TW201343918A - 偵測罹患肝癌機率的方法 - Google Patents

偵測罹患肝癌機率的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201343918A
TW201343918A TW101149687A TW101149687A TW201343918A TW 201343918 A TW201343918 A TW 201343918A TW 101149687 A TW101149687 A TW 101149687A TW 101149687 A TW101149687 A TW 101149687A TW 201343918 A TW201343918 A TW 201343918A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mir
liver cancer
methylation
detecting
degree
Prior art date
Application number
TW101149687A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI454578B (zh
Inventor
Chang-Yi Lu
Meng-Tsung Tien
Cheng-Tao Wu
Yih-Huei Uen
Kai-Yuan Lin
Original Assignee
Ind Tech Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ind Tech Res Inst filed Critical Ind Tech Res Inst
Publication of TW201343918A publication Critical patent/TW201343918A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI454578B publication Critical patent/TWI454578B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本案關於偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體生物樣本中微小RNA miR-129-2的甲基化程度或表現程度。當該生物樣本中miR-129-2的甲基化程度高於對照樣本中miR-129-2的甲基化程度，或者該生物樣本中miR-129-2的表現程度低於對照樣本中miR-129-2的表現程度時，表示該個體傾向罹患肝癌或已罹患肝癌。

Description

偵測罹患肝癌機率的方法
本發明關於人類肝癌的生物標記。
微小RNA(miRNA)為約22個核苷酸的短內源性RNA。藉由與目標mRNA的鹼基配對，miRNA作用為基因表現的後轉錄調節物，導致目標mRNA崩解或者抑制目標mRNA的表現。
數個研究顯示miRNA在癌細胞中有不正常表現。在數種癌細胞株中觀察到miRNA的表現受到抑制。一般推測miRNA抑制腫瘤形成是透過抑制致癌基因和調控與細胞凋亡或分化相關的基因表現。這種miRNA作用如腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene)，因此亦稱為「腫瘤抑制微小RNA」(tumor suppressor miRNA)。已知有68%的慢性淋巴性白血病(CLL)的患者，其miR-15及miR-16有缺失或被抑制的現象。另一方面，相對於直腸及肺的正常組織，在直腸癌及肺癌組織中miR-143與miR-145呈現較低的表現程度。此外，miRNA let-7在肺癌細胞中亦受到抑制，而且藉由miRNA let-7的向下調節可偵測肺癌的不良預後結果。
研究亦顯示DNA甲基化在腫瘤抑制微小RNA的調控中扮演重要角色。DNA甲基化係指藉由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase)使CpG二核苷酸的胞嘧啶(cytosine)轉變為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)的現象。CpG二核苷酸(亦稱為「CpG位」)多位於基因5’端的區域。研究顯 示約70%的人類基因中可在啟動子區域發現CpG位。當啟動子區域中的CpG位被高甲基化時，推測位於下游的編碼基因的轉錄可能受到抑制，因此無法表現。一般推測某些甲基結合蛋白與組織胺去乙醯酶(HDAC)及共抑制物(co-repressor)可辨識高甲基化的CpG位，因此改變染色體結構及形成去活性的異質染色質(heterochromatin)。數個研究顯示異常的DNA甲基化發生在癌症的早期階段，可能造成腫瘤抑制基因無法表現。近來的研究顯示，DNA甲基化不但抑制腫瘤抑制基因的表現，也降低腫瘤抑制微小RNA的表現。
本案一實施形態提供一種偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體的生物樣本中微小RNA miR-129-2的甲基化程度，其中，該甲基化程度係由下列所述之方法所偵測：重亞硫酸限制組合分析法(combined bisulfite restriction analysis；COBRA)、定量甲基化特異聚合酶鏈反應(quantitative methylation-specific polymerase chain reaction；q-MSP)、重亞硫酸定序法(bisulfite sequencing)、焦磷酸定序法(pyrosequencing)、次世代定序(next generation sequencing；NGS)、及DNA甲基化陣列晶片分析法(DNA methylation array analysis)等，其中，當該生物樣本中miR-129-2的甲基化程度高於對照樣本中miR-129-2的甲基化程度時，表示該個體傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌。
