TW201036653A - Collagen/ elastin crosslinking materials and use thereof - Google Patents

Description

201036653 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於使用來自魚類之彈力蛋自與來自魚類之 白之交聯物及其用途。 【先前技術】 使师原蛋白之鑛被覆材或人造真皮 繼23號說明書、日本專利第3772232號說明書、 Ο 書等’且亦有實際市售品。但於此等所使用之膠原 蛋白’其大刀採自牛、豬等家畜之組織，而近年BSE(B〇vine 牛#nr=pathy、牛海雜腦病)之問題浮現，使用含有 料之膠原蛋白製品’有病原感染人類危險 在此種背景中，希望研發生物親和性高、細胞侵人性 縮似真皮組織後快速表現生物分解性等特性 ，使用末自牛、豬寺哺乳動物以外材料之人造真皮 953^/=蛋㈣泡體片材及其用途（日本特開薦一 水溶液或懸浮液中加熱時變性成為师。變性之 ’被生減巾之蛋白轉酶分解而容易 性溫痛凝膠強度弱之缺點。為防止變性而須要在變 應^點。订α，但在低溫下有視交聯劑種類而不能進行反 纖維力蛋白為勒帶、皮膚等各種組織或器官之彈性 器官再生之醫療 :材正在探討彈力蛋白作為損 本特Α平6 —30616號公報揭示將水溶性彈力蛋白與可溶性 201036653 膠原蛋白在冷時混合而成之成型用組成物。又，國際公 2002/96978號說明小册(WO2002/96978號)揭示將彈力蛋H二 劑進行交聯時，使膠原蛋白等成分化學性鍵結而成 聯物’及其醫療㈣具及再生域。 [專利文獻1]曰本專利第2997823號說明書 [專利文獻2]日本專利第3772232號說明書 [專利文獻3]日本專利第31〇5308號說明書 [專利文獻4]日本特開20〇5 —95B1號公報 [專利文獻5]曰本特公平6 —30616號公報 [專利文獻6]國際公開第2002/96978號說明小册 【發明内容】 「發明欲解決之課題」 f原蛋白及彈力蛋白’作為人造真皮製造用材料及 等用途而備受注目，但以現狀而言，在原材料來源、 =^前在先前技術文射，尚未絲示伽來自魚類之 覆材或人造真皮者。又，來自魚類之膠原蛋白盘 庫凝膠強度弱之缺點。為防止變性而 能進τ應，轉低訂有贼制種類而不 取3_號公報記載將核性彈力蛋白與可溶性 冷喊合喊之成域物，及使料喊得之膜 =^。ϊίϊ賴射域物製得之構造體®未實施交聯等不 ;ίίΐ時無法在水中長時間保持形態。又，人造真= =但由該公報所記載之成型用組成物不易麟 國際公開第2002/96978號說明小册揭示將水溶性彈力蛋白以 201036653 ί=^聯時化學性鍵結膠原蛋自而成之交聯物及其作為醫 i用途。但’國際公開第麗/96978號說明小册所記載 戶^’、喊因交聯劑或交聯條件而流人模型困難、反應速 二:難、不能製得目標形狀及性質之交聯體等。再者，即使 法製得交聯體’亦有料能充分對應包括人造真皮之醫 療用材料及細胞培養基礎材料等各種用途。 聯 本發明之目的在於提供絲充分對應包括人造真皮之醫療用 ^料及細胞培養基礎材料等各種用途之膠原蛋白/彈力蛋白交 「解決課題之方法」 本發明之交聯物，其特徵在於··係藉由將來自魚 白及來自魚類之彈力蛋白交聯而獲得。

〇 類之膠原蛋 明之交聯物之製造方法，其特徵為具有以下步驟： 在來自魚類之彈力蛋白不引起凝聚(coacervati〇狀條件下， ^備溶解來自魚類之_蛋自與來自魚類之彈力蛋白之溶液之步 驟’及 、+·ΐ來自魚類之彈力蛋白不狀凝聚之條件下’添加交聯劑於 上述溶液，在冷凍乾燥中形成交聯製得交聯物之步驟，或 、 "私，來自魚類之彈力蛋白不5丨絲聚之條件下’將上述溶液進 订乾無，再將所得乾燥物進行交聯之步驟。 又 m i 交聯物之製造綠，其特徵為：將上述未交聯 乾無物進仃交聯之方法，以使用交聯劑之交聯、熱 利用照射料線或放轉之交聯、此等單獨餘合 水之交聯物。 衣灯个/合不 本叙明之醫療用材料，特徵在於：含有上述交聯物。又， 發明之細胞培養基礎材料’特徵在於：含有上述交聯物。又 發明之化粧品基材，特徵在於··含有上述交聯物。 「發明效果」 依據本發明，能夠提供充分對應包括人造真皮之醫療用材料 及細胞培養基礎材料等各種用途之來自魚類原料之膠原蛋白/彈力 201036653 蛋白，聯物及其製造方法，並提供利用該朦原蛋白/彈力蛋白交聯 物製得之醫療用材料、細胞培養基礎材料、化粧品基材之用途。 【實施方式】 在本發明，使用來自魚類之彈力蛋白。製備彈力蛋白用之魚 t如能fy鱒氣等餘形叫alm〇n#_e推科_monidae),箱 '、、、經魚寺驢形目鯖科(免0所知油㈡， ，長縣單線魚(Lin=+t ^twdon elongatus)等紬亞B㈣六象备科 tTrm。就彈力蛋白而言，為與膠原蛋白形成交聯物 ，于句勻之父如物，以水溶性彈力蛋白較佳。水溶性彈力蛋白，

