KR101720887B1

KR101720887B1 - Ｖｅｇｆ용 ｅｌｉｓａ

Info

Publication number: KR101720887B1
Application number: KR1020157005110A
Authority: KR
Inventors: 유-쥬 지. 멩; 큐 에이치. 홍; 쟈니 구티레즈
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2007-10-03
Publication date: 2017-03-28
Also published as: EP2069798A2; IL197374A; HRP20140675T1; AU2007319654A1; PT2069798E; EP2457929A1; KR20150038444A; CN103454434A; MX2009003562A; MX342791B; ZA200901518B; JP2010506171A; NZ613646A; PL2457929T3; TWI541251B; RS53387B; US20170276683A1; TW201406778A; CN103454434B; ES2584322T3

Abstract

환자의 혈류 또는 다른 생물학적 시료 중의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 활성은 암, 당뇨병, 심장 병태 및 기타 병변의 진단 및 예후 지수로서 작용할 수 있다. 동물 모델 및 인간 환자로부터의 생물학적 시료 중에 VEGF 농도를 검출하기 위하여, 항원으로서 VEGF를 위한 항체-샌드위치 ELISA 방법 및 키트가 제공되며, 이는 진단/예후 지수로서 사용될 수 있다.

Description

ＶＥＧＦ용 ＥＬＩＳＡ{ELISA FOR VEGF}

관련 출원

본 출원은 2006년 10월 4일 출원된 미국 가출원 시리얼 번호 제60/828,203호(그의 명세서 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 우선권과 잇점을 주장한다.

기술분야

본 발명은, 암, 심혈관 또는 기타 병변을 가진 환자에 대한 진단 및 예후 방법으로서 사용될 수 있는, VEGF의 특정 군집을 검출하기 위한 면역분석법에 관한 것이다.

혈관형성이 각종 질병의 병인론에 관련된다는 것은 이미 잘 입증되어 있다. 이들은 충실성 종양, 증식성 망막증 또는 연령-관련된 황반 변성(AMD)과 같은 안내 신생혈관 증후군, 류마티스양 관절염 및 건선을 포함한다 (문헌 ([Folkman et al. J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992)]; [Klagsbrun et al. Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)]; 및 [Garner A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Garner A, Klintworth GK, Eds. 2^nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710])). 충실성 종양의 경우에, 혈관신생은 종양 세포가 정상 세포에 비해 성장 우세 및 증식 자율성을 획득하도록 할 수 있다. 따라서, 유방암 뿐만 아니라, 몇가지 다른 여러 종양에서 종양 부위의 미세혈관 밀도와 환자 생존율 간에 상관관계가 관찰되었다 (문헌 ([Weidner et al. N Engl J Med 324:1-6 (1991)]; [Horak et al. Lancet 340:1120-1124 (1992)]; 및 [Macchiarini et al. Lancet 340:145-146 (1992)])).

혈관형성의 양성 조절인자에 관한 연구는 예로서, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, 안지오게닌, IL-8 등을 비롯한 다수의 후보물질들을 밝혀내었다 (문헌 ([Folkman et al., 상기 문헌 동일], 및 [Klagsbrun et al., 상기 문헌 동일])). 지금까지 밝혀진 음성 조절인자 중 일부로서 트롬보스폰딘 (문헌 [Good et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6624-6628 (1990)]), 프롤락틴의 16-킬로달톤 N-말단 단편 (문헌 [Clapp et al. Endocrinology, 133:1292-1299 (1993)]), 안지오스타틴 (문헌 [O'Reilly et al. Cell. 79:315-328 (1994)]) 및 엔도스타틴 (문헌 [O'Reilly et al. Cell 88:277-285 (1996)])을 포함한다.

지난 수년간에 걸쳐 행해진 작업은, 정상 및 비정상 혈관형성의 조절에 있어서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 주요 역할을 입증하였다 (문헌 [Ferrara et al. Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)]). 단지 하나의 VEGF 대립인자의 소실에 의해서도 배아 치사율이 얻어진다는 연구결과는, 혈관계의 발생 및 분화에 있어서 이 인자가 대신할 수 없는 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다 (문헌 [Ferrara et al., 상기 문헌 동일]).

또한, VEGF는 종양 및 안내 질환과 연관된 혈관신생의 주요 매개인자인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Ferrara et al., 상기 문헌 동일]). VEGF mRNA는 시험된 대부분의 인간 종양에 의해 과다발현된다 (문헌 ([Berkman et al. J Clin Invest 91:153-159 (1993)]; [Brown et al. Human Pathol. 26:86-91 (1995)]; [Brown et al. Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)]; [Mattern et al. Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)]; 및 [Dvorak et al. Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)])). 또한, 안액내의 VEGF 농도는, 당뇨병 및 기타 허혈-관련 망막증을 가진 환자에서 혈관의 능동적인 증식이 존재하는 것과 매우 높은 상관관계를 갖는다 (문헌 [Aiello et al. N. Engl. J. Med. 331:1480-1487 (1994)]). 또한, 연구는 급성 황반 변성 (AMD)에 걸린 환자에서 맥락막 신생혈관 막에 VEGF가 편재해 있음을 증명하였다 (문헌 [Lopez et al. Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)]).

VEGF는 조직에 의해 생성되고, 그의 생물학적 효과를 발휘하기 위해 순환되어야 하는 것이 아니라, 파라크린 조절인자로서 국소적으로 작용한다. 양(Yang)등에 의한 최근의 연구 (문헌 [Yang et al. J. Pharm. Exp. Ther. 284:103 (1998)]는, 순환으로부터 rhVEGF₁₆₅의 제거가 매우 빠르다는 것을 밝혀내었으며, 이는 순환에서의 내인성 VEGF가 VEGF의 연속적인 합성 결과일 가능성이 높음을 시사한다. 또한, 몇몇 연구들은 순환하는 VEGF의 농도와 종양 부담을 서로 연관시키고자 시도하였으며, VEGF 농도를 잠재적인 예후 마커로서 제안하였다 (문헌 ([Ferrari and Scagliotti Eur. J. Cancer 32A:2368 (1996)]; [Gasparini et al. J. Natl. Cancer Inst. 89:139 (1997)]; [Kohn Cancer 80:2219 (1997)]; [Baccala et al. Urology 51:327 (1998)]; [Fujisaki et al. Am. J. Gastroenterol. 93:249 (1998)])). 명백하게, VEGF를 정확하게 측정하는 능력은, 예컨대, 혈관 개방, 월경주기, 허혈, 당뇨병, 암, 안내 질병 등의 지속과 같은 많은 생물학적 과정에서 그의 잠재적 역할(들)을 이해하는 것이 중요할 것이다.

문헌은, 정상 및 질병에 걸린 환자에 있어서, 검출불가능한 농도로부터 높은 농도에 이르는 범위에 걸쳐 내인성 VEGF의 다양한 농도를 보고하고 있다. 내인성 VEGF 농도를 측정하는 능력은 감수성있고 특이적인 분석법의 이용가능성에 의존된다. VEGF에 대한 비색, 화학발광 및 형광분석을 기초로 한 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)이 보고되어 있다 (문헌 ([Houck et al., 상기 문헌 동일, (1992)]; [Yeo et al. Clin . Chem . 38:71 (1992)]; [Kondo et al. Biochim . Biophys . Acta 1221:211 (1994)]; [Baker et al. Obstet . Gynecol. 86:815 (1995)]; [Hanatani et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995)]; [Leith and Michelson Cell Prolif. 28:415 (1995)]; [Shifren et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996)]; [Takano et al. Cancer Res. 56:2185 (1996)]; [Toi et al. Cancer 77:1101 (1996)]; [Brekken et al. Cancer Res. 58:1952 (1998)]; [Obermair et al. Br. J. Cancer 77:1870-1874 (1998)]; [Webb et al. Clin. Sci. 94:395-404 (1998)])).

예를 들면, 문헌 [Houck et al., 상기 문헌 동일 (1992)]은 ng/ml 감도를 갖는 것으로 보이는 비색 ELISA를 기재하고 있으나, 이는 내인성 VEGF 농도를 검출하기에는 충분히 민감하지 않다. 문헌 [Yeo et al., 상기 문헌 동일 (1992)]은 2-부위 시간-분할 면역형광분석 측정법을 기재하고 있으나, 정상 혈청에서는 VEGF가 검출되지 않았다 (문헌 [Yeo et al. Cancer Res. 53:2912 (1993)]). 문헌 [Baker et al., 상기 문헌 동일 (1995)]은 이러한 면역형광분석 측정법의 변형을 사용하여, 자간전증을 가진 여성에서 관찰되는 더욱 높은 농도와 함께, 임신한 여성으로부터의 혈장 중의 검출가능한 VEGF 농도를 보고하였다. 방사능면역분석법을 사용한 임신한 여성에서의 유사한 데이타가 문헌 [Anthony et al. Ann . Clin . Biochem. 34:276 (1997)]에 의해 보고되었다. 문헌 [Hanatani et al., 상기 문헌 동일 (1995)]은 순환하는 VEGF를 측정할 수 있는 화학발광 ELISA를 개발하였으며, 30명의 정상적인 개인 (남성 및 여성)으로부터의 혈청 중에 8-36 pg/ml의 VEGF 농도를 보고하였다. 문헌 [Brekken et al, 상기 문헌 동일 (1998)]은 VEGF 단독 또는 VEGF:Flk-1 복합체에 대해 결합 선호도를 가진 항체를 사용한 ELISA 분석법을 기재하고 있다.

VEGF 검출을 위한 ELISA 키트는 R&D 시스템즈(R&D Systems) (미네소타주 미니애폴리스)로부터 상업적으로 이용가능하다. 표적 VEGF 항원을 포획하기 위해 모노클로날 항체를 사용하고 VEGF를 검출하기 위해 폴리클로날 항체를 사용하는 샌드위치 분석법에서 R&D VEGF ELISA 키트가 사용되었다. 문헌 [Webb et al. 상기 문헌 동일 (1998)]. 또한, 문헌 [Obermair et al, 상기 문헌 동일 (1998)]도 참조한다.

문헌 ([Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996)]; [Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:5638 (1996)]; 및 [Shifren et al., 상기 문헌 동일 (1996)])은 또한 이중 모노클로날 항체 쌍을 기초로 한 비색 ELISA를 개발하였다. 이러한 ELISA는 암 환자에서의 높은 VEGF 농도를 검출할 수 있긴 하지만, 정상적인 개인에서의 내인성 VEGF 농도를 측정하기 위해 필요한 감수성이 부족하다. 문헌 [Rodriguez et al. J. Immunol. Methods 219:45 (1998)]은 순수한 혈장 또는 혈청에서 10 pg/ml VEGF의 민감도를 나타내는 2-부위 형광분석 VEGF ELISA를 기재하고 있다. 그러나, 이러한 형광분석 측정법은 VEGF의 완전히 온전한 165/165 및 165/110종을 검출한다 (VEGF165/165는 3개의 다른 형태: 165/110 이종이량체, 110/110 동종이량체, 및 55-아미노산 C-말단 단편으로 단백질 분해에 의해 절단될 수 있다 (문헌 ([Keyt et al. J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996)]; [Keck et al. Arch. Biochem. Biophys. 344:103-113 (1997)])).

