KR101501822B1 - 인간 간암에 대한 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 대상체로부터의 바이오샘플 중의 한 마이크로RNA인 miR-129-2의 메틸화 수준 또는 발현 수준을 검출하는 것을 포함하는, 대상체에서 간암의 발생률을 측정하는 방법에 관한 것이다. 바이오샘플 중의 상기 마이크로RNA의 메틸화 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 마이크로RNA의 것에 비하여 더 높거나, 또는 바이오샘플 중의 상기 마이크로RNA의 발현 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 마이크로RNA의 것에 비하여 더 낮을 경우, 이는 대상체가 간암에 취약하거나 또는 간암을 앓고 있음을 시사하는 것이다.

Description

인간 간암에 대한 바이오마커{BIOMARKER FOR HUMAN LIVER CANCER}
본 기술 분야는 인간 간암에 대한 바이오마커에 관한 것이다.
마이크로RNA (miRNA)는 대략 22개의 뉴클레오티드로 이루어진, 풍부한 부류의 짧은 내인성 RNA이다. miRNA는 그의 표적 mRNA와 염기쌍을 형성함으로써 표적 mRNA를 분해시키거나, 또는 표적 mRNA 발현을 억제시키는, 유전자 발현의 전사후 조절인자로서의 역할을 한다.
수개의 연구를 통해 암 세포에서의 miRNA의 발현이 비정상적이라는 것이 밝혀졌다. 게놈 범주의 연구를 통해서도 또한 miRNA는 암과 관련된 이종접합성 소실을 보이는 염색체 영역에 존재한다는 것도 밝혀졌다. 수개의 암 세포주에서, miRNA의 발현이 억제되는 것으로 관찰되었다. 이는 miRNA가 종양유전자 발현의 억제를 통해, 및 세포 아폽토시스 또는 분화에 관여하는 유전자의 조절을 통해 종양 형성을 억제시킨다는 것을 제안한다. 종양 억제인자 유전자처럼 작용하는 miRNA는 또한 "종양 억제인자 miRNA"로도 명명된다. miR-15 및 miR-16; miR-143 및 miR-145가 결실되어 있거나, 억제되어 있는 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 환자 중 68%의 경우, 결장암 및 폐암 조직에서의 발현 수준은 상응하는 정상 조직에서의 것보다 더 낮게 나타났고; miRNA let-7은 폐암 세포에서 억제되어 있었으며, 예후가 불량한 폐암은 miRNA let-7의 하향조절에 의해 검출될 수 있다고 보고된 바 있다.
연구를 통해 DNA 메틸화가 종양 억제인자 miRNA 조절에서 일정 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. DNA 메틸화란 CpG 디뉴클레오티드 상태에서 나타나는 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의한 시토신의 5-메틸시토신으로의 전환을 의미하는 것이다. CpG 디뉴클레오티드는 보통은 "CpG 부위"로도 불리는 5'-말단 영역에 풍부하다. 인간 유전자 중 약 70%에서는 CpG 부위가 프로모터 영역에서 발견될 수 있다는 것이 연구를 통해 밝혀졌다. 프로모터 영역 중의 CpG 부위가 과다메틸화되어 있는 바, 이는 전사에 앞서 하류의 코딩되는 유전자가 억제될 수 있고, 이로써 유전자는 발현되지 않는다는 것을 제안하였다. 따라서, 염색체 구조를 변화시키고, 불활성 이질염색질을 형성하기 위해 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 및 공동-리프레서를 수반하는 일부 메틸 결합 단백질에 의해 과다메틸화된 CpG 부위가 인식될 수 있다고 제안되었다. 비정상적인 DNA 메틸화가 조기 암 단계에서 발생하며, 이로 인해 종양 억제인자 유전자가 발현되지 못할 수 있다는 것이 수개의 연구를 통해 밝혀졌다. 최근 연구에서는 DNA 메틸화가 종양 억제인자 유전자 발현을 억제할 뿐만 아니라, 종양 억제인자 miRNA 발현도 감소시킨다는 것이 밝혀졌다.
