TW201211540A - LOC device for pathogen detection and genetic analysis with dialysis and nucleic acid amplification - Google Patents

Description

201211540 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於使用微系統技術（MST )之診斷裝置。特 別是’本發明關於用於分子診斷之微流體及生化處理以及 分析。 【先前技術】 0 分子診斷已用於：可於病徵顯現之前，提供早期疾病 檢測預示之領域。分子診斷試驗係用於檢測： •遺傳病症 •後天病症 •傳染性疾病 •與健康有關情況之基因易致病因素 因高準確度及快速處理時間，分子診斷試驗得以減少 無效健康照護的發生、增進病患預後（patient outcome ) 〇 、改進疾病管理及個體化患者照護。分子診斷的許多技術 係基於自生物樣本（諸如血液或唾液）萃取及擴增之特定 核酸（去氧核糖核酸（DNA )以及核糖核酸（RNA)兩者 )的檢測及辨識。核酸鹼基的互補特徵使得經合成DNA ( 寡核苷酸）短序列結合（雜交）至用於核酸試驗之特定核 酸序列。若發生雜交，則互補序列存在於樣本中。此使得 例如預測個人未來會得到的疾病、判定感染性病原體的種 類及病原體，或判定個人對藥物的反應成爲可能。 201211540 以核酸爲基之分子診斷試驗 以核酸爲基之試驗具有四個獨立步驟： 1. 樣本製備 2. 核酸萃取 3 .核酸擴增（任意的） 4.檢測 許多樣本類型，諸如血液、尿液、痰和組織樣本’係 用於基因分析。診斷試驗判定所需的樣本類型，因並非所 有樣本代表疾病進程。這些樣本具有各種組分，但通常只 有其中之一受到關注。例如，在血液中，高濃度的紅血球 可抑制致病微生物的檢測。因此，於開始時經常需要純化 及/或濃縮步驟。 血液爲較常請求的樣本類型之一。其具有三種主要組 分：白血球、紅血球及血栓細胞（血小板）。血栓細胞促 進凝集且在體外維持活性。爲抑制凝聚作用，在純化及濃 縮之前令試樣與諸如乙二胺四乙酸（EDTA )之試劑混合 。通常自樣本移除紅血球以濃縮標靶細胞。在人體中，紅 血球佔細胞物質之約99%但其不帶有DNA，因彼不具細胞 核。此外，紅血球含有諸如血紅素之可能干擾下游核酸擴 增程序（描述於下）的成分。可藉由示差（differentially )溶胞於溶胞液中之紅血球來移除紅血球，而留下剩餘的 完整細胞物質，可接著使用離心而自樣本將其分離。此提 供自彼萃取核酸之濃縮標靶細胞。 用於萃取核酸之確切規程取決於樣本及待實施之診斷 -6- 201211540 分析。例如，用於萃取病毒RNA之規程與用於萃取基因組 DN A之規程相當不同。然而，自標靶細胞萃取核酸通常包 含細胞溶胞步驟及接續的核酸純化。細胞溶胞步驟使細胞 及細胞核膜破裂，而釋放出遺傳物質。此經常使用溶胞清 潔劑來完成，溶胞清潔劑係諸如十二烷基硫酸鈉，其亦使 存在於細胞中之蛋白質大量變性。 接著以酒精（通常爲冰乙醇或異丙醇）沉澱步驟純化 0 核酸，或是經由固相純化步驟，於清洗之前在高濃度的離 液鹽（chaotropic salt)存在下，通常於分飽塔中的氧化 矽基質、樹脂或順磁性珠上，接著以低離子強度緩衝液進 行洗提。核酸沉澱之前之任意的步驟爲添加剪切蛋白質之 蛋白酶，以進一步純化樣本。 其他的溶胞方法包括經由超聲振動之機械式溶胞以及 將樣本加熱至94 °C以破壞細胞膜之熱溶胞。 標靶DNA或RNA可以極小量存在於經萃取之物質中， Q 尤其是若標靶來自病原體來源。核酸擴增提供選擇性擴增 (即，複製）特定標靶（就可檢測程度而言爲低濃度者） 的能力。 最常使用之核酸擴增技術爲聚合酶鏈反應（PCR )。 PCR係業界已知悉，以及於E. van Pelt-Verkuil等人之 Principles and Technical Aspects of PCR Amplification, Springer，2008中提供此類反應之綜合理解性描述。 PCR爲有用的技術，其相對複雜DNA背景而擴增標靶 DNA序列。若欲（藉由PCR )擴增RNA，則首先必須使用 201211540 名爲反轉錄酶之酵素將之轉錄爲cDNA (互補DNA )。隨 後，藉由PCR擴增得到的cDNA。 PCR爲指數型方法，只要維持反應的條件爲可接受的 則其可繼續進行。反應之成分爲：