本案另一實施形態提供一種偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體的生物樣本中微小RNA miR-129-2的表現程度，其中，該表現程度係由定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative real time PCR；qRT-PCR)或微小RNA陣列晶片分析法(miRNA array analysis)等所偵測，其中，當該生物樣本中miR-129-2的表現程度低於對照樣本中miR-129-2的表現程度時，表示該個體傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌。
本發明之具體實施詳細說明如下，然而以下的實施例僅用於進一步揭露本發明之技術內容，不應藉以限制本案的發明範疇。
本案一實施形態提供一種新穎微小RNA(miRNA)作為偵測人類肝癌的生物標記(biomarker)。根據高通量CpG微陣列平台(high-throughput CpG microarray platform)的結果，本案發明人等從肝癌(hepatocellular carcinoma；HCC)細胞中的甲基化miRNA中，篩選出具有潛力的miRNA，即miR-129-2，作為肝癌的偵測標記。
此述之微小RNA(miRNA)係指人類(Homo sapiens)的miRNA，可獲得自公開的資料庫，例如miRBases資料庫(http：//mirbase.org)或者NCBI資料庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)等。微小RNA(miRNA)由具有莖環結構(stem-loop form)的前驅體(precursor)經過切割、加工而形成成熟體(mature)。成熟體若為位於原前驅體 5’端的活性片段則稱為「5p」；成熟體若為位於原前驅體3’端的活性片段則稱為「3p」。根據本案，miR-129-2係序列識別號1所示之90bp直線序列之前驅體。在後述的實施例及第4A、4B圖中，「miR-129-2-5p」表示miR-129-2位於5’端的成熟體活性片段，「miR-129-2-3p」表示位於miR-129-2 3’端的成熟體活性片段。
傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌的個體可根據來自該個體的生物樣本中miR-129-2的甲基化程度高於對照樣本中對應的miR-129-2的甲基化程度來判斷。可偵測的生物樣本可獲自新鮮或冷凍的肝癌組織、細胞、血液、血清、血漿等，但是並不限於此。對照樣本可來自於經過診斷確認為無疾病的健康個體的正常組織、細胞、血液、血清、血漿等，或者來自相鄰於所檢測的腫瘤的相同組織型態的正常組織或細胞等。
miRNA的甲基化情形可由重亞硫酸限制組合分析法(combined bisulfite restriction analysis；COBRA)、定量甲基化特異聚合酶鏈反應(quantitative methylation-specific polymerase chain reaction；q-MSP)、重亞硫酸定序法(bisulfite sequencing)、焦磷酸定序法(pyrosequencing)、次世代定序(next generation sequencing；NGS)、或者DNA甲基化陣列晶片分析法(DNA methylation array analysis)等方法來確認。重亞硫酸限制組合分析法(COBRA)係指將偵測的DNA先經過重亞硫酸(bisulfite)的處理，之後進行由PCR擴增(amplification)，再藉由限制酶的切割、分解，以得知 DNA甲基化程度或甲基化情況的分析方法。本發明中，miR-129-2進行COBRA分析法所使用的引子對包括序列識別號4或5所示之核苷酸序列，但不限於此。詳細的COBRA操作流程可參見DNA Methylation Protocols,Methods in Molecular BiologyTM,HUMANA Press,Totowa,New Jersey,vol.200,p.71-86之記載。
miRNA的甲基化圖譜(methylation profile)可由重亞硫酸定序法(bisulfite sequencing)與定量甲基化特異聚合酶鏈反應(q-MSP)分析。當以重亞硫酸鈉(sodium bisulfite)處理DNA序列時，DNA序列上的胞嘧啶(cytosine；C)會轉變為脲嘧啶(uracil；U)，但對於5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosines；mC)卻沒有影響。因此，重亞硫酸鈉的處理會誘導DNA序列的特異性變化而顯現出有關甲基化情況的資訊。本案一實施例中，以q-MSP分析miR-129-2的甲基化情況可使用序列識別號8或9所示之引子對，但不限於此。詳細的q-MSP操作流程可參見DNA Methylation Protocols,Methods in Molecular BiologyTM,HUMANA Press,Totowa,New Jersey,vol.200,p.71-86。
本案另一實施形態提供一種偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體的生物樣本中微小RNA miR-129-2的表現程度，當該生物樣本中miR-129-2的表現程度低於對照樣本中miR-129-2的表現程度時，表示該個體傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌。
