KR20220157228A - 보툴리눔 독소 a에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 이를 이용한 보툴리눔 독소 a 진단 키트 - Google Patents

보툴리눔 독소 a에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 이를 이용한 보툴리눔 독소 a 진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 22B3에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 이용한 보툴리눔 독소 A 검출용 키트, 및 보툴리눔 독소 A 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 키트는 기존의 검출용 키트와 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 갖는다.

Description

보툴리눔 독소 A에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 이를 이용한 보툴리눔 독소 A 진단 키트 {AN ANTIBODY SPECIFIC FOR BOTULINUM TOXIN TYPE A, HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING THE SAME, AND KIT FOR DETECTING BOTULINUM TOXIN TYPE A USING THE SAME}
본 발명은 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 22B3에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 이용한 보툴리눔 독소 A 검출용 키트, 및 보툴리눔 독소 A 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 키트는 기존의 검출용 키트와 비교하여 월등하게 우수한 민감도를 갖는다.
보툴리눔 독소는 그람양성 세균인 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)에서 생성되는 독성 단백질로, 축삭말단에서 아세틸콜린의 방출을 막아 이완성 마비를 일으킨다.
보툴리눔 독소는 혈청형에 따라 A에서 G까지 7종으로 분류되며, 특히 사람에게 보툴리눔독소증을 유발하는 혈청형은 A, B, E, 및 F의 4종이다. 보툴리눔 독소는 중쇄 (heavy chain, 100kDa)와 경쇄 (light chain, 50kDa)로 구성되어 있고, 중쇄는 N-말단 내부 전위 도메인 (heavy chain, translocation domain, Hn)과 C-말단 수용체 결합 도메인 (heavy chain, binding domain, Hc)을 이루고 있다. 보툴리눔 독소가 체내로 들어오게 되면 혈류를 따라 최종 목적지인 근신경 접합부로 이동한다. 보툴리눔 독소의 수용체 결합 도메인은 세포막의 수용체에 결합하면서 세포질 안으로 유입되고 (endocytosis), 이때 중쇄가 단백질 가수분해 효소로 작용하여 신경전달물질의 분비에 관련된 Soluble N-ethylmaleimide Sensitive Factor-attachment Protein Receptors (SNARE) 단백질을 분해하고 아세틸콜린의 분비를 방해하여 근육의 이완성 마비증상이 나타낸다.
보툴리눔 독소 A의 추정 치사량은 정맥 또는 근육내 주사시 1.3-2.1 ng/kg, 흡입시 10-13 ng/kg, 경구복용시 1000 ng/kg으로 (Arnon SS, Schechter R, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, Fine AD, Hauer J, Layton M, Lillibridge S, Osterholm MT, O'Toole T, Parker G, Perl TM, Russell PK, Swerdlow DL, Tonat K (February 2001). "Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management". JAMA. 285 (8): 1059-70), 자연계에 존재하는 독소 1g 만으로도 수십만 명에서 수백만 명까지 희생자가 발생할 수 있어, 지구상에서 가장 강력한 독소로 분류되고 있다.
보툴리눔 독소증은 보툴리눔 독소가 인체에 심각한 강직성 마비를 일으키는 질병이다. 전신적인 신경마비를 동반하며, 호흡근 마비로 호흡부전에 이르는 것이 주요한 사망기작이다. 보툴리눔 독소증으로 진단되는 경우, 빠른 시간 내에 항독소혈청을 투여하며 호흡부전을 막기 위해 인공호흡 등의 치료가 수반된다. 보툴리눔 독소증 환자의 약 5%정도가 사망에 이르나, 특별한 치료를 받지 않는 경우 치명적이다.
이러한 맹독성 물질인 보툴리눔 독소를 테러 등의 생물학 무기로 사용할 가능성이 제기되고 있고, 그러한 상황에서 적절하고 신속한 대응을 위해 보툴리눔 독소를 신속하게 진단 내지 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
한편, 면역분석방법은 특정 물질의 정량적 분석을 위하여 그 물질에 대한 특이적인 항체를 사용하여 높은 민감도와 특이도를 요구하는 분석시스템의 개발에 이용되고 있으며, 그 중 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)는 생물학적 시료들 (혈액, 뇨, 조직, 세포 등)에 포함되어 있는 특정 항원 혹은 항체를 면역반응과 생화학 반응을 결합하여 측정하는 방법으로, 약 50년 전 개발된 이후 전 세계적으로 빠르게 급변하는 생명과학분야와 신약개발 분야에서 널리 사용되고 있다.