1. 引子對-具有約10-30個與毗鄰（flanking)標靶序 列區互補之核苷酸的短單股DNA 2. DNA聚合酶-合成DNA之熱穩定性酶 3. 去氧核糖核苷三磷酸（dNTP )-提供整合至新合 成之DNA股之核苷酸 4. 緩衝液-提供DNA合成之最佳化學環境 PCR普通包含將這些反應物置於含有經萃取之核酸的 小管（〜10-50微升）。將管放置於聚合酶鏈反應器（ thermal cycler)中；一種令反應經受一連串不等量時間之 不同溫度的儀器。各熱循環的標準規程（protocol )包括 變性相、黏著相及延伸相。延伸相有時代表引子延伸相。 除了此三-步驟規程外，可採用二-步驟熱規程，於其中黏 著及延伸相合倂。變性相普通包含將反應溫度升溫至90-95°C以使DNA股變性；於黏著相中，將溫度降低至〜50-6〇°C以供引子黏著；接著於延伸相中，將溫度升溫至最佳 DNA聚合酶活性溫度60-72°C，以供引子延伸。此方法重複 循環約20-4〇次，最終結果爲產生數百萬拷貝之引子間的 標靶序列。 已發展出用於分子診斷之許多標準PCR規程之變體， 其中包括諸如多引子組PCR、聯結子引發（linker-primed 201211540 )PCR、直接PCR、串接重複序列（串接重複序列）PCR 、即時PCR以及反轉錄酶PCR。 多引子組PCR使用單一 PCR混合物中之多重引子組以 產生對不同DNA序列具特異性之不同大小之擴增子。藉由 一次標靶多個基因，由單一試驗可得到額外的資訊（以其 他方式則需要數次試驗）。最佳化多引子組PCR更爲困難 ，因其需要選取具近似黏著溫度之引子及具近似長度與鹼 0 基組成之擴增子以確保各擴增子之擴增效率相等。 聯結子引發（linker-primed ) PCR，又稱爲接合接合 子（ligation adaptor) PCR，爲用於致能複雜DNA混合物 中實質上所有DNA序列之核酸擴增的方法，而不需要標 靶-特異性引子。此方法首先以合適的限制性內核酸酶（ enzyme)來剪切（digest)標靶DNA群體。使用接合酶酵 素，具有合適的懸伸（overhanging)端之雙股寡核苷酸聯 結子（亦稱爲接合子）接著與標靶DNA片段之端子接合。 〇 接下來使用對聯結子序列具有特異性之寡核苷酸引子實施 核酸擴增。藉此，可擴增毗鄰聯結子寡核苷酸之D N A來源 的所有片段。 直接PCR描述一種直接於樣本上實施pCr而不需要任 何核酸萃取（或最少核酸萃取）之系統。長久以來認爲， PCR反應受到存在於未純化的生物樣本中之許多成分的抑 制，諸如血液中的原血紅素成分。傳統上，於製備反應混 合物之前，PCR需要加強純化標靶核酸。然而，利用化學 性質的適當變化及樣本濃縮，可以最少化DNA純化而進行 201211540 PCR或進行直接PCR。用於直接PCR之PCR化學性質的調整 包括加強緩衝液強度、使用高活性及進行性（p r 〇 c e s s i v i t y )之聚合酶及與潛在聚合酶抑制劑螯合之添加物。 串接重複序列PCR利用兩次獨立的核酸擴增以增進擴 增正確擴增子的機率。串接重複序列PCR中的一類型爲巢 式PCR，其中使用兩對PCR引子，以於分別的核酸擴增進 行單一基因座擴增。第一對引子與標靶核酸序列外部區域 的核酸序列雜交。第二次擴增中所使用的第二對引子（巢 式引子）結合於第一 PCR產物中並且產生含有標靶核酸的 第二PCR產物（較第一 PCR產物爲短）。此策略所運用的 論理爲：若於第一次核酸擴增期間因失誤而擴增錯誤的基 因座，由第二對引子再次擴增錯誤的基因座的機率非常低 ，因此確保了特異性。 使用即時PCR或定量PCR以即時量測PCR產物之量。 藉使用含有探針或螢光染料之螢光團以及反應中的參考標 準，可測定樣本中之核酸的最初含量。此特別有用於分子 診斷，其中治療選擇可能取決於樣本中所載病原體而有所 不同。 反轉錄酶PCR ( RT-PCR )係用於自RNA來擴增DNA。 反轉錄酶爲將RNA反轉錄成互補DNA(cDNA)之酵素，接 著藉由PCR擴增cDNA。RT-PCR廣泛地用於表現型態（ expression profiling )以判定基因的表現或辨識RNA轉錄 本（包括轉錄起始及終止位址）之序列。其亦用於擴增 RN A病毒，諸如人類免疫缺乏病毒或C型肝炎病毒。 -10- 201211540 恆溫擴增爲另一種類型的核酸擴增，其不依靠擴增反 應期間之標靶DN A的熱變性，因此不需要複雜的機械。恆 溫核酸擴增方法可因此於原始位置進行或於實驗室環境外 易於被操作。包括股取代擴增（Strand Displacement Amplification)、轉錄介導擴增（Tr ans cr i p t i 〇 η M ed i at e d Amplification )、依賴核酸序列擴增（Nucleic Acid Sequence Based Amplification)、重組酵素聚合酶擴增（ ◎ Recombinase Polymerase Amplification )、滾動循環擴增 (Rolling Circle Amplification ) 、分枝型擴增（ Ramification Amplification )、解旋恆溫 DNA 擴增（ Helicase-Dependent Isothermal DNA Amplification)及環 形恒溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification) 之一些恆溫核酸擴增方法已被敘述。 恆溫核酸擴增法不依賴模板DN A之持續加熱變性來產 生作爲進一步擴增之模板的單股分子，而是依賴諸如於常 ❹ 溫下藉由特異性限制內核酸酶之DNA分子的酵素性切割， 或是利用酵素分開DN A股之其他方法。 股取代擴增（SDA )依賴特定限制性酵素的能力以切 割半修飾（hemi-modified) DNA之未經修飾股，及依賴 5’-3’外核酸酶-缺乏之聚合酶的能力以延伸並取代下游股 。然後藉由偶合義（sense )與反義（antisense )反應而達 成指數性核酸擴增，其中來自義反應之股取代作爲反義反 應之模板。使用不以普通方式切割DN A而是於DN A之一股 上產生切口之切口酶（諸如N. Alwl, N. BstNBl及Mlyl) -11 - 201211540 係有用於此反應。藉使用熱穩定限制性酵素（Jvfll )及熱 穩定性外-聚合酶（聚合酶）之組合已改進SDA。此組 合顯現出使反應的擴增效率由1〇8倍擴增增加至101()倍擴增 ，以致可使用此技術來擴增獨特的單拷貝分子。 轉錄介導擴增（TMA)及依賴核酸序列擴增（NASBA )使用RNA聚合酶以複製RNA序列而非對應之基因組DNA 。此技術使用兩種引子及兩或三種酵素、RNA聚合酶、反 轉錄酶及任意的RNase Η (若反轉錄酶不具有RNase活性） 。一種引子含有供RNA聚合酶之啓動子序列。在核酸擴增 的第一步驟中，此引子於限定的位置與標靶核糖體RN A ( rRN A )雜交。藉由自啓動子引子的3’端開始延伸，反轉錄 酶產生標靶rRN A之DN A拷貝。若存在另外的RNase Η，則 所得的RNA : DNA雙股中的RNA經由反轉錄酶之RNase活 性而被分解。接著’第二引子結合至DN A拷貝。藉反轉錄 酶自此引子的末端合成新的DNA股而產生雙股DNA分子。 RNA聚合酶辨識DNA模板中的啓動子，並開始轉錄。各個 新合成的RN A擴增子再進入過程中並作爲新的複製之模板 〇 於重組酵素聚合酶擴增（RPA )中，藉結合相對的寡 核苷酸子至模板DNA並且由DN A聚合酶將之延伸而達成特 定DNA片段之恆溫擴增。使雙股DNA ( dsDNA )模板變性 不需要熱。反之’ RP A利用重組酵素-引子錯合體來掃描 dsDNA及促進同源（cognate )位置處的股交換。藉由單股 DN A結合蛋白與經取代模板股的交互作用來穩定所得到的 -12- 201211540 結構，因此防止引子因分支遷移而放出。重組酵素分解離 開可接近股取代DNA聚合酶（諸如Pol I (5·^)的大片段）之寡核苷酸的3'端，且引子接著開始延伸 。藉循環重複此步驟而達到指數性核酸擴增。 解旋酶擴增（HDA )模擬活體內系統，於活體內系統 中使用DN A解旋酶來產生用於引子雜交之單股模板並接著 以DNA聚合酶延伸引子。於HDA反應的第一步驟中，解旋 0 酶穿過標靶DNA，破壞聯結兩股的氫鍵，此二股隨後由單 股結合蛋白所結合。由解旋酶所暴露之單股標靶區域使引 子得以黏著。DN A聚合酶使用自由的去氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)以接著延伸各引子的3’端，以產生兩個DNA複製 (replicate )。兩個複製的dsDN A股獨立地進入下一個 HD A循環，造成標靶序列之指數性核酸擴增。 其他的基於DNA之恆溫技術包括滾動循環擴增（RCA )，於其中DNA聚合酶繞環狀DNA模板持續地延伸引子而 Q 產生由許多環狀重複拷貝所組成之長的DNA產物。藉由終 止反應，聚合酶產生數千拷貝之環狀模板，其具有栓繫至 原始標靶DNA的拷貝鏈。此致使標靶之空間解析度及信號 之快速核酸擴增。於1小時內至多可產生1 〇12拷貝之模板。 分枝型擴增爲RCA之變體，並利用封閉的環狀探針（C-探 針）或扣鎖探針及具高進行性之DNA聚合酶，以於常溫情 況下指數地擴增C-探針。 環形恆溫擴增（LAMP )提供高選擇性且利用DNA聚 合酶及含有四個特別設計的引子之引子組，引子組辨識標 -13- 201211540 靶DNA上總共六個不同的序列。含有標靶DNA之義股及反 義股序列的內引子起始LAMP。由外引子引發之後續股取 代DNA合成釋出單股DNA。此作爲由第二內及外引子所引 發之DN A合成的模板，第二內及外引子與標靶之另一端雜 交，產生莖-環（stem-loop) DNA結構。於接續的LAMP循 環中，內引子與產物上的環形雜交並起始取代DNA合成， 產生原始莖-環DNA及具有兩倍莖長度之新莖-環DNA。於 一小時內持續循環反應而聚積109拷貝之標靶。最終產物 爲，具有數個反相重複標靶之莖-環DN A以及具有多個環 形（交替黏著相同股中之反相重複標靶所形成）之花椰菜 狀結構。 於完成核酸擴增之後，必須分析擴增的產物以判定是 否產生預期的擴增子（標靶核酸之擴增量）。分析產物的 方法有透過膠體電泳簡單測定擴增子的大小、使用DN A雜 交以識別擴增子之核苷酸組成。 膠體電泳爲檢查核酸擴增步驟使否產生預期之擴增子 之最簡單方式之一。膠體電泳利用施加至膠體基質之電場 來分離DNA片段。帶負電的DNA片段將以不同速率（主要 取決於其大小）移動通過基質。於電泳完成之後，可染色 膠體中的片段使其成爲可見。於UV光下發螢光之溴化乙 菲錠爲最常用的染劑。 藉由與DNA大小標記（DNA標準片段（DNA ladder) )相比較來判定片段的大小，DNA大小標記含有已知大小 的DNA片段，其與擴增子一同跑膠。因寡核苷酸引子結合 -14- 201211540 至毗鄰標靶dna之特定位置’經擴增之產物的大小可被預 測且利用膠體上已知大小的帶（band)來檢測。爲確認擴 增子爲何或若產生數種擴增子時，常利用DNA探針與擴增 子雜交。 DNA雜交意指藉由互補鹼基配對而形成雙股DNA。用 於特定擴增產物之正面識別的DN A雜交需使用長度爲約20 個核苷酸的DNA探針。若探針具有與擴增子（標靶）DNA 0 序列互補的序列，則雜交將於有利的溫度、pH及離子濃度 條件下發生。若發生雜交，則表示關注的基因或DN A序列 出現於原始樣本中。 光學檢測爲最常見之檢測雜交的方法。標記擴增子或 是探針以經由發螢光或電致化學發光而發光。這些方法之 引發產光部分之激發態的方式不同，但兩者同樣致能核苷 酸股之共價標記。於電致化學發光（ECL )，當以電流刺 激時，由發光團分子或錯合體產生光。於發螢光時，以造 Q 成發射之激發光來發光。 使用發光源以檢測螢光，發光源提供波長爲螢光分子 吸收之激發光以及檢測單元。檢測單元包含光感測器（諸 如光電倍增管或電荷耦合裝置（CCD )陣列）以檢測發射 的信號，以及防止激發光被包含於光感測器輸出之機制（ 諸如波長-選擇濾波器）。回應激發光，螢光分子發射史 托克斯轉換光（Stokes-shifted light )，以及此發射的光 由檢測單元收集。史托克斯轉換爲發射的光與吸收的激發 光之間之頻率差或波長差。 -15- 201211540 使用光感測器來檢測ECL發射，光感測器對於所採 之ECL種類之發射波長爲敏感。例如，過渡金屬配位錯 體發射可見波長的光，因而採用傳統光二極體及CCD作 光感測器。ECL之優勢爲，若排除周圍光線，ECL發射 爲檢測系統中唯一存在的光，因而增進靈敏度。 微陣列使數十萬的DNA雜交試驗得以同時進行。微 列爲有用的分子診斷工具，其可篩檢數千種遺傳疾病或 單一試驗中檢測是否存在數種感染性病原體。微陣列由 多不同的固定於基板上且呈點狀之DN A探針所組成。首 以螢光或發光分子標記標靶DNA (擴增子）（於核酸擴 期間或之後），然後將其施加至探針陣列。於經控制的 度下、潮濕的環境中培養微陣列數小時或數天，此時探 及擴增子之間發生雜交。於培養後，必須以一連串緩衝 清洗微陣列以移除未經結合股。一旦清洗後，以氣流（ 常爲氮）乾燥微陣列表面。雜交及清洗的嚴格度很重要 不夠嚴格可能導致高度非特異性結合。過度嚴格可能導 無法適當進行結合而造成減低的靈敏度。藉由檢測來自 標記之與互補探針形成雜交的擴增子之光發射而辨識雜 〇 使用微陣列掃描器檢測來自微陣列的螢光，微陣列 描器通常爲經電腦控制的反相掃描式螢光共軛焦顯微鏡 其一般使用激發螢光染料的雷射及光感測器（諸如光電 增管或CCD )以檢測發射的信號。螢光分子發射經史托 斯轉換的光（如上述），而光被檢測單元收集。 用 合 爲 可 陣 於 許 先 增 溫 針 液 通 〇 致 經 交 掃 ， 倍 克 -16- 201211540 發射的螢光必須被收集、與未經吸收的激發波長分離 ’並被傳送至檢測器。於微陣列掃描器中常使用共軛焦配 置以藉由位於影像平面的共軛焦針孔來刪除失焦資訊。此 使得僅檢測光的聚焦部分。防止於物之焦點平面之上方或 下方的光進入檢測器，藉此增加信號對雜訊比。檢測器將 經檢測的螢光光子轉換成電能，電能並接著被轉換成數位 信號。此數位信號轉變成代表來自給定像素之螢光強度的 0 數字。陣列的各特徵係由一或多個此像素所構成。掃描的 最終結果爲陣列表面影像。由於已知微陣列上每一個探針 的確切序列及位置，因此可同時識別及分析雜交的標靶序 列。 可於下列找到更多有關螢光探針之資訊： http ： "www.premierbiosoft.com/tech_notes/ F R E T _ p r 〇 b e. h t m 1 以及 http : "www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/ OMolecular-Probes-The-Handbook/Technical-Notes-and-Product-Highlights/Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer-FRET.html 就地醫護分子診斷 儘管分子診斷試驗提供了優勢，臨床檢驗中此類型試 驗的成長不如預期且仍僅占檢驗醫學之實施的小部分。此 主要歸因於，與基於非關核酸方法之試驗相比，核酸試驗 相關之複雜度與成本。分子診斷試驗之於臨床處理的廣泛 -17- 201211540 適用性係與可顯著降低成本、自始（樣本處理）至終（產 生結果）之快速及自動化分析，以及不需大量人爲操作之 儀器發展息息相關。 用於醫師診所、鄰近的或基於使用者的醫院、家中之 就地醫護技術提供以下優點： • 快速得到結果而致能快速促進治療及改進照護品 質。 • 經由試驗極少量樣本而得到檢驗値的能力。 • 減少臨床工作量。 • 減少實驗室工作量並因減少管理工作而增進工作 效率。 • 因減少住院時間、門診病人於首次就診得知結果 ’及簡化樣本的處理、儲存及運送而改善每個病 人所需成本。 • 促進臨床管理決策，諸如接種控制及抗生素使用 以晶片上實驗室（LOC)爲基之分子診斷 基於爲流體技術之分子診斷系統提供自動化及加速分 子診斷分析的方法。較短的檢測時間主要歸因於微流體裝 置中之診斷方法步驟使用極少用量、自動化及內建低開銷 串級。奈升與微升級用量亦降低試劑消耗及成本。晶片上 實驗室（LOC )裝置爲微流體裝置之常見形式。晶片上實 驗室裝置於MST層中具有MST結構以將流體處理整合至單 -18· 201211540 一支撐基板（通常爲矽）。使用半導體產業之VLSI (超大 型積體電路）技術之製造’使各LOC裝置的單元成本非常 低。然而，控制流體流經LOC裝置、添加試劑、控制反應 條件等需要大體積的外部管路及電子裝置。將LOC裝置連 接至這些外部裝置實際上將用於分子診斷之LOC裝置之用 途限制爲檢驗處理。外部設備的成本及其操作上的複雜度 排除了利用以LOC爲基的分子診斷作爲就地醫護處理的實 ^ 用選擇。 鑒於上述，需要一種用於就地醫護之基於LOC裝置之 分子診斷系統。 【發明內容】 於以下的標號段落將描述本發明的各種面向。 GCF027.1 本發明之此面向提供一種用於檢測生物 樣本中之病原體之晶片上實驗室（LOC )裝置，LOC裝置 〇 包含： 接收樣本的入口； 支撐基板； 複數個試劑貯槽； 病原體透析部，用於使樣本中之病原體與小於預定閾 限之組分分離； 病原體透析部下游之病原體溶胞部，用於利用溶胞試 劑溶胞病原體以釋放出其中的遺傳物質； 病原體透析部下游之培養部，培養部係與含有用於與 -19- 201211540 遺傳物質進行酵素反應之酵素的試劑貯槽之一者呈流體連 通；以及， 培養部下游之核酸擴增部，用於自遺傳物質擴增核酸 序列；其中， 病原體透析部、病原體溶胞部、培養部以及核酸擴增 部均被支撐於支撐基板上。 GCF027.2 較佳地，核酸擴增部爲聚合酶鏈反應（ PCR )部。 GCF02 7.3 較佳地，LOC裝置亦具有PCR部下游之 雜交部，雜交部具有用於與樣本中之標靶核酸序列雜交之 探針陣列以形成探針-標靶雜交體；以及具有用於檢測探 針-標靶雜交體之光感測器。 GCF027.4 較佳地，透析部具有與入口呈流體連通 之第一通道、具有與溶胞部呈流體連通之第二通道，以及 比大於其他組分之病原體小之複數個孔口，第二通道與第 一通道係經由孔口而呈流體連通，使得小的組分流入第二 通道而病原體保留於第一通道中。 GCF02 7.5 較佳地，第一通道及第二通道係組態成 藉由毛細作用而塡充樣本。 GCF027.6 較佳地，第一通道係組態成藉由毛細作 用而將病原體吸入溶胞部。 GCF027.7 較佳地，核酸擴增部爲恆溫核酸擴增部 〇 GCF027.8 較佳地，試劑貯槽各具有用於將試劑保 -20- 201211540 持於其中之表面張力閥，表面張力閥具有彎液面固定器， 彎液面固定器用於固定試劑的彎液面直至與樣本流接觸而 移除彎液面使得試劑自試劑貯槽流出。 GCF027.9 較佳地，LOC裝置亦具有自入口至雜交 部之流動路徑，其中流動路徑係組態成藉由毛細作用自入 口吸引樣本至雜交部。 GCF027.10 較佳地，LOC裝置亦具有位於支撐基板 0 與PCR部之間之CMOS電路，以及溫度感測器，其中CMOS 電路使用溫度感測器輸出來反饋控制PCR部。 GCF027.il 較佳地，PCR部具有供熱循環樣本以擴 增核酸序列之PCR微通道，PCR微通道界定部分的用於樣 本之流動路徑並具有橫切流向的小於1〇〇,〇〇〇平方微米的 截面積。 GCF027.12 較佳地，LOC裝置亦具有至少一個用於 加熱伸長PCR微通道內之核酸序列之伸長加熱器元件，伸 Q 長加熱器元件係平行於PCR微通道而延伸。 GCF02 7.1 3 較佳地，PCR微通道的至少一部形成伸 長PCR室。 GCF027.14 較佳地’ PCR部具有複數個各由PCR微 通道之個別段所形成之伸長PCR室，PCR微通道具有由_ 連串寬曲流所形成之彎曲構型’每一寬曲流係形成其中一 個身長PCR室之通道部。 GCF02 7.1 5 較佳地，培養部具有用於加熱遺傳物質 及酵素至預定酵素反應溫度之加熱器元件。 201211540 GCF027.1 6 較佳地，LOC裝置亦具有容納探針之雜 交室陣列，使得各雜交室中的探針係組態成與標靶核酸序 列中之一者雜交。 GCF027.1 7 較佳地，光感測器爲與雜交室配準（ registration)定位之光二極體陣列。 GCF027.1 8 較佳地，CMOS電路具有用於儲存來自 光感測器輸出之雜交資料之數位記憶體以及用於將雜交資 料傳輸至外部裝置之資料界面。 GCF027.1 9 較佳地，PCR部具有於熱循環期間用於 保留液體於PCR部及回應來自CMOS電路之啓動訊號而允 許液體流至雜交室之主動閥。 GCF027.20 較佳地，主動閥爲沸騰引動閥，其具有 彎液面固定器及加熱器，彎液面固定器經組態以固定彎液 面而中止毛細作用驅動之液體流，加熱器係使液體沸騰而 自彎液面固定器釋放彎液面而恢復毛細作用驅動流。 此LOC裝置設計之優點爲，其使用減少堵塞之優於單 純過濾之方法而基於尺寸來分離想要與不想要的樣本成分 。此LO C裝置之藉由序列專一性擴增之優點包括：得自擴 增之靈敏度；大的動態範圍；及針對標靶DNA序列之高專 一性。此LOC裝置設計之優點爲於經控制的條件下進行培 養。 GCF029.1 本發明之此面向提供一種用於生物樣本 之基因分析之晶片上實驗室（LOC )裝置，L0C裝置包含 -22- 201211540 接收樣本的入口； 支撐基板； 複數個試劑貯槽； 透析部，用於使樣本中之大於預定閾限之細胞與較小 組分分離，藉此大於預定閾限之細胞包括含有用於分析之 遺傳物質之標靶細胞； 透析部下游之培養部，培養部係與含有用於與遺傳物 0 質進行酵素反應之酵素的試劑貯槽之一者呈流體連通；以 及 培養部下游之核酸擴增部，用於擴增遺傳物質中的核 酸序列；其中， 透析部、培養部及核酸擴增部均被支撐於支撐基板上 〇 GCF029.2 較佳地，核酸擴增部爲聚合酶鏈反應（ PCR)部。 〇 GCF029.3 較佳地，LOC裝置亦具有光感測器及 PCR部下游之雜交部，雜交部具有用於與樣本中之標靶核 酸序列雜交之探針陣列，探針係組態成與標靶核酸序列雜 交以形成探針-標靶雜交體，其中光感測器係組態成用於 檢測探針-標靶雜交體。 GCF029.4 較佳地，透析部具有與上游端入口呈流 體連通之第一通道、具有與下游端之廢料通道呈流體連通 之第二通道，以及比大於預定閾限之病原體及細胞小之複 數個孔口，第二通道與第一通道係經由孔口而呈流體連通 -23- 201211540 ，使得大於閾限之病原體及細胞保留於第一通道中’而較 小的組分流入第二通道。 GCF029.5 較佳地，第一通道及第二通道係組態成 藉由毛細作用而塡充樣本。 GCF029.6 較佳地，第一通道係組態成藉由毛細作 用而將標靶細胞吸入培養部。 GCF029.7 較佳地，核酸擴增部爲恆溫核酸擴增部 〇 GCF029.8 較佳地，試劑貯槽各具有用於將試劑保 持於其中之表面張力閥，表面張力閥具有彎液面固定器， 彎液面固定器用於固定試劑的彎液面直至與樣本流接觸而 移除彎液面使得試劑自試劑貯槽流出。 GCF029.9 較佳地，LOC裝置亦具有自入口至雜交 部之流動路徑，其中流動路徑係組態成藉由毛細作用自入 口吸引樣本至雜交部。 GCF029.1 0 較佳地，LOC裝置亦具有位於支撐基板 與PCR部之間之CMOS電路，以及溫度感測器，其中CMOS 電路使用溫度感測器輸出來反饋控制PCR部。 GCF029.il 較佳地，PCR部具有PCR微通道，於使 用期間樣本於PCR微通道熱循環以擴增核酸序列，PCR微 通道界定部分的用於樣本之流動路徑並具有橫切流向的小 於1 00,000平方微米的截面積。 GCF029.1 2 較佳地，LOC裝置亦具有至少一個用於 加熱伸長PCR微通道內之核酸序列之伸長加熱器元件’伸 -24 - 201211540 長加熱器元件係平行於PCR微通道而延伸.。 GCF029.1 3 較佳地，PCR微通道的至少一部形成伸 長PCR室。 GCF029.14 較佳地，PCR部具有複數個各由PCR微 通道之個別段所形成之伸長PCR室，PCR微通道具有由一 連串寬曲流所形成之彎曲構型，每一寬曲流係形成其中一 個身長PCR室之通道部。 0 GCF029.1 5 較佳地，培養部具有用於加熱遺傳物質 及酵素至預定酵素反應溫度之加熱器元件。 GCF029.1 6 較佳地，雜交部具有容納探針之雜交室 陣列，使得各雜交室中的探針係組態成與標靶核酸序列中 之一者雜交。 GCF029.1 7 較佳地，其中光感測器爲與雜交室配準 定位之光二極體陣列。 GCF029.1 8 較佳地，CMOS電路具有用於儲存來自 Q 光感測器輸出之雜交資料之數位記憶體以及用於將雜交資 料傳輸至外部裝置之資料界面。 GCF029.1 9 較佳地，PCR部具有於熱循環期間用於 保留液體於PCR部及回應來自CMOS電路之啓動訊號而允 許液體流至雜交室之主動閥。 GCF029.20 較佳地，主動閥爲沸騰引動閥，其具有 彎液面固定器及加熱器，彎液面固定器經組態以固定彎液 面而中止毛細作用驅動之液體流，加熱器係使液體沸騰而 自彎液面固定器釋放彎液面而恢復毛細作用驅動流。 -25- 201211540 此LOC裝置設計之優點爲，其使用減少堵塞之優於單 純過濾之方法而基於尺寸來分離想要與不想要的樣本成分 。此LOC裝置之藉由序列專一性擴增之優點包括：得自擴 增之靈敏度；大的動態範圍；及針對標靶DNA序列之高專 一性。此LOC裝置設計之優點爲於經控制的條件下進行培 養。 GCF03 0.1 本發明之此面向提供一種用於生物樣本 之病原體檢測及基因分析之晶片上實驗室（LOC )裝置， LOC裝置包含： 接收樣本的入口； 支撐基板； 複數個試劑貯槽； 透析部，用於使樣本中之大於預定閩限之病原體及細 胞與較小組分分離，藉此大於預定閩限之病原體及細胞含 有用於分析之遺傳物質； 位於透析部下游之核酸擴增部，用於擴增遺傳物質中 的核酸序列；其中， 透析部及核酸擴增部均被支撐於支撐基板上。 GCF03 0.2 較佳地，核酸擴增部爲聚合酶鏈反應（ PCR)部。 GCF030.3 較佳地，LOC裝置亦具有光感測器及 PCR部下游之雜交部，雜交部具有用於與遺傳物質中之標 靶核酸序列雜交之探針陣列，探針係組態成與標靶核酸序 列雜交以形成探針-標靶雜交體，其中光感測器係組態成 -26- 201211540 用於檢測探針-標靶雜交體。 GCF03 0.4 較佳地，透析部具有與上游端入口呈流 體連通之第一通道、具有與下游端之廢料通道呈流體連通 之第二通道，以及比大於預定閩限之病原體及細胞小之複 數個孔口，第二通道與第一通道係經由孔口而呈流體連通 ，使得大於閾限之病原體及細胞保留於第一通道中’而較 小的組分流入第二通道。 GCF030.5 較佳地，第一通道及第二通道係組態成 藉由毛細作用而塡充樣本。 GCF03 0.6 較佳地，第二通道係組態成藉由毛細作 用而將大於閾限之病原體及細胞吸入核酸擴增部。 GCF03 0.7 較佳地，核酸擴增部爲恆溫核酸擴增部 〇 GCF03 0.8 較佳地，試劑貯槽各具有用於將試劑保 持於其中之表面張力閥，表面張力閥具有彎液面固定器’ Q 彎液面固定器用於固定試劑的彎液面直至與樣本流接觸而 移除彎液面使得試劑自試劑貯槽流出。 GCF030.9 較佳地，LOC裝置亦具有自入口至雜交 部之流動路徑，其中流動路徑係組態成藉由毛細作用自入 口吸引樣本至雜交部。 GCF03 0.1 0 較佳地，LOC裝置亦具有位於支撐基板 與PCR部之間之CMOS電路，以及溫度感測器，其中CMOS 電路使用溫度感測器輸出來反饋控制PCR部。 GCF030.il 較佳地，PCR部具有PCR微通道，於使 -27- 201211540 用期間樣本於PCR微通道熱循環以擴增核酸序列’ PCR微 通道界定部分的用於樣本之流動路徑並具有橫切流向的小 於1 00,000平方微米的截面積。 GCF030.12 較佳地，LOC裝置亦具有至少一個用於 加熱伸長PCR微通道內之核酸序列之伸長加熱器元件’伸 長加熱器元件係平行於PCR微通道而延伸。 GCF03 0.1 3 較佳地，PCR微通道的至少一部形成伸 長PCR室。 GCF030.1 4 較佳地，PCR部具有複數個各由PCR微 通道之個別段所形成之伸長PCR室，PCR微通道具有由一 連串寬曲流所形成之彎曲構型，每一寬曲流係形成其中一 個身長PCR室之通道部。 GCF03 0.1 5 較佳地，PCR微通道之橫切流向的截面 積係小於16,000平方微米。 GCF03 0.1 6 較佳地，雜交部具有容納探針之雜交室 陣列’使得各雜交室中的探針係組態成與標靶核酸序列中 之一者雜交。 GCF03 0.1 7 較佳地，光感測器爲與雜交室配準（ registration)定位之光二極體陣列。 GCF03 0.1 8 較佳地，CMOS電路具有用於儲存來自 光感測器輸出之雜交資料之數位記憶體以及用於將雜交資 料傳輸至外部裝置之資料界面。 GCF03 0.1 9 較佳地’ PCR部具有於熱循環期間用於 保留液體於PCR部及回應來自CMOS電路之啓動訊號而允 28 - 201211540 許液體流至雜交室之主動閥。 GCF030.20 較佳地，主動閥爲沸騰引動閥，其具有 彎液面固定器及加熱器，彎液面固定器經組態以固定彎液 面而中止毛細作用驅動之液體流，加熱器係使液體沸騰而 自彎液面固定器釋放彎液面而恢復毛細作用驅動流。 此LOC裝置設計之優點爲，其使用減少堵塞之優於單 純過濾之方法而基於尺寸來分離想要與不想要的樣本成分 。此LOC裝置設計之優點爲，其濃化待進一步藉L0C裝置 處理之樣本部中分之有效標靶濃度。此LOC裝置之藉由序 列專一性擴增之優點包括：得自擴增之靈敏度；大的動態 範圍；及針對標靶DNA序列之高專一性。 【實施方式】 總論 此總論指明包含本發明之具體實施例之分子診斷系統 Q 之主要組件。於以下說明書中討論系統結構及操作之綜合 細節。 參照圖、1、2、3、99及100，系統具有下列最重要的 組件： 試驗模組10及1 1爲普通USB隨身碟的大小且可便宜製 造。試驗模組1〇及11各含有微流體裝置，其普通呈晶片上 實驗室（LOC )裝置30形式並預載有試劑，且普通具有 1 000個以上之用於分子診'斷分析之探針（見圖1及99)。 圖1中所槪示的試驗模組1 0使用基於螢光之檢測技術以辨 -29- 201211540 識標靶分子，而圖9 9中之試驗模組1 1使用基於電致化學發 光之檢測技術。LOC裝置30具有用於螢光或電致化學發光 檢測之整合的光感測器44 (於以下詳細描述）。試驗模組 10及1 1均使用了用於電力、數據及控制之標準微型-USB接 頭14、均具有印刷電路板（PCB ) 57，及均具有外部供電 之電容器32及感應器15。試驗模組10及1 1均爲僅供大量製 造之單一用途且以可供使用之無菌包裝分銷。 外殻13具有用於接收生物樣本之大容器24及可移除之 無菌密封帶22，其較佳具低黏性黏著劑，以於使用前覆蓋 大容器。具有膜防護件410之膜密封件408形成部份外殼13 以減少試驗模組中之抗濕性，而由小氣壓變動提供釋壓作 用。膜防護件410保護膜密封件408免於損傷。 經由微型-USB埠16，試驗模組閱讀器12供電給試驗模 組10或11。試驗模組閱讀器12可爲許多不同形式，及其選 擇係描述於後。圖1、3及99中所示之閱讀器I2版本爲智慧 型電話之具體實施例。閱讀器1 2之方塊圖係示於圖3中。 處理器42執行來自程式儲存器43的應用軟體。處理器42亦 與顯示螢幕18及使用者界面（UI)觸控螢幕17及按鈕19、 蜂巢式無線電2 1、無線網路連接23，以及衛星導航系統25 界接。蜂巢式無線電2 1及無線網路連接2 3係用於通訊。衛 星導航系統2 5係用於以位置資料更新流行病學資料庫。替 代性地’能夠以觸控螢幕1 7或按鈕1 9人爲輸入位置資料。 資料儲存器27保有遺傳及診斷資訊、試驗結果、患者資訊 '用於識別各探針之分析及探針數據及其陣列位置。資料 -30- 201211540 儲存器27及程式儲存器43可共享於共同記憶體設備。試驗 模組閱讀器12中安裝的應用軟體提供結果分析與另外的試 驗及診斷資訊。 爲執行診斷試驗，將試驗模組1 0 (或試驗模組1 1 )插 入至試驗模組閱讀器12上的微型-USB埠16。將無菌密封帶 22翻起並將生物樣本（呈液體形式）載入至樣本大容器24 中。按下開始按鈕20以藉由應用軟體來起始試驗。樣本流 0 進LOC裝置30且在裝置中分析萃取、培養、擴增及以預合 成的雜交-反應性寡核苷酸探針與樣本核酸（標靶）雜交 。於試驗模組1 0的情況中（其使用基於蛋光的檢測），探 針係經螢光標記且置於殼13中的LED 26提供必要激發光以 誘發自經雜交探針的螢光發射（見圖1及2)。於試驗模組 1 1中（其使用基於電致化學發光（ECL )的檢測），LOC 裝置30載有ECL探針（如上述）且LED 26對於產生光致發 射螢並非必要。反之，電極860及8 70提供激發電流（見圖 〇 100 )。使用與各LOC裝置上之CMOS電路整合的光感測器 44來檢測發射（螢光或光致發光）。擴增所檢測的信號並 將其轉換成藉由試驗模組閱讀器1 2分析之數位輸出。閱讀 器接著顯示結果。 可本地儲存數據及/或將數據上傳至含有患者記錄之 網路伺服器。自試驗模組閱讀器1 2移除試驗模組1 0或1 1並 將彼等適當處理。 圖1、3及99顯示組態成行動電話/智慧型電話28之試 驗模組閱讀器1 2。於其他形式中，試驗模組閱讀器爲醫院 -31 - 201211540 、私人診所或實驗室中使用之膝上型電腦/筆記型電腦101 、專用閱讀器103、電子書閱讀器107、平板電腦1〇9或桌 上型電腦105 (見圖1〇1)。閱讀器可與一些額外的應用程 式界接，諸如病患記錄、帳務、線上資料庫及多使用者環 境。其亦可與一些本地或遠端周邊設備界接，諸如印表機 及病患智慧卡° 參照圖102，透過閱讀器12及網路125，由試驗模組1〇 產生之資料可用來更新用於流行病學資料1 1 1之主機系統 所保有之流行病學資料庫、用於遺傳資料1 1 3之主機系統 所保有之遺傳資料庫、用於電子化健康記錄（EHR ) 1 1 5 之主機系統所保有之電子化健康記錄、用於電子化醫療記 錄（EMR ) 121之主機系統所保有之電子化醫療記錄，以 及用於個人健康記錄（PHR ) 123之主機系統所保有之個 人健康記錄。相反地，經由網路1 2 5及閱讀器1 2 ’用於流 行病學資料1 1 1之主機系統所保有之流行病學資料、用於 遺傳資料1 1 3之主機系統所保有之遺傳資料、用於電子化 健康記錄（EHR ) 115之主機系統所保有之電子化健康記 錄、用於電子化醫療記錄（EMR ) m之主機系統所保有 之電子化醫療記錄，以及用於個人健康記錄（PHR ) 123 之主機系統所保有之個人健康記錄可用以更新試驗模組 LOC 30中之數位記憶體。 再次參照圖1、2、99及1 00，於行動電話組態中，閱 讀器1 2使用電池電力。行動電話閱讀器含有所有預載的試 驗及診斷資訊。經由一些網路或接觸界面亦可載入或上傳 -32- 201211540 資料以致能與週邊裝置、電腦或線上伺服器連通。設置微 型-USB埠16以連接電腦或主要電力供應以再充電電池。 圖7 1顯示試驗模組1 0之具體實施例，其係用於僅需要 得知特定標靶存在與否之試驗，諸如試驗個人是否受到例 如A型流行性感冒病毒H1N1感染。僅作爲內建之僅供USB 電力/指示器之模組47爲適當的。不需要其他閱讀器或應 用軟體。僅供USB電力/指示器之模組47上之指示器45示出 0 正或負結果。此組態非常適於大量篩檢。 供應給系統的額外物件可包括含有供預處理特定樣本 之試劑的試驗管，及包含供樣本收集之壓舌板及刺血針。 爲便利之故，圖71顯示之具體實施例的試驗模組包括有簧 壓式可伸縮刺血針390及刺血針釋出按鈕392。可於遠端地 區使用衛星電話。 試驗模組電子裝置 Q 圖2和1 00分別爲試驗模組1 0和1 1中之電子組件的方塊 圖。整合於LOC裝置30之CMOS電路具有USB裝置驅動器36 、控制器34、USB相容LED驅動器29、時鐘33、功率調節 器3 1、RAM 3 8和程式及資料快閃記憶體40。此等提供用 於包括光感測器44、溫度感測器1 70、液體感測器1 74和各 種加熱器1 5 2、1 5 4、1 8 2、2 3 4之試驗模組1 0或1 1整體以及 關聯的驅動器37和39以及暫存器35和41的控制和記憶體。 僅LED 2 6 (在試驗模組1 0的情況中）、外部電源電容器3 2 和微型-USB接頭14在LOC裝置30的外部。LOC裝置30包括 -33- 201211540 用於連接至這些外部組件的黏合墊。RAM 38及程式和資 料快閃記億體40具有用於超過個探針之應用軟體和診 斷與試驗資訊（快閃/保全儲存’例如經由加密）。在針 對E C L檢測所組態之試驗模組1 1的情況中’無L E D 2 6 (見 圖99和100)。資料由LOC裝置30加密以供保全儲存及與 外部裝置之安全通訊。LOC裝置3 0以電化學發光探針及雜 交室加載，其各具有ECL激發電極對860和8 70。 以一些試驗形式製造許多類型的試驗模組1 〇，其爲準 備好可現成使用者。試驗形式之不同在於機載分析（on board assay)之試劑和探針。 快速以此系統識別的感染性疾病的一些實例包括： • 流行性感冒-流行性感冒病毒A、B、C、傳染性 鮭魚貧血病毒、托高土病毒 • 肺炎-呼吸道融合病毒（RS V )、腺病毒、間質肺 炎病毒、肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌 • 結核病-結核分枝桿菌、牛型分枝桿菌、非洲分 枝桿菌、卡氏分枝桿菌和田鼠分枝桿菌 • 惡性瘧原蟲、弓漿蟲和其他寄生性原生蟲病 • 傷寒-傷寒桿菌 • 依波拉病毒 • 人類免疫不全病毒（HIV ) • 登革熱-黃熱病毒 • 肝炎（A到E ) • 醫源性感染·例如難養芽孢梭菌、抗萬古黴素腸 -34- 201211540 球菌以及抗藥性金黃色葡萄球菌 • 單純泡疹病毒（HSV) • 巨大細胞病毒（CMV ) • 愛彼斯坦-巴爾病毒（EBV ) • 腦炎-日本腦炎病毒、章地埔拉病毒 • 百日咳-百日咳菌 • 麻疹-副黏液病毒 • 腦膜炎-肺炎鏈球菌和腦膜炎雙球菌 • 炭疽病-炭疽桿菌 以此系統識別的遺傳性疾病的一些實例包括： • 囊性纖維變性 • 血友病 • 鐮狀細胞貧血病 • 黑朦性白癡病 • 血色素沉著症 • 腦動脈病 • 克隆氏病 多囊性腎臟病 先天性心臟病 蕾特氏症 由診斷系統識別之癌症的少數選擇包括： 卵巢癌 結腸癌 多發性內分泌腫瘤 -35- 201211540 • 視網膜母細胞瘤 • 透克氏症（Turcot syndrome ) 上述清單並非窮舉的’且診斷系統可經組態以使用核 酸和蛋白質體分析來檢測許多不同疾病以及症狀。 系統組件的詳細結構 LOC裝置 LOC裝置30爲診斷系統之中心。其使用微流體平台快 速實施以核酸爲基之分子診斷分析的四個主要步驟，即樣 本準備、核酸萃取、核酸擴增和檢測。LOC裝置亦具有替 代的用途，並將詳述於下。如上述討論，試驗模組1 0及1 1 可採取許多不同組態以檢測不同的標靶。同樣地，LOC裝 置3 0具有很多針對關注的標靶打造之不同實施例。LOC裝 置30之一種形式爲用於全血樣本之病原體中的標靶核酸序 列之螢光檢測之LOC裝置301。爲了闡述的目的，LOC裝置 301的結構和操作係參考圖4至26及2 7至5 7而詳細描述。 圖4爲LOC裝置301結構之圖式槪要。爲了便利性，顯 示於圖4的處理階段係以相應於實施處理階段之LOC裝置 301的功能部之元件符號表示。與各個以核酸爲基的分子 診斷分析的主要步驟有關的處理階段亦表示：樣本輸入及 製備28 8、萃取290、培養291、擴增292以及檢測294。 LOC裝置3 0 1之各種貯槽、室、閥以及其他組件將於以下 更仔細的描述。 圖5爲LOC裝置301之透視圖。其使用高容積CMOS和 -36- 201211540 MST (微系統技術）製造技術而製造。LOC裝置301之層狀 構造以圖12之槪要部分剖面圖（非按比例）闡述。LOC裝 置301具有支持COM S + MST晶片48之矽基板84，包含CMOS 電路86和MST層87，以蓋46覆蓋MST層87。爲了本專利說 明書目的，術語“MST層”關於以不同試劑處理樣本之結構 和層之集合。因此，這些結構和組件經組態以定義具有特 性尺寸的流動路徑，其支持具處理期間之物理性質與樣本 0 之物理性質相似之毛細作用驅動之液體流。據此，MST層 和組件通常使用面型微加工技術和/或體型微加工技術製 造。然而，其他製造方法亦可製造針對毛細作用驅動之液 體流及加工非常小容積而尺寸化的結構和組件。描述於本 說明書之特定實施例顯示MST層爲支持在CMOS電路86上 之結構和主動組件，但排除蓋46之特徵。然而，熟此技藝 者將理解MST層不需要下方的CMOS或甚至不需要上覆的 蓋來使其處理該樣本。 Q 顯示於下列圖式的LOC裝置之整體尺寸爲1 760微米 χ5824微米。當然，爲了不同應用而製造的LOC裝置可具 有不同的尺寸。 圖6顯示與蓋特徵疊置之MST層87的特徵。顯示於圖6 中之插圖AA至AD、AG和AH個別放大於圖13、14、35、56 、55和63中，且對LOC裝置301內之各個結構的充分了解 詳細描述於下。當圖11獨立顯示CMOS + MST裝置48結構時 ，圖7至10獨立顯示蓋46的特徵。 層狀結構 -37- 201211540 圖12和22爲圖形性顯示CMOS+ MST裝置48、蓋46以及 彼等之間的流體交互作用之層狀構造之略圖。圖式因闡述 目的而未依比例繪製。圖12爲通過樣本入口 68之槪要剖面 圖且圖22爲通過貯槽54之槪要剖面圖。如最佳顯不於圖12 ，CMOS + MST裝置48具有矽基板84，其支持著操作上述 MST層87內之主動元件之CMOS電路86。鈍化層88密封且 保護CMOS層86免於流體流過MST層87。 流體分別流過於蓋層46及MST通道層100中之蓋通道 94及MST通道90兩者（例如見圖7及16)。當在較小的MST 通道90實施生化處理時，細胞輸送發生在於蓋46中製造之 較大的通道94中。細胞輸送通道係按尺寸製作以便能輸送 樣本中之細胞至MST通道90中之預定位置。輸送尺寸大於 2 0微米的細胞（例如，某些白血球）需要通道尺寸大於20 微米，且因此橫切流向的截面積大於400平方微米。特別 在不需要輸送細胞的LOC中的位置之MST通道可以顯著地 較小。 將理解的是蓋通道94和MST通道90爲普通參考且特別 的MST通道90亦可因其特定的功能而爲（例如）經加熱的 微通道或透析MST通道。MST通道90藉由蝕刻通過在鈍化 層88上沉積且以光阻劑圖案化之MST通道層1〇〇而形成。 MST通道90由頂部層66環繞，頂部層形成CMOS + MST裝置 48之頂部（相對於顯示於圖中之方位）。 儘管有時作爲獨立的層顯示，蓋通道層80和貯槽層78 係由單一材料片所形成。當然，材料片亦可爲非單一性。 -38- 201211540 自兩邊蝕刻材料片以形成蓋通道層80與貯槽層78 ’在蓋通 道層80中蝕刻蓋通道94’在貯槽層78中蝕刻貯槽54、56、 58、60和62。替代性地，貯槽和蓋通道由微成形法形成。 蝕刻和微成形技術兩者皆用以製造具有至大爲20,〇〇〇平方 微米且至小爲8平方微米之橫切流向的通道。 於LOC裝置中不同位置有針對橫切流體之通道的截面 積之適當的選擇。其中大量的樣本或具有大組分的樣本係 0 容納於通道中，至多20,000平方微米之截面積（例如，在 100微米厚之層中的2 00微米寬的通道）是適合的。其中少 量的液體或無大細胞存在的混合物係容納於通道中，較佳 者係橫切流體之截面積非常小。 下密封64環繞蓋通道94且上密封層82環繞貯槽54、56 、58 、 60和 62 ° 五個貯槽54、56、58、60和62係預載特定分析之試劑 -於此描述的實施例中，貯槽預載有下列試劑，但可簡易 0 的以其他試劑取代： • '貯槽54 :抗凝血劑，其選擇性包括紅血球溶胞緩 衝液 • 貯槽5 6 :溶胞試劑 * #胃5 8 :限制性酵素、接合酶和聯結子（用於聯 結子引發PCR (見圖69，節錄自丁以⑽⑽et ah，Human

