TW201536801A - 改質單體ＩｇＭ - Google Patents

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Fujirebio Kk
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Abstract

本發明係提供一種蛋白質改質IgM，其係克服了多聚體抗體IgM特有之問題。具體而言，本發明係提供一種改質單體IgM、及表現如此之改質單體IgM的轉形細胞(例如，哺乳動物細胞)等，其中改質單體IgM係含有IgM輕鏈、及改質IgM重鏈，而改質IgM重鏈含有：A)由可變區及C末端缺失恆定區(例如，具有CH1‧CH2鄰接區中、CH2‧CH3鄰接區中、或CH3上游區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區)所構成的重鏈區；及B)融合於重鏈區的蛋白質。

Description

改質單體IgM
本發明係關於改質單體IgM、轉形細胞、及標的物質之測定方法。
已知藉由使抗體與指定蛋白質結合(conjugate)，而可製作被賦予了蛋白質之機能的抗體。例如，藉由使抗體與酵素結合，而製作酵素免疫測定用之標識抗體的方法係正被一般性地進行。已知於結合體之製作所利用的抗體係越是具有單純構造者越佳，而使將IgG1以胃蛋白酶(pepsin)消化並還原而獲得的F(ab’)片段，透過其游離半胱胺酸殘基與酵素結合的方法係正被廣泛使用著。
又，為了製作被賦予了蛋白質之機能的抗體，亦正嘗試以使抗體與蛋白質融合來替代抗體與蛋白質之結合(專利文獻1~3)。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1 特開2010-17113號公報
專利文獻2 特開平8-70875號公報
專利文獻3 特開平10-323187號公報
[發明概要]
多聚體IgM(作為五聚體或六聚體而存在)係容易凝集等為不安定的。又，作為免疫測定用之抗體而使用的情形，容易與血清等之檢體中之物質發生非特異反應，而成為偽陽性的原因。因此，一般而言不喜好使用多聚體IgM來作為應該藉由蛋白質而被改質的抗體。
又，多聚體IgM之分子量大(五聚體的情形，約90萬)，藉由化學性手法來將IgM以蛋白質標識的情形，可被標識的部位係多數存在。其結果，就獲得的蛋白質標識多聚體IgM(結合物)而言，係會獲得藉由蛋白質的多聚體IgM之標識部位或標識數為多樣且不均一者。因此，而有所謂結合物之批次間差異的減少係困難的問題。
再者，雖亦可藉由胃蛋白酶消化而調製IgM之F(ab’)片段，但用以調製如此之片段的反應之控制係困難，且效率差。
又，使用動物細胞作為宿主而製作的重組IgM係於多聚體形成上經常有問題。因此，若可迴避會產生如此之問題的多聚體形成，則係有益。
據上所述，本發明之目的係提供克服了為多聚體抗體的IgM所特有之問題的蛋白質改質IgM。
本發明者們專心檢討的結果，發現了：使蛋白質於指定之改質恆定區融合的改質IgM，儘管其原本 是作為多聚體而作用的抗體，但是卻作為單體而發揮抗體的機能，而且還良好地維持所融合之蛋白質的機能，遂而完成本發明。
即，本發明係如以下所述。
[1]一種改質單體IgM，其包含IgM輕鏈、及改質IgM重鏈，其中改質IgM重鏈係包含：A)由可變區及C末端缺失恆定區所構成的重鏈區、及B)融合於重鏈區的蛋白質。
[2]如[1]之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH1‧CH2鄰接區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
[3]如[1]之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH2‧CH3鄰接區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
[4]如[1]之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH3上游區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
[5]如[1]~[4]中任一項之改質單體IgM，其中蛋白質為酵素。
[6]如[1]~[5]中任一項之改質單體IgM，其中IgM輕鏈、及改質IgM之重鏈區係來自鳥類。
[7]如[6]之改質單體IgM，其中鳥類為雞。
[8]一種轉形細胞，其表現如[1]~[7]中任一項之改質單體IgM。
[9]如[8]之細胞，其中前述細胞為哺乳動物細胞。
[10]一種標的物質之測定方法，其包含使用如[1]~[7]中任一項之改質單體IgM，而測定樣品中的標的物質。
本發明之抗體係於培養上清液中被良好地分泌，又，可保持對抗原的結合能力。本發明之抗體因藉由自培養上清液之純化而可容易地調製，故有用於製造製程之大幅簡化。
第1圖係顯示具有使相異長度之C末端區缺失的IgM(抗體1)重鏈與ALP之融合蛋白質(改質IgM重鏈)的各種改質抗體之西方印漬術的圖。縮寫係如以下所示(Conj：結合物；ALP：鹼性磷酸酶；S：培養上清液；M：膜區分；以下相同)。