Sin合成歸之祕力蛋白，彈力蛋—酸及驗處理

Si Hi f、r彈力蛋白’及以酵素處理所得之彈力蛋白 械強产之八子使f之?力蛋白以製備交聯物時容易獲得機 槭強度之/刀子1整背一致之高分子α—彈力蛋白為宜。 平：^ J發明所使用彈力蛋自之分子量並無制限定，其重量 千均分子1以約1萬〜10萬較佳。 巧力蛋自娜紐自味時，雖然在生物體巾之 ，膠原蛋白相同其生物體親和性高，故^ :顧，柔軟性。又，α一彈力蛋白因具有附 、，-田胞黏著、抑制血小板凝料生物學功能，故使用 交聯物原料時，期待能夠附加此等生物學功能《^ 為 來自魚類之彈力蛋白之製備，可依常法進行。 二以的：有其胺級組成與來自 旦盘ΐΐί本發明利用之來自魚類之彈力蛋白，Μ成胺基酸含 里ΐίΪ之彈力蛋白不同之例可舉如下述組成(πκί/〇)Γ 甘胺酸：35〜45% 201036653 •丙胺酸：10〜20% •纈胺酸：3〜8% •異鎖鍊素：0.1〜1.0% •鎖鍊素：0.1〜1.0% •非極性胺基酸合計為67〜77%

又’於上述胺基酸組成，其分析對象胺基酸為：甘胺酸(Gly)、 丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(lieu)、絲胺酸 (Ser)、酥胺酸(Thr)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、離胺酸(Lys)、 精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、羥離胺酸(Hylys)、半胱胺酸(Cys)、甲 硫胺酸(Met)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺酸(Pro)、羥脯胺 酸(Hypro)、異鎖鍊素(IS0-Des)及鎖鍊素(Des)。上述甘胺酸、丙胺 酸、纈胺酸、異鎖鍊素、鎖鍊素以外之胺基酸含量(m〇1%)例示如 下0 •白胺酸：3.4〜4.5 •異白胺酸：0.9〜1.9 •絲胺酸：3.1〜3.4 •酥胺酸：3.1〜6.5 •天門冬胺酸：1.6〜2.9 •麩胺酸：3.2〜4.3 •離胺酸：0.7〜1.5 •精胺酸：1.6〜Z6 •組胺酸：0.2〜0.8 •羥離胺酸：0 •半胱胺酸：0〜0.2 •曱硫胺酸：0.4〜〇.7 •酪胺酸：3.4〜4.4 •苯丙胺酸：1.1〜3.1 •脯胺酸：8.6〜10.1 •羥脯胺酸：0.5〜〇.9 膠原蛋白。膠原蛋白 另一方面，膠原蛋白亦使用來自魚類之 7 201036653 製備用魚類，如鮮备 ^ _ ，缔;二、嫩專二=缝形目‘鞋科 /ς, , . j ." 態魚寺鑪形目CPerci/brmes)績科 =二等五驢r—樹= 白，由與彈力；====):觀 由魚類製備=可依= t存在其主要抗原部位之末端胜肽(TelGP_e)。如 盾唇白ίϋΐ此部位時’膠原蛋白之抗原性極端減低。此卿 料及組蛋白(atel〇C〇Uagen) ’應用於跡用植入材 白备麵^土 =用1礎材料。本發明所使用之可溶性膠原蛋白以來 自…、類之去％狀膠原蛋白較佳。 工A v fx月所使用膠原蛋白之分子量並無特別限定，其重量 平均分子量以約1萬〜30萬較佳。 $自魚類之膠原蛋自絲自牛、豬之獅蛋自比較時，直胺 基馱、、且成不同，如脯胺酸及羥脯胺酸含量低。又，膠原蛋白呈有 溫度社時變㈣霄化之性質，但來自魚類之膠原蛋白 …來^牛、豬之膠原蛋白比較時，其變性溫度通常較低。 旦，夠在本發明利用之來自魚類之膠原蛋白，其組成胺基酸含 1與來自動物之膠原蛋白不同之例可舉如下述組成(mol%)。 •甘胺酸：34〜40% •脯胺酸： •羥脯胺酸：4.0〜8.0% •組胺酸：0.8〜2.0% 又’於上述胺基酸組成，其分析對象胺基酸為：甘胺酸(Gly)、 丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸贝邱）、絲胺酸 (Ser)、酥胺酸(¾)、天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、離胺酸(Lys)、 精&c酸(Arg)、組胺酸(His)、經離胺酸(Hylys)、半胱胺酸(Cys)、甲 硫胺酸(Met)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)、苯丙胺酸(phe)、脯胺酸 (Pro)、及翻_膽胺酸(Hypro)。 