샌드위치 ELISA는 포획 항체와 검출 항체 두 종류의 항체를 이용하며, 항원의 각기 다른 부위에 결합할 수 있도록 하여 민감도를 높일 수 있는 기술로 정량분석에 이용되고 있다. 샌드위치 ELISA에서는 웰 위에 포획 항체를 결합시킨 뒤, 항원이 포획 항체와 결합하면, 검출항 체가 포획 항체-항원에 다시 결합하게 되고, 이후 생화학 반응에 의해 검출 가능한 신호로 전환되는 방법을 이용하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 효소면역분석법의 특이성 및 높은 민감도를 이용하여 보툴리눔 독소 A를 신속하고 특이적으로 진단할 수 있는 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 보툴리눔 독소 A를 신속하고 민감하게 검출할 수 있는 진단 키트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
한국공개특허 제10-2005-0046911호 한국등록특허 제10-1720887호
Figgitt DP, Noble S (2002). "Botulinum toxin B: a review of its therapeutic potential in the management of cervical dystonia". Drugs. 62 (4): 705-22 Arnon SS, Schechter R, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, Fine AD, Hauer J, Layton M, Lillibridge S, Osterholm MT, O'Toole T, Parker G, Perl TM, Russell PK, Swerdlow DL, Tonat K (February 2001). "Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management". JAMA. 285 (8): 1059-70
본 발명은 보툴리눔 독소 A에 특이적인 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 22B3, 이를 이용한 보툴리눔 독소 A 진단키트, 및 보툴리눔 독소 A 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질을 특이적으로 인지하는 단클론항체 및 항체 생산용 하이브리도마 세포주 (22B3)를 제공하며, 이를 이용한 보툴리눔 독소 A 진단 및 탐지 키트를 개발하여, 생물테러 및 보툴리눔 독소증 의심환자에 대한 신속하고 정확한 진단에 활용하고자 한다.
본 발명은 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 (HCCA) 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 제공한다.
본 발명의 상기 단클론항체, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하이브리도마 세포주 22B3에 의해 생산된 것일 수 있고, 이의 이소타입 (isotype)은 IgG1 카파 (kappa)일 수 있다.
본 발명은 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포주 22B3을 제공한다. 상기 하이브리도마 세포주 22B3은 2021년 2월 16일 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00511로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명은 포획 항체 (capturing antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체 (detection antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하며, 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00511로 기탁된 하이브리도마 세포주 22B3에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 포획 항체 (capturing antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체 (detection antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하며, 상기 단클론항체는 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 포획 항체 (capturing antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체 (detection antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하며, 상기 단클론항체는 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 상기 검출 항체는 검출표지, 예를 들어, 비오틴과 연결된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 다클론항체는 보툴리눔 독소 A 항원으로 면역된 동물의 혈청에서 분리된 것일 수 있으며, 보툴리눔 독소 A 항원에 CFA (Complete Freund’s adjuvant) 및 IFA (Incomplete Freund’s adjuvant)로 이루어진 군에서 하나 이상을 추가로 혼합하여 면역된 동물의 혈청에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에서, 검출 가능한 최소 농도 (LLD)가 10 ng/mL 미만일 수 있고, 바람직하게 1 ng/mL 미만일 수 있다.
본 발명은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 보툴리눔 독소 A에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함하며, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주 22B3 (수탁번호 KCLRF-BP-00511)에 의해 생산된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 보툴리눔 독소 A에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함하며, 상기 단클론항체는 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 보툴리눔 독소 A에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함하며, 상기 단클론항체는 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)을 사용하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 진단 키트 및 검출 방법은 목적 시료 내 보툴리눔 독소 A를 민감하고 특이적으로 검출하는 것이 가능하다. 특히, 본 발명의 보툴리눔 독소 A 진단 키트에 보툴리눔 독소증 의심 검체를 적용하는 경우, 6시간 이내에 검사가 가능하며 0.128 ng/mL의 보툴리눔 독소 A를 검출할 수 있을 정도로 민감도가 우수하다.
따라서, 보툴리눔 독소 A를 이용한 생물테러 또는 보툴리눔 독소증 의심 환자 발생시 신속하고 정확한 진단 및 검사에 사용될 수 있으며, 국가 생물테러를 대비하고 대응하는 능력 향상에 기여할 수 있다.
도 1은 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질의 발현을 나타낸다.
도 2는 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질의 분리 및 정제한 결과를 나타낸다.
도 3은 보툴리눔 독소 A에 대한 다클론항체의 생산 여부를 ELISA를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4 및 도 5는 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 Intra-assay 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
도 6 및 도 7은 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 Inter-assay 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
도 8 및 도 9는 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 Intermediate-assay 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
도 10 및 도 11은 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 민감도 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
도 12는 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 최소 검출 한계 (LLD) 및 최소 정량 한계 (LOQ)를 나타낸다.
