈之可變域各包含四個主要採用β摺疊構型、由三個高變區(其形成環連接且在某些情況下形成β摺疊結構之一部分)連接之FR。各鏈中之高變區由FR而緊密結合在一起，且與另一鏈之高變區一起促進形成抗體之抗原結合位點(參見Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定域並不直接與抗體結合抗原有關，但顯示各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。

抗體之番木瓜蛋白酶消化作用產生兩個稱為"Fab"片段之相同抗原結合片段，每一片段各具有單一抗原結合位點及殘餘"Fc"片段(其名稱反映其具有易於結晶之能力)。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠與抗原交聯之F(ab')₂片段。

"Fv"為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體片段。此區域由緊密非共價結合之一重鏈可變域與一輕鏈可變域之二聚體組成。在該構型中，各可變域之三個高變區相互作用以界定一在V_H-V_L二聚體表面上之抗原結合位點。總而言之，六個高變區賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單個可變域(或僅包含三個具有抗原特異性之高變區的半個Fv)亦具有識別且結合抗原之能力，儘管其結合親和力低於整個結合位點。

Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於在重鏈CH1域之羧基末端處添加少許殘基(包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸)。Fab'-SH為本文中對於恆定域之該(等)半胱胺酸殘基帶有至少一個自由硫醇基之Fab'的名稱。最初以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab'片段對的形式產生F(ab')₂抗體片段。亦已知抗體片段之其他化學偶合。

來自任何脊椎動物物種之抗體(免疫球蛋白)之"輕鏈"可基於其恆定域之胺基酸序列歸屬於兩種截然不同類型(稱為κ及λ)中之一者。

視其重鏈之恆定域的胺基酸序列而定，抗體可分成不同類別。存在5個主要完整抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之若干者可進一步分為子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同抗體類別之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同免疫球蛋白類別之次單位結構及三維構型為熟知的。

"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體之V_H及V_L域，其中該等域以單個多肽鏈形式存在。Fv多肽較佳進一步於V_H與V_L域之間包含多肽連接子以便使scFv能夠形成用於抗原結合之所需結構。對於scFv之評述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。

術語"高變區"當用於本文中時係指引起抗原結合之抗體的胺基酸殘基。高變區包含來自"互補判定區"或"CDR"之胺基酸殘基(例如輕鏈可變域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)及重鏈可變域中之殘基31-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))及/或來自"高變環"之殘基(例如輕鏈可變域中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域中之殘基26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。"構架"或"FR"殘基為除如本文中所定義之高變區殘基以外的可變域殘基。

用於治療目的之"哺乳動物"係指任何歸類為哺乳動物之動物，包括人類、家畜及農畜及動物園動物、體育競技動物或寵物，諸如狗、馬、貓、綿羊、豬、牛等。哺乳動物較佳為人類。

術語"癌症"、"癌性"及"惡性"係指或描述哺乳動物之通常以不受調節之細胞生長為特徵的生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤，包括腺癌、淋巴瘤、母細胞瘤、黑色素瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胃腸基質癌、胰腺癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌(例如肝癌及肝細胞瘤)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰門癌、甲狀腺癌、基底細胞癌、睾丸癌、食道癌、肝癌、軟組織肉瘤、卡波氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、類癌、間皮瘤、多發性骨髓瘤及各種類型之頭部及頸部癌症、以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)(NHL)；小淋巴球性(SL)NHL；中級/濾泡性NHL；中級彌漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小型無裂細胞NHL；龐大疾病NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS-相關淋巴瘤；及瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))；霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞白血病及移植後淋巴組織增生病症(PTLD)以及與母斑病相關之異常血管增生、水腫(諸如與腦腫瘤相關之水腫)及梅格症候群(Meigs' syndrome)。

短語"血管"及"心血管"可互換使用且描述具有刺激血管生成及/或心血管形成之指征及抑制血管生成及/或心血管化之指征的患者。該等病症包括(例如)動脈疾病，諸如動脈粥樣硬化、高血壓、發炎性脈管炎、雷諾病(Reynaud's disease)及雷諾現象、動脈瘤及動脈再狹窄；靜脈及淋巴病症，諸如血栓性靜脈炎、淋巴管炎及淋巴水腫；及其他血管性病症，諸如周邊血管疾病、AMD；癌症，諸如血管腫瘤，例如血管瘤(微細管型及海綿狀)、血管球瘤、毛細管擴張症、桿菌性血管瘤病、血管內皮瘤、血管肉瘤、血管外皮細胞瘤、卡波氏肉瘤、淋巴管瘤及淋巴管肉瘤；腫瘤血管生成；損傷，諸如創傷、燒傷及其他組織損傷；植入物固定、劃傷、缺血再灌注損傷、類風濕性關節炎、腦血管疾病、諸如急性腎衰竭之腎疾病及骨質疏鬆症。其將亦包括心絞痛、諸如急性心肌梗塞之心肌梗塞、心臟肥大及諸如充血性心臟衰竭(CHF)之心臟衰竭。

術語"糖尿病"係指涉及胰島素之產生或利用不充分之糖代謝的進行性疾病且以高血糖症及糖尿為特徵。該術語包括糖尿病之所有形式，諸如I型及II型糖尿病及抗胰島素糖尿病，諸如門登荷爾氏症候群(Mendenhall's Syndrome)、沃納症候群(Werner Syndrome)、矮妖精貌症候群(leprechaunism)、脂肪萎縮性糖尿病及其他脂肪萎縮。

