TW200944132A - Products comprising, and uses of, decarboxylated phenolic acids derived from chlorogenic acids of coffee - Google Patents

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200944132 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的 用途以及包含衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的產 品，尤其咖啡萃取物，及製造該等產品之方法。 【先前技術】 已展示咖°非及諸如咖啡驗及二結（例如咖_醇、咖啡豆 醇）之咖啡活性化合物誘發解毒酶（例如麵胱甘肽-s -轉移 酶，GST)(Cavin C.等人，1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin B1 -induced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19，1369-1375 ; Cavin, C.等人，2003. Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306，488-495 ; Huber, W.等人，2002a. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronosyl transferase and glutathione transferase in specific organs of the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76，209-2 17)。已進一步表明在人類 中消耗800 ml咖啡歷時5日之後由咖啡所造成的GST活性增 力σ (Steinkellner, Η.等人，2005. Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo [a] pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide induced DNA-damage: results of controlled human intervention 139212.doc 200944132 trials. Mut. Res. 591 264-275)。 已知此類抗氧化活性藉由降低（例如）癌症、心臟病、腦 退化性病症及衰老中可能涉及之自由基損害而保護免受 「氧化應力」。 阿兹海默氏病（Alzheimer's disease，AD)為進行性神經 退化性疾病且為癡呆病之最常見形式，症狀為（例如）記憶 喪失、混亂、情緒波動及認知能力下降。其特徵在於在腦 中存在細胞外類澱粉斑塊及神經内神經原纖維纏結，其主 要成分為稱為類澱粉β蛋白質（Αβ)之39-42個殘基之肽的原 纖維凝集體。認為Αβ原纖維形成在AD之病因中起重要作 用。已展示若干病原性AD突變導致Αβ(尤其變異之Αβ42) 含量增加。因此認為類澱粉原纖維形成為AD中疾病進展 及神經退化之原因。已藉由活體外研究證實Αβ原纖維形成 經由涉及當原纖維形成後消失之稱為ADDLS之離散可溶性 募聚中間物或基原纖維（PF)之複合多步機制而發生。此表 明PF可為AD之病原物質。人類及動物中之許多其他疾病 涉及蛋白質凝集，例如黃斑退化、牛海綿狀腦病（BSE)、 庫兹德-賈克氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)及糖尿病。 