第2圖係顯示具有使相異長度之C末端區缺失的IgM(抗體2)重鏈與ALP之融合蛋白質(改質IgM重鏈)的各種改質抗體之西方印漬術的圖。
第3圖係顯示改質IgM重鏈之與IgM輕鏈的組合的圖。PC：陽性對照組；NC：陰性對照組；BSA：牛血清白蛋白。陽性對照組用之結合物係藉由使CHO細胞所產生的來自雞的五聚體IgM(辨識25OH VD3與抗25OH VD3抗體之親和性複合體的抗體)與ALP結合而製作。PC、NC、BSA、陽性對照組用之結合物在以下係同樣。
第4圖係顯示具有改質IgM重鏈的改質抗體(衍生自抗體2)所致之25OH VD3與抗25OH VD3抗體的親和性複合體(間接地為25OH VD3)之測定的圖。使用pNPP作為ALP之基質。pNPP係藉由酵素反應，而變換為吸收405nm波長的對硝基酚。本試驗係測定於405nm之吸光度。
第5圖係顯示具有改質IgM重鏈的各種改質抗體(衍生自抗體2)之西方印漬術的圖。
第6圖係顯示具有改質IgM重鏈的各種改質抗體(衍生自抗體2)所致之25OH VD3與抗25OH VD3抗體的親和性複合體(間接地為25OH VD3)之測定的圖。係使用AMPPD作為ALP之基質。AMPPD係藉由酵素反應被分解而產生發光。本試驗係測定其發光計數值。
第7圖係顯示具有改質IgM重鏈的改質抗體(衍生自抗體3及4)所致之人類IgG之測定的圖。係使用AMPPD作為ALP之基質。
[用以實施發明之形態]
本發明提供改質單體IgM。以下，因應必要而將本發明之改質單體IgM簡稱為本發明之抗體。
本發明之抗體來自IgM而獲得。就IgM而言，可利用來自具有產生IgM之能力的任意動物。就此種動物而言，可列舉例如鳥類(例如，雞、鵪鶉、駝鳥)、哺乳動物(例如，人類、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、牛、馬、綿羊、驢、豬)。
本發明之抗體包含IgM輕鏈。IgM輕鏈係由 可變區(VL)及恆定區(CL)所構成。就輕鏈而言，可列舉例如λ鏈及κ鏈。
本發明之抗體還包含改質IgM重鏈。通常之 IgM重鏈係由可變區(VH)、及恆定區(CH)所構成。IgM重鏈之CH係由4個功能域(CH1、CH2、CH3、及CH4)所構成。IgM抗體之重鏈中的恆定區中之功能域(CH1、CH2、CH3、及CH4)之歸屬可依據所屬領域之技術常識，而基於重鏈之胺基酸序列來決定。
已知IgM之恆定區係於特定之動物種中被保 存。即，特定之動物種產生之對某抗原的IgM之恆定區係可能與該動物種產生之對其他抗原的IgM之恆定區相同。此係由於IgM並無亞型存在，僅有1種，而編碼IgM之恆定區的μ基因係於特定之動物種為相同。例如，來自雞的IgM之恆定區之胺基酸序列係以1)X01613.1、2)CAA25762.1、及3)P01875.2之GenBank存取號或Swiss-prot存取號被揭示，但恆定區之胺基酸序列係於此等之IgM間為一致的。將經由此等存取號所揭示的恆定區等之胺基酸序列顯示作為序列識別號1。於序列識別號1之胺基酸序列，CH1(Cμ1功能域)係對應於包含第1~105位之胺基酸殘基的胺基酸序列，CH2(Cμ2功能域)係對應於包含第106~209位之胺基酸殘基的胺基酸序列，CH3(Cμ3功能域)係對應於包含第210~316位之胺基酸殘基的胺基酸序列，CH4(Cμ4功能域)係對應於包含第317~427位之胺基酸殘基的胺基酸序列。又，於序列識 別號1之胺基酸序列中，包含第428~446位之胺基酸殘基的胺基酸序列被稱為C末端區。
但是，藉由伴隨動物之系統或個體差異的μ 基因變異、以及基因再構成後之階段，例如IgM抗體產生細胞之發生階段可能產生的μ基因之變異等，而於IgM抗體之恆定區之胺基酸序列會有些微的胺基酸殘基之變異發生。因此，也有可能是以下的情形：特定之動物種所產生之對某抗原的IgM之恆定區會與該動物種所產生之對其他抗原的IgM之恆定區並不完全相同，而為「實質上相同」。本發明中，關於IgM之恆定區全體，表現「實質上相同」係意圖為包含經由如上述的變異所產生之1或數個胺基酸殘基之變異的恆定區之胺基酸序列。 在此，關於IgM之恆定區全體，用語「1或數個胺基酸殘基」係意指1~40個，較佳為1~30個，更佳為1~20個，又更佳為1~10個，特佳為1~5個胺基酸殘基。就變異而言，可列舉例如取代、插入、缺失及添加。
胺基酸殘基之變異為取代之情形，胺基酸殘 基之取代亦可為保存性的取代。用語「保存性的取代」係指將指定之胺基酸殘基，以具有類似側鏈之胺基酸殘基來取代。具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族係於本項領域為周知。例如，就如此的家族而言，可列舉具有鹼性側鏈的胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈的胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有非帶電性極性側鏈的胺基酸(例如，天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性 側鏈的胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β位分支側鏈的胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)、具有芳香族側鏈的胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)、具有含羥基(例如，醇性、酚性)的側鏈的胺基酸(例如，絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)、及具有含有硫的側鏈的胺基酸(例如，半胱胺酸、甲硫胺酸)。較佳之胺基酸之保存性的取代係可為天冬胺酸與麩胺酸之間的取代、精胺酸與離胺酸與組胺酸之間的取代、色胺酸與苯丙胺酸之間的取代、苯丙胺酸與纈胺酸之間的取代、白胺酸與異白胺酸與丙胺酸之間的取代、及甘胺酸與丙胺酸之間的取代。