따라서, 기존의 ELISA에 비해, 동물 모델 또는 환자의 생물학적 시료 중에서 VEGF의 더욱 높은 측정가능한 농도를 검출할 수 있고/거나, VEGF의 모든 이소형을 측정할 수 있는 진단 및 예후 분석법이 개발될 필요가 있다.

요약

생물학적 시료 중의 VEGF 형태를 검출하기 위해, 항원으로서의 VEGF에 대한 항체-샌드위치 ELISA 방법이 개발되었다. 본원에서 제공하는 VEGF ELISA는 VEGF 이소형 및 110을 초과하는 VEGF 단편 ("VEGF₁₁₀₊")을 검출할 수 있다. 그의 키트 또한 제공한다.

예를 들면, 생물학적 시료 중 110 초과의 아미노산으로 이루어진 선택적 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 형태(VEGF₁₁₀₊)를 검출하는 방법은 (a) 생물학적 시료를 고체 지지체에 고정화된 포획 시약과 접촉시키고 인큐베이션시키되, 여기서, 상기 포획 시약은 인간 VEGF에 대한 항체 5C3과 동일한 에피토프를 인식하는 항체이며, 상기 모노클로날 항체는 인간 VEGF의 110 초과의 잔기에 특이적으로 결합하는 것인 단계; (b) 고정화된 포획 시약으로부터 생물학적 시료를 분리해내는 단계; (c) 고정화된 포획 시약-표적 분자 복합체를, VEGF의 KDR 및/또는 FLT1 수용체 결합 도메인에 결합하는 검출가능한 항체와 접촉시키는 단계; 및 (d) 검출가능한 항체에 대한 검출 수단을 사용하여 포획 시약에 결합된 VEGF₁₁₀₊의 농도를 측정하는 단계를 포함한다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 항체는 VEGF 1-110의 에피토프에 결합한다. 특정 실시태양에서, 비교 ELISA는 상이한 유형의 VEGF를 검출하기 위해 실시될 수 있다. 특정 실시태양에서, 생물학적 시료 (예로서, 종양 시료 또는 종양 용해물, 혈장, 혈청, 또는 뇨 등)는 인간 피험자로부터 단리된다.

하나의 실시태양에서, 포획 시약은 5C3 모노클로날 항체이다. 하나의 실시태양에서, 고정화된 포획 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 실시태양에서, 검출가능한 항체는 뮤린 모노클로날 항체이다. 하나의 실시태양에서, 고정화된 모노클로날 항체는 MAb 5C3이고, 검출가능한 항체는 MAb A4.6.1이다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 항체는 직접적으로 검출가능하다. 하나의 실시태양에서, 검출가능한 항체는 비색 시약에 의해 증폭된다. 하나의 실시태양에서, 검출가능한 항체는 비오티닐화되고, 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 3,3 ',5,5'-테트라메틸 벤지딘이다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 인간 피험자는 혈관, 당뇨병 또는 암 환자이고, 측정하는 단계 (d)는 추가로 정상적인 개체와 비교하여 VEGF의 농도를 결정하기 위하여 표준 곡선과 비교하는 것을 포함한다.

키트 또한 제공한다. 예를 들면, 생물학적 시료 중 110 초과의 아미노산으로 이루어진 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 형태(VEGF₁₁₀₊)를 검출하기 위한 면역분석법 키트는 (a) 포획 시약으로서, 모노클로날 항체가 인간 VEGF의 110 초과의 잔기에 특이적으로 결합하는 것인, 인간 VEGF에 대한 항체; 및 (b) 검출 시약으로서, VEGF의 KDR 및/또는 FLT1 수용체 결합 도메인에 결합하는 검출가능한 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 검출가능한 항체는 VEGF 1-110의 에피토프에 결합한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 포획 시약을 위한 고체 지지체를 포함한다. 예를 들면, 포획 시약은 고체 지지체 (예로서, 마이크로타이터 플레이트) 상에 고정화될 수 있다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 검출가능한 항체를 위한 검출 수단 (예로서, 비색 수단, 형광분석 수단 등)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 키트는 추가로 항원 표준으로서 정제된 VEGF를 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, VEGF₁₁₀₊ ELISA와의 비교 연구를 위해 추가의 VEGF ELISA 등을 제공할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 키트는 뮤린 모노클로날 항체 MAb 5C3인 포획 시약 모노클로날 항체와, MAb A4.6.1인 검출가능한 항체를 포함한다.

추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명은 (ATCC 번호 PTA-7737하에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있거나, 그에 의해 생산된) 항-VEGF 항체 5C3을 제공한다. 본 발명은 또한 VEGF 1-110에는 결합하지 않고, 하이브리도마 세포주 PTA-7737에 의해 생산된 모노클로날 항체와 동일한 VEGF₁₁₀₊ 에피토프에는 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 항체는 검출가능한 표지에 접합된다. 하나의 실시태양에서, ATCC 기탁 번호 PTA-7737하에 기탁된 하이브리도마 5C3.1.1을 제공한다.

도 1, 패널 A, B 및 C는 상이한 VEGF ELISA에 의해 재조합 VEGF165, VEGF121(1) (절단된 것으로서, 제조사인 R&D 시스템즈에 따라 카복시-말단으로부터 대략 9개의 아미노산이 결실되어 있을 수 있는 것), VEGF 121(2) (페프로 테크(Pepro Tech)로부터 입수), VEGF110 (VEGF의 플라스민 분해에 의해 생성된 N-말단 단편) 및 VEGF8-109 (VEGF165의 아미노산 8-109를 갖는 인공 VEGF) 분자를 검출한 것을 도시한다. (A). 코팅을 위해 3.5F8을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1을 사용한 ELISA A. (B). 코팅을 위해 A4.6.1을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 2E3을 사용한 ELISA B. (C). 코팅을 위해 5C3을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1을 사용한 ELISA C.
도 2는 프로빙을 위해 3.5F8 (좌측) 또는 A4.6.1 (우측)을 사용함으로써, A673 세포에 의해 생산된 VEGF을 단백질 블롯팅한 것을 도시한다. 시료는 A4.6.1 친화성 칼럼 (래인 1) 및 재조합 VEGF 단백질 VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁ (제조사인 R&D 시스템즈에 따라 카복시-말단으로부터 대략 9개의 아미노산이 결실되어 있을 수 있는 것) 및 E. 콜라이(E. coli)에 의해 생산된 VEGF_8-109 (각각 래인 2, 3 및 4)를 사용하여 A673 세포의 조절된 배지로부터 정제된 VEGF이다.
도 3은 3개의 VEGF ELISA에서 사용된 항체의 제안된 결합 부위를 보여주는 VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₁₀ (VEGF의 플라스민 분해에 의해 생성된 N-말단 단편)의 도해를 도시한다.

상세한 설명

정의

본 발명을 상세시 설명하기 앞서, 본 발명은 특정의 조성물이나 생물학적 시스템으로 제한되는 것이 아니며, 이들은 물론 달라질 수 있다는 점을 이해하여야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하고자 하는 목적으로만 사용되는 것이며, 이는 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 명세서와 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바, 단수 형태 "하나(a)," "하나(an)," 및 "그(the)"는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 지시물을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 분자"에 관해 언급하는 것은 임의로 2개 이상의 상기 분자의 조합 등을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "VEGF"는, 문헌 ([Leung et al. Science 246:1306 (1989)], [Houck et al. Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)], 및 [Neufeld et al., 상기 문헌 동일])에 기재된 바와 같이, 165-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 145-, 189- 및 206-아미노산 혈관 내피 세포 성장 인자와 함께, 이러한 성장 인자의 천연적으로 발생된 대립형질 및 프로세싱된 형태를 일컫는 것이다. 또한, 미국 특허 번호 제6,057,428호의 도 1A 및 B를 참조한다. 활성 VEGF 단편은 플라스민 절단에 의해 ECM에 결합된 VEGF로부터 유리될 수 있으며, 이를 통해 처음 110개의 아미노산이 생성될 수 있다 (예로서, 문헌 [Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271:7788-7795 (1996)] 참조). 본원에서 사용되는 "VEGF₁₁₀₊"은 (N-말단으로부터) 110개 초과의 아미노산으로 이루어져 있으며, 처음 110개의 아미노산 또는 그보다 작은 단편 (예로서, VEGF_8-109)은 포함하지 않는 VEGF 단편을 일컫는 것이다.

용어 "검출"은 가장 넓은 의미에서 표적 분자의 정성적 및 정량적 측정을 모두 포함하기 위해 사용된다. 하나의 측면에서, 본원에 기재된 것과 같은 검출 방법은 생물학적 시료 중의 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 단순한 존재를 확인하기 위해 사용된다. 또다른 측면에서, 본 방법은 샘플 중의 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF가 검출가능한 수준인지의 여부를 시험하기 위해 사용된다. 추가의 또다른 측면에서, 본 방법은 시료 중의 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 양을 정량하고, 상이한 시료로부터의 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF 농도와 추가로 비교하기 위해 사용될 수 있다.

용어 "생물학적 시료"란 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간으로부터의 신체 시료를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 그러한 생물학적 시료는 혈관, 당뇨병 또는 암 환자로부터의 시료이다. 그러한 시료는 생물학적 체액, 예로서, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 소포액, 정액, 양수액, 젖, 전혈, 뇨, 뇌-척수액, 타액, 객담, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지 뿐만 아니라, 균질화된 조직, 종양 조직, 및 세포 추출물과 같은 조직 추출물을 포함한다. 특정 실시태양에서, 시료는 임의의 동물로부터의 신체 시료이며, 하나의 실시태양에서, 시료는 포유동물로부터의 것, 하나의 실시태양에서, 인간 피험자로부터의 것이다. 하나의 실시태양에서, 그러한 생물학적 시료는 임상 환자로부터의 것이다.

용어 "검출가능한 항체"란 검출 수단에 의해 증폭된 표지를 통해 직접적으로, 또는 예로서, 표지화된 또다른 항체를 통해 간접적으로 검출될 수 있는 항체를 지칭한다. 직접적으로 표지화하기 위해, 항체는 전형적으로 일부 수단에 의해 검출될 수 있는 부분에 접합된다. 하나의 실시태양에서, 검출가능한 항체는 비오티닐화된 항체이다.