miRNA的表現程度(expression level)可由定量反轉錄 聚合酶鏈反應(quantitative real time PCR；qRT-PCR)或微小RNA陣列晶片分析法(miRNA array analysis)所偵測。qRT-PCR為改良的PCR反應，其特徵在於在PCR反應過程中可即時(real-time)偵測擴增(amplified)的DNA。qRT-PCR的指數期(exponential phase)中可偵測的螢光循環數稱為循環閾值(cycle threshold；Ct)。Ct值或相對於參考基因的Ct值差(△Ct)，可用於目標DNA的定量。本案一實施例中，以qRT-PCR偵測miR-129-2的表現程度所使用的引子對可包括如序列識別號6或7所示之核苷酸序列，但不限於此。人類肝癌組織中miRNA向下調節(down-regulation)的表現程度與該miRNA的甲基化情況一致，表示該miRNA是可信賴的肝癌檢測生物標記。
miRNA在肝癌組織中的生物功能可進一步以細胞群落的形成(colony formation)來確認。本案一實施例中，使miR-129-2插入病毒核酸中並經由感染途徑進入肝癌(HCC)細胞。該miRNA在HCC細胞中可抑制該細胞的群落形成，顯示該miRNA在人類肝癌組織中作用為腫瘤抑制基因。
實施例
材料與方法
患者樣本的取得、細胞培養條件及5-氮雜胞苷(5-aza-cytidine；5-AzaC)的處理
肝癌(HCC)細胞HepG2、HuH7、J7、Hep3B、Mahlavu及SK-Hep1培養於37℃、5%CO2的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基中。在進行後續處理前的24小時，將HuH7細胞(1×105 cells/well)與其他肝癌細胞(3×105 cells/well)分別接種於6孔盤(6-well plate)中。以5μM的5-azaC(Sigma)處理細胞3天。每24小時更換含有5-azaC的新鮮培養基。42對肝癌(HCC)臨床樣本，包括腫瘤組織與腫瘤相鄰的正常組織；41個肝癌血漿樣本、8個肝硬化血漿樣本以及10個健康人血漿樣本取得自台灣台南奇美醫院。進行重亞硫酸定序法及甲基化特異聚合酶鏈反應(MSP)的正常成人的肝組織染色體DNA(對照)購買自美國生技公司(US Biological)。作為甲基化特異聚合酶鏈反應(MSP)的對照組甲基化DNA(CpGenome Universal Methylated DNA)購買自Chemicon。
重亞硫酸限制組合分析法(COBRA)與重亞硫酸定序法
使用EZ DNA甲基化套組(Zymo Research)處理來自肝癌(HCC)臨床樣本、肝癌(HCC)細胞、及成人正常肝細胞的染色體DNA(1μg)，進行重亞硫酸的處理以及PCR的擴增反應(amplification)。在重亞硫酸限制組合分析法(COBRA)中，以內切酶BstUI在60℃處理上述的PCR產物過夜使其分解。分解的DNA片段可目視於1.5%(w/v)溴化乙啶(EtBr)染色的洋菜膠上。另一方面，用於重亞硫酸定序法的PCR產物以CloneJET PCR選殖套組(Thermo Fisher Scientific)選殖於pJET1.2/blunt選殖載體。經轉形於大腸桿菌(E.coli)後，以ABI定序系統(Applied Biosystems) 選擇約10個選殖株並進行定序。
即時定量甲基化分析
如前述以重亞硫酸處理的DNA，進行螢光SYBR green的即時甲基化特異性PCR(qMSP)的擴增(amplification)。每一反應添加1倍PCR緩衝液、0.25 mM的dNTP、0.25 μM的順向引子(forward primer)與0.25 μM的反向引子(reverse primer)、1.5 U的FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)及1μl的螢光SYBR green(Cambrex)於總體積20μl中稀釋1000倍。擴增反應(amplification)在ABI Prism 7000序列偵測系統中進行，根據下列的熱循環條件：94℃、7分鐘；之後94℃、30秒，62℃、30秒及72℃、30秒的40個循環。根據上述記載，以下列公式計算β-肌動蛋白(β-actin)與miR-129-2之間的Ct值差，獲得甲基化程度：對於組織樣本：2[Ct(β-actin)-Ct(miR-129-2)]×100；對於血漿樣本：2[Ct(β-actin)-Ct(miR-129-2)]×1000。
即時定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)
使用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取肝細胞與肝癌臨床樣本的總RNA(total RNA)。根據使用者手冊使用Superscript III反轉錄酶(Invitrogen)進行cDNA的合成。即時定量聚合酶鏈反應使用螢光SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems)在ABI Prism 7000序列偵測系統進行。在微小RNA成熟體的表現分析上，使用TaqMan miRNA分析系統 (Applied Biosystems)根據操作手冊進行。相對表現程度以△Ct方法分析，U6及RNU44為內在對照組(internal control)。
細胞群落的形成
將HuH7與J7細胞以密度2×104 cells/well接種於96孔盤(96-well plate)。以帶有miR-129-2前驅體的重組慢病毒(lentivirus)或對照的慢病毒根據操作手冊感染細胞。經過24小時感染後，將細胞與0.7%頂層瓊脂(top agar)混合，移至每孔(well)含有1%底層瓊脂(bottom agar)的6孔盤(6-well plate)中。以5μg/ml的嘌呤黴素(puromycin)篩選轉染體四星期。形成的細胞群落以PBS洗滌，以絕對甲醇固定，結晶紫溶液(0.5% crystal violet solution)染色1小時。
[實施例1]確認由DNA甲基化調節的具潛力的微小RNA
根據上述COBRA分析法確認正常肝組織、正常肝細胞與六種肝癌(HCC)細胞(HepG2,HuH7,J7,Hep3B,Mahlavu及SK-Hep1)的miR-129-2的甲基化情形。結果如第1圖所示，顯示在六個HCC細胞中miR-129-2有甲基化現象，但是在正常肝組織及細胞中則呈現無甲基化現象。