為增加食物及飲料產品之健康益處，需要製造具有增加 之抗氧化活性以及其他有益生物活性的產品，及找尋抗氧 化劑及具有有益生物活性之其他化合物之天然來源，該等 物質可用以增強食物及飲料產品以及（例如）化妝品及醫藥 產品之特性。 【發明内容】 139212.doc 200944132 本發明者目前已發現衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化 齡酸具有抗氧化及消炎特性，以及有效抑制及/或延遲類 澱粉β肽之凝集，且其可由咖啡萃取物產生，從而產生具 有增強的抗氧化及消炎特性之咖嗓萃取物。因此，本發明 係關於一種製造包含衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚 酸的咖啡萃取物之方法，該方法包含：a)用水及/或蒸汽萃 取咖啡豆以產生咖啡萃取物；及b)處理咖啡萃取物以將存 在於該萃取物中之漂木酸水解為酚酸且去羧酸化所得酚 酸。在其他態樣中，本發明係關於一種包含衍生自咖啡之 漂木酸之經去羧酸化酚酸的咖啡萃取物，製造食物或飲料 產品之方法’食物或飲料產品包含衍生自咖啡之漂木酸之 經去羧酸化酚酸’及衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚 酸的用途。 【實施方式】 漂木酸為反式肉桂酸與奎尼酸之間所形成之酯家族。漂 木酸天然存在於咖啡中，主要呈奎尼酸與連接於不同位置 之酚系基團（例如咖啡基、阿魏基、香豆基、甲氧基肉桂 基）之單酯及二酯形式。漂木酸可水解以產生紛系化合 物，諸如咖啡酸及阿魏酸。此等紛系化合物可藉由去缓酸 化作用進一步轉化。本發明係關於衍生自咖啡之漂木酸之 經去羧酸化酚酸。術語咖啡之漂木酸意謂一或多種實際上 衍生自咖啡或來自另一來源之天然見於咖啡中且含有紛系 基團之漂木酸。在一較佳實施例中，咖，之漂木酸實際上 衍生自咖啡。天然存在於咖啡中之漂木酸為（例如）咖啡醯 139212.doc 200944132 基奎尼酸（CQA)(諸如3-咖徘醯基奎尼酸、4-咖σ非醯基奎尼 酸或5-咖啡醯基奎尼酸）及二酯、阿魏醯基奎尼酸（fqa)(諸 如3-阿魏醯基奎尼酸、4-阿魏醯基奎尼酸或5-阿魏醯基奎 尼酸）及二酯及二甲氧基肉桂醯基奎尼酸（DMCQA)(諸如3-二曱氧基肉桂醯基奎尼酸、4-二曱氧基肉桂醯基奎尼酸或 5-二甲氧基肉桂醯基奎尼酸）及二酯。 咖啡之漂木酸可水解以產生酚酸，例如CQA可水解以產 生咖啡酸（CA)，FQA可水解以產生阿魏酸（fa)且DMCQA 可水解以產生二甲氧基肉桂酸（DMCA)。藉由水解咖啡之 漂木酸所產生之盼酸可進一步去羧酸化以產生衍生自咖〇朴 之漂木酸之經去羧酸化酚酸；例如CA可去羧酸化以產生4-乙烯基兒茶酚，FA可去羧酸化以產生4-乙烯基癒創木酚且 DMCA可去羧酸化以產生4_乙烯基藜蘆醚。 在本發明之一實施例中’衍生自咖啡之漂木酸之經去羧 酸化酚酸為4-乙烯基兒茶酚或其曱氧基衍生物。4-乙烯基 兒茶酚之甲氧基衍生物為（例如）4-乙烯基癒創木酚及4-乙 稀基藜蘆醚。在本發明之一較佳實施例中，衍生自咖啡之 漂木酸之經去羧酸化酚酸係選自4-乙烯基兒茶酚、4-乙烯 基癒創木紛、4-乙烤基藜蘆趟及其混合物。 本發明係關於一種包含衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸 化酌·酸之咖啡萃取物，該咖"非萃取物可包含一或多種衍生 自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸。本發明之咖啡萃取物 可為烘焙咖啡豆、生咖啡豆或兩者之萃取物。 在本發明之一實施例中，咖啡萃取物每公克乾物質包含 139212.doc 200944132 總量至少ο. 1毫克，諸如每公克乾物質總量至少丨毫克、至 少2毫克、至少5宅克或至少2〇毫克之4_乙烯基兒茶酚、心 乙烯基癒創木酚及4-乙烯基藜蘆醚。