TW201112948A

TW201112948A - Method for processing tissues

Info

Publication number: TW201112948A
Application number: TW099127475A
Authority: TW
Inventors: Benjamin Kibalo
Original assignee: Lifecell Corp
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2011-04-16
Also published as: EP3103461B1; US20150202338A1; JP2013502275A; EP2467148A2; US20200179542A1; SG178070A1; ES2740782T3; US9023273B2; WO2011022369A3; US20110044847A1; EP3103461A1; CN107115567A; AU2010284365A1; CA2768863A1; CN102470149A; CA2768863C; EP2467148B1; WO2011022369A2; AU2010284365B2

Description

201112948 六、發明說明：本申請案依據35 U.S.C. §119來主張2009年8月18曰申請之美國臨時專利申請案第61/234,681號之優先權。【先前技術】人類及動物組織可用於產生病人使用之多種組織產物。該等組織經常經處理以移除某些細胞及/或非細胞成分及/ 或破壞該等組織中出現的病原體。此外，在處理或儲存期間，可冷康及融解組織。【發明内容】根據某些實施例，提供一種用於將一組織樣本去細胞之方法，s亥方法包括.在一液體中提供包括一喷乳動物軟組織之一組織樣本；及施加一至少2〇〇 MPa壓力至該液體達足以破壞該軟組織内部之大體所有天生組織細胞之一時間，其中破壞大體所有細胞包含使該等細胞之細胞膜破裂使得在一鹽溶液中清洗該組織樣本允許移除至少95%之天生組織細胞。根據某些實施例’提供一種用於融解一組織樣本之方法’ δ亥方法包括.在一液體中提供包括一哺乳動物組織之 * 一組織樣本，該組織樣本至少部分被冷凍；及施加足以融 * 解該冷凍組織樣本之一壓力至該液體。根據某些實施例’提供一種用於將一組織樣本去細胞之方法，該方法包括：在含有液體之一容器中提供包括一哺乳動物組織之一組織樣本；及施加一壓力至該液體達足以破壞該軟組織内部之大體所有細胞之一時間，其中破壞大

S 150182.doc 201112948 體所有細胞包含使該等細胞之細胞膜破裂使得在一鹽溶液中清洗該組織樣本允許移除至少95%之天生組織細胞，且其中以一速率施加該壓力使得該組織樣本之溫度不超過3〇。(：。根據某些實施例，提供一種用於減小一組織樣本中之生物負荷之方法，該方法包括：在含有液體之一容器中提供包括一哺乳動物軟組織之一組織樣本；及施加一壓力至該液體並持續一足以造成該軟組織内部之細菌濃度之至少一 5 log減小量之時間，其中在施加壓力期間，該組織樣本之溫度不超過30°C。【實施方式】現將詳細參考根據本揭示内容之某些例示性實施例隨附圖式情示其等之某些實例。無論任何情況下，㈣的參考數字將用以遍及該等圖式指相同的或類似的部分。在本申請案中’除非特別說明，否則單數之使用包幻數。在本申請案中，除非另行說明，否則「或」之使用i 思係「及/或」。此外，術語「包含」之使用及其它形邮如「包含」及「包含於」）係不受限。本文描述之任何！圍應理解為包含諸端點及諸端點間之所有值。如本文使用，「高流體靜壓」應理解為係指施加至1 體中合有之-：件之壓力’該液體經加壓以在該物件上勒加力。在某些貫例中，冥、；雜抵阿，巩體靜壓可包含大於200 MPa之施加至該液體之壓力。如本文使用，「生物負荷」意思係-組織樣本中之微生 150182.doc -4- 201112948 物量，包含（但不限於）細體、立次克氏菌、黴漿菌菌、病毒、真菌、寄生體、衣原及原生動物。 :本文使用，「組織產物」或「組織衍生產物」意思係自-組織之任何產物’該產物已以任何方式改變(例仁不限於，藉由自該組織移除細胞、自該組織移除某些化學物質或使該組織無菌)。如本文使用，「組織樣本」包含完整而未經處理的組織及已經處理的組織兩者以產生「組織產物」或「組織衍生產物」。本文使用㈣節標題❹於組織目的且不應解釋為限制經描述的標的。本申請案中引用之所有文件或部分文件包含(但不限於)專利、專利申請案、文章、書及專著，其等之全文以參考方式明白地併人本文中用於任何目的。