CN1318581C - 利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法，该方法包括下列步骤：(a)在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下，将超临界二氧化碳导入含有待处理物的容器进行灭菌，该待处理物是可能带有冠状病毒的物品或物质；以及(b)从该待处理物移除该超临界二氧化碳，使该可能存在于待处理物的冠状病毒失去活性。由于本发明的方法是使用无毒性的超临界二氧化碳即能够使可能存在于医疗物品或材料的冠状病毒去活性，因此不需额外添加具有毒性或可能致癌的添加剂。另一方面，本发明的方法可以在较低的温度条件下进行，特别适合用于对热不稳定的材料以及敏感的蛋白质材料进行灭菌。

Description

利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法

技术领域

本发明是关于一种利用超临界流体(supercritical fluid)去除冠状病毒(corona virus)活性的方法，特别是关于一种利用超临界二氧化碳去除冠状病毒活性的方法。

背景技术

物质具有固相、液相、气相三种形态，当系统温度及压力达到某一特定点时，气-液两相密度趋于相同，两相合并为一均匀相。此特定点即为该物质的临界点，所对应的温度、压力和密度则分别为该纯物质的临界温度(Tc)、临界压力(Pc)和临界密度(ρc)。一旦超过此点，无论压力如何增加都无法使之液化，温度如何升高也无法使之返回气相，该物质即进入超临界状态，此高于临界温度及临界压力的均匀相即为超临界流体。

超临界流体的物性均在气体与液体之间，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，尤其是溶解能力可随温度、压力、极性而变化，同时兼具低粘度、低表面张力的特性，能够渗透进入微孔隙的物质，使得超临界流体非常适合用于无水洗净、萃取、染整等用途。

超临界流体技术的应用领域相当广泛，多达数十种，最早的工业化应用为天然物的萃取，例如德国利用超临界二氧化碳萃取咖啡因及植物香精等；接下来扩展至染整、工业洗净等领域。未来，随着技术发展及追求高品质、省能源、符合环保的公开要求，还能应用在纳米、化工、石化、制药、生技、半导体等其它产业。

二氧化碳由于其易于达到临界点，临界温度约摄氏31.1℃，与一般室温相近，临界压力则为72.9bar，本身无毒、无色、无臭、不具自燃性、不产生光化学反应，不会破坏臭氧层、不产生烟雾。使用时，其溶解力随温度与压力条件而变，且易于回收再利用，加上易于取得、便宜又安全，因此很适合进行超临界流体的各项应用。

有鉴于二氧化碳本身是一种惰性(inert)的酸性气体，在槽体真空密闭的空间，灌注二氧化碳进行洗净时，过程中二氧化碳会穿透细菌的细胞膜，此时其具有酸性气体的特质，会使得细胞死亡，因此二氧化碳本身就具有杀菌效果。然而，超临界二氧化碳能够杀死菌种及清洗效能到何种程度，还需要进一步检测；杀菌环境条件也仍有待理清，例如各菌种适应温度不同，有些必须在高温环境进行，有些则可能在低温进行即可；抑或是需加装其它设备，如紫外线设备等。

就目前人人闻之色变的SARS病毒而言，是属于去氧核甘酸(RNA)病毒，病毒上面有一层脂质外套膜(lipid envelop)，形状像皇冠，故名「冠状」病毒。由于酒精可以溶解掉病毒的「脂质外套膜」，所以一般常使用酒情来做消毒灭菌的方法。此种灭菌方法是使用7-75％的酒精，擦拭皮肤表面或物体表面来达到消毒作用。然而，酒精使病毒失去活性的同时也会使蛋白去活性化，且酒精挥发之后，效力将不再持续，因此其并不适用于对敏感的蛋白质材料进行灭菌。

再者，一般常用的高温或高压灭菌方式，也不适用于对热不稳定的材料。因此，对于冠状病毒而言，仍需要一种能够在较低的温度条件下进行的灭菌方法。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点，本发明的主要目的在于提供一种能够无毒地去除冠状病毒活性的方法。

本发明的另一目的在于提供一种能够简单地去除冠状病毒活性的方法。

本发明的又一目的在于提供一种能够在较低的温度条件下去除冠状病毒活性的方法。

本发明的再一目的在于提供一种适合用于对热不稳定的材料进行灭菌以去除冠状病毒活性的方法。

本发明的又一目的在于提供种适合用于敏感的蛋白质材料进行灭菌以去除冠状病毒活性的方法。

为达上述及其它目的，本发明提供一种利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法，其包括下列步骤：(a)在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下，将超临界二氧化碳导入含有待处理物的容器进行灭菌，该待处理物是可能带有冠状病毒的物品或物质；以及(b)从该待处理物移除该超临界二氧化碳，使该可能存在于待处理物的冠状病毒失去活性。