발명의 개요
본 개시내용의 실시양태는 간암의 검출 및 진단을 위한 바이오마커로서 사용되는 마이크로RNA 및 그의 메틸화를 개시한다.
본 개시내용의 한 실시양태는 대상체로부터의 바이오샘플 중의 miR-129-2의 메틸화 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서, 메틸화 수준은 복합 중아황산염 제한 분석 (COBRA), 정량적 메틸화 특이 중합효소 연쇄 반응 (q-MSP) 중아황산염 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 차세대 시퀀싱 (NGS), 또는 메틸화 어레이로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되며, 여기서, 바이오샘플 중의 상기 마이크로RNA의 메틸화 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 마이크로RNA의 메틸화 수준에 비하여 더 높고, 이는 대상체가 간암에 취약하거나 또는 간암을 앓고 있음을 시사하는 것인, 대상체에서 간암의 발생률을 측정하는 방법을 제공한다.
본 개시내용의 또 다른 실시양태는 대상체로부터의 바이오샘플 중의 miR-129-2의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서, 바이오샘플 중의 상기 마이크로RNA의 발현 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 마이크로RNA(들)의 발현 수준에 비하여 더 낮고, 이는 대상체가 간암에 취약하거나 또는 간암을 앓고 있음을 시사하는 것인, 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 또는 miRNA 어레이를 사용하여 대상체에서 간암의 발생률을 측정하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 첨부된 도면을 참조하면서 하기의 상세한 설명 및 실시예를 판독함으로써 더욱 충분하게 이해될 수 있을 것이다:
도 1은 본 실시양태에 따른 COBRA 분석에 의해 검출된 정상적인 간 조직, 정상적인 간 세포 (HH) 및 6개의 HCC 세포 중의 miR-129-2의 메틸화를 보여주는 것이다;
도 2a∼2f는 본 실시양태에 따른 중아황산염 시퀀싱에 의해 검출된 정상적인 간 조직, 정상적인 간 세포 (HH) 및 6개의 HCC 세포 중의 miR-129-2의 메틸화 비율(%)을 보여주는 것이다;
도 3a는 본 실시양태에 따른 정상적인 간 세포 (HH) 및 HCC 세포 중의 miR-129-2의 발현 수준을 보여주는 것이다;
도 3b는 본 실시양태에 따른 정상적인 간 조직 및 HCC 조직 중의 miR-129-2의 발현 수준을 보여주는 것이다;
도 3c는 본 실시양태에 따른, 5-아자-시티딘으로 처리되거나 또는 처리되지 않은 HCC 세포 중의 miR-129-2의 발현 수준을 보여주는 것이다;
도 4a 및 4b는 본 실시양태에 따른, 렌티-miR-129-2 감염이 있거나 또는 없는 HuH7 및 J7 세포 중의 miR-129-2의 발현 수준을 보여주는 것이다;
도 4c는 본 실시양태에 따른, 렌티-miR-129-2 감염이 있거나 또는 없는 J7 세포의 콜로니 형성을 보여주는 것이다;
도 4d는 본 실시양태에 따른, 렌티-miR-129-2 감염이 있거나 또는 없는 HuH7의 콜로니 형성을 보여주는 것이다;
도 5a는 본 실시양태에 따른 COBRA 분석에 의해 검출된 조직 샘플 (42개의 HCC 쌍)로부터의 miR-129-2의 메틸화 상태를 보여주는 것이다;
도 5b는 본 실시양태에 따른 COBRA 분석에 따라 검출된 조직 샘플 (42개의 HCC 쌍)로부터의 miR-129-2의 메틸화 비율(%)을 보여주는 것이다;
도 5c는 본 실시양태에 따른 q-MSP 방법에 의해 검출된 조직 샘플로부터의 miR-129-2의 메틸화 수준을 보여주는 것이다;
도 5d는 본 실시양태에 따른 HCC 및 인접한 정상 조직 중의 메틸화 수준을 박스 플롯으로 나타낸 것이다;