도 13 및 도 14는 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 교차반응 검사 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
도 15 및 도 16은 본 발명에 따른 보툴리눔 독소 A 검출용 키트에 대한 spike and recovery 검사 분석 결과 및 검량선을 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
항체
본 발명은 보툴리눔 독소 A, 구체적으로 서열번호 9의 염기서열을 갖는 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 (C-terminal receptor binding domain) (HCCA) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본원에서 사용된 용어 "항체"는 천연 면역글로불린 또는 부분적으로 또는 전체적으로 합성하여 생산된 면역글로불린이다. 상기 용어는 또한 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 항원 결합 도메인을 포함하는 항체 단편은 Fab, scFv, Fv, dAb, Fd 및 다이아바디 (diabody)와 같은 분자이다. 용어 "항체"는 광범위한 의미로 이용되며, 구체적으로 온전한 단일클론항체, 다클론항체, 적어도 두 개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체)를 포함하며, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편도 포함한다. 항체는 2개의 중쇄 (heavy chain)와 2개의 경쇄 (light chain)로 구성되며, 대상 항원의 종류에 따라 아미노산 서열이 달라지는 가변부위 (variable region)와 서열이 달라지지 않는 불변부위 (constant region)를 갖는다.
경쇄 및 중쇄의 가변부위는 "상보성 결정 부위 (complementarity-determining region, CDR)"라고 불리우는 매우 가변적인 3개의 영역을 포함한다. CDR은 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하며, 각 체인의 CDR은 전형적으로 3개의 영역 (CDR1, CDR2 및 CDR3)을 갖는다.
본원에 사용된 용어, "특이적으로 결합 (specifically binding)"은 당업자에게 통상적으로 알려져있으며, 구체적으로, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.
발명의 일 실시태양에서, 상기 항체는 단클론항체일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 항체는 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단클론항체 (monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다.
발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주에서 생산되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포 (myeloma cell)와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 하이브리도마 세포주는 22B3일 수 있으며, 바람직하게는, 2021년 2월 16일 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00511로 기탁된 하이브리도마 세포주 22B3일 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트 (Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주 마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다.
피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 방법으로 얻은 하이브리도마를 배양하여 단클론항체를 얻는다. 배양 방법은, 특별히 제한은 없고, 목적에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.
또한, 상기 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다.
상기 하이브리도마가 생산하는 단클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도 (예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.
한편, 바람직한 실시태양에서, 단클론항체는 IgG 면역글로불린 이소타입, 예를 들어, IgG1 카파일 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 항체는 다클론항체일 수 있다.
다클론항체는 통상적으로 체내의 다양한 B 세포 클론에서 생산되는 불균일한 항체분자 집단이다. 이들은 단일 항원의 여러가지 많은 에피토프 (epitope)를 인식하여 이에 결합할 수 있다.
다클론항체는 면역원을 동물에 주입하여 체액성 면역반응을 유도하여 수득한다. 동물에 특정 항원을 주입하여 1차 면역 반응을 유도한 후, 동물을 다시 2차 또는 3차 면역화시켜 특정 항원에 대한 높은 역가의 항체를 생성한다. 면역화 후, 다클론항체는 혈청으로부터 직접 수득될 수도 있고, 또는 정제하여 다른 혈청 단백질이 제거된 용액을 수득할 수도 있다.