各種人類及動物組織可用於產生詩治療病人之產物。舉例而&，已產生各種用於人類組織之再生、修補、增加、加強及/或治療，該等人類組織已由於各種疾病及/或結構破壞（例如’外傷、外科手術、萎縮及/或長期磨損及退化)而被破壞或損失。舉例而言，此等產物可包含組織基質及/或組織衍生蛋白質或含有蛋白質的物質（例如，葡萄糖胺聚糖）’可單獨使用此等產物或結合其它物質及/或化學物質。在某些實施例中，此等產物可完全或部分予以去細胞以產生用於病人之組織基質或細胞外組織物質。舉例而古，各種組織（諸如皮膚、腸、骨頭、軟骨、神經組織（例如，神經纖維或硬腦膜）、腱、韌帶或其它組織）可完全或部分 150182.doc 201112948 予以去細胞以產生對病人有用的組織產物。在一些情況下，在不増加外源細胞物質（例如，幹細胞）時可使用此等去細胞產物。在某些情況下，此等去細胞產物可利用來自自體或其匕來源之細胞予以種入以促進治療。在某些實施例中，因為組織產物經常被植入一病人的身體上或體内，所以期望使此等物質無菌，或至少減小可能在該等產物中之細菌或其它病原體的數量至所選定用途可接受之一位準。在某些實施例中，通常可使用諸如照射 (例士伽瑪、電子束或X射線）、化學處理或熱處理之處理來消毒各種組織、組織衍生產物及其它可植入醫學裝置。 " 對於各種醫學或手術應用中之用途，取決於預期用途，組織或組織產物應具有所期望的生物性質。舉例而言，用於組織再生之組織產物通常應能夠支援或誘導細胞向内生長或再生。然而，某些組織處理技術可破壞一些組織及/ 或移除某些生物功能所期望的部分組織。舉例而言，在某些實施例中，組織去細胞處理可包含可能破壞或移除某些組織之再生或生長所期望的各種細胞信號分子或細胞外基質蛋白質之各種酶、洗滌劑及/或化學藥品之使用。此外，在某些實施例中，殺菌技術（諸如伽瑪照射）可藉由造成此等產物之分解或化學變化改變組織產物。本揭示内容提供處理組織樣本之方法，該等組織樣本保留使用此等方法產生之組織產物之期望的生物性質。在一些實施例中，該等方法包括一種用於將一纽織樣本去細胞 150182.doc 201112948 之方法。在某些實施例中，該等方法包括一種用於融解一組織樣本之方法。在某些實施例中，該等方法包括一種用於減小一組織樣本之生物負荷之方法。在一些實施例中，用於處理組織樣本之方法可包括施加一高流體靜壓至一組織。在某些實施例中，可藉由在一液體中放置一組織樣本或在一液體中提供一組織將高流體靜壓施加至一組織樣本。在某些實施例中，可將壓力施加至該液體，藉此控制施加至該組織樣本之壓力。在各種實施例中，可控制施加至該組織樣本之壓力、施加壓力之時間及/或壓力增加及/或減小之速率以將該組織樣本去細胞、減小該組織樣本中之生物負荷及/或融解該組織樣本。在各種實施例中，可基於許多因素選擇施加至該組織樣本之£力纟-些貫施命j中，基於待處理之組織樣本類型選擇該壓力。在一些實施例中，選擇該壓力以當保留該組織樣本之某些期望的生物性質時允許將該組織樣本去細胞。在-些實施例中’選擇該壓力以允許融解該組織而不使該組織樣本增溫至一所選溫度之上及/或在一所選時間内允許融解。，本發明之该等方法可用於處理許多不例示性哺乳動物組織樣纟包含(但不限在各種貫施例中同組織樣本類型。於)骨頭、皮膚、腸、膀胱、腱、拿刀帶、肌肉、筋膜、神經組織、肝臟、心臟、*、腎臟、軟骨及/或其它哺乳動物組織。在某些實施例中’該組織樣本可包含乳動物軟組織樣本。舉例而言，在某些實施例中，該組織樣本可 £ 150182.doc 201112948 包含哺乳動物真皮。在某些實施例中，該真皮可與周圍表皮及/或其它組織分離，諸如皮下脂肪。纟某些實施例中，該組織樣本可包含小腸黏膜下層。在某些實施例中，該組織樣本可包含人類或非人類來源。例示性之合適的非人類來源包含（但不限於）豬、綿羊、山羊、兔子、猴及/或其它非人類哺乳動物。根據某些實施例，各種類型之高流體靜壓施加系統可用於處理組織樣本。在某些實施例中，—高流體靜壓施加系統將包含一硬質容器或由鋼或其它硬材料形成之容器。在某些實施例巾，將待處理之—組織樣本連同—液體（例如’水)放置於該容器十。在某些實施例中，該組織樣本可封裝於亦含有流體之一撓性容器中’且該撓性包裝可放置於含有流體之一容器中。在某些實施例中，該容器裝載绞組織樣本及流體之後，施加壓力至該容器中之該流體。在某些實施例中’可以多種方式施加該壓力。舉例而言，在某些實施例中，可使用—氣動活塞施加該壓力以壓縮該容器中之該流體，或—爷订杜扣拥+ ^ ^ 泵了強迫額外流體進入至該容器中直到5亥谷器中之壓力達到一期望位準。在某二貫施例中，一組織樣本被封裝在含有一液體之一撓性容器巾，且施加壓力至該容器。