進一步使用重亞硫酸定序法檢測在HCC細胞與正常肝細胞中miR-129-2的甲基化情況。整體來說，檢查miR-129-2中的33個CpG位。在正常肝細胞及組織中觀察到低甲基 化現象(如第2A~2B圖)。在正常肝組織NL-1663與NL-4149以及正常肝細胞中，miR-129-2的甲基化比例分別為2.1%、3.3%及0.6%。相反地，在HepG2、HuH7、J7、Hep3B、Mahlavu及SK-Hep1的HCC細胞中，miR-129-2的甲基化比例分別為64.5%、58.8%、71.5%、79.7%、72.7%及94.5%(如第2C~2F圖)。這些結果顯示，相較於正常肝細胞而言，miR-129-2在HCC細胞中的高甲基化情形為一普遍現象。
[實施例2]DNA甲基化調節的miR-129-2在HCC細胞中的表現
為了評估miR-129-2的表現是否受到DNA甲基化的調控，以定量反轉錄PCR(quantitative reverse transcription PCR)檢查正常肝細胞與HCC細胞中miR-129-2的表現程度。相較於正常肝細胞，所有HCC細胞中的miR-129-2表現皆降低(如第3A圖)。相同地，HCC組織樣本中miR-129-2的表現也低於正常肝組織約16倍(如第3B圖)。而且，在經過5-氮雜胞苷(5-aza-cytidine；5-AzaC)處理後，HuH7細胞與J7細胞中miR-129-2的表現程度明顯地增加，分別是未經5-AzaC處理細胞的2.5倍及16倍(如第3C圖)。從這些結果推論，DNA甲基化調節miR-129-2的表現，造成HCC細胞中miR-129-2的表現降低。
[實施例3]HCC細胞中miR-129-2作用為腫瘤抑制miRNA
為評估miR-129-2在HCC細胞中的生物功能，首先以帶有miR-129-2前驅體的慢病毒(lenti-miR-129-2)感染，建立表現miR-129-2的HCC細胞(HuH7-miR、J7-miR)。之後使用Taqman分析法確認以lenti-miR-129-2感染的HCC細胞中miR-129-2成熟體的表現。HuH7細胞中lenti-miR-129-2的感染(HuH7-miR)使得成熟體miR-129-2-5p與miR-129-2-3p過度表現，其表現量較對照感染細胞(HuH7-Ctrl)分別提高約2000倍及1000倍(如第4A~4B圖)。同樣地，lenti-miR-129-2感染的J7細胞(J7-miR)，其miR-129-2-5p與miR-129-2-3p的表現量較對照感染細胞(J7-Ctrl)的表現量分別提高約500倍及1000倍。細胞群落實驗證明，miR-129-2具有降低HCC細胞非貼附性生長(anchorage-independent growth)的能力。相較於對照的感染細胞(J7-Ctrl)，表現miR-129-2的J7細胞(J7-miR)僅觀察到1/3的細胞群落形成(如第4C圖)。相同地，以對照的慢病毒感染的HuH7(HuH7-miR)細胞中，每一培養皿(well)平均有47個群落形成(如第4D圖)。相反地，表現對照miRNA的HuH7細胞(HuH7-Ctrl)幾乎沒有群落形成。這些結果顯示，miR-129-2在HCC細胞中作用如腫瘤抑制微小RNA(tumor suppressor miRNA)。
[實施例4]miR-129-2在HCC臨床樣本中的高甲基化與向下調節表現(down regulation)
為了評估miR-129-2在臨床樣本中的甲基化情行，使 用COBRA分析42對HCC腫瘤以及與該腫瘤相鄰的正常組織(如第5A圖)。42對中有30對(~71%)的HCC組織顯示miR-129-2具有高度甲基化(如第5B圖)。為了進一步定量甲基化程度，進行如上述的甲基化特異性PCR。除了3例例外(患者編號1111、2000及2756)，相較於腫瘤相鄰的正常組織，幾乎所有的HCC臨床樣本都顯示miR-129-2有較高的甲基化程度(如第5C~5D圖)。而且，使用q-MSP分析的結果與使用COBRA分析的結果有顯著的相關性(correlation)。這些結果顯示，miR-129-2在HCC臨床樣本中為高度甲基化，與前述HCC細胞的結果相符。
又為了確認miR-129-2的表現是否因DNA的甲基化而向下調節(down regulation)其表現，因此進行qRT-PCR的分析。結果顯示，相較於腫瘤相鄰的正常組織，42個HCC臨床樣本中有29個(~69%)樣本其miR-129-2的表現降低(如第6A~6B圖)。
這些結果顯示，miR-129-2在HCC樣本中為高度甲基化且向下調節其表現，但這些情形並未發生在腫瘤相鄰的正常組織中。此表示miR-129-2在肝癌及正常組織中的差異表現及/或甲基化程度可作為HCC診斷的標記。
[實施例5]HCC血漿樣本中miR-129-2的甲基化程度
將奇美醫院獲得的41個HCC血漿樣本、8個肝硬化血漿樣本以及10個健康血漿樣本分別進行q-MSP，以確認miR-129-2的甲基化程度。在41個HCC血漿樣本中，有 37個樣本(90%)其miR-129-2的甲基化程度超過0.1(如第7A圖)。反之，沒有一位健康捐贈者的血漿樣本中miR-129-2的甲基化程度超過0.05，而肝硬化血漿樣本中且僅有2例其miR-129-2甲基化程度超過0.1(如第7A圖所示)。為了進一步統計分析，將上述所得甲基化程度轉換成log2數值。統計分析顯示，HCC血漿中miR-129-2的甲基化程度顯著高於健康者或肝硬化的血漿(P<0.01)(如第7B圖)。以接收者操作特徵曲線(ROC)分析確認miR-129-2在肝癌診斷的靈敏性、特異性以及曲線下面積(AUC)及截取值(cutoff value)。在截取值(cut-off value)為-2.36時，可區別HCC與健康者及肝硬化，靈敏性為88%及特異性為100%(AUC=0.92,SE=0.039,95% CI=0.843-0.997,P<0.001)(如第7C圖)。ROC曲線分析顯示使用miR-129-2在HCC診斷上的高準確性。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此項技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖為顯示本案一實施例中以COBRA分析法偵測正常肝組織、正常肝細胞、及六種HCC細胞(HepG2、HuH7、J7、Hep3B、Mahlavu、SK-Hep1)中miR-129-2甲基化的電泳圖。
