TW201313743A - 抗親和性複合體之抗體 - Google Patents

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Yoshiaki Uchida
Katsutoshi Goishi
Asako Oka
Takashi Shirakawa
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Abstract

本發明係提供以三明治法為高敏感度且特異性地測定低分子物質等物質的手段及方法。具體而言，本發明係提供可特異性結合於親和性複合體的抗體，以及測定親和性複合體之方法，其包含使用可特異性結合於親和性複合體的抗體來測定親和性複合體。本發明之抗體可為全長抗體。又本發明之抗體可具有來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域(例如，互補決定區域、框架區域、可變區域)。就構成親和性複合體的至少1個之因子而言，可舉例例如低分子物質、蛋白質(例如，抗體)。

Description

抗親和性複合體之抗體
本發明係關於抗親和性複合體之抗體、及使用抗親和性複合體之抗體之親和性複合體構成因子的測定方法等。
目前利用荷爾蒙、醫藥、胜肽等低分子物質的免疫測定法的定量正頻繁地進行。測定對象物質為低分子物質的情形，一般利用稱為競爭性抑制法的定量法。
競爭性抑制法之測定敏感度有賴於所使用的抗體對抗原的親和性，但一般而言，已知於製作抗低分子物質的抗體的情形，難以獲得高親和性之抗體。又，競爭性抑制法係基於1種類之抗體之反應性而發揮其特異性，故有必要獲得高特異性之抗體，但為了獲得如此抗體則伴隨著困難性。即，藉由競爭性抑制法進行測定之際，為了篩選滿足測定敏感度及特異性的抗體，需要花費很多勞力。又，即使可幸運地篩選出抗體，競爭性抑制法於測定對象物質為低濃度及高濃度的情形，其測定準確度及測定敏感度低，且有決定樣品與標識抗原之競爭條件為煩雜等的缺點。
競爭性抑制法中的上述缺點可藉由三明治法，其係使用2種用以辨認抗原之不同抗原決定位的抗體進行測定而消除。然而，低分子物質的情形，由於僅存在1個抗原決定位，而2種抗體間會產生立體障礙，故利用一般的三明治法來定量低分子物質被認為有其困難。
就用於三明治法測定低分子物質的方法而言，已報告使用辨識抗原抗體複合體的抗體的測定法。就抗體之製作方法而言，已知有使用動物的活體內(in vivo)法(例如，融合瘤法)、及活體外(in vitro)法(例如，噬菌體表現(phage display)法)。例如，非專利文獻1記載已成功藉由小鼠免疫法，取得低分子半抗原(hapten)(△9-四氫大麻酚(△9-tetrahydrocannabinol)：MW314.5)-抗體複合體抗體，並藉由實施5次融合實驗，確立約200個選殖株之抗小鼠抗體(獨特型(idiotype))抗體，但僅1株為複合體辨識抗體。
又，關於藉由三明治法之低分子物質之測定方法，已知專利文獻1、2、非專利文獻1~4所揭示之方法。又，關於抗體及抗體產生細胞之製作技術，已知專利文獻3所揭示之方法。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2008/125733號
[專利文獻2]特開2001-174460號公報
[專利文獻3]國際公開第2004/011644號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Ulman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90, 1184-89 (1993)
[非專利文獻2]Tamm et al., Clinical Chemistry, 54 (9), 1511-1518 (2008)
[非專利文獻3]Oguri et al., Journal of American Chemical Society, 125 (25), 7608-7612 (2003)
[非專利文獻4]Self et al., Clinical Chemistry, 40 (11), 2035-2041 (1994)
[非專利文獻5]Rossotti et al, Anal. Chem., 82, 8838-8843 (2010)
本發明之目的係以三明治法而高敏感度且特異地測定低分子物質等之物質。
本發明者們專心檢討的結果，成功藉由組合使用親和性複合體(例如，含低分子物質及抗此等之抗體的複合體)及規定之方法，獲得可特異性地結合親和性複合體的良好抗體，以及使用如此抗體，以三明治法而高敏感度且特異地測定構成親和性複合體的因子(例如，低分子物質等之物質)，遂而完成本發明。
即，本發明如以下所示。
[1]一種抗體，其可特異性地結合親和性複合體。
[2]如[1]之抗體，其中前述抗體為全長抗體。
[3]如[1]之抗體，其中前述抗體為具有來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域。
[4]如[3]之抗體，其中來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域為互補決定區域(complementarity determining region)、框架區域(framework region)、或可變區域(variable domain)。
[5]如[1]~[4]之任一者之抗體，其中構成親和性複合體的至少1個之因子為低分子物質。
[6]如[1]~[5]之任一者之抗體，其中構成親和性複合體的至少1個之因子為蛋白質。
[7]如[1]~[6]之任一者之抗體，其中親和性複合體為含低分子物質及抗此等之抗體的複合體。
[8]如[7]之抗體，其中低分子物質為(a)類固醇化合物、(b)胺基酸化合物、或(c)維生素。
[9]如[8]之抗體，其為以下(a)~(c)之任一者：(a)類固醇化合物為雌激素(estrogen)；(b)胺基酸化合物為甲狀腺荷爾蒙；或(c)維生素為維生素D。
[10]如[9]之抗體，其為以下(a)~(c)之任一者：(a)雌激素為雌二醇；(b)甲狀腺荷爾蒙為三碘甲狀腺素(triiodothyronine)；或(c)維生素D為25OH維生素D3或25OH維生素D2。
[11]如[10]之抗體，其顯示以下(a)~(c)之結合率：(a)對於包含雌二醇及抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I)，對親和性複合體I可特異性結合的抗體(抗體I)之結合率算出為100%的情形，抗體I對於包含雌甾酮(estrone)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I’)、包含雌三醇(estriol)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I”)、包含雌二醇共軛物及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''')、包 含雌莫司汀(estramustine)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I'''')、或包含乙烯鹽酸氮芥(estromustine)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''''')的結合率為10%以下；(b)對於包含三碘甲狀腺素及抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II)，對親和性複合體II可特異性結合的抗體(抗體II)之結合率算出為100%的情形，抗體II對於包含二碘酪胺酸(diiodotyrosine)及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II’)、或包含甲狀腺素(thyroxine)及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II”)的結合率為10%以下；或(c)對於包含25OH維生素D3及抗25OH維生素D3抗體的親和性複合體(親和性複合體III-1)或包含25OH維生素D2及抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III-2)，對親和性複合體III-1或III-2可特異性結合的抗體(抗體III)之結合率算出為100%的情形，抗體III對於包含1,25(OH)2維生素D3及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III’)、或包含1,25(OH)2維生素D2及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III”)的結合率為10%以下。
[12]如[1]~[11]任一者之抗體，其係藉由下列方法製作，該方法包含培養具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞，而獲得可特異性結合於親和性複合體的抗體。 [13]一種套組，其包含以下：(i)可特異性結合於親和性複合體的抗體；及(ii)構成親和性複合體的至少1個之因子。[14]如[13]之套組，其為下述：(i’)對包含低分子物質或蛋白質、及抗此等之抗體的親和性複合體可特異性結合的抗體；以及(ii’)對低分子物質或蛋白質可特異性結合的抗體。
[15]一種親和性複合體之測定方法，其包含使用可特異性結合於親和性複合體的抗體測定親和性複合體。
[16]如[15]之方法，其中親和性複合體之測定係藉由三明治法。
依據本發明，可提供對於抗原(例如，低分子物質)抗體複合體等之親和性複合體可特異性結合的抗體。
依據本發明，可以三明治法測定向來以競爭性抑制法測定的低分子物質。藉由以三明治法測定，可期待測定敏感度之上升、提升特異性、改善測定準確度、建構測定系之迅速化等。又，因抗體取得之操作簡便，故容易藉由操作自動化而低成本化、迅速化。
又本發明不僅有用於低分子物質之測定，亦有用於低分子物質以外之因子之測定、及將指定因子做為治療標的的醫藥之開發。
[實施發明之形態] (1.抗體)
本發明係提供可特異性結合於親和性複合體的抗體。
用語「親和性複合體(affinity complex)」係指藉由2個以上之因子之締合(assoaiation)或凝集(即，非共價鍵)所形成的複合體。另一方面，就不同於親和性複合體的複合體而言，可舉例共價鍵性複合體。用語「共價鍵性複合體(covalent complex)」係指2個以上之因子藉由共價鍵所形成的複合體。就如此共價鍵性複合體而言，可舉例例如：無免疫原性之低分子物質(即，半抗原)與載體(例如，BSA、KLH等之蛋白質)藉由共價鍵結合的接合體(conjugate)。換言之，共價鍵性複合體係可為了於動物中引發對無免疫原性的低分子物質(即，半抗原)的免疫反應，藉以取得抗低分子物質的抗體，而向來被投與動物之應被免疫的複合體(即，免疫複合體)。向來使用如此共價鍵性複合體來製作抗低分子物質的抗體，但被認為亦會獲得做為副產物之對共價鍵性複合體可特異性結合的抗體(辨識共價鍵部分周邊的抗體)。然而，將如此接合體做為抗原使用所製作的抗共價鍵性複合體的抗體與藉由將親和性複合體本身做為抗原使用所製作的本發明抗體並不相同。其理由為例如，藉由人為導入共價鍵部分所製作的共價鍵性複合體之立體結構，由於共價鍵部分之存在及位置，以及由於共價鍵部分之導入所引起的立體結構(例如，折疊(folding)及/或構形(conformation))的潛在變化等，而與藉由自然締合(即，非共價鍵)所形成的親和性複合體並不相同。
親和性複合體係同種類之因子締合或凝集的均複合體、或不同種類之因子締合或凝集的雜複合體。又親和性複合體可為自然生成的親和性複合體、或無法自然生成之人為所製作的親和性複合體。就自然生成的親和性複合體而言，可舉例例如：於病毒或生物(例如，微生物、昆蟲、植物、動物)發現的親和性複合體、及可於環境中存在的親和性複合體。又親和性複合體為多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體)。就構成親和性複合體的因子而言，可舉例例如：蛋白質、低分子物質、糖、核酸(例如，DNA、RNA)、金屬以及此等之衍生物。
構成親和性複合體的因子較佳可為蛋白質。就如此蛋白質而言，可舉例具有親和性結合能力的蛋白質、具有凝集能力的蛋白質。就具有親和性結合能力的蛋白質而言，可舉例例如：配位體依賴性蛋白質[例如，G蛋白質共軛型受體等之細胞膜上受體、以及可溶性受體(例如，免疫球蛋白、自細胞膜上受體切斷的細胞外功能域)、及核內受體]、核酸結合蛋白質(例如，轉錄因子、核酸之保護或輸送蛋白質)、形成蛋白質複合體的蛋白質(例如，銜接子(adapter)蛋白質)、細胞外基質蛋白質(例如，細胞間黏合蛋白質)、酵素[例如，酪胺酸激酶(tyrosine kinase)(受體或非受體)、絲胺酸/蘇胺酸激酶等之激酶]、糖蛋白質。就具有凝集能力的蛋白質而言，可舉例例如：變性蛋白質、病原性蛋白質(例如，β類澱粉(amyloid)等之神經變性蛋白質)。
為構成親和性複合體的因子的蛋白質較佳可為抗體 。構成親和性複合體的抗體例如可為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等任一者之同型(isotype)。又如此抗體亦可為多株抗體或單株抗體(例如，嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體)。構成親和性複合體的抗體可為抗自體抗原的抗體。又如此抗體亦可為如後述的全長抗體、或抗體片段。抗體片段可列舉例如：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、單鏈抗體。
又構成親和性複合體的因子較佳可為低分子物質。用語「低分子物質(small substance)」係指分子量低於1,500的化合物。低分子物質為天然物質或合成物質。低分子物質之分子量可低於1,200、低於1,000、低於800、低於700、低於600、低於500、低於400或低於300。又低分子物質之分子量可為50以上、100以上、150以上或200以上。就低分子物質而言，可舉例例如：配位體、荷爾蒙、脂質、脂肪酸、維生素、類鴉片(opioid)、神經傳達物質(例如，兒茶酚胺(catecholamine))、核苷、核苷酸、寡核苷酸、蔗糖、寡糖、胺基酸、及寡肽、或醫藥、毒物、及代謝產物。就荷爾蒙而言，可列舉例如：類固醇荷爾蒙、甲狀腺荷爾蒙、胜肽荷爾蒙。