용어 "검출 수단"은 본원의 ELISA에서 검출가능한 항체의 존재를 검출하기 위해 사용되는 부분 또는 기법을 지칭하며, 마이크로타이터 플레이트 상에 포획된 표지와 같은 고정화 표지를 증폭시키는 검출 시약을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 검출 수단은 예로서, 아비딘 또는 스트렙타비딘-HRP와 같은 비색 검출 제제이다.

용어 "포획 시약"이란 시료 중의 표적 분자를 결합하고 포획함으로써 적절한 조건하에서 나머지 시료로부터 포획 시약-표적 분자 복합체를 분리할 수 있도록 하는 시약을 지칭한다. 전형적으로, 포획 시약은 고정화되거나 고정화될 수 있다. 샌드위치 면역분석법에서, 포획 시약은 바람직하게는 표적 항원에 대한 항체 또는 상이한 항체들의 혼합물이다.

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 결합 활성을 나타내는 이상 구체적으로는 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이성 항체 (예로서, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 그의 항원-결합 부위 또는 가변 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.

본원에서의 목적을 위해, "온전한 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 뿐만 아니라, Fc 부위를 포함하는 것이다.

"천연 항체"는 보통 2개의 동일한 경쇄(L)와 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 이황화 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되며, 이황화 결합의 갯수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄에 따라 상이하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 일정한 간격을 둔 쇄내 이황화 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 끝에 하나의 가변 도메인(V_H)에 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 끝에 하나의 가변 도메인(V_L)과 그의 다른 한쪽 끝에는 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 가변 도메인과 중쇄의 가변 도메인 사이에 경계를 형성하는 것으로 여겨진다.

본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는, 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연적으로 발생된 돌연변이를 제외하고는, 실질적으로 동질적인 항체, 즉, 군집을 구성하는 개개의 항체들이 서로 동일한 군집으로부터 수득되는 항체를 지칭하는 것이다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 위의 하나의 결정인자에 대해 지시된다. 그의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양물에 의해 합성된다는 점에서 이롭다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동질적인 항체 군집으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내는 것이고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되어지는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 의해 처음으로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예로서, 미국 특허 번호 제4,816,567호 참조)에 의해 만들어질 수도 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들면, 문헌 ([Clackson et al. Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)])에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로, 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 소부류에 속하는 항체내의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 그와 동종인 반면, 쇄(들)의 나머지는 또다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 소부류에 속하는 항체 뿐만 아니라, 이러한 항체의 단편내의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 동종인, "키메라" 항체 (면역글로불린)를 포함한다 (미국 특허 번호 제4,816,567호; [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:6851-6855 (1984)]). 본원의 관심의 대상이 되는 키메라 항체는 비-인간 영장류 (예로서, 올드 월드 몽키(Old World Monkey), 예를 들면, 개코원숭이, 붉은털 원숭이, 또는 사이노몰거스 원숭이)로부터 유래된 가변-도메인 항원-결합 서열, 및 인간 불변-부위 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다 (미국 특허 번호 제5,693,780호).

비-인간 (예로서, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화된 항체는, 수령체의 초가변 부위 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종으로부터의 초가변 부위 잔기 (공여체 항체)에 의해 대체된, 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정교하게 하기 위해 행해질 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인 모두를 포함하고, 여기에서 초가변 루프 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열에 상응한다. 또한, 인간화된 항체는 임의로 면역글로불린 불변 부위(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 수도 있다. 추가의 상세한 설명을 위해서는 문헌 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature. 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)])을 참조한다. 하나의 실시태양에서, 인간화된 5C3 항체가 제공되며, 본원에서 제공되는 방법에서 사용된다.

용어 "가변"이란 가변 도메인 중 특정의 일부가 서열에 있어 항체들간에 광범위하게 상이하고, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전역에 걸쳐 고르게 분포하는 것은 아니다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 둘 모두에서 초가변 부위로 명명되는 3개의 세그먼트로 집중된다. 가변 도메인 중 더욱 고도로 보존적인 부분은 프레임워크 부위(FR)로 명명된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs를 포함하는데, 이는 주로 β-쉬트 구조를 취하고, 3개의 초가변 부위에 연결되어 있으며, 이는 β-쉬트 구조의 일부를 연결하는 루프를 형성하거나, 몇몇의 경우에는 그 일부를 형성하기도 한다. 각 쇄에서 초가변 부위는 FRs과 매우 인접하게 결합되어 있으며, 다른 쇄로부터의 초가변 부위와 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성하는데 이바지한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ^th Ed. Public Health Service. National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는 것에 직접적으로 관여하지는 않지만, 예로서, 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 항체가 관여하는 것과 같은 다양한 효과기 기능을 나타낸다.

파파인에 의한 항체의 분해를 통해 각각이 단일 항원-결합 부위를 갖는 것으로서 "Fab" 단편이라 명명되는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편을 생산하게 되는데, 상기의 명칭은 용이하게 결정화될 수 있는 그의 능력을 반영하는 것이다. 파파인 처리를 통해 2개의 항원-결합 부위를 갖는 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있고, 또한, 항원을 가교결합시킬 수 있다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위와 항원-결합 부위를 함유하는 최소의 항체 단편이다. 상기 부위는 치밀한 비-공유 결합으로 결합된, 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이러한 구조로 각 가변 도메인의 3개의 초가변 부위는 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면상의 항원-결합 부위를 한정한다. 총괄적으로 6개의 초가변 부위가 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이성인 오직 3개의 초가변 부위만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 비록 전체 결합 부위보다는 친화성이 낮지만, 항원을 인식하고 그에 결합할 수 있는 능력은 갖고 있다.

Fab 단편 또한 경쇄의 불변 도메인과, 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 부위로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 수개의 잔기가 첨가되어 있다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 Fab' 단편 쌍 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편 쌍으로서 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.

임의의 척추동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 명명되는, 뚜렷히 다른 2개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

그들 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 항체는 상이한 부류로 지정될 수 있다. 온전한 항체에는 5가지 주된 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 수개는 추가로 소부류 (이소형), 예로서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, 및 IgA2로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 명명된다. 상이한 부류의 면역글로불린의 하위단위 구조 및 3차 구조는 잘 알려져 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는데, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 바람직하게, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 관한 리뷰를 위해서는 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

본원에서 사용되는 바, 용어 "초가변 부위"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 부위는 "상보성-결정 부위" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예로서, 경쇄 가변 도메인 중 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인 중 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 ^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 그러한 잔기 (예로서, 경쇄 가변 도메인 중 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3), 중쇄 가변 도메인 중 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의되는 초가변 부위 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

치료 목적을 위한 "포유동물"은, 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원용, 스포츠용 또는 애완용 동물, 예컨대, 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

용어 "암", "암성" 및 "악성"은, 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 설명하는 것이다. 암의 예는 선암, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병과 같은 암종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 암의 더욱 특별한 예는 편평세포암, 폐암 (소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐 선암종, 및 폐 편평세포암종), 복막암, 간세포암, 위암(gastric cancer) 또는 위암(stomach cancer) (위장 암 포함), 위장관 기질 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암 (예로서, 간 암종 및 간암 포함), 방광암, 간암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신암(kidney cancer) 또는 신장암(renal cancer), 간암(liver cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 기저세포 암종, 고환암, 식도암, 간암종, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 육종, 중피종, 다발골수종, 및 각종 유형의 두경부 암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저급/소포 비-호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중급/소포 NHL; 중급 미만성 NHL; 고급 면역모세포성 NHL; 고급 림프모세포성 NHL; 고급 소 비-분할 세포 NHL; 거대한(bulky) 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프성 백혈병(ALL), 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모세포 백혈병, 및 이식후 림프세포증식 질병(PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예로서, 뇌종양과 관련된 것) 및 메이그스 증후군과 관련된 비정상적인 혈관 증식을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

어구 "혈관" 및 "심혈관"은 상호교환적으로 사용되며, 혈관형성 및/또는 심혈관신생을 자극하는 징후와, 혈관형성 및/또는 심혈관신생을 억제하는 징후를 가진 환자를 설명하는 것이다. 그러한 질환은 예를 들어, 동맥 질환, 예컨대, 아테롬성경화증, 고혈압, 염증성 맥관염, 레이노드 질환 및 레이노드 현상, 동맥류 및 동맥 재발협착증; 정맥 및 림프관 질병, 예로서, 혈전성정맥염, 림프관염 및 림프부종; 및 기타 혈관 질환, 예로서, 말초 혈관 질환, AMD, 혈관 종양과 같은 암, 예로서, 혈관종 (모세관 및 해면상), 사구종양, 모세혈관확장증, 세균성 혈관종증, 혈관내피종, 맥관육종, 혈관주위세포종, 카포시 육종, 림프관종 및 림프관육종, 종양 혈관형성, 창상, 화상 및 기타 손상된 조직과 같은 외상, 이식 고정술, 반흔, 허혈 재관류 손상, 류머티스양 관절염, 뇌혈관 질환, 급성 신부전과 같은 신장병, 및 골다공증을 포함한다. 이러한 창상은 또한 안지나, 심근 경색, 예로서, 급성 심근경색, 심장비대, 및 울혈성 심부전(CHF)과 같은 심장병을 포함한다.

용어 "당뇨병"은 인슐린의 부적절한 생산 또는 이용과 관련된 탄수화물 대사의 진행성 질환을 지칭하며, 고혈당증 및 당뇨를 특징으로 한다. 이 용어는 모든 형태의 당뇨병, 예로서, I형 및 II형 당뇨병 및 인슐린-내성 당뇨병, 예로서, 멘덴홀 증후군, 워너 증후군, 요정증, 지방위축증 당뇨병 및 기타 지방위축병들을 포함한다.

용어 "친화성 정제(affinity purified)"란 친화성 크로마토그래피 칼럼을 통해 용리시킴으로써 물질을 정제하는 것을 지칭한다.