本发明方法是使用超临界二氧化碳去除可能行在于医疗物品或材料的冠状病毒活性，不需额外添加具有毒性或可能致癌的添加剂进行灭菌，由于超临界二氧化碳具有无色、无毒、无味、不易燃、具有化学惰性、价格便宜、以及易制成高浓度液体等特点，因此可以免除后续移除有毒物质的步骤，同时具有简化的方法与降低成本的优点。另一方面，由于二氧化碳的临界温度接近室温且临界压力不高，相较于一般的高温、高压灭菌方式，本发明的方法可以在较低的温度条件下进行灭菌，去除冠状病毒的活性，特别适合用于对热不稳定的材料以及敏感的蛋白质材料进行灭菌。

具体实施方式

以下借由具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。

一般而言，所谓的“临界流体(critical fluid)”是指温度与压力分别为临界温度或超过临界压力以及临界压力或超过临界压力，处于临界状态的流体。另一方面，所谓的“近临界流体(near critical fluid)”指温度与压力分别为临界温度或接近临界温度以及临界压力或接近临界压力者。在本说明书中，“超临界流体(supercritical fluid，SCF)”一词包括温度与压力分别为临界温度、接近临界温度或超过临界温度，以及临界压力、接近临界压力或超过临界压力的临界、近临界及超临界流体。同样地，本说明书中，所谓的“超临界二氧化碳”包括温度与压力分别为临界温度(31.1℃)、接近临界温度或超过临界温度，以及临界压力(72.9bar)、接近临界压力或超过临界压力的临界、近临界及超临界二氧化碳。

在本说明书中，所谓的“待处理物”包括可能(即可能含有或者不含有)带有冠状病毒的固态或液态物品与物质。该种可能带有冠状病毒的固态或液态物品与物质的实例包括，但不限于：医疗用品、工具、装置、以及生物材料，例如蛋白质、胜、核酸、生物活性分子、血小板、血液因子等。

本发明利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法，是在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下，先将超临界二氧化碳导入含有待处理物的容器进行灭菌；接着，从该待处理物移除该超临界二氧化碳，使该可能存在于待处理物的冠状病毒失去活性，或同时移除可能存在的冠状病毒。

一般而言，雷诺数(Reynold number，Re)是判断流体流动形态的指针。雷诺数小于2,100)则称为层流(laminar flow)，即当流体流动时，各质点间互相平行，不相干扰；雷诺数大于4,000则称为紊流(turbulentflow)，即流体除了向前流动外，并碎成许多漩涡，而与侧边的流体混合；而雷诺数介于2,100与4,000之间则称为过渡流(transition flow)，即从层流过渡至扰流的中间状态，流体行为不稳定，时而层流时而扰流。雷诺数的定义如下式(I)所示：

$R_e=\frac{D{\stackrel{\‾}{u}}_{\mathrm{\ρ}}}{\mathrm{\μ}}---\left(I\right)$

其中，

D表示管内直径，单位为公尺；

表示平均速度，单位为公尺/秒；

ρ表示密度，单位元为公斤/立方公尺；以及

μ表示粘度，单位为公斤/公尺·秒。

本发明的方法是在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下，将超临界二氧化碳导入含有待处理物的容器进行灭菌，适用于液态或固态的待处理物。由于超临界二氧化碳是在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下导入，因此可确定病毒的去活乃是因流体达到超临界而非由流体的紊流所导致。就该超临界二氧化碳的导入比例而言，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例较佳是100至500克的范围；更佳者，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例是300克，但并非局限于此。又，该超临界二氧化碳的压力是以60至240bar的范围较佳；而该超临界二氧化碳的温度是以40至80℃的范围较佳，但并非局限于此。再者，根据实际导入的超临界二氧化碳的温度而定，灭菌时间是在2小时或2小时以内的时间进行；然而，本领域技术人员可视需要，根据待处理物的特性加以调整。

在本发明的具体实例中，该超临界二氧化碳司进一步加入辅溶剂进行流体助溶。该辅助溶剂的实例包括有机溶剂，例如内酮(acetone)、己烷(hexane)、二氧杂环己烷(dioxane)、苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙酸乙酯(ethylacetate)、甲醇(methanol)、乙醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)、二甲基甲酰胺(dimethylforamide)、环己烷(cyclohexane)、三氯甲烷(chloroform)、二氯甲烷(dichloromethane)、吡啶(pyridine)、乙醚(diethylether)、硝基甲烷(nitromethane)、及苯甲醚(anisole)；以及生物制剂，例如过氧化物(如，过乙酸(peroxyaceticacid)、过氧化氢(bydrogenperoxide))、醛类(如，甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)、邻苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde))、卤素试剂(如，碘)、Sterilox、乙醇、酸、及碱等。该辅溶剂的添加时间与添加量是本领域枝术人员视需要而加以决定，并无特别限制。