術語"親和純化"係指藉由經由親和性層析管柱溶離來純化物質。

ELISA

血管內皮生長因子(VEGF)為均二聚醣蛋白且為腫瘤發展期間及在與腫瘤相關之病理性血管生成中血管形成之關鍵血管生成因素。回應於低氧及(可能)諸如生長因子、激素及致癌基因之其他因子，VEGF之表現得以增強。(參見例如Ferrara N：Vascular endothelial growth factor：Basic science and clinical progress. Endocrine Reviews 25：581-611(2004))。人類VEGF基因具有8個由內含子分離之外顯子。替代性RNA拼接引起產生至少四種具有121、165、189及206個胺基酸單體之主要同功異型物(參見例如Houck KA等人：The vascular endothelial growth factor family：identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 5：1806-1814(1991)及TischerE等人：The human gene for vascular endothelial growth factor.Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing.J Biol Chem 266：11947-11954(1991))。亦已報導較少見之同功異型物，包括具有145個胺基酸單體之同功異型物(參見例如Poltorak Z.等人：VEGF145,a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix.J Biol Chem 272：7151-7158(1997))及具有183個胺基酸單體之同功異型物(參見例如Jingjing L等人：Human Muller cells express VEGF183,a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor.Invest Ophthalmol Vis Sci 40：752-759(1999))。所有VEGF同功異型物結合兩種受體酪胺酸激酶，VEGFR-1(參見例如De Vries C等人：The fms-like tyrosine kinase,a receptor for vascular endothelial growth factor.Science_255：989-991(1992))及VEGFR-2(參見例如Terman BI等人：Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase.Oncogene 6：1677-1683(1991))。VEGF₁₆₅亦與神經漿(neuropilin)相互作用(參見例如Soker S.等人：Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor.Cell 92：735-745(1998))。VEGF₁₈₉及VEGF₂₀₆與肝素以較高親和力結合且大部分鉗合於細胞外基質(ECM)中。VEGF₁₆₅與肝素以中等親和力結合且具有部分可溶性且與細胞表面及ECM部分結合。VEGF₁₂₁並不與肝素結合且為易溶的。藉由反轉錄-PCR分析發現在乳癌及卵巢癌腫瘤試樣及細胞株中VEGF₁₂₁及VEGF₁₆₅為最具顯性表現之變異體，而未偵測到VEGF₂₀₆表現。發現VEGF₁₈₃及VEG₁₈₉表現在細胞株中不可偵測或處於較低水準且在某些腫瘤試樣中得以偵測(參見例如Stimpfl M等人：Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer.Clinical Cancer Research 8：2253-2259(2002))。

可由ECM-結合之VEGF藉由纖溶酶裂解而釋放活性VEGF片段以產生前110個胺基酸(參見例如Keyt BA等人，The carboxyl-terminal domain(111-165)of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency.J Biol Chem.271：7788-7795(1996))。其可能為在血管生成之生理性及病理性過程期間局部調節VEGF之生物可用性的機制。參見例如Houck KA等人，Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms.J Biol Chem 1992；267：26031-26037(1992)；Keyt BA等人，The carboxy-terminal domain(111-165)of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency.J Biol Chem.271：7788-7795(1996)及Roth D等人，Plasmin modulates vascular endothelial growth factor-A-mediated angiogenesis during wound repair.Am Pathology 168：670-684.(10-12)(2006)。然而，尚未報導生物試樣中之VEGF₁₁₀濃度。亦可由ECM-結合之VEGF藉由基質金屬蛋白酶(MMP)裂解而釋放活性VEGF片段。其由在來自卵巢癌患者之腹水中觀測到經裂解之具有1-110以外胺基酸之VEGF片段而加以證實。在腹水中亦偵測到纖溶酶與MMP3。參見例如Lee S,Shahla MJ等人，Processing of VEGF-A by matrix metalloproteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors.J Cell Biology 169：681-691(2005)。

用於各種抗原之酶聯免疫吸附檢定(ELISA)包括基於比色法、化學發光及螢光法之酶聯免疫吸附檢定。ELISA已成功用於測定血漿及尿液試樣中之低量之藥物及其他抗原組份，其不涉及提取步驟且執行簡單。本文中所述之檢定為利用抗體作為VEGF及VEGF₁₁₀₊之捕集試劑及可偵測抗體的ELISA。在某些實施例中，該ELISA係以細胞為基礎。在檢定之第一步驟中，將懷疑含有VEGF或含有VEGF₁₁₀₊之生物試樣與捕集(或塗佈)抗體接觸且一起培育以使得該等捕集抗體捕集或結合VEGF或VEGF₁₁₀₊使得其可在偵測步驟中得以偵測。偵測步驟涉及使用可偵測抗體，該可偵測抗體當與經結合之VEGF或VEGF₁₁₀₊之任一者接觸時與所關注之蛋白質(若存在)結合且使用偵測工具偵測抗體上之標記物且由此偵測VEGF或VEGF₁₁₀₊之存在或存在之量。該ELISA可與識別整個VEGF(例如美國專利第6,855,508號；本文中所述之VEGF及此項技術中已知之VEGF)或VEGF之同功異型物以判定VEGF存在類型的ELISA進行比較。

舉例而言，在某些實施例中，該檢定利用以下步驟。

第一步驟

在本文中之檢定之第一步驟中，使該生物試樣與經固定之捕集(或塗佈)試劑接觸且一起培育，該試劑為抗VEGF單株抗體。該抗體可來自任何物種，但該單株抗體較佳為鼠類或大鼠單株抗體，更佳為鼠類單株抗體，且最佳為源自本文中所鑑別之融合瘤的MAb 5C3。因此，在一特定較佳實施例中，該經固定之單株抗體為鼠類單株抗體，最佳為MAb 5C3。通常藉由使捕集試劑在檢定程序之前不可溶，如藉由吸附至水不溶性基質或表面(美國專利第3,720,760號)或非共價或共價偶合(例如如美國專利第3,645,852號或Rotmans等人，J.Immunol. Methods 57：87-98(1983)中所述在伴以或不伴以用(例如)硝酸及還原劑預先活化支撐物的情況下使用戊二醛或碳化二醯亞胺交聯)或此後(例如)藉由免疫沈澱來實現固定。

用於固定之固相可為基本上不溶於水且適用於免疫檢定之任何惰性支撐物或載體，包括呈(例如)表面、顆粒、多孔基質等形式之支撐物。通常所用之支撐物之實例包括小薄片、葡聚糖凝膠(Sephadex)、聚氯乙烯、塑膠珠粒及由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯及其類似物製成之檢定板或試管(包括96孔微量滴定板)，以及微粒物質，諸如濾紙、瓊脂糖、交聯葡聚糖及其他多醣。或者，適當採用反應性水不溶性基質(諸如經溴化氰活化之醣類)及美國專利第3,969,287號、第3,691,016號、第4,195,128號、第4,247,642號、第4,229,537號及第4,330,440號中所描述之反應性受質用於捕集試劑固定化。在一實施例中，將經固定之捕集試劑塗佈於微量滴定板上，且詳言之所用較佳固相為可用於一次分析多個試樣之多孔微量滴定板，例如微量96孔ELISA板，諸如以Nune Maxisorb或Immulon銷售者。在某些實施例中，該板為MICROTEST^TM或MAXISORP^TM 96孔ELISA板，諸如以NUNC MAXISORB^TM或IMMULON^TM銷售者。

