TW201026850A - PCV 2-based methods and compositions for the treatment of pigs - Google Patents

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201026850 六、發明說明： 本申請案主張於2008年12月15曰申請之美國臨時專利申 請案第61/122,555號之優先權。上述申請案之全部内容以 引用的方式全部併入本文中。 【先前技術】 豬環狀病毒（PCV)為環狀病毒科（circoviridae)之動物病 原體且為一些在哺乳動物細胞中自主複製之最小病毒。病 毒粒子為二十面體、無包膜、直徑為17 nm。目前，存在 兩種公認PCV類型，第1型豬環狀病毒（PCV1)及第2型豬環 狀病毒（？(^2)。？(：¥1不致病，？(：¥2與以下多種疾病及症 候群相關聯，包括（但不限於）斷奶後多系統消瘦症候群 (PMWS)、豬皮炎及腎病症候群（PDNS)及先天性震顫，此 等疾病可統稱為豬環狀病毒相關性疾病（PCVAD)。現認識 到由PCV2引起之疾病對世界上許多豬隻生產區有重要經 濟影響。 具有特殊商業重要性之PMWS會在許多畜群中引起顯著 程度之死亡率且對養豬業造成嚴重經濟損失。PMWS為養 殖及育肥豬隻之疾病，其特徵在於生長遲滯、皮膚蒼白、 呼吸困難及死亡率提高。PMWS最初在1991年於加拿大之 豬群中鑑別出，現公認其為全球養豬業之最重要問題之 一。多項臨床研究已證實PCV2在PMWS中之病因學重要 性。 PCV2含有約1.76 kb之單股環狀DNA基因組’其具有兩 個主要開放閱讀框架（ORF)(Mankertz等人，2000)。由病毒 144878.doc 201026850 基因之ORF2編碼之衣殼蛋白（Cap蛋白）為病毒之主要結構 蛋白且具有類型特異性抗原決定基（Mahe等人，2000 ; Nawagitgul等人，2000)。已顯示中和單株抗體及中和豬血 清與衣殼蛋白反應（Pogranichnyy等人，2000 ; McNeilly等 人 ’ 2001 ; Lekcharoensuk等人，2004)。PCV2之免疫相關 ORF2抗原決定基已鑑別為病毒感染之血清學標記（Truong 等人，2001)。PCV2之血清分析展示病毒可引發體液免 疫。長期被動免疫對小豬抵抗PCV2感染係重要的且因此 不太可能顯示PMWS之徵象（Blanchard等人，2003a)。此使 得若可設計將在斷乳母體免疫力使小豬易患PCV2感染時 之時點前於小豬中誘導免疫力之疫苗接種方法，則PCV2 疫苗方法成為可能。但不存在可利用之有效疫苗。 豬腺病毒（PAdV)表現系統為產生PCV2疫苗之有吸引力 候選物。豬腺病毒能夠以高效價高效複製；提供選殖空 間；PAdV允許重組蛋白在許多豬細胞株及組織中表現； 在同一細胞株或組織中表現多個基因；精確表現及修飾重 組蛋白。一些研究已藉由使用人類腺病毒表現系統表現 PCV2之ORF2蛋白且證明重組腺病毒在小鼠中具有免疫原 性（Wang等人，2006)。 然而，雖然已數次嘗試使用插入病毒載體中且由病毒載 體表現之PCV2 ORF2基因來引發對抗PCVAD之適當保護性 免疫反應，但該等嘗試未能產生商業上可行的疫苗。已發 現雖然PCV2之ORF2為相關疾病之血清學標記，但當PCV2 ORF2出於疫苗接種目的由病毒載體表現時，該等疫苗未 144878.doc 201026850 能產生保護豬隻對抗疾病之充分適當的免疫反應。本發明 首次鑑別出導致此失敗之重要因素且提供克服與先前基於 病毒載體傳遞PCV2 ORF 2來產生PCVAD疫苗之嘗試相關 之問題的組合物。 【發明内容】 本發明解決在此項技術中對於用於治療豬隻之疫苗的需 要。詳言之，本發明者已發現為了在病毒載體或次單位疫 苗組合物中有效，應呈遞PCV-2 ORF2以使得其由受感染 細胞分泌或至少表現於受感染細胞之細胞表面上。 詳言之，本發明係關於一種重組表現載體，其包含編碼 與啟動子可操作連接之經修飾PC V2 ORF2的核酸序列，其 中該經修飾PCV2 ORF2為野生型PCV2 ORF2之核定位信號 已經移除或修飾以允許在表現後分泌截短ORF2蛋白者； 或經修飾PCV2 ORF2為核定位信號已經移除且經指導 PCV2 ORF2表現於受感染細胞之細胞表面上的疏水性信號 序列置換者。 在特定實施例中，重組表現載體為PCV2 ORF2之核定位 信號已經疏水性信號序列及裂解位點置換者。裂解位點之 存在將允許表現產物作為分泌產物釋放。在特定實施例 中，該ORF2之核定位信號經例如選自（但不限於）由雞γ干 擾素、豬γ干擾素及流感病毒之Η Α蛋白組成之群的信號序 列置換。可使用之許多其他信號序列在下文中描述且亦為 熟習此項技術者所已知。 所用病毒載體可為任何病毒載體，包括例如腺病毒載 144878.doc 201026850 體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、疱疹病毒載體、痘病 毒載體。詳言之，病毒載體為豬病毒載體。在更特定實施 例中，腺病毒載體為選自由PAdVl、PAdV2、PAdV3、 PAdV4及PAdV5組成之群的豬腺病毒載體。在某些較佳實 施例中，豬腺病毒載體為PAdV3。PAVd3較佳為複製勝任 型PAdV3。在其他實施例中，編碼該經修飾PCV ORF2之 核酸序列係插入PAdV3之非必需序列中。 PAdV-3之例示性非必需序列係選自由E3區域、E4之ORF 1-2及4-7、E4末端與豬腺病毒基因組之ITR之間的區域組 成之群。 在其他實施例中，PAdV3為包含該PAdV3之原生纖維基 因且進一步包含該腺病毒之異源第二纖維基因的重組 PAdV3，其中該第二纖維基因係由該重組腺病毒藉由使該 重組腺病毒在穩定表現該第二纖維基因之細胞株中生長而 獲得。在較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:3 或 SEQIDNO:5之序列。 在其他較佳實施例中，重組表現載體進一步包含編碼在 豬隻中引發免疫反應之另一抗原的核酸。舉例而言，該另 一抗原可選自由另一豬病原體之其他抗原組成之群，該另 一豬病原體之其他抗原係選自由以下組成之群：PRRS病 毒之抗原、緒肺炎黴衆菌（Mycoplasma hyopneumoniae)之 抗原、胸膜肺炎放線桿菌 （Actinobacillus pleuropneumoniae)之抗原、大腸桿菌（E. coli)之抗原、萎 縮性鼻炎之抗原、假性狂犬病病毒（Pseudorabies virus)之 144878.doc 201026850 抗原、豬痕（Hog cholera)之抗原、諸流感（Swine Influenza) 之抗原及其組合。該抗原較佳來自由以下組成之群： PRRS病毒之抗原、萎縮性鼻炎之抗原、假性狂犬病病毒 之抗原、豬瘟之抗原、豬流感之抗原及其組合。 本發明涵蓋一種包含上述第一重組表現載體及包含在豬 隻中引發免疫反應之另一抗原之第二重組表現載體的組合 物。亦涵蓋包含該組合物用於在豬隻中引發對抗PCV2感 染之保護性反應的疫苗。 本發明之其他態樣係關於一種在豬隻中引發對抗豬環狀 病毒（PCV2)感染之保護性反應的疫苗，其包含獸醫學上可 接受之媒劑或賦形劑及一種包含編碼經修飾之PCV2 ORF2 之核酸序列可操作地連接於啟動子的重組表現載體，其中 該經修飾之PCV2 ORF2為野生型PCV2 0RF2之核定位信號 已經移除或修飾以允許在表現後分泌截短ORF2蛋白者； 或該經修飾之PCV2 ORF2為核定位信號已經移除且經指導 PCV2 ORF2表現於受感染細胞之細胞表面上的信號疏水性 信號置換者。在一些實施例中，疫苗宜進一步包含一或多 種用於對豬隻疫苗接種之其他抗原，其中該一或多種其他 抗原係以蛋白質組份在該疫苗之獸醫學上可接受之媒劑或 賦形劑中的形式提供。 本發明特定涵蓋用於保護豬隻對抗PCV-2 ORF2引起之 疾病之疫苗的製備及用途，該疫苗包含重組病毒載體，該 重組病毒載體包含啟動子可操作地連接於包含編碼膜錨定 域之核酸之疏水性信號序列、用於插入經修飾之PCV-2 144878.doc 201026850 ORF2於該疏水性信號序列框内的多個選殖位點、聚腺苷 酸化信號；及病毒基因組，其中該經修飾之PCV_2 〇RF2 缺少核定位信號。在特定實施例中，載體進一步包含一個 裂解序列緊鄰經修飾之PCV-2 ORF2之選殖位點上游，其 中該載體之PCV-2 ORF2表現產物產生可溶性基因產物。 亦涵蓋用於保護豬隻對抗PCV-2相關性病症之疫苗的製 備及用途，該疫苗包含重組豬腺病毒3載體，該重組豬腺 病毒3載鱧包含與包含編碼膜錨定域之核酸之疏水性信號 序列可操作連接之啟動子、及與該疏水性信號序列同框插 入之編碼缺少NLS序列之截短PCV2 ORF2的核酸、聚腺苷 酸化信號；及豬腺病毒3基因組。 疫苗可經調配用於任何投藥途徑，包括例如經口、經 鼻、肌肉内、皮下或皮内傳遞。在較佳實施例中，疫苗經 調配用於氣溶膠投藥。 本發明亦涵蓋在豬個體中引發免疫反應的方法，其包含 向豬個體投與有效在該豬個體中引發保護性免疫反應之量 的本發明疫苗。 在特定實施例中’該等方法減少豬隻中豬環狀病毒2 (PCV2)的病毒負荷量，其包含在豬隻中誘導對抗PCV2之 免疫學或免疫原性反應，包含向豬隻投與包含以下之組合 物：醫藥學上或獸醫學上或醫學上可接受之載劑及包含編 碼與啟動子可操作連接之經修飾PCV2 ORF2之核酸序列的 表現載體’其中該經修飾pCV2 ORF2為野生型PCV2 ORF2 之核定位信號已經移除或修飾以允許在表現後分泌截短 144878.doc 201026850 ORF2蛋白者；或該經修飾PCV2 ORF2為核定位信號已經 移除且經指導PCV2 ORF2表現於受感染細胞之細胞表面上 的信號疏水性信號置換者。 在特定實施例中，在育種之前進行投藥。在其他實施例 中’投與疫苗之豬隻為懷孕母豬。 【實施方式】 PCVAD為導致養豬業之巨大經濟損失的嚴重疾病。雖然 已鑑別出此疾病之病因學標記為PCV2 ORF2，但迄今對於 產生對抗此等疾病之以病毒載體PCV2-ORF2為基礎之疫苗 的所有嘗試未能獲得有商業意義之疫苗。本發明首次提供 包含提供對抗PCV2之免疫力之經修飾PCV ORF2的病毒疫 苗組合物。 PCV2 ORF2之全長核酸序列先前已經表徵且展示於SEQ ID NO:7中。此核酸編碼SEQ ID NO:8之蛋白質。SEQ ID NO:7之前42個密碼子（展示於SEQ ID NO:9中）編碼PCV ORF2之核定位信號（Liu等人，Virology 285: 91-99, 2001)。 在核靶向研究中，Liu等人製備具有綠色螢光蛋白之PC V2 ORF2融合蛋白且展示當移除PCV2 ORF2之胺基酸殘基1至 41的信號時，PCV ORF2 GFP融合蛋白變成細胞質蛋白。 Liu等人因此推斷殘基1至42且特定言之位置12至18及34至 41處的鹼性殘基為PCV2 ORF2之核定位所必需。 本發明者已發現移除原生核定位序列（亦即，SEQ ID >^〇:8之殘基1至42的序列）且將其以引起？0：乂2〇11[2自細胞 分泌之信號序列置換產生一種組合物，其含有適用作產生 144878.doc 201026850 對抗PC VAD之免疫力之病毒載體疫苗的編碼該經修飾 PCV2 ORF2之核酸。以下討論提供用於製備及使用該等疫 苗且用於以該等疫苗處理豬隻群體之方法及組合物。 本發明依靠構建用於處理豬隻之改良型病毒疫苗的習知 技術。病毒疫苗可由任何病毒載體構建，該病毒載體可用 於感染豬隻且可包括諸如但不限於以下之載體：腺病毒載 體、腺相關病毒載體、慢病毒載體、疮療病毒載體、痘病 毒載體。在例示性實施例令，病毒載體為豬腺病毒載體。 用豬病毒載體製成之疫苗為熟習此項技術者所已知（參見 例如美國專利第7,323，177號；第7,297,537號；第6,852,7〇5 號）。 本發明係關於製備及使用重組病毒疫苗組合物之方法， 可將該組合物投與豬隻群體以產生對抗由PCv_2引起之任 何疾病的保護性免疫力。有利地，本發明之疫苗構築體指 導傳遞至細胞外位點的PCV_2 ORF2抗原在受感染細胞上 之表現而非PCV-2 ORF2之内部表現。在本文所述疫苗之 情況下，免疫原由此傳遞至黏膜細胞（例如鼻孔、呼吸 道、胃腸道、腸黏膜及其類似物中之黏膜細胞）之外表 面，藉此將免疫原呈遞於可迅速發生免疫反應之位點而 非使所傳遞PCV-2 ORF2免疫原表現於使其可能不能與適 _免疫反應機構有效接觸之細胞内部。 現有疫田並不滿足此項技術中對於對抗由pcv_2引起之 疾病之有效疫苗的長期需要。為解決現有相關性疾 病之治療問題，本發明者已開發-種使緒隻具有保護性免 144878.doc •10- 201026850 疫力之新疫苗。該疫苗係基於病毒表現系統（感染豬隻之 任何病毒均可用作傳遞病毒）’例如提供次單位疫苗中經 修飾PCV-2 ORF之表現的豬腺病毒表現系統。抗原與疏水 性信號序列同框表現且呈遞於已投與疫苗之豬隻中的受病 毒感染細胞之細胞表面上或在表現載體為疏水性信號序列 亦包含裂解信號者之情況下替代分泌至該等受感染動物之 胞外域中。此等特徵及使用用於PCV_2相關性疾病之重組 病毒疫苗的方法及組合物在下文中進一步詳細描述。 一般而言，本發明之疫苗包含由病毒基因組製成之病毒 表現載體。豬腺病毒為熟習此項技術者所熟知且已經廣泛 表徵。在特定實施例中，使用豬腺病毒3作為本文所述之 方法及組合物中的載體。然而，鑒於本文中提供之教示， 熟習此項技術者可使用感染豬隻之任何病毒來製備本發明 之疫苗。 在本文中所製備之疫苗中，所用啟動子可為可驅動相關 異源基因在病毒構築體中表現的任何啟動子。該等啟動子 包括（但不限於）禽腺病毒主要晚期啟動子（MLp)、cMVp、 PGK-、E1_、SV40早期啟動子（SVG2)、sv4〇晚期啟動 子、SV-40即刻早期啟動子、T4晚期啟動子及HSVq ΤΚ(第 1型疱疹病毒胸苦激酶）基因啟動子、RSV(R〇us肉瘤病 毒）LTR(長末端重複序列）及PGK㈤酸甘油酸激酶）基因啟 動子。亦可使用熟習此項技術者已知之許多其他哺乳動物 或禽類啟動子。 本文所述之疫苗中所用之啟動子驅動與編碼％^2 144878.doc 201026850 ORF2之核酸序列同框連接之疏水性信號序列之同框融合 體的表現。疏水性信號序列可為可用於靶向或特定言之指 導相關核酸表現於受表現載體感染之宿主細胞外膜上的任 何序列。在本發明中’基於PAV之表現載體意欲感染豬 隻。FAV通常感染黏膜細胞、肝臟及可例如存在於動物之 腸道、呼吸道或胃腸道中之上皮細胞。因此，疏水性信號 序列為傳達PCV-2 ORF2表現產物於此等黏膜細胞之細胞 表面上表現的序列。藉由如此呈遞PC V-2 ORF2表現產物 於動物黏膜細胞之細胞表面，本發明之疫苗能夠最有效地 將抗原傳遞至可有效發生免疫反應之内部位點，而非表現 於可能不太有效地促進免疫反應發生之動物細胞内部。 在真核細胞中，分泌性蛋白質藉由疏水性信號序列靶向 内質網膜。本發明使用此特性來採用異源疏水性信號序列 指導疫苗中之指定蛋白質表現於細胞表面。 本文中所用之病毒載體為重組載體，其中其包含含有編 碼經修飾PCV2 ORF2之核酸之聚核苷酸構築體，其中野生 型PCV2 ORF2之原生核定位信號已經移除且經信號序列及 裂解位點置換以允許在表現後（自受感染細胞）分泌截短 ORF2蛋白。舉例而言，〇RF2之原生核定位序列（NLS)可 經來自雞γ干擾素、豬γ干擾素或流感病毒之11人蛋白的信 號序列置換。可使用之其他信號序列包括例如乳清磷蛋白 k號序列；α-1酸性醣蛋白；α_促甲狀腺素；來自盲鰻之 胰島素；來自銨鳙魚之胰島素；人類胰島素；大鼠胰島素 I或II，綿羊β_酪蛋白；綿羊酪蛋白；綿羊α乳白蛋白； 144878.doc 12 201026850 綿羊β-乳球蛋白；綿羊a_s丨酪蛋白及綿羊心^酪蛋白；vs 病毒醣蛋白；小公雞VLDL_n ;蜜蜂蜂毒肽（melittin);大 鼠乳糖；人類胎盤催乳激素；人類卜絨膜促性腺激素；人 類CX-絨膜促性腺激素；兔子宮珠蛋白；大鼠生長激素；人 類生長激素；牛生長激素；牛副甲狀腺素；大鼠鬆弛素 (relaxin);大鼠血清白蛋白；人類血清白蛋白；大鼠肝臟 白蛋白；雞原彈性蛋白B ;雞類卵黏蛋白；雞溶菌酶；雞 伴白蛋白，人類α· 1抗騰蛋白酶；大鼠前列腺結合蛋白； 大鼠前列腺結合蛋白C2 ; AD病毒醣蛋白；大鼠脂蛋白元 A1 ;狂犬病毒醣蛋白；人類流感維多利亞（Vict〇ria)血球凝 集素；人類流感Jap血球凝集素；禽流感ρρν血球凝集素； 人類白細胞干擾素；人類免疫干擾素；人類纖維母細胞干 擾素’小取χ-免疫球蛋白，小鼠χ_免疫球蛋白；小鼠尤·免 疫球蛋白；小鼠Η-鏈免疫球蛋白；小鼠胚胎VH-免疫球蛋 白；小鼠Η-鏈免疫球蛋白；犬胰蛋白酶原1 ;犬胰蛋白酶 原2+3，犬胰凝乳蛋白酶原2 ;犬叛肽酶Α1 ;犬澱粉酶；小 鼠殿粉酶；大鼠澱粉酶；兔α乳白蛋白；豬α_乳白蛋白； 大鼠羧肽酶Α;牛ACTH-p-LPH前驅體；豬ACTH-p-LPH前 驅體；人類ACTH -β-LPH前驅體；豬胃泌素（gastrin);小 鼠腎素（renin);錐體蟲醣蛋白；鯰魚生長抑素；銨鳙魚生 長抑素；大鼠降血約素（calcitonin);及鍵錄魚升糖素 (glucagon)之信號序列。此等信號序列之每一者在v〇n Heijne等人Eur. j· Biochem 133 17-21(1983)之圖 1 中展示且 可容易經改適以供本文中使用。來自上述參考文獻之圖i 144878.doc • 13- 201026850 之信號序列再現於本文之圖2中。 可使用熟習此項技術者已知之方法容易地測定指定蛋白 質之此等及其他信號肽位點。舉例而言，可使用SignalP 3.0伺服器（Bendtsen，J.D.，Nielsen, H.，von Heijne，G. & Brunak, S. (2004) Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340, 783-795)預測信號肽位點。 另外，存在可用以便於測定信號序列之網站，參見例如 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/。所用信號序列之 確切特性並不重要，只要其為能夠將表現產物傳達至細胞 表面之疏水性序列即可。