於一實施形態，IgM係來自雞的情形，IgM之恆定區係可為以下所述。
a)包含對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~427位之胺基酸殘基的胺基酸序列的多胜肽；或b)包含在對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~427位之胺基酸殘基的胺基酸序列中，含有1或數個之胺基酸殘基之變異的胺基酸序列的多胜肽。
於其他實施形態，IgM來自雞的情形，IgM之恆定區可為包含相對於序列識別號1之胺基酸序列而具有90%以上之相同性的胺基酸序列的多胜肽。胺基酸序列之百分比相同性係較佳可為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上。於本發明，用語「相同性」係 意指於NEEDLE程式(J Mol Biol 1970；48：443-453)檢索中，使用內定設定的參數所獲得的值(Identity)。如此的參數係間隔處罰(Gap penalty)=10、延長處罰(Extend penalty)=0.5、矩陣(Matrix)=EBLOSUM62。
改質IgM重鏈係包含以下A)B)：a)由可變區及C末端缺失恆定區所構成的重鏈區；以及b)融合於重鏈區的蛋白質。
於A)所列舉的重鏈區係由可變區及C末端缺失恆定區所構成。C末端缺失恆定區係以使單體IgM之形成成為可能的方式，其C末端區缺失的恆定區。C末端區之缺失係藉由使自C末端胺基酸殘基至其上游的某指定之胺基酸殘基為止的連續單位(位於C末端側的區)缺失而進行。單體IgM並非由天然IgM所形成的多聚體(5量體或6量體)，而為1價之單體(即，Fab樣之分子)或2價之單體(即，F(ab’)樣之分子)。參與藉由雙硫鍵之重鏈與輕鏈之交聯的半胱胺酸殘基(以下，有時稱為「CH1 Cys」)係可位於CH1中。參與藉由雙硫鍵之重鏈間之交聯的半胱胺酸殘基(以下，有時稱為「CH2 Cys」)係可位於CH2中。參與藉由雙硫鍵之單體IgM間之交聯(即，多聚體IgM之形成)的半胱胺酸殘基(以下，有時稱為「CH3 Cys」)係可位於CH3中。
因此，C末端缺失恆定區，由抗原結合部位之保持的觀點，其作為恆定區而至少含有由N末端胺基酸殘基至CH1 Cys為止之必須區域，又，由改質單體IgM 之形成的觀點，其至少缺失自CH3 Cys至C末端胺基酸殘基為止之區域。具有如此之C末端缺失恆定區的改質單體IgM係可具有抗體機能(例如，分泌能力及結合能力)及蛋白質機能(例如，酵素活性)兩者。C末端缺失恆定區其作為恆定區，係於必須區域以外，進一步含有自CH1 Cys至CH2 Cys為止之區域的情形，本發明之抗體可為2價之單體。另一方面，C末端缺失恆定區其作為恆定區，係於必須區域之外，未進一步含有自CH1 Cys至CH2 Cys為止之區域的情形，換言之，即缺失自CH2 Cys至C末端胺基酸殘基為止之區域的情形，本發明之抗體可為1價之單體。
具體而言，就本發明之抗體中的C末端缺失恆定區而言，可列舉例如以下：i)缺失自較CH1 Cys更位於C末端側的CH1中之指定胺基酸殘基至C末端胺基酸殘基為止的區域(即，由CH1之一部分所構成的區域)；ii)缺失自CH2至C末端胺基酸殘基為止的區域(即，由CH1之全體所構成的區域)；iii)缺失自CH2中之指定胺基酸殘基至C末端胺基酸殘基為止的區域(即，由CH1之全體及CH2之一部分所構成的區域)；iv)缺失自CH3至C末端胺基酸殘基為止的區域(即，由CH1之全體及CH2之全體所構成的區域)；及v)缺失自CH3 Cys至C末端胺基酸殘基為止的區域(即，由CH1之全體、CH2之全體及CH3之一部分所構成的區域)。
於特定之實施形態，C末端缺失恆定區係作 為C末端胺基酸殘基而具有CH1‧CH2鄰接區中、CH2‧CH3鄰接區中、或CH3上游區中之胺基酸殘基的恆定區。具有如此之C末端缺失恆定區的本發明之抗體，係可於抗體之機能(例如，分泌能力及結合能力)及蛋白質之機能(例如，酵素活性)兩者為特別優異。
於本發明，CH1‧CH2鄰接區係指，以CH1 ‧CH2之邊界(CH1-CH2)為基準，而假設CH1之C末端胺基酸殘基之位置為「-1」、CH2之N末端胺基酸殘基之位置為「+1」之時(此時，「0位」之胺基酸殘基並不存在，「-1位」及「+1位」之胺基酸殘基彼此藉由醯胺鍵而連結)，包含自CH1區中之「-4位」之胺基酸殘基連續至CH2區中之「+4位」之胺基酸殘基的連續8個之胺基酸殘基的區域。作為C末端胺基酸殘基而具有CH1‧CH2鄰接區中之胺基酸殘基的C末端缺失恆定區係可符合上述i)、ii)或iii)之區域。