將該固相以如以上所定義之捕集試劑塗佈，兩者視需要可由非共價或共價相互作用或物理鍵而鍵聯。連接技術包括美國專利第4,376,110號及其中所引用之參考文獻中所描述的技術。若為共價連接，則將該板或其他固相與交聯劑連同捕集試劑在此項技術中所熟知之條件(例如在室溫下歷時1小時)下一起培育。

通常用於連接捕集試劑至固相受質之交聯劑包括(例如)1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯乙烷、戊二醛；N-羥基-丁二醯亞胺酯，例如與4-疊氮基-水楊酸之酯；同型雙官能亞胺基酯，包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫雙-(丁二醯亞胺基-丙酸酯)；及雙官能馬來醯亞胺，諸如雙-N-馬來醯亞胺基-1,8-辛烷。諸如甲基-3-[(對疊氮基苯基)-二硫基]丙醯亞胺酯之衍生化劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光敏化中間物。

若使用96孔板，則通常將其以捕集試劑(通常藉由在約4-20℃或約4-8℃之溫度下且在約8-12或約9-10或約9.6之pH值下培育至少約10小時、更佳至少隔夜來稀釋於諸如0.05M碳酸鈉之緩衝液中)塗佈。若需要更短塗佈時間，則可在室溫下塗佈(例如)96孔板兩小時。可較久地先於檢定本身而堆疊且塗佈該等板，且隨後可同時對多個試樣以手動、半自動或自動方式諸如藉由使用機器人進行檢定。

隨後通常將經塗佈之板以阻斷劑處理，該阻斷劑與結合位點非特異性結合且使其飽和以防止在板孔上自由配位體與過多位點之不當結合。為達此目的之適當阻斷劑之實例包括(例如)明膠、牛血清白蛋白、卵白蛋白、酪蛋白及脫脂乳。通常在環境溫度下歷時約1-4小時、較佳約1至3小時或在0-4℃下隔夜的條件下進行阻斷處理。

在塗佈且阻斷後，將經適當稀釋之待分析之VEGF標準物(經純化之VEGF)或生物試樣添加至固定相中。較佳稀釋率為按體積計約1-15%、較佳約10%。為達此目的，可用於稀釋之緩衝液包括(a)含有0.5% BSA、0.05% TWEEN 20^TM清潔劑(P20)、0.05% PROCLIN^TM 300抗生素、5mM EDTA、0.25% Chaps界面活性劑、0.2% β-γ球蛋白及0.35M NaCl之PBS，pH值為7.4；(b)含有0.5%牛血清白蛋白、0.05%聚山梨醇酯20、5mM EDTA、0.25% CHAPS、0.2%牛γ-球蛋白及0.35M NaCl之PBS，pH值為7.4；(c)含有0.5% BSA、0.05%聚山梨醇酯20(P20)及0.05% PROCLIN^TM 300之PBS，pH值為7；(d)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN^TM 300、5mM EDTA及0.35M NaCl之PBS，pH值為6.35；(e)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN^TM 300、5mM EDTA、0.2% β-γ球蛋白及0.35M NaCl之 PBS，pH值為7.4；及(f)含有0.5% BSA、0.05% P20、0.05% PROCLIN^TM 300、5mM EDTA、0.25% Chaps及0.35M NaCl之PBS，pH值為7.4。PROCLIN^TM 300用作防腐劑且TWEEN 20^TM用作清潔劑以消除非特異性結合。

儘管捕集試劑濃度將通常由VEGF之所關注濃度範圍來確定(考慮生物試樣之任何必要稀釋)，但通常將憑經驗確定捕集試劑之最終濃度以便使在所關注範圍內檢定敏感度最大。

選擇試樣及經固定之捕集試劑的培育條件以便使檢定敏感度最大且使解離最小。較佳地，在約0℃至約40℃、較佳約20至25℃範圍內之相當恆定溫度下實現培育。培育時間主要視溫度而定，通常不超過約10小時以避免檢定不敏感。培育時間較佳為在室溫下約0.5至3小時且更佳為1.5-3小時以便使自由VEGF₁₁₀₊或VEGF與捕集試劑之結合最大。若添加蛋白酶抑制劑以防止生物流體中之蛋白酶使VEGF降解，則培育持續時間可能較長。

在此階段，培育混合物之pH值將通常在約4-9.5之範圍內、較佳在約6-9、更佳約7-8之範圍內且檢定(ELISA)稀釋液之pH值最佳為pH 7.4。選定培育緩衝液之pH值以便保持顯著水準之捕集試劑與待捕集之VEGF₁₁₀₊或VEGF的特異性結合。可使用各種緩衝液以在該步驟期間獲得且保持所需pH值，其包括硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、Tris-HCl或Tris-磷酸鹽、乙酸鹽、巴比妥(barbital)及其類似物。所用特定緩衝液並不為本發明之關鍵，但在個別檢定中一種緩衝液可能優於另一種緩衝液。

第二步驟

在本文中之檢定法之第二步驟(可選)中，將生物試樣與經固定之捕集試劑分離(較佳藉由洗滌)以移除未捕集之分子。用於洗滌之溶液通常為具有使用以上對於培育步驟所述之考慮因素及緩衝液所確定之 pH值的緩衝液("洗滌緩衝液")，且較佳pH值範圍為約6-9。可洗滌3次或3次以上。洗滌溫度通常為冷藏室溫度至中等溫度，且在檢定期間保持通常約0-40℃、更佳約4-30℃之恆溫。舉例而言，可在洗滌之前將洗滌緩衝液置於儲液器中4℃下之冰中且對於該步驟可使用板洗滌劑。若擔心經捕集之VEGF₁₁₀₊或VEGF可能在後續步驟中產生某種程度之解離，則在此階段亦可添加交聯劑或其他合適試劑以便使已結合之VEGF₁₁₀₊或VEGF與捕集試劑共價連接。