도 6a는 본 실시양태에 따른 qRT-PCR 방법에 의해 측정된 조직 샘플로부터의 miR-129-2의 발현 수준을 보여주는 것이다;
도 6b는 본 실시양태에 따른 HCC 조직 및 인접한 정상 조직 중의 miR-129-2의 발현 비율(%)을 보여주는 것이다;
도 7a는 본 실시양태에 따른 q-MSP 방법에 의해 검출된 HCC 혈장, 간경변증 혈장 및 건강한 혈장 중의 miR-129-2의 메틸화 수준을 보여주는 것이다;
도 7b는 본 실시양태에 따른 HCC 혈장, 간경변증 혈장 및 정상적인 혈장 샘플 중의 메틸화 수준을 박스 플롯으로 나타낸 것이다;
도 7c는 본 실시양태에 따른, HCC 혈장 샘플을 함유하는 한 군, 및 건강한 혈장 샘플 및 간경변증 혈장 샘플을 함유하는 다른 한 군의 두 군 사이의 miR-129-2 메틸화 수준의 민감도 및 특이도 계산을 위한 ROC 곡선을 보여주는 것이다.
상세한 설명
설명을 위해서 하기 상세한 설명에서는 개시된 실시양태를 전반적으로 이해시키기 위해 다수의 구체적인 세부 사항들을 기술한다. 그러나, 하나 이상의 실시양태는 이들 구체적인 세부 사항들 없이도 실시될 수 있다는 것은 자명할 것이다. 다른 경우에 있어서, 도면의 간소화를 위해 주지된 구조물 및 장치는 개략적으로 제시된다.
본 개시내용의 실시양태는 인간 간암 검출용 바이오마커로서의 신규한 마이크로RNA (miRNA)를 제공한다. 고처리량 CpG 마이크로어레이 플랫폼에 기반하여, 본 발명자들은 간암 검출을 위한 것인, 한 잠재적 마이크로RNA, miR-129-2를 발견하기 위해 간세포 암종 (HCC) 세포 중의 메틸화된 복수의 miRNA를 스크리닝하였다.
본원에 기술된 miRNA는 miRBases 데이터베이스 (http://mirbase.org) 또는 NCBI 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 이용가능한, 인간 (호모 사피엔스(Homo sapiens)) 마이크로RNA를 의미한다. miRNA는 스템-루프 전구체 형태, 및 5'-말단 (즉, "5p") 및 3'-말단 (즉, "3p")을 포함하는 2개의 활성 단편을 생성하는 절단 및 프로세싱된 성숙한 형태를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따라, 마이크로RNA, miR-129-2는 서열 1에 개시된, 약 100 bp의 선형 서열을 포함하는 전구체 형태이다.
간암에 취약하거나, 또는 간암을 앓고 있는 대상체는 대조군 샘플 중의 상응하는 miRNA의 것보다 상대적으로 더 높은, 대상체로부터의 바이오샘플 중의 miRNA의 메틸화 수준 또는 상태에 따라 결정될 수 있다. 검출용 바이오샘플은 신선한 또는 냉동된 간암 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 것일 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 대조군 샘플은 무질환으로 진단받은 건강한 사람으로부터 유래된 동일 조직 유형의 정상 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 유래된 것이거나, 또는 그에 인접하게 종양이 형성되어 있는 동일 조직 유형의 정상 조직으로부터 유래된 것일 수 있다.
miRNA의 메틸화 상태는 복합 중아황산염 제한 분석 (COBRA), 정량적 메틸화 특이 중합효소 연쇄 반응 (q-MSP) 및 중아황산염 시퀀싱 중아황산염 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 차세대 시퀀싱 (NGS) 또는 메틸화 어레이에 의해 측정될 수 있다. COBRA는 PCR로 증폭된, 중아황산염으로 처리되어진 DNA의 제한 효소 분석을 통해 DNA 메틸화를 조사하는 분석을 의미한다. COBRA 프로토콜에 관한 상세한 설명은 문헌 [DNA Methylation Protocols, Methods in Molecular Biology™, HUMANA Press, Totowa, New Jersey, vol. 200, p. 71-86]에서 살펴볼 수 있다.