진단 키트 및 검출 방법
본 발명은 포획 항체 (capturing antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체; 및 검출 항체 (detection antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트를 제공한다. 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00511로 기탁된 하이브리도마 세포주 22B3에 의해 생산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 단클론항체는 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 보툴리눔 독소 A 검출 키트에는 검사대상시료를 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 항원 단백질의 존재유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 보툴리눔 독소 A를 면역분석 방법에 따라 검출하여 보툴리눔 독소 A 감염여부를 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석 (immunoassay) 또는 면역염색 (immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은, 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 효소결합면역측정법 (ELISA), 유세포 분석 (flow cytometry), 면역형광염색 면역친화성 정제, 면역 크로마토그래피 (immunochromatography) 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명은 상기 보툴리눔 독소 A 검출 키트를 사용하여, 상기 단클론항체 및 다클론항체를 검사대상시료와 접촉시켜, 이로부터 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소 A 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 검출 방법은
(a) (i) 검사대상시료;
(ii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체인 포획 항체; 및
(iii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
(b) 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
(c) 상기 보툴리눔 독소 A에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
를 포함한다. 상기 단클론항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00511로 기탁된 하이브리도마 세포주 22B3에 의해 생산된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 단클론항체는 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정 (Sandwich ELISA)법일 수 있다. 구체적 실시태양에서, 상기 다클론항체의 검출 표지로 비오틴을 사용하고, Avidin-HRP (Horseradish peroxidase, 호스래디쉬 퍼옥시다제)와 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)를 사용하여 발색을 유도한 뒤, 흡광도로 측정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 검사대상시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 채취되거나 분리된 것, 예를 들어, 혈액 또는 혈액 구성성분 (blood constituent), 체액 (bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 보툴리눔 독소 A 항원과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단클론항체 및 다클론항체의 결합물을 의미하며, 이 때 다클론항체는 검출 항체로서, 보툴리눔 독소 A의 C말단 수용체 결합 도메인 단백질이 단클론항체 (포획 항체)와 결합한 부분 이외의 항원결정기 (epitope)에 결합될 수 있다. 이러한 항원-항체 복합체는 비색법 (colormetric method), 전기화학법 (electrochemical method), 형광법 (fluorimetric method), 발광법 (luminometry), 입자계수법 (particlecounting method), 육안측정법 (visual assessment) 및 섬광계수법 (scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 상기 검출에 의해, 보툴리눔 독소 A를 정성적 또는 정량적 분석할 수 있다.
본 발명의 항원-항체 복합체를 검출하기 위해 다클론항체는 여러가지 검출 표지와 연결될 수 있다. 검출 표지의 구체적인 예로는 화학물질 (예를 들어, 비오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP) 및 사이토크롬 P450), 방사능물질 (예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출 표지는 비오틴이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질 발현벡터 제작, 발현 및 정제
보툴리눔 독소 A형 중쇄의 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질 (C-terminal receptor binding domain) (HCCA)을 암호화하는 1311bp의 염기서열을 화학합성을 통하여 제작한 후, pET19b 벡터의 Nde I과 BamH I 부위에 삽입하였다. 상기 염기서열은 서열번호 9로, 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 염기서열
서열번호 9 NdeI) CATATG