第三步驟

在下一步驟中，使經固定之捕集試劑較佳在約20-40℃、更佳約20-25℃之溫度下與可偵測抗體接觸，且對於兩者接觸之精確溫度及時間主要視所用偵測工具而定。舉例而言，當將抗生蛋白鏈菌素過氧化酶及3,3',5,5'-四甲基聯苯胺用作偵測工具時，例如在一實施例中進行接觸(例如約1小時或更長時間)以便使信號放至最大。較佳將相對於所預期之最大自由VEGF₁₁₀₊或VEGF濃度(如上所述)莫耳過量之抗體添加至經洗滌之板中。此抗體為直接或間接可偵測的。儘管可偵測抗體可為多株或單株抗體，但(例如)在某些實施例中其為單株抗體，在一實施例中其為鼠類單株抗體且在一實施例中為MAb A4.6.1。可偵測抗體亦可為直接可偵測的，且在一實施例中其具有比色標記物，且在另一實施例中其具有螢光測定標記物。更佳地，該可偵測抗體經生物素標記且偵測工具為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素過氧化酶及3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。該偵測工具之讀數可為螢光測定讀數或比色讀數。抗體之親和力必須足夠高以便偵測少量自由VEGF₁₁₀₊或VEGF，但若不夠高則將導致VEGF₁₁₀₊或VEGF自捕集試劑中脫離。

第四步驟

在檢定法之最後步驟中，使用用於可偵測抗體之偵測工具量測已與捕集試劑結合之自由VEGF的含量。若生物試樣係來自血管病、糖尿病或癌症患者，則量測步驟較佳包含將由以上三個步驟所產生之反應與標準曲線比較以便測定與正常個體相比之VEGF₁₁₀₊或VEGF含量，或較佳包含將由以上三個步驟所產生之反應與另一識別不同同功異型物或整個VEGF之VEGF ELISA比較以便測定當比較該等ELISA且視情況與正常個體相比時該等類型VEGF的含量。

抗體產生

通常藉由多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射VEGF及佐劑來增加動物中VEGF之多株抗體。其可適用於使用雙官能或衍生化劑(例如馬來醯亞胺苄醯基磺酸琥珀醯亞胺酯(經由半胱胺酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(經由離胺酸殘基結合)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl₂或其中R及R1為不同烷基之R1N=C=NR)使VEGF或含有靶胺基酸序列之片段與對欲免疫之物種具有免疫原性之蛋白質(例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)結合。

用作塗佈或可偵測抗體之抗體可獲自任何適當脊椎動物來源，諸如鼠類、靈長類、兔類、山羊類、野兔類、大鼠類、雞類、牛類、羊類、馬類、犬類、貓類或豬類。如(例如)美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851(1984)；Neuberger等人，Nature 312：604(1984)；Takeda等人，Nature 314：452(1985)及1998年10月15日公開之WO 98/45331以及以上所闡明之附加參考文獻中所述，亦可使用嵌合或人源化抗體。

可藉由將1mg或1μg結合物(分別用於兔或小鼠)與3體積弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)組合且在多處皮內注射該溶液來使動物對免疫原性結合物或衍生物免疫。一個月後，以1/5至1/10最初量之於弗氏不完全輔劑中之結合物藉由在多處進行皮下注射來對該等動物進行補充。7至14天後，對動物進行放血且檢定血清之抗VEGF力價。對動物進行補充直至力價平穩。較佳地，以VEGF之結合物(但結合於不同蛋白質及/或經由不同交聯劑結合)來對動物進行補充。結合物亦可在重組細胞培養物中製備為蛋白質融合物形式。諸如礬之凝聚劑亦適用於增強免疫反應。產生多株抗體之方法描述於許多免疫學教科書中，諸如Davis等人，Microbiology，第三版(Harper & Row,New York,New York,1980)。

藉由自經免疫之動物回收脾臟細胞且以習知方式使細胞永生化(例如藉由與骨髓瘤細胞融合或藉由Epstein-Barr病毒轉化)且篩檢表現所需抗體之純系來製備單株抗體。參見例如Kohler及Milstein Eur.J.Immunol.6：511(1976)。單株抗體或單株抗體之抗原結合區(諸如Fab或(Fab)₂片段)可或者藉由重組方法製造。

合適抗體之實例包括已用於對於所討論之蛋白質之已知RIA中的抗體，例如如本文引言中所給出之參考文獻中所述之針對VEGF的抗體。

在某些實施例中，使用可由以ATCC編號PTA-7737寄存之融合瘤獲得或由其產生之抗VEGF抗體5C3，且視情況與另一抗VEGF抗體A4.6.1一起使用。本發明亦提供一種不結合VEGF 1-110而與由融合瘤細胞株PTA-7737所產生之單株抗體所結合相同之VEGF₁₁₀₊抗原決定基的抗體。提供以ATCC寄存編號PTA-7737寄存之融合瘤5C3.1.1。

偵測

添加至經固定之捕集試劑中之抗體將被直接標記或藉由在洗去過量第一抗體之後添加莫耳過量之針對第一抗體之動物物種之IgG的第二標記抗體來間接偵測。在後者(間接檢定)中，將抗第一抗體之經標記之抗血清添加至試樣中以便就地產生經標記之抗體。

用於第一或第二抗體之標記物為不干擾自由VEGF₁₁₀₊或VEGF與抗體結合之任何可偵測官能基。合適標記物之實例為已知用於免疫檢定之許多標記物，包括可直接偵測之部分(諸如螢光染料、化學發光標記物及放射性標記物)以及必須經反應或衍生化而得以偵測之部分(諸如酶)。該等標記物之實例包括放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H及¹³¹I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、羅丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯基、傘形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌性螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與使用過氧化氫使染料前軀物氧化之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白鏈菌素、生物素/抗生蛋白鏈菌素-β-半乳糖苷酶以及MUG、自旋標記物、噬菌體標記物、穩定自由基及其類似物。如上所述，螢光偵測為一實例。