ELISA

혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 동종이량체 당단백질이며, 발생시, 및 종양과 관련된 병적 혈관형성에 있어서 혈관 형성에 중요한 혈관형성 인자이다. VEGF의 발현은 저산소증에 대한 반응으로, 그리고, 잠재적으로는 예로서, 성장 인자, 호르몬, 종양유전자와 같은 다른 인자에 대한 반응으로 증가하게 된다 (예로서, 문헌 [[Ferrara N: Vascular endothelial growth factor: Basic science and clinical progress. Endocrine Reviews 25:581-611 (2004)]). 인간 VEGF 유전자는 8개의 엑손을 갖는데, 이는 인트론에 의해 분리되어져 있다. 선택적 RNA 스플라이싱에 의해 121, 165, 189 및 206개의 아미노산을 갖는 단량체인 적어도 4개의 주요 이소형이 생성된다 (예로서, 문헌 ([Houck KA, et al.,: The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 5:1806-1814 (1991)]; 및 [Tischer E, et al.,: The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem 266:11947-11954 (1991)])). 145개의 아미노산을 갖는 단량체 (예로서, 문헌 [Poltorak Z., et al.,: VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem 272:7151-7158 (1997)] 참조) 및 183개의 아미노산을 갖는 단량체 (예로서, [Jingjing L, et al.,: Human Muller cells express VEGF 183, a novel spliced variant of vascular endothelial growth factor. Invest Ophthalmol Vis Sci 40:752-759 (1999)] 참조)를 비롯한, 덜 빈번하게 존재하는 이소형 또한 보고되어 있다. 모든 VEGF 이소형은 2개의 수용체 티로신 키나제, VEGFR-1 (예로서, 문헌 De Vries C, et al.,: The fins-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science 255:989-991 (1992)] 참조) 및 VEGFR-2 (예로서, 문헌 [Terman BI, et al.,: Identification of a new endothelial cell growth factor receptor tyrosine kinase. Oncogene 6:1677-1683 (1991)] 참조)에 결합한다. VEGF₁₆₅는 또한 뉴로필린과 상호작용한다 (예로서, 문헌 [Soker S. et al.,: Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell 92:735-745 (1998)] 참조). VEGF₁₈₉ 및 VEGF₂₀₆은 고도한 친화도로 헤파린에 결합하며, 대개는 세포외 기질(ECM)에서 격리되어 있다. VEGF₁₆₅는 중간 정도의 친화도로 헤파린에 결합하며, 부분적으로는 가용성이고, 부분적으로는 세포 표면 및 ECM에 결합되어 있다. VEGF₁₂₁은 헤파린에 결합하지 않고, 자유롭게 가용성이다. 역전사 PCR-분석법에 의하면 VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅ 는 유방암 및 난소암 종양 표본 및 세포주에서 가장 우세하게 발현된 변이체인 것으로 발견된 반면, VEGF_2O6 발현은 검출되지 않았다. VEGF₁₈₃ 및 VEG₁₈₉ 발현은 상기 세포주에서 검출불가능한 것으로 나타나거나, 낮은 수준으로 나타났고, 종양 표본 중 일부에서 검출되었다 (예로서, 문헌 [Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8:2253-2259 (2002)] 참조).

활성 VEGF 단편은 플라스민 절단에 의해 ECM-결합 VEGF로부터 유리될 수 있으며, 이로써 처음 110개의 아미노산이 생성될 수 있다 (예로서, 문헌 [Keyt BA, et al., The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271:7788-7795 (1996)] 참조). 이는 혈관형성의 생리학적 및 병적 과정에서 VEGF의 생체이용성을 국소적으로 조절하는 기전일 수 있다. 예로서, 문헌 ([Houck KA, et al. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem 1992;267:26031-26037 (1992)]; [Keyt BA, et al. The carboxy-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271:7788-7795 (1996)]; 및 [Roth D, et al. Plasmin modulates vascular endothelial growth factor-A-mediated angiogenesis during wound repair. Am Pathology 168:670-684. (10-12) (2006)])을 참조한다. 그러나, 생물학적 시료 중 VEGF₁₁₀ 농도는 보고된 바 없다. 활성 VEGF 단편은 또한 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP) 절단에 의해 ECM-결합 VEGF로부터 유리될 수 있다. 이는 난소암 환자로부터 유래된 복수 중 1-110에 부가적인 아미노산을 갖는 분해된 VEGF 단편의 발견에 의해 입증된다. 플라스민 및 MMP3 둘 모두 복수에서 검출되었다. 예로서, 문헌 [Lee S, Shahla MJ, et al. Processing of VEGF-A by matrix metalloproteinases regulates bioavailability and vascular patterning in tumors. J Cell Biology 169:681-691 (2005)]을 참조한다.

다양한 항원에 대한 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 비색법, 화학발광법 및 형광분석법에 기초하는 것을 포함한다. ELISA는 혈장 및 뇨 시료 중 소량의 약물 및 기타 항원 성분 측정시에 성공적으로 적용되어 왔으며, 이는 추출 단계를 포함하지 않고, 수행이 간편하다. 본원에서 기술된 분석법은 포획 시약으로서 항체를, VEGF 및 VEGF₁₁₀₊을 위해 검출가능한 항체를 사용하는 ELISA이다. 특정 실시태양에서, ELISA는 세포에 기초하는 것이다. 분석의 제1 단계에서, VEGF를 함유하거나 VEGF₁₁₀₊을 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 시료를 포획 (또는 코트) 항체와 접촉시키고 인큐베이션시켜 포획 항체가 VEGF 또는 VEGF₁₁₀₊을 포획하거나, 그에 결합함으로써 검출 단계에서 검출될 수 있도록 한다. 검출 단계는 검출가능한 항체를 사용하는 것을 포함하는데, 검출가능한 항체는 결합된 VEGF 또는 VEGF₁₁₀₊ 중 어느 것과 접촉되는 경우, 관심의 대상이 되는 단백질에 결합하고, 존재한다면, 검출 수단은 항체 상의 표지를 검출하기 위해 사용되며, 이로써, VEGF 또는 VEGF₁₁₀₊의 양 또는 존재하는 VEGF 또는 VEGF₁₁₀₊의 양이 검출된다. 상기 ELISA는 존재하는 VEGF의 유형을 결정하기 위해 전체 VEGF (예로서, 미국 특허 번호 제6,855,508호; 본원에 기술되어 있는 것, 및 당업계에 공지되어 있는 것) 또는 VEGF의 이소형을 인식하는 VEGF와 비교될 수 있다.

예를 들면, 특정 실시태양에서, 분석법은 하기 단계를 사용한다.

제1 단계

본원의 분석법의 제1 단계에서, 생물학적 시료를 항-VEGF 모노클로날 항체인 고정화된 포획 (또는 코트) 시약과 접촉시키고 그와 함께 인큐베이션시킨다. 이러한 항체들은 임의의 종에서 유래된 것일 수 있으나, 바람직하게는 모노클로날 항체는 뮤린 또는 래트 모노클로날 항체이고, 더욱 바람직하게는 뮤린 항체이며, 가장 바람직하게는 본원에서 동정된 하이브리도마로부터 유래된 MAb 5C3이다. 그러므로, 특정의 바람직한 실시태양에서, 고정화된 모노클로날 항체는 뮤린 모노클로날 항체이고, 가장 바람직하게는, MAb 5C3이다. 고정화는 통상적으로, 분석 절차에 앞서 수-불용성 매트릭스 또는 표면으로의 흡착에 의해 (미국 특허 번호 제3,720,760호) 또는 비-공유 또는 공유 커플링 (예를 들면, 미국 특허 번호 제3,645,852호 또는 문헌 [Rotmans et al. J. Immunol. Methods 57:87-98 (1983)]에 기재된 것과 같이 질산 및 환원제로 지지체를 미리 활성화시키거나 활성화시키지 않은 채로, 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드 가교를 사용하여)에 의해 포획 시약들을 불용화시키거나, 또는 분석 절차 후에 예로서, 면역침전법에 의해 포획 시약들을 불용화시킴으로써 달성된다.

고정화를 위해 사용되는 고체상은, 예를 들어, 표면, 입자, 다공성 매트릭스 등의 형태의 지지체를 비롯한, 필수적으로 수-불용성이고 면역분석 측정법에서 유용한 임의의 불활성 지지체 또는 담체일 수도 있다. 통상적으로 사용되는 지지체의 예는 작은 쉬트, 세파덱스, 폴리비닐 클로라이드, 플라스틱 비드, 및 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함하여 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등으로부터 제조된 분석 플레이트 또는 시험관 뿐만 아니라, 예로서, 여과지, 아가로스, 가교된 덱스트란 및 기타 다당류와 같은 입상 물질을 포함한다. 별법으로, 시아노겐 브로마이드-활성화 탄수화물과 같은 반응성 수-불용성 매트릭스 및 미국 특허 번호 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 기질이 포획 시약 고정화를 위해 적절히 사용된다. 하나의 실시태양에서, 고정화된 포획 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅되고, 특히, 사용되는 바람직한 고체상은 한번에 여러 개의 시료를 분석하는데 사용될 수 있는 다중-웰 마이크로타이터 플레이트, 예로서, 눈 맥시소르브(Nune Maxisorb) 또는 이뮬론(Immulon)과 같은 마이크로테스트 96-웰 ELISA 플레이트이다. 특정 실시태양에서, 플레이트는 예로서, 눈 맥시소르브(NUNC MAXISORB)™ 또는 이뮬론(IMMULON)™으로서 시판되는 것과 같은 마이크로테스트(MICROTEST)™ 또는 맥시소르프(MAXISORP)™ 96-웰 ELISA 플레이트이다.

고체상을 상기 정의된 포획 시약으로 코팅하고, 이것을 원하는 바에 따라 비-공유 또는 공유 상호작용 또는 물리적 결합에 의해 연결시킬 수도 있다. 부착 기법은 미국 특허 번호 제4,376,110호에 기재된 것 및 그에 인용된 참고문헌을 포함한다. 공유 결합일 경우, 플레이트 또는 기타 고체상을 당업계에 공지된 조건하에서 예로서, 실온에서 1시간 동안 포획 시약과 같이 가교제와 함께 인큐베이션시킨다.

포획 시약을 고체상 기질에 부착하기 위해 통상 사용되는 가교제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함한 동종이작용성 이미도에스테르, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도화 시약은 빛의 존재하에서 가교결합을 형성할 수 있는 광활성화 중간체를 생성한다.

96-웰 플레이트가 사용된다면, 이것을 포획 시약 (전형적으로, 약 4-20℃, 또는 약 4-8℃의 온도에서 약 8-12, 또는 약 pH 9-10, 또는 약 pH 9.6의 pH하에 적어도 약 10시간 동안, 더욱 바람직하게, 적어도 밤새도록 인큐베이션시킴으로써 0.05M 탄산나트륨과 같은 완충액에 희석된 포획 시약)으로 코팅한다. 더욱 짧은 코팅 시간을 원한다면, 예로서, 96-웰 플레이트를 실온에서 2시간 동안 코팅할 수 있다. 플레이트를 분석에 앞서 그 자체로 길게 쌓아올리거나 코팅할 수도 있고, 이어서 수작업, 반-자동 방식 또는 자동 방식으로, 예컨대, 로보트공학을 사용하여 여러 시료들에 대해 동시에 분석을 수행할 수 있다.

이어서 전형적으로는 플레이트 웰 상의 과다 부위에 유리 리간드가 원치않게 결합되는 것을 막기 위하여, 코팅된 플레이트를 결합 부위에 비-특이적으로 결합하거나 결합 부위를 포화시키는 차단제로 처리한다. 이러한 목적을 위해 적절한 차단제의 예로는 예를 들면, 젤라틴, 소 혈청 알부민, 난 알부민, 카제인 및 탈지유를 포함한다. 차단 처리는 전형적으로 약 1-4 시간동안, 바람직하게는 약 1 내지 3시간동안, 주변 온도에서, 또는 밤새도록 0-4℃의 조건하에서 수행된다.