miR-129-2의 COBRA 분석을 위한 프라이머 쌍은 서열 4 및 5에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나, COBRA를 사용하여 miRNA 메틸화를 분석하기 위한 프라이머는 그로 한정되는 것은 아니다. 본 개시내용에 따라 당업자는 miRNA의 COBRA 분석을 위해 적절한 프라이머 쌍을 디자인할 수 있고, 따라서, miRNA의 COBRA 분석을 위해 적합한 프라이머 또한 본 발명에 포함된다.
중아황산염 시퀀싱 및 정량적 메틸화 특이 PCR (q-MSP)에 의해 7개의 miRNA의 메틸화 프로파일을 추가로 분석할 수 있다. 중아황산나트륨으로 처리되었을 때, DNA 서열 중의 시토신 (C)은 우라실 (U)로 전환되지만, 5-메틸시토신 (mC)은 영향받지 않고 그대로 유지된다. 따라서, 중아황산염 처리가 DNA 서열에 특이적인 변화를 도입하며, 메틸화 상태에 대한 정보를 보여준다. 본 발명의 일례에서, q-MSP에서의 miR-129-2에 대한 프라이머 쌍은 서열 8 및 9에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수는 있지만, 그로 한정되는 것은 아니다. 중아황산염 시퀀싱 프로토콜에 관한 상세한 설명은 문헌 [DNA Methylation Protocols, Methods in Molecular BiologyTM, HUMANA Press, Totowa, New Jersey, vol. 200, p. 143-154]에서 살펴볼 수 있다.
추가로, 본 발명의 한 실시양태는 대상체로부터의 바이오샘플 중의 마이크로RNA miR-129-2의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하고, 여기서, 바이오샘플 중의 상기 마이크로RNA(들)의 발현 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 마이크로RNA(들)의 발현 수준에 비하여 더 낮고, 이는 대상체가 간암에 취약하거나 또는 간암을 앓고 있음을 시사하는 것인, 대상체에서 간암의 발생률을 측정하는 방법을 제공한다.
miRNA의 발현 수준은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR) 또는 miRNA 어레이에 의해 측정될 수 있다. qRT-PCR은 반응이 실시간으로 진행되어감에 따라 증폭된 DNA가 검출된다는 점을 특징으로 하는 변형된 PCR이다. qRT-PCR의 경우, 지수기 동안 형광 검출이 가능한 주기를 주기 역치 (Ct)로 명명한다. 표적화된 DNA를 정량화하는 데 Ct 값, 또는 참조 유전자와 비교된 델타 Ct 값 (ΔCt)이 사용될 수 있다. 본 발명의 일례에서, qRT-PCR에서의 miR-129-2에 대한 프라이머 쌍은 서열 6 및 7에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수는 있지만, 그로 한정되는 것은 아니다. 하향조절된 miRNA 발현 수준은 인간 간암에서 miRNA의 메틸화 상태에 상응하며, 이는 miRNA가 간암 검출용 바이오마커로서 신뢰성이 있다는 것을 시사하는 것이다.
콜로니 형성을 사용하여 간암에서의 마이크로RNA의 기능을 추가로 측정한다. 일례에서, 마이크로RNA(들)를 바이러스 핵산에 삽입하고, 바이러스 감염을 통해 HCC 세포 내로 진입시킬 수 있다. HCC 세포에서의 miRNA의 기능은 세포의 콜로니 개수로 밝혀지게 되는데, miRNA가 인간 간암에서 종양 억제인자 유전자로서의 기능을 하는 것으로 나타났다.
