CN101835497A - 具有强rna干涉效果的脂质修饰的双链rna - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率，并且能够产生优异的RNA干涉效果的新型双链RNA。本发明提供一种脂质修饰的双链RNA，其包含具有与靶序列互补的核苷酸序列的有义链，及具有与该有义链互补的核苷酸序列的反义链，该双链RNA能够抑制该靶基因的表达，并且该有义链具有直接或通过连接体连接到从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个上的脂质。

Description

具有强RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA
技术领域
本发明涉及一种能够有效地抑制靶基因表达的脂质修饰的双链RNA。更具体而言，本发明涉及一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率(uptake efficiency)并且产生优异的RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA。
背景技术
有效地治疗癌症和AIDS等难治疾病的药物的开发是生命科学领域中的一个重大课题。攻克上述课题的一种有效的方法是使用仅作用于特定基因的基因药物。特别是，作为这样的基因药物，利用长21个碱基的短双链RNA(小干涉RNA:siRNA)的RNA干涉(RNA interference：RNAi)法最近受到更多的关注。上述RNAi法在1998年由Fire等人首次报道(参见非专利文献1)。根据Fire等人的报道，当与欲抑制功能的基因的特定区域同源的100个碱基对左右的双链RNA被导入细胞内时，通过切酶(Dicer)的作用双链RNA分解成20～25个碱基对左右的片段，之后与多种蛋白质复合，形成RNA/蛋白质复合体(该复合体称作RISC:RNA诱导沉默复合体)，所述复合体与由靶基因产生的mRNA的同源位点结合，从而强力地抑制基因表达。但是，据报道：当将约30个碱基对或更长的长双链RNA导入哺乳动物细胞中时，作为抗病毒应答的干扰素应答被诱导，结果导致细胞凋亡的现象。因此，认为RNAi法难以适用于哺乳动物。Tuschl等人化学合成了在双链RNA的两个3’末端具有悬端(dangling end)的21个碱基长度的双链RNA，并且报道当将这种双链RNA直接导入哺乳动物细胞内时，该双链RNA能够序列特异性地强有力地抑制基因表达，同时避免干扰素应答(参见非专利文献2)。Tuschl等人进一步合成了由19个碱基对的双链区域和位于3’末端或5’末端的各种长度的悬端组成的短双链RNA，并且研究了它们的RNA干涉效果。结果观察到在两个3’末端具有2个碱基的悬端的21个碱基长度的siRNA显示出非常强的RNA干涉效果，而没有其它类型的短双链RNA显示出显著的RNA干涉效果。根据上述报道，目前通常使用下述RNA干涉法，其采用21个碱基长度、在两个3’末端具有2个碱基的悬端的双链RNA。此处为了与RNAi法相区别，将使用21个碱基长度的短双链RNA来抑制靶基因表达的方法称作“siRNA法”。
由于上述siRNA法使用合成的RNA，所以较容易制备样品，操作也简单，并且能够产生非常强的效果，因此，siRNA法不仅在生命科学领域，在生物技术商业领域也广泛受到关注。
但是，上述优异的siRNA法也存在必须要解决的问题。如上所述，siRNA由容易被核酸酶的作用分解的RNA分子组成。双链RNA区域与单链RNA相比，对培养基及/或细胞中含有的核酸酶具有相当的高抗性。但由19个碱基对组成的双链RNA几乎不产生已知的RNA干涉效果。因此，有报道称，当被导入含有靶基因序列的细胞内时，虽然合成的siRNA在大约2天～大约4天的时间里产生强基因表达抑制效果，但之后其RNA干涉效果迅速减弱，到7日左右几乎完全消失。
最近为了使合成的siRNA具有提高的细胞导入率和延长的高活性RNA干涉效果，报道了各种化学修饰的siRNA。例如为了提高对核酸外切酶消化的抗性，合成了在siRNA末端用氨基、巯基或脱碱基位点修饰的siRNA。但是，已经有报道称，大多数末端修饰的21个碱基长度的siRNA具有显著减弱的RNA干涉效果。