一實施形態中，低分子物質可為類固醇化合物。類固醇化合物係指具有類固醇骨架(環戊烷多氫菲(cyclopentanoperhydrophenanthrene)骨架)的化合物。就類固醇化合物而言，可舉例類固醇荷爾蒙、及保有類固醇骨架之其衍生物(例如，蛋白質同化類固醇、抗男性荷爾蒙劑及抗雌激素劑等之合成類固醇)。就類固醇荷爾蒙 而言，可舉例例如：男性荷爾蒙、雌激素、黃體素、皮質素(corticoid)(例如，糖質皮質素、礦物質皮質素)，但以雌激素為較佳。就雌激素而言，可舉例例如：雌甾酮、雌二醇、雌三醇。又低分子物質亦可為類固醇化合物之代謝產物。就類固醇化合物之代謝產物而言，可舉例例如：於如上述之類固醇化合物附加有羥基的化合物、及共軛物。就共軛物而言，可舉例例如：葡萄糖醛酸(glucuronic acid)共軛物、硫酸共軛物(例如，雌二醇之3位或17位之任一羥基、或3位及17位兩者之羥基共軛結合有硫酸基的化合物)、麩胱苷肽(glutathione)共軛物、乙醯基共軛物、胺基酸共軛物。又低分子物質可為類類固醇化合物治療用藥物(例如，雌莫司汀(estramustine))或其代謝產物(例如，乙烯鹽酸氮芥(estromustine))。
於其他實施形態，低分子物質可為胺基酸化合物。胺基酸化合物係指具有胺基及羧基的化合物。就胺基酸化合物而言，可舉例例如：α-胺基酸(例如，甘胺酸、丙 胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸(citrulline))、β-胺基酸(例如，β-丙胺酸)、γ-胺基酸(例如，γ-胺基酪酸)、以及保有胺基及羧基的彼等衍生物。胺基酸化合物可為L體或D體。又低分子物質可為胺基酸化合物之代謝產物。就胺基酸化合物之代謝產物而言，可舉例例如：於如上述之胺基酸化合物附加有羥基的化合物、及如上述的共軛物。低分子物質進一步可為類胺基酸化合物治療用藥物或其代謝產物。
胺基酸化合物較佳可為式(I)：R-CH2CH(NH2)COOH所表示的化合物。就R而言，可舉例如下：(i)烴基；(ii)芳基；(iii)烴-芳基；(iv)芳基-烴基；(v)烴氧基-烴基、芳基氧基-烴基、烴氧基-芳基、或芳基氧基-芳基；(vi)烴硫-烴基、芳基硫-烴基、烴硫-芳基、或芳基硫-芳基；(vii)單或二(烴)胺基-烴基、單或二(芳基)胺基-烴基、單或二(烴)胺基-芳基、或單或二(芳基)胺基-芳基。
烴基為直鏈、分支鏈或環狀之非芳香族烴基，其碳原子數係例如1~15個，較佳為1~12個，更佳為1~9個，特 佳為1~6個。就如此烴基而言，可舉例例如：烷基(例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、戊基、異戊基、新戊基、1-乙基丙基、己基、異己基、1,1-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、2-乙基丁基)、烯基(例如，乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-烯基、3-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-己烯基、3-己烯基、5-己烯基)、炔基(例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基)、環烷基(例如，環丙基、環丁基、環戊基、環己基)。烴亦與烴基相同。
芳基為芳香族烴基，其碳原子數例如為1~14個。就芳基而言，可舉例例如：苯基、萘基、蒽基、聯苯基。芳基(aryl)亦與芳基(aryl group)相同。
R可為具有1~8個，較佳為1~6個之取代基。就取代基而言，可舉例例如：鹵素原子(例如，氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、羥基、胺基、硫醇基、氰基、硝基、側氧基、醯亞胺基、羧基、醯胺基、磺醯基、硝基、甲醯基、碳原子數1~6之烴基。
更佳為式(I)所表示的化合物可為式(II)：R1-X-R2-CH2CH(NH2)COOH所表示的化合物。R1及R2各自獨立為表示上述烴基或上述芳基，較佳為表示上述環烷基或上述芳基，特佳為表示上述芳基。-X-表示-O-、-S-、-NH- 或結合肢，較佳為表示-O-、-S-或-NH-，更佳為表示-O-或-S-，特佳為表示-O-。R1可具有1~4個，較佳為1~3個之取代基。R2可具有1~4個，較佳為1~3個，更佳為1~2個之取代基。於R1及R2之取代基，關於R，與上述者相同。
再更佳為式(II)所表示的化合物，如以下所示，可為自酪胺酸生合成的酪胺酸衍生物。就酪胺酸衍生物而言，可舉例甲狀腺荷爾蒙(例如，三碘甲狀腺素、甲狀腺素)。又酪胺酸衍生物可為甲狀腺荷爾蒙之代謝產物。就甲狀腺荷爾蒙之代謝產物而言，可舉例例如：於甲狀腺荷爾蒙附加有羥基的化合物、及如上述的共軛物。又低分子物質可為類甲狀腺荷爾蒙治療用藥物或其代謝產物。
又其他實施形態中，低分子物質可為維生素。就維生素而言，可舉例例如：維生素A、B1、B2、B6、B12、C、D、E、K。較佳維生素為脂溶性維生素(例如，維生素A、D、E、K)，更佳為如以下所示的維生素D。又低分子物質可為維生素之代謝產物。就維生素之代謝產物而言，可舉例例如：於如上述維生素附加有羥基的化合物、及如上述的共軛物。低分子物質進一步可為類維生素治療用藥物或其代謝產物。
親和性複合體係含有如上述的2個以上之因子的複合體。具體而言，就親和性複合體而言，可舉例含有低分子物質及蛋白質(例如，抗體)的複合體、含有2個以上之蛋白質的蛋白質複合體、含有蛋白質及核酸的複合體 、含有蛋白質及金屬的金屬要求性蛋白質複合體、蛋白質凝集體、含互補的2個以上之核酸的核酸複合體(例如，雙鏈、參鏈)、金屬錯合物。
就有效率地製作可特異性結合於親和性複合體的抗體的觀點而言，親和性複合體較佳為構成親和性複合體的因子間具有強結合親和性者。因此，就有效率地製作抗體的觀點而言，親和性複合體可藉由構成親和性複合體的因子間之結合親和性而界定。就較佳結合親和性而言，可舉例具有低於10-5M、低於5×10-5M、低於10-6M、低於5×10-7M、低於10-7M、低於5×10-8M、低於10-8M、低於5×10-9M、低於10-9M、低於5×10-10M、低於10-10M、低於5×10-11M或低於10-11M之解離常數(即，Kd)之親和性。又解離常數可為10-15M以上、5×10-15M以上、10-14M以上、5×10-14M以上、10-13M以上、5×10-13M以上、10-12M以上、5×10-12M以上、10-11M以上、5×10-11M以上、10-10M以上或5×10-10M以上。又，即使構成親和性複合體的因子間之結合親和性低的情形，由於藉由使溶液中之因子之濃度增加，因可促進親和性複合體之形成，故可有效率地製作抗體。因此，構成親和性複合體的因子間之結合親和性未必重要。
表現「對親和性複合體可特異性結合[capable of specifically binding to an(the)affinity complex]」係指相較構成親和性複合體的各因子，對於親和性複合體更具有優先結合的能力。例如，本發明之抗體係具有結合於親和性複合體的能力，且實質上不具有對構成親和性複 合體的各因子結合的能力。因此，本發明之抗體可藉由對構成親和性複合體的各因子(例如，低分子物質、蛋白質)或其類似因子(例如，低分子物質之類似物、同系蛋白質)的交叉反應性而界定。例如，本發明抗體對於目的之親和性複合體的結合率算出為100%的情形，本發明之抗體對於構成親和性複合體的各因子或其類似因子、或對含類似因子的親和性複合體(類親和性複合體)的結合率為20%以下、15%以下、10%以下、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%、0.1%、或0.05%以下為宜。
例如，本發明之抗體可為顯示以下(a)~(c)之結合率者：(a)對於包含雌二醇及抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I)，對親和性複合體I可特異性結合的抗體(抗體I)之結合率算出為100%的情形，抗體I對於包含雌甾酮及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I’)、包含雌三醇及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I”)、包含雌二醇共軛物及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''')、包含雌莫司汀及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I'''')、或包含乙烯鹽酸氮芥及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''''')的結合率為上述值以下；(b)對於包含三碘甲狀腺素及抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II)，對親和性複合體II可特異性結合的抗體(抗體II)之結合率算出為100%的情形 ，抗體II對於包含二碘酪胺酸及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II’)、或包含甲狀腺素及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II”)的結合率為上述值以下；或(c)對於包含25OH維生素D3及抗25OH維生素D3抗體的親和性複合體(親和性複合體III-1)或包含25OH維生素D2及抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III-2)，對親和性複合體III-1或III-2可特異性結合的抗體(抗體III)之結合率算出為100%的情形，抗體III對於包含1,25(OH)2維生素D3及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III’)、或包含1,25(OH)2維生素D2及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III”)的結合率為上述值以下。
又可特異性結合於親和性複合體的抗體，相較共價鍵性複合體(構成共價鍵性複合體的各因子係與構成親和性複合體的各因子相同)，對於親和性複合體更可具有優先結合的能力。因本發明之抗體係將親和性複合體本身做為抗原使用所製作者，故相較共價鍵性複合體，本發明之抗體對於親和性複合體更可特異性結合。因此，本發明之抗體可藉由抗親和性複合體的結合親和性而界定。就抗親和性複合體的本發明抗體之結合親和性而言，可舉例具有低於10-5M、低於5×10-5M、低於10-6M、低於5×10-7M、低於10-7M、低於5×10-8M、低於10-8M、低於5×10-9M、低於10-9M、低於5×10-10M、低於10-10M、低 於5×10-11M或低於10-11M之解離常數(即，Kd)的親和性。又抗親和性複合體之本發明抗體之解離常數可為10-15M以上、5×10-15M以上、10-14M以上、5×10-14M以上、10-13M以上、5×10-13M以上、10-12M以上、5×10-12M以上、10-11M以上、5×10-11M以上、10-10M以上、5×10-10M以上、10-9M以上或5×10-9M以上。
本發明之抗體可為單株抗體。本發明之抗體可為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等之任一者之同型，例如，IgG或IgM。
本發明之抗體可具有來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域(例如，可變區域、互補決定區域、框架區域、恆定區域)。就來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域而言，可舉例例如：可變區域(VR)及恆定區域(CR)、以及VR中發現的互補決定區域(CDR)及框架區域(FR)。就VR而言，可舉例例如：重鏈可變區域(VH)、輕鏈可變區域(VL)。就CR而言，可舉例例如：重鏈恆定區域(包含CH1、CH2、CH3及CH4的CH)、輕鏈恆定區域(CL)。
用語「基因變換(gene conversion)」係指接受V(D)J重排(reconstruction)的可變區域基因被取代為存在於V基因上游的偽基因。雞等之鳥類、牛、綿羊、兔等之哺乳類動物等之動物(具有基因變換能力的動物)，抗體產生細胞中的抗體基因之可變區域可藉由為位點特異性重組的V(D)J重排、及一種為同源重組的基因變換兩者而多樣化。另一方面，於人類、小鼠等之哺乳類動物(不具有 基因變換能力的動物)，抗體產生細胞中的抗體基因之可變區域雖然得藉由V(D)J重排而多樣化，但無法藉由基因變換而多樣化。如後述之本發明之抗體之製作方法，因較佳使用富含多樣性的抗體產生細胞之集團(即，具有產生多樣抗體的能力的多樣抗體產生細胞之集團)，故藉由如此抗體產生細胞所產生的本發明之抗體可具有來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域。
本說明書中以下將具有基因變換能力的動物簡稱為動物X。又，將不具有基因變換能力的動物簡稱為動物Y。
就本發明者們所掌握者，於動物X，抗複合體(特別是親和性複合體)抗體似乎尚未被人為地加以製作。因此認為相對於活體內製作的向來抗體，具有來自動物X之免疫球蛋白的區域的本發明抗體係新穎的。
本發明之抗體可具有來自動物X之免疫球蛋白的第1區域(例如，VR、CR、CDR、FR)、及/或來自動物Y之免疫球蛋白的第2區域(例如，VR、CR、CDR、FR)。例如，本發明之抗體可具有CDR、FR、或包含CDR及FR兩者的VR做為來自動物X之免疫球蛋白的第1區域，且可具有CR、FR、或CR及FR兩者做為來自動物Y之免疫球蛋白的第2區域。如此抗體可對應於後述的抗體等。
較佳之本發明抗體係可具有(I)具有(a)來自動物X之免疫球蛋白(例如，IgM)的第1區域(例如，VR、CDR、FR)、及來自動物Y之免疫球蛋白(例如，IgG)的第2區域(例如，CR、CH1、CH2、CH3)的重鏈、以及具有(b)來自動物X 之免疫球蛋白(例如，IgM)的第1區域(例如，VR、CDR、FR)、及來自動物Y之免疫球蛋白(例如，IgG)的第2區域(例如，CR)的輕鏈(例如，λ鏈、κ鏈、以及λ鏈及κ鏈之嵌合體鏈)、或(II)具有(a)來自動物X之免疫球蛋白(例如，IgM)之第1區域(例如，VR、CDR、FR、CR、CH1)、及來自動物Y之免疫球蛋白(例如，IgG)的第2區域(例如，CR、CH2、CH3)的重鏈、以及具有(b)來自動物X之免疫球蛋白(例如，IgM)的VR及CR的輕鏈(例如，λ鏈、κ鏈)。