CH1‧CH2鄰接區係較佳可為a)包含自CH1 區中之「-3位」之胺基酸殘基連續至CH2區中之「+3位」之胺基酸殘基的連續6個之胺基酸殘基的區域、b)包含自CH1區中之「-2位」之胺基酸殘基連續至CH2區中之「+2位」之胺基酸殘基的連續4個之胺基酸殘基的區域、或c)包含自CH1區中之「-1位」之胺基酸殘基連續至CH2區中之「+1位」之胺基酸殘基的連續2個之胺基酸殘基的區域。
C末端缺失恆定區係作為C末端胺基酸殘基 而具有CH1‧CH2鄰接區中之胺基酸殘基的恆定區之情形，C末端缺失恆定區可來自雞。此情形，C末端缺失恆定區可為以下所述。
a1)包含對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~X位之胺基酸殘基的胺基酸序列的多胜肽；或b1)包含在對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~X位之胺基酸殘基的胺基酸序列中，含有1或數個之胺基酸殘基之變異的胺基酸序列的多胜肽。
X係102以上109以下之任意之整數，較佳為103以上108以下之任意之整數，更佳為104以上107以下之任意之整數，又更佳為105或106。
又，C末端缺失恆定區，係可為包含相對於對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~X位之胺基酸殘基的胺基酸序列，而具有90%以上之相同性的胺基酸序列的多胜肽。X係如上述。胺基酸序列之百分比相同性係較佳可為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上。百分比相同性之決定係可如上述進行。
於本發明，CH2‧CH3鄰接區係指，以CH2‧CH3之邊界(CH2-CH3)為基準，假設CH2之C末端胺基酸殘基之位置為「-1」、CH3之N末端胺基酸殘基之位置為「+1」之時(此時，「0位」之胺基酸殘基並不存在，「-1位」及「+1位」之胺基酸殘基彼此藉由醯胺鍵結合)，包含自CH2區中之「-4位」之胺基酸殘基連 續至CH3區中之「+4位」之胺基酸殘基的連續8個之胺基酸殘基的區域。作為C末端胺基酸殘基而具有CH2‧CH3鄰接區中之胺基酸殘基的C末端缺失恆定區，係可符合上述iii)、iv)或v)之區域。
CH2‧CH3鄰接區係可較佳為a)包含自CH2 區中之「-3位」之胺基酸殘基連續至CH3區中之「+3位」之胺基酸殘基的連續6個之胺基酸殘基的區域、b)包含自CH2區中之「-2位」之胺基酸殘基連續至CH3區中之「+2位」之胺基酸殘基的連續4個之胺基酸殘基的區域、或c)包含自CH2區中之「-1位」之胺基酸殘基連續至CH3區中之「+1位」之胺基酸殘基的連續2個之胺基酸殘基的區域。
C末端缺失恆定區係作為C末端胺基酸殘基 而具有CH2‧CH3鄰接區中之胺基酸殘基的恆定區之情形，C末端缺失恆定區係可來自雞。此情形，C末端缺失恆定區可為以下所述。
a2)包含對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~Y位之胺基酸殘基的胺基酸序列的多胜肽；或b2)包含在對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~Y位之胺基酸殘基的胺基酸序列中，含有1或數個之胺基酸殘基之變異的胺基酸序列的多胜肽。
Y係206以上213以下之任意之整數，較佳為207以上212以下之任意之整數，更佳為208以上211以下之任意之整數，又更佳為209或210。
又，C末端缺失恆定區係可為包含相對於對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~Y位之胺基酸殘基的胺基酸序列，而具有90%以上之相同性的胺基酸序列的多胜肽。Y係如上述。胺基酸序列之百分比相同性係可較佳為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上。百分比相同性之決定可如上述進行。
於本發明，CH3上游區係指，假設CH3之N 末端胺基酸殘基之位置為「+1」之時，包含自CH3區中之「+1位」之胺基酸殘基連續至「+18位」之胺基酸殘基的連續18個之胺基酸殘基的區域。作為C末端胺基酸殘基而具有CH3上游區中之胺基酸殘基的C末端缺失恆定區係可符合上述v)之區域。
CH3上游區係較佳可為於CH3區中，包含 自「+1位」之胺基酸殘基連續至「+17位」、「+16位」、「+15位」、「+14位」、「+13位」、「+13位」、「+12位」、「+11位」、「+10位」、「+9位」、「+8位」、「+7位」、「+6位」、「+5位」、「+4位」、「+3位」、或「+2位」之胺基酸殘基的連續之胺基酸殘基所構成的區域。
C末端缺失恆定區係作為C末端胺基酸殘基 而具有CH3上游區中之胺基酸殘基的恆定區之情形，C末端缺失恆定區係可來自雞。此情形，C末端缺失恆定區可為以下所述。
a3)包含對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~Z位之胺基酸殘基的胺基酸序列的多胜肽；或b3)包含在對應序列識別號1之胺基酸序列中之第1~Z位之胺基酸殘基的胺基酸序列中，含有1或數個之胺基酸殘基之變異的胺基酸序列的多胜肽。
