TW200927177A - Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect - Google Patents

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200927177 六、發明說明： 【發明所肩之技術領域3 發明領域 本發明係關於一種經脂質修飾的雙股RNA，其可有效 5 抑制一標的基因之表現。更詳細地，本發明係關於一種經 脂質修飾的雙股RNA，其具有高核酸酶抗性及高細胞攝取 效率，及產生極佳的RNA干擾作用。 C先前技術3 發明背景 10 研發用於有效治療棘手疾病諸如癌症與AIDS之藥 物，係生命科學領域所欲達成之重要目標。達成該目標之 一種可能方法，係使用僅作用於特定基因的基因藥物。特 別是使用一個具21鹼基長度的短雙股RNA(小型干擾 RNA : siRNA)之RNA干擾(RNAi)方法，最近在作為基因藥 15 物方面深受矚目。該RNAi方法最先由Fire等人於1998年提 出（見第1項非專利文件）。依據Fire等人的報告，當與欲抑 制其功能之一基因的一特定區域同源之一個約100鹼基對 的雙股RNA被導入細胞内時，該雙股RNA經Dicer的作用而 分解為約20至25鹼基對的片段，然後與多種蛋白質複合而 20 形成一種RNA/蛋白質複合體(該複合體稱作RISC : RNA誘 導型沈默化複合體），其與標的基因所產生之mRNA的一同 源位址結合，及藉此有效地抑制基因表現。然而，據報導 當在哺乳動物細胞中導入約30鹼基對或更長的長雙股RNA 時，會誘發一種抗病毒反應的干擾素反應，因而造成細胞 200927177 调亡現象。因此，認為難以將RNAi方法應用到哺乳動物。 Tuschl等人因而以化學方式合成在3’端均具有懸擺端之一 個具21個鹼基長度的雙股RNA，及據報導當將該雙股RNA 直接導入哺乳動物細胞時，該雙股RNA能以具序列專一性 5 的方式有效地抑制基因表現，同時避免干擾素反應（見第2 項非專利文件）。Tuschl等人進一步合成包含一個19鹼基對 的雙股區域及在3,或5,端具有不同長度的懸擺端之短雙股 RNA°結果，觀察顯示在3’端均具有一個2鹼基的懸擺端之 具21個鹼基長度的siRNA展現非常強效的RNA干擾作用， 10 同時並無其他類型的短雙股RNA展現顯著的RNA干擾作 用。基於該報告，一般所採用的RNA干擾方法，係使用在3, 端均具有一個2鹼基的懸擺端之具21個鹼基長度的雙股 RNA。使用一個具21個鹼基長度的短雙股RNA以抑制一標 的基因表現之方法，在此稱作“siRNA方法”，以與RNAi方 15 法區別。 因為siRNA方法使用合成的RNA，試樣的製備作用相 對簡單，其處理也容易；而且，可產生非常有效的作用。 因此，該siRNA方法不僅在生命科學領域深受矚目，在生物 科技產業亦受到注意。 20 然而’該極佳的siRNA方法亦存在待解決的問題。如上 述’ siRNA係由隨時可被核酸酶的作用分解之— RNA分子 所組成。相較於單股RNA，雙股RNA區域對於存在於基質 及/一細胞中的核酸酶具有較高的抗性。然而，含有19驗基 對的雙股RNA鮮少產生該已知的rNA干擾作用。因此，曾 200927177 有報告指出當合成的siRNA被導入含有一標的基因序列的 細胞中時，雖然在約2至4天的期間產生有效的基因表現抑 制作用，之後其RNA干擾作用急劇降低，及在約7天内幾乎 完全喪失。 5 最近曾有報告提出各種經化學修飾的siRNAs，以提供 具有增進的細胞攝取效率及較久與高度有效的RNA干擾作 用之合成siRNA。例如，為增進對核酸外切酶分解作用的抗 性，已合成出在siRNA終端經一胺基、一硫醇基或一脫驗基 位點修飾之siRNA。然而，曾有報告指出，大部分具有21 10個鹼基長度之經終端修飾的siRNA，具有明顯降低的RNA 干擾作用。 最近幾年，J. Rossi等人的報告指出具有27個鹼基對長 度的雙股RNA所產生之RNA干擾作用，比具有21個鹼基長 度的雙股RNA高約1〇〇倍（見第3項非專利文件）。其可能因為 15在具有27個鹼基對長度的RNA被RNase III類型的酵素、 Dicer切成具有21個鹼基長度的siRNA之後，該蛋白質複合 體RISC認得該siRNA，因此能以高效率產生siRNA的作用。 如上述’因為具有27個鹼基長度的RNA可產生極佳的 RNA干擾作用，對於使用該RNA作為一基因藥物之期望與 20日俱增。然而，對於具有27個鹼基長度的RNA而言，得以 有效增進其RNA干擾作之技術方法，迄今完全未知。此外， 對於本身具有RNA干擾作用之短於或長於27個鹼基長度的 雙股RNA而言，亦不清楚用於增進其RNA干擾作用之技術 方法。 5 200927177 具有RNA干擾作用的雙股RNA，其構形一般具有一懸 擺端。亦曾研究不具有懸擺端的RNA(亦即具有平整端）之 RNA干擾作用。然而，結果顯示具有平整的訊息股5,端之 雙股RNA ’其RNA干擾作用實質上相同於或低於在訊息股 5 5’端具有一懸擺端之雙股RNA(見第4項非專利文件）。 脂質的細胞膜滲透力高，及已知適用於將藥物輸送至 細胞内。將該一脂質與具有RNA干擾作用的雙股RNA連接， 預期可增加細胞攝取效率，及藉此產生更有效的RNA干擾 作用。然而，已知若僅將一脂質與具有RNA干擾作用的雙 10 股RNA連接’該RNA干擾作用將急劇降低。在習知技藝中， 尚未建構出同時具有極佳的RNA干擾作用及基於一脂質的 有用效應之一種經脂質修飾的雙股RNA。 第1項非專利文件：Fire等人於Nature第391期第806-811 頁（1998年）乙文。 15 第2項非專利文件：Tuschl等人於EMBO期刊第20期第 6877-6888 頁（2001 年）乙文。 第3項非專利文件：J. Rossi等人於Nature Biotech.第23 期第222-226頁(2005年）乙文。 第4項非專利文件：j. T. Marques等人於Nature Biotech. 20第24期第559-565頁（2005年）乙文。 C 明内3 發明概要 本發明欲解決之問題 本發明的一目標係提供一種具有高核酸酶抗性與高細 200927177 5 ❹ 10 15 20 胞攝取效率之新穎雙股RNA，及其可產生極佳的RNA干擾 作用。本發明的另一目標係提供—種含有該新穎雙股RNA 之藥學組成物。本發明的另一目標係提供一種抑制一標的 基因表現之方法，其包括將新穎的雙股尺^^人導入細胞内， 以抑制該標的基因之表現。 解決問題之方式 為達成上述目標，本案發明者進行廣泛的研究，及發 現當-脂質直接或經由-連接子與雙股RNA之訊息股5，續 的第-至第六個核苷酸中之至少一者連接，其中該訊息股 所具有的一核苷酸序列與一標的基因中之一標的序列及 補’及-個反訊息麟具有的—核㈣序列與該訊息殿及 補’此時該雙股RNA可抑制該標的基因之表現，依此方式 所建構的雙股RNA具有高核酸酶抗性與高細祕取效率: 及產生極佳的RNA干擾作用。本發明之完成，係以此項發 現為基礎而進一步研究之結果。 更詳細地，本發明提供下列經脂質修飾的雙股RNA、 含有新穎雙股RNA的藥學組成物、抑制-標的基因表 方法等。 第1項：-種經脂質修㈣雙股RNa，其包括具有與〜 標的基因中之-標的序列互補的一核脊酸序列之訊息股， 及具有與該訊息股互補的_核苦酸序列之反訊息股， 股讓可抑漏㈣因之纽，及軸息股具有與5,端的 第-至第六個婦酸中之至少—者直接或經由一連接 接之一脂質。 7 200927177 第2項：如第1項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其訊 息股的5’終端侧為平整端，而訊息股的3’終端側為平整端或 具有一懸擺端。 第3項：如第1項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其訊 5 息股的5’與3’終端側均具有懸擺端。 第4項：如第1至第3項中任一項之一種經脂質修飾的雙 股RNA，其訊息股具有21至27個核苷酸。 第5項：如第2項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其訊 息股的5’與3’終端側均為平整端，及其中各訊息股與反訊息 10 股具有27個核苷酸。 第6項：如第2項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其訊 息股的5’與3’終端側均為平整端，及其中各訊息股與反訊息 股具有23個核苷酸。 第7項：如第2項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其訊 15 息股的5’終端側為平整端，訊息股具有25個核苷酸，而反 訊息股具有23個核苷酸。 第8項：如第3項之一種經脂質修飾的雙股RNA，其中 各訊息股與反訊息股具有21個核苷酸。 第9項：如第1至第8項中任一項之一種經脂質修飾的雙 20 股RNA，其中該脂質係具有ό至50個碳原子的脂肪酸。 第10項：如第1至第9項中任一項之一種經脂質修飾的 雙股RNA，其中該脂質為十二烧酸、十八烧酸、十四烧酸 或十六烧酸。 第11項：如第1至第10項中任一項之一種經脂質修飾的 200927177 連接子而與訊息股5,端的 者連接，該連接子係由下 雙股RNA，其中該脂質係經由一 第一至第六個核苷酸中之至少一 列構造式所代表： -NH-(CH2)nl- (L-4) 5 ❹ 10 15 ❹ 20 其中nl為1至40之一整數。 第12項：一種藥學組成物，其包括如第i至第10項中任 -項之-齡脂f修㈣雙股職，及—種藥學上 的主劑。 又 第13項.如第1至第1G項中任—項之經脂質修飾的雙股 RNA，其在製造用以抑制—標的基因表現之—種藥學組成 物之用途。 第14項：-種抑制一標的基因表現之方法，其包括將 如第1至第10項中任一項之經脂質修飾的雙股RNA導入細 胞内，以抑制該標的基因之表現。 本發明之效用 本發明之經脂質修飾的雙股RNA，係以一脂質修飾訊 息股的5’端，藉此產生顯著增加的RNA干擾作用。更詳細 地，經脂質修飾的雙股RNA具有與RNA的一特定位點連接 之一脂質，及因而具有顯著增進的核酸酶抗性及細胞攝取 效率，且不損及Dicer的作用或RNA與RISC的結合’因而對 於醫藥用途大有幫助。 即使單獨使用，本發明之經脂質修飾的雙股尺^^八具有 極佳的細胞内輸送力。因而，毋需使用任一已知的基因轉 染試劑，或以一較低量使用任一已知的基因轉染試劑，即 9 200927177 可將經脂質修飾的雙股RNA導入細胞内。因此，本發明之 經脂質修飾的雙股RNA，可抑制驗用已知的基因轉染試 劑時所擔憂之細胞毒性表現，藉此確保臨床應用的高度安 全性。 5 因而，藉由使用本發明之藥學組成物，或藉由使用如 本發明之抑制一標的基因表現之方法，可有效抑制或減弱 該標的基因之表現。 【實施方式1 實施本發明之最佳模式 10 在本說明書中，“平整端，，或“具平整端的”係指雙股 RNA的終端構造，其中一訊息股終端區域中的鹼基係與跟 該訊息股互補之反訊息股的終端區域中的鹼基配對，而不 形成一個單股。“懸擺端”係指其中以單股存在而不形成雙 股之一核苷酸序列的終端部份，其係因為在雙股RNA之訊 15息股的終端區域或者在與訊息股互補之反訊息股的終端區 域，不存在互補鹼基。 本發明之經脂質修飾的雙股RNA包括一訊息股，其所 具有之一核苦酸序列係與一標的基因中的一標的序列互 補。 20 該標的基因在此係指其表現為RNA干擾作用所欲抑制 者之一基因。對於本發明之經脂質修飾的雙股RNA之標的 基因，並無特定限制，及可依據經脂質修飾的雙股RNA之 所欲用途，而適宜地加以選擇。 對於標的基因中之標的序列並無特定限制’只要該基 200927177 5 ❹ 10 15 Ο 20 因的表現可被該RNA干擾作用抑制即可。可依據已知方 法，例如使用NCBI BLAST搜尋等，而適宜地決定標的序 列。例如，標的序列可為包括該標的基因編碼區域(ORF) 的啟始密碼往下游50至100個鹼基之外顯子區域“AA”鹼基 之後的19至30個鹼基的一區域，及其GC含量約為50%。在 該領域中由經驗得知，使用與該一標的序列互補之一股， 可獲致極佳的RNA干擾作用。例如，依據IDT的說明（整合 DNA科技公司（Integrated DNA Technologies, Inc.) ; Dicer 受質RNAi之設計（Dicer Substrate RNAi Design)乙書），可決 定標的序列。最近的一報告揭露，具有高RNA干擾作用的 雙股RNA之製造，可藉由建構具有下列各者之雙股RNA而 完成：⑴在反訊息股的5’端具有一個A/U對；（ii)在訊息股 的5’端具有一個G/C對；及（iii)在反訊息股的5,端約有5個 A/U對；及(iv)不具有9或更多個G/C對(Ui-Tei等人於Nucleic Acids Res.第 32期第 936-948 頁（2004年）乙文）。 當本發明之經脂質修飾的雙股RNA之訊息股不具有懸 擺端時’該訊息股包含與該標的序列互補之一核苦酸序 列。當訊息股在5’端及/或3”端具有一懸擺端時，該訊息股 所包含之一核苷酸序列具有與該標的序列互補之一核苷酸 序列，及該懸擺端的一核苷酸序列與該互補的核苷酸序列 之5’端及/或3”端連接。 只要可達成RNA干擾作用，對於構成本發明之經脂質 修飾的雙股RNA的訊息股之核苷酸數目，並無特定限制， 及可依據β亥雙股RNA的所欲構造而適宜地決定之。核苷酸 11 200927177 的數目通常為21至27個’較佳為21、23、25或27個，及更 佳為21、23或27個。當訊息股不具有一個懸擺端時，構成 訊息股的核#酸數目，在此係指構成與標的序列互補之核 苷酸序列的核苦酸總數。當訊息股具有一個懸擺端時，構 5成訊息股的核苦酸數目，係指構成該懸擺端的核苷酸數目 及構成與標的序列互補之核苷酸序列的核苷酸數目之總 和。本發明之經脂質修飾的雙股RNA包括一個反訊息股’ 其具有與訊息股互補的一核苷酸序列。 當本發明之經脂質修飾的雙股RNA之反訊息股不具有 @ 10 —個懸擺端時’該反訊息股所包括之一核苷酸序列係與訊