在另一實施例中，該 咖啡萃取物每公克乾物質包含至少〇1毫克，諸如每公克 乾物質至少1毫克、至少2毫克、至少5毫克或至少2〇毫克 之4-乙烯基兒茶酚。 根據本發明之方法，漂木酸可如上所述藉由將漂木酸水 解為酚酸且去羧酸化所得酚酸而轉化為衍生自咖啡之漂木 酸之經去羧酸化酚酸。 水解及去羧酸化反應可分別進行或其可在時間上重疊。 漂木酸之轉化可藉由任何合適方法進行。在本發明之一 實施例中，轉化係藉由一或多種能夠在咖啡中轉化漂木酸 之微生物進行。可（例如）如此申請案之實例中所揭示鑑別 能夠轉化漂木酸之微生物。合適微生物可為酵母，例如麵 包酵母（Bakers yeast);真菌，例如麴菌屬; 或細菌’例如乳酸菌，例如乳桿菌屬，諸 如約氏乳桿菌（I. /o/msom./XCNCM 1-1225)。在本發明之 一實施例中，能夠轉化漂木酸之微生物為乳酸菌。在本發 明之另一實施例中，使用兩種或兩種以上微生物以轉化漂 木酸’例如一或多種能夠將漂木酸水解為酚酸之微生物， 及一或多種能夠去羧酸化酚酸之微生物。 漂木酸之轉化可藉由在適用於生長特定微生物之條件下 用月b夠轉化漂木酸之微生物培育咖啡萃取物歷時達成漂木 酸之所需轉化必需之時間而進行。特定條件可易於由熟習 139212.doc 200944132 此項技術者（例如）參考本文所含有之實例來判定。 在本發明之另一實施例中，漂木酸之轉化係藉由一或多 種合適微生物經由使用非複製型微生物（例如經溶胞之微 生物細胞）來進行。藉由在合適條件下將咖啡萃取物與經 . 溶胞細胞一起培育，存在於細胞溶胞物中之酶可轉化漂木 . 酸。合適細胞可為（例如）以上所提及之微生物的細胞。此 項技術中已知產生細胞溶胞物之合適方法。 Φ 微生物之量及轉化之條件應適合於達成漂木酸之所要轉 化，且可由熟習此項技術者藉由常規方法（例如使用本文 實例中所揭示之方法）測定。 在另一實施例中，漂木酸之轉化係藉由使用一或多種能 —夠轉化漂木酸之酶進行。在-實施例中，使用至少兩種 酶，至少一種酶能夠水解漂木酸以產生酚酸且至少一種酶 能夠去m酸化所制酸。用於水解漂木酸之合適酶為⑽ 如）醋酶’例如來源於日本麴菌（如吻^抑_嶋） ❹ （Klkk_n，~an)之漂木酸㈣。用於錢酸㈣酸之合 適酶為(例如)去幾酶(EC 41.1χ)，例如丙酮酸去缓酶⑽ . Μ)酶促轉化可藉由用於酶促反應之習知方法，例 如藉由在適用於所需酶活性之條件下將酶溶解或懸浮於咖 =萃取物中而進行。在轉化發生之後可(例如)藉由加熱使 亦可將待使用之酶固定（例如）於薄膜或惰性戴劑 ^ ’且使待處理之咖啡萃取物經薄膜循環或經由载劑循環 至達成所要轉化度。當使用兩種或兩種以上酶時， 酶可同時使用，或例如若各酶之間的最佳條件不同時^’則 139212.doc 200944132 處理可相繼進行。 待使用之酶量及條件應適合於達成漂木酸之所要水解及 酚酸之去羧酸化，且可由熟習此項技術者藉由常規方法判 定。 待萃取以產生咖啡萃取物之咖啡豆可為完整或經研磨 的。在本發明之一實施例中，咖啡豆為生咖啡豆。在另一 . 實施例中，將生咖啡豆與烘焙咖啡豆共萃取，亦即，將生 · 咖啡丑及烘焙咖啡豆於同一萃取系統中同時萃取以產生混 合萃取物。例如，若將萃取物用於產生純的可溶咖啡，則 ❹ 可在萃取之前自豆中汽提最具揮發性之芳香組份。在（例 如）來自EP 1078576之技術中熟知汽提揮發性芳香組份之 方法。 待萃取之咖啡豆可藉由任何合適方法萃取，從而產生包 - 含漂木酸之萃取物。在（例如）來自EP 〇916267之技術中熟 知用水及/或蒸汽萃取咖啡豆。萃取物可進行濃縮步驟且 可在轉化漂木酸處理之前（例如）藉由噴霧乾燥或冷凍乾燥 法乾燥。若萃取物已乾燥，貝U若需要）可將其再懸浮，以 ❹ 進行轉化漂木酸之處理。咖啡萃取物可進行任何合適處 理，以在轉化漂木酸之前、期間或之後移除萃取物之不當 組份’例如增加最終經處理萃取物中經去羧酸化盼酸之濃 度。 — 可在萃取之後或在萃取期間進行轉化漂木酸之萃取物的 處理。可在轉化漂木酸處理之前、期間或之後將萃取物與 經萃取咖啡豆分離。在一實施例中，在轉化漂木酸處理之 139212.doc -10- 200944132 後使萃取物與經萃取咖啡豆保持分離，亦即在轉化漂木酸 處理之後，使萃取物不再與經萃取咖啡豆接觸。萃取物與 '、i萃取咖啡丑之分離可藉由任何合適方法（例如過濾或離 〜）進仃。分離法可採取實際上及經濟上可行及依萃取物 - 所需用途之需要程度進行。因此分離法可能並非100%完 全，舉例而言，分離之後來自豆之少量不溶解物質可能仍 存在於萃取物争。 ❹ 本發明亦係關於一種製造食物或飲料產品之方法，其中 本發明之咖啡萃取物係用作該食物或飲料產品之成份。在 本發明一項實施例中，萃取物與經萃取咖啡豆分開使用， 亦即如本文所述，藉由分離法大體上移除來自豆之不溶解 物質，且不用於製造食物或飲料產品。食物或飲料產品可 &相M技術中6知之任何食物或飲料產品。在較佳實施例 中，食物或飲料產品為咖啡飲料；純的可溶咖啡；清涼飲 料；腊食補充劑；乳產品；穀物產。口口 ；水果或蔬菜汁產 Φ 品；或糖果點心產品’諸如巧克力產品，例如巧克力飲 料可/合加非產品可藉由濃縮及乾燥本發明之萃取物而產 . f在乾燥之前，可將萃取物與未經轉化漂木酸處理之咖 非萃取物（例如烘培咖_豆、生咖啡豆或兩者之萃取物）混 «。此項技術中熟知由咖啡萃取物產生可溶咖啡產品之方 法。虽將該萃取物用於產生咖啡產品時，（例如）如EP-A-1078576中所述，可在萃取之前使待萃取之豆進行汽提， 以移除揮發性芳香物。接著可在水解漂木酸處理之後將揮 發性芳香物添加回萃取物中，例如在乾燥之後，以產生加 139212.doc •11- 200944132 香味的可溶咖啡產品。由本發明之咖啡萃取物所產生之可 溶咖啡產品可呈原樣銷售，或可（例如）與奶精及/或甜味劑 /tc*合且銷售’以製備包含奶精及/或甜味劑之咖啡飲料， 例如卡布奇諾咖啡或拿鐵咖啡。 在一實施例中，本發明係關於一種食物或飲料產品，其 中每公克乾物質包含至少01毫克，諸如每公克乾物質至 少1毫克、至少2毫克、至少5毫克或至少20毫克之4-乙烯 基兒茶盼及/或其甲氧基衍生物。 备本發明之咖啡萃取物用作食物或飲料產品之成份時， 其可在該食物或飲料產品之生產過程中之任何適當步驟添 加以達成所要效應。萃取物可以適於達成所要效應（例如 抗氧化效應或消炎效應）之任何量添加。 在另一實施例中，本發明係關於一種食物或飲料產品， 其包含衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸。食物或飲 料產品可為此項技術中已知之任何食物或飲料產品。在一 較佳實施例中，食物或飲料產品為咖啡飲料；純的可溶咖 啡，清涼飲料；膳食補充劑；乳產品；縠物產品；水果或 嵬菜汁產，或糖果點心產品，諸如巧克力產品，例如巧 克力飲料。食物或飲料產品可（例如）藉由本文所揭示之方 法來製備。 衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途 本發明係關於衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的 用途。待使用之本發明之經去羧酸化酚酸可藉由任何合適 方法產生’例如藉由咖啡酸之去羧酸化作用且其可呈任何 139212.doc -12- 200944132 ’形式’例如呈經純化化合物形式。在本發明之一實施 例中，待使用之本發明之經去缓酸化紛酸呈包含如本文所 j示之經去羧酸化酚酸之咖啡萃取物形式。在本發明之另 實施例中，經去缓酸化盼酸與本發明之咖_萃取物部分 . 或完全分離。待使用之本發明之經綠酸化㈣可藉由任 冑合適方法向人類或動物投與，例如藉由經口，靜脈内或 皮膚局部投與^經口投與，則此㈣可（例如）呈本發明 參 食物或飲料產品形式。