近年来，J.Rossi等人报道了27个碱基对的双链RNA比21个碱基长度的双链RNA产生高100倍左右的RNA干涉效果(参见非专利文献3)。推断这是由于27个碱基对的RNA被RNase III样酶切酶切割成21个碱基长度的siRNA后，蛋白质复合体RISC识别siRNA，使得可以高效地产生siRNA效果。
如上所述，由于27个碱基长度的RNA可以产生优异的RNA干涉效果，所以更期待使用这种RNA作为基因药物。但是，完全不清楚何种技术方法对增强27个碱基长度的RNA的RNA干涉效果有效。此外，也不清楚何种技术方法可提高具有RNA干涉效果的长于或短于27个碱基的双链RNA的RNA干涉效果。
具有RNA干涉效果的双链RNA通常构造为具有悬端。对不具有悬端(即，具有平端)的RNA也进行了RNA干涉效果的研究。但是结果表明，在有义链的5’末端侧为平端的双链RNA与在有义链的5’末端侧具有悬端的双链RNA相比，RNA干涉效果基本相同或者较低(参见非专利文献4)。
脂质具有高的细胞膜透过性，而且已知其对向细胞内转运药物有用。预期将脂质与具有RNA干涉效果的双链RNA连接可提高细胞内导入率，从而产生更强的RNA干涉效果。但是，如果将具有RNA干涉效果的双链RNA与脂质简单地连接，则会导致RNA干涉效果的显著减弱。在现有技术中，现状是尚未构建兼有优异的RNA干涉效果与基于脂质的有用效果的脂质修饰的双链RNA。
非专利文献1：Fire et al.，Nature，391，806-811(1998)
非专利文献2：Tuschl et al.，EMBO Journal，20，6877-6888(2001)
非专利文献3：J.Rossi et al.，Nature Biotech.，23，222-226(2005)
非专利文献4：J.T.Marques et al.，Nature Biotech.，24，559-565(2005)
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的一个目的在于提供一种具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率并且能够产生优异的RNA干涉效果的新型双链RNA。本发明的另一个目的在于提供一种含有上述新型双链RNA的药物组合物。本发明的进一步的目的在于提供一种抑制靶基因表达的方法，所述方法包括将新型双链RNA导入细胞来抑制靶基因表达。
解决所述问题的手段
本发明人等为了实现上述目的，进行了深入的研究，结果发现如果脂质直接或通过连接体连接到双链RNA的有义链中从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个上，所述双链RNA包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序列的有义链，及具有与该有义链互补的核苷酸序列的反义链，该双链RNA能够抑制所述靶基因的表达，则这样构建的双链RNA具有高核酸酶抗性及高细胞内导入率，并且产生优异的RNA干涉效果。基于上述发现，通过进一步的研究完成了本发明。
更具体而言，本发明提供下述脂质修饰的双链RNA、含有新型双链RNA的药物组合物、抑制靶基因表达的方法等。
项1、一种脂质修饰的双链RNA，其包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序列的有义链，及具有与上述有义链互补的核苷酸序列的反义链，上述双链RNA能够抑制所述靶基因的表达，并且上述有义链具有直接或通过连接体连接到从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个上的脂质。
项2、如项1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧为平端，并且在有义链的3’末端侧为平端或具有悬端。
项3、如项1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端。
项4、如项1～3中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述有义链由21～27个核苷酸组成。