第2A~2F圖為顯示本案一實施例中以重亞硫酸定序法(bisulfite sequencing)偵測正常肝組織、正常肝細胞、及六種HCC細胞(HepG2、HuH7、J7、Hep3B、Mahlavu、SK-Hep1)中miR-129-2的甲基化情況及比例的圖。
第3A圖為顯示本案一實施例中在正常肝細胞與HCC細胞中miR-129-2表現程度的柱狀圖。
第3B圖為顯示本案一實施例中在正常肝組織與HCC組織中miR-129-2表現程度的柱狀圖。
第3C圖為顯示本案一實施例中在有無經過5-氮雜胞苷(5-aza-cytidine；5-AzaC)處理的HCC細胞中miR-129-2表現程度的柱狀圖。
第4A及4B圖為顯示本案一實施例中在有無經過lenti-miR-129-2感染的HuH7與J7細胞中miR-129-2表現程度的柱狀圖。
第4C圖為顯示本案一實施例中有無lenti-miR-129-2感染的J7細胞的群落形成的柱狀圖。
第4D圖為顯示本案一實施例中有無lenti-miR-129-2感染的HuH7細胞的群落形成的柱狀圖。
第5A圖為顯示本案一實施例中以COBRA分析法偵測組織樣本(42對HCC組織)中miR-129-2的甲基化情況的電 泳圖。
第5B圖為顯示本案一實施例中以COBRA分析法偵測組織樣本(42對HCC組織)中miR-129-2甲基化程度的柱狀圖。
第5C圖為顯示本案一實施例中以q-MSP反應偵測組織樣本中miR-129-2甲基化程度的柱狀圖。
第5D圖為顯示本案一實施例中HCC組織與相鄰正常組織中甲基化程度的盒鬚圖(box plot)。
第6A圖為顯示本案一實施例中以qRT-PCR反應偵測HCC組織與相鄰正常組織中miR-129-2表現程度的柱狀圖。
第6B圖為顯示本案一實施例中HCC組織與相鄰正常組織中miR-129-2表現比例的比例圖。
第7A圖為顯示本案一實施例中以q-MSP反應偵測HCC血漿、肝硬化血漿與正常血漿中miR-129-2甲基化程度的柱狀圖。
第7B圖為顯示本案一實施例中在HCC血漿、肝硬化血漿與正常血漿中miR-129-2的甲基化程度的盒鬚圖(box plot)。
第7C圖為顯示本案一實施例中計算HCC血漿樣本組織及由健康血漿與肝硬化血漿所構成的樣本組織之間miR-129-2甲基化程度的靈敏性與特異性之ROC曲線圖。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 偵測罹患肝癌機率的方法
<130> 0965-A23943-TW
<150> US61/640,512
<151> 2012-04-30
<150> US13/685,551
<151> 2012-11-26
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> Precursor RNA
<223> miR-129-2
<400> 1
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mat_peptide
<223> miR-129-2-5p
<400> 2
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> mat_peptide
<223> miR-129-2-3p
<400> 3
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 4
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 5
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 6
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-129-2的合成寡核苷酸
<400> 9

Claims (12)

  1. 一種偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體的生物樣本中微小RNAmiR-129-2的甲基化程度，其中，當該生物樣本中該miR-129-2的甲基化程度高於對照樣本中該miR-129-2的甲基化程度時，表示該個體傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該miR-129-2包括序列識別號1所示之核苷酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該甲基化發生在該miR-129-2的一個或以上的CpG位。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該甲基化程度係由選自下列所構成之群組中的方法所偵測：重亞硫酸限制組合分析法(COBRA)、定量甲基化特異聚合酶鏈反應(q-MSP)、重亞硫酸定序法、焦磷酸定序法、次世代定序(NGS)、及DNA甲基化陣列晶片分析法。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中，使用該重亞硫酸限制組合分析法(COBRA)偵測該甲基化程度時，使用如序列識別號4或5所示之引子對。
  6. 如申請專利範圍第4項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中使用該定量甲基化特異聚合酶鏈反應(q-MSP)偵測該甲基化程度時，使用如序列識別號8或9所 示之引子對。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該生物樣本包括肝組織、血液、血清或血漿。