실시예
물질 및 방법
환자 샘플, 세포 배양물 및 5- 아자 - 시티딘 (5- 아자 C) 처리
간세포암 세포주인 HepG2, HuH7, J7, Hep3B, Mahlavu 및 SK-Hep-1을 습윤화된 5% CO2 인큐베이터 중 37℃하에 둘베코 변형 이글 배지 중에서 유지시켰다. 처리 24시간 전, HuH7 세포 (1 X 105개의 세포/웰) 및 다른 간세포암 세포 (3 X 105개의 세포/웰)를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 세포를 3일 동안 5 μM 5-아자C (시그마(Sigma))로 처리하였다. 배양 배지를 매 24시간마다 5-아자C를 함유하는 새 배지로 교체하였다. 타이완 타이난에 소재하는 치메이(Chi Mei) 의료 센터로부터 종양 및 인접한 정상 조직, 41개의 혈장 샘플, 8개의 간경변증 혈장 및 10개의 건강한 혈장을 포함하는, 42개의 쌍을 이룬 HCC 임상 샘플을 입수하였다. 중아황산염 시퀀싱 및 메틸화 특이 PCR (MSP)을 위해 정상적인 성인 간 게놈 DNA (대조군)는 US 바이올로지컬(US Biological)로부터 구입하였다. MSP 양성 대조군으로서 Cp게놈 유니버셜 메틸레이티드 DNA(CpGenome Universal Methylated DNA)를 케미콘(Chemicon)으로부터 구입하였다.
복합 중아황산염 제한 분석 ( COBRA ) 및 중아황산염 시퀀싱
EZ DNA 메틸화 키트 (자이모 리서치(Zymo Research))를 사용하여 HCC 임상 샘플, 간세포암 세포 및 성인의 정상적인 간으로부터의 게놈 DNA (1 ㎍)를 중아황산염-전환시키고, PCR 증폭에 사용하였다. COBRA를 위해, PCR 생성물을 60℃에서 밤새 메틸화-민감성 엔도뉴클레아제 BstUI로 분해하였다. 분해된 DNA 단편을 1.5% (w/v) 에티디움 브로마이드로 염색된 아가로스 겔 상에서 시각화하였다. 클론JET(CloneJET) PCR 클로닝 키트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 사용하여 pJET1.2/블런트 클로닝 벡터 내로 중아황산염 시퀀싱을 위한 PCR 생성물을 클로닝하였다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 형질전환 후, 대략 10개의 클론을 선별하고, ABI 시퀀싱 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 서열 분석하였다.
실시간 정량적 메틸화 분석
앞서 기술된 바와 같이 중아황산염 전환된 DNA를 SYBR 그린을 사용하여 형광 기반 실시간 메틸화 특이 PCR (qMSP)에 의해 증폭시켰다. 각각의 반응물은 총 부피 20 ㎕ 중의 1x PCR 완충제, 0.25 mM dNTP, 0.25 μM 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 각각, 1.5 U 패스트스타트(FastStart) Taq DNA 폴리머라제 (로슈(Roche)) 및 1 ㎕ SYBR 그린 (캠브렉스(Cambrex)) 1,000x 희석액으로 구성되었다. 하기 열순환 조건하에 ABI 프리즘(Prism) 7000 서열 검출 시스템 상에서 증폭을 수행하였다: 94℃에서 7분 동안, 이어서, 94℃에서 30초 동안, 62℃에서 30초 동안, 및 72℃에서 30초 동안으로 40회 순환. 앞선 설명에 따라, 하기 식에 따라서 β-액틴과 miR-129-2 사이의 Ct 값의 차에 의해 메틸화 수준을 계산하였다: 조직 샘플인 경우, 2[ Ct (β- 액틴 ) - Ct ( miR -129-2)] x100 또는 혈장 샘플인 경우, 2[ Ct (β- 액틴 ) - Ct ( miR -129-2)] x1,000.