可採用習知方法使該等標記物與蛋白質或多肽共價結合。舉例而言，偶合劑(諸如二醛、碳化二醯亞胺、二馬來醯亞胺、雙醯亞胺酯、雙重氮化聯苯胺及其類似物)可連同上述螢光標記物、化學發光標記物及酶標記物一起用於標記抗體。參見例如美國專利第3,940,475號(螢光測定法)及3,645,090(酶法)；Hunter等人，Nature 144：945(1962)；David等人，Biochemistry 13：1014-1021(1974)；Pain等人，J.Immunol.Methods 40：219-230(1981)；及Nygren,J.Histochem.及Cytochem.30：407-412(1982)。在某些實施例中，本文中之標記物為使放大率及敏感度增加至8pg/ml之螢光物質，更佳為用於放大該信號之具有抗生蛋白鏈菌素-β-半乳糖苷酶及MUG的生物素。在某些實施例中，例如當可偵測抗體經生物素標記且偵測工具為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素過氧化酶及3,3',5,5'-四甲基聯苯胺時使用比色標記物。

該標記物(包括酶)與抗體之結合為一般熟習免疫檢定技術者之標準操作程序。參見例如O'Sullivan等人，"Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay",Methods in Enzymology,J.J.Langone及H.Van Vunakis編，第73卷(Academic Press,New York,New York,1981)，第147-166頁中。

添加最後經標記之抗體之後，藉由經由洗滌移除過量未結合之標記抗體且隨後使用適用於標記物之偵測方法量測所連接標記物之量，且使所量測量與生物試樣中自由VEGF₁₁₀₊或VEGF之量相關聯來測定經結合之抗體的量。舉例而言，在酶之情況下，顯現且量測之顏色量將為VEGF₁₁₀₊或VEGF之存在量的直接度量。具體言之，若HRP為標記物，則使用受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺在450nm吸光率下偵測顏色。

在一實例中，在將針對第一未標記之抗體的經酶標記之第二抗體自固定相中洗出後，藉由將經固定之捕集試劑與酶受質一起培育來顯現且量測顏色或化學發光。隨後藉由與由平行操作之標準VEGF所產生之顏色或化學發光相比較來計算自由VEGF₁₁₀₊或VEGF濃度之量。

套組

為方便起見，可以套組形式提供本發明之檢定方法。該套組為經封裝之組合，其包括以下基本成分：(a)捕集試劑，其包含抗人類VEGF分子之單株抗體，其中該單株抗體識別VEGF₁₁₀₊；及(b)偵測試劑，其包含與VEGF之KDR及FLT1受體結合域結合之可偵測(經標記或未標記)抗體。該等基本成分係如上文所定義。在某些實施例中，該等偵測試劑包含與VEGF1-110之抗原決定基結合的可偵測抗體。

該套組較佳進一步包含一用於捕集試劑之固體支撐物，該固體支撐物可以獨立成分或上面已固定有捕集試劑之形式提供。因此，套組中之捕集抗體可固定於固體支撐物上，或其可固定於套組所包括或與套組獨立提供之該支撐物上。

較佳將該等捕集試劑塗佈於微量滴定板上。偵測試劑可為直接偵測之經標記抗體或由針對不同物種中所產生之未標記抗體之經標記抗體偵測的未標記抗體。當標記物為酶時，該套組將通常包括酶所需之受質及輔因子且當標記物為螢光團時，則包括提供可偵測發色團之染料前軀物。當偵測試劑未經標記時，該套組可進一步包含用於可偵測抗體之偵測工具，諸如針對未標記抗體之經標記抗體，較佳呈螢光偵測形式。當標記物為酶時，該套組將通常包括酶所需之受質及輔因子，當標記物為螢光團時，則包括提供可偵測發色團之染料前軀物，且當標記物為生物素時，則包括抗生物素蛋白，諸如抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或與HRP或β-半乳糖苷酶及MUG結合之抗生蛋白鏈菌素。

在一特定實施例中，捕集試劑為單株抗體，較佳為齧齒動物單株抗體，更佳為鼠類或大鼠單株抗體，甚至更佳為鼠類單株抗體且最佳為MAb 5C3。在某些實施例中，可偵測抗體亦為經生物素標記之單株抗體，該單株抗體為齧齒動物單株抗體，更佳為鼠類或大鼠單株抗體，甚至更佳為鼠類單株抗體，仍更佳為MAb A4.6.1。在某些實施例中，該捕集試劑固定於該套組中。

在某些實施例中，該套組可含有用於如本文所述之比較研究的多種ELISA以便偵測各種形式之VEGF及VEGF₁₁₀₊。

該套組亦通常含有對於執行檢定之用法說明書及/或作為抗原標準物之VEGF(例如經純化之VEGF、較佳以重組方式產生之VEGF及VEGF110)以及其他添加劑，諸如穩定劑、洗滌及培育緩衝液及其類似物。

VEGF之標準物之實例為哺乳動物細胞中所產生之重組人類VEGF，其可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California及本文中所述之公司及方法獲得。

套組之組份將以預定比率提供且各種試劑之相對量適當變化以提供實質上使檢定敏感度最大之試劑溶液濃度。特定言之，該等試劑可以包括賦形劑之乾粉(通常經凍乾)形式提供，其溶解後即將提供具有適合於與待測試試樣結合之濃度的試劑溶液。

物質寄存

以下物質已寄存於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection),10801 University Boulevard,Manassas,VA.20110-2209,USA(ATCC)：5C3.1.1以2006年7月19日寄存之寄存編號PTA-7737寄存於ATCC。

依據有關出於專利程序目的之微生物寄存國際公約(International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)之布達佩斯條約(Budapest Treaty)及其下法規(布達佩斯條約)之規定進行寄存。其確保自寄存之日起30年內維持寄存培養物有活力。寄存將可由ATCC根據布達佩斯條約之條款進行且受Genentech,Inc.與ATCC之間的協定約束，其確保一旦相關美國專利頒布後或一旦任何美國或國外專利申請案公諸於眾後(無論何種情況先發生)公眾可永久且無限制地利用該寄存培養物之子代且確保由美國專利與商標局委員根據35 USC § 122及遵循其之委員規則(包括37 CFR § 1.14，特別參考886 OG 638)確定有資格者可利用此子代。

本申請案之受讓人已同意，若寄存物質之培養物萬一在適宜條件下培養時死亡或遺失或破壞，則該等物質將立即根據通告以另一相同者替換。寄存物質之可用性不應理解為許可在違反任何政府當局根據其專利法所授予之權利的情況下實施本發明。