息股之“與一標的序列互補的核苷酸序列”之一部份或全部 互補。當反訊息股在5,端及/或3,端具有一個懸擺端時，該 反訊息股所包括之一核苷酸序列係與訊息股之，，與一標的 序列互補的核苷酸序列，，之一部份或全部互補；及與該反訊 15息股的互補核苷酸序列之5,端及/或3,端連接之連接子的一 核苷酸序列。只要可達成RNA干擾作用，對於構成本發明 之經脂質修飾的雙股RNA的反訊息股之核苷酸數目，並無 D 特定限制，及可依據該雙股RNA的所欲構造而適宜地決定 之。核苷酸的數目通常為21至27個，較佳為21、23、25或 20 27個，及更佳為21、23或27個。當反訊息股不具有一個懸 擺端時，構成反訊息股的核苷酸數目，係指構成與標的序 列互補之核苷酸序列的核苷酸總數。當反訊息股具有一個 懸擺端時，構成反訊息股的核苷酸數目，係指構成該懸擺 端的核苷酸數目及構成與標的序列互補之核苷酸序列的核 12 200927177 苷酸數目之總和。 5 ❹ 10 15 Ο 20 構成本發明之經脂質修飾的雙股RNA之訊息股與反訊 息股的核苷酸，基本上為核醣核酸。為增進對於酵素分解 作用的抗性，該RNA序列可含有各種經化學修飾的核苷 酸，諸如經2，-氧-甲基修飾的核賊、經2,遠修飾的核苦 酸、LNA(鎖核酸)核苷酸、去氧核醣核酸等。特別地，當本 發明之經脂質修飾的雙股RNA具有—㈣擺端時，訊息股 及/或反訊息RNA的懸擺端可由去氧核聽核酸所组成。該等 經化學修飾的核倾之實例包括：經磷酸鹽主鏈修飾的核 苷酸，諸如經硫代磷酸鹽修飾的DNA/RNA與經硼烷磷酸鹽 修飾的DNA/RNA ; 2，.修飾的核苦酸諸如經2，_氧甲基修飾 的RNA及經2’-氟修飾的⑽八；藉由將料酸的糖分子交聯 而製得之修飾型核賴，諸如LNA(鎖核酸)與疆（2，_氧、 4 -碳-乙稀-橋接型核酸）；具有不同主鍵之修飾型核苦酸， 諸如PNA(肽核酸)與嗎琳·核苦酸；驗基修飾型核普酸諸如 5-氟尿嘧啶核苷與5-丙基尿嘧啶核苷等。 本發明之經脂質修飾的雙股RNA在構造上並無特定限 制，只要訊息股與反訊息股可以雜交成為―個雙股即可。 例如，經脂質修飾的雙股職較佳具有下列構造：構造(a) 其中該雙股RNA纟訊息股的5,終端側為平整的（亦即具有— 個平整端），及在訊息股的3’終端側為平整的或具有一個懸 擺端（單股區域）；構造(B)其中該雙股RNA在訊息 股的5’與 3終端側具有懸擺端。其中該雙股rna在訊息股的3，終端側 具有-個懸擺端之構造，係、包括#訊息股的3，終端區域形 13 200927177 成一懸擺端之情況及當反訊息股的5 ’終端區域形成一懸擺 端之情況。其中該雙股RNA在訊息股的5,終端側具有一個 懸擺端之構造’係包括其中訊息股的5,終端區域形成一懸 擺端之情況及其中反訊息股的3,終端區域形成一懸擺端之 5 情況。 為進一步增進RNA干擾作用，可用於形成本發明之經 脂質修飾的雙股RNA之雙股RNA，在該等具有上述(A)構造 者之中，係以具有下列所示(A-1)至(A-3)構造的雙股RNA為 特佳者，而在該等具有上述(B)構造者之中，係以具有下列 ® 10 所示(Β-1)構造的雙股RNA為特佳者。（Α-1)構造：其中雙股 RNA之訊息股的5’與3’終端側均為平整端’及訊息與反訊息 股各含有27個核苷酸；（A-2)構造：其中雙股rna之訊息股 的5’與3’終端側均為平整端，及訊息與反訊息股分別各含有 _ 23個核苷酸；（A-3)構造：其中雙股rNa之訊息股的5,終端 15側為平整端，訊息股含有25個核苷酸，而反訊息股含有23 個核苷酸；及(B-1)構造：其中雙股狀八在訊息股的3’端與 反訊息股的3’端均具有各含有2個核苷酸之一懸擺端，及訊 0 息與反訊息股各含有21個核芽酸。 更詳細地，在(A-1)與(A-2)構造中，訊息與反訊息股雜 20交，及在其終端並無懸擺端形成。在(A-3)構造中，訊息與 反訊息股雜交’藉此雙股RNA的訊息股5,端為平整端，而 訊息股3’端的第一與第二個核苷酸形成一懸擺端。在(A-3) 構造中’訊息股5’端的第一至第十九個核苷酸與反訊息股3, 端的第三至第廿一個核苷酸雜交，藉此訊息股3,端的第_ 14 200927177 與第二個核苷酸及反訊息股3,端的第一與第二個核苷酸分 別形成懸擺端。 5 10 15 ❹ 20 本發明之經脂質修飾的雙具有與訊息股5，端的 第一至第六個核苷酸中之至少一者連接之至少一個脂質。 除了訊息股的5’終端區域之外，本發明之經脂質修飾的雙 股RNA在其他任一位址並無取代基。更詳細地，在訊息股 的5’終端區域以外的其他任—地區及在反訊息股中，並無 取代基存在，及該等地區含有核苷酸。僅在訊息股的5，終 端區域連接脂質，可增進細胞攝取效率及提供極佳的尺\八 干擾作用。 對於與本發明之經脂質修飾的雙股RNA的訊息股連接 之脂質，並無特定限制，及其實例包括單脂（脂肪酸與各種 醇之酯類），複合脂類諸如璘脂類與醣脂類；衍生脂類諸如 脂肪酸、高級醇類、脂溶性維生素、類固醇及碳氫化合物。 為增進細胞攝取效率與RNA干擾作用，所用的脂質較佳為 一種衍生脂類，較佳為具有6至50個碳原子之脂肪酸，更佳 為具有10至22個碳原子之脂肪酸，特佳為具有12至18個碳 原子之脂肪酸，尤其更佳為十二烷酸、十八烷酸、十四烷 酸或十六烷酸，及最佳為十六烷酸。 對於將脂質連接至訊息股而形成本發明之經脂質修飾 的雙^RNA之方式，並無特定限制。脂質可直接或經由連 接子而與訊息股連接。在本發明中，脂質藉而與訊息股連 接之連接子，並非含有核酸之連接子。該連接子並無特定 限制，只要脂質與訊息股可藉而連接即可。例如，具有下 15 200927177 列構造的連接子，可作為連接子： -O-Co-O- (L-1) -NH-CO-O- (L-2) -NH-CO-NH- (L-3) 5 -NH-(CH2)nl- (L-4) -S-(CH2)nl- (L-5) -CO-(CH2)nl-CO- (L-6) -CO-(CH2)„i-NH- (L-7)