실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 ( qRT - PCR )
트리졸(TRIzol) 시약 (인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 간세포암 세포 및 HCC 임상 샘플의 총 RNA를 추출하였다. 제조사의 설명서에 따라 수퍼스크립트 III(Superscript III) 역전사효소를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 ABI 프리즘 7000 서열 검출 시스템 상에서 실시간 정량적 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 성숙 miRNA 발현 분석을 위해 제조사의 매뉴얼에 따라 택맨(TaqMan) miRNA 검정 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하였다. ΔΔCt 방법에 의해 상대적인 발현 수준을 분석하고, U6 및 RNU44를 내부 대조군으로서 사용하였다.
콜로니 형성
HuH7 및 J7 세포를 96-웰 플레이트 상에 2 X 104개의 세포/웰인 밀도로 시딩하였다. 제조사의 설명서에 따라 miR-129-2 전구체를 보유하는 재조합 렌티바이러스 또는 대조군 렌티바이러스로 세포를 감염시켰다. 감염 후 24시간이 경과하였을 때, 세포를 0.7% 탑(top) 아가와 혼합하고, 6-웰 플레이트 중의, 1% 바텀(bottom) 아가를 함유하는 웰로 옮겨 놓았다. 4주 동안 퓨로마이신 5 ㎍/ml를 사용하여 형질감염체를 선별하였다. 콜로니를 PBS로 세척하고, 무수 메탄올로 고정시키고, 1시간 동안 크리스탈 바이올렛 용액 (0.5%)으로 염색하였다.
[ 실시예 1] DNA 메틸화에 의해 조절되는 잠재적 miRNA 확인
COBRA에 따라 정상적인 간 조직 및 세포 (HH), 및 6개의 HCC 세포 (HepG2, HuH7, J7, Hep3B, Mahlavu 및 SK-Hep1) 중의 miR-129-2의 메틸화 상태를 측정하였다. 도 1에 제시된 결과를 보면, miR-129-2가 6개의 HCC 세포에서는 메틸화되어 있지만, 정상적인 간 조직 및 세포에서는 메틸화되어 있지 않은 것으로 나타났다.
중아황산염 시퀀싱을 사용하여 HCC 및 정상적인 간 세포 중의 miR-129-2의 메틸화 상태를 추가 조사하였다. 통틀어 33개의 CpG 부위를 조사하였다. 일반적으로, 정상적인 간 세포 (HH) 및 조직, 둘 모두에서는 저메틸화가 관찰되었다 (도 2a∼2b). 정상적인 간 조직인 NL-1663 및 NL-4149 뿐만 아니라, 정상적인 간 세포 HH 중 miR-129-2의 메틸화 비율(%)은 각각 2.1%, 3.3% 및 0.6%였다. 대조적으로, HCC 세포, HepG2, HuH7, J7, Hep3B, Mahlavu 및 SK-Hep1 중의 메틸화 비율(%)은 각각 64.5%, 58.8%, 71.5%, 79.7%, 72.7% 및 94.5%였다 (도 2c∼2f). 상기 결과는, miR-129-2 과다메틸화가 정상적인 간 세포와 비교하여 HCC 세포에서 빈번하게 일어나는 이벤트라는 것을 시사하였다.
[ 실시예 2] HCC 세포에서 miR -129-2 발현을 조절하는 DNA 메틸화
miR-129-2 발현이 DNA 메틸화에 의해 조절되는지 여부를 평가하기 위하여, 정상적인 간 세포와 HCC 세포 사이의 miR-129-2의 발현 수준을 정량적 역전사 PCR에 의해 조사하였다. 정상적인 간 세포인 HH와 비교하였을 때, 모든 HCC 세포에서 miR-129-2 발현은 감소되어 있었다 (도 3a). 유사하게, HCC 조직 샘플 중의 miR-129-2의 발현 수준은 정상적인 간 샘플 풀 중의 것보다 16배 더 낮게 나타났다 (도 3b). 추가로, DNA 메틸트랜스퍼라제의 억제제인 5-아자-시티딘 처리 후, miR-129-2 발현 수준은 비처리된 세포에서의 것과 비교하였을 때, HuH7 세포에서는 2.5배, 및 J7 세포에서는 16배 유의적으로 상승하였다 (도 3c). 이러한 결과를 통해, DNA 메틸화가 miR-129-2 발현을 조절하고, 이는 HCC 세포에서 miR-129-2의 발현을 감소시킨다는 것이 제안되었다.