项5、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，并且有义链及反义链各自由27个核苷酸组成。
项6、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，并且有义链及反义链各自由23个核苷酸组成。
项7、如项2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧为平端，有义链由25个核苷酸组成，且反义链由23个核苷酸组成。
项8、如项3所述的脂质修饰的双链RNA，其中有义链及反义链各自由21个核苷酸组成。
项9、如项1～8中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质为具有6～50个碳原子的脂肪酸。
项10、如项1～9中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质为月桂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
项11、如项1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中上述脂质通过连接体与从有义链的5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个连接，所述连接体由下述结构式表示
-NH-(CH2)n1-(L-4)
其中，n1为1～40的整数。
项12、一种药物组合物，含有项1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA及药学上可接受的基质。
项13、项1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA在制备用于抑制靶基因表达的药物组合物中的应用。
项14、一种抑制靶基因表达的方法，包括将项1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA导入细胞来抑制靶基因的表达。
发明效果
本发明的脂质修饰的双链RNA在有义链的5’末端侧被脂质修饰，由此产生显著提高的RNA干涉效果。特别是本发明的脂质修饰的双链RNA具有与RNA的特定位点连接的脂质，因此具有显著提高的核酸酶抗性及细胞内导入效率，而不妨碍切酶的加工或RNA与RISC的结合，因此对药物用途有很大贡献。
本发明的脂质修饰的双链RNA即使单独使用也具有优异的细胞内递送能力。因此不使用任何已知的基因转染试剂，或者以减少的量使用已知的基因转染试剂，也可以将脂质修饰的双链RNA导入细胞内。因此，本发明的脂质修饰的双链RNA可以抑制细胞毒性的表达(这是使用已知的基因转染试剂时的担心)，因此可以确保临床应用中高度的安全性。
因此，根据本发明，通过使用本发明的药物组合物或利用抑制靶基因表达的方法可以更有效地抑制或减弱靶基因的表达。
具体实施方式
在本说明书中，所谓“平端”是指双链RNA的一种末端结构，其中有义链的末端区域中的碱基与和有义链互补的反义链的末端区域中的碱基配对，而不形成单链。所谓“悬端”是指由于在双链RNA的有义链的末端区域中或与有义链互补的反义链的末端区域中不存在互补的碱基，所以不形成双链，存在单链的核苷酸序列的末端部分。
本发明的脂质修饰的双链RNA包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序列的有义链。
此处，所谓“靶基因”是指RNA干涉效果抑制其表达的基因。本发明的脂质修饰的双链RNA的靶基因没有特别的限制，可以根据该脂质修饰的双链RNA的预期用途适当选择。
对靶基因中的靶序列没有特别的限制，只要该基因的表达可以被RNA干涉效果抑制即可。靶序列可以根据公知方法例如使用NCBIBLAST搜索等适当确定。例如靶序列可以是由19～30个碱基组成的区域，所述碱基在位于靶基因编码区(ORF)起始密码子50～100个碱基下游的外显子区中的碱基“AA”之后，靶序列的GC含量约为50％。本领域技术人员根据经验可知，通过采用与上述靶序列互补的链，可以获得优异的RNA干涉效果。例如，上述靶序列可以根据IDT的说明(IntegratedDNA Technologies，Inc.；Dicer Substrate RNAi Design)来确定。最近有报道指出通过构建如下双链RNA可以产生具有高RNA干涉效果的双链RNA，所述双链RNA(i)在反义链的5’末端侧具有A/U对；(ii)在有义链的5’末端侧具有G/C对；及(iii)在反义链的5’末端侧具有5个左右的A/U对；(iv)不存在9个或更多的G/C对。(Ui-Tei et al.，NucleicAcids Res.，32，936-948(2004))。