上述甘胺酸、脯胺酸、經脯胺酸、組胺酸以外之胺基酸含量 201036653 (mol%)例示如下。 •丙胺酸：10.5〜15ό .纈胺酸：1.1〜2>2 .白胺酸：1.5〜U •異白胺酸：〇,5〜u •絲胺酸：3.5〜 •酥胺酸：2.1〜％ •天門冬胺酸：4.3〜；5.3 •麵胺酸：7.4〜 Ο Ο •離胺酸：2.4〜19 •精胺酸：4.9〜5.5 •羥離胺酸：〇.5〜α8 •半胱胺酸：〇〜0.2 •甲硫胺酸：0.3〜1>7 •色胺酸：0 •酪胺酸：0.2〜0.3 •苯丙胺酸：l.l〜i 4 萨物t 白與膠原蛋白之交聯物時可使用交聯劑。尤发 度文定性時’使用交聯劑較好。至於交聯劑，只聋 環氧ί ί耳:炭二邮胺系、疊氮系、_酸系、三口并1 =氧糸4父％別(縮合劑）。又’亦可使用助縮合劑，如Ν—羥其 :羧酉&亞胺類、Ν-羥基三唑類、三畊類、2_羥亞胺基_2__氰羞 酉文乙S曰（2-hydroxyimino-2-cyanoethylacetate )等。此等縮合劑今 ，合劑如當做S療職料使料，以·低殘·及低毒性者 本發明之交聯物，可將來自魚類之彈力蛋白與來自魚類之膠 原蛋白，利用使用交聯劑之交聯法、利用熱之交聯法、利用^ 線或放射線之交聯法製造。為獲得當做人造真皮等醫療用材球斗、 細胞培養基礎材料及化粧品基劑之特性，以具有下述步 i、告 方法製造交聯物較好。 ^ 9 201036653 白不魚類之膠原蛋自與來自魚類之彈力蛋白在彈力蛋 之條件下進行溶解以製備溶液之步驟； 造交=物之舞步力驟蛋白不發生凝聚之條件下，由步驟㈧製得之溶液製 步驟(B)可使用下述步驟(b—J)或步驟(b —2)。 步驟 产、方法’可利用冷;東乾燥、真空乾燥、吹風乾 燥、自然、乾燥等。又妙驟⑻之後，可再 ===；；===聯、细料線或放射線之交 因此H(造方法具有以下特徵 :並在此狀態，於溶有 牛驟· 使在冷康乾無中形成交聯以製得交聯物之 ^驟^將雜液挪力蛋白不發錢聚之齡 將所付乾燦物進行交聯之步驟。水溶性彈白二 聯劑種類或交耳ΐϋ狀水物不均勾交聯，更視交 i 液中，應使彈力蛋料發生凝聚為 杆反雍^, 不發生凝聚之條件下使膝原蛋白鱼交聯劑進 有更均質ii孔分’亦能夠形成具 $行交聯，軸;中會產生彈力蛋:白 在交聯物全體不能充分形成交聯結構的情形財杨發生 定。性彈力蛋白種類而設 田U 40 C/皿度耗圍及卜邮範圍選擇之溫度及 10 201036653 pH條件。 另-方面’膠原蛋白在某—溫度以上即變性成明膠 膠原蛋白㈣溶於搞強度弱，故祕生物體中之蛋白 解吸收’而不適於在生物體中要求適當蚊性之醫療用村料。: 上述理由，製備溶液及進行交聯必須在變性溫度以下 魚類之膠，白變性溫度-般據說為2叱上下，故在較低於$ 度之溫度範ffiit行製備溶液及交聯反應為宜。又， ’二 Ο 〇 f中性PH範圍較酸性pH範圍可溶化，但在驗性則稀化^ 質。由上述種種，欲使含膠原蛋白之組成物在均—條件下 聯，則溶解膠原蛋白之溶液之pH以i〜7較佳，3〜6 又 因此’要獲得彈力蛋白與膠原蛋白之均質 兩^ 溶解之狀態。亦即，溫度為彈力蛋白不發生;;;膠;J = 性，10 C以下’並以〇〜5。。更佳，而pH為彈力蛋白二 $原蛋白溶解之PH3〜6，並以所選擇之交聯劑容易反^之^ 溶解彈力蛋白與膠原蛋白時之溶劑，可使 界面活_之水，含低濃度水溶性有機溶劑之轉。心&驗、 彈力蛋白與_蛋白混合比例(重量％) 0.5%〜99.5%細為佳。並以！重1以 得良好多孔質之成型體，’可製得當做包括从要直在^=5 具、細胞培魏礎材料及健^細之良好絲物。西療用时 將J有彈力蛋白與膠原蛋白之乾燥物進行 法，可應用使用交聯劑之化學交聯、利 卞之又1汁方 放射線_。亦即，含有彈力&外線或 添加交欄，亦可熱、紫外線及放射線之至少不 物不溶解於溶針，在高濃度_水溶液1，燥 聯劑存在下進行交聯。 手之〜射，亚因應須要在交 交聯劍之配合_(„%)絲_較，但树於進行交聯 201036653 〜5G%健。欲製得#做 礎材料纖品基劑之良好卿= 量中力原蛋白進行交聯時，其等之濃度(重 $=："，、将別限疋，但考慮膠原蛋白及彈 以g.5〜較佳。