更佳為本發明之抗體可具有(I’)具有(a’)來自雞IgM的VR、及來自動物Y(例如，小鼠、人類)IgG(例如，IgG1)之CR(CH1、CH2、CH3)的重鏈、以及具有(b’)來自雞IgM的VR、及來自動物Y(例如，小鼠、人類)IgG(例如，IgG1)的CR的輕鏈(例如，λ鏈、κ鏈、以及λ鏈及κ鏈之嵌合體鏈)、或(II’)具有(a’)來自雞IgM的VR及CH1、及來自動物Y(例如，小鼠、人類)之IgG(例如，IgG1)的CH2及CH3的重鏈、以及具有(b’)來自雞IgM的VR及CR的輕鏈(例如，λ鏈、κ鏈)。
因上述動物之免疫球蛋白基因之核苷酸序列為已知，本項技術領域之人士藉由使用基因遺傳工程的手段，可適當地製作如此抗體(參照例如實施例5、6)。(I)及(I’)之抗體係可對應於後述的嵌合體I型抗體。(II)及(II’)之抗體可對應於後述的嵌合體II型抗體。
本發明之抗體可為全長抗體。用語「全長抗體」係指包含分別含有可變區域及恆定區域的重鏈及輕鏈的抗體(例如，含有2個Fab部分及Fc部分的抗體)。又本發明 之抗體可為來自如此的全長抗體的抗體片段。抗體片段為本發明之全長抗體之一部分，可舉例例如：F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv。
活體外製作的向來抗體，慣常者為所謂的單鏈抗體(scFv)，並不具有恆定區域。因此，認為本發明之全長抗體或其抗體片段相對於活體外製作的向來抗體係新穎的。又，將單鏈抗體變為全長抗體的情形，一般而言，已知對抗原的結合力及/或特異性會喪失或顯著降低。因此，本發明之全長抗體相對於活體外製作的向來之單鏈抗體、及可能由其所衍生的全長抗體係為優異的。又，後述的本發明方法具有：得以於短期間(數日)內調製可取得全長抗體之多樣性抗體產生細胞之集團(抗體庫)、以及經由1次之篩選操作可取得真的陽性選殖株(可能起因於用於測定的抗體產生細胞(例如，DT40細胞)之大小，而得以抑制非特異的反應之故)等之優點。
又本發明之抗體可為對露出於親和性複合體之表面上的部分可特異性結合的抗體(即，抗複合體的中和抗體)。依據如後述的本發明方法，可製作如此的抗體。例如，親和性複合體於活體內形成雜多聚體(例如，由3種蛋白質而成的雜3聚體)而顯示作用的情形下，藉由使用可對於雜多聚體中彼此締合的2聚體(親和性複合體)特異性結合的抗體，得以防止經由雜多聚體之形成所媒介的生物性訊號的產生。
又本發明之抗體可為對於具免疫原性之親和性複合體、或對無免疫原性之親和性複合體(即，半抗原)可特 異性結合的抗體。免疫原性係指引發動物中的抗體反應的能力。依據如後述的本發明之方法，不僅可製作對於具免疫原性之親和性複合體可特異性結合的抗體，亦可製作對無免疫原性的親和性複合體(即，半抗原)可特異性結合的抗體。本發明之方法係可自多樣性抗體產生細胞之集團(與多樣的抗體庫同義)，獲得可產生對於親和性複合體可結合之抗體的抗體產生細胞。因此，即使親和性複合體本身無免疫原性，亦可獲得產生對於親和性複合體可結合之抗體的抗體產生細胞。
又本發明之抗體可為對於包含來自任意動物的因子的複合體可特異性結合的抗體。依據如後述的本發明方法，即使構成親和性複合體的因子之一部分或全部為來自任意動物，可製作對如此親和性複合體可特異性結合的抗體。使用動物的向來方法中，因無法誘導抗來自同種動物的因子的免疫反應(例如，將包含抗原及抗此抗原的小鼠抗體的複合體免疫於小鼠的情形)，故無法製作抗如此因子的抗體。然而，依據本發明之方法，可製作對於含有來自任意動物的因子的複合體可特異性結合的抗體。
又本發明之抗體藉由特異性辨識親和性複合體中的因子間之締合部分、及/或由於結合而引起的因子變化的立體結構(例如，折疊及/或構形)，可獲得對於親和性複合體可特異性結合的抗體。
本發明之抗體可為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
嵌合抗體係指VR及CR來自互不相同的動物種之免疫球蛋白的單株抗體。例如，嵌合抗體可為具有來自動物X(例如，雞)之免疫球蛋白的VR、且具有來自動物Y(例如，人類)之免疫球蛋白的CR的嵌合(動物X/動物Y)抗體。來自動物Y之免疫球蛋白的CR，由於IgG、IgM、IgA、IgD、IgE及IgY等之同型而各自具有固有的胺基酸序列。本發明之嵌合抗體之CR可屬於任一者之同型。
嵌合抗體可藉由本身為周知的方法製作(例如，參照Morrison，Science 229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，(1989)J.Immunol.Methods 125：191-202；美國專利第5,807,715號；美國專利第4,816,567號；及美國專利第4,816,397號)。具體而言，嵌合抗體可如以下方式製作。首先，將自編碼動物Y免疫球蛋白的DNA所取得的CH基因(編碼H鏈CR的C基因)連結於自編碼分離自源於動物X的抗體產生細胞的動物X單株抗體的DNA所取得的VH基因(編碼H鏈VR的VDJ基因)的下游，並將自編碼動物Y免疫球蛋白的DNA所取得的CL基因(編碼L鏈CR的C基因)連結於自編碼分離自源於動物X的抗體產生細胞的動物X單株抗體的DNA所取得的VL基因(編碼L鏈VR的VJ基因)的下游。其次，藉由將此等連結物嵌入1個或各別的表現載體使可各別表現，以獲得的表現載體將宿主細胞予以轉形，經培養所得的轉形細胞而可製作該抗體(參照例如實施例5、6)。又本發明提供嵌合抗體之製作方法，其包含將本發明之抗體變換為嵌合抗體。
人類化抗體係指基因工程所製作的單株抗體，意指例如，CDR之一部分或全部係來自動物X(例如，雞)單株抗體，FR及CR係來自人類免疫球蛋白的單株抗體。CDR係存在於抗體之VR中之超可變區域(HVR)，為與抗原互補結合的部分(例如，CDR1、CDR2、CDR3)，FR係介隔於CDR前後之相對上經保存的部分(例如，FR1、FR2、FR3、FR4)。換言之，人類化抗體係動物X(例如，雞)單株抗體之CDR之一部分或全部以外的全部區域經人類免疫球蛋白之對應區域取代的單株抗體。
人類化抗體可藉由本身為周知的方法製作[例如，CDR移植(歐洲專利第239,400號；WO91/09967；美國專利第5,225,539號；美國專利第5,530,101號及美國專利第5,585,089號)、鑲面(veneering)或表面重整(resurfacing)(歐洲專利第592,106號；歐洲專利第519,596號；Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，PNAS 91：969-973(1994))、及鏈替換(chain shuffling)(參照美國專利第5,565,332號)]。又，FR中之胺基酸殘基就維持(較佳為改善)抗原結合性的觀點而言，可與來自CDR供給者抗體的對應殘基置換。FR中應被取代的胺基酸殘基可藉由本項技術領域周知的方法決定，例如，可藉由CDR及FR之相互作用模型，其係用以鑑定於抗原結合為重要的FR中之胺基酸殘基、以及序列比較，其係用以鑑定特定位置中的異常FR胺基酸殘基來決定[參照例如Queen等人，美國專利第5,585,089號； Riechmann等人，Nature 332：323(1988)]。具體而言，人類化抗體可如以下製作。首先，自產生動物X單株抗體的抗體產生細胞，分離動物X之H鏈CDR基因、及對應其之動物X之L鏈CDR基因，而且，自人類免疫球蛋白基因，分離編碼對應於動物X之H鏈CDR的人類H鏈CDR以外的全區域的人類H鏈基因、及編碼對應動物X之L鏈CDR的人類L鏈CDR以外之全區域的人類L鏈基因。其次，移植CDR。之後，將經移植CDR的人類H鏈基因、及經移植CDR的人類L鏈基因嵌入1個或各別之表現載體使可各別表現，以獲得的表現載體將宿主細胞轉形，藉由培養所獲得轉形細胞，藉此可製作抗體。又本發明提供人類化抗體之製作方法，其包含將本發明之抗體變換為人類化抗體。
人類抗體係指包含構成免疫球蛋白的H鏈及L鏈之VR及CR的全部區域為來自編碼人類免疫球蛋白的基因的抗體。
人類抗體可藉由本身為周知的方法製作。例如，人類抗體可藉由下列方式製作：使用經由將人類免疫球蛋白基因或含有其之染色體，嵌入至非人類動物(例如，動物X、非人類動物Y)(例如，經同源重組，嵌入至非人類動物之基因座中)所製作之轉基因動物所分離的抗體產生細胞、或使用導入人類免疫球蛋白基因或含其之染色體的轉基因抗體產生細胞而製作。轉基因動物為就人類免疫球蛋白而言為轉基因，且亦可為未表現內因性免疫球蛋白的動物。產生人類抗體的轉基因動物(及/或產生 人類抗體的轉基因抗體產生細胞)已知有小鼠、牛等之動物(及/或抗體產生細胞)。如此轉基因動物(及/或細胞)之製作、以及/或人類抗體之製作揭示於例如，WO98/37757、WO00/10383、WO00/075300、WO2002/070648、WO2003/047336、WO2003/085107、WO2005/104835、WO2006/047367、特開2001-231403、特開2009-82033、美國專利第5,939,598號、以及/或Lonberg及Huszar，Int.Rev.Immuno 1.13：65-93(1995)；WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；WO98/24893；WO92/01047；WO96/34096；WO96/33735；歐洲專利第0 598 877；美國專利第5,413,923號；美國專利第5,625,126號；美國專利第5,633,425號；美國專利第5,569,825號；美國專利第5,661,016號；美國專利第5,545,806號；美國專利第5,814,318號；美國專利第5,885,793號；美國專利第5,916,771號；及美國專利第5,939,598號。又，本發明之抗體(例如，人類化抗體及人類抗體)係得以對於抗原/抗體反應賦予pH依賴性的方式製作之可將抗原/抗體反應重複阻斷的循環抗體(recycling antibody)(參照例如Nature Biotechnology，28，1203-1207(2010))。又本發明提供人類抗體之製作方法。
本發明之抗體於決定其核苷酸序列上係使用本項技術領域周知之方法(例如，重組DNA技術、位點特異性變異導入、PCR等(參照例如Sambrook等人，1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版、Cold Spring Harboe Laboratory，Cold Spring Harbor，NY及Ausubel 等人編，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY記載之技術)來操作，例如，胺基酸殘基可經變異(例如，取代、缺失、及/或嵌入)。又本發明之抗體係如後述，可與其他部分或物質、或支持體等之固相連結。
本發明之抗體可藉由關於免疫球蛋白等之蛋白質之周知方法而加以分離或純化。就如此方法而言，可列舉例如：層析法(例如，離子交換層析法、親和性層析法、尺寸管柱層析法)、離心分離、透析、以及利用溶解度差異的方法。又本發明之抗體藉由使用對抗體之恆定區域(例如，特定之同型之恆定區域)具有親和性的物質(例如，蛋白質)，或藉由融合於異種多胜肽序列，可容易地純化。
(2.抗體產生細胞)
本發明係提供具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞。對可藉由該抗體產生細胞產生的可特異性結合於親和性複合體的抗體係如上所述。
用語「抗體產生細胞(antibody-producing cell)」係指具有產生抗體的能力的細胞。抗體產生細胞可為來自具有產生抗體的能力的動物的細胞，可舉例為B細胞。抗體產生細胞可為來自哺乳類動物(例如，人類、小鼠、大鼠、牛、綿羊)、鳥類(例如，雞)等之動物的細胞。就抗體產生細胞而言，可舉例初代培養細胞、細胞株，但較佳為細胞株。
抗體產生細胞較佳可為除了V(D)J重排之外，可引起可變區域中之進一步變異的抗體產生細胞。可引起可變區域中之進一步變異的抗體產生細胞之一例為來自具有基因變換能力的動物之保有該能力的抗體產生細胞。可引起可變區域中之進一步變異的抗體產生細胞之另一例為可引起可變區域中之體細胞突變的抗體產生細胞。就可引起可變區域中之體細胞突變的抗體產生細胞而言，已報告可變區域中之體細胞突變之頻率可顯著亢進的抗體產生細胞，例如，可使用來自淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大細胞淋巴瘤(diffuse large-cell lymphoma))的細胞。如此抗體產生細胞之製作已揭示於例如，Buerstedde等人[EMBO J.(1990)9：921-927]、WO2004/011644、WO2004/058964、WO2002/100998等之先前文獻。
抗體產生細胞較佳可為來自具有基因變換能力的動物。來自具有基因變換能力的動物的抗體產生細胞可為基因剔除(knockout)細胞。就如此基因剔除細胞而言，可舉例XRCC(例如，XRCC1、XRCC2、XRCC3等之1種以上之XRCC分子種)的基因剔除細胞。更佳為抗體產生細胞係DT40細胞等之華氏嚢(bursa of Fabricius)淋巴瘤細胞。DT40細胞為來自雞的B細胞株，亦包含該細胞所保有的染色體經導入變異(例如，特定基因之重組、嵌入、削除等)的衍生物株及亞株(Subline)(參照例如WO2004/011644)。
抗體產生細胞可為於抗體基因座產生同源重組的細 胞，藉以產生特定同型之免疫球蛋白。就特定之同型而言，可舉例例如：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE及IgY。
又抗體產生細胞可為藉由將本發明之抗體或其他蛋白質之表現載體導入於宿主細胞所製作的轉形體。藉由表現載體之外来基因的表現可為暫時性或恆定性(即，安定的)。就宿主細胞而言，可舉例例如：細菌(例如，大腸菌)、酵母等之微生物、以及昆蟲細胞、鳥類細胞及哺乳類動物細胞(例如，CHO細胞、MDCK細胞)等之動物細胞。又本發明提供用於轉形體之製作之如此表現載體。
表現載體所使用的啟動子只要可於所導入的細胞中發揮作用即可，並未特別限制，例如，可舉例可於微生物及動物細胞中發揮作用的啟動子。就如此啟動子而言，可舉例例如：病毒啟動子(例如，來自SV40的初期啟動子、巨細胞病毒(cytomegalovirus)LTR、勞氏肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、來自MoMuLV的LTR、來自腺病毒的初期啟動子)、來自哺乳類動物之構成基因啟動子(例如，β-肌動蛋白基因啟動子、PGK基因啟動子、運鐵蛋白(transferrin)基因啟動子)。