認為本說明書足以使熟習此項技術者能夠實施本發明。因為所寄存之實施例意欲作為本發明之某些態樣之單個說明且任何功能上等效之構築體處於本發明之範疇內，所以本發明範疇不受所寄存之構築體的限制。本文中之物質之寄存並不認可書面描述不足以使本發明之任何態樣(包括其最佳態樣)的實施可行，亦不應將其視為將申請專利範圍的範疇限制於其提出之特定說明。實際上，除彼等本文中所展示且描述者之外，熟習此項技術者根據上述描述將不難想到本發明之各種修改且該等修改屬於隨附申請專利範圍之範疇內。

應瞭解，本文中所述之實例及實施例僅為達成例示性目的且根據其之各種修改或改變將為熟習此項技術者想到且包括於本申請案之精神及權限及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案據此以引入的方式全部併入本文中而用於所有目的。

實例 實例1：

已知由於替代性RNA拼接而表現為不同同功異型物之血管內皮生長因子(VEGF)在腫瘤血管生成中起重要作用。吾人已量測VEGF₁₆₅及整個VEGF之濃度且評估VEGF₁₁₀之相對量，該VEGF₁₁₀為由纖溶酶消化VEGF所產生的活性片段。ELISA A(VEGF165-206 ELISA)偵測 VEGF₁₆₅及更長同功異型物，但不偵測VEGF₁₂₁。ELISA B(VEGF110-206 ELISA)偵測VEGF₁₆₅及同功異型物VEGF₁₂₁及VEGF₁₁₀。ELISA C(VEGF121-206 ELISA)偵測VEGF₁₆₅及更長同功異型物VEGF₁₂₁及具有比VEGF₁₁₀更大之分子量的VEGF片段，但不偵測VEGF₁₁₀(本文中稱為"VEGF₁₁₀₊")。

材料及方法

試劑及細胞：在大腸桿菌(E.coli.)中產生重組VEGF₁₆₅(Genentech)、VEGF₁₂₁(PeproTech,Rocky Hill,New Jersey)、VEGF_8-109(由VEGF₁₆₅之胺基酸8-109組成)及截短型VEGF₁₂₁(R&D Systems,Minneapolis,MN)。截短型VEGF₁₂₁具有完整N末端(根據質譜分析)但具有26KDa之質量，其與根據製造商自羧基末端截短約9個胺基酸一致。當在還原條件下進行SDS-PAGE分析時其在VEGF₁₁₀與VEGF₁₂₁之間遷移。藉由纖溶酶消化VEGF₁₆₅來製備VEGF₁₁₀(Keyt BA等人：The carboxyl-terminal domain(111-165)of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency.J Biol Chem.271：7788-7795(1996))。由質譜分析所量測之分子量為25390，其與25389之理論質量相匹配。使用二辛可寧酸(bicinchorinic acid)法(Pierce,Rockford,IL)測定濃度。用於VEGF_8-109、VEGF₁₂₁及VEGF₁₆₅之濃度計算的分子量分別為23.8KDa、28.9KDa及38.2KDa。藉由用CHO細胞中所產生之VEGF₁₆₅使小鼠免疫來產生單株抗VEGF抗體A4.6.1、3.5F8、2E3及5C3(Kim KJ等人：The vascular endothelial growth factor proteins：Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies.Growth Factors 7：53-64(1992))。使乳房細胞株SK-BR-3、BT-474、T-47D及MCF-7以及卵巢細胞株ES-2、OVCAR-3及SK-OV-3(美國菌種保存中心，Rockville,MD)在5% CO₂加濕培養室中37℃下於RPMI、2mM L-麩胺醯胺及10% FBS(除用於OVCAR-3 為20%之外)中生長。

在A673細胞之改良性培養基中純化VEGF：使A673細胞(美國菌種保存中心)於50：50F12/DMEM、2mM L-麩胺醯胺及5% FBS中生長至60%融合且隨後使其於無血清培養基(Genentech)中生長直到融合。使用以CNBr活化之瓊脂糖(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)製備之A4.6.1-瓊脂糖管柱自上清液純化VEGF。使管柱溶離液及重組VEGF對照物(每色帶0.2μg)於18% Tris-Glycine凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上在還原條件下流動且轉漬至硝化纖維素中。將漬點以0.5M Tris-HCl(pH 7.5)、1.5M NaCl、50mM EDTA、含有3%牛血清白蛋白之0.5% Trition100阻斷且以200ng/ml 3.5F8或A4.6.1、接著2ng/ml山羊抗小鼠Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch)探測。使用SuperSignal West Dura(Pierce)顯現信號且記錄於X射線膠片上。

用於量測VEGF濃度之VEGF ELISA

ELISA A(VEGF165-206 ELISA)。除非另作說明，否則螢光ELISA A係用於量測試樣中之VEGF。螢光ELISA A使用3.5F8來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1、接著抗生蛋白鏈菌素-β半乳糖苷酶來偵測且使用4-甲基傘形酮基-β-D半乳糖苷作為受質(Rodriguez CR等人：A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma.J Immunol Methods 219：45-55(1998))。VEGF₁₆₅標準物為1-128pg/mL或0.026-3.35pM。比色ELISA A使用3.5F8來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1來偵測，其按照用於如下所述之ELISA C之方案。VEGF₁₆₅標準物為1.6-200pg/mL。