CGCTTGCTGAGCACCTTTACCGAGTATATCAAGAACATCATTAACACTTCCATCCTGAACCTGCGTTACGAAAGCAATCATCTGATTGATCTCAGCCGCTATGCGAGCAAAATCAATATTGGAAGCAAAGTGAACTTCGACCCTATAGACAAAAACCAGATTCAACTGTTCAATCTGGAATCCAGCAAAATTGAGGTAATTCTGAAGAATGCCATTGTTTATAATAGCATGTATGAAAATTTCAGCACTAGCTTCTGGATTCGTATTCCGAAGTATTTCAATAGCATAAGCCTGAATAATGAATATACCATTATTAACTGCATGGAAAACAATAGCGGCTGGAAAGTTAGCCTGAACTACGGCGAGATAATTTGGACGCTGCAGGATACACAAGAGATAAAACAGAGAGTAGTGTTTAAATATAGCCAGATGATAAACATTAGCGACTATATCAACCGCTGGATCTTTGTGACGATCACGAACAACCGTCTCAACAACAGCAAAATTTACATTAACGGACGTCTGATTGATCAGAAACCCATCAGCAACCTGGGTAACATTCACGCCAGCAATAACATTATGTTTAAGTTGGATGGATGTCGGGACACCCATCGTTATATATGGATTAAATACTTTAACCTGTTTGATAAAGAGCTGAATGAGAAGGAAATCAAAGATCTGTATGATAATCAGTCAAATAGCGGTATTCTGAAAGATTTTTGGGGCGATTATCTGCAGTATGATAAACCGTATTATATGCTTAATCTGTATGATCCAAATAAGTACGTCGATGTGAATAACGTAGGTATACGTGGTTACATGTATCTGAAAGGTCCGCGTGGGAGCGTGATGACCACAAATATTTACCTGAATAGCAGCCTGTACCGCGGCACCAAATTCATCATCAAAAAGTATGCTAGCGGGAACAAAGATAATATCGTTAGGAATAACGACCGCGTTTATATTAATGTCGTCGTCAAGAACAAAGAATACCGTCTGGCAACGAATGCTTCCCAGGCGGGGGTTGAAAAAATCCTCAGCGCGCTGGAAATCCCAGACGTGGGCAACCTGAGCCAAGTTGTGGTTATGAAAAGCAAAAATGATCAGGGGATAACAAACAAGTGCAAGATGAACCTACAGGACAATAATGGCAACGATATTGGATTTATTGGCTTTCATCAGTTCAACAATATAGCAAAACTGGTAGCAAGCAATTGGTACAACCGTCAGATAGAAAGAAGCAGCCGGACACTGGGTTGTAGCTGGGAGTTTATCCCGGTCGACGATGGGTGGGGTGAACGGCCTCTGTAA
GGATCC (BamHI)
클로닝이 확인된 pET19b-HCCA DNA는 E. coli BL21(DE3) codon-plus RIL 균주에 형질 전환 후 37℃, 0.4 mM IPTG, 200 rpm, 4시간 동안 단백질 발현을 유도하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 또한, NI-NTA 컬럼을 이용하여 단백질을 분리 및 정제하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
[실시예 2]
보툴리눔 독소 A에 대한 단클론항체 제작
보툴리눔 독소 A에 대한 단클론항체 제작을 위하여, 상기 실시예 1에서 분리 및 정제한 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질을 마우스의 발바닥에 100 mg의 농도로 면역하고 2주 후 동일한 양을 추가면역 (booster injection)하였다. 추가면역은 1주 간격으로 3회 실시하였으며, 면역이 완료된 후 혈청 내 titer가 높은 마우스를 선별하여 림프절에서 림프구를 분리하고 골수종 (sp2/0 myeloma) 세포와 세포융합을 실시하였다. 선택배지를 이용하여 융합이 된 세포를 선별하고, ELISA를 수행하였다. 최종적으로 흡광도 값이 높은 22B3 단클론항체 생산 세포 (하이브리도마 세포주 22B3; 수탁번호 KCLRF-BP-00511)를 선별하였고, 이를 배양하여 단클론항체를 얻었다. 상기 단클론항체의 중쇄 가변영역 (VH) 및 경쇄 가변영역 (VL), 중쇄의 CDR (CDRH) 및 경쇄의 CDR (CDRL) 서열을 하기 표 2에 나타내었다.
서열번호 아미노산 서열
서열번호 1 중쇄 CDR1
(CDRH1)		 GYSITSDYA
서열번호 2 중쇄 CDR2(CDRH2) ISYSGST
서열번호 3 중쇄 CDR3(CDRH3) ARGYDALDY
서열번호 4 경쇄 CDR1(CDRL1) SSVSY
서열번호 5 경쇄 CDR2(CDRL2) DTS
서열번호 6 경쇄 CDR3(CDRL3) QQWTSDPLT
서열번호 7 중쇄(VH) DVKLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGSTSYNPSLKSRISITRDTSRNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGYDALDYWGQGTSVTVSS
서열번호 8 경쇄(VL) DIVMTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSDPLTFGAGTKLELK
상기 단클론항체의 특성을 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었고, 이를 통해 항체의 이소타입 (isotype)은 IgG1 (kappa)임을 확인하였다.
IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM Kappa Lamda H-chain L-chain
흡광도
(OD450)		 2.604 0.197 0.189 0.185 0.159 0.157 1.254 0.173 IgG1 Kappa
[실시예 3]
보툴리눔 독소 A에 대한 다클론항체 제작
보툴리눔 독소 A에 대한 다클론항체 제작을 위하여, New Zealand White 토끼에 2주 간격으로 100 mg의 alkylated 보툴리눔 독소 A 항원을 3회 면역하였다. 1차 면역은 Complete Freund’s adjuvant (CFA)와 항원을 혼합하여 면역하였고, 2차 면역은 Incomplete Freund’s adjuvant (IFA)와 항원을 혼합하여 면역하였다. 3차 면역은 면역 보조제 없이 항원만 면역하였다. 3회 면역 후 혈청을 분리 및 희석하여 보툴리눔 독소 A의 항체에 대해 ELISA를 수행하였다. 희석비에 대한 면역 전, 후의 혈청 흡광도 값을 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
희석비 면역 전 혈청 흡광도 값 면역 후 혈청 흡광도 값
1/10 0.64735 1.9905
1/102 0.35595 2.0485
1/103 0.1492 2.12385
1/104 0.06395 1.9389
1/105 0.0589 1.1412
1/106 0.05485 0.2734
1/107 0.05195 0.0736
1/108 0.05515 0.05305
상기 표 4 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 3회 면역 후의 혈청은 1/106배 희석시에도 흡광도 값을 나타내는 것을 확인하였다.
[실시예 4]
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트 제작
상기 실시예 2에서 제조된 단클론항체 및 상기 실시예 3에서 제조된 다클론항체를 이용하여 보툴리눔 독소 A 검출용 Sandwich 효소결합면역측정법 (ELISA) 키트를 제작하였다. 보툴리눔 독소 A 검출을 위하여 단클론항체를 포획 항체 (capture antibody)로 사용하고, 비오틴 (biotin)과 결합한 다클론항체를 검출 항체 (detection antibody)로 사용하였으며, Avidin-HRP와 TMB를 사용하여 발색을 유도하였다.