表現載體較佳為於編碼核酸分子的寡(多)核苷酸之下游包含轉錄終結訊號(即，終止子區域)。再者，表現載體可含有抗藥劑(例如，安比西林(ampicillin)、卡那黴素(kanamycin)、G418)之耐性基因。
為了將外来基因導入癌細胞所使用的表現載體之基本載體可為例如，質體或病毒載體(例如，來自腺病毒、反轉錄病毒(retrovirus)、腺相關病毒(Adeno-associated virus)、疱疹病毒、痘病毒(vaccinia virus)、痘病毒(poxvirus)、脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、辛德比斯病毒(Sindbis virus)、仙台病毒(Sendai virus)、慢病毒(lentivirus)等之病毒的載體)。
(3.抗體產生細胞之製作方法)
本發明係提供具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞之製作方法。本方法係包含使用親和性複合體，由多樣的抗體產生細胞之集團，調製具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞。親和性複合體、可特異性結合於親和性複合體的抗體、及抗體產生細胞係如上所述。例如，如此調製係藉由將多樣的抗體產生細胞接種於不同的孔中，培養後，評價可特異性結合於親和性複合體的抗體是否存在於培養上清液中來進行。或，如此調製係藉由自多樣的抗體產生細胞之集團，篩選具有結合於親和性複合體之能力的抗體產生細胞來進行。如此調製可於培養基、緩衝液、水等之溶液中進行。即，如此調製可於活體外進行。
本發明可使用因應目的步驟之任意的適當培養基。例如，關於指定的細胞，就調製培養基所使用的基礎培養基而言，可舉例例如：MEM、IMDM、DMEM、αMEM、Ham's培養基、RPMI培養基、Fischer’s培養基、及此等之混合培養基。培養基可含有例如，血清(例如，雞血清、FCS等之牛血清)、血清替代物(例如，KSR)、脂肪酸或脂質、胺基酸、維生素、增殖因子、細胞激素、抗氧 化劑、2-巰基乙醇、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。培養溫度、CO2濃度等之其他培養條件可適宜設定。培養溫度並未特別限定，例如約30~40℃，較佳為約39.5℃。又，CO2濃度例如為約1~10%，較佳為約5%。培養中的細胞數、各種因子之濃度等之其他條件可適宜設定。就本發明可使用的指定細胞而言，例如，可舉例來自哺乳類動物(例如，人類、犬、小鼠、大鼠、兔、倉鼠)之細胞(例如，CHO細胞、MDCK細胞)、來自鳥類(例如，雞)之細胞(例如，DT40細胞)、來自昆蟲之細胞。
本發明可使用因應目的步驟之任意的適當緩衝液。就如此緩衝液而言，可舉例例如：磷酸緩衝液(例如，PBS、PBST)、Tris緩衝液(例如，Tris-HCl)、碳酸緩衝液、乙酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液。緩衝液亦可進一步含有鹽等之物質。緩衝液之pH可因應目的步驟而適當調整，例如為pH4.0~10.0，較佳為pH5.0~9.0，更佳為pH6.0~8.0，再更佳為pH6.5~7.5。
較佳者即：調製來自多樣的抗體產生細胞之集團之具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞，係藉由使用親和性複合體，自多樣的抗體產生細胞之集團，篩選具有結合於親和性複合體的能力之抗體產生細胞來進行。具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞亦可使用包含保有締合能力的自然因子之一部分(例如，配位體結合功能域、細胞外功能域、可溶性受體)的親和性複合體來製作。親和性複合體係可經由如後述的檢測用物質加以標 識。親和性複合體可直接地、或介隔配位體(例如，蛋白質G)而間接地被固定於固體上。固體可使用如後述的檢測用物質加以標識。就親和性複合體可被固定的固體而言，可舉例例如：粒子(例如，磁性粒子、螢光標識粒子)。具體而言，調製可如以下方式進行。首先，於溶液(例如，緩衝液)中，將多樣的抗體產生細胞之集團與固定有親和性複合體的固體予以混合，並於指定溫度(例如，0~40℃，較佳為2~10℃)、指定時間(例如，5~300分鐘，較佳為15~60分鐘)下使反應。溶液中之抗體產生細胞之濃度可為例如，1.0×105~1.0×1010細胞/ml、1.0×106~1.0×109細胞/ml、或1.0×107~5.0×108細胞/ml。就並非防止獲得具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞，而是防止獲得具有產生可結於構成親和性複合體的各因子的抗體的能力的抗體產生細胞之觀點(即，阻礙)而言，反應用溶液除了親和性複合體之外，亦可含有構成親和性複合體之至少1個或複數個因子。其次，藉由任意手段(例如，磁性的或螢光的方法)，將與固定於固體的親和性複合體結合的抗體產生細胞自多樣的抗體產生細胞之集團回收。因應必要，將所回收的抗體產生細胞分散於培養基中，使抗體產生細胞與固定有親和性複合體的固體解離，之後，培養抗體產生細胞。所獲得的抗體產生細胞可產生可特異性結合於親和性複合體的抗體。
可確認獲得的抗體產生細胞是否產生可特異性結合於親和性複合體的抗體。如此之確認可使用例如親和性 複合體來進行。具體而言，確認可如以下方式進行。首先，將構成親和性複合體的至少1個之因子固定於支持體(例如，免疫盤)上。其次，於存在或未存在有形成親和性複合體的其他因子之下，添加抗體產生細胞之培養上清液。最後，使用可特異性結合於親和性複合體的抗體之檢測手段[例如，使用結合在可結合於該抗體之恆定區域的抗免疫球蛋白(例如，IgM)抗體的酵素(例如，HRP)及其基質(例如，TMB)]，評價可特異性結合於親和性複合體的抗體是否含有於抗體產生細胞之培養上清液中。
由抗體產生細胞所產生的抗體之對雜複合體的特異性可藉由上述方法論來確認。另一方面，抗體產生細胞所產生的抗體之對均複合體的特異性則無法藉由上述方法論來確認。因為構成均複合體的同種之因子(單量體)，於溶液中，將自律地締合而形成複合體，而無法以單量體存在。因此，自抗體產生細胞所產生的抗體對均複合體為特異性的，而針對無法結合於可形成均複合體的單量體，則有必要進一步評價。如此評價可如下進行，i)藉由製作於因子間之締合部分，導入有使其無法締合的胺基酸變異(例如，置換、刪除、嵌入)之變異因子，並確認本發明之抗體不會結合於變異因子，ii)藉由製作得以阻礙因子間締合而於因子附加有蛋白質(例如，GFP、GST)的融合因子，並確認本發明之抗體不會結合於融合因子，或iii)藉由使用得以使因子不形成親和性複合體的溶液來確認。iii)中所述的溶液之調製可藉由下列方式進行，例如，藉由鹽濃度、pH值等條件之調整、或將相 較於同種因子a間之結合強度，顯示與因子a具高結合強度的異種因子b添加至溶液中，或將得以與因子a結合之異種因子b過量地添加至溶液中來進行。
本發明之方法亦可進一步包含使彼此具有親和性之2個以上的因子締合，而調製親和性複合體。締合可於溶液(例如，緩衝液)中進行。構成親和性複合體的因子如上所述。2個以上因子之中的至少1個因子亦可預先被固定於固體。於此情形，所調製的親和性複合體可為被固定於固體者。因子可介隔例如，連結物(linker)，而被固定於固體。例如，因子為免疫球蛋白的情形，因子可介隔著對免疫球蛋白具有親和性的蛋白質(例如，蛋白質G)，而被固定於固體。使彼此具有親和性的2個以上之因子締合的情形，溶液中之各因子的濃度只要可形成親和性複合體即可，並未特別限定，例如，可為0.001~100,000μM、0.01~10,000μM、0.05~1000μM、或0.1~100μM。又，本發明之方法所使用的親和性複合體可為含各種種類之親和性複合體的複合體庫，亦可使用陣列樣式。
本發明之方法可進一步含有提供多樣的抗體產生細胞之集團。多樣的抗體產生細胞之集團可使用預先調製者，亦可使用新調製者。多樣的抗體產生細胞之集團較佳者為除了V(D)J重排之外，可引起可變區域中之進一步變異的抗體產生細胞之集團。就多樣的抗體產生細胞之集團而言，可舉例例如：如上述來自具有基因變換能力的動物之保有該能力的抗體產生細胞之集團、以及可引起可變區域中之體細胞突變的抗體產生細胞之集團。此 等集團之調製可藉由例如先前列舉的文獻中記載的方法來進行。
本發明之方法可進一步包含於培養基中，將具有基因變換能力的抗體產生細胞，以組蛋白去乙醯酶(Histone Deacetylase)之抑制劑處理，而調製多樣的抗體產生細胞之集團者。藉由如此處理，首先，將促進抗體產生細胞之染色體中的染色質結構之鬆緩。其次，由於染色質結構之鬆緩，將促進抗體基因座中的同源重組，而獲得產生多樣性抗體的多樣的抗體產生細胞之集團。就組蛋白去乙醯酶之抑制劑而言，可舉例例如：具有抑制組蛋白去乙醯酶(HDAC)活性的活性的抗體等之蛋白質因子、以及曲古抑菌素A(trichostatin A)、丁基酸及丙戊酸(valproic acid)等之化合物。由具有基因變換能力的抗體產生細胞調製多樣的抗體產生細胞之集團的方法的細節，參照例如WO2004/011644。又，如此技術之一例已知有ADLib(Autonomously Diversifying Library)系統。
本發明之方法亦可包含，使用親和性複合體，自多樣的抗體產生細胞之集團，調製具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞之前，使用構成親和性複合體的因子，自多樣的抗體產生細胞之集團，去除具有產生可特異性結合於構成親和性複合體的因子的抗體的能力的抗體產生細胞。藉由如此方法論，可有效率地獲得具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞。例如，目的之抗體產生細胞為具有結合於親和性複合體的能力的抗體產生細 胞的情形，去除係可如以下方式進行。首先，於溶液中，將構成親和性複合體的因子固定於支持體(例如，免疫盤)上。其次，將多樣的抗體產生細胞之集團添加於溶液中，放置一定時間，使具有結合於構成親和性複合體的因子的能力的抗體產生細胞與支持體上之因子結合。回收包含未與支持體結合的抗體產生細胞之集團的溶液後，使用親和性複合體，自多樣的抗體產生細胞之集團，調製具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞。去除係可針對構成親和性複合體的1種因子進行，或可藉由重複複數次，針對構成親和性複合體的2種以上(例如，全部)因子進行。
本發明之抗體係如上述，有可能特異性辨識親和性複合體中的因子間之締合部分、及/或因締合所引起之因子立體結構之變化(例如，折疊及/或構形)。因此，本發明之方法可進一步含有將本發明之抗體分類為對於親和性複合體中的因子間之締合部分可特異性結合的抗體、或對於因締合所引起之因子立體結構之變化(例如，折疊及/或構形)可特異性結合的抗體、或具有上述特性之兩者的抗體。
本發明之方法亦可藉由重複以上步驟之全部或一部分來進行。例如，藉由將以上之步驟重複2次以上，可調製對親和性複合體產生更良質之抗體的抗體產生細胞。 又本發明之方法亦可藉由組合不同方法論加以進行。例如，藉由將內含ADLib系統的方法論，與如上述之體細胞突變導入法加以組合，可調製產生對於親和性複合體 產生而言為最佳化之抗體的抗體產生細胞。當然，因本發明之方法其本身為優異，未必有必要與其他方法論併用。就更迅速獲得目的抗體的觀點而言，可單獨使用本發明之方法。
(4.抗體之製作方法)
本發明係提供可特異性結合於親和性複合體的抗體之製作方法。本方法係藉由培養具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞，而獲得可特異性結合於親和性複合體的抗體。親和性複合體、可特異性結合於親和性複合體的抗體、及抗體產生細胞為如上所述。
抗體產生細胞之培養可於培養基中進行。例如，關於動物細胞，可使用上述的培養基。又，關於微生物，培養基較佳為含有微生物生長所必要的碳源、氮源、無機物等。其中，就碳源而言，可舉例例如：葡萄糖、糊精、可溶性澱粉、蔗糖等，就氮源而言，可舉例例如：銨鹽類、硝酸鹽類、玉米澱粉‧溶液、腖、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯萃取液等之無機或有機物質，就無機物而言，例如，氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。又，於培養基可添加酵母萃取物、維生素類等。培養條件，例如溫度、培養基之pH及培養時間，可適當選擇以使抗體產生細胞得以大量產生抗體。培養溫度例如為30~40℃。
抗體之製作方法係可進一步包含於培養基中，自多樣的抗體產生細胞之集團，獲得具有產生可特異性結合 於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞。如此步驟可與本發明之抗體產生細胞之製作方法相同地進行。
(5.抗體之用途)
本發明之抗體係有用於例如：做為試藥(例如，診斷試藥、實驗試藥)及醫藥，以及因子之篩選。
例如，本發明之抗體做為試藥，可用於親和性複合體之免疫分析(定性的或定量的測定)。就免疫分析而言，可舉例酵素免疫測定法(EIA)(例如，直接競爭性ELISA、間接競爭性ELISA、三明治ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、螢光免疫測定法(FIA)、免疫層析法、螢光免疫測定法、自旋免疫測定法(spin-immunoassay)、西方墨漬法(Western blot)、免疫組織化學染色法。
就做為試藥使用的情形，本發明之抗體可與檢測用物質連結。本發明之抗體可直接或間接與檢測用物質(即，藉由使用連結物)連結。就檢測用物質而言，可列舉例如：酵素(例如，西洋辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase))、親和性物質(例如，鏈黴親和素(Streptavidin)、生物素)、螢光物質(例如，螢光素(fluorescein)、螢光素異硫氰酸酯、玫紅(rhodamine))、發光物質(例如，蟲螢光素(luciferin)、水母蛋白(aequorin))、放射性物質(例如，125I、131I、111In、99Tc)。連結檢測用物質的本發明抗體有用於免疫分析。
做為試藥使用的情形，本發明之抗體可被固定於支持體上。就支持體而言，可舉例例如：膜(例如，硝基纖 維素膜)、玻璃、塑膠、金屬、免疫盤(例如，多孔盤)。固定在支持體上的本發明抗體有用於例如免疫分析、及親和性複合體之純化。