코팅 및 차단 후에, 분석하고자 하는, 적절히 희석된 VEGF 표준 (정제된 VEGF) 또는 생물학적 시료를 고정화된 상에 첨가한다. 바람직한 희석 비율은 약 1-15 부피%, 바람직하게 약 10 부피%이다. 이러한 목적으로 희석을 위해 사용될 수 있는 완충액은 (a) 0.5% BSA, 0.05% 트윈(TWEEN)20^TM 세제 (P20), 0.05% 프로클린(PROCLIN)^TM 300 항생제, 5 mM EDTA, 0.25% 챕스(Chaps) 계면활성제, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS; (b) 0.5% 소 혈청 알부민, 0.05% 폴리소르베이트 20, 5 mM EDTA, 0.25% 챕스, 0.2% 소 γ-글로불린, 및 0.35 M NaCl; pH 7.4를 함유하는 PBS; (c) 0.5% BSA, 0.05% 폴리소르베이트 20 (P20), 및 0.05% 프로클린™ 300, pH 7을 함유하는 PBS; (d) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린™ 300, 5 mM EDTA, 및 0.35 M NaCl, pH 6.35를 함유하는 PBS; (e) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린™ 300, 5 mM EDTA, 0.2% 베타-감마 글로불린, 및 0.35 M NaCl, pH 7.4를 함유하는 PBS; 및 (f) 0.5% BSA, 0.05% P20, 0.05% 프로클린™ 300, 5 mM EDTA, 0.25% 챕스, 및 0.35 M NaCl, pH 7.4를 함유하는 PBS를 포함한다. 프로클린™ 300은 방부제로서 작용을 하고, 트윈 20™은 비-특이 결합을 제거하기 위한 세제로서의 작용을 한다.

포획 시약의 농도는 일반적으로, 생물학적 시료의 임의의 필요한 희석을 고려하며, VEGF의 관심의 대상이 되는 농도 범위에 의해 결정되는 반면, 포획 시약의 최종 농도는 보통 관심의 대상이 되는 범위에 걸쳐 분석의 감도를 최대화하기 위해 실험적으로 결정될 것이다.

시료 및 고정화된 포획 시약의 인큐베이션 조건은 분석의 감도를 최대화하고 해리를 최소화하도록 선택된다. 바람직하게는, 인큐베이션은 약 0℃ 내지 약 40℃, 바람직하게, 약 20 내지 25℃ 범위의 상당히 일정한 온도에서 수행된다. 인큐베이션 시간은 주로 온도에 의존하고, 일반적으로 감응이 없는 분석을 피하기 위하여 약 10 시간 이하이다. 바람직하게는, 포획 시약에 대한 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 결합을 최대화하기 위하여, 인큐베이션 시간은 실온에서 약 0.5 내지 3시간, 더욱 바람직하게는 1.5-3시간이다. 생물학적 유체 중의 프로테아제가 VEGF를 분해하는 것을 막기 위하여 프로테아제 억제제가 첨가된다면, 인큐베이션 지속 기간이 더욱 길어질 수도 있다.

이 단계에서, 인큐베이션 혼합물의 pH는 통상 약 4-9.5 범위, 바람직하게는 약 6-9 범위, 더욱 바람직하게는 약 7-8의 범위이고, 가장 바람직하게는 분석(ELISA) 희석액의 pH가 7.4이다. 인큐베이션 완충액의 pH는, 포획되는 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF에 포획 시약을 특이적으로 결합시키는 유의 수준을 유지하도록 선택된다. 이 단계 동안 원하는 pH를 달성하고 유지하기 위해서는 보레이트, 포스페이트, 카보네이트, 트리스-HCl 또는 트리스-포스페이트, 아세테이트, 바르비탈 등을 비롯한, 다양한 완충액이 사용될 수 있다. 사용되는 특정한 완충액은 본 발명에 중요한 것이 아니며, 개개의 분석에서 하나의 완충액이 다른 것에 비해 바람직할 수도 있다.

제2 단계

임의 단계인, 본원의 분석 방법의 제2 단계에서, 포획되지 않은 분자를 제거하기 위해 고정화된 포획 시약으로부터 생물학적 시료를 분리한다 (바람직하게는, 세척에 의해). 세척을 위해 사용된 용액은 일반적으로 상기 인큐베이션 단계를 위해 기재된 고려사항 및 완충액을 사용하여 결정된 pH를 가진 완충액 ("세척 완충액")이며, 바람직한 pH 범위는 약 6-9이다. 세척은 3회 이상 행해질 수도 있다. 세척 온도는 일반적으로 냉장고 온도 내지 중간 온도이며, 분석 기간동안 전형적으로 약 0-40℃, 더욱 바람직하게는 약 4-30℃에서 일정한 온도가 유지된다. 예를 들면, 세척 완충액은 세척 전에 저장기에서 4℃에서 얼음에 배치될 수 있고, 플레이트 세척기가 이 단계에서 사용될 수 있다. 포획된 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF가 후속 단계에서 어느 정도로 해리될 수 있음을 고려한다면, 이에 결합된 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF를 포획 시약에 공유 결합시키기 위해 이 단계에서 가교제 또는 기타 적절한 약제를 첨가할 수도 있다.

제3 단계

다음 단계에서, 바람직하게는 약 20-40℃, 더욱 바람직하게는 약 20-25℃의 온도에서 고정화된 포획 시약을 검출가능한 항체와 접촉시키는데, 상기 둘을 접촉시키기 위한 정확한 온도 및 시간은 주로 사용되는 검출 수단에 의존된다. 예를 들면, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘이 검출용 수단으로서 사용되는 경우, 예로서, 하나의 실시태양에서는 신호를 최대로 증폭시키기 위해 접촉을 (예로서, 약 1시간 이상 동안) 수행한다. 바람직하게, 플레이트를 세척한 후에, 기대되는 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF (상기 기재된 것과 같음)의 최대 농도에 대해 몰 과량의 항체를 플레이트에 첨가한다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능하다. 검출가능한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 예로서, 특정 실시태양에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이고, 하나의 실시태양에서는 뮤린 항체이고, 하나의 실시태양에서는 MAb A4.6.1이다. 또한, 바람직한 검출가능한 항체는 직접적으로 검출될 수 있고, 하나의 실시태양에서는 비색 표지를 갖고, 또다른 실시태양에서는 형광분석 표지를 갖는다. 더욱 바람직하게는, 검출가능한 항체는 비오티닐화되고 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘이다. 검출 수단의 판독은 형광분석적으로 또는 비색적으로 이루어질 수 있다. 항체의 친화력은 소량의 소량의 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF가 검출될 수 있을 정도로 충분히 높아야 하지만, VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF를 포획 시약으로부터 끌어낼 정도로 높아서는 안된다.

제4 단계

분석 방법의 마지막 단계에서, 검출가능한 항체를 위한 검출 수단을 사용하여 포획 시약에 결합된 유리 VEGF의 농도를 측정한다. 생물학적 시료가 혈관, 당뇨병 또는 암 환자로부터 유래된다면, 측정 단계는 바람직하게 정상 개체에 대한 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 농도를 결정하기 위하여 상기 3개의 단계의 결과로서 발생하는 반응을 표준 곡선과 비교하는 것을 포함하거나, 바람직하게는, ELISA가 비교될 때, 및 임의로 정상 개체와 비교될 때 VEGF의 유형의 농도를 결정하기 위하여 상기 3개의 단계의 결과로서 발생하는 반응을, 상이한 이소형 또는 전체 VEGF를 인식하는 또다른 VEGF ELISA와 비교하는 것을 포함한다.

항체 생성

VEGF에 대한 폴리클로날 항체는 일반적으로 VEGF 및 애주번트를 다회에 걸쳐 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사함으로써 동물에서 발생한다. 이작용성 또는 유도화제, 예를 들면, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르 알데히드, 숙신산 무수물, SOCl2 또는 R1N=C=NR (식중, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)를 사용하여, VEGF 또는 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편을, 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예로서, 키홀 림페트 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로블린 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

코트 또는 검출가능한 항체로서 사용되는 항체는 임의의 편리한 척추동물 공급원, 예컨대, 뮤린, 영장류, 토끼목 포유동물, 염소, 토끼, 래트, 닭, 소, 양, 말, 개, 고양이 또는 돼지로부터 수득할 수 있다. 또한, 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,816,567호; 문헌 ([Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)]; [Neuberger et al. Nature 312:604 (1984)]; [Takeda et al. Nature 314:452 (1985)]) 및 1998년 10월 15일 공개된 WO 98/45331 뿐만 아니라, 상기 기재된 추가의 참고문헌에 기재된 바와 같이 키메라 또는 인간화된 항체가 사용될 수도 있다.

(각각 토끼 또는 마우스에 대해) 1 mg 또는 1 ㎍의 접합체를 3 부피의 프로인트 완전 애주번트와 조합하고, 용액을 다수의 부위에서 피내 주사함으로써, 동물을 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킬 수 있다. 1개월 후에, 동물을 다수 부위에서 피하 주사에 의해 프로인트 불완전 애주번트 중의 접합체의 원래 양의 1/5 내지 1/10로 추가면역시킨다. 7일 내지 14일 후에, 동물을 사혈시키고 혈청을 항-VEGF 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체기에 들어갈 때까지 동물을 추가면역시킨다. 바람직하게는, 동물을 상이한 단백질에 접합되고/되거나 상이한 가교제를 통해 접합된 VEGF의 접합체로 추가면역시킨다. 접합체는 또한 단백질 융합체로서 재조합 세포 배약액 중에서 형성될 수 있다. 또한, 알룸과 같은 응집 시약을 사용하여 면역반응을 증진시킨다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 문헌 [Davis et al. Microbiology, 3 ^rd Edition, (Harper & Row, New York, New York, 1980)]과 같은 다수의 면역학 교재에 기재되어 있다.

면역화된 동물로부터 비장 세포를 회수하고, 통상적인 방식으로, 예를 들어, 골수종 세포와의 융합에 의해 또는 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 형질전환에 의해 세포를 무한증식시키고, 원하는 항체를 발현하는 클론을 선별함으로써 모노클로날 항체를 제조한다. 예로서, 문헌 [Kohler and Milstein Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)]를 참조한다. 별법으로, 모노클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 항원-결합 부위, 예로서, Fab 또는 (Fab)₂ 단편을 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다.

적절한 항체의 예로는 당해 단백질에 대해 공지된 RIAs에서 이미 사용된 것, 예로서, 본원 도입부에서 제공된 참고문헌에 기재된 것과 같이 VEGF에 대해 지시되는 항체를 포함한다.