欲製得當做“ 成形物礎材料及化輕品基劑之良好 定力f自交聯體之魅枝並無特別限 劑加入含有彈力型。例如將交聯 乾燥進行交聯，或“有彈^蛋白型再將此冷滚 衡成雜。《此方法 狀、線狀、膜狀、棒狀蛋白二“管用模型之海绵 麟法使成型城狀。例如將交聯劑加 力、=== 燥，藉此3聯體；或?原： 等基板上薄薄地展開後，去除溶劑並乾^ : 、于月曰 狀膠原蛋白/彈力蛋白交聯體。比沾所侍物進仃交聯即得臈 類之與谬原蛋白外，亦可添加來自魚 其分 =二產生膠原蛋白之效果。來自,4皮之===; 科之DNA寻。又，本發明所使用DNA 、， 來自<''土 以重量平均分子量約i萬〜麵萬較佳/子里亚無特別限定， 魚精蛋白為特異性存在於脊椎動物精 抗菌效果故期望對創傷有預防感染作用。3二3具有 科之链精蛋白(saW)、來自鯡科之_精蛋白等自缝 12 201036653 構成魚精蛋白之胺基酸以精胺酸含量較多，來自鮭科之魚 蛋白之鮭精蛋白約含70%精胺酸，如膠原蛋白/彈力蛋白多孔 有魚精蛋白時，因其生物體中之分解過程而產生精胺酸。I 能狗抑制伴隨組織發炎釋出之過多細胞激素(cytokine)(給予刺激 之生理活性物質)之表現。又，精胺酸為產生N〇(—氧化幻之代表 Ζ ί有攻擊腫瘤細胞或受感染細胞之作用。再者，精胺 I對Τ此球之成熟具有重要作用。如上所述，精胺酸且有活化 細胞增舰果，促進膠原蛋白生成效果等，亦為 促進’σ療創傷或褥瘡之重要胺基酸。 Ο 〇 因此，添加此縣自魚類之DNA或魚精蛋自於縣蛋白 力蛋白交聯物時，可雜杨上叙效果。鱗 使得能夠賦予交聯物目標物性、特性或功能性而^之^;g 無^限定:相對於膠原蛋白與彈力蛋白合計量，添加〇·5%〜5〇% 之DNA及或魚精蛋白，並以1〜20%較佳。 再者，本發明之交聯物除添加來自魚類之彈力蛋白與膠原蛋 加粉末狀_粒狀―酸妈。該交聯物能夠應用於作 劑或促進骨再生劑、或在骨缺損部位則丨導或促進 月形成為目的之骨填補材料，但其用途不限定於此等。 阶人墙ίίΓί量以能夠賦予交聯物目標物性、特性或功能性而 η ς。/5里無4寸別限疋，相對於勝原蛋白與彈力蛋白合計量， 添加0.5/。〜50%之磷酸約，並以丨〜2〇%較佳。 磷S曼飼如氫氧鱗灰石脱）、鱗酸三鈣(a—TCp、卜丁 ί ίί 合物(DCPD)、鱗酸八約(ocp)、填酸四妈(TeCP)、碳酸 石拜灰石(CAP)等，此等可使用至少1種。 能獲得由非水溶性且均質之複合物構成之交聯 培養基礎多獲Γ合當做人造真皮或細胞 胸碟結構。再者，製造有關本發明之交聯物所 膠原蛋白’非為有舰(牛海錦狀腦病)等傳染病之 二入哺礼動物之原料，而為來自魚類之天然原料，故 月b夠徒供更文全之交聯物。 13 201036653 有關本發明之交聯物，由於 3 蛋白提升生物體中之安定性力蛋白，錄早獨之膠原 解性，故細合醫=^；度，_雛物體中之分 做人為·且具有適合當 皮使用時，其皮膚纖;===，因人造真 熱傷、褥㈣而受損及收，故越因創傷、 成分欠缺部位。因此依傷面，能夠使用於真皮 人造真皮。 據本I明，此夠提供有效促進創傷治癒之 系統，_ 因=: ί皮亦達並供給患料須要雜。又，不僅人造 聯物’能夠應用於骨再生基材，但亦可使其 基因骨形成因子如骨形成蛋白質(歸)、 子(FGn、R》ΛΓ碰）’生長因子如纖維芽細胞生長因 长叉朱材#)、移植材料等醫療用材料 長因子(TGF—Ρ)、上皮细子^、 至少可使用1 Γ二i *因子(IGF)、血小板由來生長因子师奶、血管内皮 :胞生長因子(VEGF)、神經營養因子(NGF)#，(此等）血吕内皮 今里 料用ϊίΐϋί;能夠應用㈣剌及細胞培養基礎材 識理想纽料構，因此㈣特軟骨樣組 骨目此補本㈣，能酸财效促進軟 有關本發日狀交善.，錢含錢財醫療用及細胞培養基 14 201036653 礎材料用之軟骨再生基材之軟骨分化引導因子及生長因子。軟骨 分化引導因子如β轉形作用生長因子(TGF —β)、骨形成蛋白質 (BMP)、基因重組人骨形成蛋白質(邮辦)，s〇x基因組(s〇x9、s〇x5 或Sox6)等’此等至少可使用1種。 本發明之膠原蛋白/彈力蛋白交聯物，能夠作為於化粧品基 材。化粧品基材可使用於化粧用面膜及濕片材等。尤其以多孔體 狀態能夠含浸多量化粧水或美容液，故能夠期待膠原蛋白、彈力 蛋白之功能。當做化粧用面膜使用時，可利用厚度約丨〜5_之 片狀多孔體，且符合顏面形狀或覆蓋部分顏面形狀者。