在—些實施例中一 :且織樣本被放置在含有—液體之—硬質加壓容器中且施加壓力至該硬質容器中之該液體。在一些實施例中，該組織樣本被封裝在含有_液體之—撓性容器中，且該撓性容器被放置在含有，且施加壓力至一液體之一硬質加壓容器中 150182.doc 201112948 該硬質容器中之該液體。在各種實施例巾，可藉由使用一活塞（舉例而言）壓縮該流體或藉由將額外流體泵送入一固定容積之-容器中施加塵力至該液體。在某些實施例中，當該組織樣本被封裝在一撓性容器中時，大致上密封該撓性容器使得僅該撓性容器中之該流體接觸該組織樣本。在施加高流體靜壓期間，許多液體可用於接觸該液體。舉例而5，可使用各種水溶液。在某些實施例中，該液體可包含一鹽水。在某些實施例中，該液體可包含一鹽溶液’諸如一靖酸鹽緩衝液。在一些實施例中，該組織樣本可經處理以破壞該組織樣本之一些或大體所有天生組織細胞。在某些實施例中，可藉由用利用不明顯破壞該等細胞之一液體（例如pBS)清洗已用尚流體靜壓處理之一組織樣本且分析該等樣本以決定該等天生組織細胞保留多少（若有）而執行已完成該等天生組織細胞之破壞的決定。舉例而言，在一些實施例中，在向流體靜壓處理以破壞細胞之後，利用一鹽溶液之簡單清洗可移除細胞剩餘部分，且可評估該清洗的樣本以決定該等細胞是否已被移除，藉此指示該等細胞之破壞。用於評估5亥荨樣本以決定細胞是否已被破壞及移除之某些合適的方法已熟知’且包含（但不限於）冷凍或固定組織細胞之光學顯微鏡法。在某些實施例中，可使用指示DNA存在之試劑評估細胞或細胞剩餘部分之存在，舉例而言，可使用 PICOGREEN®DNA量化套件。如本文使用’大體所有細胞之破壞應理解為意思係當使 150182.doc Λ 201112948 用習知組織學（例如，光學顯微鏡法）評估時，-組織樣本之該等天生組織細胞之至少95%至1GG%(包含端點值及在此等端點值間之所有百分率）不存在，該組織樣本已經高流體靜壓處理且已在一鹽溶液中清洗。在-些實施例中’可利用高流體靜壓處理组織樣本以移除該組織樣本中之-些或大體所有細胞，且進-步利用其它處理來處理該組織樣本以移除剩餘細胞。舉例而言，如上所注意，在各種實施例中，各種酶、洗滌劑及/或其它化學藥品可用於自組織移除細胞，但是此等處理可能改變組織細胞外基質。因此’為了減小利用酶、洗滌劑及/或其它化學藥品之處理量，首先可利用一高流體靜壓處理來處理組織樣本，藉此移除一些或大體所有細胞，且進一步利用至少一額外去細胞處理來處理該組織細胞以移除額外細胞（在該組織樣本中若存在時）。用⑨執行去細胞之合適的試劑及方法包含（但不限於）例如頒予Liversey.人之美國專利第5,336,616號中所描述者。在—些實施财，可處理㈣織樣本以產生—非細胞植織基質。在-些實施例中，該非細胞組織基質可包含一細胞外基質。舉例而言’在各種實施例中，該組織基質可包含衍生自許多不同續乳動物軟組織之―膠原蛋白基質。在某些實施例中，該組織基質可包含—或更多額外細胞外基質蛋白質及/或分子’其等包含(但不限於)各種gag、細胞信號分子或其它用於實現各種生物功能（諸如細胞結合、黏合、生長、分化及/或改造）之期望的化學物質。 150182.doc in 201112948 在一些實施例中，用於將一組織樣本去細胞之一方法包括在一液體中提供包括一哺乳動物軟組織之一組織樣本及施加一壓力至該液體達一足以破壞該軟組織内部之大體所有天生組織細胞的時間。在一些實施例中，以一最小壓力施加該壓力以破壞該軟組織内部之大體所有天生組織細胞。在各種實施例中，該壓力係至少200 MPa、至少300 MPa、至少400 MPa或至少5〇〇 MPa。在各種實施例中，該壓力在300 MPa及500 MPa間。在各種實施例中，施加該壓力達一足以破壞該軟組織内部之大體所有天生組織細胞之時間。在各種實施例中，施加該壓力達至少3 〇分鐘達至少 60分鐘。在某些實施例中，施加至該液體之該壓力係至少 400 MPa達至少1 〇分鐘。在某些實施例中，施加至該液體之該壓力係至少400 MPa達至少30分鐘。在某些實施例中’施加至該液體之該壓力係至少5〇〇 MPa達至少3〇分鐘。在各種實施例中，在不造成過度加熱該組織樣本之情况下執行該等去細胞方法，如下文描述。在各種貫施例中，本揭示内容之該等方法允許在不造成明顯地加熱一組織細胞之情況下施加高流體靜壓至該組織樣本。在各種實施例中，當用於組織修復、替換或再生時，加熱某些組織樣本可能破壞各種組織細胞外基質蛋白質，藉此減小該組織樣本之期望的生物功能。因此，本文中之某些實施例在不使該等組織#本加熱至可破壞组織細胞外基貝蛋白質之一溫度或達一時間情況下可允許組織去細胞化、組織融解及/或組織生物負荷之減小。