  8. 一種偵測個體罹患肝癌機率的方法，包括偵測來自該個體的生物樣本中微小RNAmiR-129-2的表現程度，其中，當該生物樣本中該miR-129-2的表現程度低於對照樣本該miR-129-2的表現程度時，表示該個體傾向於罹患肝癌或已罹患肝癌。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該miR-129-2包括序列識別號1所示之核苷酸序列。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中，該表現程度係由定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)或微小RNA陣列晶片分析法所偵測。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中使用定量反轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)偵測該表現程度時，使用如序列識別號6或7所示之引子對。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之偵測個體罹患肝癌機率的方法，其中該生物樣本包括肝組織、血液、血清或血漿。
TW101149687A 2012-04-30 2012-12-25 偵測罹患肝癌機率的方法 TWI454578B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261640512P 2012-04-30 2012-04-30
US13/685,551 US8846316B2 (en) 2012-04-30 2012-11-26 Biomarker for human liver cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201343918A true TW201343918A (zh) 2013-11-01
TWI454578B TWI454578B (zh) 2014-10-01

Family

ID=49477629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW101149687A TWI454578B (zh) 2012-04-30 2012-12-25 偵測罹患肝癌機率的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8846316B2 (zh)
JP (1) JP5731568B2 (zh)
KR (1) KR101501822B1 (zh)
TW (1) TWI454578B (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9984201B2 (en) 2015-01-18 2018-05-29 Youhealth Biotech, Limited Method and system for determining cancer status
CN105154533B (zh) * 2015-07-29 2018-11-02 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 诊断早期肝癌的miRNA组合及其试剂盒
TWI569012B (zh) * 2015-12-29 2017-02-01 財團法人工業技術研究院 評估一個體罹患肝癌之風險以及罹患肝癌預後的方法
EP3481953A4 (en) * 2016-07-06 2020-04-15 Youhealth Biotech, Limited SPECIFIC METHYLATION MARKERS OF LIVER CANCER AND USES THEREOF
EP3481403B1 (en) 2016-07-06 2022-02-09 Youhealth Biotech, Limited Solid tumor methylation markers and uses thereof
KR101884989B1 (ko) 2016-08-31 2018-08-02 전주대학교 산학협력단 조절 miRNA ID의 검출방법 및 이를 이용한 유방암 바이오 마커
KR101884073B1 (ko) 2016-09-21 2018-07-31 전주대학교 산학협력단 마이크로 rna의 데이터 마이닝을 통한 마이크로 rna id의 분석방법
KR101884992B1 (ko) 2016-09-29 2018-08-02 전주대학교 산학협력단 조절 miRNA의 검출방법 및 이를 이용한 대장암 바이오마커
BR112019018272A2 (pt) 2017-03-02 2020-07-28 Youhealth Oncotech, Limited marcadores metilação para diagnosticar hepatocelular carcinoma e câncer
KR101960597B1 (ko) 2017-06-28 2019-03-20 전주대학교 산학협력단 발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 rna id의 분석방법
WO2020212586A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment and prognosis of cancer
KR102155044B1 (ko) * 2019-10-08 2020-09-11 주식회사 레피다인 생물학적 시료의 간암 조직 기원 여부를 판별하는 방법

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1713938A2 (en) 2004-02-09 2006-10-25 Thomas Jefferson University DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCERS WITH MicroRNA LOCATED IN OR NEAR CANCER-ASSOCIATED CHROMOSOMAL FEATURES