Molecular Genetics 2，Garland Science，NY and London， ( 1 999)) * P _ 60 :擴增混合物（去氧核糖核苷三磷酸 -39- 201211540 (dNTP)、弓I子、緩衝液），以及 • 貯槽62 : DNA聚合酶。 蓋46和CMOS + MST層48經由在下密封64和頂咅層66中 之相應的開口而呈流體連通。依據流體是否自MST通道90 流至蓋通道94或反向而代表開口爲上管道96及下管道92。 LOC裝置操作 LOC裝置301的操作係參考在血液樣本中之分析病原 體（pathogenic) DNA而逐步描述於下。當然，其他生物 或非生物流體的種類亦使用適當的套組或試劑、試驗規程 、LOC變體和檢測系統之組合來分析。參考圖4 ,分析生 物樣本涉及五個主要步驟，包含：樣本輸入和製備288、 核酸萃取290、核酸培養291、核酸擴增292和檢測及分析 294 〇 樣本輸入和製備步驟288係混合血液與抗凝血劑116且 接著利用病原體透析部7〇使病原體與白血球及紅血球分開 。如最佳顯示於圖7和12中者，血液樣本經由樣本入口 68 進入裝置。毛細作用吸引血液樣本沿著蓋通道94而到達貯 槽5 4。當樣本血液流開啓其表面張力閥n 8時，抗凝血劑 自貯槽54釋出（見圖1 5和22 )。抗凝血劑防止形成會阻塞 流動的血凝塊。 如最佳顯示於圖22中者，抗凝血劑116藉由毛細作用 自貯槽54被抽出且經由下管道92進入MST通道90。下管道 92具有毛細作用起始特徵（CIF ) 102以形成彎液面幾何， 使其不固定在下管道9 2的邊緣。當抗凝血劑116自貯槽54 -40- 201211540 被抽出時，在上密封82中之通氣孔122允許空氣取代抗凝 血劑1 1 6。 顯示於圖22之MST通道90爲表面張力閥118的一部分 。抗凝血劑116塡充表面張力閥118且固定至上管道96之彎 液面120於彎液面固定器98。在使用前，彎液面12 0保持固 定於上管道96，使得抗凝血劑不會流入蓋通道94。當血液 流經蓋通道94至上管道96時，移除彎液面120且將抗凝血 0 劑吸入流體中。 圖15至21顯示插圖AE，其爲顯示於圖13之插圖AA之 一部分。如顯示於圖15、16和17中者，表面張力閥118具 有三個分開的MST通道90延伸於個別的下管道92及上管道 96之間。在表面張力閥中之這些MST通道90可變化以改變 進入樣本混合物之試劑的流速。當樣本混合物以及試劑藉 由擴散而混合時，離開貯槽之流速決定在樣本流中之試劑 的濃度。因此，各貯槽的表面張力閥係組態以符合所需之 Q 試劑濃度。 血液通入病原體透析部70 (見圖4和15)，其中使用 根據預定閥値制定大小之孔口 1 64的陣列自樣本濃縮標靶 細胞。小於閥値的細胞通過孔口，而大細胞不能通過孔口 。在標靶細胞持續作爲分析的一部分之同時，非所欲之細 胞重新被導入廢料單元76。非所欲之細胞爲經由孔口 164 陣列阻擋之大細胞或爲通過孔口之小細胞。 在描述於此之病原體透析部70中，來自全血樣本之病 原體被濃縮以供微生物DNA分析。孔口之陣列藉由流體性 -41 - 201211540 連通蓋通道94中之輸入流至標靶通道Μ的多個3微米直徑 的孔口 164所形成。3微米直徑的孔口 164和用於標靶通道 74之透析汲取孔168係由一系列的透析MST通道204連接（ 最佳顯示於圖15和21 )。病原體小到足以經由透析MST通 道204通過3微米直徑孔口 164且塡充標靶通道74。諸如紅 血球和白血球之大於3微米的細胞留在蓋46之廢料通道72 中，蓋通向廢料儲器76 (見圖7)。 其他孔口形狀、大小和長寬比可用以分離特定病原體 或其他標靶細胞，諸如用於人DN A分析的白血球。後面提 供透析部和透析變體之更詳細的詳情。 再次參照圖6和7，流體被吸入通過標靶通道74而到達 溶胞試劑貯槽56中之表面張力閥128。表面張力閥128具有 七個MST通道90延伸於溶胞試劑貯槽56和標靶通道74之間 。當彎液面由樣本流脫除時，所有的七個MST通道90之流 速將大於抗凝血劑貯槽5 4之流速，其中表面張力閥1 1 8具 有三個M S T通道9 0 (假設流體的物理特性爲大致相等的） 。因此在樣本混合物中之溶胞試劑的比例係大於抗凝血劑 之比例。 溶胞試劑和標靶細胞在化學溶胞部1 3 0內之標靶通道 74中藉由擴散而混合。沸騰引動閥1 2 6使流動停止直到擴 散和溶胞進行了足夠的時間，自標耙細胞釋放遺傳物質（ 見圖6和7)。參考圖31和32’於下詳細描述沸騰引動閥之 結構和操作"其他主動閥類型（與被動閥相反’諸如表面 張力閥118)亦已由申請人開發，其可用於此以替代沸騰 -42 * 201211540 引動閥。這些替代閥設計亦描述於下。 當開啓沸騰引動閥126時，經溶胞之細胞流入混合部 13丨以預擴增限制酶剪切（restriction digestion)以及聯結 子接合（linker ligation )。 參考圖13，當流體移除在混合部131起始處之表面張 力閥132上的彎液面時，限制酵素、聯結子和接合酶自貯 槽58釋放。爲了擴散混合，混合物流過混合部131的長度 0 。在混合部131的末端爲通到培養部114之培養器入口通道 133的下管道134 (見圖13)。培養器入口通道133將混合 物饋入經加熱之微通道2 1 0的彎曲構型，其提供在限制酶 剪切以及聯結子接合期間用來保留樣本之培養室（見圖13 及 1 4 )。 圖23、24、25、26、27、28及29顯示在圖6之插圖AB 內的LOC裝置301之層。各圖顯示連續疊加（addition)形 成CMOS+MST層48和蓋46結構之層。插圖AB顯示培養部 〇 1 14的末端和擴增部1 12的起始。如最佳顯示於圖14及23中 者，流體塡充培養部1 1 4之微通道2 1 0直到抵達沸騰引動閥 1 06，其中流體在擴散發生時停止。如上所討論，沸騰引 動閥106上游之微通道210成爲含有樣本、限制酵素、接合 酶和聯結子的培養室。加熱器154接著啓動且維持於穩定 溫度以使限制酶剪切和聯結子接合發生一段特定時間。 熟此技藝者將理解此培養步驟291 (見圖4)爲任意的 且僅爲一些核酸擴增分析類型所需要。再者，在一些例子 中，可能需要在培養期間結束時具有加熱步驟以將溫度增 -43 - 201211540 高到超過培養溫度。在進入擴增部u 2前，溫度增高使限 制酵素和接合酶失活。當使用等溫合酸擴增時，限制酵素 和接合酶的失活具有特定影響。 培養之後，沸騰引動閥1 0 6啓動（打開）且流體再進 入擴增部112。參考圖31及32，混合物塡充經加入微通道 158之彎曲構型直到到達沸騰引動閥108，微通道形成一或 更多擴增室。如最佳顯示於圖30之剖面示意圖，擴增混合 物（dNTP、引子、緩衝液）自貯槽60釋放且聚合酶接著自 貯槽62釋放而進入連接培養部和擴增部（分別爲114及112 )之中間MST通道212。 圖3 5至51顯示在圖6之插圖AC中的LOC裝置3 01之層。 各圖顯示連續疊加形成CMOS + MST裝置48和蓋46結構之層 。插圖AC顯示擴增部112的末端和雜交及檢測部52的起始 。經培養的樣本、擴增混合物和聚合酶流經微通道1 5 8而 至沸騰引動閥1 〇 8。在擴散混合經足夠時間後，啓動在微 通道158中之加熱器154以供熱循環或等溫擴增。擴增混合 物經歷預定數目的熱循環或預設之擴增時間以擴增充分的 標靶DN A。在核酸擴增程序之後，沸騰引動閥108開啓且 流體再進入雜交及檢測部52。沸騰引動閥之操作更詳細描 述於下。 如顯示於圖5 2，雜交及檢測部5 2具有雜交室之陣列 1 10。圖52、53、54及56詳細顯示雜交室陣列1 10和個別雜 交室1 8 0。雜交室1 8 0的入口爲擴散屏障1 7 5，其在雜交期 間防止標靶核酸、探針股和雜交探針於雜交室1 8 0之間擴 -44 - 201211540 散’以防止錯誤的雜交檢測結果。擴散屏障175之流動路 徑長度足夠長以在探針和核酸雜交以及檢測信號的時間內 ’防止標靶序列和探針擴散出一個室且污染另一室，因此 避免錯誤的結果。 另一防止錯誤讀取的機制是在一些雜交室中具有相同 的探針。CMOS電路86自對應於包含相同的探針之雜交室 180之光二極體184導出單一結果。導出的單一結果中之異 0 常的結果可被忽略或給予不同權重。 用於雜交所需的熱能係由CMOS控制的加熱器1 82所提 供（更詳細描述於下）。在啓動加熱器後，雜交發生於互 補標靶探針序列之間。CMOS電路86中之LED驅動器29傳 送訊息使位於試驗模組10中之LED ；26發光。這些探針僅於 當雜交發生時發螢光’從而免除移除未結合的股時經常需 要之清洗和乾燥步驟。雜交強制FRET探針186之莖與環結 構打開’其允許螢光團發射螢光能量以回應led激發光， 〇 詳述於下。螢光由位於各雜交室180下之CMOS電路86中之 光二極體184所檢測（見以下之雜交室的敘述）。用於所 有雜父室之光一極體184以及相關的電子裝置共同形成光 感測器44 (見圖64 )。在其他實施例，光感測器可爲電荷 耦合裝置陣列（C C D陣列）。自光二極體1 8 4所檢測之信 號被放大且轉換成可以由試驗模組閱讀器丨2分析的數位輸 出。檢測方法進一步的細節係描述於下。 LOC裝置之其他詳細說明 -45- 201211540 模組化設計 LOC裝置301具有許多功能部，包括試劑貯槽54、56 、58、60及62、透析部70、溶胞部130、培養部114及擴增 部1 1 2、閥類型、增濕器及濕度感測器。於其他具體實施 例之LOC裝置中，可省略此等功能部，然可附加另外的功 能部或與上述裝置之用途不同的功能部。 例如，可使用培養部1 1 4作爲串接重複序列擴增分析 系統之第一擴增部112，且使用溶胞試劑貯槽56來加入引 子、dNTP及緩衝液的第一擴增混合，並且使用試劑貯槽58 來添加反轉錄酶及/或聚合酶。若樣本需進行化學溶胞’ 亦可添加化學溶胞試劑（連同擴增混合）至貯槽56，或替 代性地，可藉由加熱樣本一段預定的時間以在培養部中發 生熱溶胞。在一些具體實施例中，若需要化學溶胞並使化 學溶胞試劑與此混合分離，可在用於引子、dNTP及緩衝液 的混合之貯槽5 8之毗連上游合倂另外的貯槽。 於一些情況中，欲省略諸如培養步驟29 1之步驟。於 此情況中，可特別地製造LOC裝置以免去試劑貯槽58及培 養部114或是貯槽可僅載有試劑，或存在主動閥時，其不 被啓動來分配試劑至樣本流中’及培養部單純成爲將樣本 自溶胞部130傳送至擴增部112之通道。加熱器係獨立地操 作，因此當反應仰賴熱時’諸如熱溶胞’令加熱器不於此 步驟期間啓動’確保熱溶胞不會發生在不需熱溶胞之LOC 裝置中=透析部7〇可位於微流體裝置內之流體系統的開端 ，如圖4中所示者’或可位於微流體裝置內之任何其他位 -46- 201211540 置。於一些情況中，例如，於擴增階段292之後，雜交及 檢測步驟294之前，進行透析以移除細胞碎片係有利者。 替代性地’可於LOC裝置上任何位置合倂二或多個透析部 。同樣地，可合倂另外的擴增部1 1 2以致能在雜交室陣列 1 1 〇中利用特定核酸探針進行檢測之前之多標靶的同時或 連續擴增。爲分析例如其中不需要進行透析之全血液的樣 本，簡單地於LOC設計之樣本輸入及製備部28 8省略透析 0 部7〇。於一些情況中，即便分析不需要進行透析，不必要 於LOC裝置省略透析部7〇。若透析部的存在不會造成幾何 性阻礙，仍可使用於樣本輸入及製備部具有透析部70之 LOC而不會損失所需之功能。 此外，檢測部294可包括蛋白質體室陣列，其係與雜 交室陣列相同但載有設計成與存在於非擴增之樣本中之蛋 白質共軛或雜交之探針，而不是設計用來與標靶核酸序列 雜交之核酸探針。 Q 將了解的是，爲用於此診斷系統而製造之LOC裝置係 不同於根據特別LOC應用而選擇的功能部之組合。絕大部 分之功能部對於許多LOC裝置而言爲普通，而針對新應用 之額外的LOC裝置之設計，有關於自現存LOC裝置中所使 用之大幅功能部選項中組構適當組合之功能部。 '本說明中僅顯示少數LOC裝置，並顯示一些其他者以 闡述爲此系統所製造之LOC裝置的設計彈性。熟此技藝者 將可輕易地明白本文所示之LOC裝置並非窮舉，且許多另 外的LOC設計係關於組構適當功能部之組合。 -47- 201211540 樣本類型 LOC變體可接受及分析各種呈液體形式之樣本類型之 核酸或蛋白質內容，液體形式包括’但不限於’血液及血 液產物、唾液、腦脊髓液、尿液、精液、羊膜液、臍帶血 、母乳、汗液、肋膜積液、淚液、心囊液、腹腔液、環境 水樣本及飲料樣本。亦可使用LOC裝置分析得自巨觀核酸 擴增之擴增子；於此情況中，所有試劑貯槽將爲空的或是 係組態成不釋出其內容物，並僅使用透析、溶胞、培養及 擴增部來將樣本從樣本入口 6 8傳送至供核酸檢測之雜交室 1 8 0，如上所述。 針對一些樣本類型，需要預處理步驟，例如於輸入至 LOC裝置中之前，可能需要使精液液化及可能需以酵素預 處理黏液以減低黏性。 樣本輸入 參照圖1及12，添加樣本至試驗模組1〇之大容器24。 大容器24爲截錐，其係藉毛細作用而饋入LOC裝置301之 入口 68。於此，其流至64μιη寬χ60μιη深之蓋通道94中並亦 藉由毛細作用而被吸引至抗凝劑貯槽54。 試劑貯槽 使用微流體裝置，諸如LOC裝置3 0 1，之分析系統所 需之小量試劑使得試劑貯槽含有生化處理之所有必須試劑 -48- 201211540 ，且各試劑貯槽爲小體積。此體積確實小於1,〇〇〇,〇〇〇,〇〇〇 立方微米，於絕大多數的情況中係小於300,000,000立方微 米，普通小於70,000,000立方微米，及於圖式中顯示的 LOC裝置3〇1的情況中係小於2〇，〇〇〇,〇〇〇立方微米。 透析部 參照圖15至21、33及34，病原體透析部70係經設計以 0 濃縮來自樣本之病原體標靶細胞。如前述者，頂部層66中 呈直徑爲3微米之孔口 164之複數個孔口，過濾來自大量樣 本之標靶細胞。當樣本流經直徑爲3微米之孔口 1 64，微生 物病原體通過孔而進入一系列透析MST通道204並經由 16μιη透析汲取孔168回流至標靶通道74中（見圖33及34 ) 。剩餘的樣本（紅血球等）滯留於蓋通道94中。於病原體 透析部70之下游，蓋通道94成爲通往廢料儲器76之廢料通 道72。針對產生相當廢物量之生物樣本類型，試驗模組1〇 〇 之外殻13內之泡沬體（foam )插圖或其他多孔元件49係組 態成與廢料儲器76呈流體連通（見圖1 )。 病原體透析部70係皆以流體樣本之毛細作用運作。位 於病原體透析部70上游端之直徑爲3微米之孔口 164具有毛 細作用起始特徵（CIF ) 166 (見圖33 )，以致流體被向下 拉至下方的透析MST通道204之中。用於標靶通道74之第 一汲取孔1 9 8亦具有C IF 2 0 2 (見圖1 5 )以防止流體輕易地 固定彎液面於透析汲取孔168之上。 於圖75中槪要顯示之小組分透析部682可具有類似於 -49- 201211540 病原體透析部70之結構。藉由尺寸化（且成形’若必要） 適於允許小標靶細胞或分子通向標靶通道並繼續進一步分 析之孔口，小組分透析部分離來自樣本之任何小標靶細胞 或分子。大尺寸的細胞或分子被移除至廢料儲器766。因 此，LOC裝置30 (見圖1及109)並不受限於分離尺寸小於 3 μπι之病原體，而可用於分離任何所欲尺寸之細胞或分子 溶胞部 再次參照圖7、11及13，藉化學溶胞處理，樣本中之 遺傳物質自細胞釋出。如上述者，來自溶胞貯槽5 6之溶胞 試劑與用於溶胞貯槽56之表面張力閥128下游之標靶通道 74中流動的樣本混合。然而，一些診斷分析較佳使用熱溶 胞處理，或甚至是標靶細胞之化學及熱溶胞的組合。LOC 裝置301容納此及培養部114之加熱的微通道210。樣本流 塡充培養部114並停止於沸騰引動閥106。培養微通道210 將樣本加熱至細胞膜破裂之溫度。 於一些熱溶胞應用中，化學溶胞部130中不需要酵素 反應，且熱溶胞全然取代化學溶胞部130中之酵素反應。 沸騰引動閥 如以上討論者，LOC裝置301具有三個沸騰引動閥126 、106及108。於圖6中顯示這些閥的位置。圖31爲擴增部 11 2之加熱的微通道158側之獨立的沸騰引動閥108之放大 的平面圖。 -50- 201211540 藉由毛細作用，樣本流1 19沿加熱的微通道158被吸引 直至到達沸騰引動閥108爲止。樣本流之前沿的彎液面12〇 固定於閥入口 146之彎液面固定器98。彎液面固定器98幾 何使彎液面停止前進而阻止毛細作用流。如圖3 1及3 2中所 示者，彎液面固定器98係藉由自MST通道9〇至蓋通道94之 上管道開口而設置之孔口上管道。彎液面120之表面張力 使閥保持閉合。環形加熱器152位於閥入口 146的周圍。環 0 形加熱器152經由沸騰引動閥加熱器接點153而受CMOS控 制。 爲打開閥，CMOS電路86發送電脈衝至閥加熱器接點 153。環形加熱器152電阻式地進行加熱直到液體樣本1 19 沸騰爲止。沸騰使彎液面120自閥入口 146脫除並開始濕潤 蓋通道94。一但開始濕潤蓋通道94，毛細作用恢復。流體 樣本119塡充蓋通道94且流經閥下管道150而至閥出口 148 ，其中毛細作用驅動之液體流沿擴增部出口通道1 60前進 Q 至雜交及檢測部52之中。液體感測器174置於用於診斷的 閥之前及之後。 將能了解的是，一但沸騰引動閥被打開，則不可能再 關上。然而，因LOC裝置301及試驗模組1〇爲單一用途裝 置，不需要再關閉閥。 培養部及核酸擴增部 圖 6、7、13、14、23、24、25、35 至 45、50 及 51 顯示 培養部1 1 4及擴增部1 1 2。培養部1 1 4具有單一的、加熱的 -51 - 201211540 培養微通道2 1 0，其係經蝕刻而成爲自下管道開口 i 3 4至沸 騰引動閥106之MST通道層1〇〇中的蜿蜒圖案（見圖13及14 )。控制培養部Π 4的溫度致能更有效的酵素性反應。同 樣地，擴增部1 1 2具有從沸騰引動閥1 〇6通向沸騰引動閥 108之呈彎曲構型之加熱的擴增微通道158 (見圖6及14) 。於混合、培養及核酸擴增發生時，此等閥中止流動以將 標靶細胞保留於加熱的培養或擴增微通道210或158中。微 通道之蜿蜒圖案亦促進（在某種程度上）標靶細胞與試劑 混合。 於培養部11 4及擴增部112中，樣本細胞及試劑經由使 用脈衝寬度調變（PWM)之CMOS電路86所控制的加熱器 154而被加熱。加熱的培養微通道210及擴增微通道158之 彎曲構型之每一個曲折具有三個獨立地可操作加熱器154 (延伸於彼之個別加熱器接點1 5 6之間（見圖1 4))’其提供 輸入熱通量密度之二維控制。如最佳顯示於圖5 1中者，加 熱器154係支撐於頂部層66上並埋入下密封64中。加熱器 材料爲TiAl，但許多其他的傳導性金屬也適用。伸長加熱 器154平行於形成蜿蜒狀的寬曲流之各通道部的縱向長度 。於擴增部11 2中，經由個別加熱器控制，可操作每一寬 曲流以作爲獨立的PCR室。 使用微流體裝置，諸如LOC裝置301，之分析系統所 需之小體積的擴增子允許於擴增部1 1 2中擴增使用小體積 的擴增混合物。此體積大槪小於4 0 0奈升’於絕大多數情 況中小於1 7 0奈升，普通小於7 〇奈升’及於L 0 C裝置3 0 1的 -52- 201211540 情況中，此體積係介於2奈升與30奈升之間》 加熱速率增加及較佳擴散混合 各通道部的小截面積增加擴增流體混合物的加熱速率 。所有流體與加熱器154保持相當短的距離。減少通道截 面積（即擴增微通道158截面）至小於1 00,000平方微米， 而較“大規模”設備具有顯著較高之加熱速率.。微影製造技 術使得擴增微通道158具有小於1 6,000平方微米之橫切流 向實質上提供較高的加熱速率之截面。以微影製造技術輕 易地獲致1微米級尺寸特徵。若僅需要非常小量的擴增子 (如LOC裝置301中的情況），可使截面縮小至小於2,500 平方微米。針對以LOC裝置上之1,000至2,000個探針進行 且於1分鐘內之“樣本入，答案出”所需之診斷分析，橫切 流體之適當的截面積爲400平方微米及1平方微米之間。 擴增微通道158中之加熱器元件以每秒大於80絕對溫 £.....| 度（K )之速率加熱核酸序列，於大多數的情況中爲每秒 大於100 K之速率。普通地，加熱器元件以每秒大於10 00 K之速率加熱核酸序列，以及於許多情況中，加熱器元件 以每秒大於1 0000 K之速率加熱核酸序列。通常，基於分 析系統的需求，加熱器元件以每秒大於1 00,000 K、每秒 大於1，000,000 K、每秒大於10,000,000 K、每秒大於 20.000. 000 κ、每秒大於40,000,000 K、每秒大於 80.000. 000 K及每秒大於1 60,000,000 K之速率加熱核酸序 列。 -53- 201211540 小截面積通道亦有益於任何試劑與樣本流體之擴散性 混合。於擴散性混合完成之前，靠近兩液體間之界面處， 一種液體擴散至另一液體之擴散現象最顯著。現象發生密 度隨遠離界面距離而減少。使用具相當小截面積之橫切流 體方向之微通道，而保持兩流體靠界面流動以快速擴散混 合。縮小通道截面至小於1 00,000平方微米，獲致較“大規 模”設備具有顯著較高之擴散速率。微影製造技術使得微 通道具有小於16000平方微米之橫切流向的實質上提供較 高的混合速率之截面。若僅需要非常小量的擴增子（如 LOC裝置301中的情況），可使截面縮小至小於2,500平方 微米。針對以LOC裝置上之1,000至2,000個探針進行且於1 分鐘內之“樣本入，答案出”所需之診斷分析，橫切流體之 適當的截面積爲400平方微米及1平方微米之間。 短的熱循環時間 使樣本混合物保持接近加熱器且使用極小流體量，致 使核酸擴增法期間之快速熱循環。針對至高1 5 0鹼基對（ bp )長之標靶序列，於3 0秒內完成各個熱循環（即，變性 、黏著及引子延伸）。在絕大多數之診斷分析中，個別熱 循環時間小於1 1秒，且大部分小於4秒。針對至高1 5 0鹼基 對（bp)長之標靶序列，用於一些最常見診斷分析之l〇C 裝置3 0的熱循環時間爲〇 · 4 5秒至1 · 5秒之間。此速度之熱循 環使得試驗模組能在遠少於1 0分鐘之內完成核酸擴增程序 ;經常爲2 2 0秒之內。針對大多數分析，擴增部於8 〇秒之 -54- 201211540 內由進入樣本入口的樣本流體產生充足的擴增子。針對大 部分的分析，於30秒內產生充足的擴增子。 於完成預定數目擴增循環時，經由沸騰引動閥108將 擴增子饋入雜交及檢測部52。 雜交室 圖52、53、54、56及57顯示雜交室陣列110中的雜交 0 室180。雜交及檢測部52具有雜交室180之24 X 45陣列1 10 ，其各具有雜交-反應性FRET探針186、加熱器元件182及 整合的光二極體1 84。倂入光二極體1 84以檢測得自標靶核 酸序列或蛋白質與FRET探針186雜交之螢光。藉由CMOS 電路86獨立地控制各光二極體184。對發射的光而言， FRET探針186及光二極體184之間的任何物質必須爲透明 。因此，探針186及光二極體184之間的壁部97亦必須對發 射的光呈光學透明。於LOC裝置301中，壁部97爲二氧化 Q 矽之薄層（約0.5微米）。 於各雜交室180之下直接地倂入光二極體184允許使用 極小體積之探針-標靶雜交體，卻仍產生可檢測的螢光信 號（見圖54)。因爲小量而能使用小體積的雜交室。於雜 交之前，可檢測的探針-標靶雜交體的量所需之探針量大 槪小於270微微克（piCOgram )(對應至900,000立方微米 )，於大多數的情況中小於60微微克（對應至200,000立 方微米），普通小於12微微克（對應至4〇,〇〇〇立方微米） ，並且於附圖中所示之LOC裝置3 0 1的情況中爲小於2 · 7微 -55- 201211540 微克（對應至體積爲9,000立方微米之室）。當然’縮小 雜交室的尺寸容許較高的室密度及因此更多的LOC裝置上 的探針。於LOC裝置301中’於1,500微米乘1，500微米的面 積內，雜交部具有超過1，〇〇〇個室（即，每個室小於2,250 平方微米）。較小的體積亦減少反應時間，使得雜交及檢 測更快速。各個室需求之小量探針的另一優點爲’ ML0C 裝置製造期間，僅需要配置極小量的探針溶液至各個室中 。根據本發明之LOC裝置之具體實施例可配置有1奈毫升 或更少之探針溶液。 於核酸擴增之後，沸騰引動閥1 〇8被啓動且擴增子沿 流動路徑176流動並流進各雜交室180 (見圖52及56)。端 點液體感測器178指示雜交室180塡充有擴增子及可啓動加 熱器1 8 2之時點。 於充分雜交時間後，啓動LED 26 (見圖2 )。各雜交 室180中之開口設有光學窗136以將FRET探針1 86暴露於激 發輻射（見圖52、5 4及56) 。LED 26發光持續充分長的時 間以誘發自探針之高強度的螢光信號。於激發期間，光二 極體184短路（shorted)。經預編程延遲300 (見圖2)之 後，於無激發光下，致能光二極體1 84及檢測螢光發射。 將光二極體184之主動區1 85上之入射光（見圖54 )轉換成 可使用CMOS電路86測量之光電流。 各雜交室1 8 0載有用於檢測單一標靶核酸序列之探針 。若希望，則各雜交室180可載有檢測超過1，〇〇〇種不同標 靶的探針。替代性地，許多或全部雜交室可載有重複地檢 -56- 201211540 測相同標靶核酸之相同探針。於雜交室陣列1 1 〇中以此方 式複製探針使得所得結果之可信度增加，以及若希望，可 藉由相鄰雜交室之光二極體來合倂所有結果以得到單一結 果。熟此技藝者將了解，依據分析明細，於雜交室陣列 110上可具有1至超過1,000種不同的探針。 增濕器及濕度感測器