-NH-(CH2)nl-NH- (L-8) 10 -CO-NH-(CH2)nl-NH-CO- (L-9) -C(=S)-NH-(CH2)nl-NH-CO- (L-10) -C(=S)-NH-(CH2)nl-NH-C-(=S)- (L-ll) -CO-0-(CH2)nl-0-CO- (L-12) -C(=S)-0-(CH2)nl-0-C0- (L-13) 15 -C(=S)-0-(CH2)nl-0-C-(=S)- (L-14) -C0-NH-(CH2)nl-0-C0- (L-15)

-C(=S)-NH-(CH2)n,-0-C0- (L-16) -C(=S)-NH-(CH2) rO-C-(=S)- (L-17) -CO-NH-(CH2)nrO-CO- (L-18) 20 -C(=S)-NH-(CH2)nl-CO- (L-19) -C(=S)-0-(CH2)nl-NH-C0- (L-20) -C(=S)-NH-(CH2)nl-0-C-(=S)- (L-21) -NH-(CH2CH20)n2-CH(CH20H)- (L-22) -NH-(CH2CH20)„2-CH2- (L-23) 16 200927177 在上述化學式（L-4)至(L-21)中，ni為1至4〇之_整數， 較佳為2至20之一整數，及更佳為2至12之一整數。 在上述化學式（L-22)與（L-23)中，112為1至4〇之—整 數，較佳為1至丨〇之一整數，及更佳為1至6之一整數。 5 具化學式(L·4)至(L'23)之連接子，可在左側或右側連 接訊息股。較佳，訊息股的特定位點（或核酸綴合物的核酸) 連接在具化學式(L-4)至(L-23)之連接子的右側，而—脂質 連接在其左側。 馨 可依據所用之脂質與連接子的類型，而適宜地選擇該 1〇知質與連接子的連接位點。例如，當使用一脂肪酸作為脂 質時，其可經由一酯鍵、一醯胺鍵或在該脂肪酸的羧基與 連接子之間形成的類似鍵而連接。更詳細地，當使用一脂 肪酸作為脂質時，較佳以連接子取代該脂肪酸之綾基的 -OH，而連接該脂質。 15 依據所連接的脂質類型，而適宜地選擇連接子。當使 ❿ 帛—脂肪酸作為脂質時，較佳使用錢學式(L-4)所代表的 連接子。 ' 除了上的連接子之外，亦可使用其他的連接子。其實 例包括雙官能型連接子（含有二個官能基的連接子），諸如 2〇 N-琥ί白酿亞胺基=3_(2_π比咬基二硫代）丙酸醋、N_4_馬來酿 亞胺丁酸、基二硫代赠基乙胺、峨乙醯氧基號拍 醯亞胺、N-(4-馬來酿亞胺丁基氧)號抬酿亞胺、n_[5<3，_馬 來醯亞胺丙基醯胺）竣戊基]亞胺二乙酸、N_(5-胺基戊 基)_亞胺二乙酸等。在訊息股中，對於與脂質或與用以連接 17 200927177 脂質的連接子連接之核芽酸，並無特定限制，只要是訊息 股5’端的第-至第六個核|酸中之至少—者即可，較佳為5， 端的第一至第四個核苷酸中之至少一者，更佳為5，端的第 -及/或第二個核脊酸’及特佳為位於5’端的核苦酸(5，端的 5 第一個核苷酸）。 對於訊息股與脂質或與用以連接脂質的連接子之連接 位點’並無特定限制。較佳藉由取代該訊息股的一特定核 苦酸之磷酸部份的經基#之氫原子，而予以連接。 對於與本發明之經脂質修飾的雙股RNA連接的脂質數 ❹ 1〇目，並無特定限制。例如，可連接1至3個脂質，較佳丨至2 個脂質’及更佳1個脂質。 可藉由分別合成其上連接至少一個脂質之一訊息股及 . -反訊息股’及依據已知方法將訊息股與反訊息股雜交， 而產生本發明之經脂質修飾的雙股。亦可依據已知的合成 15方法，產生其上連接一脂質之訊息股。 可將本發明之經修飾的雙股RNA導入細胞内，以抑制 或減弱一標的基因之表現’及因而可作為用於抑制或減弱 〇 一標的基因表現之一藥物或用於基因療法之—組成物亦 即一種藥學組成物。本發明的藥學組成物可配製成不同的 2〇劑型。本發明的藥學組成物之劑型類型包括液態製劑諸如 液體(諸如糖漿）、滴劑及注射劑；固態製劑諸如錠劑、藥丸、 粉末、顆粒及膠囊(諸如軟式膠囊）等。當本發明的藥學組成 物為—液態製劑時，該組成物可在藉由冷凍乾燥除去水之 後加以低溫貯藏或保存。經冷凍乾燥的製劑或無水糖漿 18 200927177 等’可藉由添加注射用蒸餾水或無菌水等，而以溶液形式 使用。當本發明的藥學組成物為一固態製劑時，該組成^ 可藉由添加注射用蒸餾水或無菌水等，而以溶液形式使用。 該藥學組成物可僅含有一種經脂質修飾的雙股rna， 或者若需要的話，進-步含有-種藥學上可接受的戴劑。 對於所㈣制並無特定關，只要其巧及本發明之經 修飾的雙股RNA對於標的基因表現之抑 、 A 丨則作用即可，及可 ❹ 10 15 Ο 依據劑型而適宜地加以選擇。適用的載 她μu %剛實例包括純水、 糖的水溶液、緩衝液、生理食鹽水、聚 人枋她 合物的水溶液、不 3核醣核酸酶的水等。當本發明的荦 银予級成物含有栽劑 時，對於域物巾的組份_並無特Μ制，^要其不^ ^發明之經㈣教股祖對於__㈣之㈣^ 減弱作用即可，及可依據劑型而適宜地如以選擇。 一 例如，本發明的藥學組成物所含 ΟΧΤΑ π有之經修飾的雙股 RNA量可為0 001至50，更佳〇 〇1 ^ηπ 及更佳0.1至1。本 發月的藥學組成物所含有的載劑量可為 ^ 1 叫至99.99重量〇/〇 , 較佳90至99.99重量％，及更佳99至99 重為基礎。 ^量％’以組成物總 對於本發明的藥學組成物所針對之椤、 鱼 並無特定限制。已知標的基因與疾病^的基因與疾病， 屎届之間的關係。對於本 發明的樂學組成物所導入之細胞類型 胎·^ ㈣迷無限制。所用的細 胞可為人類衍生細胞或非人類的動物 藥學組成物可用於試管中或活體内。、細胞發明的 將本發明之經脂質修飾的雙股RNA導入細胞内之量與 20 200927177 方法，係與習知的siRNA方法相同。例如，當本發明的藥學 組成物係用於將經脂質修飾的雙股RNA導入試管中的細胞 時，可使用在一適宜量的藥學組成物存在下培養細胞之一 種方法。當本發明的藥學組成物係用於將經脂質修飾的雙 5股RNA導入經培養的細胞或試管中之自活體抽出的細胞 時’本發明之經脂質修飾的雙股RNA可在血清存在下導 入。當本發明的藥學組成物係用於將經脂質修飾的雙股 RNA導入活體内的細胞時’可採用下列方法：將藥學組成 物直接注射至組織中；靜脈内、皮下、肌肉、腹膜間、眼 10 内、胃腸或口腔注射；至鼻腔、口腔、肺等之吸入性投藥 作用；口服投藥；經由皮膚之經皮投藥作用；經由口腔黏 膜、陰道黏膜、眼精黏膜、直腸黏膜及子宮黏膜之經黏膜 投藥作用；及類似方法。 當使用本發明的藥學組成物時，可選擇性地一起使用 15 一種用於將siRNA轉染進入細胞内之已知的基因轉染試 劑。任擇地，本發明的藥學組成物可含有一種基因轉染試 劑。本發明的藥學組成物所含有之經脂質修飾的雙股 RNA，即使單獨使用時，亦具有極佳的細胞轉染能力。因 此，毋需使用一種用於將siRNA輸送至細胞内之已知的基因 20 轉染試劑或以一較低量使用一種基因轉染試劑’即可將經 脂質修飾的雙股RNA導入細胞内。 能以一有效量使用本發明的藥學組成物，例如’該量 使得導入各細胞之經脂質修飾的雙股RNA量為0.001至1〇 pM，較佳0.001 至 1 pM，及更佳0.01 至0.1 pM。 200927177 本發月的藥學組成物γ抑制或減弱一標的基因之表 現，藉此預防、改善或治療因該標的基因之表現所引發的 一疾病。 本發明進一步提供一種抑制一標的基因表現之方法。 該抑制-標的基因表現之方法，包括將經脂質修飾的雙股 RNA轉染進入細皰内。