특정 실시태양에서, ATCC 번호 PTA-7737하에 기탁된 하이브리도마로부터 수득할 수 있거나, 그에 의해 생산된 항-VEGF 항체 5C3은 임의로 또다른 항-VEGF 항체인 A4.6.1과 함께 사용된다. 본 발명은 또한 VEGF 1-110에는 결합하지 않지만, 하이브리도마 세포주 PTA-7737에 의해 생산된 모노클로날 항체와 동일한 VEGF₁₁₀₊ 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. ATCC 번호 PTA-7737하에 기탁된 하이브리도마 5C3.1.1을 제공한다.

검출

고정화된 포획 시약에 첨가된 항체는 직접적으로 표지화되거나, 또는 과량의 제1 항체를 세척해 낸 후에, 제1 항체의 동물 종의 IgG에 대해 지시된 제2 표지화된 항체를 몰 과량으로 첨가함으로써 간접적으로 검출되어진다. 후자의 간접적 분석법에서, 계내에서 표지화된 항체를 생성하기 위해, 제1 항체에 대해 표지화된 항혈청을 시료에 첨가한다.

제1 또는 제2 항체를 위해 사용된 표지는 항체에 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF가 결합하는 것을 방해하지 않는 임의의 검출가능한 관능기이다. 적절한 표지의 예는 예로서, 형광색소, 화학발광체 및 방사능 표지과 같이 직접적으로 검출될 수 있는 부분 뿐만 아니라, 검출되기 위해 반응되거나 유도화되어야 하는 효소와 같은 부분을 비롯한, 면역분석법용으로 공지된 다수의 표지이다. 이러한 표지의 예는 방사능 동위원소 ³²P, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I, 형광단, 예로서, 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움베릴페론, 루시퍼라제, 예로서, 반딧불이 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 번호 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 허스래디시 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예로서, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, HRP와 같은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소와 결합된 헤테로사이클릭 옥시다제, 예로서, 유리카제 및 크산틴 옥시다제, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, MUG와 함께 비오틴/스트렙타비딘-β-갈락토시다제, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 형광분석 검출이 일례이다.

이러한 표지들을 단백질 또는 폴리펩티드에 공유 결합시키기 위해 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체를 상기-기재된 형광체, 화학발광체 및 효소 표지로 태깅하기 위하여 커플링제, 예로서, 디알데히드, 카르보디이미드, 디말레이미드, 비스-이미데이트, 비스-디아조화 벤지딘 등이 사용될 수 있다. 예를들면, 미국 특허 번호 제3,940,475호 (형광분석) 및 제3,645,090호 (효소), 문헌 ([Hunter et al. Nature 144:945 (1962)]; [David et al. Biochemistry 13:1014-1021 (1974)]; [Pain et al. J, Immunol. Methods 40:219-230 (1981)]; 및 [Nygren J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412 (1982)])을 참조한다. 특정 실시태양에서, 본원의 표지는 8 pg/ml까지 증폭 및 감도를 증가시키는 형광체이고, 더욱 바람직하게는 신호를 증폭시키는, 스트렙타비딘-β-갈락토시다제 및 MUG와 함께 하는 비오틴이다. 특정 실시태양에서, 비색 표지가 사용되는데, 예로서, 검출가능한 항체는 비오티닐화된 것이고, 검출 수단은 아비딘 또는 스트렙타비딘-퍼옥시다제 및 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘이다.

효소를 비롯한, 상기와 같은 표지를 항체에 접합시키는 것은 면역분석법 기법에 있어 당업자에게 표준의 조작 절차이다. 예를 들면, 문헌 [O 'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," in Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone and H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), pp. 147-166]을 참조한다.

마지막 표지된 항체를 첨가한 후에, 과량의 결합되지 않은 표지된 항체를 세척을 통해 제거한 다음, 표지에 적절한 검출 방법을 사용하여 부착된 표지의 양을 측정하고, 측정된 양을 생물학적 시료 중의 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 양과 서로 연관시킴으로써, 결합된 항체의 양을 결정한다. 예를 들면, 효소의 경우에, 발색되고 측정된 색의 양은 존재하는 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF의 양의 직접적인 척도가 된다. 구체적으로, HRP가 표지라면, 490 nm 흡광도에서 기질 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘을 사용하여 색을 검출한다.

일례로 제1의 비표지 항체에 대해 지시되는 제2의 효소-표지 항체를 고정화 상으로부터 세척한 후에, 고정화된 포획 시약을 효소 기질과 함께 인큐베이션시킴으로써 색 또는 화학발광을 발색시키고 측정한다. 이어서, 유사하게 시행되는 표준 VEGF에 의해 생성된 색 또는 화학발광과 비교함으로써 유리 VEGF₁₁₀₊ 또는 VEGF 농도의 양을 계산한다.

키트

편의상, 본 발명의 분석 방법은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 이러한 키는 하기 기본 요소들:

(a) 인간 VEGF 분자에 대한 모노클로날 항체로 구성된 포획 시약 (여기에서, 모노클로날 항체는 VEGF₁₁₀₊을 인식한다); 및

(b) VEGF의 KDR 및 FLT1 수용체 결합 도메인에 결합하는 검출가능한 (표지화 또는 비표지화) 항체로 구성된 검출 시약을 포함하는 포장된 조합물이다. 이러한 기본 요소는 상기 정의되어 있다. 특정 실시태양에서, 검출 시약은 VEGF1-110의 에피토프에 결합하는 검출가능한 항체(들)를 포함한다.

바람직하게 키트는 포획 시약을 위한 고체 지지체를 포함하고, 이것은 별도의 요소로서 제공될 수 있거나, 또는 그 위에 포획 시약이 이미 고정화되어 있다. 따라서, 키트내의 포획 항체가 고체 지지체 상에 고정화될 수도 있거나, 또는 키트와 함께 포함되거나 키트와는 별도로 제공되는 지지체 상에 고정화될 수도 있다.

바람직하게 포획 시약은 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅된다. 검출 시약은 직접적으로 검출되는 표지화 항체일 수도 있거나, 또는 상이한 종에서 유래된 비표지화 항체에 대해 지시된 표지화 항체에 의해 검출되는 비표지화 항체일 수도 있다. 표지가 효소일 경우, 키트는 통상 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자를 포함하고, 표지가 형광단일 경우, 키트는 검출가능한 발색단을 제공하는 염료 전구체를 포함한다. 검출 시약이 비표지되는 경우, 키트는 바람직하게 형광분석-검출된 방식에서 검출가능한 항체를 위한 검출 수단, 예컨대, 비표지 항체에 대해 지시되는 표지 항체를 추가로 포함할 수 있다. 표지가 효소일 경우, 키트는 통상 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자를 포함하고, 표지가 형광단일 경우, 키트는 검출가능한 발색단을 제공하는 염료 전구체를 포함하며, 표지가 비오틴일 경우, 키트는 아비딘, 예로서, 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 HRP 또는 MUG와 함께 β-갈락토시다제에 접합된 스트렙타비딘을 포함한다.

특정 실시태양에서, 포획 시약은 모노클로날 항체, 바람직하게 설치류 항체, 더욱 바람직하게, 뮤린 또는 래트 항체, 더욱더 바람직하게, 뮤린 항체, 및 가장 바람직하게는, MAb 5C3이다. 또한 특정 실시태양에서, 검출가능한 항체는 비오티닐화된 모노클로날 항체이고, 모노클로날 항체는 설치류 항체이고, 더욱 바람직하게, 뮤린 또는 래트 항체, 더욱더 바람직하게, 뮤린 항체, 추가로 더욱더 바람직하게, MAb A4.6.1이다. 특정 실시태양에서, 포획 시약은 이러한 키트에서 고정화되어 있다.

특정 실시태양에서, 키트는 다양한 형태의 VEGF 및 VEGF₁₁₀₊을 검출하기 위한 것으로서 본원에 기술된 것과 같은 비교 연구용의 다중 ELISA를 함유할 수 있다.

키트는 또한 전형적으로 분석을 수행하기 위한 설명서 및/또는 항원 표준으로서의 VEGF (예를 들어, 정제된 VEGF, 바람직하게는 재조합적으로 생산된 VEGF 및 VEGF110) 뿐만 아니라, 안정화제, 세척 및 인큐베이션 완충액 등과 같은 기타 첨가제를 함유한다.

VEGF를 위한 표준의 예는 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인크.(Genentech, Inc.)로부터 입수가능하거나, 본원에 기술된 회사들 및 공정처리로부터 이용가능한 포유동물 세포에서 생산된 재조합 인간 VEGF이다.

키트의 성분들은 미리결정된 비율로 제공되고, 각종 시약의 상대적인 양은 분석의 감도를 실질적으로 최대화하는 용액 중 시약의 농도를 제공하기 위해 적절히 변한다. 특히, 시약은 건조 분말, 통상 부형제를 포함한 동결건조 분말로서 제공될 수도 있고, 용해시에 이것은 시험되는 시료와의 조합을 위해 적절한 농도를 가진 시약 용액을 제공한다.

물질의 기탁

하기 물질을 미국 20110-2209 버지니아주 매나서스 10801 유니버시티 블러바드에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 기탁하였다: 5C3.1.1은 2006년 7월 19일자로 기탁 번호 PTA-7737하에 ATCC에 기탁되었다.

상기 기탁은 특허 절차 및 감독의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약 (부다페스트 조약)의 규정하에 수행되었다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 살아 있는 배양물의 보관을 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 관점하에서 ATCC에 의해 이용가능하게 될 것이며, 어느 것이 먼저 나오든, 적절한 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시 공중에게 기탁물의 배양물의 후손의 영구적이며 비제한된 이용가능성을 보장하며, 35 USC §122 및 그에 따른 장관의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정 언급을 갖는 37 CFR §1.14 포함)에 따라 표제화된 미국 특허 상표청 장관에 의해 결정된 것에 대한 후손의 이용가능성을 보장하는 제넨테크, 인크.와 ATCC 사이의 동의를 이룬다.

본 출원의 양수인은 적합한 조건하에 배양될 경우 기탁물의 배양물이 죽거나 소실되거나 파괴되어야 할 경우, 물질은 통지시 또다른 동일물로 즉시 대체될 것임을 동의하였다. 기탁물의 이용가능성은 임의의 정부의 권한하에서 그의 특허법에 따라 등록된 권리를 위반하여 본 발명을 실시하는 자격으로서 간주되지 않아야 한다.

본 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시태양은 본 발명의 특정 측면을 단독으로 예시하기 위한 의도일 뿐, 본 발명은 기탁된 작제물의 범위로 제한되지 않으며, 기능적으로 등가인 임의의 작제물을 본 발명의 범주에 포함된다. 본원에서 물질의 기탁은 작성된 기술 내용이 본 발명의 최선의 양식을 비롯한 본 발명의 임의의 측면을 실시할 수 있도록 하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허청구 범위의 범주가 본 명세서에 나타낸 구체적인 예들로 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 본원에 나타내고 기술한 것 이외에도, 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게는 명백할 것이며, 이들은 첨부된 특허청구의 범주에 포함된다.