在某些盘 150182.doc -11 - 201112948 施例中，以一速率施加高流體靜壓且至一最大壓力使得該組織樣本不達到高於30T：之一溫度。在某些實施例中，該溫度不超過25°C。在某些實施例中，在一流體靜壓容器中施加壓力造成該容器中之該等物質（即，該液體）之絕熱壓縮，其造成增加該等壓縮物質之溫度。然而，某些加壓容器允許—些通過該容器壁之熱傳導，且因此，此等系統並非真正絕熱的。因此，在各種實施例中，壓力增加量與壓縮率（即壓力增加）及至該容器壁或來自該容器壁之熱傳導有關。此外，在各種實施例中，該容器内之水之相變亦可影響該容器内之溫度。因成匕，在一些實施例中，可藉由控制該處理容器中之壓力增加率控制利用高流體靜壓處理之該樣本之溫度。在某些實施例中，在施加高流體靜壓之前及/或期間可冷凍該組織樣本、一加壓容器中含有之液體及/或加壓設備。在一些貫施例中，可在該加壓容器中含有之液體中放置冰’及/或可冷凍該加壓容器壁。在各種貫施例中，為了阻止組織破壞、分解及/或微生物生長，通常期望在處理、運輸及/或儲存期間冷凍組織樣本。在各種貫施例中，在隨後的處理或使用期間，融解該组織樣本。但是，在某些實例中，藉由加熱該組織樣本之融解可破壞組織細胞外基質成分及/或促進微生物生長。而且，在某些實施例中，在相對冷條件下（例如在冷藏下或恰好在該樣本中之冰點之上）融解組織樣本可係耗 150182.doc -12- 201112948 時的，特別對於較大組織樣本來說。在某些實施例中，用於融 -液體中提供包括至少，4本之—方法包括在組織樣本且施加-磨力？奶，.且為之 ^ ^ , . 、且織樣本以足以融解該冷凍組織祅本。在一些實施例中，蛐解發生在一有限時間内及/ 或僅利用該組織樣本溫度之有限提高。圖1提供水之固相及液相之―相圖'如圖所示，各種冰相之浴點在較高屡力處降低。因此，在某些實施例卜施加提高的流體靜壓至含有冰之樣本可在不明顯加熱該組織樣本情況下造成固態水至液態之轉換。在各種實施例中，一組織樣本可含有部分或完全固態之水(即，冰）。在各種實施例中，融解該組織樣本包括造成該樣本中之—部分或Α體所有固態水被轉換至㈣。在— 些實施例巾，融解該料_樣本包括造成該組織樣本十之固態水之大於50%經歷一至—液態之相變。在一些實施例中，融解該冷康組織樣本包括造成該組織樣本中之大體所有固態水經歷一至一液態之相變。在各種實施例中，該樣本中50%至⑽％之間之冰經歷_至—液態之相變。在各種實施例中’可以數種方式決定在施加一高流體靜屋處理之前及之後在該樣本中之固態冰量。舉例而言，在各種實施例中，可使用用於差示掃描量熱法（DSC)之小樣本決定一樣本中之冰之存在。在各種實施例中，對於較大樣本，可藉由於在一已知溫度之一絕熱液體中放置一樣本且供應熱至該系統而識別冰。在某些實施例中，在一絕熱 150l82.doc •13· 201112948 系統中可壓縮（加壓）樣本，且在壓縮期間可測量該樣本溫度或圍繞該樣本之一流體媒體之溫度。將會預期不具有2 之樣本在-絕熱系統中以與加壓速率有關之—恆定速率增加其溫度。在某些實施例中，對於含有冰之樣本，該等樣本之溫度將穩定在接近冰之溶點之一溫度。在一些實施例中’若測量圍繞該樣本之該流體之溫度，則含有：：樣本之流體溫度增加得比不含冰之樣本較慢。樣本溫度之平穩狀態及/或以溫度上升速率之降低將取決於冰存在量。在-些實施例中，經歷高流體靜壓處理之—組織樣本之溫度保持在-上限之下。在一些實施例中，該上限基於該樣本之初始溫度。舉例而言，在一些實施例中，在不掸加高於听之該組織樣本之溫度情況τ執行該組織之料。在一些實施例中’在不增加高於3〇。〇之溫度情況下執行融解。在-些實施例中’在不增加高於饥之溫度情況下執行融解。在某些實施例中’在不增加高於在说及抓間之該組織樣本之溫度情況下執行融解。在一些實施例中’在不將溫度增加高於一上限之情況下且在一特定時_執行融解。舉例而言，在—些實施例中/融解在30分鐘内發生。在某些實施例中，融解在60分 •里内七生纟各種實知例中’融解在約分鐘至約分鐘之間發生。在各種實施例中’執行高流體靜壓處理以獲得生物負荷某位準之減夕舉例而言，在各種實施例中，可以足以造成-樣本之細菌負荷之至少―⑽減小量、—61〇以咸 150182.doc • 14 * 201112948 小量、 7 log減小量或一8 log減小量‘一壓力及時間的壓力及時間施加高流體靜壓。在一些實施例中，可以足以減小生物負荷至一特定位準之一壓力及時間施加高流體靜壓。隹谷種實施例，、'…/十、卞0微工切工甘 f或定量化一特定類型有機體來測量一組織樣本之生物負荷。用於自-組織樣本萃取微生物之一合適的方法包含利用-消毒液體清洗-樣本及培養用於清洗該樣本之液體之 P刀或所有以便疋里化一樣本中之任一特定微生物量或諸微生物量。