在較佳實施例中，信號序列含有允許信號序列裂解且允 許所連接蛋白質分泌至該等細胞之細胞外間隙的裂解位 點。在尤其較佳實施例中，使用以下證明本發明之此態 樣：含有由 DNA序列 ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC TTG TTT GTT CTG TCT GTC ATC ATG ATT TAT TAT GGA CAT ACT GCA AGT AGT CTA AAT CTT(SEQ ID NO:ll)編 碼之序列：MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNL(SEQID NO:12)的來自雞γ IFN之信號序列；豬γ IFN之疏水性信號 序列為：MSYTTYFLAFQLCVTLCFSGSYC(SEQ ID NO: 14)，其由 DNA序列 ATG AGT TAT ACA ACT TAT TTC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ACT TTG TGT TTT 丁(：丁00(：1'(：1'丁八(：丁0(：(8£〇1〇]^0:13)編碼；人類流感 病毒H1N2之疏水性信號序列為由序列：atg aaa gta aaa eta ctg ate ctg tta tgt aca ttt aca get aca tat gca gac aca ata(SEQ 144878.doc -14- 201026850 ID NOW)編碼之 MKVKLUllctftatyad耶eq ι〇 謝6)。此等例示性序列中之每—者亦含有裂解位點，在 此處信號肽酶起作用且使相關基因之所表現基因產物釋 放。圖2之序列的推定裂解位點以星號（*)標示。 聚核苷酸構築體較佳包含編碼待傳遞之蛋白質的DNA〇 該DNA可包含核苷酸鹼基a、T、C&G，且亦可包括該等 驗基之任何類似物或經修飾形式。該等類似物及經修飾鹼 基為熟習此項技術者所熟知且包括（但不限於）甲基化核苷 酸、諸如不帶電鍵聯及硫代酸酯之核苷酸間修飾、糖類似 物之使用、及經修飾之及/或替代性骨架結構，諸如聚醯 胺。 在例示性實施例中，病毒載體為豬腺病毒載體。豬腺病 毒載體在目標細胞中可為複製勝任型或複製缺陷型。在載 體為複製缺陷型之情況下’載體可能需要使用輔助細胞或 輔助病毒以促進複製。促進複製缺陷型腺病毒載體複製的 輔助細胞或輔助病毒之使用在此項技術中係常規且熟知 的。通常，該等辅助細胞向已剔除重組腺病毒載體而致使 其呈複製缺陷型的實體提供功能。 複製勝任型載體另外可稱為「無輔助物之病毒載體」， 因為其不需要第二病毒或細胞株來向載體供應所缺乏之事 物。如上所述’修飾PCV2 ORF2以移除NLS及添加具有裂 解位點之信號序列使ORF2蛋白自定位於細胞核中者轉變 為自細胞分泌者。表現產物自細胞分泌至細胞外間隙中使 含有經修飾PCV2 ORF2之疫苗比表現含有NLS之PCV2 144878.doc -15- 201026850 ORF2的疫苗更有效刺激抗體產生。ORF2表現產物之此細 胞外分泌為優於先前描述疫苗之優點，因為其產生比以具 有野生型NLS之PCV2 ORF2製備的疫苗所見強之抗體免疫 反應。 含有經修飾PCV2 ORF2之基於病毒載體之疫苗的製備僅 受所給病毒基因組之插入容量及重組病毒載體表現所插入 異源序列之能力的限制。舉例而言，當載體為腺病毒載體 時，腺病毒基因組可接受使重組腺病毒尺寸增至野生型基 因組長度之至少105%且保持封裝至病毒粒子中之能力的 插入物。該等病毒載體之插入容量可藉由缺失非必需區域 及/或缺失諸如E1功能（其功能可隨後由輔助細胞株（諸如提 供E1功能者）提供）之必需區域而增加。在一些實施例中， 將編碼相關蛋白質（在此情況下，PCV2 ORF2及/或欲用於 疫苗中之任何其他治療蛋白質）之異源聚核苷酸插入腺病 毒E3基因區域中。在其他實施例中，使E3區域之非必需部 分缺失且將編碼相關蛋白質之異源聚核苷酸插入由該缺失 留下之間隙中。在一些較佳實施例中，當重組腺病毒載體 為基於豬腺病毒血清型3(PAdV-3)之腺病毒載體時，則將 含有編碼PCV2 ORF2之核酸（及/或其他核酸）的表現構築體 插入PAdV-3基因組中位於PAdV-3 E3之聚腺苷酸化信號後 方及PAdV-3纖維基因之ORF起點前方的區域中。 在一些實施例中，產生腺病毒，其中插入或插入之前的 缺失在腺病毒之E1基因區域中，隨後在提供E1功能之輔助 細胞株中增殖載體。PAdV-3中異源基因可插入之其他區域 144878.doc -16- 201026850 包括E4區域。當重組腺病毒載體為基於PAdv_3之載體時， 除編碼ORF3之區域以外的全部E4區域可缺失以為異源基 因讓出空間。舉例而言，位於圖上單位（map unit)97 99 5 處之區域為特別適用於插入異源基因之位點。如Li等人 (Virus Research 104 181-190 (2004))中所示，位於基因組 之右手端的PAdV-3 E4區域向左方轉錄且具有編碼七個（pl_ p7)ORF之潛能。其中，僅〇RF p3對複製必不可少。因 而，大多數（若非全部）其餘£4區域可能在不致使病毒複製 缺下谷易地缺失，藉此為異源插入物讓出更大空間。在 本發明之一實施例中，插入可藉由構建含有希望插入編碼 所要治療蛋白質之聚核苷酸之腺病毒基因組區域的質體達 成。隨後以具有識別序列之限制酶消化質體，因為質體之 腺病毋分及異源聚核苷酸序列插入限制消化之位點。將 3有具有所插入異源序列之一部分腺病毒基因組之質體連 同腺病毒基因組或含有腺病毒基因組之線性化質體一起共 轉型至細菌細胞（諸如大腸桿菌）中。質體之間的同源重組 產生a有所插入異源序列之重組腺病毒基因組。在此等實 施例中’腺病毒基因、组可為全長基因組或可如本文中所論 述含有一或多個缺失。 妓使腺病毒序列缺失以例如提供插人異源序列之位點或提 在不同位點插入之其他容量可藉由熟習此項技術者熟知 /1實現。舉例而言，對於選殖於質體中之腺病毒，以 ,或夕種限制酶(腺病毒插入物中具有至少一個識別序列) 肖匕接著連接之腺病毒序列在一些情況下將導致限制酶 144878.doc -17- 201026850 ===:，，一一單 連接將導致鄰接限制性:點核酸酶處理、接著 ::建=有具有-或多個缺失之腺病毒 部分的質體可連同腺 ^次多個 或缺失基因組之質:=組(全長或缺失)或含有全長 起，、轉染至細菌細胞中以藉由同源 沾哲妙3有在—或多個特定位點具有缺失之重組基因組 、、3有缺失之腺病毒病毒粒子可隨後藉由以含有重 組腺病毒基因組之質體轉染包括(但不限於)含有本文所述 之其他纖維基因之穩定轉型細胞的哺乳動物細胞獲得。插 入位點可與腺病毒中之内源性啟動子鄰接且在内源性啟動 子下游轉錄。「内源性」啟動子、強化子或控制區域係 原生於或來源於腺病毒。可用作插入位點之指定啟動子下 游之限制酶識別序列可易於由熟習此項技術者根據對部分 或全部希望插入之腺病毒基因組之認識來確定。或者，可 使用各種活體外技術以在特定位點插入限制酶識別序列或 在不含有限制酶識別序列之位點插入異源序列。該等方法 包括（但不限於）在募核苷酸介導下形成異源雙鏈體以插入 一或多個限制酶識別序列（參見例如Zoller等人（1982)

Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 ; Brennan 等人（1990) Roux's Arch. Dev. Biol. 199:89-96;及 Kunkel 等人（1987)

Meth. Enzymology 154:367-382)及插入較長序列之PCR介 導之方法。參見例如Zheng等人（1994) Virus Research 31:163-186 。 144878.doc • 18 · 201026850 插入不在内源性啟動子下游之位點中的異源序列之表現 亦可藉由連同異源序列一起提供在真核細胞中有活性之轉 錄調節序列來達成。該等轉錄調節序列可包括細胞啟動 子，諸如（卿R啟動子）；病毒啟料，諸如疮療病毒、 腺病毒及乳多泡病毒啟動子；及逆轉錄病毒長末端重複序 列（LTR)之DNA複本。在該等實施例中，將異源基因引入 表現構築體中，在該表現構築財異源基因與該等轉錄調 節元件可操作連接。

PCV2 ORF2基因經安置受諸如 制以提供組成性轉錄。在基於 在特定例示性實施例中， CMV啟動子之啟動子的控 mRNA之持續轉譯 MLP/TPL序列之 PAdV3之病毒載體中，重組PCV2 ORF2 可藉由將PCV2 ORF2基因安置於PAdV 3 下游達成。應瞭解重組腺病毒載體之製備包括以質體形式 增殖所選殖之腺病毒基因組及自含有諸之細胞解救感染 性病毒。 病毒核酸之存在可藉由熟習此項技術者已知之技術伯 測，該等技純括（但不限於）雜交檢定、聚合酶鏈反應及 其他類型之擴增反應。類似地，债測蛋白質之方法為熟習 ，項技術者所熟知且包括（但不限於）各種類型之免疫檢 疋ELISA自方墨點、酶檢定、免疫組織化學等。包含 本發明之核普酸序列的診斷套組亦可含有詩細胞破壞及 :&純化之4劑’以及用於雜交物之形成、選擇及伯測的 緩衝液及4卜包含本發明之多肽或胺基酸序列之診斷套 組亦可包含用於蛋白質分離及用於免疫複合物之形成、分 144878.doc •19- 201026850 離、純化及/或偵測的試劑。 除PCV2 ORF2之外，其他外源（亦即外來）核苷酸序列亦 可併入腺病毒中。此等其他外源序列可由一或多個相關基 因或其他不為基因但具有其他治療相關功能之核苷酸序列 組成。在本發明之情形中，相關核苷酸序列或基因可編碼 反義RNA、短髮夾RNA、核糖核酸酶或隨後將轉譯成相關 蛋白質之mRNA。該核苷酸序列或基因可包含基因組 DNA、互補DNA(cDNA)或混合型（袖珍基因，其中至少一 個内含子缺失）。核苷酸序列或基因可編碼調節或治療功 _ 能、成熟蛋白質、成熟蛋白質之前驅體（特定言之包含信 號肽之前驅體）、來源於不同來源之序列之融合體的嵌合 蛋白、或顯示改良或經修飾之生物特性的天然蛋白質之突 變體。該突變體可藉由缺失、取代及/或添加編碼天然蛋 白質之基因的一或多個核苷酸，或編碼天然蛋白質之序列 中的任何其他類型之變化（諸如轉位或倒位）獲得。 由載體傳遞之基因可經安置受適於其在宿主細胞中表現 之元件（DNA控制序列）的控制。合適DNA控制序列應理解 _ 意謂基因轉錄為RNA(反義RNA或mRNA)及mRNA轉譯為蛋 白質所需之元件的集合。舉例而言’此等元件將至少包括 啟動子。啟動子可為組成性啟動子或可調控啟動子，且可 . 自真核、原核或病毒來源且甚至腺病毒來源之任何基因分-離。或者，其可為相關基因之天然啟動子。一般而言，本 發明中所用之啟動子可經修飾以便含有調節序列。當基因 乾向指定組織類型時’例示性啟動子可包括組織特異性啟 144878.doc -20- 201026850 動子。可使用之其他習知啟動子包括（但不限於）HSV-I TK(第1型疱疹病毒胸苷激酶）基因啟動子、腺病毒MLP(主 要晚期啟動子）、RSV(Rous肉瘤病毒）LTR(長末端重複序 列）、CMV即刻早期啟動子、SV-40即刻早期啟動子及 PGK(構酸甘油酸激酶）基因啟動子，以例如允許在許多細 胞類型中表現。 病毒載體或實際上包含病毒載體之醫藥組合物可另外包 括至少一種來自至少一種以下其他豬病原體之免疫原，例 籲 如：豬生殖及呼吸症候群（PRRS)、豬肺炎黴漿菌、胸膜肺 炎放線桿菌、大腸桿菌、支氣管敗血性博德氏桿菌 (Bordetella bronchiseptica)、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)、緒丹毒桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、假 性狂犬病、豬瘟、豬流感及豬小病毒（ppv)。因此，基於 載體之組合物可包括至少一種來自至少一種其他豬病原體 之免疫原’諸如表現來自此病原體之序列的載體，其中載 φ 體亦能夠表現上述PCV-2 ORF2。或者，疫苗組合物可由 一種表現如本文所述之PCV2 〇RF2的載體組份及第二組份 ‘成°玄第一組份可為表現第二免疫原之重組載體，或第 - 二組份為含有已自另一來源分離之經分離免疫原的組合 物。 雖然本發明之大部分描述係關於作為例示性疫苗載體之 2腺病毒，但該載體可包含任何病毒載體，包括例如病 毋諸如癌療病#，包括豬癌療病毒、包括奥傑斯基病 (Aujeszky s dlsease)病毒（亦稱為假性狂犬病病毒）；腺病 144878.doc •21 201026850 毒’包括任何血清型之豬腺病毒或人類腺病毒、包括痘瘡 病毒、鳥類癌病毒、金絲雀痘病毒、浣熊痘病毒及豬痘病 毒之痘病毒，及其類似物。 在某些較佳實施例中，製備本發明之疫苗以對豬進行疫 苗接種以對抗彼等動物中非PMWS及除PMWS之外的疾 病。舉例而言，疫苗可針對假性狂犬病病毒（PRV)gp5〇 ; 傳染性胃腸炎病毒（TGEV)S基因；豬輪狀病毒VP7及VP8 基因，豬呼吸及生殖症候群病毒（PRRS)基因；豬流行性腹 填病毒基因；豬瘟病毒基因；豬小病毒基因；及口蹄疫病 毒基因；豬流感病毒基因；及其他除pcv2 〇RF2之外亦與 豬環狀病毒相關之基因。 應瞭解雖然在一些情況下可能需要將完整基因併入至載 體中’但可構建僅包含可使用之基因核苷酸序列之一部分 (當此等核苷酸序列足以產生保護性免疫反應或特定生物 作用時）而非野生型有機體中所見之完整序列的其他載 體。當基因含有許多内含子時，cDNA可較佳。 如上所述，基因可經插入受合適啟動子之控制。另外， 載體亦可包含增強子元件及聚腺苦酸化序列。提供外源基 因在哺乳動物細胞中之成功表現及表現卡匣之構建的啟動 子及t腺普酸化序列在此項技術中已知，例如在美國專利 第5，151，267號中，其揭示内容以引用的方式併入本文中。 術語「表現卡匣」係指天然或重組產生之核酸分子，其 能夠在細胞中表現基因或遺傳序列。表現卡匣通常包括啟 動子（允許轉錄啟始）及編碼一或多個蛋白質或rn A之序 I44878.doc -22- 201026850 列。視情況，表現卡匣可包括轉錄強化子、非編碼序列、 拼接信號、轉錄終止信號及聚腺苷酸化信號。RNA表現卡 匣通常包括轉譯啟始密碼子（允許轉譯啟始）及編碼一或多 個蛋白質之序列。視情況，表現卡匣可包括轉譯終止信 號、聚腺苷序列、内部核糖體進入位點（IRES)及非編碼序 列。視情況，表現卡匣可包括不轉譯成蛋白質之基因或部 分基因序列。核酸可影響目標細胞之DNA或RNA序列之改 變。此可藉由雜交、多股核酸形成、同源重組、基因轉 換、RNA干擾或其他有待描述之機制來達成。 病毒载體可包含一個以上外源基因。本發明之方法較佳 用以在豬隻中提供對抗！>(：¥2相關性疾病的保護。雖然本 發明之例示性實施例使得異源核苷酸（本文中亦稱為異源 核酸）為編碼蛋白質者，但應瞭解異源核苷酸實際上可為 含有細胞中需要存在或轉錄之序列的任何聚核苷酸。因 此，可使用载體來傳遞例如導致序列特異性降解或抑制基 鲁因之功能、轉錄或轉譯的任何聚核苷酸。 除經修飾PC V2 ORF2以外的免疫原組合物可重組產生或 自天然來源萃取或可經化學合成。舉例而言，除經修飾 PC V2 ORF2以外的免疫原組合物可自受感染或轉染細胞分 離及/或純化；例如以製備用於投與豬隻之組合物；然 而，在某些情況下，不自細胞分離及/或純化表現產物可 月b有利，例如當細胞或其部分增強多肽之免疫原性作用 時。用以達成此舉之蛋白質純化及/或分離技術為熟習此 項技術者所熟知且一般可包括：藉由利用相關蛋白質在不 144878.doc •23· 201026850 同鹽濃度下之溶解度來沈澱；以有機溶劑、聚合物及其他 物質來沈澱；親和性沈澱及選擇性變性；管柱層析，包括 高效液相層析（HPLC)、離子交換、親和、免疫親和或染 料-配位體層析；免疫沈澱；凝膠過濾；電泳法；超濾及 等電聚焦；及其組合。 先前已展示在PK-15細胞中生長之經修飾rPAdV-gp55當 藉由皮下或經口途徑投與市售大白緒（Large White Pig)時 完全保護豬隻免於CSFV(當藉由皮下注射或經口途徑給予 時）之致死攻擊。在本發明之情形中，可採用類似方法單 獨或與gp55或為豬隻賦予對抗疾病之有效免疫力或疫苗接 種之某些其他抗原組合投與經修飾rPAdV-PCV2 ORF2。 為使PC V2 ORF2由動物中儘可能多的組織吸收或特異性 靶向指定組織，PAdV可經修飾以包含來自PAdV之一種以 上血清型之纖維基因（例如，含有PCV2 ORF2之重組疫苗 亦含有PAdV3纖維及PAdV4纖維之基因）。以此方式，含有 PAdV-3及PAdV-4纖維蛋白的含經修飾PCV2 ORF-2之疫苗 將比未經修飾之疫苗靶向豬隻之更多種組織，且因此在宿 主中產生更廣泛免疫反應。 本文中特定言之涵蓋包含治療有效量之根據本發明方法 製備之重組腺病毒載體、重組腺病毒或重組蛋白質與醫藥 學上可接受之媒劑及/或佐劑組合的醫藥組合物。可根據 此項技術中熟知之技術製備該醫藥組合物及確定劑量。本 發明之醫藥組合物可藉由任何已知投藥途徑投與，包括 (但不限於）全身性（例如靜脈内、氣管内、血管内、肺内、 144878.doc -24- 201026850 腹膜内、鼻内、非經腸'經腸、肌肉内、皮下、瘤内或顧 内）、藉由經口投與、藉由氣溶膠化或肺内滴入。投藥可 以單-劑量或以在特定時間間隔之後重複一或多次之劑量 進打。適當投藥途徑及劑量將根據情況（例如，所治療之 個體、欲治療之病症或相關基因或多肽）變化，但可由熟 習此項技術者確定。 … 在特定實施例中，將以包含表現至少一種治療蛋白質 (亦即當表現時不定位至受感染細胞之細胞核中而實際上 其缺少核定位信號且由此釋放至細胞之細胞質中的經修飾 PCV2 ORF2)之核酸的病毒載體組合物接種母豬。可在育 種之前；及/或在配種之前、及/或在妊娠（或懷孕）期間； 及/或在圍產期或分娩之前；及/或終生重複地接種動物， 以預防與PCV-2相關之心肌炎及/或流產及/或子宮内感染 以及斷奶後多系統消痩症候群及其他與PCv_2相關之病理 性後遺症；或引發對抗PCV_2之免疫原性或保護性反應且 φ 藉此預防任何與PCV-2感染相關之疾病。該等疾病包括（但 不限於）與豬環狀病毒_2相關之斷奶後多系統消瘦症候群及 /或豬皮炎及腎病症候群及/或心肌炎及/或流產及/或子宮 - 内感染及/或其他與PCV-2相關之病理性後遺症。儘管本發 明係由治療目前稱為「斷奶後多系統消痩症候群」之病症 例示，但應瞭解本發明之組合物及方法將適用於治療任何 與PCV-2感染相關之疾病且有益結果將改善任何與以下疾 病相關之症狀：包括由細菌感染引起之續發性感染，諸如 格拉氏病（Glasser disease)(豬副嗜血桿菌 144S78.doc -25- 201026850 π⑽‘））、肺巴氏桿菌症（Pulmonary Pasteurell〇sis)、大 腸桿菌病（Colibacilosis)及沙門氏菌病（Salm〇neU〇sis)及其 類似疾病。其他症狀包括消瘦 '呼吸困難及皮膚蒼白妗 合淋巴結增大、間質性肺炎及腎炎之病理性檢查結果。淋 巴細胞消耗及淋巴組織與某些器官中組織細胞肉芽腫性發 炎為PCV-2相關性疾病中可見之主要組織學改變。本發明 之方法及組合物係用以預防、抑制或以其他方式減少或降 低此等症狀之影響。 在另-實施例中，小緒在其出生一週内接種，例如在其Θ 出生第一週及/或第二週及/或第三週及/或第四週及/或第 五週接種。更佳地，小豬在其出生_週内或出生三週内 (例如’在斷奶之時）首次接種。甚至更有利地，該等小豬 隨後在（首次接種之後的）兩⑺至四⑷週以後加強。小豬可 來自於經疫苗接種或未經疫苗接種之母豬。因此，可向後 代以及母豬均投與本發明之組合物以增加小豬及其母親的 預期壽命。 本發明進-步提供治療方法，其中治療有效量之含有© PCV2 ORF2作為治療性抗原之重組腺病毒載體（例如， PAdV-3腺病毒載體）。 …’座修飾PCV2 ORF2組合使用的除經修飾pc V2 〇RF2以 h 1為原生或重組抗原多狀或片段。其可為部分序 =、全長序列或甚至融合體（例如，具有重組宿主之適當 則導序列或與另-病原體之另一抗原序列融合待由本 發明之病毒系統表現的較佳抗原多肽含有編碼抗原之全長 144878.doc -26- 201026850 (或接近全長）序列。或者，可使用具抗原性（亦即編碼一或 多個抗原決定基）之較短序列。較短序列可編碼「中和抗 原決定基」，其定義為能夠引出在活體外檢定中中和病毒 感染性之抗體的抗原決定基。肽較佳應編碼「保護性抗原 決定基」，其能夠在宿主中引起「保護性免疫反應；」，亦 即保護經免疫宿主免於感染的抗體及/或細胞介導之免疫 反應。 另外，本發明之任何疫苗亦可包含佐劑。「佐劑」為添 加至疫苗中以增強疫苗之免疫原性的任何物質。在疫苗組 合物中使用佐劑為此項技術中所熟知：例如，牛血清白蛋 白（BSA)、人類血清白蛋白（HSA)及匙孔螺血氰蛋白 (KLH)。咸信一些佐劑藉由緩慢釋放抗原來增強免疫反 應，而其他佐劑自身有極強的免疫原性且咸信協同起作 用。已知疫苗佐劑包括（但不限於）油水乳液（例如，完全弗 氏佐劑（complete Freund’s adjuvant)及不完全弗氏佐劑 0 (lnC〇mplete Freund，s adjuvant))、短棒狀桿菌（C〇rynebacterium parvum)、卡介苗（Bacillus Calmette Guerin)、氫氡化鋁、 葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、海藻酸鈉、Bact〇佐劑、 - 諸如聚胺基酸及胺基酸之共聚物的某些合成聚合物、皂素 • (saponin)雷格雷欣（REGRESSIN)」（Vetrepharm，Athens,