Z係210以上227以下之任意之整數。較佳地，Z可為226以下、225以下、224以下、223以下、222以下、221以下、220以下、219以下、218以下、217以下、216以下、215以下、214以下、213以下、212以下、或211以下。
於B)所列舉的蛋白質係被融合於重鏈區。融合係藉由將蛋白質之N末端胺基酸殘基，經由醯胺鍵而連結於重鏈區之C末端胺基酸殘基來進行。如此之融合蛋白質係可於編碼重鏈區的多核苷酸之下游，使讀框(reading frame)一致而連結編碼蛋白質的多核苷酸，接著，進行連結多核苷酸對表現載體的導入、及表現載體對細胞之導入，最後，於細胞中使融合蛋白質表現，藉此而調製。融合係可經由包含1或數個(例如，1~50個、1~30個、1~20個、1~10個、或1~5個)之胺基酸殘基的連結子來進行。
於本發明，蛋白質係對本發明之抗體賦予某些性質的胺基酸聚合物。就代表性的蛋白質而言，可列舉例如可具有可檢測之物性(例如，吸光度)的物質、或是可生成可產生可檢測之訊號(例如，發光、螢光)的物質的蛋白質(例如，酵素)、或可具有可檢測之物性或是 可生成可產生可檢測之訊號的蛋白質(例如，螢光蛋白質)。就如此蛋白質而言，可列舉例如可生成上述物質的酵素(例如，鹼性磷酸酶、過氧化酶、螢光素酶、β半乳糖苷酶)、可產生訊號的蛋白質(例如，綠色螢光蛋白質、紅色螢光蛋白質)。就蛋白質而言，可溶性蛋白質為較佳。蛋白質之分子量係可為例如，10kDa以上、20kDa以上、30kDa以上、40kDa以上、或50kDa以上。蛋白質之分子量還可為例如，200kDa以下、180kDa以下、或160kDa以下。
本發明之抗體係可辨識具有抗原性的任意抗 原者。就如此之抗原而言，可列舉例如低分子物質、蛋白質、多醣類、過敏原。
用語「低分子物質」係指分子量低於1,500的化合物。低分子物質係天然物質或合成物質。低分子物質之分子量可為低於1,200、低於1,000、低於800、低於700、低於600、低於500、低於400或低於300。低分子物質之分子量還可為50以上、100以上、150以上或200以上。就低分子物質而言，可列舉例如配位體、荷爾蒙、脂質、脂肪酸、維生素、類鴉片、神經傳導物質(例如，兒茶酚胺)、核苷、核苷酸、寡核苷酸、單糖、寡糖、胺基酸、及寡肽、或是醫藥、毒物、及代謝產物。就荷爾蒙而言，可列舉例如類固醇荷爾蒙、甲狀腺荷爾蒙、胜肽荷爾蒙。
就蛋白質而言，可列舉免疫球蛋白等之可溶性蛋白質、及膜蛋白質。就免疫球蛋白而言，可列舉例如IgG、 IgA、IgE、IgD、IgY。免疫球蛋白等之蛋白質係可利用來自如上述任意之動物(較佳為人類等之哺乳動物)者。
本發明之抗體係可為辨識親和性複合體者。 用語「親和性複合體」係指藉由2個以上之因子的組合或凝集(即，非共價鍵)所形成的複合體(例如，參照WO2013/042426)。構成親和性複合體的至少一個因子係較佳可為蛋白質。就如此之蛋白質而言，可列舉例如具有親和性結合之能力的蛋白質(例如，抗體)、具有凝集能力的蛋白質。構成親和性複合體之因子的蛋白質為抗體的情形，本發明之抗體係可作為例如二次抗體來使用。構成親和性複合體的至少一個因子還可為低分子物質。
於一實施形態，低分子物質可為維生素。就 維生素而言，可列舉例如維生素A、B1、B2、B6、B12、C、D、E、K。維生素較佳為脂溶性維生素(例如，維生素A、D、E、K)，更佳為如以下所示的維生素D。低分子物質還可為維生素之代謝產物。就維生素之代謝產物而言，可列舉例如於如上述維生素加成羥基的化合物、及結合物(conjugate)(例如，葡萄糖醛酸(glucuronic acid)結合物、硫酸結合物、麩胱甘肽(glutathione)結合物、乙醯基結合物、胺基酸結合物)。低分子物質進一步可為類似維生素之治療用藥物或其代謝產物。
於其他實施形態，低分子物質可為類固醇化 合物。類固醇化合物係指具有類固醇骨架(環戊烷多氫菲(cyclopentanoperhydrophenanthrene)骨架)的化合物。就類固醇化合物而言，可列舉類固醇荷爾蒙、及保持類固醇骨架之其衍生物(例如，蛋白質同化類固醇、抗男性荷爾蒙劑及抗濾泡荷爾蒙劑等之合成類固醇)。就類固醇荷爾蒙而言，可列舉例如男性荷爾蒙、濾泡荷爾蒙、黄體荷爾蒙、皮質素(例如，糖質皮質素、礦質皮質素)，但濾泡荷爾蒙為較佳。就濾泡荷爾蒙而言，可列舉例如雌甾酮(estrone)、雌二醇(estradiol)、雌三醇(estriol)。低分子物質還可為類固醇化合物之代謝產物。就類固醇化 合物之代謝產物而言，可列舉例如於如上述之類固醇化合物加成羥基的化合物、及結合物。就結合物而言，可列舉例如葡萄糖醛酸結合物、硫酸結合物(例如，雌二醇之第3位或第17位之任一個羥基、或第3位及17位之兩者之羥基與硫酸基結合的化合物)、麩胱甘肽結合物、乙醯基結合物、胺基酸結合物。低分子物質進一步可為類似類固醇化合物之治療用藥物(例如，雌莫司汀(estramustine))或其代謝產物(例如，雌脫司汀(estromustine))。