在各種實施例中，可基於待量化之微生物類型及/或阻止破壞該組織來選擇清洗流體。在一些實施例中，在不增加高於3(TC之溫度情況下執行減小生物負荷。例中，在不增加高於25。。之溫度情況生物負何°在某些實施例中’在不增加該組織樣本之、.，度二於在抑及机間的情況下執行減小生物負荷。- 二貫施例中，可在施加高流體靜1至-組織樣本之刖或之後執行一消毒處理。舉例而言，在一歧一 / 施加高流體靜壓將至少部分—貫轭例中，乂 I刀減小一組織樣本且可執行-組織消毒處理 I之生物負何，荷。在一些實施例令，今、、肖主/減小該樣本中之生物負 τ °茨/為毒處理可係小人丄i +上樣本之前或之後執行之—末期消毒處理裝-組織「消毒處理…含減小-樣本中之生二=用’- 理，但是不需要使該樣本絕對地消毒。何之任何處某些例示性處理包含(但 ’ 於)-伽碼照射處理、一電 150182.doc

* J5- S 201112948 子束照射處理、一超臨界二氧化碳消毒處理及一過乙酸處理。在各種實施例中’此等處理可破壞一些組織成分，且因此’產生具有期望的生物性質之組織，期望限制該消毒處理之時間或強度（例如，輻射劑量或pH值）。在某些實施例中，施加高流體靜壓至一樣本以部分減小生物負荷，因此可減小用於實現一期望的無菌位準之隨後的消毒處理之劑量。合適的消毒處理包含（但不限於）以下各項（舉例而言）中描述者：美國專利公開案第2006/0073 592 A1號（Sun 等人），美國專利第5,460,962號（Kemp);美國專利公開案第 2008/0171092A1 號（Cook等人）〇實例1 :組織生物負荷之減小使用豬皮膚。該組織提供作為具有完整毛髮之整個皮膚或作為自表皮及皮下脂肪層分離之真皮層。藉由自該真皮切。丨4皮下月曰肪及一薄層（1至2 mm)較低真皮，且藉由自該真皮切割一薄層（0·25至i mm)表皮及上真皮而分離該真皮層。在分離該真皮之前，機械地移除毛髮。預先冷凍兩種樣本類型，且為增加分離的真皮組織中之生物負荷水準，在冷藏條件下融解之後將所有組織一起（整個皮膚及分離的真皮）儲存數天。使用一 DENIw Magic Vac食物儲存裝置個別封裝每一件。每一件被密封在三個真空密封袋内以阻止暴露豬組織至該加壓容器。利用該密封袋中之一最小！_流體封裝该等樣本使得該封裝密切符合樣本。由埃爾姆赫斯（ElmHurst)研究公司（位於美國紐約州之 Albany)製成之一13升加壓系統用於該等實驗。該系統具 150182.doc 201112948 有一固定容積且藉由將流體泵入該容器中以施加壓力。使用從該容器蓋伸出進入加壓室以測量大量流體壓力之一熱電偶測量溫度。首先測S式整個皮膚及分離的真皮兩者之小件（執行1及執行2) ’且大的未去毛件係暴露於相同條件（執行3及執行 4)。表1總結此等條件。該壓力容器沒有溫度控制系統，所以最高溫度主要取決於初始溫度及最大壓力，壓力增加速率是在350 PSI/sec之一單一速率。執行丨及執行2之後，藉由眼睛及觸覺針對退化之明顯徵象來檢查暴露於高流體靜壓之小件組織。未見到退化之明顯徵象，所以在執行3 及執行4中處理大部分組織，表1 :執行條件執行# 壓力(PSI) 時間(分鐘）起始溫度(C) 最高溫度(C) 1及3 60,000 5 27·0 及 25.3 38.7 及 38_8 2及4 75,000 10 26.8 及 25.7 39.9 及 40.5 暴露之後，在冷藏條件（1_10。〇下儲存該等組織樣本達少於一星期。提交整個皮膚及分離的真皮之樣本用於生物負荷測試。在一 PBS溶液中攪動該等樣本以自該等樣本萃取細菌，且該PBS溶液被平置在一瓊脂平板上且予以培養。在暴路於咼流體靜壓之前，未處理組織（分離的真皮及整個皮膚兩者）之控制樣本亦經受相同的生物負荷測試。冷藏之後’ 一些剩餘分離真皮組織樣本亦經受DSC。在一 TA差示掃描熱析儀（美國德拉瓦州之的丁 a 150182.doc 201112948