Ga·)、「阿夫立定（AVRIDINE)J (N，N_:(十八烷基）_ν·，ν，_ 雙（2-羥乙基）_丙二胺）、石蠟油、胞壁醯二肽及其類似 物。 可插入的所要抗原或其編碼序列之基因包括引起哺乳動 144878.doc -27- 201026850 物之疾病的之有機體的基因’尤其牛病原體，諸如口蹄疫 病毒、牛輪狀病毒、牛冠狀病毒、第1型牛疮療病毒、牛 呼吸道融合病毒、第3型牛副流行性感冒病毒（ΒΡΙ·3)、牛 類腹λ寫病毒、溶血性巴氏桿菌（Pasteurella haemolytica)、 昏睡嗜血桿菌（Haemophilus somnus)及其類似物。編竭人 類病原體之抗原的基因亦可適用於本發明之實施中。攜帶 外來基因或片段的本發明之疫苗亦可在合適經口載劑中， 諸如以塗腸衣劑型經口投與。經口調配物包括常用賦形 劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精 @ 鈉纖維素、碳酸鎂及其類似物。經口疫苗組合物可採用溶 液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑 形式，含有約10%至約95%，較佳約25%至約7〇%之活性成 份。經口及/或鼻内接種可較佳引起黏膜免疫力（其在對抗 病原體感染呼吸道及胃腸道中起重要作用）以及全身免疫 力。 另外，疫苗可調配為栓劑。對於拴劑，疫苗組合物將包 括傳統黏合劑及載劑，諸如聚烷二醇或甘油三酯。該等栓⑩ 齊J可由s有約0.5%至約i〇%(w/w)，較佳約至約範圍 内之活性成份的混合物形成。 向動物投與本發明之疫苗組合物的方案鑒於本發明在此 項技術之技能範圍内。熟習此項技術者將選擇劑量中有效 引出針對抗原片段之抗體及/或丁細胞介導之免疫反應或另 類型之治療或預防作用之疫苗組合物濃度。咸信在寬限 又内劑量並不重要。投藥時機亦可能重要。舉例而言， i44878.doc -28· 201026850 需要時較佳可在首次接種之後進行後續加強接種。在初始 免疫之後數週至數月向動物投與第二次加強免疫亦可能較 佳(不匕可視f月况選用）。為確保對抗疾病之持續高水準保 護’向動物定期（例如每數年一次）重複投與加強免疫可能 有幫助《者，可經口投與初始劑量，稍後接種，或反之 亦然。可經由常規疫苗接種方案實驗確立較佳疫苗接種方 案。 活體内重組病毒疫苗之所有投藥途徑的劑量視包括宿主/ 患者之體型、需要保護以免受到之感染的性質、載劑及其 ，似因素之各種因素而定且可易於由熟f此項技術者確 定。藉助於非限制性實例，可使用在1〇2 pfu與i〇ls 之 間，較佳在104與l〇i3 pfu之間，更佳在1〇5至1〇"响之間 及其類似範圍的劑量。如同活體外次單位疫苗可如由所 涉及之臨床因素所確定給出其他劑量。 本發明亦包括向哺乳動物且特定言之向豬隻提供基因傳 φ 遞以控制基因缺乏、提供治療性基因或核苷酸序列及/或 誘導或糾正基因突變之方法。可使用該方法例如治療包括 (但不限於）遺傳疾病、感染性疾病ϋ管疾病及病毒感 染之病狀。此類技術目前正由熟習此項技術者用於治療多 種疾病病狀。可併入習知基因療法中使用之外來基因、核 苷酸序列或其部分之實例包括t腫性纖維化跨琪轉導調節 基因、人類微型肌縮蛋白（minidystr〇phin)基因、-抗胰 蛋白酶基因、涉及心血管疾病之基因及其類似物。 出於本發明之目的，藉由本發明之方法製備的載體、細 144878.doc •29- 201026850 胞及病毒粒子可離體（亦即在自患者移除之細胞中）引入個 體中或直接活體内引入待治療之身體中。 實例 實例1 : 圖1展示製備本文中所用之重組病毒載體之例示性方 案。使用5’及3·基因特異性引子自作為模板之選殖於質體 中的全長PCV2 ORF2基因PCR擴增截短PCV2 ORF2基因。 5' PCR引子經特異性設計以結合PCV2 ORF2基因起點下游 的127 bp(其使NLS缺失）且亦引入同框併入最終PCR產物之 5·末端的信號序列。為利於產物之選殖，5’及3'引子亦同時 分別向最終PCR產物中引入限制性位點Bglll及Hindlll。 隨後將包含具有信號序列之截短PCV2 ORF2基因的PCR 擴增產物選殖至PAV3 RHE質體内部表現卡匣之Bglll及 Hindlll位點中。隨後使用在質體骨架序列内部特異性切割 (酶「X」及「Y」）而非在PAV3基因組序列或所插入DNA 内部切割之限制酶使重組PAV3 RHE質體及PAV3 LHE質體 線性化。 將均攜帶部分PAV3病毒基因組之線性化PAV3 LHE及 PAV3 RHE質體DNA共轉染至豬細胞中。兩個DNA片段均 具有〜1 kb同源重疊PAV3序列區域，其指導發生同源重組 且重構具有所插入DNA之勝任型全長重組PAV3病毒基因 組0 轉染細胞之連續繼代使感染性粒子富集，其表現為病毒 斑塊。其代表表現具有5'同框信號序列之截短PCV2 ORF2 144878.doc •30- 201026850 蛋白的重組PAV3病毒。 儘管上述實例證明插入至PAV-3 RHE中，但應暸解插入 可能會發生於PAV3基因組之其他非必需區域中。 實例2 : 為測試本發明之疫苗的功效，給予各組小豬兩個劑量之 基於如本文所述之經修飾PC V2-ORF2的疫苗或含有未經修 飾PCV2-ORF2的疫苗且測定豬隻對以PCV2攻擊之易感 性。另外，測試經修飾疫苗誘導中和抗體及當藉由經口途 ❿ 徑投與時給予保護之能力。 本實例描述經設計以評估由兩個劑量之三種不同重組豬 腺病毒血清型3疫苗候選物提供給斷奶小豬之保護的研 究，該等候選物含有來自來源於合成共同序列之豬環狀病 毒2(PCV2)的開放閱讀框架2。親本重組體指定為rPAV-3 PCV2 mORF2。保護將在以美國典型培養物保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC)PCV2 分離株 TBA攻擊經疫苗接種之小豬後並量測對病毒血症之影響 Φ (如藉由病毒分離、體重、攻擊後直腸體溫、淋巴結組織 病理學及在屍體剖檢後自淋巴組織、腎臟、胸腺、肺及派 亞氏淋巴叢（peyers patch)進行病毒分離所量測）來評估。 在該研究中使用來自無PCV2之畜群的60隻21天齡小豬 群。下表闡明用於該畜群之例示性疫苗接種方案。 144878.doc -31- 201026850 研究設計 治療 編號 治療組 豬隻數 _篆苗接種 攻毒 屍體剖檢 天數 劑量 途徑 T1 RBS 10-15 0,14 2.0m! iM —第28天攻蕃~~ 篦49天屍體剖檢 T2 iPAV-3PCV2mORF2 V1 10-15 0,14 1xl08/ 2.0 mt IM 第28关攻毒 镇49天屍體剖檢 T3 fFAV-3 PCV2 mORF2 V2 10-15 0,14 1xt08/ 2.0 ml IM 第28天攻毒 篦49夭嚴體剖檢 T4 rPAV-3 PCV2 mORF2 V3 10-15 0,14 1x1ο8/ 2.0 mi IM 第28天攻毒. 第49天屍體剖檢 更特定言之，最近斷奶之21(+/-4天）天齡之小豬係來源 於PCV1及PCV2a及PCV2b陰性豬群且轉運至試驗站點。以 耳標個別標識小豬。動物排泄物收集於罐中且在釋放於瀉 湖之前消毒。每曰一次記錄對小豬之臨床觀察直至研究結 束。評估小豬之萎靡不振、嗜睡、呼吸率增加、呼吸窘 迫、垂死及死亡。 在第〇天，自各小豬收集血液樣本（每隻小豬2.0至4.0 ml)、體重及直腸體温。治療组T1中之小豬將接受安慰 劑，T2中之小豬將藉由肌肉内途徑以rPAV-3 PCV2 mORF2 VI進行疫苗接種，T3中之小豬將藉由IM途徑以rPAV-3 PCV2 mORF2 V2進行疫苗接種且T4中之小豬將藉由IM途 徑以rPAV-3 PCV2 mORF2 V3進行疫苗接種。 在第14天’自治療組ΤΙ、T2、T3及T4中之各小豬收集 血液樣本（每隻小豬2.0至4.0 ml)、體重及直腸體溫。亦在 第1 4天，治療組T1中之小豬將接受安慰劑，T2中之小豬將 藉由肌肉内途徑以rPAV-3 PCV2 mORF2 VI進行疫苗接 種，T3中之小豬將藉由IM途徑以rPAV-3 PCV2 mORF2 V2 進行疫苗接種且T4中之小豬將藉由IM途徑以rPAV-3 PCV2 144878.doc -32· 201026850 mORF2 V3進行疫苗接種。 在第28天，自治療組T1、T2、丁3及丁4中之小豬收集金 液樣本（每隻小豬2.0至4.〇 ml)、體重及直腸體溫。亦在第 28天，將藉由鼻内途徑使治療組T1、T2、丁3及^中之小 豬暴露於-致目標劑量的M ml—致PC%毒分離株攻擊 接種物。在攻擊之前滴定攻擊接種物且記錄於註釋 檔。 在第35天，自治療組丁卜^及以中之小豬收集血 液樣本（每隻小緒2.0至4.0 ml)、體重及直腸體溫。在第42 天，自治療組T1、T2、T3及丁4中之小豬收集也液樣本（每 隻小豬2.0至4.0 ml)、體重及直腸體溫。在第49天自治 療組Ti、T2、T3及了4中之小豬收集血液樣本（每隻小豬 至4.0 ml)、體重及直腸體溫。 /在第49天，對治療組T1、T^T3中之所有小緒實施 安樂死’ Α體剖檢且將淋巴結樣本儲存於福馬林 Φ ⑽刪叫中以便務後^進行的組織病王里學檢驗。獲取 肺H胸腺、淋巴及派亞氏淋巴叢组織樣本以便進行 PCV2病毒分離。 對在第28、35、42及49天自小豬收集之血清樣本執行 PCV2病毒分離職，且藉由病毒分離分析其pcv2病毒。 對在第0、14、28、35、42及49天自小豬收集之血清樣本 測試血清中之抗體含量且藉由阳从分析其針對pm病毒 之抗體效價。將在第〇、14、28、35、似的天自小豬收 集之血清樣本儲存以供㈣可能進行的對針對ρΑν3病毒之 144878.doc •33· 201026850 ELISA效價的分析。 使用在第28、35、42及49天收集之血清樣本執行病毒分 離。藉由使用市售IgG PCV2-ELISA套組（Ingezim PCV IgG® (Ingenasa，Madrid，Spain))測試在第 〇、14、21、 28、35、42及49天自小豬收集之ik清樣本中針對PCV2抗 體之存在。亦儲存各種血清樣本以供未來可能藉由PCR檢 定測試PCV2基因組之存在。 估算及記錄範圍為〇(正常）至3(四倍正常尺寸）之淋巴結 尺寸（淺表、腹股溝、縱隔、氣管支氣管及腸系膜）。 預期含有經修飾PCV2 ORF2之疫苗將產生與投與基於未 經修飾PCV2 ORF-2之疫苗所見相比更大的免疫力。預測 含有經修飾PCV2 ORF2之疫苗在小於未經修飾PCV2 ORF2 之劑量的劑量下將完全保護豬隻。在皮下注射或藉由經口 途徑之後監測該等有益作用。 實例3 :試驗資料 為評估基於經修飾PCV2 ORF2之疫苗對斷奶小豬提供之 保護，進行試驗。在此試驗中，使用兩個劑量之三種不同 重組豬腺病毒血清型3疫苗候選物，其含有來源於合成共 同序列之PCV2 ORF2。親本重組體指定為rPAV-3 PCV2 mORF2。在以PCV2攻擊經疫苗接種之小豬且如藉由病毒 分離及臨床徵象所量測來量測對病毒血症之作用後評估保 護。 三種候選疫苗為： (l)PAdV3-PCV20RF2全長，其中 PCV2 ORF 3未經修 144878.doc •34· 201026850 飾； (2) PAdV3-PCV20RF2截短，其中已移除PCV2 ORF2核定 位信號；及 (3) PAdV3-0CV20RF2分泌，其中PCV2 ORF2之NLS已移 除且經疏水性信號序列及裂解位點置換。 在該方案中，3週齡小豬以（1)全長PAdV3-PCV20RF2 ; (2)截短之 PAdV3-PCV20RF2 、（3)分泌之 PAdV3-PCV20RF2或以磷酸鹽緩衝鹽水（對照）進行疫苗接種《在5 ® 週齡時，所有豬隻接受第二次（加強）疫苗接種。所有疫苗 接種均為肌肉内（IM)。在7週齡時，以PC V2攻擊所有豬 隻，在10週齡時終止試驗。