本發明之抗體較佳為有用於非競爭性測定法。就非競爭性測定法而言，可舉例例如：三明治法。本發明之抗體使用於三明治法的情形，較佳者為使用含有抗因子(例如，低分子物質、蛋白質)的第1抗體、以及對含有因子及抗此等因子之第1抗體的親和性複合體可特異性結合的第2抗體(即，抗體之組合)又更佳。
又本發明之抗體，做為醫藥，藉由與存在於活體內的親和性複合體結合，可使此親和性複合體之機能喪失，或可變更此親和性複合體之體內動態。例如，本發明之抗體可用於抑制存在於活體內之由至少3個因子所構成的親和性複合體之形成。具體而言，存在於活體內的親和性複合體為由因子a(例如，配位體)、因子b(例如，受體)及因子c(例如，共活化劑(coactivator)及輔抑制物(corepressor)等之共因子)所構成的情形，本發明之抗體係藉由競爭性結合於由因子a及因子b所構成的親和性複合體，抑制由因子a及因子b所構成的親和性複合體與因子c之間的結合，據此，可調節由因子a、因子b及因子c所構成的親和性複合體之形成所媒介的生物性訊號(例如，增殖訊號)。例如，因子c為共活化劑的情形，本發明之抗體可降低生物性訊號。另一方面，因子c為輔抑制物的情形，本發明之抗體可增強生物性訊號。或於構成存在於活體內的親和性複合體的因子產生如增強生物性 訊號(例如，增殖訊號)的變異的情形，本發明之抗體藉由抑制親和性複合體之形成，可降低生物性訊號。
做為醫藥使用的情形，本發明之抗體可與治療上有用的物質連結。本發明之抗體可直接或間接與治療上有用的物質(即，藉由使用連結物)連結。就治療上有用的物質而言，可舉例例如：抗癌劑、毒素(例如，細胞增殖抑制性或細胞毒殺性)、蛋白質(例如，增殖因子、細胞激素)、放射性金屬[例如，α射極(例如，213Bi)]、細胞凋亡促進劑、安定化劑(例如，PEG)。將如此物質連結於抗體的技術為周知者，參照例如：Arnon等人，「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(編)，243-56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，「Antibodies For Drug Delivery」Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等人(編)，623-53頁(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review」Monoclonal Antibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(編)，475-506頁(1985)。
使用做為醫藥的情形，本發明之抗體可做為包含有醫藥上可容許的載體的醫藥組成物而被投與。醫藥組成物係經口或非經口地被投與(例如，靜脈內注射、皮下注射、肌肉注射、局部注入、腹腔內投與)。就醫藥上可容許的載體而言，可舉例例如：蔗糖、澱粉、甘露糖醇、 山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣、碳酸鈣等之賦形劑；纖維素、甲基纖維素、羥基丙基纖維素、聚丙基吡咯啶酮、明膠、阿拉伯樹膠、聚乙二醇、蔗糖、澱粉等之結合劑；澱粉、羧基甲基纖維素、羥基丙基澱粉、鈉-二醇-澱粉、碳酸氫鈉、磷酸鈣、檸檬酸鈣等之崩解劑；硬脂酸鎂、aerosil®、滑石、月桂基硫酸鈉等之潤滑劑；檸檬酸、薄荷醇、甘草皂苷(glycyrrhizin)‧銨鹽、甘胺酸、橘子粉等之芳香劑；苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等之保存劑；檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸等之安定劑；甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、硬脂酸鋁等之懸浮劑；界面活性劑等之分散劑；水、生理食鹽水、柳橙汁等之稀釋劑；可可油、聚乙二醇、無色煤油等之基蠟等，但未限定於此等。
做為醫藥使用的情形，本發明之抗體之投與量因有效成分之活性或種類、疾病之嚴重度、為投與對象的動物種類、投與對象之藥物耐受性、體重、年齡等而異，未能一概而論，但通常成人每1日之有效成分量為約0.001~約500mg/kg。
本發明之抗體可與構成親和性複合體的至少1個因子組合使用。此情形，本發明之抗體係以含有(i)可特異性結合於親和性複合體的抗體、及(ii)構成親和性複合體的至少1個因子的套組(set)而被提供。構成親和性複合體的至少1個因子係與構成親和性複合體的上述因子相同。又本發明之套組可包含(i’)對於包含因子(例如，低分 子物質、蛋白質)、及抗該因子之抗體的親和性複合體可特異性結合的抗體、及(ii’)對因子(例如，低分子物質、蛋白質)可特異性結合的抗體。本發明之套組可做為試劑組(kit)而被提供。
本發明之套組有用於例如檢測及/或定量可構成親和性複合體的因子。本發明之抗體做為如此套組被提供的情形，本發明之抗體如上述般可與檢測用物質連結。或本發明之抗體未與檢測用物質連結的情形，本發明之套組可進一步含有檢測用物質、及/或與檢測用物質連結的本發明抗體之檢測用蛋白質(例如，抗免疫球蛋白抗體、或蛋白質G)。例如，構成親和性複合體的至少1個因子為蛋白質的情形，本發明之套組有用於三明治法。
或者構成親和性複合體的至少1個因子為抗體等之蛋白質的情形，本發明之套組係用於將構成親和性複合體的其他因子(例如，低分子物質、蛋白質)做為治療標的的三明治療法(例如，2重抗體療法)。
例如，抗體未必對低分子物質具有高特異性。然而，藉由組合對低分子物質可特異性結合的抗體，與對包含低分子物質及對其可特異性結合的抗體的親和性複合體可特異性結合的抗體時，將達成2重之特異性，而特異性有所放大。如此抗體之組合對低分子物質，較單獨抗體更具特異性。因此，本發明之套組係有用於抗低分子物質的抗體療法。
又，抗體對於具有高度同源性的複數蛋白質中的特定標的蛋白質未必具有高特異性。例如，治療標的為天 然蛋白質a，且存在對天然蛋白質a具有高同源性(例如，80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上或99%以上之胺基酸序列相同性)的天然蛋白質b(同系物)的情形，為對於天然蛋白質a更加專一性作用，可使用如此抗體之組合。因此，本發明之套組係有用於將具有高度同源性的複數天然蛋白質中之特定天然蛋白質做為治療標的的抗體療法。
再者，抗體對變異蛋白質未必具有高特異性。就如此變異蛋白質而言，可舉例例如：相對於天然蛋白質，有1個或數個胺基酸殘基變異(例如，置換、刪除、嵌入、及/或添加)的蛋白質。例如，於癌症，不希望將表現於正常細胞的非變異蛋白質a(天然蛋白質a)做為治療標的，且僅希望將表現於異常細胞的變異蛋白質a’做為治療標的的情形，為對於變異蛋白質a’更加專一性作用，可使用如此抗體之組合。因此，本發明之套組有用於僅以變異蛋白質做為治療標的的抗體療法。
本發明之套組有用於可形成親和性複合體的因子之篩選。本發明之套組又有用於具有不同作用機序的配位體(例如，低分子物質、蛋白質)之篩選。就針對指定受體的配位體而言，已知具有不同作用機序者(例如，激動劑、拮抗劑、逆轉激動劑)。對指定受體的此等配位體之作用機序之差異可由於受體及配位體之締合所引起的受體立體結構(例如，折疊及/或構形)之變化所引起。因此，做為本發明之抗體，使用可特異性辨識因締合所引起之因子的立體結構變化(例如，折疊及/或構形)的情形， 可能有助於配位體之作用機序之種類的鑑定。
以下以實施例為例進一步詳細說明本發明，但本發明並未受下述實施例等任何限制。
[實施例] 實施例1：針對親和性複合體(E2抗E2抗體複合體)之抗體的取得
利用活體外雞IgM取得技術[(ADLib(Autonomously Diversifying Library)系統：參照例如WO2004/011644]，藉由進行以下方法，獲得針對E2抗E2抗體複合體的抗體。又，本說明書中以下，有時記載為E1(雌甾酮)、E2(雌二醇)、E3(雌三醇)。又，以下，關於E2，1μg/mL相當於3.7μM，關於F18-3抗體，1μg/mL相當於6.7nM，關於F12-33抗體，1μg/mL相當於6.7nM，關於曲古抑菌素A(TSA)，1μg/mL相當於3.3μM。
(1)DT40細胞之多樣化
多樣化的DT40細胞係使用藉由以下順序製作者。
‧量取50mL之含有9%FBS、1%雞血清的IMDM培養基[CS(Chicken Serum)+培養基]，添加至15cm培養皿中。
‧添加曲古抑菌素A(TSA)成為2.5ng/mL。
‧添加1.5×107個之DT40細胞，並於設定為39.5℃的CO2培養箱內培養1日。
(2)DT40細胞之繼代
依以下順序，將DT40細胞繼代。
‧取培養1日的細胞懸浮液至50mL試管，於4℃，1000rpm，離心10分鐘。
‧去除上清液後，以10mL之CS+培養基再懸浮。
‧於CS+培養基950μL添加細胞懸浮液50μL作20倍稀釋，並攪拌。
‧計數活細胞數。
‧於新的15cm培養皿中添加CS+培養基50mL。
‧添加1.5×107個之DT40細胞，並於設定為39.5℃的CO2培養箱內培養1日。
‧篩選產生目的抗體之細胞前，進行2次TSA處理。TSA處理係於含有2.5ng/mL TSA的CS+培養基中於39.5℃培養一晚來進行。
(3)抗原結合粒子之調製
依以下順序，調製抗原結合粒子。
‧於含固定有Protein G的磁性粒子[Dynabeads Protein G(粒徑：2.8μm)，獲自Invitrogen公司，目錄編號：100.03D]的磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)(13.5mg/mL)中添加300μg/mL之抗E2抗體(F18-3)。又，抗E2抗體(F18-3)係本公司可確立的小鼠單株抗體。又，針對E2的抗E2抗體(F18-3)之結合，根據各種資料，類推為10-9M至10-12M左右。
‧於4℃，反應1h而將F18-3固相化於粒子上。
‧以0.1% BSA/PBS將粒子洗淨4次。
‧使粒子分散於含1.1μg/mL之E2的PBS中。
‧於4℃，放置1h，使形成抗原及抗體締合的抗原抗體複合體(含E2及抗E2抗體的親和性複合體)。
‧以0.1% BSA/PBS將粒子洗淨4次。
(4)產生目的抗體的細胞之培養
依以下順序，培養產生目的抗體的細胞。
‧於2個15cm培養皿中各別添加CS+培養基50mL。
‧將1.5×107個之細胞加到各培養基，培養1日。
‧將細胞懸浮液回收至50mL試管，於4℃，以1000rpm離心10分鐘。
‧去除上清液後，以1% BSA/PBS洗淨2次並回收於1.5mL試管中。
‧於4℃，3500rpm，離心5分鐘而去除上清液。
‧將(3)所調製的抗原結合粒子以1% BSA/PBS洗淨4次。
‧混合細胞(9x107細胞/mL)與抗原結合粒子(75μg/mL)，於4℃，使反應30分鐘。
‧以1% BSA/PBS洗淨5次，去除剩餘細胞。
‧以CS-培養基使細胞‧粒子分散。
‧接種於96孔盤，培養1週。
(5)產生目的抗體的細胞之篩選
篩選係藉由抗原抗體複合體固相ELISA來實施。藉由添加E2的情形與未添加的情形之呈色的差異，評價細胞是否產生目的抗體。順序如以下所示。
‧於測定盤中添加1μg/mL之抗E2抗體，並於37℃培養1小時使固相化。
‧以含有0.05% Tween20之磷酸緩衝生理食鹽水(0.05% PBST)洗淨3次。
‧以1%脫脂牛乳/PBS作阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加25μL之200ng/mL E2或僅添加緩衝液。
‧添加培養上清液25μL而進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞(anti Chicken)IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸停止呈色反應。
‧測定OD450。
(6)結果
成功以高產率獲得於E2未存在下、E2存在下(100ng/mL)，產生結合於抗原抗體複合體(含E2及抗E2抗體的親和性複合體)的抗體的細胞選殖株(3/88=3.4%：參照第1、2圖)。如此抗體製作效率係以向來的抗體製作方法所無法達成。例如，藉由向來的動物免疫法(融合瘤法)之抗體製作效率絕對無法達到上述效率。又，根據向來的動物免疫法，原本就無法製作抗親和性複合體本身的抗體。因此，本發明之方法顯示可有效率地製作抗親和性複合體本身的抗體。
實施例2：目的抗體對抗E2抗體及抗E2抗E2抗體複合體之特異性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價特異性。
‧於測定盤中分別以2μg/mL之濃度添加2種抗E2抗體(F18-3、F12-33)、抗AFP抗體(陰性對照組)，並於37℃培養1小時使固相化。又，抗E2抗體(F18-3、F12-33)係本 公司所確立的小鼠單株抗體。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1%脫脂牛乳/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加25μL之2ng/mL E1、2ng/mL E2或僅添加緩衝液。
‧添加以上述手段所確立的選殖株(2-1、2-2、2-3、2-4、2-5及2-6)之培養上清液25μL，並進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表1所示。選殖株2-1、2-3及2-5特異性結合於抗原[E2抗E2抗體(F18-3)複合體](參照*)。另一方面，選殖株2-2、2-4及2-6未結合於抗原[E2抗E2抗體(F18-3)複合體]，而與F18-3抗體結合。又，選殖株2-1、2-3及2-5分別對應實施例1之選殖株4、9及46，選殖株2-2、2-4及2-6分別對應實施例1之選殖株8、34及77。
根據以上，確認藉由本發明之方法，得以獲得可特異性結合複合體的抗體。
實施例3：目的抗體對E2之特異性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價目的抗體對E2之特異性。
‧於測定盤添加各濃度之E2-BSA(牛血清白蛋白)複合體，於37℃培養1小時使固相化。不使用E2而使用E2-BSA複合體的理由，係因E2為低分子化合物，不會單獨吸附於測定盤上。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1%脫脂牛乳/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧各添加25μL之100ng/mL E2或僅添加緩衝液。