「實施例」 其次以實關詳細記載實施本發明之最佳職，但本發明不 ΐΐίΐΐ例之限定。又於下述實施例，若非另有特別規定，「％」 為重I基準。 [實施例1] 彈力蛋白之 (來自魚類之去端肽膠原蛋白及來自魚類之水溶性 細胞毒性試驗） 魚皮之去端肽膠原蛋白及來自链魚心月 評價細胞制形成皮膚基f中主體之人正1 ίίίίί;匕Γ包:性試驗以WST—1檢測法實施。wst-ίΙίΛίΐ f ，乃以比色定量(歌波長45g_ws' ϋ ΓΓ 作用而分解產生之甲膳(Fo酿zan)，利用』 有胞則定活細胞數。所得結果示如圖1及3 ^有4在（M〜1(WmL濃度之細胞存活率高，__ [實施例2] 製f ί自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體） …自‘鞋魚皮之去端狀膠原蛋白及來自 (重_騎原蛋轉力蛋㈣·· 2。加去離子水於此 15 201036653 膠原蛋白/彈力蛋白混合粉末，在冷藏(3。〇下麟得濃度 5%之膠 原蛋白力蛋白混合溶液。對於製備之膠原蛋白/彈力蛋白混合溶 液’於冷藏下(3。〇加入;EDC(交聯劑：1-乙基各(3-二曱基胺基丙 基）-羰二 醯亞胺 氯化氫 (1 Ethyl 3 (3-dimetylaminopropyl)-carbodiimidehydrochloride、東京 化成(股))水，液並混合(EDC添加量為使相對於膠原蛋白之彈力 ^白=總，量，EDC為20%(w/w))。將添加有EDC:之膠原蛋白/ ^力蛋白混合溶液流人目的形狀之模型，絲乾燥制膠原蛋白/ 1蛋白纽體。將得到鱗原蛋自/彈力蛋白多孔體以離子交換 ，清洗。清後，使含水狀態之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷象乾 無’得到膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。 —以掃描式電子顯微鏡(JE〇L製，腦―638〇LV，以下稱為s 觀^寻到之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結果孔之大小為5〇 〜ΙΟΟμιη，孔徑一致(參照圖3)。 [實施例3] ^吏用熱交聯製備來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製 I用jy j夕 ，實關1仙者囉，使絲自,喊皮之去端肽膠原蛋白 歸、續之水溶轉力蛋自*财孔體。亦即，在試管中 自鮭魚皮之去端肽膠原蛋白及來自鮭魚心臟之水溶性彈力 晚/5疋使配《合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋自=7 : 3。於此混合 ^糾、曲力蛋白粉末中加入去離子水，並於冷藏下攪拌， 膠白/彈力蛋白混合溶液。將該混合溶液流入 減^東乾祕到冷練祕。將該冷綠燥物於 雕y'24交聯’得到膠原蛋白/彈力蛋白多孔 二2_的夕孔體放人水中，結果縣著形狀i週以上。 二ίί t製，JSM_6380LV，以下稱SEM)觀察得到 實施例4]由於在膠原蛋白添加彈域白所造成之多孔體之物 16 201036653 性變化 彈力皮之去端肽膠原蛋白及來自缝魚心臟之水溶性 之多孔體、對ϋΐΐ2同樣交聯方法，分別製備膠原蛋白1⑻％ 狀(直徑)之彈力蛋白的多孔體為同樣大小及形 定為W 圓柱狀)(膠原蛋白與彈力蛋白合計濃度 朦。以體於水中放置24 *時，成為膨潤狀態之凝 苴钍果，口·sun切aku(股))測定其凝隳之機械強度。 Ο 〇

Si獅：=== [實施例5] 礎材縣自/彈力蛋咖_為顧細胞培養基 蛋白ΐ用孔與體tr，jn2以同f方法製備之來自魚類之勝原蛋白/彈力 it 厚度3mm)。作為評價用細胞，使用 胞。胞不死化株）、人類皮膚正常纖維芽細 孔培養平盤。其次，各將含細胞之培養液& 5ΧΚ)5個/mL)lmL滲入各海綿後，注入lmL培養液養$ 養。細胞之存活顧與賴學評價1 弟i 、日實施。細胞之存活顧，使用WST-i檢測 ^。亦即’為了除去轉在培養平盤的細胞，僅測定生著 在夕，之=胞’將多孔體移到新的培養平盤。將2〜3此的赠 a士液Ιΐί液〇 : 1〇)注入新的培養平盤，以此狀態使反應4小 平^項取儀測定吸光度。組織學評價，係將膠原蛋白/彈力 並料㈣辦，㈣後進行蘇 17 201036653 以WST—1檢測法變法所得結果如表1 表1 評價細胞 纖維芽細胞