此試驗之資料展示於圖3 (展示病毒分離）及圖4(展示臨床 症狀之存在）中。如自此等圖中病毒分離（攻擊後）及臨床徵 象之資料可見，分泌型（上文第3號）作為對抗PCV2之疫苗 最有效。實際上，在以PBS、全長PCV20RF及截短PCVS • ORF處理之各組小豬中，豬隻在第一天内顯現PCV2之臨床 症狀，而已經以分泌之PAdV3-0CV20RF2(其中PCV2 ORF2之NLS已移除且經疏水性信號序列及裂解位點置換） 進行疫苗接種之豬隻在攻擊後7天沒有任何不利臨床症 狀0 144878.doc -35- 201026850 序列表中序列之描述 SEQ ID NO: 1 :難ylFN-PCV ORF2

ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC TTG TTT GTT CTG TCT GTC ATC ATG ATT

TAT TAT GGA CAT ACT GCA AGT AGT ^TA AAT CTT GGC ATC TTC AAC ACC

CGC CTC TCC_CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTC ACA ACG CCC TCC TGG GCG GTG GAC ATG ATG AGA TTT AAT ATT GAT GAC TTT

GTT CCC CCG GGA GGG GGG ACC AAC AAA. ATC TCT ATA CCC TTT GAA TAC

TAC AGA ATA AGA AAG GTT AAG GTT GAA TTC TGG CCC TGC TCC CCA ATC

ACC CAG GGT GAC AGG GGA GTT GGA TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT

AAC TTT GTA ACA AAG GCC ACA GCC CTA ACC TAC GAC CCC TAT GTA AAC

TAC TCC TCC CGC CAT. ACC ATA CCC CAG CCC TTC TCC TAC CAC TCC CGC

TAT TTC ACC CCC AAA CCG GTC CTT GAT AGC ACA ATC GAT TAC TTC CAA

CCC AAT AAC AAA AGA AAT CAA CTC TGG CTA AGA CTA CAA ACC TCT GCA

AAT GTG GAC CAC GTA GGC CTC GGC ACT GCG TTC GAA AAC AGT AAA TAC

GAC CAG GAC TAC AAT ATC CGT GTA ACC ATG TAT GTA CAA TTC AGA GAA

TTT AAT CTT AAA GAC CCC CCA CTT AAA CCC TAA SEQIDNO:2:由SEQIDNO:l編碼之蛋白質序列

MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNLGIFNTRLSRTFGYTVKATTVTTPSWAVDMMRFNIDDFV

PPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYS

SRHTIPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDHVGLGTAFENSKYDQD YNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKP* SEQ ID NO: 3 :豬yIFN-PCV ORF2

ATG AGT TAT ACA ACT TAT TTC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ACT TTG

TGT TTT TCT GGC TCT TAC TGC GGC ATC ^TC AAC ACC CGC CTC TCcT CGC

ACC TTC GGA TAT^ ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTC ACA ACG CCC TCC TGG

GCG GTG GAC ATG ATG AGA TTT AAT ATT GAT GAC TTT GTT CCC CCG GGA

GGG GGG ACC AAC AAA ATC TCT ATA CCC TTT GAA TAC TAC AGA ATA AGA

AAG GTT AAG GTT GAA TTC TGG CCC TGC TCC CCA ATC ACC CAG GGT GAC

AGG GGA GTT GGA TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTT GTA ACA

AAG GCC ACA GCC CTA ACC TAC GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGC

CAT ACC ATA CCC CAG CCC TTC TCC TAC CAC TCC CGC TAT TTC ACC CCC

AAA CCG GTC CTT GAT AGC ACA ATC GAT TAC TTC CAA CCC AAT AAC AAA

AGA AAT CAA CTC TGG CTA AGA CTA CAA ACC TCT GCA AAT GTG GAC CAC

GTA GGC CTC GGC ACT GCG TTC GAA AAC AGT AAA TAC GAC CAG GAC TAC

AAT ATC CGT GTA ACC ATG TAT GTA CAA TTC AGA GAA TTT AAT CTT AAA

GAC CCC CCA CTT AAA CCC TAA SEQIDNO:4:由SEQIDNO:3編碼之蛋白質序列 36- 144878.doc 201026850

MSYTTYFLAFQLCVTLCFSGSYCGrFNTRLSRTFGYTVKATTVTTPSWAVDMMRFNIDDFVPPGG

GTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHT

IPQPFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIR VTMYVQFREFNLKDPPLKP* SEQIDNO:6:由SEQIDNO:5編碼之蛋白質序列 SEQ ID NO: 5 :人類 H1N2 HA_PCV ORF2

ATG AAA GTA AAA CTA CTG ATC CTG TTA TGT ACA TTT ACA GCT ACA TAT

GCA GAC ACA ATA

TAT ACT GTC AAG ATG ATG AGA TTT AAC AAA ATC TCT GTT GAA TTC TGG GGA TCC AGT GCT GCC CTA ACC TAG CCC CAG CCC TTC CTT GAT AGC ACA CTC TGG CTA AGA GGC ACT GCG TTC GTA ACC ATG TAT CTT AAA CCC TAA

GGC ATC TTC AAC GCT ACC ACA GTC AAT ATT GAT GAC ATA CCC TTT GAA CCC TGC TCC CCA GTT ATT CTA GAT GAC CCC TAT GTA TCC TAG CAC TCC ATC GAT TAC TTC CTA CAA ACC TCT GAA AAC AGT AAA GTA CAA TTC AGA

ACC CGC CTC TCC ACA ACG CCC TCC TTT GTT CCC CCG TAC TAC AGA ATA ATC ACC CAG GGT GAT AAC TTT GTA AAC TAC TCC TCC CGC TAT TTC ACC CAA CCC AAT AAC GCA AAT GTG GAC TAC GAC CAG GAC GAA TTT AAT CTT

CGC ACC TTC GGA TGG GCG GTG GAC GGA GGG GGG ACC AGA AAG GTT AAG GAC AGG GGA GTT ACA AAG GCC ACA CGC CAT ACC ATA CCC AAA CCG GTC AAA AGA AAT CAA CAC GTA GGC CTC TAC AAT ATC CGT AAA GAC CCC CCA SEQ ID NO: 6 :由SEQ ID NO:5編碼之蛋白質序列

MKVKLLILLCTFTATYADTIGIFNTRLSRTFGYTVKATTVTTPSWAVDMMRFNIDDFVPPGGGTN

KISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFVTKATALTYDPYVNYSSRHTIPQ

PFSYHSRYFTPKPVLDSTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSAFVDHVGLGTAFENSKYDQDYNIRVTM YVQFREFNLKDPPLKP*

SEQ ID NO: 7 :全長PCV2 ORF2

ATG ACG TAT CCA AGG AGG CGT TAC CGC AGA CGA AGA CAC CGC CCC CGC AGC CAT CTT GGC CAG ATC CTC ^GC CGC CGC CCC TGG CTC GTC CAC^CC CGC CAC^GT^ TAC CGC TGG AGA AAA AAT GGC ATC TTC AAC ACC CGC

CTC TCC CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC AAG GCT ACC ACA GTC ACA ACG CCC TCC TGG GCG GTG GAC ATG CTG AGA TTT AAT ATT AAT GAC TTT GTT CCC CCG GGA GGG GGG ACC AAC AAA ATC TCT ATA CCC TTT GAA TAC TAC AGA ATA AGA AAG GTT AAG GTT GAA TTC TGG CCC TGC TCC CCA ATC ACC CAG GGT GAC AGG GGA GTT GGA TCC AGT GCT GTT ATT CTA GAT GAT AAC TTT GTA ACA AAG ACC ACA GCC CTA ACC TAC GAC CCC TAT GTA AAC TAC TCC TCC CGC CAT ACC ATA ACC CAG CCC TTC TCC TAC CAC TCC CGC TAT TTC ACC CCC AAA CCG GTC CTT GAT GGG ACA ATC GAT TAC TTC CAA CCC AAT AAC AAA AGA AAT CAA CTC TGG CTA AGA CTA CAA ACC TCT GCA AAT GTG GAC CAC GTA GGC CTC GGC ACT GCG TTC GAA AAC AGT AAA TAC GAC CAG GAC TAC AAT ATC CGT GTA ACC ATG TAT GTA CAA TTC AGA GAA TTT AAT CTT AAA GAC CCC CCA CTT AAA CCC TAA -37- 144878.doc 201026850 SEQIDNO:8:由SEQIDNO:7編碼之蛋白質序列

MTYPRRRYRRRRHRPRSHLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKNGIFNTRLSRTFGYTVKATTVTTP

SWAVDMLRFNINDFVPPGGGTNKISIPFEYYRIRKVKVEFWPCSPITQGDRGVGSSAVILDDNFV

TKTTALTYDPYVNYSSRHTITQPFSYHSRYFTPKPVLDGTIDYFQPNNKRNQLWLRLQTSANVDH VGLGTAFENSKYDQDYNIRVTMYVQFREFNLKDPPLKP* SEQ ID NO: 9 : PCV2 ORF2之信號序列

ATG ACG TAT CCA AGG AGG CGT TAC CGC AGA CGA AGA CAC CGC CCC CGC

AGC CAT CTT GGC CAG ATC CTC CGC CGC CGC CCC TGG CTC GTC CAC CCC

CGC CAC CGT TAC CGC TGG AGA AGG AAA AAT SEQ ID NO: 10 ··由SEQ ID NO: 9編碼之蛋白質序列

MTYPRRRYRRRRHRPRS HLGQILRRRPWLVHPRHRYRWRRKN SEQ ID NO:ll ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC TTG TTT GTT CTG TCT GTC ATC ATG ATT TAT TAT GGA CAT ACT GCA AGT AGT CTA AAT CTT (SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO:12

MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNL SEQ ID NO:13

ATG AGT TAT ACA ACT TAT TTC TTA GOT TTT CAG CTT TGC GTG ACT TTG TGT TTT TCT GGC TCT TAC TGC SEQ ID NO:14

MSYTTYFLAFQLCVTLCFSGSYC SEQ ID NO:15 atg aaa gta aaa eta ctg ate ctg tta tgt aca ttt aca get aca tat gca gac aca ata SEQ ID NO.16

MKVKLLILLCTFTATYADTI -38 - 144878.doc 201026850 【圖式簡單說明】 圖1.製備本發明之重組載體的圖解。 圖 2.自 Heijne Eur. J. Biochem 133，17-21 (1983)之圖 1再 現之真核信號序列的集合。該等序列基於其已知或預測之 裂解位點對準，該等裂解位點由星號（*)指示。 _ 圖3. PCV2疫苗接種/攻擊試驗：來自用以下處理之各組 中之攻擊後小豬的病毒分離百分比：（l)PAdV3-PCV20RF2 全長；（2)PAdV3-PCV20RF2截短；（3)PAdV3-PCV20RF2 ® 分泌；及（4)磷酸鹽緩衝鹽水（對照）。 圖4. PCV2疫苗接種/攻擊試驗：在用以下處理之各組中 (一組中）所有豬均無任何不利臨床徵象的攻擊後天數： (l)PAdV3-PCV20RF2全長；（2)PAdV3-PCV20RF2截短； (3)PAdV3-PCV20RF2分泌；及（4)磷酸鹽缓衝鹽水（對照）。 ❷ 144878.doc 39- 201026850 序列表 <11〇>丨澳大利亞商維托基有限公司 <120>用於治療豬隻之以PCV2為基礎之方法及組合物 <130> 02937-19823US02 <140> 098142364 <141> 2009-12-10

<150> 61/122*555 <151> 2008-12-15 <160> 106 <170> Patent In version 3.5 <210> 1 <211> 657 <212> m <233>人造序列 <220> <223> #y!FN-PCVORF2 <400> 1 atgacttgcc agacttacaa cttgtttgtt ctgtctgtca tcatgattta actgcaagta gtctaaatct tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac actgtcaagg ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat attgatgact ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc tacagaataa gaaag£ttaa ggttgaattc tggccctgct ccccaatcac aggggagttg gatccagtgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ctaacctacg acccctatgt aaactactcc tcccgccata ccatacccca taccactccc gctatttcac ccccaaaccg gtccttgata gcacaatcga cccaataaca aaagaaatca actctggcta agactacaaa cctctgcaaa gta££cctcg gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa accatgtatg tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttaa ttatggacat cttcggatat gagatttaat ctttgaatac ccagggtgac ggccacagcc gcccttctcc ttacttccaa tgtggaccac tatccgtgta accctaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 657

<210> 2 <211> 218 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> <400> 2 Met Thr Cys Gin Thr Tyr Asn Leu Phe Val Leu Ser Val lie Met lie 1 5 10 15

Tyr Tyr Gly His Ala Ser Ser Leu Asn Leu Gly He Phe Asn Tl,r

Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly 35

Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr 40 45

Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe 50 55 60

Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr 144878·序列表.doc 201026850

Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Scr Pro lie 85 90 95

Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp Asp 100 105 110

Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn 115 120 125

Tyr Ser Scr Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Scr Tyr His Ser Arg 130 135 140

Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Va〗Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin 145 150 155 160

Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Ala 165 170 175

Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asti Ser Lys Tyr 180 185 190

Asp Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu 195 200 205

Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 210 215 <210> 3 <211> 645 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223> |#yIFN-PCV ORF2 <400> 3 atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc 60 tcttactgcg gcatcttcaa cacccgcctc tcccgcacct tcggatatac tgtcaaggct 120 accacagtca caacgccctc ctgggcggtg gacatgatga gatttaatat tgatgacttt 180 gttcccccgg gaggggggac caacaaaatc tctataccct ttgaatacta cagaataaga 240 aaggttaagg ttgaattctg gccctgctcc ccaatcaccc agggtgacag gggagttgga 300 tccagtgctg ttattetaga tgataacttt gtaacaaagg ccacagccct aacctacgac 360 ccctatgtaa actactcctc ccgccatacc ataccccagc ccttctccta ccactcccgc 420 tatttcaccc ccaaaccggt ccttgatagc acaatcgatt acttccaacc caataacaaa 480 agaaatcaac tctggctaag actacaaacc tctgcaaatg tggaccacgt aggcctcggc 540 actgcgttcg aaaacagtaa atacgaccag gactacaata tccgtgtaac catgtatgta 600 caattcagag aatttaatct taaagacccc ccacttaaac cctaa 645 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213>人造序列 2- 144878·序列表.doc 201026850 <220> <223> 豬yIFN-PCVORFS <400> 4

Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gin Leu Cys Val Thr Leu 15 10 15

Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gly lie Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg 20 25 30

Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr Pro Ser Trp 35 40 45

Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly 50 55 60

Gly Gly Thr Asn Lys lie Sei lie Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg lie Arg

65 70 75 SO

Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr Gin Gly Asp

Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr 100 105 110

Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg 115 120 125

His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Mie Thr Pro 130 135 140

Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro Asn Asn Lys 145 150 155 160

Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Ala Asn Val Asp His 165 170 175

Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Scr Lys Tyr Asp Gin Asp Tyr 180 185 190

Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys 195 200 205

Asp Pro Pro Leu Lys Pro 210 <210〉 5 <211> 636 <212> DNA <213>人造序列 <220> <223> 人類H1N2 HA-PCV ORF2 <400> 5 60 atgaaagtaa aactactgat cctgttatgt acatttacag ctacatatgc agacacaata ggeatettea acacccgcct ctcccgcacc tteggatata ctgtcaaggc taccacagtc 144878-序列表.doc 120 201026850 acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg agatttaata ttgatgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc cccaatcacc cagggtgaca ggggagttgg atccagtgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag gccacagccc taacctacga cccctatgta aactactcct cccgccatac cataccccag cccttctcct accactcccg ctatttcacc cccaaaccgg tccttgatag cacaatcgat tacttccaac ccaataacaa aagaaatcaa ctctggctaa gactacaaac ctctgcaaat gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttaaa ccctaa <210> 6 <211> 211 <212> PRT <213>人造序列 <220> <223> 人類H1N2HA-PCVORF2 <400> 6

Met Lys Val Lys Leu Leu lie Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 15 10 15

Ala Asp Thr lie Gly He Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly 20 25 30

Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp 35 40 45

Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr 50 55 60

Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg lie Arg Lys Val Lys 65 70 75 80

Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr Gin Gly Asp Arg Gly Val 85 90 95

Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr 100 105 110

Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Va】Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr lie 115 120 125

Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val 130 135 140

Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gin 145 150 155 160

Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Ala Asn Val Asp His Val Gly Leu 165 170 175

Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gin Asp Tyr Asn lie Arg 180 185 190 -4- 180 240 300 360 420 480 540 600 636 144878·序列表.doc 201026850

Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro 195 200 205

Leu Lys Pro 210 <210> 7 <211> 702 <212> DNA <213>豬康狀病毒 <220> <221> misc_feature <223> 全長fCV2 0RF2 <400> 7

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 702 atgacgtatc caaggaggcg ttaccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactgt caaggctacc acagtcacaa cgccctcctg ggcggtggac atgctgagat ttaatattaa tgactttgtt cccccgggag gggggaccaa caaaatctct ataccctttg aatactacag aataagaaag gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agttggatcc agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaagacca cagccctaac ctacgacccc tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctat ttcaccccca aaccggtcct tgatgggaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga aatcaactct ggctaagact acaaacctct gcaaatgtgg accacgtagg cctcggcact gcgttcgaaa acagtaaata cgaccaggac tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa <210> 8 <211> 233 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <220> <221> MISC^FEATURE <223> 全長PCV2 0RF2 <400> 8

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg ATg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15

Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr krg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60

Pro Scr Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn lie Asn Asp Phe Val 144878·序列表.doc 201026850 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 110

Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe Val Thr Lys Thr Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr lie Thr Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Gly Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Ala Asn 180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 <210> 9 <211> 126

<212> DNA <213>諸環狀病毒 <220> <221> mi sc feature <223> PCV50RF2之信號序列 <400> 9 atgacgtatc caaggaggcg ttaocgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg aaaaat <210> 10 <211> 42 <212> PRT <213>豬環狀病毒 <220> <221> M1SC—FEATURE <223> PCV20RF2之信號序列 <400> 10

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15 6- 60 120 126 144878-序列表.doc 201026850

Ser His Leu Gly Gin He Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 <210> 11 <211> 81 <212> DNA <213>原難 <400> 11 atgacttgcc agacttacaa cttgtttgtt ctgtctgtca tcatgattta ttatggacat actgcaagta gtctaaatct t <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213>原雞 <400> 12

Met Thr Cys Gin Thr Tyr Asn Leu Phe Val Leu Ser Val He Met He 15 10 15

Tyr Tyr Gly His Thr Ala Ser Ser Leu Asn Leu 20 25 <210> 13 <211> 69 <212> DNA <213>野豬 <400> 13 atgagttata caacttattt ctlagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc tcttactgc <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213>野豬 <400> 14

Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gin Leu Cys Val Thr Leu 1 5 10 15

Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys 20 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213>流感病毒 <400> 15 atgaaagtaa aactactgat cctgttatgt acatttacag ctacatatgc agacacaata <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> i氣病毒 144878·序列表.doc 201026850 <400> 16

Met Lys Val Lys Leu Leu He Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 15 10 15

Ala Asp Thr lie 20 <210> 17 <211> 29 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 17

Met Arg Cys Phe lie Ser Leu Val Leu Gly Leu Leu Ala Leu Glu Val 15 10 15

Ala Leu Ala Arg Asn Leu Gin Glu His Val Phe Asn Ser 20 25 <210> 18 <211> 28 <212> PRT <2!3>褐家鼠 <400〉 18

Met Ala Leu His Met Val Leu Val Val Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu 15 10 15

Glu Ala Gin Asn Pro Glu Pro Ala Asn lie Thr Leu 20 25 鼠 T家 94V > 1 3 p fe> Λ > &1 64 3 <21<21<21<21 <400> 19

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Val lie Leu Val Met Leu Ser 15 10 15

Met Phe Leu His lie Leu His Ser Leu Pro Asp Gly Asp Phe lie lie 20 25 30

Gin Gly <210> 20 <211> 36 <212> PRT <213>盲鰻 <400> 20

Met Ala Leu Ser Pro Phe Leu Ala Ala Val lie Pro Leu Val Leu Leu 15 10 15

Leu Ser Arg Ala Pro Pro Ser Ala Asp Thr Arg Thr Thr Gly His Leu 20 25 30 144878-序列表.doc 201026850

Cys Gly Lys Asp 35 <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213>銨鳙 <400> 21

Met Ala Ala Leu Trp Leu Gin Ser Phe Ser Leu Leu Val Leu Leu Val 15 10 15

Val Ser Trp Pro Gly Ser Gin Ala Val Ala Pro Ala Gin His Leu Cys 20 25 30

Gly Ser

<210> 22 <211> 34 <212> PRT <213>智人 <400> 22

Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Ser His <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 23

Met Ala Leu Trp Met Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Val Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Lys Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30

Pro His <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 24

Met Ala Leu Trp lie Arg Phe Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu lie Leu 15 10 15

Trp Glu Pro Arg Pro Ala Gin Ala Phe Val Lys Gin His Leu Cys Gly 20 25 30 9- 144878-序列表.doc 201026850

Ser His <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> _羊 <400> 25

Met Lys Val Leu lie Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 15 10 15

GluGlnGl.Gl^uAsnVa, Val G,y 2631PR綿26 (>> Λ > 012 3 11 1Λ 1 lx <2<2<2<2

Met Arg Lys Ser lie Leu Leu Val Val Thr lie Leu Ala Leu Thr Leu 15 10 15

Pro Phe Leu He Ala Gin Glu Gin Asn Gin Glu Gin Arg He Cys 20 25 30 <210> 27 <211> 29 <212> PRT <213>綿单 <400> 27