본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 그러한 견지에서 볼 때 다양한 수정 및 변형이 당업자에게 제안될 것이며, 이는 본 출원 및 첨부된 특허청구의 범주의 정신 및 범위내 포함되는 것임을 이해하여야 한다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다.

실시예 1:

선택적 RNA 스플라이싱에 기인하여 상이한 이소형으로서 발현되는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 종양 혈관형성에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 VEGF₁₆₅ 및 전체 VEGF의 농도를 측정하고, VEGF의 플라스민 분해에 의해 생성된 활성 단편인 VEGF₁₁₀의 상대적인 양을 평가하였다. ELISA A (VEGF165-206 ELISA)는 VEGF₁₂₁을 제외한 VEGF₁₆₅ 및 그보다 긴 이소형을 검출한다. ELISA B (VEGF110-206 ELISA)는 VEGF₁₆₅ 및 이소형, VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₁₀을 검출한다. ELISA C (VEGF121-206 ELISA)는 VEGF₁₆₅ 및 그보다 긴 이소형, VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₁₀을 제외한 VEGF₁₁₀보다 분자량이 더 큰 VEGF 단편 (본원에서는"VEGF₁₁₀₊"로 지칭한다)을 검출한다.

재료 및 방법

시약 및 세포: 재조합 VEGF₁₆₅ (제넨테크), VEGF₁₂₁ (뉴저지주 록키힐 소재의 페프로 테크), VEGF_8-109 (VEGF₁₆₅의 아미노산 8-109로 구성됨) 및 절단된 VEGF₁₂₁ (미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈)은 E. 콜라이에서 생산되었다. 절단된 VEGF₁₂₁은 질량분석법에 의하면 온전한 N-말단을 갖고 있지만, 그의 질량은 26 KDa으로서, 이는 제조사에 따라 카복시-말단으로부터 대략 9개의 아미노산이 절단된 것과 일치한다. 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였을 때 VEGF₁₁₀과 VEGF₁₂₁ 사이에서 이동하였다. VEGF₁₁₀은 VEGF₁₆₅를 플라스민으로 분해하여 제조하였다 (문헌 [Keyt BA, et al.,: The carboxyl-terminal domain (111-165) of vascular endothelial growth factor is critical for its mitogenic potency. J Biol Chem. 271:7788-7795 (1996)]). 질량분석법에 의해 측정된 분자량은 25390였는데, 이는 이론상의 질량인 25389와 일치하는 것이었다. 비신코린산 방법 (일리노이주 록포드 소재의 피어스(Pierce))을 사용하여 농도를 측정하였다. VEGF_8-109, VEGF₁₂₁ 및 VEGF₁₆₅의 농도 측정을 위해 사용되는 분자량은 각각 23.8, 28.9 및 38.2 KDa이었다. CHO 세포에서 생산된 VEGF₁₆₅로 마우스를 면역화시켜 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1, 3.5F8, 2E3 및 5C3을 생성하였다 (문헌 [Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64 (1992)]). 유방 세포주 SK-BR-3, BT-474, T-47D 및 MCF-7 뿐만 아니라, 난소 세포주 ES-2, OVCAR-3 및 SK-OV-3 (메릴랜드주 로크빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)을 37℃ 습윤 5% CO₂하에 RPMI, 2 mM L-글루타민 및 10% FBS (단, OVCAR-3의 경우 20%)에서 배양하였다.

조절된 배지 중 A673 세포의 VEGF의 정제: A673 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)를 50:50 F12/DMEM, 2 mM L-글루타민 및 5% FBS 중에서 60% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양한 후, 컨플루언시에 도달할 때까지 무혈청 배지 (제넨테크)에서 배양하였다. CNBr 활성화된 세파로스 (뉴저지주 피츠카타웨이 애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))로 제조된 A4.6.1-세파로스 칼럼을 사용하여 상등액으로부터 VEGF를 정제하였다. 칼럼 용리액과 재조합 VEGF 대조군 (래인당 0.2 ㎍)을 환원 조건하에 18% 트리스-글리신 겔 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 상에서 전개시키고, 니트로셀룰로스 상에 블롯팅하였다. 블롯을 0.5M 트리스-HCl, pH 7.5, 1.5 M NaCl, 5O mM EDTA, 3% 소 혈청 알부민을 함유하는 0.5% 트리톤 100으로 차단하고, 200 ng/ml의 3.5F8 또는 A4.6.1로 프로빙한 후, 이어서, 2 ng/ml의 염소 항-마우스 Fc-HRP (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))로 프로빙하였다. 슈퍼시그날 웨스트 두라(피어스)를 사용하여 신호를 전개시키고, X선 필름상에 기록하였다.

VEGF 농도 측정을 위한 VEGF ELISA

ELISA A (VEGF165-206 ELISA). 달리 언급하지 않는 한, 시료 중 VEGF를 측정하기 위해 형광분석 ELISA A를 사용하였다. 형광분석 ELISA A는 코팅을 위해 3.5F8을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1에 이어 스트렙타비딘-β-갈락토시다제를, 그리고 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D 갈락토시드를 사용하였다 (문헌 [Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma. J Immunol Methods 219:45-55 (1998)]). VEGF₁₆₅ 표준은 1-128 pg/mL, 또는 0.026-3.35 pM이었다. 비색 ELISA A는 하기 기술된 ELISA C용의 프로토콜을 따라, 코팅을 위해 3.5F8을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1을 사용하였다. VEGF165 표준은 1.6-200 pg/mL였다.

ELISA B (VEGF110-206 ELISA) (앞서 VEGF121-206 ELISA로 명명됨, 문헌 [Konecny GE, et al.,: Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10:1706-1716 (2004)]): 4℃에서 밤새도록 맥시소르프 96-웰 마이크로웰 플레이트를 50 mM 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중 0.5 ㎍/ml 항체 A4.6.1을 사용하여 100 ㎕/웰로 코팅하였다. 상기 단계 후, 그리고 후속의 0.05% 폴리소르베이트 20을 함유하는 PBS (pH 7.4)와의 실온하 인큐베이션 단계들 사이에서 플레이트를 세척하였다. 플레이트를 1시간 동안 PBS (150 ㎕/웰) 중 0.5% 소 혈청 알부민, 10 ppm 프로클린™300 (펜실베이니아주 벨레폰테 소재의 수펠코(Supelco))으로 차단하였다. VEGF 표준 (2배 일련의 희석액으로 1.56-200 pg/ml VEGF₁₆₅ 또는 0.0409-5.24 pM VEGF) 및 0.5% 소 혈청 알부민, 0.05% 폴리소르베이트 20, 5 mM EDTA, 0.25% 챕스, 0.2% 소 γ-글로불린 (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)) 및 0.35 M NaCl (시료 완충액)을 함유하는 PBS (pH 7.4) 중 2배 또는 3배 일련의 희석액으로 일련으로 희석된 시료 (최소 1:10 희석)를 플레이트 (100 ㎕/웰)에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트 상에서 1시간 동안 비오티닐화된 2E3 (또는 VEGF의 수용체 결합 도메인에 결합하는 또다른 항체)을, 이어서, 30분 동안 스트렙타비딘-HRP (덴마크 코펜하겐 소재의 애머샴)에 이어, 15분 동안 비오티닐티라미드 (ELAST ELISA 증폭 시스템, 매사추세츠주 소재의 퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈 인크.(Perkin Elmer Life Sciences Inc.)) 및 30분 동안 스트렙타비딘-HRP를 인큐베이션시켜 결합된 VEGF를 검출하였다. 기질 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘) (키르케가아드 & 페리 라보라토리즈(Kirkegaard & Perry Laboratories))를 가하고, 1 M 인산을 가하여 반응을 종결시켰다. 티테르테크(Titertek) 스태커 판독기 (캘리포니아주 코스타 메이사 소재의 ICN) 상에서 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. 4-파라미터의 회귀 곡선-피팅 프로그램 (칼레이다그래프(KaleidaGraph), 펜실베니아 리딩 소재의 시너지 소프트웨어(Synergy software))을 사용하여 적정 곡선을 피팅하였다. 표준 곡선 범위내 포함되는 데이타 점을 사용하여 시료 중 추정의 VEGF 농도를 계산하였다. 본 연구를 위해 사용된 10% 혈장 중 추정의 2.1 pg/ml 내인성 VEGF를 감산한 후의 10% 인간 EDTA 혈장 (캘리포니아주 테미큘라 소재의 골든 웨스트 바이오로지칼스 인크.(Golden West Biologicals Inc.) 중 1.56-200 pg/ml VEGF₁₆₅의 회수율은 92-120%였다.

ELISA C (VEGF121-206 ELISA): 마이크로웰 플레이트를 1 ㎍/ml 항-VEGF 5C3 항체로 코팅하고, 상기 기술된 바와 같이 차단하였다. VEGF 표준 (2배 일련의 희석액으로 4.00-512 pg/ml VEGF₁₆₅ 또는 0.105-13.4 pM VEGF) 및 시료 완충액 중 일련으로 희석된 시료를 플레이트에 가하였다. 플레이트를 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 비오티닐화된 A4.6.1에 이어 스트렙타비딘-HRP를, 기질로서 TMB를 가함으로써 결합된 VEGF를 검출하였다. 플레이트를 판독하고, 데이타를 상기와 같이 분석하였다. 본 연구를 위해 사용된 10% 혈장 중 1.6 pg/ml의 추정의 내인성 VEGF를 감산한 후의 10% 혈장 중 4.00-512 pg/ml VEGF₁₆₅의 회수율은 77-101%였다.