InStrUmentS公司）上使用12至23 mg樣本執行DSC。圖2A及圖2B中顯示生物負荷測試結果。資料顯示為每一組織樣本之菌落形成單位（CFU)，以為標度。該等結果顯示用於未去毛組織之至少-1至3 LOG1G減小量及用於分離真皮組織之—4至5 L〇Gi。減小量。該等結果顯示車乂同C力及較長麗力保持時間比較低壓力及較短時間減小更多的整體生物負荷。相比於在每一測試壓力（6〇 kPSI及75 kPSI)之分離真皮組織，在整個皮膚組織之細菌去活性中有一減小量。因此’對於真皮移植，在高流體靜壓處理之前切割該組織樣本以移除非真皮成分可提供改良的生物負荷減小量。在此工作中，去活性資料顯示用於短期測試之良好結果。然而，用於處理樣本之DSC性質指示一些熱組織破壞。舉例而言，經受5分鐘65刪或1〇分鐘7〇贿之樣本具有DSC上之熱啟動值，該值指示變性膠原蛋白之一高位準。因此，當控制處理溫度時執行實驗以評估用於2細胞、融解或減小生物負荷之高流體靜壓之效應。實例2 :處理溫度之控制一刀雕具皮組舞使用之前在-80°C儲存該組織。接著在保持在7它之一培養器中融解該等組織多達3 6小時。所有樣本被士〆似7 cmx7 cm平方件。使用denitm Magic 封裝制j 裝以密切配合組織之尺寸。衣組織樣本被個別地放置在預製作封裝内。设著加入PBs 150182.doc •18- 201112948 中Γ 封裝（平均至少5G毫升）。在放置在該等封裝使用一真空下拉與㈣將該PBS脫氣數小時。泡不再形成於搜拌棒周圍時認為脫氣完成 = 裝移除盡可能多的空氣，且剎用“ & “°亥封孔且利用一熱封口機密封該封裝開口端。、< 冰係用於冷卻該高流體靜壓容器於總共三個執行m前m 碎的冰用 &之别將冰加至該容器（在該組織之上及之下兩者）°實例1中描述的加«統被用於實例2中描述的實驗。 μ2中表2總結用於實例2之每-執行之條件。因為考慮到在較低溫度下可能有容器密封茂漏，所以冰未相等的使用。在增加的低溫下使用更多冰以更信賴容器的完整性。因此，因為使用更多冰，每一執行之起始溫度較低。

高流體靜塵施加之後，在冷藏條件下儲存該組織少於24小時。為了在包裝、處理及生物負荷測試間之時間期間控制組織上之PBS溶液之效應，未處理控制樣本被保持在PBSO利用經處理樣本予以測試。高流體靜Μ 露之後在消毒條件下㈣該等樣本，其可料生物負荷結果。如實驗1中評估細菌污染。如實例!描述執行生物負荷測試。圖3顯示生物測試結

150182.doc 19- S 201112948 果。在此研究中僅測設分離真皮組織，且y軸以—對數標度表示CFU °利用較長保持時間及較高壓力改良生物負荷中之減小。舉例而言’執行1及執行3兩者執行丨〇分鐘保持時間，但是執行3(其在較高壓力下執行）導致增加的生物負荷減小量。此外，在5〇 kpsi執行執行1及執行2兩者，但是執行2(其執行較長時間）與執行丨相比係導致增加的生物負荷量。圖4係在此試驗中之三個執行及實例丨之四個執行期間壓力對度之一圖形記錄。在當前實驗中，樣本溫度不超過大約25°c。在實例1中，樣本溫度超過35。(3，且在較高壓力下甚至超過40°C。可能由於在高壓保持步驟期間至該液體或從該液體至該容器壁之熱傳導，在每一曲線頂部之平面區域係一冷卻穩定狀態。高壓容器之鋼壁在室溫開始，且取決於熱梯度，該容器之鋼壁的質量提供一大量散熱片或來源。實例2也具有此等冷卻穩定狀態，但是其等並不明顯。 .使用一 TA差示掃描熱析儀在每一樣本上亦執行dsc測试。表3顯示遠等DSC結果。亦顯示一控制、未處理皮膚樣本。對照實例1 ’實例2中之該等樣本不顯示指示膠原蛋白變性之低熱啟動值。而是用於實例2之執行丨至執行3之熱啟動值大約係59-60°C，其相似於該控制樣本。因此，當控制樣本溫度時施加高流體靜壞在不造成明顯膠原蛋白變性情況下對減小樣本生物負荷係有效的。 150182.doc •20- 201112948 表4 :實驗2之DSC結果樣本啟動變性溫度/焓控制 60.47/59.17 1 59.84/52.32 2 59.92/59.83 3 60.05/44.43 【圖式簡單說明】圖1係水之一相圖；圖2A係用於整個豬皮膚樣本之生物負荷測試結果，如實驗1中描述；圖2B係用於豬真皮之生物負荷測試結果，如實驗1中描述；圖3係用於豬真皮之生物負荷測試結果，如實驗2中描述；及圖4係用於實驗1及實驗2之樣本之溫度對壓力輪廓曲線圖0 150182.doc

Claims

201112948 七、申請專利範圍： 1. 一種用於將一組織樣本去細胞之方法，其包括組織樣在一液體中提供包括一哺乳動物組織之本；及施加一至少200 MPa壓力至該液體達一足以破壞該軟組織内部之大體所有天生組織細胞之時間，其中破壞大體所有細胞包含使該等細胞之細胞膜破裂使得在—鹽溶液中清洗該組織樣本允許移除至少95%之天生組織細胞。 2.如請求項i之方法，其中施加至該液體之壓力大約係至少 500 MPa。 3，如請求項}之方法，其中施加至該液體之壓力係至少3〇〇 MPa達至少3〇分鐘。 4·如請求項1之方法，其中施加至該液體之壓力係至少400 MPa達至少1〇分鐘。 5.如請求項1之方法，其中施加至該液體之壓力係至少400 MPa達至少3〇分鐘。 6 ·如明求項1之方法，其中該液體包括一水性鹽溶液。 7·如請求項6之方法，其中該液體包括磷酸鹽緩衝液。 8. 