0 圖6的插圖AG指示增濕器196的位置。增濕器免於LOC 裝置3 0 1操作期間之試劑及探針的蒸發。如最佳顯示於圖 55之放大圖中者，水貯槽188係流體地連接至三個蒸發器 1 90。水貯槽1 8 8塡充有分子生物等級用水且於製造期間爲 密封的。如最佳顯示於圖5 5及6 8中者，藉由毛細作用，水 被抽拉至三個下管道194且沿著個別水供應通道192而到達 蒸發器190之三個上管道193組。彎液面固定於各個上管道 193以保持水。蒸發器具有環形加熱器191，其環繞上管道 〇 193。藉由導熱柱3：76，環形加熱器191係連接至CMOS電路 86而至頂金屬層195 (見圖37)。於啓動時，環形加熱器 1 9 1加熱水而致使水蒸發並濕潤周圍的裝置。 於圖6中亦顯示濕度感測器2 3 2的位置。然而，最佳如 顯示於圖63中之插圖AH的放大圖者，濕度感測器具有電 容式梳狀結構。經微影地蝕刻之第一電極296及與經微影 地蝕刻之第二電極29 8彼此相對，使得彼等之齒交插。相 對的電極形成電容器，其具有可藉由CMOS電路86來監測 之電容。隨濕度增加，電極間之空氣隙的介電常數增加， -57- 201211540 致使電容亦增加。濕度感測器23 2鄰接雜交室陣列110 (最 主要之濕度測量位置），以減緩含有暴露的探針之溶液蒸 發。 反饋感測器 溫度及液體感測器係倂入LOC裝置3 0 1整體以於裝置 操作期間提供反饋及診斷。參照圖35，將九個溫度感測器 17〇分配至擴增部112之全部。同樣地，培養部114亦具有 九個溫度感測器170。這些感測器各使用2x2陣列之雙極接 面電晶體（BJT)以監測流體溫度及提供反饋至CMOS電路 86。CMOS電路86利用此以準確地控制核酸擴增期間的熱 循環以及熱溶胞及培養期間之任何加熱。 於雜交室180中，CMOS電路86使用雜交加熱器182作 爲溫度感測器（見圖56 )。雜交加熱器1 82之電阻係溫度 相依，且CMOS電路8 6利用此以驅動各雜交室180之溫度讀 取。 LOC裝置301亦具有一些MST通道液體感測器174及蓋 通道液體感測器208。圖35顯示於經加熱的微通道158中之 每間隔曲折之一端的MST通道液體感測器174之線。最佳 如顯示於圖37中者，MST通道液體感測器174爲藉由CMOS 結構86中之頂金屬層195之暴露的區域所形成之一對電極 。液體封閉電極間的電流以指示其存在於感測器的位置。 圖25顯示蓋通道液體感測器208之放大透視圖。相對 的TiAl電極對21 8及220係沉積於頂部層66上。電極21 8及 -58- 201211540 22 0之間爲間隙222，以於缺少液體的情況中保持電路爲開 路。液體存在時使電路閉合及CMOS電路86利用此反饋以 監測流動。 重力自主（GRAVITATIONAL INDEPENDENCE) 試驗模組10爲方向自主。其不需被緊固至平穩表面而 操作。因毛細作用驅動之流體流以及缺少至輔助設備之外 0 部管路，使得模組確實爲可攜式並可簡易地插入至類似的 可攜式手持閱讀器，諸如行動電話。重力自主操作代表試 驗模組亦加速度性地獨立於所有實用範圍。其耐衝擊及振 動並能於移動的載具上或是於攜帶的行動電話上操作。 透析變體 白血球標靶 上述之LOC裝置301中的透析設計以病原體爲標靶。 Q 圖64爲供人類DNA分析之用以從血液樣本濃縮白血球而設 計之透析部3 28的截面示意圖。除了以7.5微米直徑之孔 165形式的孔口來限制白血球以免其自蓋通道94通至透析 M ST通道204之外，將理解其結構基本上和上述之病原體 標靶透析部70之結構相同。於待分析之樣本爲血液樣本且 存在來自紅血球之血紅素而干擾後續的反應步驟之情況下 ，添加紅血球溶胞緩衝液和抗凝劑於貯槽54中（見圖22 ) 將確保大多數經溶胞之紅血球（及血紅素）將在透析步驟 期間自樣本移除。一般使用之紅血球溶胞緩衝液爲0.1 5Μ -59- 201211540 NH4CL、10mM KHC〇3 ' O.lmM EDTA « pH 7.2-7.4，但熟 習此技藝人士將了解可使用有效溶胞紅血球之任何緩衝液 〇 白血球透析部328、蓋通道94之下游成爲標靶通道74 ，使得白血球接續成爲分析的一部分。再者，在這種情況 下，透析汲取孔168通向廢料通道72，以使樣本中之所有 較小細胞和組成被移除。應注意的是，此透析變體僅減少 標靶通道74中之非所欲之試樣的濃度。 圖76槪略地顯示大組分透析部686，其亦將任何大標 靶組分和樣本分開。爲進一步分析，以大小和形狀經修改 成可阻擋在標靶通道中所關注之大標靶成分的方式製造此 透析部中的孔口。同上述之白血球透析部，大部分（但非 全部）之較小尺寸的細胞、有機體或分子流入廢料貯槽 7δ8。因此’ LOC裝置之其他具體實施例不受限於分離尺 寸大於7.5微米之白血球，但可用以分離任何所欲尺寸之 細胞、有機體或分子。