WFB 細胞濃度(锢/inL) —度(O.D·) 第14曰 5xl〇5 ;xl〇- 第28曰 0.78 0.81 0.14 0.54 如表1所示，兩細胞與空白組(無細胞)比較時，均明顯 =，又’相較於第14日，第28日的吸光度增大，因此，暗示 =孔體内存活且增射。將培養組_色並於顯微鏡下觀察， 膚正常纖維芽細胞，獅的細胞均為細胞彼此黏着， 的為附耆在夕孔體。由此可知、類之膠原蛋白/彈 孔體可作為細胞培養基礎材料使用。 [實施例6] Μ /彈力蛋自多聽躲生物翻(大鼠皮 ，用以與實施例2同樣方法製備之來自魚類之膠原蛋白/ 蛋白夕孔體(直徑llmmx厚度5mm)。對於Wister系大鼠(4週齡、 约200g、雌)施以乙_L醉’將背部的毛以電動刺刀刺掉。以7 切開背^膚約lcm’於皮下(肉狀膜下)製作直徑約lem 埋入經環A乙餘體滅菌之纽體，从龍 、 ，曰起算第3、7、14、21、28、56日，將大鼠計=地=， 多孔?之部分進行生物檢驗。將組織以福馬林固定後， 觀察多孔巧入後之、輯，結果於雜袖，二H圍 可3見發炎細胞潤、毛細血管、纖維芽細胞·内皮細胞的_ 2、牙組之後肉芽組織增生，產生新的膠原纖維(膠原蛋： 等），於第56日姐完全触m纽體^被^白 吸^，於第56日^全被吸收(參照圖7)。此結果與以^^ 用膠原蛋白之人I、皮的pemac(販售商；J〇hns〇n&版⑽ 造商；Gunze)之動物實驗的結果大致同等。 襄 18 201036653 [實施例7] _ (來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體移植到大鼠皮膚缺損 創傷的試驗） Ο Ο 以與實施例2同樣方法製備來自魚類之膠原蛋自/彈力蛋白多 孔體(直徑20mmx厚度5mm)，樣品組以其作為移植材料。對照組 以市售之使用膠原蛋白之人造真皮的TERUDERMIS(膠原蛋白單 層型、Terumo製)作為移植材料。對於胸过系大鼠施以乙 醉，在背部製作直徑❸15咖❺皮膚缺損創傷，於缺損創傷放置 移植材料，以敷g保翻·將缺損創傷及移植材料完全覆蓋， 藥保護材及皮膚斷端以尼龍線缝合。為了使雜材料與其 合’以料輕輕地壓迫’再以觸性鱗壓迫固定。製作無 材料之開放鑛組、使絲自絲之膠原蛋自/彈力蛋自多^ 3植材料之樣品組、伽TERUDE麵s作為移植材料之對= 、，且，、3組’且同樣的處置對於各組進行$隻。 各組均未確認__驗絲之試樣埋人的社及感染等。 ί 眼硯察，樣品組於受術後，創面未急速收縮，於第7日， //Λ為J1H。開放創傷組之創面於手術後開始急速收縮，於 、/σ癒。經時比較探討創面大小的結果，開放創傷袓之 起急賴純縮，相對於此，樣品組及對照組， ϊίίί 3較徐、紐生(參關8、9)。進行創_癒面)之組 邱电截Ϊ牙細胞及血管内皮細胞等。於術後第14日，下 二；疤組織，從其上部之皮膚斷端，有再生上皮伸 纽：二二Γ細f成分、毛細血管，深層部位的㈣包成分減 ii'i 果與市售人造真皮取職麵s的結 [實施例8] 備例)(使用交聯織備添加眶之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體之製 與實施例1使用者同樣，使用來自'娃魚皮之去端肽膠原蛋白 19 201036653 與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋白製備多孔體。亦即，於試管量 取來自鮭魚皮之去端肽踢原蛋白與來自鮭魚心臟之水溶性彈力蛋 白，使配。合比(重量比)為膠原蛋白/彈力蛋白=8: 2。於此混合膠 原蛋白/彈力蛋白粉末加人去離子水，於冷藏下(阳獅，得到濃 之膠原蛋白7彈力蛋白混合溶液。於來自經魚雄魚生殖腺之 DNA加入去離子水，於冷藏下(3。〇攪拌，得到濃度抓之

DNA 溶液。 pH域製備之濃度5%之膠原蛋自/彈力蛋自混合溶液，添 S二容液，使重量比為8:2，於冷藏下(3。〇攪拌， :义力膠f白白，入蛋广，對^ ，，水溶液並混合(對於膠縣白、彈力‘及DN/之= Ϊ蛋ί 吏ii〇r°(W/W)) °將添加有E欧添加舰I膠 合減流人目的形狀之模型，冷棘燥得到添 觀察力以二：f V’以下稱為SEM) 孔大，一 多孔體之構造’結果 [貫施例9] 之製ίΪί交聯劑製備添加魚精蛋白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體 與來，使絲自衫皮之去端肽膠原蛋白 Ϊ 原蛋白與來自衫心臟之 原蛋‘力上力如=8:2。於此混合膠 末力入去離子水，於冷藏下抑贿半，得到濃 20 201036653 $精蛋白蛋自混合練。