對於標的基因或疾病拉無特定限制，及如上述已知該 標的基因與疾病<_關係。對於本發明之經脂質修飾的 雙股RNA所導人之細胞類_無限制。所用的細胞可為人 10類何生細胞或非人類的動物衍生細胞。本發明之經脂質修 飾的雙股RNA可用於試管中戒活體内。 在本發明之抑制一標的基因表現之方法中，將本發明 之經脂質修飾的雙股RNA導入細胞内之量與方法，係與習 知的siRNA方法相同，及可適宣地加以選擇。例如，在本發 15 20 明之抑制—標的基因表現之方法中，為將本發明之經脂質 修飾的雙股RNA導入試管甲的細胞，可採 經脂細的雙_存在下培養細跑::：適= 明之抑制一標的基因表現之方法中，发物 之万Μ切經脂質修飾的雙 股RNA導入經培養的細胞或試管中 自活體抽出的細胞 時，可採用在血清存在下將本發明 ΟΛΤΑ^ 質料的雙股 RNA導入細胞内之一步驟。在本發 —赞a之抑制一標的基因表 =方法中，為將經脂質修飾的雙股RNa導人活體内的細 飾的雙股麵直接注射至組織巾.靜^發明之經脂質修 ’㈣内、皮下、肌肉、 21 200927177 腹膜間、眼内、胃腸或口腔等之注射；至鼻腔、口腔、肺 等之吸入性投藥作用；口服投藥；經由皮膚之經皮投藥作 用；經由口腔黏臈、陰道黏膜、眼精黏膜、直腸黏膜及子 宮黏膜之經黏膜投藥作用；及類似步驟。藉由使細胞與一 5有效量之經脂質修飾的雙股RNA接觸，可將本發明之經脂 質修飾的雙股RNA導入細胞中。例如，經脂質修飾的雙股 RNA係以每細胞〇.〇〇1至1〇1)]^，較佳〇 〇〇1至lpM，及更佳 0.01至0.1 pM之一量投藥。 本發明之經脂質修飾的雙股尺^^八，即使單獨使用時， ❹ 10亦具有極佳的細胞轉染能力。因此，毋需使用一種已知的 基因轉染試劑或以-較低量使用一種基因轉染試劑，即可 將經脂質修飾的雙股尺]^八導入細胞内。 如本發明之抑制一標的基因表現之方法，可抑制或減 弱-標的基因之表現，藉此預防、改善或治療因該標的基 15因之表現所引發的一疾病。 實例

參照下列實例，詳細地說明本發明；然而，本發明並 Q 非受限於該等實例。 紐LL5’經脂質修錦的雙股RNA對於榮光素酶基因表現之 20 抑制作用 i·梯定螢光素㈣㈣RNA之合 1 -1.訊息股與反訊息股夕年gl丨— 含有具21至27個驗基長度的訊息股及具21至27個驗基 長度的反訊息股之雙股RNA ’係設計具有與海參螢光素酶 22 200927177 同源的一序列及可抑制海參螢光素酶基因之表現。依反訊 息股與訊息股的組合而定，該雙股RNA可產生不同的雙股 形式。下列名稱係用來指稱該等雙股RNA。“DS(雙股） RNA” ：不含有一懸擺端（單股區域)之完全雙股rnA(亦即在 5 訊息股的5’與3’終端側均具有平整端之雙股RNa) ; “Si RNA” ：在其二個終端侧均具有懸擺端（突出端）之雙股 RNA ;及“RO(右突出端）RNA” ：當訊息股的5’終端側顯示 在左側時，僅在右側具有一懸擺端之雙股RNA。該等不同 的雙股RNA名稱之區別’係將訊息股指定為“α，，(“ΑΓ’或 10 “Α2”)及反訊息股指定為“Β”，及顯示各單股RNA亦即訊息 股與反訊息股之驗基數目。因為設計出二種類型的訊息 股，其等各被指定為“Α1”與“Α2”，以加以分類。就在訊息 股的5’終端區域以一脂質加以修飾之雙股RNA而言，在各 訊息股的名稱之後加上符號“Cx(x= 16或12)’’。所用的RNA 15 序列如下： 訊息股： 27nt 27A1: 5，-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC -3, (序列辨識編號：1) 25nt 25A1: 55-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-35 20 (序列辨識編號：2) 23nt 23A1: 5，-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’（序 列辨識編號：3) 21nt 21A1: 5，-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC-3’（序列辨 識編號：4) 23 200927177 21nt 21A2: 5，-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3,（序列辨 識編號：5) 反訊息股： 27nt 27B: 5，-GUGCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG -3’ 5 (序列辨識編號：6) 25nt 27B: 5,-GCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3, (序列辨識編號：7) 23nt 27B: 5，-UCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’（序列 辨識編號：8) © 10 21nt 27B: 5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3,（序列辨 識編號：9) 1二2. _標定螢光素酶某因之未經脂質修飾的螯股rNA之合成 作用 15 使用上述的訊息股與反訊息股，製備各種雙股RNA。 藉由在一通用緩衝液(Hayashi Kasei股份有限公司）中，混合 等莫耳量的一訊息股與一反訊息股，在92。(：加熱該混合物2 分鐘，然後將溫度逐漸地降至4°c ,而製備各雙股RNA。所 得的各種雙股RNA ’在20%聚丙烯醯胺凝膠上以250伏特進 20行電泳60分鐘，然後藉由一個銀染色套組(GE Health Care Bioscience公司）之染色作用而予以確認。第1圖顯示該未經 修飾的雙股RNA之構造。 Ιι3·梯定營光素之經脂皙修飾的雙股RNA之合成作用 合成經脂質修飾的訊息股，其中在可抑制螢光素酶基 24 200927177 因表現之雙股靈的訊息…，料接—脂f。在該等經脂 質修飾的訊息股中’_旨質經由—胺纽基(胺基修飾劑 C6;GlenRes_h公司）心共價方式連接至上述訊息股的 5知藉由在液相中’將含有一活性醋基的一脂質化合 物（此後稱作含活㈣旨基㈣旨f化合物）婦由5,端胺化作 用而予以修飾之訊息股反應，而合成經脂質修飾的訊息股 (第1與2反應流程圖）。 第1反應流程圖 'NKCHdfp+〇-寡核苷酸-0f( Η 〇 10 第2反應流程圖 〇 H2N"(CH2>n〇f〇-募核苷酸—+ CH3.(CH2)n_&Q_^N〇2 ❹ C%<CH2)n-(5；-N (CH2)rt〇|-0-募核苷酸-oft Η 〇 如下說明一種特定的合成方法。為胺化訊息股的5’ 端，可進行一習知方法（亞磷醯胺合成方法），在RNA固相合 成作用上使用5’-胺基修飾劑C6(Glen Research公司），藉此 15 合成在5’端經一胺基烷基修飾的訊息股（長度為21鹼基）。 已藉由HPLC純化及進行MALDI-TOF MS分析之在5’端 經一胺基烷基修飾的訊息股，係購自Hayashi Kasei股份 有限公司。所得之在5’端經一胺基烷基修飾的訊息股， 具有與5’端（自5’端的第一個核苷酸的磷酸鹽基）連接之 25 200927177

-(CHzVNH2。藉由使用紫外線光譜儀，測量26〇 nm的吸光 度，而測定所產生的單股RNA濃度。在縮合作用條件下， 經胺基烧基修倚的單股RNA與溶於DMF(N,N-二甲基甲醯 胺）中之一種含活性酯基的脂質化合物（十六烷酸N_羥基琥 5珀酿亞胺（Sigma_Aldrich公司）或十二烷酸_4_硝基苯基酯 (TCI))混合，而合成一種經脂質修飾的訊息股。在反應之 後，藉由HPLC純化反應溶液，而自含有經脂質修飾的訊息 股之反應溶液中除去不需要的試劑。在5〇分鐘的期間，以 10-100%緩衝液B的線性梯度，使用緩衝液a: 1〇〇%的20 mM 10 TEAA (pH 7.0)與緩衝液B : 70% CH3CN/20 mM TEAA (pH 7.0) ’進行HPLC純化作用。使用CAP CELL (4.6 x 150毫米， 5微米；Shiseido公司）作為純化管柱。第2圖顯示例示性 HPLC分析結果。藉由HPLC純化之經脂質修飾的訊息股進 行冷凍乾燥’及溶於純水中，之後藉由紫外線光譜分析測 15 定其濃度與合成產率。 所得之經脂質修飾的訊息股之構造模式與產率如下。

0 〇 27A1C16： CHaiCHaiw-fi^CH^ OTO^GGCCUUlKiAC^i^UCCUACGAGCAC-y 產率:β320 % 27A1C12： Ο^ίΟ^,ο-δ-Ν ^Η^Ο^Ο-ουΟΘΟΟυυυΟΑΟυΑΟυΟΟυΑΟβΑΟΟΑΟ-^ 產率:49 02 % Η Ο