在本發明之-實施例中，本發明 艮物或飲料產品係以標記有指示本發明之用途的形式來 鎖售。 實€<例中本發明係關於衍生自功π啡之漂木酸之經 •去竣酸化紛酸的用途’其係用於製備食物或飲料產品。食 ^或飲❹品可為此項技術巾已知之任何食物或飲料產 时°在-較佳實施例中，食物或飲料產品為*啡飲料；純 7可溶咖啡；清涼飲料；腾食補充劑；乳產品；榖物產 〇 …水果或蔬菜汁產品；或糖果點心產品，諸如巧克力產 例如巧克力飲料。當使用經去羧酸化 • 歧料產品時，其可在該食物或飲料產品之生產過程:！ 任何適當步驟添加。 • 在一實施例中，本發明係關於衍生自咖啡之漂木酸之經 去緩酸化紛酸作為抗氧化劑的用途，例如作為產品（例如 食物或飲料產品）中之成份，其中需要抗氧化特性，例如 以防止儲存期間產品組份之氧化。抗氧化劑通常用於許多 產中且衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸可以類似 139212.doc •13- 200944132 方式用作習知抗氧化劑。熟習此項技術者可易於藉由常規 實驗測定達成所要抗氧化效應所需之量。 在另一實施例中，本發明係關於在人類或動物中衍生自 咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸（例如）藉由誘發解毒酶（諸 如麵胱甘肽-s-轉移酶（GST))及藉由增加Nrf2介導之基因表 現路徑來增強活體内抗氧化及/或消炎能力的用途。已報 導增加之與Nrf2活性相關之基因增強解毒作用且激發内源 性防衛以抵抗氧化應力。此等效應可（例如）藉由經口投與 經去幾酸化驗酸或藉由局部塗覆於人類或動物之皮膚而達 成。 在另一實施例中，本發明係關於（例如）藉由向人類或動 物經口投與衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸衍生 自咖啡之漂木酸之經去缓酸化紛酸在人類或動物中（例如） 藉由減少前列腺素E2含量來減輕發炎的用途。 許多健康問題及病症與氧化應力及發炎有關。衍生自咖 啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸可用以治療或預防該等問題 或病症。相關問題及病症為（例如）皮膚病症，例如，歸因 於UV輻射之光損傷、異位性皮膚炎、濕疹、脫屑、瘙 疼、過敏症狀；腦病症；發炎；肥胖症；及癌症，例如皮 膚癌及肺癌。 在本發明之一實施例中’衍生自咖啡之漂木酸之經去羧 酸化盼酸係（例如）藉由降低血糖含量及/或增加血液瘦體 素、胰島素及/或c-肽之含量而用作抗糖尿病劑；（例如）藉 由增加骨礦物密度及/或藉由增加血清雌激素及/或黃體_ 139212.doc •14· 200944132 a篁及/或鹼性磷酸酶活性而用作骨再造劑；用作（例如）具 有抗血^生成效應之抗轉移劑，及/或用於保護腦。此等 效應可（例如）藉由向人類或動物經口投與而達成。 在本發明之另一實施例中，衍生自咖啡之漂木酸之經去 羧酸化酚酸係用於製備調配物以治療或預防皮膚病症、糖 尿病、腦病症、發炎、肥胖症、癌症；神經退化性病症、 認知能力下降、輕度認知障礙、癡呆病、情感疾患、抑鬱

症、睡眠障礙、涉及蛋白質凝集之疾病、阿茲海默氏病 (包括AD、癡呆病、輕度認知障礙及認知能力下降（如睡眠 障礙）、冑緒波動、㈣症、應力症之常見症狀）、黃斑退 化或糖尿病。該調配物可呈任何合適形式，例如用於經口 投與或皮膚局部投與，例如呈食物或飲料產品、營養補充 劑、錠劑、洗劑或化妝品形式。在較佳實施例中，該調配 物為藥物。 本發明進一步係關於本發明之食物產品、飲料產品、食 物補充劑或寵畜食物產品之非治療用途，其係料治療 及/或預防皮病症，例如歸因MUV輻射之光損傷、異位性 皮膚炎、濕療、脫肩、瘙疼、過敏症狀；發炎；肥胖症； 癌症’例如皮膚癌及肺f能力下降、情感疾患及/ 或睡眠問題，用於保護腦；及，或用於改善人類或動物之 認知效能、免疫反應及/或消化道_功能。