核酸擴增變體 直接PCR 傳統上’於製備反應混合物之前，PCR需要大量純化 標靶DNA。然而’適當地改變化學及樣本濃度，可利用最 少量的DNA純化實施核酸擴增，或進行直接擴增。當以 PCR進行核酸擴增時，此方法便稱做直接pcR。於L〇C裝 置中經控制的於常溫下實施核酸擴增時，此方法爲直接恆 -60- 201211540 溫擴增。當用於LOC裝置時，尤其是關於所需流體設計的 簡化時，直接核酸擴增技術具相當多的優勢。直接PCR或 是直接恆溫擴增之擴增化學調整包括增加緩衝液強度、使 用高活性及高進行性之聚合酶及與潛在聚合酶抑制劑螯合 之添加物。稀釋樣本中之抑制劑亦爲重要的。 爲利用直接核酸擴增技術，LOC裝置設計倂入兩個額 外的特徵。第一特徵爲試劑貯槽（例如，圖8中的貯槽5 8 0 )，其經適當地尺寸化以供應充分量之擴增反應混合或稀 釋劑，使得可能影響擴增化學之樣本成分的最終濃度足夠 低以成功地進行核酸擴增。非細胞樣本成分的所欲稀釋度 爲5倍至20倍。當適度確認標靶核酸序列的濃度被維持於 足夠高以用於擴增及檢測時，使用不同的LOC結構，例如 圖4中的病原體透析部70。於此具體實施例中（進一步於 圖6中說明），於樣本萃取部2 90之上游使用有效地濃縮足 夠小而得以進入擴增部292之病原體的濃度並將較大細胞 Q 排出至廢料容器76之透析部。於另外的具體實施例中，使 用透析部以選擇性地去除血漿中之蛋白質及鹽而保留關注 的細胞。 支持直接核酸擴增之第二LOC結構性特徵爲設計通道 的深寬比以調整樣本及擴增混合成分之間的混合比。例如 ，爲確保經由單一混合步驟之相關於樣本之抑制劑的稀釋 爲較佳的5倍-20倍範圍中，設計樣本及試劑通道之長度與 截面，以使混合起始位置之上游的樣本通道構成之流組抗 較試劑混合物流動之通道的流組抗高出4倍-19倍。經由控 -61 - 201211540 制設計幾合而容易地控制微通道中之流組抗。針對恆定截 面積，微通道之流組抗隨通道長度而線性地增加。對於混 合設計而言爲重要的是，微通道中之流組抗較多取決於最 小截面積尺寸。例如，當深寬比極爲不均一時，方形截面 之微通道的流組抗與最小垂直尺寸之立方成反比。 反轉錄酶PCR ( RT-PCR) 當分析或萃取之樣本核酸種類爲RNA時，諸如來自 RNA病毒或信使RNA，於PCR擴增之前必須先將RNA反轉 錄爲互補DNA ( cDNA )。可於與PCR相同之室中實施反轉 錄反應（一步驟RT-PCR )，或是其可爲分別的起始反應 (二步驟RT-PCR)。於此所述之LOC變體中，可藉由添加 反轉錄酶及聚合酶至試劑貯槽62以及程式化加熱器154以 先循環反轉錄步驟並接續進行核酸擴增步驟，而簡單地實 施一步驟RT-PCR。藉由利用試劑貯槽58來儲存及分配緩 衝液、引子' dNTP及反轉錄酶，以及利用培養部1 14以用 於反轉錄步驟，接著於擴增部112中以普通方式進行擴增 ，亦可簡單地完成二步驟RT-PCR。 恆溫核酸擴增 針對一些應用，較佳之核酸擴增方法爲恆溫核酸擴增 ’因此不需於各種溫度循環重複地循環反應成分，而是將 擴增部維持於常溫下，普通爲約37。(：至41 已描述一些 恆溫核酸擴增方法，包括股取代擴增（SDA )、轉錄介導 -62- 201211540 擴增（ΤΜΑ )、依賴核酸序列擴增（NASBA )、重組酵素 聚合酶擴增（RPA )、解旋恆溫DNA擴增（HDA )、滾動 循環擴增（RCA )、分枝型擴增（RAM )及環形恆溫擴增 (LAMP )，以及此等之任何或其他恆溫擴增方法可特別 用於本文之LOC裝置之具體實施例中。 爲實施恆溫核酸擴增，鄰接擴增部之試劑貯槽60及62 將載有用於特定恆溫方法之適當的試劑而不是載有PCR擴 0 增混合及聚合酶。例如，針對SDA，試劑貯槽60含有擴增 緩衝液、引子及dNTP，以及試劑貯槽62含有適當的核酸內 切酶及外切-DNA聚合酶。針對RP A，試劑貯槽60含有擴增 緩衝液、引子、dNTP及重組酶蛋白，及試劑貯槽62含有股 取代DNA聚合酶，諸如。同樣地，針對HDA，試劑貯 槽60含有擴增緩衝液、引子及dNTP，以及貯槽62含有適當 的DN A聚合酶及解旋酶（而非使用熱）以解開雙股DN A。 熟此技藝者將了解以任何適用於核酸擴增法之方式，可將 Q 必要試劑分配於兩個試劑貯槽。 針對自RNA病毒，諸如HIV或C型肝炎病毒之病毒核酸 的擴增，NASBA或TMA係適當的因其不需先將RNA轉錄成 cDNA。於此實例中，試劑貯槽60塡充有擴增緩衝液、弓| 子及dNTP，以及試劑貯槽62塡充有RNA聚合酶、反轉錄酶 及任意的RNase Η。 針對一些恆溫核酸擴增類型，於維持恆溫核酸擴增之 溫度以利反應續行之前’必須採用初始變性循環以分開雙 股DNA模板。因可藉擴增微通道158中之加熱器15 4嚴密地 -63- 201211540 控制擴增部II2中之混合的溫度，於本文中描述之LOC裝 置之所有具體實施例中均可輕易完成此變性循環（見圖14 )° 恆溫核酸擴增對於樣本中潛在的抑制劑之耐受性較高 ，因而通常適用於自所欲樣本之直接核酸擴增。因此，恆 溫核酸擴增尤其有用於分別顯示於圖77、78及8〇中之LOC 變體 XLIII 673、LOC 變體 XLIV 674 及 LOC 變體 XLVII 677 。直接恆溫擴增亦可與如圖77及80中所示之一或多個預擴 增透析步驟70、686或682及/或如圖78中所示之預-雜交透 析步驟682組合，以分別於核酸擴增之前有助於樣本中之 標靶細胞的部份濃縮或是於樣本進入雜交室陣列110前移 除不想要的細胞碎片。熟此技藝者將了解可使用預-擴增 透析及'預-雜交透析之任何組合。 亦可以平行的擴增部，諸如，圖72、73及74中所槪述 者，實施恆溫核酸擴增。多工及一些恆溫核酸擴增方法， 諸如LAMP，係與初始反轉錄步驟相容以擴增RNA。 螢光檢測系統之另外的細節 圖58及59顯示雜交-反應性FRET探針23 6。此等經常被 稱爲分子信標及係爲由單股核酸產生之莖-及-環探針，並 於與互補核酸雜交時發螢光。圖58顯示於與標靶核酸序列 238雜交之前之單一 FRET探針236。探針具有環240、莖 242、於^端之螢光團246及於3’端之淬熄劑248。環240包 含與標靶核酸序列238互補之序列。探針序列兩側的互補 -64- 201211540 序列黏著在一起以形成莖2 4 2。 於缺少互補標耙序列時，如圖5 8中所示者，探針維持 閉合。莖242保持螢光團-淬熄劑對彼此相當接近，使得大 量的共振能量可於彼此間傳輸，而當以激發光2 4 4照射時 實質地消除螢光團發螢光團的能力。 圖59顯示呈開放或經雜交組態的FRET探針236。於與 互補標靶核酸序列23 8雜交時，莖-及-環結構被破壞，螢光 0 團及淬熄劑於空間上分離，因此恢復螢光團2M發螢光的 能力。光學檢測地螢光發射250以作爲探針已雜交的指標 〇 探針以極高專一性與互補標靶雜交，因探針之莖螺旋 係設計成較具單一不互補核苷酸之探針-標靶螺旋穩定。 因雙股DN A相對堅固’立體上探針-標靶螺旋與莖螺旋不 可能共存。 Q 引子·聯結的探針 引子-聯結的莖-及-環探針及引子-聯結的線性探針， 亦稱作蠍子型探針，爲分子信標之替代物且可用於LOC裝 置之即時及定量核酸擴增。即時擴增可直接實施於L〇C裝 置之雜交室中。使用引子-聯結的探針之優點爲探針元件 實體地聯結至引子，因此於核酸擴增其間僅需單次雜交而 不需要分別的引子雜交及探針雜交。此確保即時有效地反 應並產生更強的信號 '更短的反應時間，且當使用分別的 引子及探針時具有更佳的識別度。於製造期間，探針（與 -65- 201211540 聚合酶及擴增混合）將沉積於雜交室180中且不需L〇C裝 置上之獨立的擴增部。替代性地，擴增部未被使用或用於 其他反應。 引子-聯結的線性探針 圖81及82分別顯示首輪核酸擴增期間之引子-聯結的 線性探針692及於後續核酸擴增期間之雜交的組態。參照 圖8 1，引子-聯結的探針692具有雙股莖區段2 42。其中一 股結合引子聯結的探針序列696，其係與標靶核酸696上的 區域同源且以螢光團246標記其5’端，以及經由擴增阻斷物 694聯結其3 '端至寡核苷酸引子700。以淬熄劑部分248標記 莖2 42之另外一股的3’端。於完成首輪核酸擴增之後，利用 目前爲互補的序列698，探針可環繞且雜交至延伸的股。 於首輪核酸擴增期間，寡核苷酸引子700黏著至標靶DNA 238 (圖81)並接著延伸而形成含有探針序列及擴增產物 兩者之DN A股。擴增阻斷物694防止聚合酶之讀取通過及 拷貝探針區域696。於接續的變性時，雜交之延伸的寡核 苷酸引子700/模板及引子-聯結的線性探針之雙股莖242分 離，因此釋出淬熄劑248。一但用於黏著及延伸步驟的溫 度降低，引子聯結的線性探針之引子-聯結的探針序列696 捲曲並與延伸的股上之擴增的互補序列6 9 8雜交’以及檢 測出的螢光指出標靶DNA存在。未延伸的引子-聯結的線 性探針保留其雙股莖且螢光保持淬熄。此檢測方法特別適 於快速檢測系統，因其依賴單一分子製程。 -66 - 201211540 引子-聯結的莖-及-環探針 圖83 A至8 3 F顯示引子-聯結的莖-及-環探針7〇4之操作 。參照圖83 A，引子-聯結的莖-及-環探針704具有互補雙 股DNA之莖242及合倂探針序列的環240。以螢光團246標 記其中一個莖股708之Y端。以3’-端淬熄劑248標記另一股 710，且另一股710帶有擴增阻斷物694及寡核苷酸引子700 0 兩者。於初始變性相（見圖83B)，標靶核酸238之股及引 子·聯結的莖242分開莖-及-環探針704。當溫度冷卻以用於 黏著相時（見圖83C)，引子-聯結的莖-及-環探針7〇4上之 寡核苷酸引子7 0 0與標靶核酸序列2 3 8雜交。於延伸期間（ 見圖83D)，合成標靶核酸序列23 8之互補706以形成含有 探針序列及擴增的產物兩者之DN A股。擴增阻斷物694 防止聚合酶之讀取通過及拷貝探針區域704。變性之後， 當接著黏著探針時，引子-聯結的莖-及-環探針之環區段 〇 240之探針序列（見圖83F )黏著至延伸的股上之互補序列 7 06。此組態使得螢光團246與淬熄劑248相距甚遠，造成 螢光發射的顯著增強。 對照探針