‧添加實施例1所確立、並經實施例2評價的選殖株(2-1 、2-2、2-3、2-4、2-5及2-6)之培養上清液25μL，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表2所示。於單獨將E2(E2-BSA)固相化的ELISA，未發現顯示陽性的選殖株。因此，選殖株2-1、2-2、2-3、2-4、2-5及2-6被認為不會產生可結合於E2的抗體。
實施例4：對類似物質的交叉反應性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價對類似物質的抗體之交叉反應性。
‧將5μg/mL抗E2抗體(F18-3)固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1%脫脂牛乳/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧調製各濃度E1、E3、E2，各添加25μL。
‧各添加25μL之含3種抗體的培養上清液(選殖株2-1、2-3、2-5)，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表3所示。表3中，交叉反應性(%)係在計算出本發明抗體對於目的親和性複合體之結合率為100%的情形下，根據本發明抗體對於構成親和性複合體的各因子或其類似因子的結合率而算出。3種抗體(選殖株2-1、2-3、2-5)幾乎未與E1、E3結合。
根據以上，3種抗體(選殖株2-1、2-3、2-5)顯示可特異性結合於抗原抗體複合體[包含E2-抗E2抗體(F18-3)的複合體]。因此，證實藉由本發明，得以開發可特異性結合於親和性複合體的抗體。又，證實藉由三明治法可測定低分子物質。
實施例5：重組I型嵌合抗體之製作
將雞IgM抗體變換為小鼠IgG抗體，製作重組I型嵌合抗體。重組I型嵌合抗體係於針對E2-抗E2抗體複合體之雞IgM抗體之μ鏈及λ鏈可變區域(VH及VL)的下游，連結有小鼠恆定區域(CH、CL)的抗體[重鏈：來自雞IgM(μ鏈)之VH-來自小鼠IgG1(γ1鏈)之CH；輕鏈：來自雞IgM(λ鏈)之VL-來自小鼠IgG1(κ鏈)之CL]。以下，因應必要，稱為「嵌合體I型(抗體)」。
(1)嵌合體I型重鏈表現載體之製作
依以下順序，製作嵌合體I型重鏈表現載體。
a)將與E2-抗E2抗體複合體結合之雞IgM抗體(選殖株2-3)之μ鏈cDNA做為模板，使用引子A及引子B進行PCR，將雞μ鏈可變區域放大。
b)以抗TNF小鼠IgG1抗體之γ鏈cDNA做為模板，使用引子C及引子D進行PCR，將小鼠IgG1之恆定區域放大。
c)將於a)及b)放大的DNA片段之混合物做為模板，使用引子A及引子D進行裝配PCR(assemble PCR)，調製雞μ鏈可變區域與小鼠IgG1γ鏈恆定區域連結的1條DNA片段。
d)將於c)所獲得的DNA片段以限制酶Hind III及Not I處理後，嵌入市售(Invitrogen公司)之表現載體pcDNA3.1之Hind III-Not I位點。
(2)嵌合體I型輕鏈表現載體之製作
依以下順序，製作嵌合體I型輕鏈表現載體。
e)將與E2-抗E2抗體複合體結合之雞IgM抗體(選殖株2-3)之λ鏈cDNA做為模板，使用引子E及引子F進行PCR ，將雞λ鏈可變區域放大。
f)將抗TNF小鼠IgG1抗體之κ鏈cDNA做為模板，使用引子G及引子H進行PCR，將小鼠κ鏈恆定區域放大。
g)將於e)及f)中放大的DNA片段之混合物做為模板，使用引子E及引子H進行裝配PCR，調製連結有雞λ鏈可變區域與小鼠κ鏈恆定區域的單股DNA片段。
h)將於g)所獲得的DNA片段以限制酶Hind III及Not I處理後，嵌入市售(Invitrogen公司)之表現載體pcDNA3.1/Zeo之Hind III-Not I位點。
(3)重組嵌合體I型抗體之製作及表現確認
依以下順序，製作重組嵌合體I型抗體。
i)將經嵌合體I型重鏈表現載體、及嵌合體I型輕鏈表現載體所轉形的大腸菌選殖株分別於含100μg/ml安比西林的150ml之LB培養基中於37℃震盪培養一晚後，使用Quiagen公司之Plasmid Midi Kit來調製質體。
j)分別使用4μg之於i)調製的嵌合體I型重鏈表現載體、及嵌合體I型輕鏈發現載體，藉由Invitrogen公司之Lipofectamin 2000，將106個之CHO細胞予以轉形。
k)將於j)所轉形的CHO細胞使用含10%胎牛血清的Ham F-12培養基，於CO2培養箱中、37℃培養24小時。
1)為了確認嵌合體I型抗體之表現，以ELISA法確認k)之培養上清液中是否分泌了嵌合體I型抗體。即，於ELISA盤(Nunc公司)上將抗小鼠IgG固相化，將其與(1/2)n稀釋的培養上清液反應，其次，以標識有POD的抗小鼠IgG(DAKO公司)檢測。又，使用小鼠單株抗體(anti TNF36) 做為陽性對照、CHO培養上清液做為陰性對照。其結果確認嵌合體I型抗體之表現(表4)。
實施例6：重組II型嵌合抗體之製作
將雞IgM抗體變換為小鼠IgG抗體，來製作重組II型嵌合抗體。重組II型嵌合抗體係將小鼠IgG1之Hinge區域以下區域(Hinge區域、CH2及CH3)連結於抗E2-抗E2抗體複合體之雞IgM抗體之λ鏈(VL及CL)與μ鏈可變區域(VH)及CH1功能域的下游之抗體[重鏈：來自雞IgM(μ鏈)之VH及CH1-來自小鼠IgG1(γ1鏈)之Hinge區域、CH2及CH3；輕鏈：來自雞IgM(λ鏈)之VL及CL]。以下，因應必要，稱為「嵌合體II型(抗體)」。
(1)嵌合體II型重鏈表現載體之製作
依以下順序，製作嵌合體II型重鏈表現載體。
a’)將結合於E2-抗E2抗體複合體之雞IgM抗體(選殖株2-3)之μ鏈cDNA做為模板，並使用引子I及引子J進行PCR，將雞μ鏈可變區域及CH1放大。
b’)將抗TNF小鼠IgG1抗體之γ鏈cDNA做為模板，使用引子K及引子D進行PCR，將小鼠γ鏈之Hinge區域以下的區域(Hinge區域、CH2及CH3)放大。
c’)將於a’)及b’)中放大的DNA片段之混合物做為模板， 使用引子I及引子D進行裝配PCR，調製連結有雞μ鏈可變區域及CH1與小鼠γ之Hinge區域以下區域(Hinge區域、CH2及CH3)的1條DNA片段。
d’)將於c’)所獲得的DNA片段以限制酶Nhe I及Not I處理後，嵌入市售(Invitrogen公司)之表現載體pcDNA3.1之Nhe I-Not I位點。
(2)嵌合體II型輕鏈表現載體之製作
依以下順序，製作嵌合體II型輕鏈表現載體。
e’)將結合於E2-抗E2抗體複合體之雞IgM抗體(選殖株2-3)之λ鏈cDNA做為模板，使用引子E及引子L進行PCR，將雞λ鏈放大。
f’)將於e’)中放大的DNA片段以Hind III及Not I處理後，嵌入市售(Invitrogen公司)之表現載體pcDNA3.1/Zeo之Hind III-Not I位點。
(3)重組嵌合體II型抗體之製作及表現確認
依以下順序，製作重組嵌合體II型抗體。
g’)將經嵌合體II型重鏈表現載體、及嵌合體II型輕鏈表現載體所轉形的大腸菌選殖株分別於含100μg/ml安比西林的150ml之LB培養基中於37℃震盪培養一晚後，使用Quiagen公司之Plasmid Midi Kit來調製質體。
h’)分別使用4μg之於g’)所調製的嵌合體II型重鏈表現載體、及嵌合體II型輕鏈表現載體，藉由Invitrogen公司之Lipofectamin 2000，將106個之CHO細胞予以轉形。
i’)將於h’)所轉形的CHO細胞，使用含10%胎牛血清的Ham F-12培養基，於CO2培養箱中，於37℃培養24小時。 j’)為了確認嵌合體II型抗體之表現，以ELISA法確認i’)之培養上清液中是否分泌了嵌合體II型抗體。即，於ELISA盤(Nunc公司)上將抗小鼠IgG固相化，將其與(1/2)n稀釋的培養上清液反應，其次，以標識有POD的抗小鼠IgG(DAKO公司)檢測。又，使用小鼠單株抗體(anti TNF36)做為陽性對照、CHO培養上清液做為陰性對照。其結果確認嵌合體II型抗體之表現(表5)。
實施例7：針對親和性複合體(T3-抗T3抗體複合體)之抗體的取得
利用活體外雞IgM取得技術(ADLib系統)，藉由進行以下之方法，獲得針對T3-抗T3抗體複合體的抗體。又， 於本說明書中以下，有時記載為T2(二碘酪胺酸)、T3(三碘甲狀腺素)、T4(甲狀腺素)。又，以下，關於T3，1μg/mL相當於1.5μM，關於T3-92抗體，1μg/mL相當於6.7nM，關於T3-31抗體，1μg/mL相當於6.7nM。
(1)雞B細胞株DT40庫之多樣化
經多樣化的DT40細胞藉由實施例1(1)之順序調製。
(2)DT40庫之繼代
DT40細胞之繼代藉由實施例1(2)之順序來進行。
(3)抗原結合粒子之調製
依以下順序，調製抗原結合粒子。
‧於固定有Protein G的磁性粒子中添加300μg/mL之抗T3抗體(T3-92)。
‧於4℃，使反應1h將T3-92予以固相化。
‧以0.1% BSA/PBS洗淨粒子4次。
‧以含300μg/mL之T3的PBS將粒子予以分散。
‧於4℃，使反應1h而形成抗原抗體複合體。
‧以0.1% BSA/PBS洗淨粒子4次。
(4)產生目的抗體之細胞之培養
依以下順序，培養產生目的抗體的細胞。
‧於2個15cm培養皿中分別添加CS+培養基50mL。
‧添加1.5X107個細胞，並培養1日。
‧將細胞懸浮液回收於50mL試管，於4℃，1000rpm，離心10分鐘。
‧去除上清液後，以1% BSA/PBS洗淨2次，並回收於1.5mL試管。
‧於4℃，3500rpm，離心5分鐘以去除上清液。
‧以1% BSA/PBS將於(3)所調製的抗原結合粒子洗淨4次。
‧將細胞及抗原結合粒子予以混合，於4℃使反應30分鐘。
‧以1% BSA/PBS洗淨5次，去除剩餘細胞。
‧以CS-培養基將細胞‧粒子予以分散。
‧接種於96孔盤，培養1週。
(5)產生目的抗體的細胞之篩選
篩選係藉由抗原抗體複合體固相ELISA來實施。藉由添加T3的情形與未添加的情形之呈色差異，評價細胞是否產生目的抗體。順序如以下所示。
‧於測定盤添加1μg/mL之抗T3抗體，使其固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加50μL之50ng/mL T3或僅添加緩衝液，使T3與固相抗體結合。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加DT40培養上清液50μL，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(6)結果
成功以高產率獲得於T3未存在下、T3存在下(50ng/mL)，反應性有顯著差異的選殖株(Well No.23、91、94、101、110、121)(6選殖株/144=4.2%：參照第3、4圖)。
實施例8：親和性複合體(T3-抗T3抗體複合體)抗體之特異性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價特異性。
‧於測定盤分別將2μg/mL之2種抗T3抗體(T3-92，T3-31)、抗AFP抗體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將T3、T2、T4調製為100ng/mL，分別各添加50μL，並培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各選殖株各添加50μL並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表7所示。選殖株6-19、5-3、5-6、5-13及5-22特異性結合於抗原[T3抗T3抗體(T3-92)複合體](參照*)。選殖株5-33與T2抗T3抗體(T3-92)複合體則為弱的交叉反應。由於使用選殖株5-33做為檢測抗體的情形，確認了與T2之交叉反應性，暗示固相抗體T3-92對於T2亦有弱的交叉反應。另一方面，選殖株5-32不僅與抗原[T3抗T3抗體(T3-92)複合體]結合，亦與單獨僅T3-92抗體相結合。由於5-32不與T3-31抗體，故為對T3-92抗體特異結合的選殖株。又，選殖株6-19、5-3、5-6、5-13及5-22係分別對應於實施例7之選殖株23、91、94、101及110，選殖株5-33係對應於實施例7之選殖株121，選殖株5-32係對應於實施例7之選殖株120。
實施例9：針對T3之目的抗體的特異性評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價目的抗體對T3之特異性。
‧於測定盤將5μg/mL之T3-RSA接合體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各選殖株各添加50μL，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，進行2次反應。
‧於1次反應使用小鼠抗體的情形，添加抗小鼠Ig-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表8所示。於將T3(T3-BSA)單獨予以固相化的ELISA，未發現顯示陽性的選殖株。因此，選殖株6-19、5-3、5-6、5-13、5-22及5-33被認為不會產生可對T3結合的抗體。
實施例10：對類似物質的交叉反應性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價抗體對類似物質之交叉反應性。
‧於測定盤將2μg/mL之抗T3抗體(T3-92)予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將T3、T2、T4調製為各濃度，分別各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各選殖株各添加50μL並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表9所示。表9中，交叉反應性(%)係在計算出本發明抗體對於目的之親和性複合體之結合率為100%的情形下，根據本發明抗體對於構成親和性複合體的各因子或其類似因子的結合率而算出。5種抗體(選殖株5-3、5-6、5-13、6-19及5-22)幾乎未與T2、T4結合。使用選 殖株5-33做為檢測抗體的情形，與T2為弱的交叉反應。此結果顯示固相抗體T3-92亦與T2交叉反應，而5種抗體(選殖株5-3、5-6、5-13、6-19及5-22)辨識類親和性複合體與親和性複合體。