G 25A1C16: CHJ<CH2)14.6-N(CH2)e.〇^〇-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC<3AG03, 產率:47.36 % 23A1C16: 0 o CH3<〇H2)t4-6*N(CH2)eO-P〇-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA>3, H 6 產率:28.14 % 21A1C16: CH3<CH2)14-6-N*(CH2)e〇^〇-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC-3* η δ 產率61.55 % 21A2C16: 0 0 CH3<CH2)u-C-N-(CH2)e〇^*〇-GGCCUUUCACUACUGCUACGA-3, H 〇 產率:47.10 % 21A2C12: 0 0 C^CHji^-C-N-iCHifeOf^O-eGCCUUUCACUACUCCUACGA-a* H 〇 產率:21.46% 26 200927177 將所得之經脂質修飾的訊息股與反訊息股配對，以產 生經脂質修飾的雙股RNA。依據上述的相同方法，形成經 脂質修飾的雙股RNA，及藉由20%聚丙烯醯胺凝膠電泳加 以確§忍。第1B圖顯示經脂質修飾的雙股rna之構造。在第 5 1Β圖中，當連接十六烷酸衍生物時，X為16 ;當連接十二 烷酸衍生物時，X為12。 2.經脂質修飾的彆股RNA之降解酵音打桩 評估經脂質修飾的27nt dsRNA (Ds 27A1C16/27B)之核 酸酶抗性。首先，將在訊息股5’端經一脂質修飾之27nt 10 dsRNA的最終濃度調整至2 μΜ，在含有10% FBS(Sanko Junyaku股份有限公司）之RPMI-1640基質（Invitrogen公司） (最終體積110微升）中，於37°C培養。在0小時、0.5小時、1 小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、24小時及 48小時之後，各取10微升的試樣量，及置入一個含有2微升 15 加料染劑之試管中。之後為終止該降解反應，將所取的試 樣迅速地在液態氮中冷凍乾燥，及於-20°C貯存。所得的試 樣產物在20%聚丙烯醯胺凝膠上，以250伏特進行電泳7〇分 鐘。該產物然後以一個銀染色套組（GE Health Care Bioscience公司）進行染色，及於Chemilmager 4000(Alpha 20 Innotech Corporation公司）上進行凝膠分析。為進行比較， 以類似方式評估一般被廣泛使用之具21個鹼基長度的 21 siRNA (si 21A2/21B)及未經修飾的 27nt dsRNA (Ds 27 A1 / 27B)的核酸酶抗性。第3圖顯示凝膠電泳的結果。 結果，21 siRNA在含有血清的基質中快速地被降解， 27 200927177 及經確認其在約丨至2小時内消失。另一方面，未經修飾的 27nt dsRNA及經脂質修飾的27m dsRNA，具有遠高於 21siRNA的核酸酶抗性，及該等雙股RNA即使在48小時之 後仍然存在。s亥等結果導出一個新發現，亦即經脂質修飾 5的雙股RNA所具有之活體内安定性，顯著高於一般被廣泛 的 21siRNA。

3..藉由Dicer處理標定曼立:素酶基因之經脂皙修飾的镂胳 RNA 评估重組型Dicer對於合成的雙股RNA與經脂質修飾 © 10的雙之處理作用。如下進行Dicer剪切實驗。在試管 中製備位於2〇111河丁1^-氣化氫(？只8.〇)、15 111厘氯化納及2.5 mM氯化鎂溶液中之10微升的〇 5U重組型Dice以 Therapy Systems公司）與未經修飾的雙股RNA或經脂質修 飾的雙股RNA，將其最終濃度調整至2 μΜ ;該試樣然後在 15 37 ^的培養箱中培養12小時。之後為終止Dicer剪切反應， 在反應溶液中添加2微升的Dicer終止溶液（Gene Therapy

Systems公司）’接著添加2微升的加料染劑。所得的試樣產 © 物在20%聚丙烯醯胺凝膠上，以25〇伏特進行電泳7〇分鐘。 該產物然後以一個銀染色套組(GE Health Care Bioscience 20公司）（染色條件請見產品說明書）進行染色，及於

Chemilmager 4000 (Alpha innotech c〇rporation公司）上進行 凝膠分析。作為對照組之未經修飾的21siRNA(si21A2/21B) 亦進行凝膠電泳分析。結果示於第4圖。 結果顯示’在其中 Ds rnA(Ds 27A1/27B、Ds 25A1/ 28 200927177 25B、Ds 23A1/23B及Ds 21A1/21B)的訊息股經一脂質修_ 之該等雙股RNA中，藉由重組型Dicer的作用，Ds 27A 1C 16/ 27B與Ds 27A1C12/27B在與未經修飾的21siRNA相近之位 5 ❹ 10 15 ❿ 20 置觀察到帶狀，因而強力顯示Dicer剪切作用所產生之具21 個驗基長度的siRNA含有一個具2驗基的懸擺端。同時就Ds 25A1C16/25B與Ds23AlC16/23B而言，在Dicer存在下，在 與21siRNA相近之位置觀察到新的帶狀，顯示其等經歷 Dicer之處理。另一方面，就Ds 20 21A1C16/21B而言，在 Dicer存在下並未觀察到顯著變化，顯示其未經Dicer之處 理。 除此之外，對於其中 R〇 RNA(RO 27A1/25B、R0 25A1/ 23B、RO 23A1/21B及R〇 21A1/19B)的訊息股在訊息股的3’ 終端區域各含有一個具2鹼基的懸擺端及經一脂質修飾之 該等雙股RNA’以類似方式評估其藉由Dicer的處理作用。 結果，就三種類型亦即R〇 27A1C16/25B、R0 25A1C16/ 23B 及R023A1C16/21B而言，在Dicer存在下，在與21siRNA相 近之位置觀察到帶狀，顯示其等經歷Dicer之處理。尤其是 RO 27A1C16/25B與R〇 25A1C16/23B，展現經由Dicer之顯 著處理效應。另一方面，就相對較短的r〇21A1C16/19B而 言’在雙股RNA中未觀察到變化，即使在Dicer存在下亦 然，顯示其未經Dicer之處理。

此外，對於其中 R〇 RNA(RO 27A1/23B 與 RO 25A1/ 21B)的訊息股在訊息股的3’終端區域含有一個具4鹼基的 懸擺端及經一脂質修飾之該等雙股RNA，以及對於其中RO 29 200927177 RNA(RO 27A1/21B)的訊息股在訊息股的3’終端區域含有 一個具6鹼基的懸擺端及經一脂質修飾之該等雙股RNA，評 估其藉由Dicer的處理作用。結果顯示，所有的前述R〇 RNA 皆經歷Dicer之處理，及在與21nt siRNA相同之位置觀察到 5 帶狀。 而且，對於其中 R〇 RNA(R〇 25A1/27B、RO 23A1/25B 及RO 23A1/27B)的訊息股在反訊息股的5，終端區域含有一 個懸擺端及經一脂質修飾之該等雙股RNA ,以類似方式評 估其藉由Dicer的處理作用。結果，就一些在反訊息股的5， © 10終端區域含有一懸擺端之經脂質修飾的尺〇1〇^^而言，因為 Dicer的處理作用，而觀察到新的帶狀；然而，該等帶狀係 與Dicer不存在下所觀察到的帶狀之時間相同及位置相近， 顯示Dicer之處理速率低於其對於〇8 RNA及其他R〇 rna 之處理速率。 15 4·經脂質修純ϋ隻歷互Μ對於螢光素醢篡冈袅規之物剎 作用 使用海參螢光素酶作為一標的，評估所合成之未經修 0 飾的雙股RNA與經脂質修飾的雙股RNA2RNA干擾作 用。在實驗之前，將希拉(HeLa)細胞（人類子宮頸癌細胞； 20日本東北大學之發育、老化及癌症研究所）調整至^1〇5細 胞/毫升，以每槽1〇〇微升的量植入一個96槽的平皿中及 於37°C培養過夜。第二天，移除槽中的舊培養基，以每槽 80微升的量添加新的無抗生素培養基，及在含有希拉 (HeLa)細胞的各槽中，添加1〇微升之由表現螢火蟲與海參 30 200927177 5 Ο 10 15 ❹ 20 螢光素酶的一載體(PsiCHECKTM-2載體；Promega公司）與 Lipofectamine™ 2000 (商品名；Invitrogen公司）所組成的一 複合溶液。將表現載體調整為每槽0.02微克，而 LipofectamineTM 2000調整為每槽0.2微升，及使用OptiMem (Invitrogen公司）以將體積調整至所需程度。為形成一複合 體，使用OptiMem將表現載體與Lipofectamine™ 2000混 合，然後在室溫中培養該混合物30分鐘。在添加複合溶液 之後，細胞在5%的二氧化碳存在下，於37°C培養4小時。 在培養之後，未經修飾的雙股RNA與在終端經一脂質修飾 的雙股RNA，其含有與海參螢光素酶的基因序列同源之一 個反訊息序列，以0 ηΜ、0·2 nM、0.5 nM、1 nM、2 nM、5 nM及 10 nM之最終濃度與Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen 公司）複合，所得的複合溶液各取10微升，添加至希拉(HeLa) 細胞，藉此將表現載體導入。每槽的最終體積為100微升。 藉由將每槽5微升的RNA水溶液及每槽5微升之 Lipofectamine™ 2000 (0.2微升)與OptiMem的一溶液混合， 及於室溫中培養該混合物30分鐘，而製備各RNA與 Lipofectamine™ 2000之複合溶液。在導入RNA之後，培養 細胞48小時，及使用Dual-GloTM榮光素酶分析系統(Promega 公司）與光度計(MicroLumat LB96p ; Berthold公司），分析勞 火蟲與海參螢光素酶表現的程度，以作為對照組的螢火蟲 螢光素酶表現程度為基礎，測定對於海參螢光素酶的表現 之抑制作用。 第5圖顯示，當未經修飾的雙股RNA與經脂質修飾的雙 31 200927177 股RNA的濃度為0.2 nM時，獲致對於基因表現之抑制作 用。結果’發現當在sfL息股的5 ’端具有一平整端之雙股rna 諸如Ds RNAs與RO RNA經一脂質修飾時，該等雙股RNA 所展現的RNA干擾作用，顯著優於具有相同構造但未經一 5脂質修飾之雙股RNA所提供者。亦發現相較於具有相同構 造之未經修飾的RORNA，藉由以一脂質修飾訊息股5’端所 獲致之較高的RNA干擾作用，係與RO RNA的股長度或懸擺 端的位置無關。該專結果導出一個新的發現，在訊息股5， 端含有一平整端之RNA干擾分子諸如DS RNA與RO 〇 10 RNA’可藉由以一脂質修飾訊息股5,端，而大幅地增進RNA 干擾作用。而且’亦發現其中2int siRNA的訊息股5,端經一 脂質修飾而得之si 21A2C16/21B與si 21A2C12/21B所展現 的RNA干擾作用，高於未經修飾的21泔siRNA所提供之作 用。 15 5.標定曼基因之經脂晳鉻飾的雙股RNA之RNA千 擾也J (未i用基因轉毕詁部p 在未使用基因轉染試劑諸如Lipofectamine™ 2000之情 ® 況下’將經脂質修飾的雙股RNA單獨轉染進入細胞中，及 評估其等是否展現RNA干擾作用。 20 在實驗之前’將希拉(HeLa)細胞（人類子宮頸癌細胞； 曰本東北大學之發育、老化及癌症研究所）調整至lxlO5細胞 /毫升以母槽100微升的量植入一個96槽的平皿中，及於 37°C培養過夜。第二天，移除槽中的舊培養基，以每槽8〇 微升的量添加新的無抗生素培養基，及在含有希拉(HeLa) 32 200927177 5 ❹ 10 15 20