제작한 키트는 다음과 같이 최적화하였다. 포획 항체로서 단클론항체의 농도는 2.5 mg/mL이고, 검출 항체로서 비오틴이 결합된 다클론항체의 농도는 0.4 mg/mL이고, Avidin-HRP는 1:15,000의 비로 희석하여 사용하고, 발색시간은 10분이다.
따라서, 이후 실시예에서는 상기 최적화 조건을 통해 생산된 보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트를 이용하여 진행하였다.
[실시예 5]
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트의 정밀성 (precision) 검사
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트의 정밀성 검사는 Intra-assay, Inter-assay, Intermediate assay의 변동계수 (%CV: Coefficient of variation)로 확인하였으며, 정량분석을 위한 표준독소는 Metabiologics사의 제품을 사용하였다.
Intra-assay
Intra-assay를 진행하기 위하여, 상기 실시예 4의 최적화 과정을 통해 설정한 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 ELISA 키트 배치에서 12번 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값을 평균하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
설정된 수식을 이용하여 실험상의 농도와 표준편차를 분석하였고, 이를 이용하여 변동계수 (%CV)를 계산하여 하기 표 5에 나타내었다. 분석 결과, 0.15625~10 ng/mL의 검출 범위에서 변동계수 (%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Sample Intra-assay of toxin A kit
1 2 3 4 5 6 7
N 12 12 12 12 12 12 12
Average OD 0.211 0.297 0.383 0.475 0.602 0.969 1.764
SD 0.01 0.02 0.029 0.022 0.033 0.045 0.077
%CV 5.10 6.78 7.66 4.62 5.51 4.64 4.37
Inter-assay
Inter-assay를 진행하기 위하여, 상기 실시예 4의 최적화 과정을 통해 설정한 동일한 분석 조건으로 생산된 서로 다른 6개의 ELISA 키트 배치에서 각각 2번씩 12번 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값을 평균하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
설정된 수식을 이용하여 실험상의 농도와 표준편차를 분석하였고, 이를 이용하여 변동계수 (%CV)를 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 분석 결과, 0.15625~10 ng/mL의 검출 범위에서 변동계수 (%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Sample Inter-assay of toxin A kit
1 2 3 4 5 6 7
N 12 12 12 12 12 12 12
Average OD 0.149 0.176 0.219 0.326 0.516 0.876 1.645
SD 0.010 0.014 0.010 0.018 0.034 0.048 0.036
%CV 6.70 8.31 4.89 5.62 6.65 5.51 2.22
Intermediate assay
Intermediate-assay를 진행하기 위하여, 상기 실시예 4의 최적화 과정을 통해 설정한 동일한 분석 조건으로 생산된 ELISA 키트를 서로 다른 날짜, 서로 다른 분석자가 각각 6번씩 12번 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값을 평균하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.
설정된 수식을 이용하여 실험상의 농도와 표준편차를 분석하였고, 이를 이용하여 변동계수 (%CV)를 계산하여 하기 표 7에 나타내었다. 분석 결과, 0.15625~10 ng/mL의 검출 범위에서 변동계수 (%CV)는 10% 미만의 가용 기준을 만족하였다.
Sample Intermediate assay of toxin A kit
1 2 3 4 5 6 7
N 24 24 24 24 24 24 24
Average OD 0.141 0.178 0.223 0.352 0.555 0.912 1.594
SD 0.008 0.013 0.010 0.019 0.035 0.057 0.092
%CV 5.89 7.78 4.80 5.50 6.38 6.25 5.81
[실시예 6]
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트의 민감도 (sensitivity) 검사
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트의 민감도 검사를 진행하기 위하여, 상기 실시예 4의 최적화 과정을 통해 설정한 동일한 분석 조건으로 생산된 동일한 배치의 키트를 이용하여 12번 반복 실험을 수행하였다. 얻어진 값을 평균하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
검출 가능한 최소 농도 (LLD: low limit of detection)는 최종적으로 확인된 표준곡선의 0 ng/mL 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 계산하였고, 평균값에 표준편차 3배 값을 더해 OD 값을 구하고 4 parameter 방식을 사용하여 검출 가능한 최소 농도를 계산하였다.
AVE+3SD=LLD (AVE: 평균값, SD: 표준편차)
정량 가능한 최소 농도 (LOQ: limit of quantitation)는 최종적으로 확인된 표준곡선의 0 ng/mL 농도의 평균값과 표준 편차를 이용하여 계산하였고, 평균값에 표준편차 10배 값을 더해 OD 값을 구하고 4 parameter 방식을 사용하여 검출 가능한 최소 농도를 계산하였다.