雜交室陣列11 0包括具有用於分析品質控制之陽性及 陰性對照探針之一些雜交室180。圖95及96槪要說明無螢 光團796之陰性對照探針，以及圖97及98描述無淬熄劑798 之陽性對照探針。陽性及陰性對照探針具有如前述FRET -67- 201211540 探針之莖-及-環結構。然而，不論探針雜交成爲開放組態 或保持封閉，將永遠自陽性對照探針798發射螢光信號250 且陰性對照探針79 6從不發射螢光信號250。 參照圖95及96，陰性對照探針796不具螢光團（及可 具有或不具有淬熄劑248 )。因此，不論標靶核酸序列238 與探針雜交（見圖96 )或是探針保持其莖-及-環組態（見 圖95 )，可忽略對激發光244之回應。替代性地，可設計 陰性對照探針796使得其永遠保持淬熄。例如，藉由合成 環240而得到將不會與所硏究的樣本中之任何核酸序列雜 交之探針序列，探針分子之莖242將與其自身重新雜交， 及螢光團及淬熄劑將保持緊密相鄰且將不會發射可見的螢 光。此負控制信號對應於來自雜交室180的低階發射，於 雜交室1 80中探針未經雜交但是淬熄劑未淬熄來自報導劑 的所有發射。 相反地，建構無淬熄劑之陽性對照探針798，如圖97 及98中所示者。回應激發光244，不論陽性對照探針798是 否與標靶核酸序列238雜交，無物質使來自螢光團246之螢 光發射2 5 0淬熄。 圖52顯示雜交室陣列1 1 0中的陽性及陰性對照探針（ 分別爲3 7 8及3 8 0 )之可行分佈。對照探針3 7 8及3 8 0係置於 雜交室180中並定位成橫切雜交室陣列110之線。然而，陣 列內之對照探針的配置係任意的（如同雜交室陣列1 1 〇之 組態）。 -68- 201211540 螢光團設計 需要具長螢光壽命之螢光團以允許激發光具足夠時間 以衰變至較致能光感測器44時之螢光發射的強度爲低之強 度’藉此提高充分的信號對雜訊比。而且’較長的螢光壽 命代表較大之整合的螢光子計數。 螢光團246 (見圖59)之螢光壽命大於1〇〇奈秒、經常 大於200奈秒、更常見爲大於3〇〇奈秒，以及於大多數的情 0 況中爲大於400奈秒。 以過渡金屬或鑭系金屬爲底的金屬_配位子錯合物具 長壽命（自數百奈秒至毫秒）、適當的量子產率’以及高 熱、化學及光化學穩定性’此等特性均爲相關於螢光檢測 系統需求之有利特性。 以過渡金屬離子釕（Ru(ii))爲底之經特別地徹底硏 究之金屬-配位子錯合物爲參（2,2’-聯吡啶）釕（11)( [Ru(bpy)3]2 + )，彼之壽命爲約Ιμβ。此錯合物可購自 C) Biosearch Technologies，其商品名爲 Pulsar 650。

表1 : Pulsar 650(釕螫合物）之光i 防理性質 參數 符號 値 單元 吸收波長 ^abs 460 nm 發射波長 λβτη 650 nm 吸光係數 Ε 14800 M.W1 螢光壽命 Tf 1.0 ps 量子產率 Η 1(去氧的） N/A 鑭系金屬-配位子錯合物，铽螯合物，已成功地顯示 作爲FRET探針系統中的螢光報導劑，且具有1 600μ5之長壽 -69- 201211540 命。 表2 :铽螯合物之光物理性質

參數 符號 値 單元 吸收波長 ^bs 330-350 nm 發射波長 λβιη 548 nm 吸光係數 Ε 13800 (Us，及配位子相依,可咼至30000 @ M-W1 螢光壽命 Tf 1600 (雜交的探針） ps 量子產率 Η 1 (配位子相依） N/A LOC裝置3 0 1所使用的螢光檢測系統不利用過濾來移 除不想要的背景螢光。若淬熄劑248無天然發射以增加信 號-對-雜訊比，則因此具有優勢。無天然發射，則淬熄劑 24S不貢獻至背景螢光。高淬熄效率亦爲重要者，此使得 雜交發生前沒有螢光。購自加州Novato市之Biosearch Technologies, Inc.的黑洞淬熄劑（BHQ)不具有天然發射 及具有高淬熄效率，以及係用於系統之合適的淬熄劑。 BHQ-1之最大吸收値發生於534 nm及淬熄範圍爲480-580 nm，使得其爲用於Tb-螯合螢光團之合適的淬熄劑。BHQ-2之最大吸收値發生於579 nm及淬熄範圍爲560-670 nm使 得其爲用於P u 1 s a r 6 5 0之合適的淬熄劑。 購自愛荷華州Coralville市之Intergrated DNA Technologies的愛荷華黑洋熄劑（Iowa Black FQ及RQ)爲 適合的具有少許或無背景發射之替代性淬熄劑。Iowa -70- 201211540

Black FQ之淬熄範圍爲420-620 nm，於531 nm具有最大吸 收値，並因此爲用於Tb -蜜合營光團之合適的萍煌劑。 Iowa Black RQ於65 6 nm具有最大吸收値及淬熄範圍爲5 00-700 nm，使得其爲用於Pulsar 650之理想淬熄劑。 於本文所述之具體實施例中，淬熄劑2 4 8爲初始時即 附著於探針之功能部分，但於其他具體實施例中，淬熄劑 可爲游離於溶液中之分離的分子。 ❹ 激發源 在本文描述之螢光檢測爲基礎的具體實施例中，因爲 低功率消耗、低成本和小尺寸而選擇LED替代雷射二極體 、高功率燈或雷射的激發源。參照圖84，LED 2 6係直接安 置於LOC裝置301之外部表面上之雜交室陣列110上。在雜 交室陣列1 1 0之對側爲光感測器44，其由自各室之用於檢 測螢光信號之光二極體184的陣列所組成（見圖53、54及 Ο 65)。 圖85、86及8 7槪略說明用於將探針暴露於激發光之其 他具體實施例。在顯示於圖85之LOC裝置30中，由激發 LED 26所產生之激發光244係由透鏡254導向雜交室陣列 1 10之上。脈衝激發LED 26且由光感測器44檢測螢光發射 〇 在圖86所顯示之LOC裝置30中，由激發LED 26所產生 之激發光24 4係由透鏡254、第一光稜鏡712和第二光稜鏡 7 14導向雜交室陣列11〇之上。脈衝激發LED 26且由光感測 -71 - 201211540 器44檢測螢光發射。 同樣地’顯示於圖87中之LOC裝置30，由激發LED 26 所產生之激發光2 44係由透鏡254、第一鏡716和第二鏡718 導向雜交室陣列1 10之上。再次脈衝激發LED 26且由光感 測器44檢測螢光發射。 LED 26的激發波長係取決於螢光染料的選擇。Philips LXK2-PR14-R00爲針對pulsar 650染料之合適的激發源。 SET UVT0P 3 3 5 T039BL LED係針對铽螯合物標記之合適的 激發源。 表 3 : Philips LXK2-PR14 - R0 ❹ LED 規格

參數 符號 値 單元 波長 λ6χ 460 nm 發射頻率 Vem 6.52(10)14 Hz 輸出功率 Pi 0.515(min)@ ΙΑ W 發射模式 Lambertian數據圖 N/A 表4 : SET UVT0P334T039BL LED規格

參數 符號 値 單元 波長 λ-e 340 nm 發射頻率 ve 8.82(10)14 Hz 功率 Pi 0.000240(min) @ 20mA W 脈衝順向電流 I 200 mA 發射模式 Lambertian N/A 紫外激發光 矽在U V光譜中吸收少量光。因此’使用U V激發光是 有利的。可使用UV LED激發源，但LED 26之寬光譜降低 -72- 201211540 此方法之效果。針對於此，可使用經過濾的UV LED。隨 意地’ UV雷射可爲激發源，除非因雷射相當高的花費而 對於特定的測試模組市場不實用。 LED驅動器 LED驅動器29針對所需的持續時間在固定電流下驅動 該LED 26。低功率USB2.0認證裝置可在至多1單位負載（ 0 100毫安培）以最小操作電壓4.4伏特得到。標準電力調節 電路係用於此目的。 光二極體 圖54顯示光二極體184，其合倂於LOC裝置301之 CMOS電路86。光二極體184係在沒有額外遮罩或步驟下製 成CMOS電路86之部分。這是CMOS光二極體優於CCD之一 項顯著的優點，CCD爲另一種感測技術，其可使用非標準 〇 式加工步驟整合到同一晶片上或者製於相鄰晶片上。晶片 上檢測係花費低廉且縮小陣列系統的尺寸。較短光學路徑 長度降低來自週遭環境的雜訊以有效收集螢光信號，以及 減少對於透鏡及濾鏡之傳統光學總成之需求。 光二極體184之量子效率爲光子衝撞其活性區域185之 分率，光子係有效轉換成光電子。對於標準矽處理，可見 光之量子效率根據處理參數（諸如覆蓋層之數量及吸收特 性）係在〇 · 3至0.5的範圍中。 光二極體1 84之檢測閥値決定可被檢測之螢光信號的 -73- 201211540 最小強度。檢測閥値亦決定光二極體1 84的尺寸大小以及 在雜交及檢測部52中之雜交室180的數目（見圖52)。室 的尺寸大小和數量爲技術參數，係由LOC裝置的尺寸（ LOC裝置301的實例中，其尺寸爲1 760微米><5824微米）所 限制，且受合倂其他功能性模組（諸如病原體透析部70及 擴增部1 1 2 )之後可用之不動物件的尺寸所限制。 對於標準矽處理，光二極體1 84檢測最低5個光子。然 而，爲了確認可信賴的檢測，最小値可設爲1 〇個光子。因 此量子效率範圍在0.3至0.5 (如上所討論），自探針之螢 光發射爲最小1 7個光子，而30個光子包含針對可靠檢測的 誤差的合適餘裕。 校準室 光二極體184的不均勻電學特性、自動螢光和尙未完 全衰減之剩餘激發光子通量將背景雜訊引入並偏移至輸出 信號。使用一或多種校準信號將背景自各輸出信號移除。 藉由將在陣列中之一或多種校準光一極體184暴露於各自 的校準源而產生校準信號。低校準源用來判斷標靶尙未與 探針反應之負結果。高校準源代表自探針-標靶複合物的 正結果。在本文所描述的具體實施例中，低校準光源由在 雜交室陣列110中之校準室3 82所提供，其： 不含任何探針； 包含不具有螢光報導劑的探針；或 包含具有報導劑的探針和組態成永遠預期發生淬熄的 -74- 201211540 淬熄劑。 自此種校準室382之輸出信號非常接近來自L0C裝置 中之所有雜交室的輸出信號中的雜訊和偏差。自其他雜父 室所產生的輸出信號減去校準信號’實質上移除了背景和 留下由螢光發射產生的信號（若有產生任何信號的話）° 自室陣列之區域中的環境光線產生的信號亦被去除° 可理解的是參考圖95至98之上述負控制組探針可用於 0 校準室。然而，如圖89及90所示’其爲顯示於圖88之LOC 變體X 728的插圖DG和DH之放大圖，另一選項爲將校準室 3 82與擴增子流體性隔離。當雜交由流體隔離阻止時’背 景雜訊和偏差可由將流體性隔離之室淨空或藉由包含缺少 報導劑的探針或確實具有報導劑與淬熄劑兩者的任何“標 準”探針來判斷。 校準室3 82可提供高校準源以產生高信號於對應的光 二極體。高信號對應在已雜交之室中的所有探針。以報導 Q 劑且無淬熄劑或僅以報導劑點樣探針，將一致地提供近似 雜交室中大量探針已於雜交室內雜交之信號。亦可理解校 準室3 82可用以代替對照探針或加至對照探針上。 整個雜交室陣列的校準室3 82的數量和安排是隨意的 。然而，若光二極體184由相對近的校準室382校準，校準 較準確。參考圖56，雜交室陣列11〇針對每八個雜交室180 具有一個校準室382。也就是說，校準室382係安置於每個 三乘三之正方形雜交室180的中間。在此組態中，雜交室 180係由緊鄰的校準室382所校準。 -75- 201211540 由於從周圍雜交室180之自營光信號的激發光，圖94 顯示用以自對應校準室3 82之光二極體184減除信號的示差 成像器電路788。示差成像器電路78 8自像素790和“虛擬’， 像素792取樣信號。在一個具體實施例中’ “虛擬”像素792 係被遮住以防光照射，所以其輸出信號提供暗參考。或者 ，“虛擬”像素792可和陣列的其餘部分暴露於激發光。在“ 虛擬”像素792是可以接受光的具體實施例中’自室陣列之 區域中的環境光線產生的信號亦被減除。來自像素790的 信號是微弱的（例如，接近暗信號），且因沒有參考暗信 號位準而很難分辨背景値與非常微弱的信號。 在使用期間，啓動“讀取_列” 794和“讀取_列_(1” 795 且開啓M4 797和MD4 80 1電晶體。關閉開關807和809使得 來自像素790及“虛擬”像素792的輸出分別地儲存在像素電 容器803及虛擬像素電容器805上。在像素信號被儲存後， 停用開關807和8 09。然後關閉該“讀取_行”開關81 1和虛擬 “讀取_行”開關8 1 3，且在輸出之經切換的電容器放大器 815放大示差信號817。 光二極體之抑制及致能 於LED 2 6激發期間必須抑制光二極體1 8 4及於螢光期 間必須致能光二極體184。圖66爲單一光二極體184之電路 圖及圖67爲光二極體控制信號之時序圖。電路具有光二極 體 184及六個 MOS電晶體，Mshunt 394、Mtx 3 96、Mreset 3 98、Msf 400、Mread 402 及 Mbias 404。於激發循環開始時 -76- 201211540 ，藉由升高Mshunt閜極3 84的電壓及重設閘極3 8 8爲高而開 啓tl、電晶體Mshunt 394及Mreset 3 98。於此期間，激發光 子於光二極體184中產生載子。當產生的載子量可充分使 光二極體1 84飽和時，此等載子必須被移除。於此循環期 間，因電晶體的洩漏或因基板中之激發-產生的載子擴散 ，Mshunt 394直接地移除光二極體184中所產生的載子，而 Mreset 3 98重設累積於節點‘NS’ 406之任何載子。於激發之 0 後，於t4開始俘獲循環。於此循環中，來自螢光團之發射 的回應被俘獲並整合入節點‘NS’ 406上的電路。此藉由升 高tx閘極3 8 6的電壓而達成，此開啓電晶體Mtx 396及轉移 光二極體184上任何累積的載體至節點‘NS’ 406。俘獲循 環期間可如螢光發射般長。來自雜交室陣列11〇中之所有 光二極體184的輸出同時被俘獲。 於結束俘獲循環t5與開始讀取循環t6之間具有延遲。 此延遲肇因於，在俘獲循環之後，分別讀取雜交室陣列 Q 1 10中之各光二極體1 84的需求（見圖52 )。待讀取的第一 光二極體184於讀取循環之前將具有最短的延遲’而最後 光二極體184於讀取循環之前將具有最長的延遲。於讀取 循環期間，藉由升高閘極3 93的電壓而開啓電晶體 Mread 402。使用源極-隨耦器電晶體Msf 400來緩衝及讀出‘NS’節 點406之電壓。 以下討論另外之任意的致能或抑制光二極體之方法： 1. 抑制方法 -77- 201211540 圖91、92及93顯示用於Mshunt電晶體394之可行的組態 778、780、782。於激發期間被致能之最大値|rcs| = 5V時，