認知效能可 (例如）表現為學習之能力及速度、解決智力問題之能力及 速度、形成及回憶記憶之能力、反應時間及其類似物。認 知能力下降可（例如）本身表現為記憶力降低、健忘、找詞 139212.doc -15· 200944132 或名子困難、s己憶力、注意力、計劃或組織之能力、進行 複雜任務之能力及/或認知效能之下降，且可（例如）由年 齡、應力、疾病或其他原因引起。咸理解「認知」為心理 過程’諸如理解、推理、決策、計劃、學習、記憶、聯 想、概念形成、語言、注意力、感覺、行為、問題解決及 精神意象。 - 在另一實施例中，本發明係關於一種改善認知效能；治 ， 療或預防以下病症之方法：皮膚病症，例如歸因於輻 射之光損傷、異位性皮膚炎、濕疹、脫屑、瘙癢、過敏症 〇 狀，發火，肥胖症；癌症，例如皮膚癌及肺癌；神經退化 性病症；認知能力下降；輕度認知障礙；癡呆病；涉及蛋 白質凝集之疾病；阿茲海默氏病；黃斑退化；或糖尿病； 該方法包括向人類或動物投與包含有效量之衍生自咖啡之 . 漂木酸之經去羧酸化酚酸的食物產品、飲料產品或寵物食 * 物產。食物產品、飲料產品或寵物食物產品可伴隨藥物 投與以增強功效及/或降低藥物之劑量。 在另實施例中，本發明係關於一種治療或預防以下病 ◎ 症之方法：皮膚病症’例如歸因於UV輻射之光損傷、異 4丨生皮膚炎、濕、療、脫屑、瘙癢、過敏症狀；發炎；肥胖 症癌症’例如皮膚癌及肺癌；神經退化性病症；認知能 力下降，輕度認知障礙；癡呆病；涉及蛋白質凝集之疾 病；阿茲海默氏病；黃斑退化；或糖尿病；該方法包括向 需要治療之人類或動物投與有效量之包含衍生自咖啡之漂 木酸之經去羧酸化酚酸的藥物。食物產品、飲料產品或寵 I392J2.doc -16- 200944132 物食物產品可伴隨藥物投與以增強功效及/或降低藥物之 劑量。 實例 實例1 用經喷霧乾燥之約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)製劑處理生咖 啡萃取物 將30 mg經乾燥之生咖啡萃取物溶解於1 ml磷酸鹽緩衝 液（50 mM，pH 7.0)或1 ml水中。向此溶液中添加10 mg經 喷霧乾燥之約氏乳桿菌（CNCM 1-1225)製劑（3.3 E9 cfu/g)。接著將混合物在37°C下培育且在不同反應時間抽 取樣品。在離心（3000 g，5 min)及過濾（0.45 μηι微孔尺寸 針筒過濾器，Millipore SLHA 025 BS)之後，藉由HPLC分 析該等樣品。 HPLC分析 將咖啡萃取物樣品稀釋至l%(w/w)且藉由RP-HPLC經CC 250/4 Nucleosil 100-5-C18 管柱（Macherey-Nagel)分析。溶 離劑系統為1 mL/min之流動速率的Millipore水、0.1 % TFA 及CH3CN。該方法允許使用外部標準校正曲線同步測定 CQA、FQA、di-CQA、咖啡酸（CA)、阿魏酸（FA)及4-乙烯 基兒茶酚（325 nm之吸光度）。結果係相對於時間0(t0)處之 參考來表示。 抗氧化劑反應元件（ARE)螢光素酶檢定 將含有8個存在於大鼠麩胱甘肽-S-轉移酶A2(GSTA2)中 之ARE複本之pGL-8xARE，以及含有新黴素可選標記之 139212.doc -17- 200944132 pcDNA3.1質體穩定轉染至人類MCF7細胞中（Wang等人， Cancer Res. 66，10983-10994, 2006)。ARE(抗氧化劑反應 元件）為轉錄因子Nrf2之結合位點，其調節解毒及内源性 防衛中所涉及之基因以抵抗氧化應力。質體pGL-8xARE在 8個Nrf2結合位點之下游含有允許監控Nrf2活性之榮光素 酶基因。在DMEM生長培養基中將AREc 32細胞接種於96 孔微量滴定板中。