根據以上，5種抗體(選殖株5-3、5-6、5-13、5-22及6-19)顯示可特異性結合於抗原抗體複合體[包含T3-抗T3抗體(T3-92)的複合體]。因此，證實藉由本發明，得以開發可特異性結合於親和性複合體的抗體。又，證實藉由三明治法可測定低分子物質。
實施例11：對T3之敏感度評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價對T3之敏感度。
‧於測定盤將2μg/mL之抗T3抗體(T3-92)予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將T3調整為各濃度，各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-HRP，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表10、第5圖所示。藉由使用所製作的抗體(選殖株5-3-1)的三明治法，可檢測1pg/mL以下之T3。又，選殖株5-3-1係對應實施例7之選殖株5-3。
實施例12：針對親和性複合體(25OH維生素D3-抗25OH維生素D抗體複合體)之抗體的取得
利用活體外雞IgM取得技術(ADLib系統)，藉由進行以下方法，取得針對25OH維生素D3-抗25OH維生素D抗體複合體的抗體。又，下文中，關於25OH維生素D3，1μg/Ml相當於2.5μM，關於抗25OH維生素D抗體，1μg/mL相當於6.7nM。
(1)雞B細胞株DT40庫之多樣化
經多樣化的DT40細胞係依據實施例1(1)之順序調製。
(2)DT40庫之繼代
DT40細胞之繼代係依據實施例1(2)之順序來進行。
(3)抗原結合粒子之調製
依以下順序，調製抗原結合粒子。
‧於固定有Protein G的磁性粒子中添加300μg/mL之抗25OH維生素D抗體。
‧4℃，使反應1h將抗體予以固相化。
‧以0.1% BSA/PBS洗淨粒子4次。
‧以含300μg/mL之25OH維生素D3的PBS將粒子予以分散。
‧4℃，使反應1h而形成抗原抗體複合體。
‧以0.1% BSA/PBS洗淨粒子4次。
(4)產生目的抗體之細胞之培養
依以下順序，培養產生目的抗體的細胞。
‧於2個15cm培養皿中分別添加CS+培養基50mL。
‧添加1.5X107個細胞並培養1日。
‧將細胞懸浮液回收於50mL試管，於4℃，1000rpm，離心10分鐘。
‧去除上清液後，以1% BSA/PBS洗淨2次並回收於1.5mL試管。
‧4℃，3500rpm，離心5分鐘以去除上清液。
‧以1% BSA/PBS將於(3)所調製的抗原結合粒子洗淨4次。
‧將細胞與抗原結合粒子混合，於4℃使反應30分鐘。
‧以1% BSA/PBS洗淨5次，去除剩餘細胞。
‧以CS-培養基將細胞‧粒子予以分散。
‧接種於96孔盤，並培養1週。
(5)產生目的抗體的細胞之篩選
篩選係藉由抗原抗體複合體固相ELISA來實施。藉由添加25OH維生素D3的情形與未添加的情形之呈色的差異，評價細胞是否產生目的抗體。順序如以下所示。
‧於測定盤中添加1μg/mL之抗25OH維生素D抗體並予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加50μL之1μg/mL 25OH維生素D3或僅添加緩衝液50μL，使25OH維生素D3與固相抗體結合。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加DT40培養上清液50μL，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-生物素，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加StreptAvidin-HRP，進行3次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(6)結果
成功以高產率獲得於25OH維生素D3未存在下、存在下(1μg/mL)，反應性有顯著差異的選殖株(Well No.4、52、80、81、94、120)(6選殖株/174=3.4%：參照第6、7圖)。
實施例13：親和性複合體(25OH維生素D3-抗25OH維生素D抗體複合體)抗體之特異性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價特異性。
‧於測定盤分別將1μg/mL之抗25OH維生素D抗體、抗T3抗體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧分別將25OH維生素D3、以及其類似物質的25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D3、1,25(OH)2維生素D2、維生素D3、維生素D2調製為200ng/mL，各添加50μL並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各添加各選殖株50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-生物素，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加StreptAvidin-HRP，進行3次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表11所示。選殖株3-2D1-12及3-2D1-22，特異性結合於做為抗原之25OH維生素D3-抗25OH維生素D抗體複合體及25OH維生素D2-抗25OH維生素D抗體複合體(參照*)。選殖株3-2D1-12及3-2D1-22未結合於用以做為陰性對照的抗T3抗體。又，選殖株3-2D1-12及3-2D1-22係對應實施例12所獲得的選殖株4之次選殖株。
實施例14：目的抗體對25OH維生素D3之特異性之評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價目的抗體對25OH維生素D3之特異性。
‧於測定盤將1μg/mL之25OH維生素D3-BSA接合體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將以上述手段所確立的抗體各添加各選殖株50μL，進行1次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-生物素，進行2次反應。
‧於1次反應使用抗25OH維生素D抗體的情形，添加抗IgG-HRP，進行2次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加StreptAvidin-HRP，進行3次反應。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表12所示。選殖株3-2D1-12及3-2D1-12於25OH維生素D3-BSA固相ELISA中未反應。此顯示此等選殖株並未與單獨25OH維生素D3結合。
參考例1：抗25OH維生素D抗體之交叉反應性的確認 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價抗25OH維生素D抗體對類似物質之交叉反應性。
‧於測定盤將1μg/mL之抗25OH維生素D抗體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將200ng/ml之鹼性磷酸酶標識-25OH維生素D3與25OH維生素D3、25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D3、1,25(OH)2維生素D2、維生素D3或維生素D2調製為各濃度並予以混合，分別各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧以MilliQ水洗淨2次。
‧添加PNPP，進行呈色反應。
‧添加2.5mM EDTA，停止呈色反應。
‧測定OD405。
(2)結果
結果如表13所示。表13中，交叉反應性(%)係在計算出抗25OH維生素D抗體對於25OH維生素D3的結合率為100%的情形下，根據抗25OH維生素D抗體對於25OH維生素D3類似因子的結合率而算出。抗25OH維生素D抗體係與25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D3、及1,25(OH)2維生素D2顯示高交叉反應性，但與維生素D3及維生素D2未顯示實質的交叉反應性。
實施例15：目的抗體對類似物質之交叉反應性的評價 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價目的抗體對類似物質的交叉反應性。
‧於測定盤將1μg/mL之抗25OH維生素D抗體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將25OH維生素D3、25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D3或1,25(OH)2維生素D2調製為各濃度，分別各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧分別各添加50μL之選殖株3-2D1-12，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-生物素，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加StreptAvidin-HRP，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表14所示。表14中，交叉反應性(%)係在計算出本發明抗體對於目的之親和性複合體(25OH維生素D3-抗25OH維生素D抗體複合體)的結合率為100%的情形 下，根據本發明抗體對於構成親和性複合體的各因子或其類似因子的結合率而算出。僅使用單獨之抗25OH維生素D抗體的競爭性抑制測定中，無法辨識25OH維生素D3、25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D2、及1,25(OH)2維生素D3，但藉由使用本發明抗體的三明治分析，可辨識並測定25OH維生素D3及25OH維生素D2。
實施例16：使用目的抗體的測定中對於25OH維生素D3的敏感度 (1)方法
依以下順序進行ELISA，評價使用目的抗體的測定中對於25OH維生素D3的敏感度。
‧於測定盤將1μg/mL之抗25OH維生素D抗體予以固相化。
‧以PBST洗淨3次。
‧以1% BSA/PBS阻斷。
‧以PBST洗淨3次。
‧將25OH維生素D3調製為各濃度，各添加50μL，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧各添加50μL之選殖株3-2D1-12，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加抗雞IgM-生物素，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加StreptAvidin-HRP，並予以培養。
‧以PBST洗淨3次。
‧添加TMB，進行呈色反應。
‧添加1N硫酸，停止呈色反應。
‧測定OD450。
(2)結果
結果如表15、第8圖所示。藉由使用所確立的抗體、選殖株3-2D1-12，可檢測3ng/ml以下之25OH維生素D3。
實施例17：本發明抗體對E2及抗E2抗體之複合體的特異性 (17-1)藉由競爭法之固相抗體(1次抗體)之特異性的評價
為了評價本發明抗體之特異性，首光，評價一次抗體對E2的特異性。
(A)方法 (i)1次抗體之固相化
依以下順序，將抗E2抗體(E18-3)予以固相化。
‧於NUNC Polysorp添加抗E2抗體(0.5μg/ml)，並培養一晚。
‧將固定有抗E2抗體的免疫盤以5%脫脂牛乳阻斷(37C，1hr)。
(ii)ELISA
依以下順序，進行ELISA。又，E2-3硫酸酯為E2之第3位的羥基中的氫原子經硫酸基取代的化合物。
‧調製抗原：E2(自6ng/ml作3n倍稀釋)與類似抗原：E1、E3、E2-3硫酸酯(自54ng/ml作3n倍稀釋)。
‧調製標識抗原：E2-3位ALP(鹼性磷酸酶)融合體(46ng/ml)。
‧於固相免疫盤添加抗原或類似抗原(各50μl)與標識抗原(50μl)。
‧固相免疫盤於37℃培養1h。
‧固相免疫盤以PBS-tween20(0.05%)洗淨3次。
‧以pNPP使呈色，測定吸光度。
‧將未添加抗原或類似抗原做為100%，算出添加各濃度之抗原或類似抗原之際的抑制率(反應%)。
(B)結果
雖未確認本測定法所使用的1次抗體對E1及E3有交叉反應性(第9圖)，但確認E2-3硫酸酯有10%左右之交叉反應性(第9圖)。因此，顯示此一次抗體對E2的特異性未必為高。
(17-2)藉由三明治法之測定的特異性之改善(1)
評價藉由使用本發明之抗體，能否改善相對於活體 內類似物質之E2的特異性測定。
(A)方法 (i)1次抗體之固相化
依以下順序，將抗E2抗體[與上述(17-1)所使用者相同]予以固相化。
‧於NUNC Polysorp添加抗E2抗體(2.5μg/ml)，並培養一晚。
‧固定有抗E2抗體的免疫盤以5%脫脂牛乳阻斷(37C，1hr)。
(ii)ELISA
依以下順序，進行ELISA。
‧調製抗原：E2(自2ng/ml作3n倍稀釋)與類似抗原：E1、E3；E2-3s(自54ng/ml作3n倍稀釋)。
‧於固相免疫盤添加抗原、類似抗原(各50μl)與2次抗體(來自雞之E2抗E2抗體複合體抗體(選殖株2-1)：50μl)。
‧將固相免疫盤於37℃培養1h。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧於固相免疫盤添加抗雞(anti Chicken)IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧以TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)使呈色，測定吸光度。
(B)結果
本發明之抗體可判別「E2及1次抗體之複合體」與「E2-3硫酸酯及1次抗體之複合體」(第10圖)。即，本發明 之抗體被認為係特異性地辨識E2+1次抗體之複合體中有無E2-3位的硫酸酯基。因此，顯示藉由使用本發明之抗體，相對於活體內類似物質之E2的特異性測定有所改善。