[ 실시예 3] miR -129-2는 HCC 에서 종양 억제인자 miRNA 로서 기능하였음
HCC에서의 miR-129-2의 기능을 평가하기 위해, 맨 먼저 본 발명자들은 miR-129-2 전구체를 보유하는 렌티바이러스 (렌티-miR-129-2)의 감염에 의해 miR-129-2 발현 HCC 세포를 생성하였다. 본 발명자들은 택맨 검정을 사용함으로써, 렌티-miR-129-2에 의해 감염된 HCC 세포 중의 성숙 miR-129-2의 발현을 측정하였다. HuH7 세포에서는 렌티-miR-129-2 감염으로 인해 대조군 감염 세포와 비교하였을 때, miR-129-2-5p 및 miR-129-2-3p가 각각 약 2,000배 및 1,000배 만큼 과다발현되었다 (도 4a∼4b). 유사하게, 렌티-miR-129-2에 의해 감염된 J7 세포는 대조군 감염 세포와 비교하였을 때, 약 500배 초과의 miR-129-2-5p 발현 및 1,000배 초과의 miR-129-2 발현을 보였다. 본 발명자들은 miR-129-2가 HCC 세포의 부착-비의존성 성장을 감소시킬 수 있는 능력을 소유한다는 것을 발견하게 되었다. 대조군 감염 세포와 비교하였을 때, miR-129-2를 발현하는 J7에서 세포 콜로니 중 단지 ⅓만이 관찰되었다 (도 4c). 동일한 방식으로, 대조군 렌티바이러스에 의해 감염된 HuH7은 평균적으로 한 웰당 47개의 콜로니를 나타내었다 (도 4d). 대조적으로, 대조군 miRNA를 발현하는 HuH7에서는 거의 어떤 콜로니도 검출될 수 없었다. 이러한 결과는 miR-129-2가 HCC에서 종양 억제인자 miRNA로서 기능할 수 있다는 것을 시사하는 것이었다.
[ 실시예 4] HCC 임상 샘플 중 miR -129-2 과다메틸화 및 하향조절
임상 샘플 중 miR-129-2의 메틸화 상태를 평가하기 위해, COBRA를 사용하여 42개의 HCC 종양 쌍 및 인접한 정상 조직을 분석하였다 (도 5a). 42개의 HCC 조직 중 30개 (∼71%)는 miR-129-2 과다메틸화를 보였다 (도 5b). 대조적으로, miR-129-2 과다메틸화는 단지 하나의 인접한 정상 조직에서만 관찰되었다. 메틸화 수준을 추가로 정량하기 위해, 정량적 메틸화 특이 PCR을 수행하였다. 단지 3개의 사례 (환자 번호 1111, 2000 및 2756)만을 제외하면, 거의 모든 임상 샘플은 인접한 정상 조직과 비교하였을 때, HCC 조직에서 miR-129-2의 보다 높은 메틸화 수준을 나타내었다 (도 5c∼5d). 추가로, q-MSP의 결과는 COBRA의 것과 유의적인 상관관계가 있었다. 이러한 결과를 통해, miR-129-2가 HCC 임상 샘플에서는 과다메틸화되어 있으며, 이는 HCC 세포에서의 결과와 일치하는 것으로 나타났다.
추가로, miR-129-2의 발현이 DNA 메틸화에 의해 하향조절되는지 여부를 측정하기 위해, qRT-PCR을 수행하였다. 42개의 HCC 임상 샘플에서, miR-129-2의 발현은 인접한 정상 조직과 비교하였을 때, 29개의 HCC 샘플 (∼69%)에서 억제되어 있었다 (도 6a∼6b).