결과 및 논의

VEGF ELISA: 앞서 기술된 ELISA A는 코팅을 위해 3.5F8을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1을 사용한다 (문헌 [[Rodriguez CR, et al.,: A sensitive fluorometric enzyme-linked immunosorbent assay that measures vascular endothelial growth factor 165 in human plasma. J Immunol Methods 219:45-55, 1998]). 이는 VEGF165 (VEGF₁₆₅)는 검출하지만, R&D 시스템즈로부터 입수한 것으로서, 카복시-말단으로부터 대략 9개의 아미노산이 결실되어 있는 VEGF121(1) (VEGF₁₂₁(1))과, 페프로테크로부터 입수한 VEGF121(2) (VEGF₁₂₁(2))는 검출되지 못한다 (도 1A). 비아코어(BIAcore)에 의하면 3.5F8은 VEGF₁₆₅에 결합하지만, VEGF₁₂₁에는 결합하지 못한다. A4.6.1은 모든 이소형과 VEGF₁₁₀에 존재하는 수용체 결합 도메인 (문헌 [Kim KJ, et al.,: The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64, 1992])에 결합한다. 3.5F8은 VEGF₁₂₁에는 존재하지 않는 아미노산 116 내지 118 부근에 결합할 가능성이 있다. 5C3은 VEGF₁₁₀에는 존재하지 않는 아미노산 111-113 부근에 결합할 가능성이 있다 (도 3). ELISA A는 VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉ 및 VEGF_2O6을 비롯한, VEGF₁₆₅ 서열을 함유하는 VEGF 이소형을 검출할 가능성이 있을 수 있다 (예로서, 문헌 [Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8:2253-2259, 2002]). ELISA B (앞서 VEGF121-206 ELISA로 명명됨, 문헌 [Konecny GE, et al., Association between HER-2/neu and Vascular Endothelial Growth Factor Expression Predicts Clinical Outcome in Primary Breast Cancer Patients. Clinical Cancer Research, 10:1706-1716, 2004])는 코팅을 위해 A4.6.1을, 그리고, 검출을 위해 비오티닐화된 2E3을 사용한다. A4.6.1 및 2E3은 3개 분자 모두에 존재하는 수용체 결합 도메인에 결합한다. 예로서, 문헌 ([Kim KJ, et al. The vascular endothelial growth factor proteins: Identification of biologically relevant regions by neutralizing monoclonal antibodies. Growth Factors 7:53-64 (1992)]; 및 [Muller YA, et al. Vascular endothelial growth factor: Crystal structure and functional mapping of the kinase domain receptor binding site. Proc Natl Acad Sci USA 94:7192-7197 (1997)])을 참조한다. 이들 부위에 결합하는 다른 항체 또한 사용될 수 있다. 상기 ELISA는 동등하게 VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁, 절단된 VEGF₁₂₁ (카복시-말단으로부터 대략 9개의 아미노산이 결실된 것), VEGF₁₁₀ 및 VEGF_8-109를 잘 검출한다 (도 1B). 상기 ELISA는 매트릭스 메탈로프로테이나제 분해에 의해 생성된 VEGF₁₁₀보다 더 큰 단편을 비롯한, 전체 VEGF를 검출할 수 있다. 본원에 기술된 것으로서, 코팅을 위해 5C3을 그리고 검출을 위해 비오티닐화된 A4.6.1을 사용하는 ELISA C는 동등하게 VEGF₁₆₅, VEGF₁₂₁, 및 절단된 VEGF₁₂₁을 잘 검출하지만, VEGF₁₁₀ 또는 VEGF_8-109를 검출하지 못한다 (도 1C). 비아코어에 의하면 5C3은 VEGF₁₂₁에 결합하지만, VEGF_8-109에는 결합하지 못한다. 상기 ELISA는 VEGF₁₁₀과 더욱 작은 단편을 제외한, VEGF_110-206에 의해 검출되는 모든 VEGF 분자를 검출할 수 있다.

최소 1:10의 희석액을 사용하여 이루어진 시료 중 VEGF에 대한 ELISA A, ELISA B 및 ELISA C의 감도는 각각 10, 16 및 40 pg/ml VEGF₁₆₅ (또는 상이한 VEGF 이소형 및 단편에 대해 0.26, 0.41 및 1.05 pM)였다. ELISA B 및 ELISA C는 재현가능하였다 (표 1 & 2). ELISA B 및 ELISA C는 VEGF (VEGF-A)에 특이적이었다. VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D는 농도 50 ng/ml 이하에서만 배경 신호를 나타내었다. 인슐린-유사 성장 인자 1, 성장 호르몬, 재조합 신경 성장 인자, 종양 괴사 인자 (제넨테크), 혈소판-유래 성장 인자 AB, 태반 성장 인자, 형질전환 성장 인자 β1 (R&D 시스템즈) (200 ng/ml 이하)만이 배경 신호를 나타내었다. 헤파린 (영국 벅스 및 아일랜드 더블린 소재의 레오 라보라토리즈(Leo Laboratories)) (100 U/ml 이하)은 분석에 대해 유의적인 효과를 나타내지 않았다.

ELISA B (VEGF_110-206 ELISA): 표준 범위는 완충액 중 1.56-200 pg/ml VEGF₁₆₅ (0.0409-5.24 pM VEGF)였다. 블랭크에 대한 1.56 pg/ml 표준의 OD 비는 1.37±0.11이었다. CV는 변동 계수이다.
대조군^a	평균 (pg/ml)	상호 %CV	내부 %CV
저	3.07	17.7	13.5
중	38.0	9.50	6.54
고	127	9.11	6.95
^a 중 및 고 대조군은 재조합 VEGF₁₆₅를 인간 EDTA 혈장 내로 스파이크시킴으로써 제조하였다. 저 대조군은, 혈장이 내인성 VEGF를 함유하기 때문에, VEGF₁₆₅를 70% 혈장 내로 스파이크시킴으로써 제조하였다. 대조군을 1:10으로 희석하고, 34개의 독립적인 분석법에서 이중으로 분석하였다.

ELISA C (VEGF_121-206ELISA). 표준 범위는 4.00-512 pg/ml VEGF₁₆₅ (0.105-13.4 pM VEGF)였다. 블랭크에 대한 4 pg/ml 표준의 OD 비는 2.72±0.37이었다. CV는 변동계수이다.
대조군^a	평균 (pg/ml)	상호 %CV	내부 %CV
저	3.28	20.6	8.35
중	11.7	6.56	2.39
고	56.5	2.57	1.37
^a 대조군은 재조합 VEGF₁₆₅를 인간 EDTA 혈장 내로 스파이크시킴으로써 제조하였다. 대조군을 1:10으로 희석하고, 15개의 독립적인 분석법에서 이중으로 분석하였다.

세포주의 조절된 배지 중의 VEGF : VEGF₁₆₅cDNA로 형질감염된 6개의 안정한 CHO 클론으로부터의 조절된 배지를 (문헌 [Meng et al., 2000]), 표준으로서 E. 콜라이에서 생산된 비-당화 VEGF를 사용한 3개의 ELISA에 의해 측정하였다. 6개의 안정한 CHO 클론으로부터의 조절된 배지 중 당화된 재조합 VEGF₁₆₅는 3개의 ELISA에서 매우 유사한 농도를 나타내었다. ELISA B에 의해 측정된 농도는 각각 28, 63, 64, 43, 3.8 및 3.2 nM이었다. ELISA B에 의해 측정된 것과 비교하여 ELISA A 및 ELISA C에 의해 측정된 VEGF 농도 비는 각각 0.90±0.08 및 1.08±0.10이었다. 그러므로, 3개의 ELISA는 당화된 VEGF를 동등하게 잘 정량하였고, 배양 조건하에서는 VEGF₁₆₅의 단백질 분해는 거의 없었다.

ELISA A, ELISA B 및 ELISA C에 의해 측정된, A673 세포 조절 배지 중의 VEGF 농도는 각각 0.15, 0.29 및 0.24 nM VEGF였다. ELISA A에 의해 측정된 농도는 더 낮았는데, 이는 VEGF₁₂₁이 존재한다는 것을 시사한다. A4.6.1 친화성 칼럼을 사용하여 조절된 배지로부터 VEGF를 정제하고, 단백질 블롯팅에 의해 분석하였을 때, 2개의 밴드, 가능하게는 당화된 VEGF₁₆₅와 비당화된 VEGF₁₆₅가 3.5F8에 의해 검출되었다. 하위 밴드는 E. 콜라이에서 생산된 정제된 VEGF₁₆₅와 동일한 이동성을 가졌다 (도 2, 좌측). N-글리카나제 처리를 통해 상위 밴드가 하위 밴드로 전환되었다. 가능하게는 당화된 VEGF₁₂₁ (추정의 비당화된 VEGF₁₆₅ 밴드와 부분적으로 중복됨)과 비당화된 VEGF₁₂₁인, 2개의 추가의 저분자 하위 밴드가 A4.6.1에 의해 검출되었다 (도 2, 우측). 하위 밴드는 E. 콜라이에서 생산된 정제된 VEGF₁₂₁과 동일한 이동성을 가졌고, N-글리카나제 처리를 통해 상위 밴드가 하위 밴드로 전환되었다.

ELISA B에 측정된 유방 세포주 SK-BR-3, BT-474, T-47D 및 MCF-7로부터의 조절된 배지 중 VEGF 농도는 각각 3.6, 16, 13, 및 13 pM이었다. ELISA B에 의해 측정된 VEGF 농도에 대한 ELISA A에 의해 측정된 VEGF 농도의 비는 각각 0.49, 0.42, 0.43 및 0.38 (또는 49%, 42%, 43% 또는 38%)이었고, 이는 이들 각 세포주에서의 43, 35, 40 및 41%의 VEGF₁₆₅ 발현율과 일치한다 (문헌 [[Stimpfl M, et al.,: Vascular Endothelial growth factor splice variants and their prognostic value in breast and ovarian cancer. Clinical Cancer Research 8:2253-2259, 2002]). ELISA B에 의해 측정된 VEGF 농도에 대한 ELISA C에 의해 측정된 VEGF 농도의 비는 이들 세포주에 대하여 1.1-1.2였고, 이는 VEGF₁₁₀이 거의 존재하지 않는다는 것을 지시한다. ELISA B에 의해 측정된 난소 세포주 ES-2, OVCAR-3 및 SK-OV-3으로부터의 조절된 배지 중 VEGF 농도는 각각 32, 11 및 20 pM이었다. ELISA B에 의해 측정된 VEGF 농도에 대한 ELISA A에 의해 측정된 VEGF 농도의 비는 이들 각각의 세포주에서 38, 42 및 24%의 VEGF₁₆₅ 발현율과 비교하여 각각 0.24, 0.20, 및 0.32 (또는 24%, 20% 및 32%)였다 (문헌 [Stimpfl et al., 상기 문헌 동일]). ELISA B에 의해 측정된 VEGF 농도에 대한 ELISA C에 의해 측정된 VEGF 농도의 비는 이들 세포주에 대하여 0.64-0.79였고, 이는 VEGF₁₁₀(또는 더 작은 단편)이 존재할 수 있음을 나타낸다.

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션

ATCCPTA-7737

20060719

아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션

ATCCHB10709

19910329

Claims

ATCC 기탁 번호 PTA-7737로 기탁된 하이브리도마 5C3.1.1로부터 수득될 수 있는 모노클로날 항체 5C3의 6개 상보성-결정 부위(CDR)를 포함하는 모노클로날 항체를 포함하고, 상기 모노클로날 항체는 VEGF₁₂₁을 포함하고 VEGF₁₁₀을 포함하지 않는 VEGF₁₁₀₊형태에 특이적으로 결합할 수 있는 것인, 생물학적 시료 중 VEGF₁₂₁을 포함한 VEGF₁₁₀₊ 형태를 선택적으로 검출하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 상기 모노클로날 항체에 의하여 VEGF₁₆₅인 VEGF 형태를 추가로 선택적으로 검출하는 조성물.
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