ES2425416T3 (es) 2006-11-01 2013-10-15 The Ohio State University Research Foundation Firma de expresión del microARN para predecir la supervivencia y la metástasis en el carcinoma hepatocelular
MX2009010899A (es) 2007-04-10 2010-02-17 Univ Nat Taiwan Prediccion de la supervivencia al post-tratamiento en pacientes de cancer con micro-rnas.
CN101711287B (zh) 2007-06-08 2016-04-27 由卫生与公众服务部代表的美利坚合众国政府 确定肝细胞癌亚型和检测肝癌干细胞的方法
JP5209272B2 (ja) * 2007-10-30 2013-06-12 国立大学法人 東京大学 肝臓癌関連遺伝子、及び肝臓癌リスクの判定方法
EP2271931A4 (en) 2008-04-25 2011-10-12 Merck Sharp & Dohme MICRO-RNA BIOMARKERS FOR TISSUE INJURIES
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
AU2009257410B2 (en) 2008-06-11 2014-03-06 Fudan University Use of miR-26 family as a predictive marker of hepatocellular carcinoma and responsiveness to therapy
US20110077168A1 (en) 2008-06-17 2011-03-31 Nitzan Rosenfeld Methods for distinguishing between specific types of lung cancers
US20110301221A1 (en) 2008-10-10 2011-12-08 Swedish Health Services Diagnosis, prognosis and treatment of glioblastoma multiforme
CA2742324A1 (en) 2008-10-30 2010-06-03 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Methods for assessing rna patterns
CN102985558B (zh) * 2008-11-13 2015-08-19 复旦大学 用于肝细胞癌症的微rna表达谱分析的组合物和方法
EP2196543A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Compositions and methods for micro-rna expression profiling of hepatocellular cancer
WO2010098862A2 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Combimatrix Corporation Method of using an oligonucleotide microarray to detect cancer from serum nucleic acid
CN104087662A (zh) 2009-04-29 2014-10-08 阿姆斯特丹大学学术医学中心 对抗、预防和/或测定心力衰竭或心力衰竭的风险的工具和方法
EP2336353A1 (en) 2009-12-17 2011-06-22 febit holding GmbH miRNA fingerprints in the diagnosis of diseases
AR078584A1 (es) 2009-10-09 2011-11-16 Baylor Res Inst Identificacion de microarn (miarn) en muestras fecales como biomarcador de canceres gastroenterologicos
CN102080082B (zh) 2009-12-01 2013-05-22 中国科学院上海药物研究所 人miR-129＊反义核酸及其应用
WO2011076141A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Fudan University Diagnostic kits comprising microrna biomarkers and methods for diagnosis of hepatocellular cancer
EP2341145A1 (en) 2009-12-30 2011-07-06 febit holding GmbH miRNA fingerprint in the diagnosis of diseases
EP2354246A1 (en) 2010-02-05 2011-08-10 febit holding GmbH miRNA in the diagnosis of ovarian cancer
US20110223607A1 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Quest Diagnostics Investments Incorporated Circulating microrna as a marker for hepatocellular carcinoma