ELISA B(VEGF110-206 ELISA)(先前稱為VEGF121-206 ELISA，Konecny GE等人：Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients.Clinical Cancer Research,10：1706-1716(2004))：將MaxiSorp 96孔微孔板以於50mM碳酸鹽緩衝液(pH 9.6)中之0.5μg/ml抗體A4.6.1以100微升/孔在4℃下塗佈隔夜。在此步驟後且在後續室溫培育步驟之前將板以含有0.05%聚山梨醇酯20之PBS(pH 7.4)洗滌。將板以於PBS(150微升/孔)中之0.5%牛血清白蛋白、10ppm Proclin^TM 300(Supelco,Bellefonte,PA)阻斷1小時。將於含有0.5%牛血清白蛋白、0.05%聚山梨醇酯20、5mM EDTA、0.25% CHAPS、0.2%牛γ-球蛋白(Sigma,St.Louis,MO)及0.35M NaCl之PBS(pH 7.4)(試樣緩衝液)中之VEGF標準物(經兩倍連續稀釋之1.56-200pg/ml VEGF₁₆₅或0.0409-5.24pM VEGF)及經兩倍或三倍連續稀釋之連續稀釋試樣(最小1：10稀釋)添加至該等板中(100微升/孔)且培育2小時。藉由將經生物素標記之2E3(或另一與VEGF之受體結合域結合之抗體)於該等板上培育1小時，接著將抗生蛋白鏈菌素-HRP(Amersham,Copenhagen,Denmark)培育30分鐘，將生物素基-酪胺(ELAST ELISA amplification System,Perkin Elmer Life Sciences Inc.,MA)培育15分鐘且將抗生蛋白鏈菌素-HRP培育30分鐘來偵測經結合之VEGF。添加受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)(Kirkegaard & Perry Laboratories)且藉由添加1M磷酸來中止反應。用Titertek堆疊機讀取器(ICN,Costa Mesa,CA)在450nm下讀取吸光率。使用四參數回歸曲線-擬合程式(KaleidaGraph,Synergy software,Reading,PA)擬合滴定曲線。將落於標準曲線範圍內之數據點用於計算試樣中之推定VEGF濃度。在減去用於本研究之10%血漿中之推定2.1pg/ml內源性VEGF後，10%人類EDTA血漿(Golden West Biologicals Inc.,Temecula,CA)中之1.56-200pg/ml VEGF₁₆₅之回收率為92-120%。

ELISA C(VEGF121-206 ELISA)：將微孔板以1μg/ml抗VEGF 5C3抗體塗佈且如上所述阻斷。將於試樣緩衝液中之VEGF標準物(經兩倍連續稀釋之4.00-512pg/ml VEGF₁₆₅或0.105-13.4pM VEGF)及連續稀釋試樣添加至該等板中。將該等板培育2小時。藉由添加經生物素標記之A4.6.1、接著抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB作為受質來偵測經結合之VEGF。讀取板且如上所述分析數據。在減去用於本研究之10%血漿中之1.6pg/ml推定內源性VEGF後，10%血漿中4.00-512pg/ml VEGF₁₆₅之回收率為77-101%。

結果及討論

VEGF ELISA：先前所描述之ELISA A使用3.5F8來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1來偵測(Rodriguez CR等人：A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma.J Immunol Methods 219：45-55,1998)。其偵測VEGF165(VEGF₁₆₅)，但不偵測來自R&D systems且自羧基末端缺少約9個胺基酸之VEGF121(1)(VEGF₁₂₁(1))及來自PeproTech之VEGF121(2)(VEGF₁₂₁(2))(圖1A)。3.5F8結合VEGF₁₆₅，但不結合VEGF₁₂₁(根據BIAcore)。A4.6.1與存在於所有同功異型物及VEGF₁₁₀中之受體結合域結合(Kim KJ等人：The vascular endothelial growth factor proteins：Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies.Growth Factors 7：53-64,1992)。3.5F8可能就近結合不存在於VEGF₁₂₁中之胺基酸116及118。5C3可能就近結合不存在於VEGF₁₁₀中之胺基酸111-113(圖3)。ELISA A有可能會偵測含有VEGF₁₆₅序列的VEGF同功異型物，包括VEGF₁₈₃、VEGF₁₈₉及VEGF₂₀₆(參見例如Stimpfl M等人：Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer.Clinical Cancer Research 8：2253-2259,2002)。ELISA B(先前稱為VEGF121-206 ELISA，Konecny GE等人，Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients.Clinical Cancer Research,10：1706-1716,2004)使用A4.6.1來塗佈且使用經生物素標記之2E3來偵測。A4.6.1及2E3與存在於所有三種分子中之受體結合域結合。參見例如Kim KJ等人，The vascular endothelial growth factor proteins：Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies.Growth Factors 7：53-64(1992)及Muller YA等人，Vascular endothelial growth'factor：Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site.Proc Natl Acad Sci USA 94：7192-7197(1997)。亦可使用於該等區域內結合之其他抗體。該ELISA同等良好地偵測VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁、截短型VEGF₁₂₁(自羧基末端缺少約9個胺基酸)、VEGF₁₁₀及VEGF_8-109(圖1B)。該ELISA可偵測整個VEGF，包括比由基質金屬蛋白酶消化所產生之VEGF₁₁₀更大的片段。本文中所述使用5C3來塗佈且使用經生物素標記之A4.6.1來偵測的ELISA C同等良好地偵測VEGF₁₆₅、VEGF₁₂₁及截短型VEGF₁₂₁，但不偵測VEGF₁₁₀或VEGF_8-109(圖1,C)。5C3結合VEGF₁₂₁，但不結合VEGF_8-109(根據BIAcore)。該ELISA可偵測由VEGF_110-206偵測之所有VEGF分子(除VEGF₁₁₀及較小片段外)。

ELISA A、ELISA B及ELISA C對於使用最小1：10稀釋之試樣中之VEGF的敏感度分別為10pg/ml、16pg/ml及40pg/ml VEGF₁₆₅(或對於不同VEGF同功異型物及片段為0.26pM、0.41pM及1.05pM)。ELISA B及ELISA C具有可重現性(表1 & 2)。ELISA B及ELISA C對VEGF(VEGF-A)具有特異性。VEGF-B、VEGF-C及VEGF-D在高達50ng/ml之濃度下僅給出背景信號。胰島素樣生長因子1、生長激素、重組神經生長因子、腫瘤壞死因子(Genentech)、血小板衍生之生長因子AB、胎盤生長因子、轉化生長因子β1(R&D Systems)(高達200ng/ml) 僅給出背景信號。肝素(Leo Laboratories,Bucks,UK及Dublin,Ireland)(高達100U/ml)對該檢定並無顯著影響。

細胞株之改良性培養基中之VEGF ：藉由三種ELISA量測6個以VEGF₁₆₅ Cdna(Meng等人，2000)轉染之穩定CHO純系的改良性培養基，該等ELISA使用大腸桿菌中所產生之非糖基化VEGF作為標準物。在該三種ELISA中，6個穩定CHO純系之改良性培養基中之糖基化重組VEGF₁₆₅產生極其類似的濃度。由ELISA B所量測之濃度分別為28nM、63nM、64nM、43nM、3.8nM及3.2nM。由ELISA A及ELISA C所量測之VEGF濃度與由ELISA B所量測之濃度相比之比率分別為0.90±0.08及1.08±0.10。因此，三種ELISA同等良好地測定糖基化VEGF數量且在培養條件下存在很少VEGF₁₆₅蛋白質水解。