本发明的方法不但可以去除冠状病毒的活性，更能够从待处理物移除可能存在的冠状病毒。另一方面，本发明的方法也可用于使酶或与冠状病毒有关的生物物质去活性，进而借由抑制蛋白脢的途径达到抑制冠状病毒散播及繁殖的目的。

实施例1至4

材料：

使用ST细胞株(来源ATCCCRL-1746)-第114代，冠状病毒属的传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)台湾野外分离株(TFI)

方法：

1.取病毒力价TCID₅₀为10⁸/ml的TGEV解冻后，滴于滤纸使其吸附于其上，加入1％的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，冷冻干燥后，密封存于4℃备用。

2.在雷诺数为2000的非紊流条件下，将压力为190bar、温度为40℃的超临界二氧化碳导入含有样品的处理槽进行火菌处理2小时，该超临界二氧化碳的导入比例以每克样品计是300克。

3.回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘ST细胞株进行TCID₅₀检定。

4.重复进行上述实验步骤以获得实施例1至4的TCID₅₀值，求取上述实施例的TCID₅₀值的平均以计算等比中数A(geometric mean)，并将结果纪录于表1。

实施例5至8

材料：

使用ST细胞株(来源ATCCCRL-1746)-第114代，冠状病毒属的传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)台湾野外分离株(TFI)

方法：

1.取病毒力价TCID₅₀为10⁸/ml的TGEV解冻后，滴于滤纸使其吸附于其上，加入1％的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，冷冻干燥后，密封存于4℃备用。

2.在雷诺数为2000的非紊流条件下，将压力为190bar、温度为50℃的超临界二氧化碳导入含有样品的处理槽进行灭菌处理1小时，该超临界二氧化碳的导入比例以克样品计是3000克。

3.回收样品，进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘ST细胞株进行TCID₅₀检定。

4.重复进行上述实验步骤以获得实施例 5至8的TCID₅₀值，求取上述实施例TCID₅₀值的平均以计算等比中数B，并将结果纪录于表1。

对照例1至2

材料：

使用ST细胞株(来源ATCCCRL-1746)-第114代，冠状病毒属的传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)台湾野外分离株(TFI)

方法：

1.取病毒力价TCID₅₀为10⁸/ml的TGEV解冻后，滴于滤纸使其吸附于其上，加入1％的明胶(gelatin)，平均分装至玻璃小瓶，冷冻干燥后，密封存于4℃备用。

2.样品进行离心，取上清液，使用Reed-Muench法，以96孔盘ST细胞株进行TCID₅₀检定。

3.重复进行上述实验步骤以获得 对照例1至2的TCID₅₀值，求取上述对照例的TCID₅₀值的平均以计算等比中数C。

4.分别将实验对照组的等比中数C除以经由超临界二氧化碳处理所获得的等比中数A与B，可得知病毒减少倍数，并将结果纪录于表1。

表一

样品	TCID50	等比中数(A、B、C)	C/A或C/B
				实施例1	4762	4078.071	127.9733
实施例2	5315
		实施例3	5315
实施例4	2056
		实施例5	3279	3851.88	135.4882
实施例6	3125
		实施例7	4042
实施例8	5315
		对照例1	409948			521884.4
对照例2	664385

由上述结果可知，相较于未经灭菌处理的对照样品，使用本发明的方法进行灭菌处理的样品，其病毒力价分别减少128及135倍。对于冠状病毒而言，本发明的方法具有去活性效果，且能避免使用毒性添加剂而发生残留的情形。

Claims (18)

1.利用超临界流体去除冠状病毒活性的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(a)在雷诺数小于或等于2000的非紊流条件下，将超临界二氧化碳导入含有待处理物的容器进行灭菌，该待处理物是可能带有冠状病毒的物品或物质；以及

(b)从该待处理物移除该超临界二氧化碳，使该可能存在于待处理物的冠状病毒失去活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例是100至500克的范围。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，以每克待处理物计，该超临界二氧化碳的导入比例是300克。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是60至240bar的范围。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的压力是190bar。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是40至80℃的范围。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是50℃。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该步骤(a)的灭菌是进行1小时。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该超临界二氧化碳的温度是40℃。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该步骤(a)的灭菌是进行2小时。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该步骤(a)是更进一步将辅溶剂加入该超临界二氧化碳。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该辅溶剂是有机溶剂。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该有机溶剂是选自由丙酮、己烷、二氧杂环己烷、苯、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、环己烷、三氯甲烷、二氯甲烷、吡啶、乙醚、硝基甲烷、及苯甲醚所构成的组群中的一种。

14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该辅溶剂是生物制剂。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该生物制剂选自由过乙酸、过氧化氢、甲醛、戊二醛、邻苯二甲醛、碘、及乙醇所构成的组群中的一种。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该步骤(b)更进一步从该待处理物移除可能存在的冠状病毒。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法用于去除酶的活性。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法用于去除冠状病毒有关的生物物质的活性。