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly He Leu Phe Trp Ala 15 10 15 TTir Gin Ala Glu Gin Leu Thr Lys Cys Glu Val Phe Gin 20 25 012 3 1 IX 1 IX <2<2<2<2 T羊 y 2828冊綿28sc Ly t Me va y 15 G1 s cy na uLe naLeulo y G, u Le a u Le u e L5 u Le

Gin Ala He lie Val Thr Gin Thr Met Lys Gly Leu 20 25 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213>綿羊 <220> <221> misc^feature <222> (24)..(24) <223> xaa可為任何天然產生之胺基酸 10· 144878·序列表.doc 201026850 <400> 29

Met Lys Leu Leu lie Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg 15 10 15

Pro Lys His Pro lie Lys His Xaa Gly 20 25 <210> 30 <211> 25 <212> PRT <213>綿丰 <400> 30

Met Lys Val Leu Met Lys Ala Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Lys 15 10 15

Asn Thr Met Glu His Val Ser Ser Ser 20 25

<210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> vs 病毒 <220> <221> misc^feature <222> (24)..(26) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400〉 31

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe lie His Val Asn Cys 15 10 15

Lys Phe Thr lie Val Phe Pro Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 32 <211> 33 <212> PRT <213>原雞 <400> 32

Met Gin Tyr Arg Ala Leu Val lie Ala Val lie Leu Leu Leu Ser Thr 1 5 10 15

Thr Val Pro Glu Val Cys Ser Lys Ser lie lie Asp Arg Glu Arg Arg 20 25 30

Asp <210> 33 <211> 31 <212> PRT <213>西方蜜蜂 <400> 33

Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr lie 1 5 10 15 -11 - 144878-序列表.doc 201026850

Ty Γ e s A a Γ Ty20 o Γ p u lo G3 o pr a o pr u G1 o Γ5 P2 u G1 o pr 鼠 T家 3439沔褐 0717备 IX 11 1* <2<2<2<2 <220> <221> misc_feature <222> (31)7.(32) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> miscjeature <222> (34)..(37) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> mi sc一feature <222> ί39) <223> Xaa奇為任何天然產生之胺基酸 <400> 34

Met Asn Ser Gin Val Ser Ala Arg Lys Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Met Met Ser Asn Leu Leu Phe Cys Gin Asn Val Gin Thr Leu Xaa Xaa 20 25 30

Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 35 <210> 35 <211> 35 <212> PRT <213>智人 <400> 35

Met Pro Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Ala Leu Leu Cys 1 5 10 15

Leu Pro Trp Leu Gin GIu Ala Gly Ala Vai Gin Thr Val Pro Leu Ser 20 25 30

Arg Leu Phe 35 <210> 36 <211> 30 <212> PRT <213>智人 <400> 36

Met Glu Met Phe Gin Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly 1 5 10 15

Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg 20 25 30 -12- 144878-序列表.doc 201026850 <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213>智人 <400> 37

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala lie Phe Leu Val Thr Leu Ser 15 10 15

Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gin Asp Cys Pro 20 25 30

Glu Cys <210> 3S <211> 31 <212> PRT <213>穴兔 <220>

<221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 38

Met Lys Leu Ala lie Thr Leu Ala Leu Val Thr Leu Ala Leu Leu Cys 15 10 15

Ser Pro Ala Ser Ala Gly lie Cys Pro Arg Phe Ala Xaa Val lie 20 25 30 <210> 39 <211> 36 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 39

Met Ala Ala Asp Ser Gin Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu 1 5 10 15

Cys Leu Leu Trp Pro Gin Glu Ala Gly Ala Leu Pro Ala Met Pro Leu 20 25 30

Ser Ser Leu Phe 35 <210> 40 <211> 36 <212> PRT <2Π>智人 <400〉 40

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr lie Pro Leu 20 25 30

Ser Arg Leu Phe •13- 144878-序列表.doc 201026850 35 <210> 41 <211> 37 <212> PRT <213>温帶牛 <400> 41

Met Met Ala Ala Gly Pro Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Ala Leu 15 10 15

Leu Cys Leu Pro Trp Thr Gin Val Val Gly Ala Phe Pro Ala Met Ser 20 25 30

Leu Ser Gly Leu Phe 35 <210> 42 <211> 35 <212> PRT <213>溫帶牛 <400> 42

Met Met Ser Ala Lys Asp Met Val Lys Val Met lie Val Met Leu Ala 15 10 15

He Cys Phe Leu Ala Arg Ser Asp Gly Lys Ser Val Lys Lys Arg Ala 20 25 30

Val Ser Glu 35 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 43

Met Ser Ser Arg Leu Leu Leu Gin Leu Leu Gly Phe Trp Leu Phe Leu 15 10 15

Ser Gin Pro Cys Arg Ala Arg Val Ser Glu Glu Trp Met Asp Gin Val 20 25 30 <210> 44 <211> 28 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 44

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe lie Ser Gly Ser Ala 15 10 15

Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213>智人 -14- 144878·序列表.doc 201026850 <400> 45

Met Lys Trp Val Thr Phe He Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 15 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys 20 25 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 46

Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe lie Ser Gly Ser Ala 15 10 15

Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys 20 25 ss >>>·>> 012 3 1Λ 11 11 IX 2ΛΖ22 < V < < <400> 47

Met A.rg Gin Ala Ala Ala Pro Leu Leu Pro Gly Val Leu Leu Leu Phe 15 10 15

Ser He Leu Pro Ala Ser Gin Gin Gly Gly Val Pro Gly Ala lie Pro 20 25 30

Gly Gly <210> 48 <211> 34 <212> PRT <213>原雞 ❿ <220> <221> <222> <223> misc feature (32)7.(34) Xaa可為任何天然產生之胺基酸 48 Met Ala Met Ala Gly Val Phe Val Leu Phe Ser Phe Val Leu Cys Gly 15 10 15 <400>

Phe Leu Pro Asp Ala Ala Phe Gly Ala Glu Val Asp Cys Ser Arg Xaa 20 25 30

Xaa Xaa <210> 49 <211> 28 <212> PRT 原雞 •15· 144878-序列表.doc 201026850 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(28) <223> xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 49

Met Arg Ser Leu Leu lie Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 15 10 15

Leu Gly Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 50 <211> 29 <212> PRT <213>原雞 <220> <221> misc^feature <222> (27)..(29) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 50 u Le s Ly t e M1 va ηα 15 A 1 ηα c I y G1 u Le Γ 60 SI u Le va Γ Th s cy u u5

Cys Fhe Ala Ala Pro Pro Lys Ser Val lie Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 51 <211> 34 <212> PRT <213>智人 <400> 51

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly lie Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 15 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gin Gly Asp Ala Ala 20 25 30

Gin Lys <210> 52 <211> 33 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 52

Met Ser Thr Val Glu Leu Ser Leu Cys Leu Leu lie Met Leu Ala Val 15 10 15

Cys Cys Tyr Glu Ala Asn Ala Ser Gin lie Cys Glu Leu Val Ala His 20 25 30

Glu -I6- 144878-序列表.doc 201026850 <210> 53 <211> 30 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 53

Met Arg Leu Ser Leu Cys Leu Leu Thr lie Leu Val Val Cys Cys Tyr 15 10 15 GIu Ala Asn Gly Gin Thr Leu Ala Gly Val Cys Gin Ala Leu 20 25 30 <210> 54 <211> 27 <212> PRT <213> AD病毒 <400> 54

Met Arg Tyr Met lie Leu Gly Leu Leu Ala Leu Ala Ala Val Cys Ser 15 10 15

Ala Ala Lys Lys Val Glu Phe Lys Glu Pro Ala 20 25 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213>褐家鼠 <220> <221> misc feature <222> (16)7.(17) <223> xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220〉 <221> mi sc一feature <222> (19)7.(19) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature <223> xaaj為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc—feature <222> (28)..(28) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 55

Met Lys Ala Ala Val Leu Ala Val Ala Leu Val Phe Leu Thr Gly Xaa 15 10 15

Xaa Ala Xaa Glu Phe Xaa Xaa Xaa Asp Glu Pro Xaa 20 25 <210> 56 <211> 29 <212> PRT <213>狂犬病毒 <400> 56

Met Val Pro Gin Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu 15 10 15 -17- 144878-序列表.doc 201026850

Cys Pbe Gly Lys Phe Pro lie Tyr Thr lie Leu Asp Lys 20 25 <210> 57 <211> 26 <212> PRT <213> i氣病毒 <400> 57

Met Lys Thr lie lie Ala Leu Ser Tyr lie Phe Cys Leu Val Phe Ala 15 10 15

Gin Asp Leu Pro Gly Asn Asp Asn Asn Ser 20 25 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213>流感病毒 <400> 58

Met Ala lie lie Tyr Leu lie Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp 15 10 15

Gin lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn 20 25 <210> 59 <211> 28 <212> PRT <213>流感病毒 <400> 59

Met Asn Thr Gin lie Leu Val Phe Ala Leu Val Ala Val lie Pro Thr 15 10 15

Asn Ala Asp Lys lie Cys Leu Gly His His Ala Val 20 25 <210> 60 <211> 33 <212> PRT <213>智人 <400> 60

Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys 1 5 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Gly <210> 61 <211> 33 <212> PRT <213>智人 18- 144878-序列表.doc 201026850 <400> 61

Met Ala Leu Thr Phe Tyr Leu Met Val Ala Leu Val Val Leu Ser Tyr 15 10 15

Lys Ser Phe Ser Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Gly <210> 62 <211> 33 <212> PRT <213>智人 <400> 62

Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val 乙eu Ser Tyr 15 10 15

Lys Ser lie Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Gly <210> 63 <211> 33 <212> PRT <213>智人 <400> 63

Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys 】 5 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu 20 25 30

y GI T人 6433冲智-- <400> 64

Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr 15 10 15

Lys Ser lie Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Gly <210> 65 <211> 33 <212> PRT <213>智人 -19· 144878-序列表.doc 201026850 <400> 65

Met Ala Leu Pro Phe Ser Leu Met Met Ala Leu Val Val Leu Ser Cys 15 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Asn <210> 66 <211> 33 <212> PRT <213>智人 <400> 66

Met Ala Leu Pro Phe Ala Leu Met Met Ala Leu Val Val Leu Ser Cys 15 10 15

Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu 20 25 30

Asn <210> 67 <211> 30 <212> PRT <213>智人 <400> 67

Met Lys Tyr Thr Ser Tyr lie Leu Ala Phe Gin Leu Cys lie Val Leu 15 10 15

Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu 20 25 30 <210> 68 <211> 31 <212> PRT <213>智人 <400> 68

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gin lie Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 15 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gin 20 25 30 <210> 69 <211> 30 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 69

Met Arg Ala Pro Ala Gin lie Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu Phe Pro 15 10 15 -20- 144878-序列表.doc 201026850

Gly Thr Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Scr 20 25 30 <210> 70 <211> 30 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 70

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 20 25 30 <210> 71 <211> 30 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 71

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ser Thr Gly Asn lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser 20 25 30 <210> 72 <211> 30 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 72

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 15 10 15

Gly Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro Ser 20 25 30 <210> 73 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 73

Met Ala Trp lie Ser Leu lie Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly 15 10 15

Ala lie Ser Gin Ala Val Val Thr Gin Glu Ser Ala Leu 20 25 <210〉 74 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 74

Met Ala Trp lie Ser Leu lie Leu Ser Leu Leu Ala Leu Ser Ser Gly 1 5 10 15 -21 - 144878·序列表.doc 201026850

Ala lie Ser Gin Ala Val Val Thr Gin Glu Ser Ala Leu 20 25 <210> 75 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 75

Met Ala Trp Thr Ser Leu lie Leu Ser Leu Leu Ala Leu Cys Ser Gly 15 10 15

Ala Ser Ser Gin Ala Val Val Thr Gin Glu Ser Ala Leu 20 25 鼠 了家 6 4 、 7 s p ·>>>> 012 3 11 1Λ 1 TA <2<2<2<2 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(34) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 76

Met Gly Val Arg Met Glu Scr His Thr Arg Val Phe lie Phe Leu Leu 15 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Thr Asp Gly Asp lie Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Xaa Xaa <210> 77 <211> 32 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 77

Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gin lie Phe Gly Phe Leu Leu Leu Leu 15 10 15

Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Scr 20 25 30 <210> 78 <211> 28 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 78

Met Lys Val Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Leu Thr Ala lie Pro Gly lie 1 5 10 15

Met Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly 20 25 <210> 79 •22· 144878·序列表.doc 201026850 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <220> <221> misc^feature <222> (20)..(29) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 79

Met Gly Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 15 10 15

Val His Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 80 <211> 29 <212〉 PRT <213>小家鼠

<220> <221> misc_feature c222> (20) (29) <223> Xaa奇·為任何天然產生之胺基酸 <400> 80 lie Lys Trp Scr Trp lie Ser Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15

Val His Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 81 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <220> <221> misc_feature <722> <223> Xaa奇·為任何天然產生之胺基酸 <400> 81

Met Glu Cys Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Leu Thr Ala Gly 15 10 15 lie His Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 ' <210> 82 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <220> <221> mi sc_feature <223> Xaa#為任何天然產生之胺基酸 <400> 82 23- 144878·序列表.doc 201026850