Κ紐魚生殖腺來源的 蛋白ίi 備ttff)·，得到濃度版魚精 ο ί拌、，得ί^/°ίΐ精蛋白溶液，使重量比為8:2,於冷藏下的） 加魚精ί itim白^膠原蛋白/彈力蛋白混合液。對於此添 l-Ethyl-3-(3-dinTeM蛋白/弹力蛋白混合液，添加EDC(交聯劑： 仆心μΛ 々以 amm〇Pr〇Pyl)_Carb〇diimide hy—cWoride、東亨 :=====、爾嫩精蛋白 之膠原蛋_力=3r ) 4EDC之添加魚精蛋白 到添加魚精蛋白形狀之模型’冷滚乾燥得 蛋白之膠原蛋白;得到的添加魚精 得白之膠原蛋白/彈力蛋白多孔體冷束乾燥， 膠原蛋白/彈力蛋白多孔體。 觀突得至顯微鏡(正0L製’JSM—638〇Lv，以下稱為se^) 果2的大小二T〇t白J；膠J蛋白/彈力蛋白多孔體之構造，結 [實施例1〇] 孔役為一致⑽圖11)。 Ο 體之聯劑製備添加經基麟灰石之膠原蛋白/彈力蛋白多孔 斑來fit例上吏Γ者同樣’使用來自娃魚皮之去端肽膝原蛋白 取ί自ίΓΐΪϋ溶1彈力蛋白製備多孔體。亦即，於試管量 白，使配二比(重原蛋白與來自娃魚心臟之水溶性彈力蛋 ί疋)為膠原蛋白/彈力蛋白=8:2。於此混合夥 度之膠/疋加入去離子水’於冷藏下(3。〇攪拌，得到濃 I白、η入^弹力蛋白混合溶液。對於製備之膠原蛋白/彈力 入經基鱗灰石（以下，稱為似），使朦原蛋白盥 量與取之重量比為8:2,於冷藏下⑽混合： 4'' .膠原蛋白/彈力蛋白混合液 ，加入EDC(交聯劑： y lmetylaminopr〇pyl)-carbodiimide hydrochloride、東京 21 201036653 於獅蛋白_力蛋白之總重量，添加 ^ZmC^ 減式電子顯微鏡(JE〇L製，了SM—638QLV，以下稱SE⑽ ft的添加HA之谬原蛋白/彈力蛋白多孔乂下冉 =) 大小為約ΙΟΟμιη(參照圖12)。 <稱w 、、，σ果孔 [實施例11] f用原^自解力蛋自纽聽財再生躺之利用） 蛋白I】2明樣方法製備之來自絲之_蛋白/彈力 膠原蛋白/彈力ί白度5mm)。將在培養液中經脱氣處置之 二I 泮力史白多孔體設置於10咖培養皿。豆次，將i立羞从

培回收並計數細胞數，將5Xl()6個再懸浮於5(%L f〇l注培養箱内開始培養。又，於12小時後將培養液 回收％η，、3曰或4日更換培養液一次。培養後第18曰 其以福馬林蚊後’包埋在石賴並薄切，作成组 =ί織切片進行蘇木素-伊紅染色、亞爾襄藍染色、ΐ苯 女i乐色、利用11型膠原蛋白抗體之免疫染色。 質被色(圖13)及甲苯胺藍染色(圖14)，細胞周圍的基 之^^忍為係含多量軟骨素硫酸或玻尿酸等酸性黏多糖類 人月土貝。又，甲苯胺藍染色觀察到軟骨細胞特徵的染色變化 染°又’利用將軟骨基質特徵含有之11型膠原蛋白 邊ί生軟骨‘ft體Γ為之免疫染色也係濃染’確認細胞周 f心（圖15)°由以上結果’暗示膠原蛋白/彈力蛋白多 肢成為軟骨細胞培養基材(Sca£fold)或軟骨再生基材。 [實施例12] 22 201036653 (膜狀之來自魚類之膠原蛋白/彈力蛋 與實施例1使用者同樣，使用夹口 衣備） 與來自娃魚心臟之水溶性彈力蛋白f膜土 1之去端月太膠原蛋白 ^%l-3-(3-dimethy^^

混ί(相對於膠原蛋白與彈力蛋白之總重量添 加EDC使為〇.5%(w/w))。將添加有EDC之此混 取 ^製>1材上’將其在放有乾制之錢 制= 5〇caT^} °^ 肢於減壓下’於i8(rc進行]l小時間加執處理。 著形====/彈力_合體浸泡於水，結果保持 [實施例13] (利用膠原蛋白/彈力蛋白複合體作為化粧品基材） 、、主、+將又°式者(2〇幾歲〜30幾歲的男性4名)的左前腕以肥息充分 =，水洗後將手擦乾。清洗3〇分鐘後，於左前腕内侧3處測定 态板，觸及的地方做記號。做記號的部位的黏彈性，以皮膚黏彈 性測定^置 Cutometer MPA 580(C〇umge+KhaZaka 社、測定模 =1)測定（塗佈前：〇時）。0時測定後，於各受試者的3處的記號 當中，1處貼附充份滲入市售化粧水的片狀膠原蛋白/彈力蛋白多 ^體，並放置15分鐘。又，片狀膠原蛋白/彈力蛋白多孔體係與實 巧例2以同樣方式製備。I5分鐘後，剝開含化粧水的膠原蛋白/ 彈力蛋白多孔體(簡稱CES +化粧水塗佈），同時於做記號的另— 處’塗佈化粧水。同樣對於全部4名的受試者，作成無塗佈部、 化粧水塗佈部、CES +化粧水塗佈部。塗佈2小時後，與上述以同 樣方式測定做記號的部位的皮膚黏彈性。 比較各部的塗佈前後的皮膚黏彈性値(R7値)的差異，CES + 23 201036653 部，皮膚黏彈性顯著上升(圖π)。