在用4-乙烯基兒茶酚處理24 h之後，測 定螢火蟲螢光素酶活性。 前列腺素E2形成檢定 將人類結腸HT-29細胞用4-乙烯基兒茶酚處理15 h，之 後連同促炎性試劑TNF-tx(10 ng/ml)—起共培育6 h。使用 競爭性酶免疫檢定（EIA)測定HT-29細胞中PGE2產生之分析 (Cavin等人，BBRC 327, 742-49, 2005)。 結果 在由酸酵或培育生羅布斯塔豆（green Robusta bean)之2 種不同萃取物所產生之酸酵咖°非萃取物之HPLC分析中觀 察到未知峰。藉由LC-MS-ToF及NMR之組合鑑別化合物為 4-乙烯基兒茶酚。將生咖啡萃取物如上所述處理且藉由 HPLC分析。結果展示於中表1中。 表1.用約氏乳桿菌處理生咖啡萃取物歷時指定時間的組 成。除4-乙烯基兒茶酚外，量係以未經處理萃取物中量之 %給出，該4-乙烯基兒茶酚係以HPLC信號之面積給出。在 未經處理萃取物中未偵測到4-乙烯基兒茶酚。 139212.doc -18- 200944132 時間(h) " 16 C〇A ' 38 F〇A ' 45 diCQA ' 27 CA 7409 FA 847 4-乙烯基兒茶酚 (HPLC峰之面積，AU) 643 藉 '，欠不；表2肀。 表2.藉由4-乙烯基兒茶盼誘導之Nrf2活性（勞火蟲榮光素 酶活性，AU)。 4-乙稀基兒茶盼(pg/ml) 螢光蟲6 200 一 400 600 活性(AU) HT-29細胞中之PGE2產生係展示於表3中。 表3.相對於未經處理對照樣品之^ 29細胞中之PGE2 產生 4-乙烯基兒茶酚(pg/ml) PGE2^7^—_- 0 --物之 ％) 3.13 58^-- 6.25 ___46 9.38 ....mr 15.63 12 ' 31.25 5 62.5 2 實例2 將生咖啡萃取物稀釋至l%(w/w)且藉由RP-HPLC經CC 250/4 Nucleosil 100-5-C18管柱（Macherey-Nagel)分析。溶 離劑系統為1 niL/min之流動速率的Millipore水、0.1% TFA 及CH3CN。藉由265 nm下之吸光度偵測4-乙烯基兒茶酚。 藉由用4-乙烯基癒創木酚外部校正獲得4-乙烯基兒茶酚之 標準校正曲線，此係因為呈經分離形式之4-乙烯基兒茶齡 139212.doc • 19- 200944132 不穩疋。結果顯不於表4中。 表4.用約氏乳桿菌處理生咖啡萃取物歷時指定時間之 組成。量係以每公克乾咖啡萃取物之毫克數給出。在未經 處理萃取物中未偵測到4_乙烯基兒茶酚。 時間(h) 16 24 乙烯基 卜11 35 實例3 單體Ap 將單體Αβ42肽藉由尺寸排阻層析純化且在37〇c下以1〇 μΜ之濃度以1:0.5及1:2(莫耳比率）之入(342與測試化合物之 比率與4-乙烯基兒茶酚一起培育。在以小時及48小時處藉 由Thioflavin T(ThT)螢光評定凝集程度。除無待測試化合 物外以相同方式進行對照組。ThT為展示結合類澱粉原纖 維後增強之螢光的疏水性染料。ThT特異性結合類澱粉原 纖維，而非Αβ之單體形式。在此檢定中，ThT螢光之減少 或缺少指示所測試分子降低及/或阻斷類澱粉原纖維之形 成。此檢定之結果展示於圖1中。 基原纖維Αβ 將經尺寸排阻純化之Α β 4 2的基原纖維混合物在3 7 〇c下以 1〇 μΜ之濃度以1:0.5及1:2(莫耳比率）之Ap42與測試化合物 之比率與4-乙烯基兒茶酚一起培育。在24小時及48小時處 藉由硫黃素（Thioflavin) T(ThT)螢光評定凝集程度。除無 待測試化合物外以相同方式進行對照組。基原纖維之ThT 螢光仏號增加之減少或缺少指示所測試分子降低及/或阻 139212.doc -20- 200944132 斷類澱粉原纖維之形成。此檢定之結果展示於圖2中。 