細胞的各槽中，添加10微升之由表現螢火蟲與海參螢光素 酶的一載體（psiCHECK™-2載體；Promega公司）與 Lipofectamine™ 2000 (商品名；Invitrogen公司）所組成的一 複合溶液。將表現載體調整為每槽0.02微克，而 LipofectamineTM 2000調整為每槽0.2微升，及使用OptiMem (Invitrogen公司）以將體積調整至所需程度。為形成一複合 體，使用OptiMem將表現載體與Lipofectamine™ 2000混 合，然後在室溫中培養該混合物30分鐘。在添加複合溶液 之後，細胞在5%的二氧化碳存在下，於37°C培養4小時。 各槽以100微升的培養基清洗三次，以自槽中除去 Lipofectamine™ 2000。之後，在細胞中添加含有90微升的 抗生素之一培養基，未經修飾的雙股RNA與經脂質修飾的 雙股RNA，其含有與海參螢光素酶的基因序列同源之一個 反訊息序列，以OptiMem調整而製備最終濃度為〇 nM、25 nM、50 nM、100 nM、200 nM、400 nM、600 nM、800 nM

及1 μΜ之試樣’各取10微升的所得試樣及添加至細胞， 然後在37°C培養48小時。使用Dual-Glo™螢光素酶分析系 統（Promega公司）與光度計（MicroLumat LB96p ; Berthold 公司），分析螢火蟲與海參螢光素酶表現的程度。作為比 較之用，亦在上述相同條件下，評估未經修飾的21nt siRNA (si 21A2/21B)與27nt dsRNA (Ds 27A1/27B)之RNA干擾作 用。 以作為對照組的螢火蟲螢光素酶表現程度為基礎，藉 由評估海參螢光素酶的表現程度，而測定RNA干擾作用。 33 200927177 第6A圖顯示當最終濃度為50 nM至1 μΜ時之si 21A2/21B、 Ds 27A1/27B及Ds 27A1C16/27B的結果。第6B圖顯示當最 終濃度為25 nM至800 nM時之Ds 23A1/23B與Ds 23A1C16/ 23B的結果。結果顯示’在訊息股的5’終端區域經十六院酸 5 修飾之Ds 27A1C16/27B與Ds 23A1C16/23B，以依雙股RNA 濃度而定之方式，抑制海參螢光素酶的表現；因而，該等 雙股RNA因為經十六烷酸修飾，而可單獨地轉染進入細胞 内，藉此產生RNA干擾反應。另一方面，即使在高濃度， 未經修飾的雙股RNA(si 21A2/21B、Ds 27A1/27B及Ds 10 23A1/23B)並未對於基因表現展現顯著的抑制作用。其進一 步確認，經十六烷酸修飾的雙股RNA具有顯著較佳的細胞 攝取效率，及在未使用基因轉染試劑之情況下，展現抑制 基因表現之極佳能力。 L評估經脂皙倐飾的蝥股RNA之細胞摄取树率 15 在實驗之前’將希拉(HeLa)細胞(人類子宮頸癌細胞； 曰本東北大學之發育、老化及癌症研究所）、A549細胞（人 類肺癌細胞；日本東北大學之發育、老化及癌症研究所)及 SH10-TC細胞（人類胃癌細胞；日本東北大學之發育、老化 及癌症研究所）調整至lxl〇5細胞/毫升；及在實驗之前，將 20卓凱(Jurkat)細胞（急性淋巴性白血病細胞；日本東北大學之 發育、老化及癌症研究所）與K-562細胞(慢性淋巴性白血病 細胞，日本東北大學之發育、老化及癌症研究所）調整至 2xl05細胞/毫升；以每槽！毫升的量植入一個24槽的平皿 中’細胞在含有10%胎牛清(FBS ; Sanko Junyaku有限公 200927177 司）與抗生素的一培養基中，在5%二氧化碳存在下，於37 °C培養。就在此所用的抗生素與培養基而言，用於所有細 胞的抗生素是一種鏈黴素，用於希拉(HeLa)細胞的培養基 為MEM培養基(invitr〇gen公司），而用於其他細胞的培養基 5 為RPMI_1640(Invitrogen公司）培養基。在經螢光標記的募核 苷酸之轉染作用之前，以一種不含抗生素的培養基(45〇微 升）替換該等培養基。使用在27nt反訊息股的5,終端區域以 6-FAM標記之募核苷酸，作為經螢光標記的寡核苷酸；及 該募核苷酸與未經修飾的27nt訊息股或與在其5,終端區域 10 以一脂質修飾的27nt訊息股配對，而形成雙股。如下進行 細胞攝取效率實驗。為形成經螢光標記的募核苷酸與 Lipofectamine™ 2000(Invitrogen公司）之一複合體，將由 微升的ΙΟμΜ經螢光標記的寡核苷酸水溶液與15微升的 OptiMem溶液所組成之一混合溶液25微升及由2微升的 15 LlPofectamineTM 2000(Invitrogen 公司）溶液與 23 微升的 OptiMem溶液所組成之一混合溶液25微升，混合製得5〇微 升的一混合溶液，及於室溫中培養3〇分鐘。當未使用

LipofectamineTM 2000(Invitrogen 公司）（第 7 圖；-LF2000) 時，以OptiMem溶液取代在上述形成一複合體條件下所用 20的2微升LiP〇fectamineTM 2000溶液，及依據上述相同方法製 備試樣。將所得之經螢光標記的寡核苷酸複合體5〇微升， 添加至450微升之上述製備的細胞（雙股rnA的最終濃度為 200 nM)，及於5%的二氧化碳存在下，在37°C培養4小時。 之後’細胞以PBS(-)或培養基清洗三次’及使用共焦式營 35 200927177 光雷射顯微鏡及流式細胞技術，評估雙股RNA的細胞攝取 效率。 在以共焦式螢光雷射顯微鏡進行的評估中，使用 Radiance 2000系統(Bio Rad公司），及以氬雷射觀察螢光。 5 在流式細胞技術中，使用細胞計數儀的EPICS XL細胞儀 (Beckman細胞計數儀公司），測量每1 〇,〇〇〇個細胞數的細胞 攝取效率。在流式細胞分析中，使用XL EXP032™軟體 (Beckman細胞計數儀公司）。 結果示於第7-1至7-3圖。第7-3圖中的F部份(-LF2000) 10 顯示當未使用Lipofectamine™ 2000時之結果；而第7-1至 7_3中的A至E部份（+LF2000)顯示當使用LipofectamineTM 2000作為基因轉染試劑時之結果。第7-1圖的A部份所顯示 的結果，係在使用Lipofectamine™ 2000作為基因轉染試劑 之情況下，各種雙股RNA進入希拉(HeLa)細胞之細胞攝取 15 效率；第7-1圖的B部份顯示A549細胞的結果；第7-2圖的C 部份顯示SH10-TC細胞的結果；第7-2圖的D部份顯示K-562 細胞的結果；及第7-3圖的E部份顯示卓凱(jurkat)細胞的結 果。第7-3圖的F部份所顯示的結果，係在未使用商品可取 得的基因轉染試劑之情況下，各種雙股RNA進入希拉(HeLa) 2〇 細胞之細胞攝取效率。結果’未經修飾的雙股RNA與經脂 質修_的雙股RNA進入所有細胞（希拉(HeLa)細胞、A549 細胞、SH10-TC細胞、Jurkat細胞及K-562細胞）之轉染作 用’在Lip0fectamineTM 2000存在下獲得確認。尤其，相較 於未經修飾的雙股RNA與經十二烧酸修飾的雙股rNa而 36 200927177 言，在訊息股的5,端經十六烷酸修飾之Ds 27A1C16/27B， 以共焦式螢光雷射顯微鏡與流式細胞儀觀察到非常高的細 胞攝取效率。此外，共焦式螢光雷射顯微鏡的觀察顯示， 經十六烷酸修飾之雙股RNA活躍地集中於細胞的細胞質 5 中。尤其在附著型細胞(希拉(HeLa)細胞、A549細胞及SH10-TC細胞）中，該攝取效率格外地明顯。而且，經流式細胞儀 分析確認，在Lipofectamine™ 2000的存在下，經十六烧酸 修飾的雙股RNA所展現之細胞攝取效率，亦高於未經修飾 的雙股RNA。該等結果導出一新發現，當雙股RNA在訊息 10 股的5’終端區域與一脂質諸如十六烷酸等共價連接時，該 雙股RNA可展現顯著增進的細胞攝取效率，及可集中於細 胞的細胞質中。 例：5’經脂質修飾的雙股rNA掛於veGF某因蛊規.之抑 制作用 15 標定VEGF基因之經脂質修飾的雙股RNA之合成祚用 1.訊息股與反訊•良股之序歹I丨 ❹ a 含有具27或21個鹼基長度的訊息股及具27或21個鹼基 長度的反訊息股之雙股RNA，係設計具有與VEGF(血管内 皮生長因子）同源的一序列及可抑制VEGF基因之表現。下 20列實驗係以該等雙股RNA進行之。27nt dsRNA是一個不含 有一懸擺端（單股區域)之完全雙股RNA(亦即一個在訊息股 的5’與3’終端侧均具有平整端之雙股RNA);而218丨汉1^八是 一個在其訊息與反訊息股的3,端均具有含2個鹼基的懸擺 端之雙股RNA。27ntdsRNA與21siRNA的序列如下。 37 200927177 27nt dsRNA : 訊息股：v27A: 5，-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAA UG-3’（序列辨識編號：l〇) 反訊息股：v27B: 3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACAC 5 UUAC-5’（序列辨識編號：11) 21siRNA ： 訊息股：v21A: 5，-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’（序 列辨識編號：12) 反訊息股：v21B: 3，-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5, 10 (序列辨識編號：13) 1-2.標定VEGF某因之未經脂質修飾的譬股RNA之合成作用 以第1例的相同方式，將上述的訊息股與反訊息股黏合 形成雙股，藉此產生未經脂質修飾的雙股rNA。依據第1 15例所述的相同方法，藉由20%丙烯醯胺凝膠的電泳分析， 確認雙股之形成。 1-3._標笔VECtF苺因少沒遍質修籂的镩股RNA之合忐祚用 合成經脂質修飾的雙其中在可抑制VEGF基因 表現之上述雙股RNA的訊息股5，端連接—脂f。在經脂質 2〇修飾的雙股RNA中，該月旨質經由-胺基烧基（胺基修飾劑 C6 ; Glen Research公司）而以共價方式連接至上述訊息股的 5知依據第1例所述的相同方法，合成經脂質修部的單股 RNA(訊息股）。 標定VEGF基因（經脂質修飾的RNA之構造模式與產 38 200927177 率如下。 V27AC16： CH3<CH2)u.£h N-(CH2)e〇g〇-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3' V27AC12. CH3<CHa)104-N (CHz)8.〇^〇-CUUCCUACAGCACAACAAAUQUGAAU&.y Η 〇 (CH^OfO-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-S* V21AC16: CH3<CH2)14i-m Η