又於其他實施形態，低分子物質可為胺基酸化合物。胺基酸化合物係指具有胺基及羧基的化合物。就胺基酸化合物而言，可列舉例如α-胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸、離胺酸、烏胺酸、瓜胺酸(citrulline))、β-胺基酸(例如，β-丙胺酸)、γ-胺基酸(例如，γ-胺基丁酸)、以及保持胺基及羧基之彼等的衍生物。胺基酸化合物可為L體或D體。低分子物質還可為胺基酸化合物之代謝產物。就胺基酸化合物之代謝產物而言，可列舉例如於如上述之胺基酸化合物添加羥基的化合物、及如上述之結合物。低分子物質還可為類似胺基酸化合物之治療用藥物或其代謝產物。
較佳為胺基酸化合物可為自酪胺酸被生合成的酪胺酸衍生物。就酪胺酸衍生物而言，可列舉甲狀腺荷爾蒙 (例如，三碘甲狀腺素(triiodothyronine)、甲狀腺素(thyroxine))。酪胺酸衍生物還可為甲狀腺荷爾蒙之代謝產物。就甲狀腺荷爾蒙之代謝產物而言，可列舉例如於甲狀腺荷爾蒙添加羥基的化合物、及如上述之結合物。 低分子物質進一步可為類似甲狀腺荷爾蒙之治療用藥物或其代謝產物。
本發明之抗體能夠以溶解於溶液中的形態而 提供，但亦能夠以被固定於支持體的形態而提供。就支持體而言，可列舉例如粒子(例如，磁性粒子)、膜(例如，硝基纖維素膜)、玻璃、塑膠、金屬、平盤(例如，多孔平盤)、裝置。本發明之抗體還能夠以被浸漬於濾紙等之媒體的形態而提供。
本發明之抗體，係藉由調製表現本發明之抗 體的本發明之轉形細胞，並接著培養本發明之轉形細胞而可獲得。
就轉形細胞之宿主而言，例如只要是可表現 本發明之抗體則並未特別限定，可使用例如原核生物細胞(例如，大腸菌)、及真核生物細胞(例如，酵母等之單細胞、及來自多細胞生物之細胞)。較佳為宿主係可利用來自任意動物的細胞。就如此之動物而言，可列舉例如鳥類(例如，雞、鵪鶉、駝鳥))、哺乳動物(例如，人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、牛、馬、綿羊、驢、豬。更佳為宿主係可為用以商業生產高品質蛋白質(例如，抗體等之蛋白質醫藥)而被廣泛使用的細胞。就如此之細胞而言，可列舉例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及其亞株(例如，CHO-K1、DG44)、幼倉鼠腎臓(BHK)細胞及其亞株。
本發明之轉形細胞之調製，係可藉由將表現 IgM輕鏈及改質IgM重鏈的1或2個載體導入宿主而進行。具體而言，如此之調製係可藉由將IgM輕鏈之表現載體、及改質IgM重鏈之表現載體一起導入宿主，或藉由將可表現IgM輕鏈及改質IgM重鏈的單一之表現載體導入宿主而進行。單一之表現載體係可為編碼IgM輕鏈的多核苷酸、及編碼改質IgM重鏈的多核苷酸其分別被連結於相異啟動子的表現載體，或編碼IgM輕鏈及改質IgM重鏈的多核苷酸被連結於1個啟動子的表現載體。 就表現載體而言，可列舉例如質體、病毒載體(例如，腺病毒、反轉錄病毒)、人工染色體、及整合型載體(integrative vector)(例如，反轉錄病毒)。表現載體亦為用以暫時性表現或恒常性(即，安定的)表現的載體。
本發明還提供使用本發明之抗體而測定標的 物質之方法。本發明之測定方法係包含在樣品中測定標的物質。本發明之測定方法係有用於臨床檢査、生物學的分析等之試驗。
樣品係含有標的物質、或被懷疑含有標的物 質的樣品。樣品之來源並未特別限定，可為來自生物之生物學性樣品，或可為環境樣品等。就生物學性樣品之來源生物而言，可列舉例如哺乳動物(例如，人、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、豬、馬、山羊、綿羊)等之動物、昆蟲、微生物、植物。又生物學性樣品可為血清、血液、血漿、唾液、組織或細胞萃取液。就環境樣品而言，可列舉例如來自土壤、海水或淡水之樣品。樣品於付諸本 發明之測定方法之前，可付諸其他的處理。就如此之處理而言，可列舉例如離心分離、萃取、過濾、沉澱、分劃。
本發明之測定方法係可定性地或定量地進 行。本發明之測定方法還可藉由免疫學手法來進行。就如此之免疫學手法而言，可列舉例如酵素免疫測定法(EIA)(例如，直接競合ELISA、間接競合ELISA、三明治ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、螢光免疫測定法(FIA)、磁性粒子法、免疫層析法、發光免疫測定法、自旋免疫測定法、西方墨漬法、乳膠凝集法。
[實施例]
以下，藉由實施例而詳細說明本發明，但本發明並未限定於此等之實施例。
於以下之實施例中，就改質抗體之重鏈而言，係於藉由WO2013/042426所揭示的方法所調製之辨識25OH VD3與抗25OH VD3抗體(1次抗體)之複合體(親和性複合體)的2種來自雞的IgM(抗體1、抗體2)中，使用使相異長度之C末端區缺失的重鏈與蛋白質(ALP，分子量：140kDa)融合者。或者，於藉由使用人類IgG作為抗原且利用ADLib(Autonomously Divcrsifying Library)系統(例如，參照WO2004/011644)而調製之辨識人類IgG的2種來自雞的IgM(抗體3、抗體4)中，使用使相異長度之C末端區缺失的重鏈與蛋白質(ALP，分子量：140kDa)融合者，作為改質抗體之重鏈。
抗體1~4的胺基酸殘基之位置與抗體區之關係係如表1所記載。
表1之補充說明如下。