如請求項1之方法，其進一步包括在該組織上執行一消毒處理。 9. 如請求項8之方法，其中該消毒處理包括一伽瑪照射處理。 1 〇如明求項8之方法，其中該消毒處理包括一電子束照射 150182.doc 201112948 處理。月求項8之方法，其中該消毒處理包括一超臨界二氧化碳消毒處理。月求項8之方法，其中該消毒處理包括—過乙酸處理過程。长項1之方法，其中該哺乳動物組織包括一軟組織。 14_如：求項13之方法，其中該哺乳動物組織包括皮膚。 15.如„月求項13之方法，其中該哺乳動物軟組織包括豬真皮。 16. 如請求項14之方法，其進—步包括在施加壓力之前自該皮膚移除一表皮層。 17. 如請求之方法，其中該哺乳動物組織包括一腱或韌帶之至少一者。 18. 如請求項丨之方法，其中該哺乳動物組織包括小腸黏膜下層。 19. 如請求们之方法’其進一步包括清洗該哺乳動物軟組織以移除被破壞的細胞；及在該組織樣本上執行至少一額外去細胞處理。 20. —種用於融解一組織樣本之方法，其包括：在-液體中提供包括-哺乳動物組織之一組織樣本， δ亥組織樣本至少部分被冷;東；及施加足以融解該冷凍組織樣本之一壓力至該液體。 21. 如請求項20之方法，其中融解該冷凍組織包括造成該組 150182.doc 201112948 織樣本中大於50%之固態水經歷-至一液態之相變。 △如請求項2G之方法’其中融解該冷;東組織包括造成該組織樣本中之大體所有固態水經歷一至一液態之相變。 23. 如請求項2〇之方法，其中在不增加該組織樣本之溫度高於I 〇 °c下執行融解該組織。 24. 如請求項2〇之方法，其中在不增加該組織樣本之溫度高於3 0 C之下執行融解該組織。 25·如請求項21之方法，其中在不增加該組織樣本之溫度高於lor之下執行融解該組織。 26.如請求項21之方法’其中在不增加該組織樣本之溫度高於30°c之下執行融解該組織。 27 •如請求項22之方法’其中在不增加該組織樣本於1 〇°c之下執行融解該組織。之溫度局其中在不增加該組織樣本之溫度高 28.如請求項22之方法，於30°C之下執行融解該組織。其中在少於30分鐘内其中在少於60分鐘内 29. 如請求項23至28中任一項之方法，執行融解該組織。 30. 如請求項23至28中任一項之方法，執行融解該組織。其中施加至該液體之壓力係至少 31.如請求項20之方法 500 MPa。 32. 如請求項20之方法， 33. 如請求項32之方法， 3 4.如清求項2 0之方法，其中該液體包括一水性鹽溶液。其中該液體包括磷酸鹽緩衝液。其進一步包括在該組織上執行一消 I50182.doc 201112948 毒處理。 35·如請求

3 4之方法理。其中該消毒處理包括— $瑪照射處 36.如請求項34之方法，處理。其中該消毒處理包括一電子束照射 37.如請求項34之方法化碳消毒處理。 38·如請求項34之方法理。其中該消毒處理包括一超臨界二氧其中該消毒處理包括一過乙酸處項2〇之方法’其中該組織樣本包括-軟組織。 • 0响，項36之方法，其中該軟組織包括真皮。 41.如n月求項37之方法，其中該軟組織包括豬真皮。月求項39之方法，其中該哺乳動物組織包括一腱或韌 π之至少一者。耷长項39之方法，其中該哺乳動物組織包括小腸黏膜下層。 44. 一種用於將一組織樣本去細胞之方法其包括：在含有液體之-容器中提供包括一哺乳動物組織之一組織樣本；及知加反力至5亥液體達一足以破壞該軟組織内部之大體所有細胞之時間，其中破壞大體所有該等細胞包含使该等細胞之細胞膜破裂使得在一鹽溶液中清洗該組織樣本允许移除至少9 5 %之天生組織細胞，且其中以使得該組織樣本之溫度不超過3 〇 °C的一速率施加該壓力。 150182.doc 201112948 45. 如請求項44之方法’其中施加至該液體之壓力係至少 500 MPa ° 46. 如請求項44之方法’其中施加至該液體之壓力係至少 300 MPa達至少30分鐘。 47. 如請求項44之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 400 MPa達至少10分鐘。 48‘如請求項44之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 400 MPa達至少40分鐘。 49. 如請求項44之方法，其中該液體包括一水性鹽溶液。 50. 如請求項49之方法，其中該液體包括磷酸鹽緩衝液。 5 1 ·如凊求項44之方法，其進一步包括在該組織上執行一消毒處理。 52·如請求項5 1之方法，其中該消毒處理包括一伽瑪照射處理。 53. 