〇 Q v21 AC12: CHJ<CH2)1(,-C-N-{CH2)e.〇^〇-UCCU/M^M3CACMCAMUGUG.3, Η 6 將所得之經脂質修飾的訊息股與反訊息股配對，以產 生經脂質修飾的雙股RNA。依據第1例的相同方法，藉由 5 20%丙烯醯胺凝膠的電泳分析’確認雙股之形成。第8圖顯 示經脂質修飾的雙股RNA之構造。在標定VEGF基因之經脂 質修飾的RNA中，其洗提時間實質上亦與第1例相同。 2.藉由Dicer處理標定VEGF基因之經脂質修飾的雙股rna 評估重組型Dicer對於所合成之未經脂質修飾的雙股 10 RNA與經脂質修飾的雙股RNA之處理作用。依據第1例的相 同方法，進行Dicer剪切實驗。結果示於第9圖。 結果顯示，對於Dsv27AC16/v27B與Dsv27AC12/v27B 而言，藉由重組型Dicer的作用，觀察到帶狀，因而強力顯 示Dicer剪切作用所產生之具21個鹼基長度的siRNA含有一 15個具2鹼基的懸擺端。該等結果證實，在27nt dsRNA之訊息 股5’端連接一脂質，並不會妨礙Dicer的處理作用。另一方 面’就siv21AC16/v21B與siv21AC12/v21B而言，相較於當 Dicer不存在之情況，即使Dicer存在，也未觀察到有所變 化’顯示其等未經Dicer之處理。 39 200927177 經脂質修飾的雙股RNA對於VEGF某因表現之抑制作用 使用希拉(HeLa)細胞（人類子宮頸癌細胞；日本東北大 學之發育、老化及癌症研究所）、A549細胞（人類肺癌細胞； 曰本東北大學之發育、老化及癌症研究所）、SH10-TC細胞 5 (人類胃癌細胞；曰本東北大學之發育、老化及癌症研究 所）、卓凱(Jurkat)細胞（急性淋巴性白血病細胞；曰本東北 大學之發育、老化及癌症研究所)及K-562細胞(慢性淋巴性 白血病細胞；日本東北大學之發育、老化及癌症研究所）， 評估具有未經修飾的終端之21nt siRNA、具有未經修飾的 10 終端之27nt dsRNA、在訊息股的5’端經一脂質修飾之27nt dsRNA(在終端經一脂質修飾的27nt dsRNA)及在訊息股的 5’端經一脂質修飾之21nt siRNA(在終端經一脂質修飾的 21ntsiRNA)對於VEGF基因表現之抑制作用。此外，未具有 與VEGF基因同源的一基因序列之雙股RNA(27nt dsRNA 15 (隨機）與21nt siRNA(隨機)），以及其中一脂質與雙股rnA 的訊息股5’端連接之該等經脂質修飾的雙股RNA，亦以類 似方式加以評估。 依據下列方法進行實驗。在實驗之前，將希拉(HeLa) 細胞、A549細胞及SH10-TC細胞調整至lxlO5細胞/毫升；及 2〇 在實驗之前，將卓凱(Jurkat)細胞與K-562細胞調整至2xl05 細胞/毫升；以每槽500微升的量植入24槽的平皿中，及於 37°C培養過夜。第二天，移除槽中的舊培養基，以每槽450 微升的量添加新的無抗生素培養基。希拉(HeLa)細胞使用 MEM培養基，而其他細胞使用PRMI-1640培養基。含有與 200927177 VEGF基因序列同源的一個反訊息序列之未經修飾或經脂 5 ❹ 10 15 肇 20

質修飾的雙股RNA(25微升），與Lipofectamine™ 2000溶液 (Invitrogen公司）(25微升）形成一複合體，然後在45〇微升的 上述細胞中，添加50微升的各雙股RNA溶液。每槽的最終 體積為500微升。將每槽25微升的RNA水溶液及每槽25微升 之由Lipofectamine™ 2000(2微升）與OptiMem所組成之一溶 液’混合製得各RNA與Lipofectamine™ 2000溶液之一複合 溶液，及於室溫中培養該混合物30分鐘。在RNA導入作用 之後’細胞在5%的二氧化碳存在下，於37°C培養48小時。 在培養之後，細胞以PBS(-)清洗三次，及使用RNeasy Plus 迷你套組(Qiagen公司），將細胞中的全部RNA抽出。之後進 行RT-PCR反應，以測量VEGF中的mRNA量。使用Qiagen 單步驟RT-PCR套組(Qiagen公司），進行RT-PCR反應；及使 用 5‘-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3,(序列辨識 編號：14)與5’-八(：0〇(：(：1^〇〇(：1'丁〇丁€八(：-3，(序列辨識 編號：15)，作為VEGF的PCT引子。依據相同方法測量 GAPDH基因，以作為對照組。使用5’-GGAAAGCTGTGGC GTGATG-3’(序列辨識編號：16)與5’-CTGTTGCTGTAGCC GTATTC-3,（序列辨識編號：17)，作為GAPDH的引子。如 下進行RT-PCR反應。RT(逆轉錄）反應於50°C進行30分鐘， 而PCR反應涉及重複25至28回合（依所用的細胞而定）之於 92°C進行30秒的雙股分離反應、於55°C進行30秒的黏合反 應及於68°C進行45秒的延伸反應。最後，在68°C培養10分 鐘，將溫度降至4°C，及完成反應。依據Qiagen單步驟RT-PCR 41 200927177 套組（Qiagen公司）的反應條件，製備用於rt-pcr中的試 劑、總RNA、引子等。在RT-PCR反應之後，添加2微升的 加料染劑，及藉由2%瓊脂凝膠確認自VEGF與GAPDH的 mRNA所衍生的RT-PCR產物。藉由測量該雙股RNA(未經修 5飾與經修飾者）轉染進入的細胞中之VEGF表現程度，而評 估對於基因表現的抑制作用’假設VEGF基因在對照組細胞 (未經雙股RNA轉染進入的細胞）中的表現程度為1〇〇%。以 對照組基因（GAPDH)的基因表現程度為基礎，修正細胞間 之表現程度的誤差。 10 第1〇-i至10-3圖顯示，當標定VEGF及雙股RNA的濃度 為200 nM時，未經修飾的雙股RNA與經脂質修飾的雙股 RNA之RNA干擾作用的結果。第1〇-1圖的a圖顯示在希拉 (HeLa)細胞中’未經修飾的雙股RNA與經脂質修飾的雙股 RNA對於VEGF基因表現的抑制作用；第1〇_2圖的b圖顯示 15 A549細胞的結果；第1〇-2圖的C圖顯示SH10-TC細胞的結 果；第10-3圖的D圖顯示卓凱(jurkat)細胞的結果；及第1〇-3 圖的E圖顯示K-562細胞的結果。該等結果顯示，相較於未 經修飾的雙股RNA(si V21A/21B與Ds v27A/v27B)，各藉由 以一脂質修飾具27個鹼基長度的雙股rnA(Ds v27A/v27B) 20 之訊息股的5’端所製得的Ds v27AC16/v27B與Ds v27AC12/ v27B，以及各藉由以一脂質修飾具21個鹼基長度的雙股 RNA(si v21A/v21B)之訊息股的5’端所製得的si v21AC16/ v21B與si v21AC12/v21B ’對於VEGF基因表現具有非常高 的抑制作用。尤其，相較於未經修飾的雙股RNA(si v21A/ 42 200927177