1)抗體1~4係可變區(Vμ)之胺基酸序列相異，但恆定區(Cμ1、Cμ2、Cμ3、Cμ4)之胺基酸序列完全相同。例如，若針對抗體1及2之關係進行說明，則構成抗體1及2之可變區的胺基酸殘基之個數相差6個。因此，若以抗體1之各恆定區之開始及結束胺基酸殘基之位置(n位)作為基準，則抗體2之各恆定區之開始及結束胺基酸殘基之位置係「(n+6)位」。
2)參與藉由雙硫鍵之重鏈與輕鏈之交聯的半胱胺酸殘基係存在於Cμ1中(抗體1：第160位之半胱胺酸；抗體2：第166位之半胱胺酸：抗體3：第158位之半胱胺酸；抗體4：第157位之半胱胺酸)。
3)參與藉由雙硫鍵之重鏈間之交聯(即，IgM單體之形成)的半胱胺酸殘基係存在於Cμ2中(抗體1：第347位之半胱胺酸；抗體2：第353位之半胱胺酸：抗體3：第345位之半胱胺酸；抗體4：第344位之半胱胺酸)。
4)參與藉由雙硫鍵之IgM單體間之交聯(即，IgM多聚體之形成)的半胱胺酸殘基係存在於Cμ3中(抗體1：第426位之半胱胺酸；抗體2：第432位之半胱胺酸：抗體3：第424位之半胱胺酸；抗體4：第423位之半胱胺酸)。
實施例1：具有改質IgM重鏈的改質抗體之表現及分泌
將連結了使相異長度之C末端區缺失的抗體重鏈(H鏈)片段之基因與鹼性磷酸酶(ALP)之基因(5’末端側：H鏈片段：3’末端側：ALP。以下相同)的表現載體(針對抗體1及2，分別為6種類之表現載體)、以及IgM抗體輕鏈(L鏈(λ))全長之表現載體，共轉染於CHO細胞，並使改質抗體暫時性地表現。針對獲得的CHO細胞之培養上清液，進行藉由西方印漬術(WB)的分析。製作的改質抗體，關於改質IgM重鏈，係以「數字+蛋白質(ALP)」標記。例如，250ALP係意指包含「由IgM抗體H鏈之第1至第250個為止的胺基酸殘基所構成的H鏈(換言之，係融合了使第251個胺基酸殘基至C末端胺基酸殘基為止缺失的H鏈)與蛋白質(ALP)者」與「IgM抗體L鏈全長」的改質抗體。
其結果，製作的全部改質抗體被認為至少其一部分係於膜區分(M)中局部存在(第1、2圖)。此表示全部有改質抗體表現。另一方面，被認為分泌至培養上清液(S)之改質抗體係只有具有對應250ALP、342ALP、及366ALP的3種之改質IgM重鏈(自抗體1衍生)、以及對應256ALP、348ALP、及372ALP的3種之改質IgM重鏈(自抗體2衍生)者(第1、2圖)。
實施例2：改質IgM重鏈與IgM輕鏈之組合
針對實施例1所獲得的CHO細胞之培養上清液，於Native PAGE後進行WB。其結果，使用抗ALP抗體所檢測出之帶位置係與使用抗L鏈抗體所檢測出之帶位置相同(數據省略)。
其次，藉由以下之分析系A~D，評價改質IgM重鏈是否與IgM輕鏈組合。又，就改質抗體而言，係使用含抗體1(366ALP)或抗體2(372ALP)之實施例1所獲得的CHO細胞之培養上清液。
(分析系A)
將抗L鏈抗體(來自小鼠)固定於ELISA平盤之孔中。於孔中添加改質抗體，接著添加抗ALP抗體(來自兔)，並使反應。
(分析系B)
將抗L鏈抗體(來自小鼠)固定於ELISA平盤之孔中。於孔中添加改質抗體，接著添加抗H鏈抗體(來自山羊)，並使反應。
(分析系C)
將抗H鏈抗體(來自山羊)固定於ELISA平盤之孔中。於孔中添加改質抗體，接著添加抗L鏈抗體(來自小鼠)，並使反應。
(分析系D)
將抗ALP抗體(來自兔)固定於ELISA平盤之孔中。於孔中添加改質抗體，接著添加抗抗L鏈抗體(來自小鼠)，並使反應。
於分析系A~D中，反應後，於孔中添加HRP標識抗兔Ig抗體，接著添加TMB(基質)，並進行藉由HRP的酵素反應後，以硫酸使反應停止。最後，測定450nm之吸光度。
其結果，藉由分析系A~D，而訊號被檢測出(第3圖)。因此，確認了改質IgM重鏈係與IgM輕鏈組合。
實施例3：改質抗體的機能之確認(1)
為了確認本發明之抗體對於25OH VD3與抗25OH VD3抗體(1次抗體)之複合體(親和性複合體)的機能，依據與WO2013/042426之實施例所揭示的方法同樣之方法，而藉由ELISA進行25OH VD3之測定。首先，將連結了使相異長度之C末端區缺失的抗體重鏈(H鏈)片段之基因與鹼性磷酸酶(ALP)之基因的表現載體(針對抗體2，3種類之表現載體)、及IgM抗體輕鏈(L鏈(λ))全長的表現載體，共轉染於CHO細胞，並使自抗體2衍生的改質抗體暫時性地表現。其次，使用所獲得的CHO細胞之培養上清液而進行分析。
其結果，具有對應256ALP及372ALP的2種改質IgM重鏈的改質抗體係顯示高吸光度之值。此係表示此等之改質抗體具有作為單體之原本抗體(多聚體IgM)之機能(分泌能力及結合能力)及蛋白質(ALP)之機能(酵素活性)兩者(第4圖)。
由以上所述確認了：具有較重鏈交聯半胱胺酸(第353位)更位於N末端側的CH1‧CH2鄰接區中之胺基酸殘基、以及較重鏈交聯半胱胺酸(第353位)更位於C末 端側的CH3上游區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的具有C末端缺失恆定區的改質單體抗體，係具有原本抗體之機能及蛋白質之機能兩者。
實施例4：改質抗體的機能之確認(2)