Mshunt電晶體394具有非常高的關閉比。如圖91中所示者， 肘411„1閘極384係組態成位於光二極體184之緣上。任意地 ，如圖92中所示者，Mshunt閘極3 84係可組態成環繞光二極 體184。第三個選擇爲將Mshunt閘極3 84組構於光二極體184 之內，如圖93中所示者。依此第三選擇，光二極體主動區 1 8 5較少。 這三種組態778、780及782降低自光二極體184中所有 位置至Mshunt閘極3 84之平均路徑長度。於圖91中，Mshunt 閘極3 84係於光二極體184之一側上。此爲用以製造之最簡 單且對於光二極體主動區185衝擊最小的組態。然而，滯 留於光二極體184遠端之任何載子需要較長時間以擴散通 過 Mshllnt 間極 384。 於圖92中，Mshunt閘極3 84環繞光二極體184。此進一 步降低光二極體184中之載子至M shunt閘極3 84之平均路徑 長度。然而，繞光二極體1 84周圍而延伸Mshunt閘極3 84造 成光二極體主動區185大幅縮減。於圖93中之組態781將 Mshunt間極384定位於主動區185中。此提供了至Mshunt閛極 3 8 4的最短平均路徑及因此得到最短過渡時間。然而，對 於主動區185之衝擊最大。其亦造成較寬的洩漏路徑。 -78- 1 致能方法 a. 觸發器光二極體以固定的延遲來驅動並聯電晶體 201211540 b- 觸發器光二極體以可程控的延遲來驅動並聯電晶

Mfto 體。 c· 由LED驅動脈衝以固定的延遲來驅動並聯電晶體 〇 d. 如2c般但以可程控的延遲來驅動並聯電晶體。 0 圖69爲透過雜交室180顯示埋入於CMOS電路86中之光 二極體184及觸發器光二極體187之槪略視圖。以觸發器光 二極體187取代光二極體184之角落中的小面積。因相較於 螢光發射時激發光的強度爲高，具小面積之觸發器光二極 體187係充分的。觸發器光二極體187係對激發光244爲敏 感。觸發器光二極體187顯示激發光244已熄滅並於短暫延 遲At 300之後啓動光二極體184(見圖2)。此延遲使得螢 光光二極體184得以於沒有激發光244時檢測來自FRET探 Q 針186之螢光發射。此致能檢測及增進信號對雜訊比。 於各雜交室180下，光二極體184及觸發器光二極體 187兩者均位於CMOS電路86中。光二極體陣列與適當電子 組件合倂以形成光感測器44 (見圖65 )。光二極體184爲 CMOS結構製造期間所製成的pn接面而不需另外的遮罩或 步驟。於MST製造期間，光二極體184之上的介電層（未 顯示）係利用標準MST光蝕刻技術而任意地薄化以使更多 螢光照射光二極體184的主動區185。光二極體184具有視 場，使得來自雜交室180內之探針-標靶雜交體的螢光信號 -79- 201211540 入射至感測器表面上。轉換螢光成爲接著可使用CMOS電 路8 6而被測量的光電流。 替代性地，一或多個雜交室180可僅專用於觸發器光 二極體187。可使用這些選擇於此等與上述之2a及2b的組 合中。 螢光之延遲檢測 下述推導說明係針對上述之LED/螢光團組合使用長壽 命螢光團的螢光延遲檢測。在由圖60顯示之時間^和？2之 間的固定強度Ie之理想脈衝激發之後，螢光強度係推導爲 時間的函數。 令[S1]⑴於時間t等於激發態的強度，然後在激發期 間及之後，每單位體積每單位時間的激發態數量由下面微 分方程式描述： …（1) ^1] [51](〇 Iesc dt Tjr hve 其中C爲螢光團的莫耳濃度，ε爲莫耳淬熄係數，〜爲 激發頻率，且h = 6.62606896(10)·34 Js爲普朗克常數。 此微分方程式具有一般式： ^- + p(x)y = q(x) αχ 其有解法： f e\pMd + ]ζ …(2) Λ%) = ~~— 現在使用此來解答式（1 )， -80- 201211540 然後於時間h，[幻]⑺）=〇，且自（3 ) k = _IffcrLe/l/Tf (4) hve 將（4 )代入（3 ) [幻](0: .sczt •εατ, hve hve 於時間h，：

hv· hv^ 於〖坌G，激發態以指數衰減且以式（6 )描述： [51](〇 = [51](i2)e-(<-(2)/r^ …⑹ 將（5 )代入（6 ): [51](〇 = ~~~CTf [\-eHh~h)'Tf ]e-(,-，2)/r/ …⑺ hve 該螢光強度由下列等式得到： ! it) = -^Mlhvfnl …⑻ αχ 其中v/爲該螢光頻率，η爲量子產率，且1爲光學路徑 長度。 於是自（7 ): J[51](Q Iesc

dt ~ hve "Λ J 將（9 )代入（8 ): IM) = Iesc^^-[\-e('z~hVTf y("h)lrf ...(10) 因爲 ^一-->〇〇, IIe sclη^-e ~(，~'2}'Tf

Tf Ve -81 - 201211540 因此’我們可以寫出下列的近似式’此式描述在充分 長的激發脈衝後之螢光強度衰減：對於 t>t2 If(t) = Ie£c^^e~(t~ll)/Tf ...(Π) \ 。 在上一節，我們針對作的情況做總結’

If{t) = Ι€εοΙη-^-β ° j) f 而對於 K ° 從上述的等式，我們可以導出下列式子： nf{t) = η^ΙηβΗι~'ι)Ιτ/ ...(12) 其中 nf (0 - "7 hV， 爲每單位面積每單位時間之螢光光子數 且 kVe 爲每單位面積每單位時間之激發光子數 因此， nf{t) = ^rif{t)dt …(13) '3 其中心爲每單位面積之螢光光子數且^爲光二極體開 啓的時間點。將（1 2 )代入（1 3 ): nf J^ne£clne~(t'h)lTfdt ...(14) h 目前，每單位面積每單位時間到達光二極體之螢光光 子數，4(0 ’係由下式獲得： ris(t) = hf (〇Φ〇 ...(15) -82- 201211540 其中九爲光學系統之光收集效率。 將（1 2 )代入（1 5 )我們發現 η!(ΐ：) = φϋηίεοΙηβΛ，~，ι)ΙΤ/ ...(16) 同樣地，每單位螢光面積4到達光二極體之螢光光子 數將如下述： «0 iis =jnsm ，3 代入（1 6 )並積分： ns =φ^ηεεαΙητίβ~(，^)Ιτ^ 因此， ns =Φ〇Κβ〇ι'ητ/β Μ'Τι -. (17) ί3的理想値係於當因螢光光子該光二極體184內之產生 的電子率等於由激發光子於光二極體184內之產生的電子 率時，因爲激發光子通量衰減比螢光光子通量衰減快更多 〇 由於螢光之每單位螢光面積的感測器輸出電子率爲： έ>(〇=^；(〇 其中#爲在螢光波長之感測器的量子效率。 代入（1 7 )我們得到： ef(t) = φ^ή^Ιηβ'^1'1 ...(18) 同樣地，由於激發光子之每單位螢光面積的輸出電子 率爲： 其中么爲在激發波長之感測器的量子效率，且Te爲相 對於激發LED之『切斷』特性的時間常數。在時間t2之後 -83- 201211540 ，LED之衰減光子通量增加螢光信號的強度且延長其衰減 時間，但我們假設此對If(t)爲可忽略的影響，因此我們採 取保守（conservative)的方法。 目前，如先前所提及，ί3的理想値爲當： ef(t3) = ee(t3) 因此，由（1 8 )和（19 )我們得到： 並且重整之後我們得到： ί3-’2= j ~— ."(20)

Tf Te 由上面兩段，我們得到下列兩個運算式： ns = φ^ή,Ρτ^1^ …(21) φ Δί = -^~-γ2- ...(22) Γ/ 其中尸=沈/；7且Αί = ί3-〖2，我們亦了解，實際上’ ί2 -匕》Γ,。 用於螢光檢測的理想時間及使用Philips LXK2-PR14-R00 LED和Pulsar 650染料所檢測的螢光光子數決定如下 理想檢測時間係使用式（22 )決定： 回顧擴增子的濃度，且假設所有擴增子雜交，則發螢 光的螢光團濃度爲：c = 2.89(10)-6mol/L。 -84- 201211540 室的高度爲光學路徑長度1 = 8(10)·6 m。 已將螢光區域視爲等同於光二極體區域，然而實際的 螢光區域實質上大於光二極體區域；因此可大槪假設 九=0.5爲光學系統之光採集效率。光二極體的特性，$ = 1〇 爲在螢光波長之該光二極體量子效率對在激發波長之光二 極體的量子效率之比的極保守値。 以典型的LED衰減壽命= 0.5奈秒和使用Pulsar 650規 〇 格，可決定Δί : 尸=[1_48(10)6][2.89(10广6][8(10)_6](1) = 3.42(10)-5 ±t. ln([3.42(10)-5](10)(0.5)) 1(10)-6 0.5(10)-9 =4.34(10)-9 s 偵測到的光子數目係使用等式（2 1 )決定。首先，每 單位時間發射的激發光子數目4係由檢驗照明幾何而決定 〇 〇

Philips LXK2-PR14-R00 LED 具有 Lambertian 發射模式 ，因此： n) = nl0 cos(0) ...(23) 其中％爲與LED的順向軸線方向之角度爲Θ之每單位立 體角每單位時間發射的光子數目，且^爲S在順向軸線方 向之値。 由該LED每單位時間所發射的光子之總數爲： -85- ...(24) 201211540 ht = J n]dQ. Ω ~ ^rilQ cos(9)dQ. Ω 現在， △Ω = 2;r[cos(0) - cos(0 + Δ0)] =4;rsin(0)cos

.(Αθλ sm —l 2 J + 4;rcos ⑹ sin2 [ΑΘ \ j d£l - 2π%\η{β)άθ 代入（24): η 2 ή, = cos(0)sin(0)洲 ο = ^/0 重新排列，我們得到： Ί ...(26) LED的輸出功率爲0.515瓦且ve = 6.52(10)14赫茲，因此 __0.515_ _[6.63(10)-34][6.52(10)14] = 1.19(10)18 光子渺 將此値帶入（26)我們得到： ... 1.19(10)18 ηιο=- π = 3.79(10)17光子渺嫌面度 參照圖6 1，光學中心2 5 2和LE D 2 6之透鏡2 5 4係槪略顯 -86- 201211540 示。光二極體爲16微米χ16微米，且對於在陣列中間的光 二極體，自LED 26發射至光二極體184的光錐的立體角（ Ω )係大約： Ω=感測器面積Θ [16 (ΙΟ)-6] [16(10)-6] 2.825(10)-3]2 = 3·21(10)·5 球面度 將理解光二極體陣列44之中央光二極體184爲用於這 0 些計算之用途。位於陣列邊緣的感測器在雜交事件時僅接 收低2%之光子用於Lambertian激發源強度分佈。 每單位時間發射的激發光子數： ne = η,Ω ...(28) =[3.79(10)17][3.21(10)-5] =1.22(10)13 光子/秒 現在參考等式（29): ns =<^0»eFTfe'^/T/ q =(0.5)(1.22(10)4(3.42(10)-5^1(10)4]^34 陳’乖尸 = 208光子/感測器。 因此，使用 Philips LXK2-PR14-R00 LED 和 Pulsar 650 螢光團，我們可以輕易地檢測任何造成此等數目之光子被 激發的雜交事件。 SET LED照明幾何係顯示於圖62中。ID = 20毫安培時， LED具有最小光學功率輸出p1 = 240微瓦，波長中心於 λε = 340奈米（鋪蜜合物之吸收波長）。驅動LED於1〇 = 200 毫安培，線性增加輸出功率至ρι = 2·4毫瓦。藉由將LED的 光學中心252置於離雜交室陣列110距離17.5毫米處，我們 -87- 201211540 大約將輸出通量集中於具有最大直徑爲2毫米的圓點大小 在雜交陣列平面之2毫米直徑點中的光子通量由等式 2 7得到。

Pi 丨hve _ 2.4(10)-3 ~[6.63(10)-34][8.82(10)14] = 4.10(10)15 光子渺 使用等式2 8，我們得到： he = η,Ω 4.10(10)15^1^10^ 4K10)·3]2 3.34(10)11 光子漱 現在，回到等式22及使用先前列舉的Tb螯合物特性， ln[(6.94(10)-5)(10)(0.5)]

Af =-Γ 1' 1(1 〇Γ3 一 0.5(10)-7 =3.98(10)-9 秒 現在自等式21 : ns =(0.5)[3.34(10),,][6.94(10)-5][1(10)-3>·3·98(,〇γ9/Ι(1〇γ， =11,600光子/感測器。 由雜交事件使用SET LED和铽螯合物系統發射之光子 理論數値係可簡單的檢測且遠超過3 0個光子數之低限値’ 其爲以用於由上述所指示之光感測器之可信賴的檢測所需 探針與光二極體間之最大間.隔 -88- 201211540 雜交之晶片上檢測避免以共軛焦顯微鏡（見先前技術 )檢測之需要。此背離傳統檢測技術在與系統有關的時間 和成本節省中爲重要的因素。傳統檢測需要必須使用透鏡 和彎曲鏡面之成像光學。藉由採用非成像光學，診斷系統 避免複雜及笨重的光學元件串之需求。將光二極體放置於 非常靠近探針具有極高收集效率的優點。當在探針和光二 極體間的材料厚度爲1微米級時，發射光之收集角係高達 0 173°。此角度藉由考慮自最靠近光二極體之雜交室表面中 心的探針發射的光來計算，該光二極體具有平行於室表面 的平面主動表面區。於光可以於其內由光二極體吸收之發 射角錐係定義爲：在其頂點和在其平面之周圍上的感測器 角落具有發射探針。對於1 6微米X 1 6微米的感測器，此錐 體的頂角爲170° ;在光二極體經擴展使得其面積符合該29 微米X 19.75微米之雜交室面積的限制例中，該頂角爲173° 。在室表面和光二極體主動表面之間的分隔爲1微米或更 Q 小是容易達成的。 應用非成像光學方法需要光二極體184非常靠近雜交 室以收集螢光發射之充分的光子。光二極體和探針之間的 最大間隔係參照如下圖54所決定。 利用铽螯合物螢光團和SET UVT0P335T039BL LED， 我們計算自個別雜交室180到達16微米xl6微米之光二極體 184的1 1 600個光子。在實施此計算時，我們假設雜交室 180之光收集區域具有與光二極體主動區185相同的底面積 ，且雜交光子之總數的一半到達光二極體184。即光學系 -89 - 201211540 統之光收集效率爲九=0.5。 更精確，我們可以寫出戎=[(雜交室之光收集 底面積）/ (光二極體面積）][Ω/4π]，其中Ω =立體 向於在雜交室之基底上之代表點之光二極體。對於 (right)正方錐幾何： Ω = 4 a r c s i n (a 2 / (4 d 〇2 + a 2))，其中 d 〇 =在室與光二極體 距離，且《爲光二極體尺寸。 各雜交室釋放23 200個光子’經選擇的光二極 測低限値爲1 7個光子，因此，所需的最小光學效率 九= 1 7/23200 = 7.33 χΙΟ·4 雜交室180之光收集區域的底面積爲29微米X: 米。 解出dQ，將得到在雜交室及光二極體184之間 限制距離爲d〇 = 249微米。在此限制中’如上所定義 錐角僅爲〇. 8 °。應注意的是此分析忽略了折射之可 影響。

LOC 變體 XLII 圖76中之LOC變體XLII 672係用於關注者爲較 通常爲不溶性組分之樣本分析。添加樣本至樣本入 固體或粉狀樣本係於樣本入口 68與合適的液體結合 毛細作用而流動至表面張力閥1 1 8。貯槽54中的試 表面張力閥1 1 8而與樣本混合’且繼續流動至大組 部6 8 6。大於特定尺寸閾限之樣本組分’諸如細胞 區域的 角其對 正確的 之間的 體之檢 爲. 19.75 微 的最大 之收集 忽略的 大的且 口 68。 ，以藉 劑經由 分透析 、病原 -90- 201211540 體及粒子，維持於樣本中。較小的組分，諸如鹽、代謝物 、DNA及蛋白質，係轉移至廢料貯槽768。經純化的樣本 續行至其他功能部以供進一步處理，如培養29 1、核酸擴 增292以及雜交及檢測294。

LOC變體XLV 參照圖79，LOC變體XLV 675使用大組分透析部686、 Q 培養部114、擴增部112、雜交室陣列110及光感測器44來 檢測病原體。大組分透析部6 86係設計來維持大於特定閾 限尺寸（包括病原體）之組分。小於閾限之組分係轉移至 廢料貯槽768。經純化的樣本前進至培養階段29 1而經由表 面張力閥1 3 2與來自貯槽5 8之限制酵素、接合酶及聯結子 引子結合，以及於培養部114中進行限制性剪切及聯結子 接合。於剪切之後，沸騰引動閥1〇8開啓且流動續行至擴 增部1 12，經由表面張力閥138來添加來自貯槽60之擴增混 Q 合且經由表面張力閥140來添加來自貯槽62之聚合酶。當 已產生充分的擴增子時，沸騰引動閥108開啓以使毛細作 用驅動流進入雜交室陣列110。各室中之序列專一性探針 與樣本中之任何標靶序列雜交’以及利用光感測器44來檢 測雜交。