21B與Ds v27A/v27B)，經十六烧酸修飾的ds v27AC16/v27B 在所有的細胞（希拉(HeLa)細胞、A549細胞、SH1〇_TC細 胞、卓凱(Jurkat)細胞及K-562細胞）中’展現顯著較高的基 因表現抑制作用。其確認藉由以一脂質諸如十六烧酸等修 5飾雙股RNA，可顯著地增進RNA干擾作用。對於不具有與 VEGF基因同源的一基因序列之未經修飾的雙股rna及經 脂質修飾的雙股RNA，亦以類似方式評估其等對於基因表 現之抑制作用；但該等雙股RNA中並無—者對於VEGF基因 展現任何顯著的抑制作用。該等結果揭示，在此所用之標 10定VEGF基因的雙股RNA，以具高度序列專一性的方式，抑 制該標的基因的表現；同時亦顯示，藉由在雙股rna上連 接一脂質，可降低對於細胞的副作用。 L圖式簡單說明;] 第1圖顯示第1例所合成之未經修飾與經脂質修飾的雙 15 股RNA之構造。 ，帛2圖顯示第1例對於經脂質修飾的單股rn a所進行之 HPLC分析結果。 第3圖顯示在5’端經一脂質修飾的雙股RNA之核酸酶 抗性，其係於第1例中測量。 20 帛4圖顯示藉由Dicer處理第1例之各個經脂質修飾的雙 股RNA之評估結果。 第5圖顯示第1例之經脂質修飾的27泔dsRNAss 〇 2 nM濃度之RNA干擾作用的評估結果。 第6圖顯不第1例之在5’端經_脂質修飾的雙股RNA之 43 200927177 RNA干擾作用（未使用一基因轉染劑）的評估結果。 第7-1圖顯示第1例之經脂質修飾的雙股舰進入希拉 (HeLa)細胞與A549細胞之細胞攝取的評估結果；其中” 係指以螢光顯微鏡所攝得的影像；，，Trans，，係指在與fl影像 5相同的視野，以相差顯微鏡所攝得的影像；及，，叠合，，係指 其中FL影像與Trans影像重疊之影像。 第7-2圖顯示川狀經脂f修飾的雙股驅進入 SH10-TC30與K562細胞之細胞攝取的評估結果；其中” 係指以螢光顯微鏡所攝得的影像；” Trans，，係指在與fl影像 〇 10相同的視野，以相差顯微鏡所攝得的影像；及”疊合，，係指 其中FL影像與Trans影像重疊之影像。 第7-3圖顯示第〗例之經脂質修飾的雙股RNA進入卓凱 . (Jurkat)與希拉（HeLa)細胞之細胞攝取的評估結果；其 中’’FL”係指以螢光顯微鏡所攝得的影像；，,Trans”係指在與 15 FL影像相同的視野，以相差顯微鏡所攝得的影像；及，，疊合，， 係指其中FL影像與Trans影像重疊之影像。 第8圖顯示第2例所合成之未經修飾與經脂質修飾的雙 〇 股RNA之構造。 第9圖顯示藉由Dicer處理第2例之各個經脂質修飾的雙 20 股RNA之評估結果。 第10-1圖顯示第2例之經脂質修飾的雙股尺^^八在希拉 (HeLa)細胞中對於VEGF基因的RNA干擾作用之評估结果。 第10-2圖顯示第2例之經脂質修飾的雙股RNA在A549 與SH10-TC細胞中對於VEGF基因的rNa干擾作用之評估 44 200927177 結果。 第10-3圖顯示第2例之經脂質修飾的雙股RNA在卓凱 (Jurkat)與K567細胞中對於VEGF基因的RNA干擾作用之評 估結果。 5 【主要元件符號說明】 (無）

45 200927177 序列清單

<110>國立先進產業科學與技術研究所與大塚(OTSUKA)製藥股份有限公司 <120>具有有效RNA干擾作用之經脂質修飾的雙股RNA <130> 2008C4/TW <160〉 17 <170>專利版本3.1 27

<210〉 1 <211> 27 <212> RNA <213>人造 <220> <223〉27nt 27A1 的序列 <400〉 1 cuggccuuuc acuacuccua cgagcac <210〉 2 <211> 25 <212> RNA <213>人造 <220> <223〉25nt 25A1 的序列 <400〉 2 cuggccuuuc acuacuccua cgagc 25 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213>人造 <220〉 <223> 23nt 23A1 的序列 <400〉 3 cuggccuuuc acuacuccua cga 23 <210〉 4 <211〉 21 <212> RNA <213> 人造 200927177 <220> <223> 21nt 21A1 的序列 <400> 4 cuggccuuuc acuacuccua c <210〉 5 <211> 21 <212> RNA <213〉人造 <220〉 <223〉21nt21A2 的序列 <400〉 5

ggccuuucac uacuccuacg a <210〉 6 <211> 27 <212> RNA <213〉人造 <220> <223〉27nt 27B 的序列 <400〉 6 gugcucguag gaguagugaa aggccag

<210〉 7 <211> 25 _ <212> RNA 〇 <213〉人造 <220> <223〉25nt 27B 的序列 <400> 7 gcucguagga guagugaaag gccag <210> 8 <211〉 23 <212> RNA <213〉人造 <220> <223〉23nt 27B 的序列 <400> 8 ucguaggagu agugaaaggc cag 200927177 <210〉 9 <211> 21 <212> RNA <213>人造 <220〉 <223〉21nt 27B 的序列 <400〉 9 guaggaguag ugaaaggcca g 21 <210> 10 <211> 27 <212> RNA <213>人造 <220〉 <223> v27A的序列

<400〉 10 cuuccuacag cacaacaaau gugaaug 27 <210〉 11 <211〉 27 <212> RNA <213>人造 <220> <223> v27B的序列 <400> 11 gaaggauguc guguuguuua cacuuac 27 ❹ <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213>人造 <220〉 <223> v21A的序列 <400> 12 uccuacagca caacaaaugu g <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213>人造 3 21 200927177 <220〉 <223〉v21B的序列 <400〉 13 gaaggauguc guguuguuua c 21 <210> 14 <211〉 24 <212〉 DNA <213>人造 <220> <223〉用於VEGF的PCR引子-1 <400> 14 ccctgatgag atcgagtaca tctt 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213>人造 <220> <223>用於VEGF的PCR引子-2 <400> 15 accgcctcgg cttgtcac 18 <210> 16 <211〉 19 <212〉DNA 〇 <213〉人造 <220〉 <223〉用於GAPDH的PCR引子-1 <400〉 16 ggaaagctgt ggcgtgatg 19 <210〉 17 <211> 20 <212> DNA <213〉人造 <220> <223〉 用於GAPDH的PCR引子-1 <400> 17 ctgttgctgt agccgtattc 4 20

Claims (1)

1. 200927177 七、申請專利範圍： ι_ 一種經脂質修飾的雙股RNA，其包括具有與一標的基因 中之一標的序列互補的一核苷酸序列之一訊息股，及具 有與該訊息股互補的一核苷酸序列之一反訊息股，該雙 股RNA可抑制標的基因之表現，及該訊息股具有與5，端 的第一至第六個核苷酸中之至少一者直接或經由一連 接子連接之一脂質。 2_如申請專利範圍第1項之經脂質修飾的雙股rna，其訊 息股的5,終端側為平整端，而訊息股的3，終端側為平整 端或具有一懸擺端。 3·如申請專利範圍第丨項之經脂質修飾的雙股11]^八，其訊 息股的5’與3’終端側均具有懸擺端。 4·如申請專利範圍第1至第3項中任一項之經脂質修飾的 雙股RNA，其中該訊息股具有21至27個核苷酸。 5. 如申請專利範圍第2項之經脂質修飾的雙股15^入，其訊 息股的5’與3’終端側均為平整端，及其中各訊息股與反 訊息股具有27個核苦酸。 6. 如申請專利範圍第2項之經脂質修飾的雙股RNA，其訊 息股的5’與3’終端側均為平整端，及其中各訊息股與反 訊息股具有23個核苷酸。 7. 如申請專利範圍第2項之經脂質修飾的雙股RNA，其訊 息股的5’終端側為平整端，該訊息股具有25個核苷酸， 而該反訊息股具有23個核芽酸。 8·如申請專利範圍第3項之經脂質修飾的雙股RNA，其中 200927177 各訊息股與反訊息股具有21個核苷酸。 9. 如申請專利範圍第1至第8項中任一項之經脂質修飾的 雙股RNA，其中該脂質係具有6至50個碳原子的脂肪酸。 10. 如申請專利範圍第1至第9項中任一項之經脂質修飾的 雙股RNA，其中該脂質為十二烧酸、十八烧酸、十四烧 酸或十六烧酸。 11. 如申請專利範圍第1至第10項中任一項之經脂質修飾的 雙股RNA，其中該脂質係經由一連接子而與訊息股5’端 〇 的第一至第六個核苷酸中之至少一者連接，該連接子係 由下列構造式所代表： -NH-(CH2)nl- (L-4) 其中nl為1至40之一整數。 ’ 12. —種藥學組成物，其包括如申請專利範圍第1至第10項 中任一項之經脂質修飾的雙股RNA，及一種藥學上可接 受的主劑。 0 13.如申請專利範圍第1至第10項中任一項之經脂質修飾的 雙股RNA，其在製造用以抑制一標的基因表現之一種藥 學組成物之用途。 14. 一種抑制一標的基因表現之方法，其包括將如申請專利 範圍第1至第10項中任一項之經脂質修飾的雙股RNA導 入細胞内，以抑制該標的基因之表現。 2 200927177 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（5 )圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： (無) 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：