由ELISA A、ELISA B及ELISA C所量測之A673細胞改良性培養基中之VEGF濃度分別為0.15nM、0.29nM及0.24nM VEGF。由ELISA A所量測之濃度較低，其表明存在VEGF₁₂₁。當VEGF由改良性培養基使用A4.6.1親和管柱純化且藉由蛋白質轉漬進行分析時，由3.5F8偵測兩個條帶(可能糖基化及非糖基化VEGF₁₆₅)。下條帶具有與大腸桿菌中所產生之純化VEGF₁₆₅相同的遷移率(圖2，左)。N-聚糖酶處理使上條帶轉換成下條帶。由A4.6.1偵測其他兩條較低分子量條帶(可能糖基化(與推定之非糖基化VEGF₁₆₅條帶部分重疊)及非糖基化VEGF₁₂₁)(圖2，右)。下條帶具有與大腸桿菌中所產生之純化VEGF₁₂₁相同的遷移率且N-聚糖酶處理使上條帶轉換成下條帶。

由ELISA B所量測之乳房細胞株SK-BR-3、BT-474、T-47D及MCF-7之改良性培養基中的VEGF濃度分別為3.6pM、16pM、13pM及13pM。由ELISA A量測之VEGF濃度與由ELISA B所量測之VEGF濃度的比率分別為0.49、0.42、0.43及0.38(或49%、42%、43%或38%)，其與在該等相應細胞株中43%、35%、40%及41%之VEGF₁₆₅表現一致(Stimpfl M等人：Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer.Clinical Cancer Research 8：2253-2259,2002)。對於該等細胞株，由ELISA C所量測之VEGF濃度與由ELISA B所量測之VEGF濃度的比率為1.1-1.2，其表明幾乎不存在VEGF₁₁₀。由ELISA B所量測之卵巢細胞株ES-2、 OVCAR-3及SK-OV-3之改良性培養基中的VEGF濃度分別為32pM、11pM及20pM。與該等相應細胞株中38%、42%及24%之VEGF₁₆₅表現相比，由ELISA A所量測之VEGF濃度與由ELISA B所量測之VEGF濃度的比率分別為0.24、0.20及0.32(或24%、20%及32%)(Stimpfl等人，前述)。對於該等細胞株，由ELISA C所量測之VEGF濃度與由ELISA B所量測之VEGF濃度的比率為0.64-0.79，其表明可能存在VEGF₁₁₀(或較小片段)。

Claims

一種用於偵測生物試樣中之選擇性血管內皮生長因子(VEGF)形式(VEGF₁₁₀₊)的方法，其包含以下步驟：(a)使該生物試樣與固定於一固體支撐物上之捕集試劑接觸且一起培育，其中該捕集試劑為與抗人類VEGF之抗體5C3識別相同抗原決定基之抗體，該單株抗體與人類VEGF之大於110之殘基特異性結合；(b)將該生物試樣與該等經固定之捕集試劑分離；(c)使經固定之捕集試劑-靶分子複合體與可偵測抗體接觸，該可偵測抗體與VEGF之KDR及/或FLT1受體結合域結合或與VEGF1-110中之抗原決定基結合；及(d)使用用於該可偵測抗體之偵測工具量測與該等捕集試劑結合之VEGF₁₁₀₊的含量。
如請求項1之方法，其中該生物試樣係自人類受檢者分離。
如請求項2之方法，其中該人類受檢者為血管病、糖尿病或癌症患者且該量測步驟(d)進一步包含與標準曲線進行比較以決定與正常個體相比之VEGF含量。
如請求項1之方法，其中該生物試樣為腫瘤溶胞物、血漿、血清或尿液。
如請求項1之方法，其中該捕集試劑為5C3單株抗體。
如請求項1之方法，其中將該等經固定之捕集試劑塗佈於一微量滴定板上。
如請求項1之方法，其中該可偵測抗體可直接偵測。
如請求項7之方法，其中該可偵測抗體係由螢光試劑放大。
如請求項8之方法，其中該可偵測抗體經生物素標記且該偵測工具為抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶及3,3',5,5'-四甲基聯苯胺。
如請求項1之方法，其中該可偵測抗體為單株抗體。
如請求項10之方法，其中該可偵測抗體為鼠類單株抗體。
如請求項11之方法，其中該經固定之單株抗體為MAb 5C3且該可偵測抗體為MAb A4.6.1。
一種用於偵測生物試樣中之VEGF₁₁₀₊的免疫檢定套組，該套組包含：(a)作為捕集試劑之抗人類VEGF的抗體，其中該單株抗體與人類VEGF之110以上之殘基特異性結合；及(b)作為偵測試劑之可偵測抗體，其與VEGF之KDR及/或FLT1受體結合域結合或與VEGF1-110中之抗原決定基結合。
如請求項13之套組，其進一步包含一用於該等捕集試劑之固體支撐物。
如請求項14之套組，其中該等捕集試劑係固定於該固體支撐物上。
如請求項15之套組，其中該等捕集試劑係塗佈於一微量滴定板上。
如請求項16之套組，其進一步包含用於該等可偵測抗體之偵測工具。
如請求項17之套組，其中該偵測工具為比色工具。
如請求項13之套組，其進一步包含經純化之VEGF作為抗原標準物。
如請求項13之套組，其中該捕集試劑抗體為鼠類單株抗體MAb 5C3且該可偵測抗體為MAb A4.6.1。
一種抗體5C3，其可由寄存編號PTA-7737之融合瘤5C3.1.1獲得 (或由其產生)。
如請求項21之抗體，其係與可偵測標記物結合。
一種融合瘤5C3.1.1，其係以ATCC寄存編號PTA-7737寄存。
一種抗體，其不結合VEGF 110且與由該融合瘤細胞株PTA-7737所產生之單株抗體結合相同抗原決定基。
如請求項24之抗體，其係與可偵測標記物結合。