Also Published As

Publication number Publication date
KR101501822B1 (ko) 2015-04-02
US20130288239A1 (en) 2013-10-31
KR20130122541A (ko) 2013-11-07
TWI454578B (zh) 2014-10-01
JP2013230147A (ja) 2013-11-14
US8846316B2 (en) 2014-09-30
JP5731568B2 (ja) 2015-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI454578B (zh) 偵測罹患肝癌機率的方法
Tian et al. Aberrant miR-181b-5p and miR-486-5p expression in serum and tissue of non-small cell lung cancer
Wang et al. Early detection of lung cancer in serum by a panel of microRNA biomarkers
Walz et al. Recurrent DGCR8, DROSHA, and SIX homeodomain mutations in favorable histology Wilms tumors
JP6203209B2 (ja) 早期結腸直腸癌の検出のための血漿マイクロｒｎａ
Wang et al. DNA hypermethylation of microRNA-34b/c has prognostic value for stage Ⅰ non-small cell lung cancer
Dohi et al. Epigenetic silencing of miR-335 and its host gene MEST in hepatocellular carcinoma
Qian et al. Identification and validation of human papillomavirus encoded microRNAs
CN107109470B (zh) 用于诊断胃癌的miRNA生物标志物
EP2474627B1 (en) New markers for cancer
Wojtas et al. Differential miRNA expression defines migration and reduced apoptosis in follicular thyroid carcinomas
Guo et al. Decreased serum miR-181a is a potential new tool for breast cancer screening
Zheng et al. Epigenetic silencing of miR-490-3p promotes development of an aggressive colorectal cancer phenotype through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway
Lu et al. Frequent DNA methylation of miR‐129‐2 and its potential clinical implication in hepatocellular carcinoma
DK2756099T3 (en) METHOD OF DETECTING HPV-INDUCED CERVIC CANCER
Chen et al. Decreased miRNA-148a is associated with lymph node metastasis and poor clinical outcomes and functions as a suppressor of tumor metastasis in non-small cell lung cancer
US20150126374A1 (en) Hypermethylated gene markers for head and neck cancer
Kelly et al. Post-transcriptional dysregulation by miRNAs is implicated in the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumor [GIST]
WO2013038737A1 (ja) 膀胱癌細胞の検出方法、膀胱癌細胞の検出方法に用いるプライマー及び膀胱癌マーカ
Sun et al. Relationship between miRNA-338-3p expression and progression and prognosis of human colorectal carcinoma
Zhao et al. MicroRNA-411 inhibits malignant biological behaviours of colorectal cancer cells by directly targeting PIK3R3 Retraction in/10.3892/or. 2022.8283
KR20110015013A (ko) 결장직장암의 평가 방법 및 여기에 사용하기 위한 조성물
Su et al. Integrated analysis of miRNAs and DNA methylation identifies miR‐132‐3p as a tumor suppressor in lung adenocarcinoma
Peng et al. Epigenetic inactivation of ADAMTS9 via promoter methylation in multiple myeloma
CN103374630B (zh) 侦测罹患肝癌机率的方法