LOC變體 XLVII 圖80槪略顯示LOC變體XLVII 677，其使用大組分透 析部686，接著以合酸擴增及雜交及檢測來檢測病原體。 201211540 大組分透析部6 8 6係設計來維持大於特定閩限尺寸（包括 病原體）之組分。小於閾限之組分係轉移至廢料貯槽768 。在擴增部1 1 2中進行核酸擴增之前，經由表面張力閥1 3 8 來添加來自貯槽60之擴增混合且經由表面張力閥1 40來添 加來自貯槽62之聚合酶。當已產生充分的擴增子時，沸騰 引動閥1 08開啓以使毛細作用驅動流進入雜交室陣列1 1 0。 各室中之序列專一性探針與樣本中之任何標靶序列雜交， 以及利用光感測器44來檢測雜交》 結論 本文所述之裝置、系統及方法促進以低成本與高速度 及就地醫護之分子診斷試驗。 上述之系統及其成分僅爲說明用途，且在不背離本發 明的精神及廣義發明槪念的範圍下，此領域中之熟知技藝 者將輕易地了解許多變化及修飾。 【圖式簡單說明】 藉由僅參照隨附圖式之實施例將說明本發明之較佳具 體實施例，其中： 圖1顯示經組態而用於螢光檢測之試驗模組以及試驗 模組閱讀器； 圖2爲經組態而用於螢光檢測之試驗模組中之電子組 件之圖式槪要； 圖3爲試驗模組閱讀器中之電子組件之圖式槪要； -92 - 201211540 圖4爲表示LOC裝置之結構之圖式槪要； 圖5爲LOC裝置之透視圖 圖6爲具有彼此疊置之所有層結構及特徵之L0C裝置 之平面圖； 圖7爲具有獨立顯示之蓋結構之LOC裝置之平面圖； 圖8爲具有以虛線顯示之內通道及貯槽之頂面透視圖 0 圖9爲具有以虛線顯示之內通道及貯槽之爆炸頂面透 視圖； 圖1 〇爲顯示上方通道組態之蓋之底面透視圖； 圖11爲獨立顯示CMOS + MST裝置結構之LOC裝置之平 面圖； 圖12爲LOC裝置之樣本入口處之槪要圖； 圖13爲圖6中所示之插圖AA之放大圖； 圖14爲圖6中所示之插圖AB之放大圖； Q 圖15爲圖13中所示之插圖AE之放大圖； 圖16爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖18爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖19爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， -93 - 201211540 圖20爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖21爲闡述插圖AE中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖22爲圖21中所示之溶胞試劑貯槽之圖式槪要； 圖23爲闈述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖24爲闡述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖25爲闡述插圖AI中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖； 圖26爲闡述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖27爲闡述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖28爲闡述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖29爲闡述插圖AB中之LOC裝置之層合結構之部份透 視圖， 圖3 0爲擴增混合貯槽及聚合酶貯槽之圖式槪要； 圖3 1顯示獨立之沸騰引動閥的特徵； 圖3 2爲圖3 1中所示之沿線3 3 - 3 3所取得之沸騰引動閥 之圖式槪要； 圖33爲圖15中所不之插圖AF之放大圖； -94- 201211540 圖34爲圖33中所示之沿線3 5-3 5所取得之透析部上游 端之圖式槪要； 圖3 5爲圖6中所示之插圖AC之放大圖； 圖3 6爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖37爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖38爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖3 9爲圖38中所示之插圖AK內之進一步放大圖； 0 圖4〇爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖41爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖42爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖43爲圖42中所示之插圖AL內之進一步放大圖； 圖44爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖45爲圖44中所示之插圖AM內之進一步放大圖； 圖46爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖47爲圖46中所示之插圖AN內之進一步放大圖； 〇 圖48爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖49爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖5 0爲插圖AC中顯示擴增部之進一步放大圖； 圖5 1爲擴增部之圖式槪要； 圖52爲雜交部之放大的平面圖； 圖53爲兩個獨立雜交室之進一步放大圖； 圖54爲單一雜交室之圖式槪要； 圖55爲圖6中所示之插圖AG中闡述之增濕器之放大圖 -95- 201211540 圖56爲圖52中所示之插圖AD之放大圖； 圖57爲插圖AD內之LOC裝置之爆炸透視圖； 圖58爲呈封閉組態之FRET探針之圖； 圖59爲呈開放及雜交組態之FRET探針之圖； 圖60爲激發光對時間之作圖； 圖61爲雜交室陣列之激發光照幾何（excitation illumination geometry)之圖； 圖62爲感測器電子技術LED光照幾何之圖； 圖63爲圖6之插圖AH中所示之濕度感測器之放大的平 面圖； 圖64爲白血球標靶透析部之示意截面圖； 圖65爲顯示部分光感測器之光二極體陣列之槪要圖： 圖66爲單一光二極體之電路圖； 圖6 7爲光二極體控制信號之時間圖； 圖68爲圖55之插圖AP中所示之蒸發器之放大的平面圖 t 圖69爲通過雜交室及檢測光二極體和觸發器光二極體 之圖式槪要； 圖7〇爲聯結子-引發之PCR之圖； 圖7 1爲表示具刺血針之試驗模組之槪要圖； 圖72爲LOC變體VII之結構之圖形表示； 圖73爲LOC變體VIII之結構之圖形表示； 圖74爲LOC變體XIV之結構之圖形表示； 圖？5爲LOC變體XLI之結構之圖形表示； -96 - 201211540 圖76爲LOC變體XLII之結構之圖形表示； 圖77爲LOC變體XLIII之結構之圖形表示； 圖78爲LOC變體XLIV之結構之圖形表示； 圖79爲LOC變體XLV之結構之圖形表示； 圖80爲LOC變體XLVII之結構之圖形表示； 圖8 1爲初次擴增期間之引子-聯結的線性螢光探針之 圖； 圖82爲後續擴增循環期間之引子-聯結的線性螢光探 針之圖； 圖83 A至83F圖形性地說明引子-聯結的螢光莖-及-環 探針之熱循環； 圖84爲相關於雜交室陣列及光之二極體激發LED之槪 要說明； 圖85爲用於將光導至L〇c裝置之雜交室陣列上之激發 LED以及光學透鏡之槪要說明； 〇 圖86爲用於將光導至LOC裝置之雜交室陣列上之激發 LED、光學透鏡以及光稜鏡之槪要說明； 圖87爲用於將光導至L0C裝置之雜交室陣列上之激發 LED、光學透鏡以及鏡配置之槪要說明； 圖88爲顯示彼此疊置之所有特徵之平面圖，並顯示插 圖DA至DK之位置； 圖89爲圖88中所示之插圖DG的放大圖； 圖90爲圖〇中所示之插圖dh的放大圖 圖91顯示用於光二極體之並聯電晶體之實施例； -97 - 201211540 圖92顯示用於光二極體之並聯電晶體之實施例； 圖93顯示用於光二極體之並聯電晶體之實施例； 圖94爲示差成像器之電路圖； 圖95槪略地描述呈莖-及-環結構之負控制螢光探針； 圖96槪略地描述呈開放結構之圖95之負控制螢光探針 圖97槪略地描述呈莖-及-環結構之正控制螢光探針； 圖98槪略地描述呈開放結構之圖97之正控制螢光探針 » 圖99顯示經組態以與ECL檢測倂用之試驗模組以及試 驗模組閱讀器； 圖1 〇 0爲與E C L檢測一起使用之試驗模組中之電子組 件之圖式槪要； 圖1 〇 1顯示試驗模組以及替代性試驗模組閱讀器；及 圖1 02顯示試驗模組以及替代性試驗模組閱讀器與儲 存各種資料庫的主機系統。 【主要元件符號說明】 I 〇 :試驗模組 II :試驗模組 1 2 :試驗模組閱讀器 13 :外殻 1 4 :微型-U S B接頭 15 :感應器 -98 - 201211540 1 6 :微型-U S B埠 17 :觸控螢幕 1 8 :顯示螢幕 19 :按鈕 2 0 :開始按鈕 2 1 :蜂巢式無線電 22 :無菌密封帶 23 =無線網路連接 24 :大容器 25 :衛星導航系統

26 ： LED 27 :資料儲存器 2 8 :電話 29 ： LED驅動器 30 ： LOC裝置 3 1 :功率調節器 32 :電容器 3 3 :時鐘 3 4 :控制器 35 :暫存器 36 : USB裝置驅動器 3 7 :驅動器 3 8 :隨機存取記憶體 3 9 :驅動器 -99- 201211540 40 :快閃記憶體 41 :暫存器 4 2 :處理器 43 :程式儲存器 44 :光感測器 45 :指示器 46 :蓋 4 7 :模組 48 ： CMOS+MST 裝置 49 :多孔元件 52 :檢測部 54 :貯槽 56、 56.1、 56.2、 56.3:貯槽 5 7 :印刷電路板 58、 58.1、 58.2:貯槽 60、 60.1-60.12、 60.X:貯槽 62、 62.1、 62.2、 62.3、 62.4、 62.X:貯槽 6 4 :下密封 66 :頂部層 6 8 :樣本入口 7 0 :透析部 72 :廢料通道 74 :標靶通道 76 :廢料儲器 -100- 201211540 78 :貯槽層 80 :蓋通道層 8 2 :上密封層 84 :矽基板 86: CMOS 電路 87 : MST® 8 8 :鈍化層 90 : MST通道 92 :下管道 94 :蓋通道 96 :上管道 9 7 :壁部 98 :彎液面固定器 1 00 : MST通道層 101 :膝上型電腦/筆記型電腦 102 :毛細作用起始特徵 103 :專用閱讀器 105 :桌上型電腦 106 :沸騰引動閥 107 :電子書閱讀器 108 :沸騰引動閥 1 〇 9 :平板電腦 I 1 0、1 1 0 · 1 -1 1 0.1 2、1 1 0 · X :雜交室陣列 II 1 :流行病學資料 -101 - 201211540 112、112.1-112.12、112.X:擴增部 1 1 3 :遺傳資料 1 1 4.1 -1 1 4.4 :培養部 1 1 5 :電子化健康記錄 1 1 6 :抗凝血劑 1 1 8 :表面張力閥 1 1 9 :液體樣本 1 2 0 :彎液面 1 2 1 :電子化醫療記錄 1 2 2 :通氣孔 1 2 3 :個人健康記錄 1 2 5 :網路 126 :沸騰引動閥 128、128.2、128.3:表面張力閥 1 3 0、1 3 0 · 1 -1 3 0.3 :溶胞部 1 3 1 :混合部 132、132.1、132.3:表面張力閥 1 3 3 :培養器入口通道 134 :下管道 1 36 :光學窗 138、 138.1、 138.2、 138.X:表面張力閥 140、 140·1、 140.2、 140.X:表面張力閥 1 4 6 :閥入口 1 4 8 :閥出口 -102 - 201211540 150 :閥下管道 1 5 2 :環形加熱器 1 5 3 :閥加熱器接點 1 5 4 :加熱器 1 5 6 :加熱器接點 158 :微通道 1 60 :出口通道 1 6 4 :孑L 口 166 :毛細作用起始特徵 1 6 8 :透析汲取孔 170 :溫度感測器 174 :液體感測器 175 :擴散屏障 176 :流動路徑 1 7 8 :液體感測器 1 80 :雜交室 1 8 2 :加熱器 1 84 :光二極體 1 85 :主動區 1 8 6 :探針 1 87 :光二極體 1 8 8 :水貯槽 190 :蒸發器 1 9 1 :環形加熱器 -103 201211540 192 :水供應通道 193 :上管道 194 :下管道 1 9 5 :頂金屬層 196 :增濕器 1 9 8 :汲取孔 202 :毛細作用起始特徵 204 ： MST 通道 206 :沸騰引動閥 207 :沸騰引動閥 208 :液體感測器 21 0 :微通道 2 1 2 : MST通道 2 1 8 :電極 220 :電極 222 :間隙 23 2 :濕度感測器 2 3 4 :加熱器 23 6 ： FRET 探針 23 8 :標靶核酸序列 240 ：環 242 ：莖 244 :激發光 246 :螢光團 -104 - 201211540 2 4 8 :淬熄劑 250 :螢光信號 2 5 2 :光學中心 2 5 4 :透鏡 28 8 :樣本輸入及製備 290 :萃取階段 291 :培養階段 292 :擴增階段 293 :預-雜交過濾純化階段 294 :檢測階段 2 9 6 :第一·電極 29 8 :第二電極 3 0 0 :延遲 301 ： LOC裝置 3 2 8 :白血球透析部 3 76 :導熱柱 3 78 :陽性對照探針 3 8 0 :陰性對照探針 3 82 :校準室 3 8 4 :聞極 3 8 6 :鬧極 3 8 8 :閘極 3 90 :可伸縮刺血針 3 92 :刺血針釋出按鈕 -105- 201211540 3 9 3 :閘極 394: MOS電晶體 3 9 6 : Μ O S電晶體 398 : MOS電晶體 400: MOS電晶體 402: MOS電晶體 404: MOS電晶體 4 0 6 :節點 4 0 8 :膜密封件 4 1 0 :膜防護件 492 ： LOC 變體 5 18： LOC 變體 594 :界面層 6 0 0 :旁路通道 602 :界面標靶通道 6 04 :廢料通道 6 3 8 :熱溶胞部 641 : LOC 變體 672 ： LOC 變體 673 ： LOC 變體 674 : LOC 變體 675 : LOC 變體 677 : LOC 變體 6 8 2 :透析部 -106 201211540 6 8 6 :透析步驟 692 :引子-聯結的線性探針 694 :擴增阻斷物 696 :探針區域 698 :互補序列 700 :寡核苷酸引子 704 :莖-及-環探針 7 0 6 :互補序列 7 0 8 :莖股 7 1 0 :股 712 :第一光稜鏡 7 1 4 :第二光稜鏡 7 1 6 :第一鏡 7 1 8 :第二鏡 740 :流速感測器 ❹ 746 : LOC變體 75 8 ： LOC 變體 760 :大組分通道 762 :小組分通道 764 :開口 766 :盲終端 76 8 :盲終端 7 7 8 :組態 7 8 0 :組態 -107 201211540 7 8 2 :組態 788:示差成像器電路 7 9 0 :像素 7 9 2 :虛擬像素 7 9 4 :讀取_列 795 :讀取_列 796 :陰性對照探針 7 9 7 :(電晶體） 798 :陽性對照探針 8 0 1 :(電晶體） 8 0 3 :像素電容器 805:虛擬像素電容器 8 07 :開關 8 09 :開關 8 1 1 :開關 8 I 3 :開關 8 1 5 :電容器放大器 8 1 7 :示差信號 860 : ECL激發電極 8 70 : ECL激發電極 -108-

Claims (1)

1. 201211540 七、申請專利範圍： 1. 一種用於生物樣本之病原體檢測及基因分析之晶 片上實驗室（LOC)裝置，該LOC裝置包含： 接收該樣本的入口； 支撐基板； 複數個試劑貯槽； 透析部，其係用於使樣本中之大於預定閾限之病原體 0 及細胞與較小組分分離，從而該等大於預定閾限之病原體 及細胞含有用於分析之遺傳物質； 位於該透析部下游之核酸擴增部，其係用於擴增遺傳 物質中的核酸序列；其中， 該透析部及核酸擴增部均被支撐於該支撐基板上。 2. 如申請專利範圍第1項之LOC裝置，其中該核酸擴 增部爲聚合酶鏈反應（PCR)部。 3. 如申請專利範圍第2項之LOC裝置，其進一步包含 Q 光感測器及該PCR部下游之雜交部，該雜交部具有用於與 遺傳物質中之標靶核酸序列雜交之探針陣列，該等探針係 組態成與標靶核酸序列雜交以形成探針-標靶雜交體，其 中該光感測器係組態成用於檢測該等探針-標靶雜交體。 4. 如申請專利範圍第3項之LOC裝置，其中該透析部 具有與上游端入口呈流體連通之第一通道、與下游端之廢 料通道呈流體連通之第二通道、以及比該等大於預定閾限 之病原體及細胞小的複數個孔口，該第二通道與第一通道 係經由該等孔口而呈流體連通’使得該等大於預定閾限之 -109- 201211540 病原體及細胞保留於第一通道中，而較小的組分流入第二 通道。 5. 如申請專利範圍第4項之LOC裝置，其中該第〜通 道及第二通道係經組態成藉由毛細作用而塡充該樣本。 6. 如申請專利範圍第5項之LOC裝置，其中該第二通 道係經組態成藉由毛細作用而將該等大於閾限之病原體及 細胞吸入該核酸擴增部。 7. 如申請專利範圍第1項之LOC裝置，其中該核酸擴 增部爲恆溫核酸擴增部。 8. 如申請專利範圍第〗項之LOC裝置，其中該等試劑 貯槽各具有用於將試劑保持於其中之表面張力閥，該表面 張力閥具有彎液面固定器，該彎液面固定器係用於固定試 劑的彎液面直至與樣本流接觸而移除彎液面使得試劑自試 劑貯槽流出。 9. 如申請專利範圍第6項之LOC裝置，其進一步包含 自入口至雜交部之流動路徑，其中該流動路徑係組態成藉 由毛細作用自入口吸引樣本至雜交部。 10. 如申請專利範圍第4項之LOC裝置，其進一步包 含位於該支撐基板與PCR部之間之CMOS電路，以及溫度 感測器，其中該CMOS電路使用溫度感測器輸出來反饋控 制PCR部。 1 1 .如申請專利範圍第10項之LOC裝置，其中該PCR 部具有PCR微通道，於使用期間樣本於該PCR微通道熱循 環以擴增核酸序列’該PCR微通道界定部分的樣本流動路 -110- 201211540 徑並具有小於1 00,000平方微米之橫切流向的截面積。 I2·如申請專利範圍第11項之LOC裝置，其中該PCR 部另包含至少一個用於加熱伸長的PCR微通道內之核酸序 列之伸長加熱器元件’該伸長加熱器元件係平行於該PCR 微通道而延伸。 13.如申請專利範圍第12項之LOC裝置，其中該PCR 微通道的至少一段形成伸長PCR室。 0 14.如申請專利範圍第13項之LOC裝置，其中該PCR 部具有複數個各由PCR微通道之個別的段所形成之伸長 PCR室’該PCR微通道具有由一連串寬曲流所形成之彎曲 構型，每一該等寬曲流係形成其中一個伸長PCR室之通道 部。 15. 如申請專利範圍第1 1項之LOC裝置，其中該PCr 微通道之橫切流向的截面積係小於1 6,000平方微米。 16. 如申請專利範圍第15項之LOC裝置，其中該雜交 Q 部具有容納探針之雜交室陣列，使得各雜交室中的探針係 組態成與標靶核酸序列中之一者雜交。 1?.如申請專利範圍第16項之LOC裝置，其中該光感 測器爲與雜交室配準（registration )定位之光二極體陣列 〇 18.如申請專利範圍第1 6項之LOC裝置，其中該 CMOS電路具有用於儲存來自光感測器輸出之雜交資料之 數位記憶體以及用於將該雜交資料傳輸至外部裝置之資料 界面。 -111 - 201211540 1 9·如申請專利範圍第1 6項之LΟC裝置，其cf 部具有於熱循環期間用於保留液體於PCR部及回應 CMOS電路之啓動訊號而允許液體流至雜交室之主謹 20.如申請專利範圍第19項之LOC裝置，其 動閥爲沸騰引動閥，其具有彎液面固定器及加熱器 液面固定器係經組態以固定彎液面而中止毛細作用 液體流，且該加熱器係使液體沸騰而自彎液面固定 彎液面而恢復毛細作用驅動流。 該PCR 來自該 I閥。 中該主 ，該彎 驅動之 器釋放 -112-