이러한 결과는 miR-129-2가 인접한 정상 조직이 아닌, HCC 샘플에서 과다메틸화되어 있고, 하향조절되어 있다는 것을 나타내고, 이는 miR-129-2의 차별적인 발현 및/또는 메틸화 수준이 HCC 진단용 마커로서의 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.
[ 실시예 5] HCC 혈장 샘플 중의 miR -129-2의 메틸화 수준
타이완 타이난에 소재하는 치메이 의료 센터로부터 41개의 HCC 혈장 샘플, 8개의 간경변증 혈장 샘플 및 10개의 건강한 혈장 샘플을 입수하였다. miR-129-2의 메틸화 수준을 측정하기 위해 샘플을 q-MSP시켰다. 41개의 HCC 혈장 샘플 중 37개 (90%)에서 메틸화 수준은 0.1을 초과하였다 (도 7a). 대조적으로, 건강한 기증자의 혈장 샘플 중에서는 메틸화 수준이 0.05를 초과하는 것이 검출되지 않았고, 단지 2개의 간경변증 혈장 샘플만이 0.1 초과를 나타냈다 (도 7a). 추가의 통계학적 분석을 위해, 메틸화 수준을 log2 값으로 변환시켰다. 통계학적 분석을 통해, HCC 혈장 중의 miR-129-2 메틸화 수준이 건강한 혈장 또는 간경변증 혈장보다 유의적으로 더 높은 것으로 나타났다 (P<0.01) (도 7b). ROC (수용자 운영 특성 곡선) 분석을 이용하여 miR-129-2 메틸화 수준의 민감도, 특이도, AUC (곡선하면적) 및 컷오프 값을 측정하였다. 컷오프 값이 -2.36일 때, HCC는 건강한 것 및 간경변증의 것으로부터 구별되었고, 민감도 및 특이도는 각각 88% 및 100%였다 (AUC = 0.92, SE = 0.039, 95% CI = 0.843-0.997, P<0.001) (도 7c). ROC 곡선 분석을 통해, HCC 진단에 있어서 miR-129-2 메틸화를 사용하는 것이 고도로 정확하다는 것이 밝혀졌다.
개시된 실시양태를 다양하게 수정 및 변형시킬 수 있다는 것이 당업자에게는 자명할 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서 해석하고자 하며, 본 개시내용의 실제 범주는 하기 특허청구범위 및 그의 등가물을 통해 명시된다.
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Claims (10)

  1. 대상체로부터 분리된 바이오샘플 중의 miR-129-2의 메틸화 수준을 검출하는 것을 포함하고,
    여기서, 메틸화 수준이 복합 중아황산염 제한 분석 (COBRA), 정량적 메틸화 특이 중합효소 연쇄 반응 (q-MSP) 및 중아황산염 시퀀싱으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 검출되고,
    COBRA에 의한 메틸화 수준의 검출이 서열 4 및 5에 개시된 프라이머 쌍을 사용하여 진행되고,
    q-MSP에 의한 메틸화 수준의 검출이 서열 8 및 9에 개시된 프라이머 쌍을 사용하여 진행되고,
    바이오샘플 중의 miR-129-2의 메틸화 수준이 대조군 샘플 중의 상응하는 miR-129-2의 메틸화 수준에 비하여 더 높고, 이는 대상체가 간암에 취약하거나 또는 간암을 앓고 있음을 시사하는 것인,
    대상체에서 간암의 발생률을 측정하기 위해 필요한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, miR-129-2가 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 메틸화가 miR-129-2의 하나 이상의 CpG 부위에서 일어나는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 바이오샘플이 간 조직, 혈액, 혈청 또는 혈장을 포함하는 것인 방법.
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Chen et al. Epigenetic regulation of miR-375 in human colorectal cancer cells: a key role of DNA methylation

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