如請求項51之方法，其中該消毒處理包括一電子束照射處理。 54. 如請求項51之方法，其中該消毒處理包括一超臨界二氧化碳消毒處理。 55. 如請求項51之方法，其中該消毒處理包括一過乙酸處理。 56. 如請求項44之方法’其中該哺乳動物組織包括皮膚。 57. 如印求項56之方法’其中該哺乳動物組織包括豬真皮。 58. 如响求項57之方法，其進〆步包括在施加壓力之前自該皮膚移除—表皮層。 150182.doc 201112948 59. -種用於減小-組織樣本中之生物負荷之方法，其包括：在含有液體之-容器中提供包括一喷乳動物軟組織之一組織樣本；及施加壓力至该液體達一足以造成該軟組織内部之細菌濃度之至少一5 log減小量的時間，其中在施加該壓力期間’該組織樣本之溫度不超過3〇〇c。 60. 如請求項59之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 500 MPa。 61. 如請求項59之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 300 MPa達至少30分鐘。 62. 如請求項59之方法’其中施加至該液體之壓力係至少 400 MPa達至少1〇分鐘。 63. 如請求項59之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 400 MPa達至少40分鐘。 64. 如請求項59之方法’其中該液體包括一水性鹽溶液。 65. 如請求項64之方法，其中該液體包括磷酸鹽緩衝液。 66. 如請求項59之方法，其進一步包括在該組織上執行至少一額外消毒處理。 67. 如請求項66之方法，其中該消毒處理包括一伽瑪照射處理。 68. 如請求項66之方法，其中該消毒處理包括一電子束照射處理。 69. 如請求項66之方法，其中該消毒處理包括—超臨界二氧 150182.doc -6 - 201112948 化後消毒處理。 70.如請求項66之方法’其中該消毒處理包括一過理。 71·如之方法，其巾該哺乳動物軟組織包括皮膚。 -72·如凊求項71之方法’其中該哺乳動物軟組織包括豬直皮。如月求項71之方法’其進一步包括在施加該壓力之前自該皮膚移除一表皮層。月求項59之方法，其中該組織樣本之溫度不超過25 。。。月求員5 9之方法，其中該哺乳動物軟組織係真皮。月长員75之方法，其中該哺乳動物軟組織係非細胞真皮。月求項5 9之方法’其中該哺乳動物軟組織係非細胞。 78. —種用於減小一組織樣本中之生物負荷之方法，其包括：在含有液體之一容器中提供包括一哺乳動物軟組織之一組織樣本；及知加至少200 MPa之一壓力至該液體，其中在施加該 ’ 壓力期間’該組織樣本之溫度不超過30°C。 79. 如請求項78之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 500 MPa。 80. 如請求項78之方法，其中施加至該液體之壓力係至少 300 MPa達至少3〇分鐘。 150182.doc 201112948 81 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 中施加至該液體之壓力係至少 .如請求項78之方法，其 400 MPa達至少1〇分鐘。如請求項78之方法 400 Mpa達至少40分如請求項78之方法，如請求項83之方法，如請求項78之方法，一額外消毒處理。如請求項85之方法，理。 ’其寸施加至該液體之壓力係至少鐘0 其中該液體包括一水性鹽溶液。其中該液體包括磷酸鹽緩衝液。其進一步包括在該組織上執行至少其中s亥消毒處理包括一伽瑪照射處如吻求項85之方法，其中該消毒處理包括一電子束照射處理。 ’… 如請求項85之方法，化碳消毒處理。如請求項85之方法理。其中該消毒處理包括一超臨界二氧其中§玄消毒處理包括一過乙酸處士吻求項78之方法，其中該哺乳動物軟組織包括皮膚。月求項9 0之方法，其中§亥哺乳動物軟組織包括豬真皮。如請求項90之方法，其進一步包括在施加壓力之前自該皮膚移除一表皮層。如β求項78之方法，其中該組織樣本之溫度不超過25 〇C。如請求項78之方法，其中該哺乳動物軟組織係真皮。 150182.doc 201112948 95. 96. 97. 98. 如明求項94之方法，其中該哺乳動物軟組織係非細胞真皮。、如响求項78之方法，其中該哺乳動物軟組織係非細胞。如明求項78之方法，其中施加壓力至該液體達一足以造成該哺乳動物軟說織中之細菌濃度之至少一 5 i〇g減小量的時間。一種使用如請求項1至97中任一項之方法產生的組織產物0 I50182.doc