AVE+10SD =LOQ (AVE: 평균값, SD: 표준편차)
상기 계산 결과를 도 12에 나타내었으며, 최소 검출 한계 OD 값은 0.118이었고, 검출 가능한 최소 농도 (LLD)는 0.128 ng/mL이었으며, 정량 가능한 최소 농도 (LOQ)는 0.178 ng/mL이었다.
따라서, 기존의 독소 다중 탐지 키트의 보툴리눔 독소 A의 LLD가 50 ng/mL임을 고려할 때, 본 발명의 ELISA 키트는 기존의 키트에 비해 약 380배의 민감도가 향상된 것을 알 수 있다.
[실시예 7]
보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트의 정확도 (accuracy) 검사
교차반응 검사 (Cross reactivity test)
상기 실시예 4에서 제작된 보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트가 보툴리눔 독소 A만을 특이적으로 검출할 수 있는지를 확인하기 위하여 다른 단백질들과의 교차반응을 조사하였다. 양성 대조군은 Toxin A 항원을 사용하였고 음성 대조군으로 Toxin B, Ricin, 페스트균 F1 항원을 사용하였으며, 각각의 항원은 희석용액으로 10 ng/mL부터 3단계 계단 희석하였다. 표준 항원을 이용하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, Toxin A 항원을 제외한 모든 항원이 최소 검출 한계 (LLD) 이상의 값을 나타내지 않았으며, 따라서 본 발명의 보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트는 다른 항원들과의 교차반응이 없음을 확인하였다.
Spike and recovery test
상기 실시예 4에서 제작된 보툴리눔 독소 A 검출용 ELISA 키트가 임의의 농도로 희석한 보툴리눔 독소 A 단백질을 정확하게 분석할 수 있는지를 확인하기 위하여, 보툴리눔 독소 A 표준 항원을 희석용액으로 8 ng/mL, 2.5 ng/mL, 0.5 ng/mL로 희석하여 실험을 수행하였다. 표준 항원을 이용하여 검량선과 수식을 구하였고, 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 측정한 3가지 농도에서 표준 항원 농도에 대한 회복률이 91~112%를 나타내는 것을 확인하였으며, 허용 범위인 80~120%의 기준을 모두 만족하였다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00511 20210216
<110> Korea Disease Control and Prevention Agency GW VITEK CO., LTD. <120> AN ANTIBODY SPECIFIC FOR BOTULINUM TOXIN TYPE A, HYBRIDOMA CELL LINE PRODUCING THE SAME, AND KIT FOR DETECTING BOTULINUM TOXIN TYPE A USING THE SAME <130> KCD20P-0001-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VH CDR1 <400> 1 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VH CDR2 <400> 2 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VL CDR1 <400> 4 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VL CDR2 <400> 5 Asp Thr Ser 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Trp Thr Ser Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VH <400> 7 Asp Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22B3 antibody VL <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asp Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Botulinum toxin type A heavy chain C-terminal receptor binding domain <400> 9 cgcttgctga gcacctttac cgagtatatc aagaacatca ttaacacttc catcctgaac 60 ctgcgttacg aaagcaatca tctgattgat ctcagccgct atgcgagcaa aatcaatatt 120 ggaagcaaag tgaacttcga ccctatagac aaaaaccaga ttcaactgtt caatctggaa 180 tccagcaaaa ttgaggtaat tctgaagaat gccattgttt ataatagcat gtatgaaaat 240 ttcagcacta gcttctggat tcgtattccg aagtatttca atagcataag cctgaataat 300 gaatatacca ttattaactg catggaaaac aatagcggct ggaaagttag cctgaactac 360 ggcgagataa tttggacgct gcaggataca caagagataa aacagagagt agtgtttaaa 420 tatagccaga tgataaacat tagcgactat atcaaccgct ggatctttgt gacgatcacg 480 aacaaccgtc tcaacaacag caaaatttac attaacggac gtctgattga tcagaaaccc 540 atcagcaacc tgggtaacat tcacgccagc aataacatta tgtttaagtt ggatggatgt 600 cgggacaccc atcgttatat atggattaaa tactttaacc tgtttgataa agagctgaat 660 gagaaggaaa tcaaagatct gtatgataat cagtcaaata gcggtattct gaaagatttt 720 tggggcgatt atctgcagta tgataaaccg tattatatgc ttaatctgta tgatccaaat 780 aagtacgtcg atgtgaataa cgtaggtata cgtggttaca tgtatctgaa aggtccgcgt 840 gggagcgtga tgaccacaaa tatttacctg aatagcagcc tgtaccgcgg caccaaattc 900 atcatcaaaa agtatgctag cgggaacaaa gataatatcg ttaggaataa cgaccgcgtt 960 tatattaatg tcgtcgtcaa gaacaaagaa taccgtctgg caacgaatgc ttcccaggcg 1020 ggggttgaaa aaatcctcag cgcgctggaa atcccagacg tgggcaacct gagccaagtt 1080 gtggttatga aaagcaaaaa tgatcagggg ataacaaaca agtgcaagat gaacctacag 1140 gacaataatg gcaacgatat tggatttatt ggctttcatc agttcaacaa tatagcaaaa 1200 ctggtagcaa gcaattggta caaccgtcag atagaaagaa gcagccggac actgggttgt 1260 agctgggagt ttatcccggt cgacgatggg tggggtgaac ggcctctgta a 1311