又， w十化桩水塗佈部肉眼觀察未認為、j又 彈力[蛋/^^綠她品之躲，料^錄用蛋白/ =自.•臟之水溶性彈力i白去⑽; 去祕膝原蛋白與水溶性彈力蛋白，使配合比(重量比 彈ϋί複合體於減壓下於赋進行1何加 之膠原蛋白/彈力蛋白之交聯物。 表侑犋狀 中保=?=冗Γ力蛋白複合體浸泡於水’結果於水 【圖式簡單說明】 圖1顯示實施例1之來自魚類去端肽膠原蛋白細胞毒性 結果之圖(絲裂黴素c (細胞毒性物質；協和醱酵尺11^1^有限^司 販售）。 口 圖2表示實施例1之來自魚類水溶性彈力蛋白細胞毒性試驗 結果之圖(絲裂黴素C (細胞毒性物質；協和醱酵尺1:^有限公^ 販售）。 圖3顯示實施例2之使用交聯劑之來自魚類膠原蛋白/彈力蛋 白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：200倍）。 ^ 圖4顯示實施例3之使用熱交聯之來自魚類膠原蛋白/彈力蛋 白多孔體之掃瞄式電子顯微鏡圖像(SEM圖像：2〇〇倍）。 ^ 圖5顯示實施例4之添加彈力蛋白於膠原蛋白所製成多孔體 之斷裂強度之圖。 24 201036653 圖6顯示實施例4之添轉力蛋 之斷裂距離之圖。 '岭原蛋白所製成多孔體 圖7顯示實施例6之膠原蛋白/彈力 第56日之組織圖像(巨觀圖像）。 夕孔體埋入大鼠皮下 定為=示_7增_匕_讀_傷面積 圖二?實：二 =(，後…)。 Ο 〇 蛋白多孔體之掃猫式電子顯微鏡圖像(SEM圖^加^白/彈力 圖Π顯示實施例9之使用交聯劑之 倍）。 /彈力圖蛋= 孔體^抓谢顯微鏡圖像 圖13顯示實施例U之使用膠原蛋白/彈力 胞培養基礎材料所培養組織之亞_襄雖細b色4、、、田 |培養基雜料所培養_之？笨胺雖 你實施例11之使用膠原蛋白/彈力蛋白多孔體當做細 ί礎撕所料_之以n _原蛋自抗舰行免疫染色 之結果圖。 圖16顯示實施例12之膜狀膠原蛋白解力蛋物 態)之照相圖像。 圖17顯示實施例13之皮膚黏彈性測定結果之圖(4、盘CES +化粧水塗佈組，比較；t檢定：* *ρ<⑽、。 圖18顯不實施例14之膜狀膠原蛋白/彈力蛋白複合物(含水狀 態)之照相圖像。 【主要元件符號說明】 （無） 25

Claims (1)

1. 201036653 七、申請專利範圍： 類之彈性蛋由將來自魚類之膠原蛋白與來自魚 或六線魚科 奴交善，更包含dna及魚精蛋白 細14 2奴遍，蝴釘輯之製造 魚類 s==s'::=、r， =，^於該溶液《形成交聯之步驟， 使所传乂聯物進行乾燥之步驟。 乾^之^ ’ _^聯形成及 方法所1或2項之交聯物’係由包含下列步驟之製造 製備使來自魚類之膠原蛋白盥 ^ '、'、類之彈性蛋白不引起凝聚之條件下、容&:、之舞性蛋白在來自該 由該溶液製得乾燥物之步驟，及，知成之溶液之步驟， 7.如卿歧雜之步驟。 燥製^翻補^項之交聯物，其_，該乾燥物_用冷絲 其中’該交聯物 =====交聯物 9.如申爷日早⑱之父聯物提升。 中二至咖 交聯物，更包含微 項之交聯物，其係以多孔體 26 201036653 狀態製得。 12.如申睛專利範圍第1 態製得。 至10項中任一項之交聯物，其係以薄臈狀 ’其特徵在於包含下_: 魚類之彈性蛋“與來自魚類之彈性蛋白在來自該 左诗碟Μ疋ί引起嘁來之條件下溶解成之溶液之步驟， 成交聯^之步H引起凝聚之條件下添加交·於該溶液以形 Ο 〇 使所得交聯物進行乾燥之步驟。 13項之交聯物製造方法，其中，該交聯物之 紋步鶴糊冷絲燥進行。 ’ 製造方法’其特徵在於包含下列步驟： 魚類Ϊ彈二i魚類之膠原蛋白與來自魚類之彈性蛋白在來自該 4 白不引起凝聚之條件下溶解成之溶液之步驟， 由该溶液製得乾燥物之步驟，及 1乾雜進行交聯㈣成交聯物之步驟。 係利用isi。15項之纖靡方法，其中’該乾燥物 复中利|&圍第13至16項中任—項之交聯物之製造方法， &中，该父聯物以多孔體形式製得。 d月專利圍第13至16項中任—項之交聯物之製造方法， 具中，该交聯物以薄膜形式製得。 发=申利細第13至18項中任—項之交聯物之製造方法， 20上又如物之機械強度能夠較膠原蛋白單體之交聯物提升。 复·dJ 專利範圍第13至19項中任一項之交聯物之製造方法， ^ ’該溶液更包含DNA及魚精蛋白至少其中之一。 ·=申清專利範圍第13至2〇工員中任一項之交聯物之製造方法， 具中，該交聯物更包含磷酸鈣。 ^種醫療用材料’其特徵在於：包含如中請專利範圍第1至12 負中任一項之交聯物。 27