【圖式簡單說明】 圖1展示4-乙烯基兒茶酚降低及/或阻斷自單體類澱粉^肽 形成類澱粉原纖維之能力之檢定的結果。白色條柱為對照 組，淡灰色條柱為1:0.5(莫耳比率）之比率的八@42與4_乙烯 基兒余酚；深灰色條柱為1:2(莫耳比率）之比率的八042與4_ 乙烯基兒茶酚；及 圖2展示4-乙烯基兒茶酚降低及/或阻斷自類澱粉^肽之基 原纖維形成類澱粉原纖維之能力之檢定的結果。白色條柱 為對照組；淡灰色條柱為1:0‘5(莫耳比率）之比率的八042與 4-乙浠基兒茶酚；深灰色條柱為丨:2(莫耳比率）之比率的 Αβ42與4-乙烯基兒茶酚。 -21· 139212.doc

Claims (1)

1. 200944132 七、申請專利範圍： 1. 一種製造包含衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸之 咖啡萃取物的方法，該方法包括： a) 用水及/或蒸汽萃取咖啡豆，產生咖啡萃取物；及 b) 處理該咖啡萃取物，將存在於該萃取物中之漂木酸 水解為酚酸，及使該所得酚酸去羧酸化。 2·如請求項1之方法，其中步驟b)中之該漂木酸之水解及該 紛酸之去羧酸化係藉由微生物進行。 I 3.如請求項2之方法，其中該微生物為乳酸菌。 如請求項1至3中任一項之方法，其中該等待萃取之咖_ 五為生咖。非豆。 5. 一種咖·#萃取物，其中每公克乾物質包含包含至少〇1毫 克4-乙烯基兒茶酚及/或其甲氧基衍生物。 6. 如請求項5之咖啡萃取物，其中該曱氧基衍生物為4乙烯 基癒創木酚、4-乙烯基藜蘆醚或其混合物。 φ 如清求項5或6中任一項之咖啡萃取物，其為生咖啡豆之 萃取物。 8_ -種製造食物或飲料產品之方法，其中以如請求項… 中任—項之°加啡萃取物係' 用作該食物或飲料產品之成 份。 如°月求項8之方法，其中該食物或飲料產品為咖4飲 料純的可溶咖啡、清涼飲料、膳食補充劑、乳產品、 穀物產品、水果或蔬菜汁產品或糖果點心產品。 1〇· 一種食物或飲料產品，其中每公克乾物質包含至少(U毫 139212.doc 200944132 克4-乙烯基兒茶酚及/或其曱氧基衍生物。 11 · 一種衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途，其 係用作抗氧化劑。 12. —種衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途，其 係用於製備藥物。 13 · —種衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途，其 係用於製備治療或預防以下病症之調配物：皮膚病症、 糖尿病、腦病症、發炎、肥胖症、癌症、神經退化性病 症、認知能力下降、輕度認知障礙、癡呆病、情感疾 患、抑鬱症、睡眠障礙、涉及蛋白質凝集之疾病、阿兹 海默氏病（Alzheimer's disease)、黃斑退化或糖尿病。 14.如請求項13之用途，其中該調配物為食物或飲料產品。 15· —種衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途，其 係用於製造供促進骨再造之藥物。 16. —種衍生自咖啡之漂木酸之經去羧酸化酚酸的用途，其 係用於製造用於增強人類或動物之活體内抗氧化能力及/ 或用於保護腦之藥物。 1 7. —種衍生自咖啡之漂木酸之經去竣酸化紛酸的用途，其 係用於製備食物或飲料產品。 139212.doc 200944132 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無元件符號說明） ❹ 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無）

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