Claims (17)

  1. 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며, 하이브리도마 세포주 22B3 (수탁번호 KCLRF-BP-00511)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
  2. 보툴리눔 독소 A의 중쇄 C-말단 수용체 결합 도메인 단백질에 특이적으로 결합하며, 하이브리도마 세포주 22B3 (수탁번호 KCLRF-BP-00511)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
  3. 서열번호 1의 서열을 갖는 CDRH1; 서열번호 2의 서열을 갖는 CDRH2; 및 서열번호 3의 서열을 갖는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 4의 서열을 갖는 CDRL1; 서열번호 5의 서열을 갖는 CDRL2; 및 서열번호 6의 서열을 갖는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는,
    보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  4. 서열번호 7의 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체.
  5. 제1항 내지 제4항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1 카파 (kappa)인 것을 특징으로 하는, 단클론항체.
  6. 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 것을 특징으로 하는, 하이브리도마 세포주 22B3 (수탁번호 KCLRF-BP-00511).
  7. 제6항에 있어서, 상기 단클론항체는 IgG1 카파 (kappa)인 것을 특징으로 하는, 하이브리도마 세포주 22B3 (수탁번호 KCLRF-BP-00511).
  8. 포획　항체 (capturing antibody)로서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론항체; 및
    검출　항체 (detection antibody)로서 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하는 다클론항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 표지와 연결된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출 표지는 비오틴인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  11. 제8항에 있어서, 상기 다클론항체는 보툴리눔 독소 A 항원으로 면역된 동물의 혈청에서 분리된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다클론항체는 보툴리눔 독소 A 항원에 CFA (Complete Freund’s adjuvant) 및 IFA (Incomplete Freund’s adjuvant)로 이루어진 군에서 하나 이상을 추가로 혼합하여 면역된 동물의 혈청에서 분리된 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  13. 제8항에 있어서, 상기 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  14. 제8항에 있어서, 상기 키트의 검출 가능한 최소 농도 (LLD)가 10 ng/mL 미만인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 키트의 검출 가능한 최소 농도 (LLD)가 1 ng/mL 미만인 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A 검출용 키트.
  16. (a) (i) 검사대상시료;
    (ii) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 단클론항체인 포획 항체; 및
    (iii) 보툴리눔 독소 A에 특이적으로 결합하며 검출 표지에 연결된 다클론항체인 검출 항체를 포함하는 배지를 제공하는 단계;
    (b) 상기 배지를 인큐베이션하는 단계; 및
    (c) 상기 보툴리눔 독소 A에 결합된 검출 항체의 검출 표지의 수준을 측정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A의 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 검출 방법은 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)을 사용하는 것을 특징으로 하는, 보툴리눔 독소 A의 검출 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050046911A (ko) 2003-11-14 2005-05-19 주식회사 에이.비.아이 알파1 안티트립신을 이용한 암 진단용 ｅｌｉｓａ 키트
KR101720887B1 (ko) 2006-10-04 2017-03-28 제넨테크, 인크. Ｖｅｇｆ용 ｅｌｉｓａ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arnon SS, Schechter R, Inglesby TV, Henderson DA, Bartlett JG, Ascher MS, Eitzen E, Fine AD, Hauer J, Layton M, Lillibridge S, Osterholm MT, O'Toole T, Parker G, Perl TM, Russell PK, Swerdlow DL, Tonat K (February 2001). "Botulinum toxin as a biological weapon: medical and public health management". JAMA. 285 (8): 1059-70
Figgitt DP, Noble S (2002). "Botulinum toxin B: a review of its therapeutic potential in the management of cervical dystonia". Drugs. 62 (4): 705-22

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