Met Glu Trp Ser Gly Val Phe lie Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 15 10 15

Val Tyr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 83 <211> 29 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 83

Met Gly Trp Ser Phe lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 15 10 15

Val His Ser Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu 20 25 <210> 84 <211> 25 <212> PRT <213>灰狼 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 84

Xaa Xaa Pro Leu Leu lie Leu Ala Phe Leu Xaa Ala Ala Val Ala Thr 15 10 15

Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys lie Val 20 25 <210> 85 <211> 25 <212> PRT <213>灰狼 <220> <221> raisc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 85

Ala Leu Xaa lie lie Phe Leu Ala Leu Leu Xaa Ala Xaa Val Ala Phe 15 10 15 24· 144878-序列表.doc 201026850

Pro lie Asp Asp Asp Asp Lys lie Val 20 25 <210> 86 <211> 27 <212> PRT <213>灰狼 <220> <221> mi sc一feature <222> (7)..(7) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (12)7.(13) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature <222> (17)..(19) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220>

<221> mi sc—feature <222> (24)7.(24) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc_feature c222> (1Ί、- (1Ί、 <223> Xaa^為任何天然產生之胺基酸 <400> 86

Ala Phe Leu lie Leu Val Xaa Ala Phe Ala Leu Xaa Xaa Val Ala Phe 1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Val Pro Ala lie Xaa Pro Val Xaa 20 25 <210> 87 <211> 26 <212> PRT <213> 灰狼 <220> <221> misc feature <222> (1)..(2) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221〉 misc feature <222> 02)7.(12) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221〉 raise feature <222〉 (16)7.(16) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (18)7.(18) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (22)..(26) 25- 144878-序列表.doc 201026850 <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 87

Xaa Xaa Leu lie Leu Val Phe Gly Ala Leu Leu Xaa Ala lie Tyr Xaa 1 5 10 15

Gin Xaa Ala Phe Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 88 <211> 25 <212> PRT <213>灰狼 <220> <221> misc feature <222> (1).7(2) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220〉 <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc—feature <222> (13)7.(13) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <220> <221> misc feature <222> (21)..(25) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 88

Xaa Xaa Phe Phe Leu Leu Leu Xaa Val lie Gly Phe Xaa Val Ala Gin 15 10 15

Tyr Ala Pro His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 <210> 89 <211> 25 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 89

Met Lys Phe Phe Leu Leu Leu Ser Leu He Gly Phe Cys Trp Ala Gin 15 10 15

Tyr Asp Pro His Thr Gin Tyr Gly Arg 20 25 <210> 90 <211> 25 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 90

Met Lys Phe Val Leu Leu Leu Ser Leu lie Gly Phe Cys Trp Ala Gin 15 10 15

Tyr Asp Pro His Thr Ser Asp Gly Arg 26- 144878-序列表.doc 201026850 20 25 <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213>褐家鼠 <400> 91

Leu Leu Ser Leu lie Gly Phe Cys Tyr Ala Gin Tyr Asp Pro His Thr 15 10 15

Ala Asp Gly Arg 20 <210> 92 <211> 29 <212> PRT <213>穴兔 <400> 92

Met Met Pro Leu Val Pro Leu Leu Leu Val Ser lie Val Phe Pro Gly 15 10 15 lie Gin Ala Thr Gin Leu Thr Arg Cys Glu Leu Thr Glu 20 25 <210> 93 <211> 29 <212> PRT <213>野豬 <400> 93

Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Val Val Gly lie Leu Phe Pro Ala 1 5 10 15 lie Gin Ala Lys Gin Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gin 20 25

<210> 94 <211> 26 <212> PKT <213>褐家鼠 <400> 94

Met Lys Arg Leu Leu lie Leu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val Cys Gly 15 10 15

Asn Glu Asn Phe Val Gly His Gin Val Leu 20 25 <210> 95 <211> 36 <212> PRT <213>溫帶牛 <400> 95

Met Pro Arg Leu Cys Ser Ser Arg Ser Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Leu Leu Gin Ala Ser Met Glu Val Arg Gly Trp Cys Leu Glu Ser Ser -27- 144878-序列表.doc 201026850 20 25 30

Gin Cys Gin Asp 35 T猪 963085野0717多 11 IX ΙΑ <2<2<2<2 <400> 96

Met Ala Trp Gin Gly Leu Leu Leu Ala Ala Cys Leu Leu Val Leu Pro 15 10 15

Ser Thr Met Ala Asp Cys Leu Ser Gly Cys Ser Leu Cys Ala 20 25 30 <210> 97 <211> 30 <212> PRT <213>智人 <400> 97

Met Ala Are Phe Leu Thr Leu Cys Thr Trp Leu Leu Leu Leu Gly Pro 15 10 15

Gly Leu Leu Ala Thr Val Arg Ala Glu Cys Ser Gin Asp Cys 20 25 30 <210> 98 <211> 31 <212> PRT <213>野豬 <220> <221> mi sc feature <222> (30)..(31) <223> Xaa可為任何天然產生之胺基酸 <400> 98

Met Gin Arg Leu Cys Ala Tyr Val Leu lie His Val Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15

Ala Cys Ser Glu Ala Ser Trp Lys Pro Gly Phe Gin Leu Xaa Xaa 20 25 30 <210> 99 <211> 31 <212> PRT <213>小家鼠 <400> 99

Met Asp Arg Arg Arg Met Pro Leu Trp Ala Leu Leu Leu Leu Trp Ser 1 5 10 15

Pro Cys Thr Phe Ser Leu Pro Thr Gly Thr Thr Phe Glu Arg lie 20 25 30 <210> 100 <211> 31 -28- 144878·序列表.doc 201026850 <212> FRT <213>錐體蟲 <400> 100

Met Val Lys Ala lie Ala Ser Leu Met Leu Leu His lie Trp Ala lie 1 5 10 15

Glu Glu lie Lys Ala Glu Arg Gin Ala Pro Ser Val Ser Arg Thr 20 25 30 <210> 101 <211> 33 <212> PRT <213>河内鯰魚 <400> 101

Met Ser Ser Ser Pro Leu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Met Cys Leu Val 15 10 15

Ser Ala Val Gly Val lie Ser Cys Gly Arg Pro His Val Val Leu Asn 20 25 30

Ser <210> 102 <211> 36 <212> PRT <213>鞍鳙 <400> 102

Met Va】Ser Ser Ser Arg Leu Arg Cys Leu Leu Val Leu Leu Leu Ser 15 10 15

Leu Thr Val Ser lie Ser Cys Ser Phe Ala Gly Gin Arg Asp Ser Lys 20 25 30

Leu Arg Leu Leu 35 <210> 103 <211> 38 <212> PRT <213〉銨緣 <400> 103

Met Lys Met Val Ser Ser Ser Arg Leu Arg Cys Leu Leu Val Leu Leu 15 10 15

Leu Ser Leu Thr Ala Ser He Ser Cys Ser Phe Ala Gly Gin Arg Asp 20 25 30

Ser Lys Leu Arg Leu Leu 35 <210〉 104 <211> 33 <212> PRT <213>銨繚 29- 144878-序列表.doc 201026850 <400> 104

Met Gin Cys lie Arg Cys Pro Ala lie Leu Ala Leu Leu Ala Leu Va] 15 10 15

Leu Cys Gly Pro Ser Val Ser Ser Gin Leu Asp Arg Glu Gin Ser Asp 20 25 30

Asn <210> 105 <211> 32 <212> PRT <2i3> mm <400> 105

Met Gly Phe Leu Lys Phe Ser Pro Phc Leu Val Val Ser lie Leu Leu 15 10 15

Leu Tyr Gin Ala Cys Gly Leu Gin Ala Val Pro Leu Arg Ser Thr Leu 20 25 30 <210> 106 <211> 31 <212> PRT <213>銨鰱 <400> 106

Met Lys Arg lie His Ser Leu Ala Gly lie Leu Leu Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 lie Gin Ser Ser Cys Arg Val Leu Met Gin Glu Ala Asp Pro Ser 20 25 30 30· 144878-序列表.doc

Claims (1)

1. 201026850 七、申請專利範圍： 1. 一種重組表現載體，其包含編碼經修飾之PCV2 ORF2的 核酸序列可操作地連接於啟動子，其中 a.該經修飾之PCV2 ORF2為野生型PCV2 ORF2之核定 位信號已經移除或修飾以允許在表現後分泌截短ORF2蛋 白者；或 b·該經修飾之PCV2 ORF2為核定位信號已經移除或經 指導該PCV2 ORF2表現於受感染細胞之細胞表面上的疏 ❿ 水性信號置換者。 2·如請求項1之重組表現載體’其中該〇RF2之核定位信號 已經疏水性信號序列及裂解位點置換。 3. 如請求項1之重組表現載體，其中該〇RF2之核定位信號 經選自由雞γ干擾素、豬γ干擾素及流感病毒之HA蛋白組 成之群的信號序列置換。 4. 如請求項1之重組表現載體，其中該載體為病毒載體。 5. 如請求項4之重組表現載體，其中該病毒載體係選自由 • 腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體（lentiviral vector)、疮療病毒載體、疫病毒載體組成之群。 6. 如請求項5之重組表現載體，其中該腺病毒載體為選自 由 PAdVl、PAdV2、PAdV3、PAdV4及 PAdV5 組成之群的 豬腺病毒載體。 7. 如請求項6之重組表現載體，其中該豬腺病毒載體為 PAdV3。 8. 如請求項7之疫苗，其中該pAVd3為複製勝任型 144878.doc 201026850 (replication competent) PAdV3 ° 9. 如請求項7之重組表現載體，其中編碼該經修飾之pcv ORF2之該核酸序列係插入PAdV3中之非必需序列中。 10. 如請求項9之重組表現載體，其中PAdV-3之該非必需序 列係選自由緒腺病毒基因組之E3區域、E4之ORjr 1 2及 4-7、E4末端與ITR之間的區域組成之群。 11. 如請求項7之重組表現載體，其中該PAdV3為包含該 PAdV3之原生纖維基因且另包含該腺病毒之異源第二纖 維基因的重組PAdV3 ’其中該第二纖維基因係由該重組 腺病毒在穩定表現該第二纖維基因之細胞株中生長而獲 得。 12. 如請求項1之重組表現載體，其中該核酸包含SEq id ΝΟ:1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5之序列。 · 13. 如請求項丨之重組表現載體，其進一步包含編碼在豬隻 中引發免疫反應之另一抗原的核酸。 14· 一種組合物，其包含如請求項丨之第一重組表現載體及 包含在豬隻中引發免疫反應之另一抗原的第二重組表現 載體。 15. —種用於在豬隻中引發對抗豬環狀病毒（pcv2)感染之保 護性反應的疫苗，其包含獸醫學上可接受之媒劑或賦形 劑及如請求項1之重組表現載體。 16. 種用於在豬隻中引發對抗PCV2感染之保護性反應的疫 為’其包含如請求項14之組合物。 17·如請求項15之疫苗’其進一步包含一或多種用於對豬隻 H4878.doc 201026850 疫苗接種之其他抗原’其中該一或多種其他抗原係以蛋 白質組份在該疫苗之獸醫學上可接受之媒劑或賦形劑中 的形式提供。 18. —種用於保護豬隻以對抗PCV_2❹尺^引起之疾病的疫 苗’該疫苗包含重組病毒載體，該載體包含啟動子可操 作地連接於包含編碼膜錨定域（anchoring d〇main)之核酸 的疏水性信號序列、用於插入經修飾之PC V-2 ORF2於該 疏水性信號序列框内的多個選殖位點、聚腺苦酸化信 ® 號；及病毒基因組，其中該經修飾之PCV-2 0RF2缺少核 定位信號。 19. 如請求項18之疫苗，其中該載體進一步包含一個裂解序 列緊鄰經修飾之PCV-2 ORF2之選殖位點上游，其中該載 體之PCV-2 ORF 2表現產物產生可溶性基因產物。 2〇, 一種用於保護豬隻免於PCV-2相關病症之疫苗，該疫苗 包含重組豬腺病毒3載體，該載體包含啟動子可操作地 連接於包含編碼膜錨定域之核酸的疏水性信號序列、及 W 插入該疏水性信號序列框内的編碼缺少NLS序列之截短 PCV2 ORF2的核酸、聚腺苷酸化信號；及豬腺病毒3基 . 因組。 21.如請求項17之疫苗’其中該疫苗經調配供氣溶膠投藥。 22·如請求項17之疫苗，其中該疫苗經調配供經口、鼻、肌 肉内、皮下或皮内傳遞。 23 · —種在豬個體中引發免疫反應之方法，其包含向該豬個 體投與可有效在該豬個體中引發保護性免疫反應之量的 144878.doc 201026850 如請求項17之疫苗。 24. —種減少豬隻中豬環狀病毒2(PCV2)之病毒負荷量的方 法，其包含在豬隻中誘導對抗PCV2之免疫學或免疫原性 反應，包含向該豬隻投與一種包含醫藥學上或獸醫學上 或醫學上可接受之載劑及如請求項1之表現載體的組合 物。 25. 如請求項24之方法，其中該投藥係在育種之前進行。 26. 如請求項24之方法，其中該豬隻為懷孕母豬。 144878.doc