(17-3)藉由三明治法之測定的特異性的改善(2)
使用藉由使用本發明之抗體，能否改善相對於治療用藥物之E2的特異性測定。
(A)方法 (i)1次抗體之固相化
依以下順序，將抗E2抗體[與上述(17-1)所使用者相同]予以固相化。
‧於NUNC Polysorp添加抗E2抗體(2.5μg/ml)，並培養一晚。
‧將固定有抗E2抗體的免疫盤以5%脫脂牛乳阻斷(37C，1hr)。
(ii)ELISA
‧調製抗原：E2(自2ng/ml作3n倍稀釋)與類E2治療用藥物(100ng/ml)。就類E2治療用藥物而言，使用乙烯鹽酸氮芥及雌莫司汀。
‧於固相免疫盤添加抗原、類似抗原(各50μl)及2次抗體(來自雞之E2抗E2抗體複合體抗體(選殖株2-1)：50μl)。
‧固相免疫盤於37℃培養1h。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧於固相免疫盤添加抗雞(anti Chicken)IgM-HRP，進行2次反應。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧以TMB使呈色，測定吸光度。
‧根據E2測定時之吸光度，計算對類似藥物之交叉反應性(%)。
(B)結果
本發明之抗體可判別「E2及1次抗體之複合體」及「E2類似治療用藥物及1次抗體之複合體」(表16)。因此，顯示藉由使用本發明之抗體，能改善相對於E2類似治療用藥物之E2的特異性測定。
實施例18：本發明抗體對25(OH)維生素D2或D3及抗此等之抗體之複合體之特異性 (18-1)藉由競爭法之固相抗體(1次抗體)之特異性之評價
為了評價本發明抗體之特異性，首先，評價一次抗體對25(OH)維生素D2之特異性。
(A)方法 (i)1次抗體之固相化
依以下順序，將抗25OH維生素D抗體予以固相化。‧於NUNC Maxisorp中添加抗25OH維生素D抗體(1μg/ml)，並於37℃培養1hr。
‧以1% BSA-PBS將固定有抗25OH維生素D抗體的免疫盤予以阻斷(37C，1hr)。
(ii)ELISA
‧調製抗原：25OH維生素D3(自111ng/ml作3n倍稀釋)與類似抗原：25OH維生素D2、1,25(OH)2維生素D3、1,25(OH)2維生素D2(自111ng/ml作3n倍稀釋)。
‧調製標識抗原：25OH維生素D3-3位ALP融合體(20ng/ml)。
‧於固相免疫盤添加抗原、類似抗原(各50μl)及標識抗原(50μl)。
‧37℃，1hr培養
‧以PBS-tWeen20(0.05%)洗淨3次
‧以pNPP使呈色，測定吸光度。
‧將未添加抗原或類似抗原做為100%，算出添加各濃度之抗原或類似抗原之際之抑制率(反應%)。
(B)結果
本測定法所使用的1次抗體對25(OH)維生素D2、25(OH)維生素D3、1,25(OH)2維生素D2、及1,25(OH)2維生素D3顯示相同程度的反應性(第11圖)。因此，顯示此一次抗體對特定之維生素D的特異性低。
(18-2)藉由三明治法測定之特異性之改善
使用本發明之抗體，評價能否改善相對於活體內類似物質的特定維生素D之特異性測定。
(A)方法 (i)1次抗體之固相化
依以下順序，將抗25OH維生素D抗體[與上述(18-1)使用者相同]予以固相化。
‧於NUNC Maxisorp中添加抗25OH維生素D抗體(1μg/ml)，並於37℃培養1hr。
‧以1%BSA-PBS將固定有抗25OH維生素D抗體的免疫盤予以阻斷(37C，1hr)。
(ii)ELISA
‧調製抗原：25OH維生素D3(自370ng/ml作5n稀釋)及類似抗原：25(OH)維生素D2(自370ng/ml作5n稀釋)、1,25(OH)2維生素D3、1,25(OH)2維生素D2(自37000ng/ml作5n稀釋)。
‧於固相免疫盤添加抗原、類似抗原(各50μl)。
‧以PBS-tween20(0.05%)洗淨3次。
‧於固相免疫盤添加二次抗體(來自雞之25(OH)維生素D抗25(OH)維生素D複合體抗體：50μl)。
‧固相免疫盤以37℃培養1hr。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧於固相免疫盤添加抗雞IgG抗體-鏈黴親和素(50μl)。
‧固相免疫盤於37℃培養1hr。
‧以PBS-tween20(0.05%)將固相免疫盤洗淨3次。
‧於固相免疫盤添加鏈黴親和素-HRP(西洋辣根過氧化物酶)(50μl)。
‧固相免疫盤於37℃培養1hr。
‧以TMB使呈色，測定吸光度。
(B)結果
本發明之抗體可判別「25OH維生素D2或D3及1次抗體之複合體」與「1,25(OH)2維生素D2或D3與1次抗體之 複合體」(第12圖)。即，本發明之抗體被認為特異性辨識1,25(OH)2維生素D2或D3及1次抗體之複合體中的1,25(OH)2維生素D2或D3有無1位的OH基。因此，顯示藉由使用本發明之抗體，相對於活體內類似物質的1,25(OH)2維生素D2及D3之特異性的測定有所改善。
第1圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖株(No.1~43)的圖。2種細胞選殖株產生對抗原抗體複合體(包含雌激素(estrogen)及抗雌激素抗體的親和性複合體)可特異性結合的抗體。
第2圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖株(No.44~88)的圖。1種細胞選殖株產生對抗原抗體複合體(包含雌激素及抗雌激素抗體的親和性複合體)可特異性結合的抗體。
第3圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖株(No.1~56)的圖。1種細胞選殖株產生對抗原抗體複合體(包含T3及抗T3抗體的親和性複合體)可特異性結合的抗體。
第4圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖株(No.57~144)的圖。5種細胞選殖株產生對抗原抗體複合體(包含T3及抗T3抗體的親和性複合體)可特異性結合的抗體。
第5圖係顯示對使用本發明之抗體的測定中的T3的敏感度的圖。
第6圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖 株(No.1~86)的圖。4種細胞選殖株對抗原抗體複合體(包含25OH維生素D3及抗25OH維生素D抗體的親和性複合體)產生可特異性結合的抗體。
第7圖係顯示藉由本發明之方法所獲得的細胞選殖株(No.87~174)的圖。2種細胞選殖株產生對抗原抗體複合體(包含25OH維生素D3及抗25OH維生素D抗體的親和性複合體)可特異性結合的抗體。
第8圖係顯示對使用本發明之抗體的測定中的25OH維生素D3的敏感度的圖。
第9圖係顯示藉由競爭系統之固相抗體(一次抗體：抗E2抗體)的特異性評價的圖。
第10圖係顯示藉由三明治法之E2測定中的特異性改善的圖。
第11圖係顯示藉由競爭系統之固相抗體(一次抗體：抗25(OH)維生素D2抗體)的特異性評價的圖。
第12圖係顯示藉由三明治法之抗25(OH)維生素D2及D3測定中的特異性改善的圖。
<110> FUJIREBIO INC.
<120> 抗親和性複合體之抗體
<130> PRBA-24235
<150> JP 2011-206162
<151> 2011-09-21
<150> JP 2012-006359
<151> 2012-01-16
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子A
<400> 1
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子B
<400> 2
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子C
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子D
<400> 4
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子E
<400> 5
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子F
<400> 6
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子G
<400> 7
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子H
<400> 8
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子I
<400> 9
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子J
<400> 10
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子K
<400> 11
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子L
<400> 12

Claims (16)

  1. 一種抗體，其可特異性結合於親和性複合體。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中前述抗體為全長抗體。
  3. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中前述抗體具有來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗體，其中來自具基因變換能力的動物之免疫球蛋白的區域為互補決定區域、框架區域(framework region)、或可變區域。
  5. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中構成親和性複合體的至少1個之因子為低分子物質。
  6. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中構成親和性複合體的至少1個之因子為蛋白質。
  7. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中親和性複合體為包含低分子物質及抗此等之抗體的複合體。
  8. 如申請專利範圍第7項之抗體，其中低分子物質為(a)類固醇化合物、(b)胺基酸化合物、或(c)維生素。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體，其為以下(a)~(c)之任一者：(a)類固醇化合物為雌激素；(b)胺基酸化合物為甲狀腺荷爾蒙；或(c)維生素為維生素D。
  10. 如申請專利範圍第9項之抗體，其為以下(a)~(c)之任一者：(a)雌激素為雌二醇； (b)甲狀腺荷爾蒙為三碘甲狀腺素；或(c)維生素D為25OH維生素D3或25OH維生素D2。
  11. 如申請專利範圍第10項之抗體，其顯示以下(a)~(c)之結合率：(a)對於包含雌二醇及抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I)，對親和性複合體I可特異性結合的抗體(抗體I)之結合率算出為100%的情形，抗體I對於包含雌甾酮(estrone)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I’)、包含雌三醇(estriol)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I”)、包含雌二醇共軛物及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''')、包含雌莫司汀(estramustine)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I'''')、或包含乙烯鹽酸氮芥(estromustine)及該抗雌二醇抗體的親和性複合體(親和性複合體I''''')的結合率為10%以下；(b)對於包含三碘甲狀腺素及抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II)，對親和性複合體II可特異性結合的抗體(抗體II)之結合率算出為100%的情形，抗體II對於包含二碘酪胺酸及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II’)、或包含甲狀腺素及該抗三碘甲狀腺素抗體的親和性複合體(親和性複合體II”)的結合率為10%以下；或(c)對於包含25OH維生素D3及抗25OH維生素D3抗體的親和性複合體(親和性複合體III-1)或包含25OH維生素D2及抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和 性複合體III-2)，對親和性複合體III-1或III-2可特異性結合的抗體(抗體III)之結合率算出為100%的情形，抗體III對於包含1,25(OH)2維生素D3及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III’)、或包含1,25(OH)2維生素D2及該抗25OH維生素D3抗體或該抗25OH維生素D2抗體的親和性複合體(親和性複合體III”)的結合率為10%以下。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項之抗體，其係藉由包含下列之方法所製作，培養具有產生可特異性結合於親和性複合體的抗體的能力的抗體產生細胞，而獲得可特異性結合於親和性複合體的抗體。
  13. 一種套組，其包含以下：(i)可特異性結合於親和性複合體的抗體；及(ii)構成親和性複合體的至少1個之因子。
  14. 如申請專利範圍第13項之套組，其為以下：(i’)可特異性結合於包含低分子物質或蛋白質、及抗其之抗體的親和性複合體的抗體；以及(ii’)可特異性結合於低分子物質或蛋白質的抗體。
  15. 一種親和性複合體之測定方法，其包含使用可特異性結合於親和性複合體的抗體來測定親和性複合體。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中親和性複合體係藉由三明治法測定。
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