將連結了使相異長度之C末端區缺失的抗體重鏈(H鏈)片段之基因與鹼性磷酸酶(ALP)之基因的表現載體(於抗體2，實施例1~4係相異的11種類之表現載體、及與先前實施例相同之6種表現載體)、以及IgM抗體輕鏈(L鏈(λ))全長的表現載體，共轉染於CHO細胞，並使由抗體2所衍生的改質抗體暫時性地表現。使用所獲得的CHO細胞之培養上清液，而測定25OH VD3。25OH VD3之測定係依據與WO2013/042426之實施例所揭示的方法相同之方法，藉由ELISA而進行。
其結果，具有改質IgM重鏈的改質抗體之中，於ELISA中呈現高計數值的改質抗體為357ALP、362ALP、367ALP、372ALP、373ALP、374ALP、及375ALP(第5、6圖)。又，由WB與ELISA之結果(第5、6圖)，關於此等改質抗體係確認了表現量與活性有某程度之相關性。 而關於250ALP，亦因顯示了低計數值，所以確認了雖些微但機能之保持(第5、6圖)。
由上述內容，由原本抗體之機能(分泌能力及結合能力)、以及被融合於抗體的蛋白質之機能(活性)之良好保持的觀點，認為重鏈恆定區中之C末端胺基酸殘基的位置為在CH1‧CH2鄰接區、或是較重鏈交聯半胱胺酸更位於C末端側之區(尤其是CH2‧CH3鄰接區或CH3上 游區)中係重要。尤其是為了於培養上清液中大量獲得可具有優異機能的改質抗體，較重鏈交聯半胱胺酸更位於C末端側之區(尤其，CH2‧CH3鄰接區或CH3上游區)中應係重要的。
實施例5：來自具有對相異抗原之結合能力之抗體的改質抗體之製作及評價
將連結了使相異長度之C末端區缺失的抗體重鏈(H鏈)片段之基因與鹼性磷酸酶(ALP)之基因(5’末端側：H鏈片段：3’末端側：ALP。以下相同)的表現載體(於抗體3及4，各自1種類之表現載體)、以及IgM抗體輕鏈(L鏈(λ))全長之表現載體，共轉染於CHO細胞，使為改質抗體的抗體3(364ALP)及抗體4(363ALP)暫時性地表現。抗體3(364ALP)及抗體4(363ALP)的恆定區係與抗體2(372ALP)的相同(參照表1)。使用所獲得的CHO細胞之培養上清液，而進行ELISA。
ELISA係依據下述順序進行。於分析平盤之孔中，添加5μg/mL之濃度之人類IgG或僅添加緩衝液並於4℃培養一晚。以TBST將孔洗淨3次，接著以1% BSA/TBS阻斷1小時後，以TBST洗淨3次。於孔中添加CHO細胞之培養上清液並放置一定時間後，以TBST洗淨3次。 於孔中添加AMPPD，並進行發光反應。最後測定發光計數值。
其結果，由於在CHO細胞之培養上清液中，發光計數值係被良好地測定了(第7圖)，所以確認了：作為C末端胺基酸殘基而具有較重鏈交聯半胱胺酸更位於C末 端側的CH3上游區中之胺基酸殘基的具有C末端缺失恆定區的改質單體抗體，係具有原本抗體(多聚體IgM)之機能(分泌能力及對人類IgG之結合能力)及蛋白質(ALP)之機能(酵素活性)兩者。此係顯示：不論原本抗體具有結合能力的抗原之種類為何(即，原本抗體之可變區之胺基酸序列之種類)，以具有作為C末端胺基酸殘基而具有與上述相同之區中之胺基酸殘基的C末端缺失恆定區的方式來進行改質，藉此可製作原本抗體之機能及蛋白質之機能兩者被維持之本發明的改質單體抗體。
由上述可知，本發明係有用於製作抗各種抗原的改質單體抗體之製作。
<110> 富士瑞必歐股份有限公司
<120> 改質單體IgM
<130> PRBA-14706-TW
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<151> 2014-02-25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 446
<212> PRT
<213> 雞
<400> 1

Claims (10)

  1. 一種改質單體IgM，其含有IgM輕鏈、及改質IgM重鏈，而改質IgM重鏈係含有：A)由可變區及C末端缺失恆定區所構成的重鏈區、及B)融合於重鏈區的蛋白質。
  2. 如請求項1之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH1‧CH2鄰接區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
  3. 如請求項1之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH2‧CH3鄰接區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
  4. 如請求項1之改質單體IgM，其中前述恆定區係具有CH3上游區中之胺基酸殘基作為C末端胺基酸殘基的恆定區。
  5. 如請求項1至4中任一項之改質單體IgM，其中蛋白質為酵素。
  6. 如請求項1至5中任一項之改質單體IgM，其中IgM輕鏈、及改質IgM之重鏈區係來自鳥類。
  7. 如請求項6之改質單體IgM，其中鳥類為雞。
  8. 一種轉形細胞，其表現如請求項1至7中任一項之改質單體IgM。
  9. 如請求項8之細胞，其中前述細胞為哺乳動物細胞。
  10. 一種標的物質之測定方法，其包含使用如請求項1至7中任一項之改質單體IgM，而測定樣品中的標的物質。
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