本发明的脂质修饰的双链RNA的有义链中不存在悬端时，该有义链由与靶序列互补的核苷酸序列组成。有义链在5’末端及/或3’末端具有悬端时，该有义链由与靶序列互补的核苷酸序列、和与互补核苷酸序列的5’末端及/或3’末端连接的悬端的核苷酸序列组成。
构成本发明的脂质修饰双链RNA的有义链的核苷酸数量没有特别的限制，只要可以发挥RNA干涉效果即可，并且可以根据双链RNA所期望的结构适当地确定。核苷酸的数量通常为21个～27个，优选为21个、23个、25个或27个，更优选为21个、23个或27个。在该有义链中不存在悬端时，所谓构成该有义链的核苷酸的数量是指构成与靶序列互补的核苷酸序列的核苷酸的总数。在该有义链中存在悬端时，所谓构成该有义链的核苷酸的数量是指构成悬端的核苷酸的数量和构成与靶序列互补的核苷酸序列的核苷酸的数量的总和。本发明的脂质修饰的双链RNA包含具有与上述有义链互补的核苷酸序列的反义链。
本发明的脂质修饰的双链RNA的反义链中不存在悬端时，该反义链由与上述有义链的“与靶序列互补的核苷酸序列”的一部分或全部互补的核苷酸序列组成。另外，在反义链的5’末端及/或3’末端存在悬端时，该反义链由下述核苷酸序列组成：与上述有义链的“与靶序列互补的核苷酸序列”的一部分或全部互补的核苷酸序列；和与反义链的互补核苷酸序列的5’末端及/或3’末端连接的悬端的核苷酸序列。在本发明的脂质修饰的双链RNA中，构成上述反义链的核苷酸数量只要可以获得RNA干涉效果即可，没有特别的限制，并且可以根据该双链RNA所期望的结构适当地确定。上述核苷酸的数量通常为21个～27个、优选为21个、23个、25个或27个，更优选为21个、23个或27个。在该反义链中不存在悬端时，构成该反义链的核苷酸的数量是指构成与靶序列互补的核苷酸序列的核苷酸总数。在该反义链中存在悬端时，构成该反义链的核苷酸的数量是指构成悬端的核苷酸数量和构成与靶序列互补的核苷酸序列的核苷酸数量的总和。
构成本发明的脂质修饰的双链RNA的有义链和反义链的核苷酸基本为核糖核苷酸。为了提高对酶消化的抗性，RNA序列中可以包含各种化学修饰的核苷酸，如2’-O-甲基-修饰的核苷酸、2’-F-修饰的核苷酸、LNA(锁定核酸)核苷酸、脱氧核糖核苷酸等。特别是，当本发明的脂质修饰的双链RNA具有悬端时，有义链及/或反义RNA中的该悬端也可以由脱氧核糖核苷酸组成。这些化学修饰的核苷酸的例子包括磷酸骨架修饰的核苷酸，如硫代磷酸修饰的DNA/RNA及硼磷酸修饰的DNA/RNA；2’修饰的核苷酸，如2’-OMe-修饰RNA及2’-F-修饰RNA；通过将核苷酸的糖分子交联得到的修饰核苷酸，如LNA(锁定核酸)和ENA(2’-O，4’-C-亚乙基-桥联核酸)；具有不同骨架的修饰核苷酸，如PNA(肽核酸)和吗啉-核苷酸；碱基修饰的核苷酸，如5-氟尿苷和5-丙基尿苷；等等。
本发明的脂质修饰的双链RNA在结构上没有特别的限制，只要有义链和反义链杂交形成双链即可。例如，上述脂质修饰的双链RNA优选具有下述结构：(A)双链RNA在有义链的5’末端侧为平端(即具有平端)、且在有义链的3’末端侧为平端或具有悬端(单链区域)的结构，以及(B)双链RNA在有义链的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端的结构。双链RNA在有义链的3’末端侧具有悬端的结构包括下述情况：有义链的3’末端区域形成悬端，及反义链的5’末端区域形成悬端。双链RNA在有义链的5’末端侧具有悬端的结构包括下述情况：有义链的5’末端区域形成悬端，及反义链的3’末端区域形成悬端。
在可以用来形成本发明的脂质修饰的双链RNA的双链RNA中，为了进一步提高RNA干涉效果，在具有上述结构(A)的双链RNA中特别优选具有以下所示的结构(A-1)～(A-3)的双链RNA，在具有上述结构(B)的双链RNA中特别优选具有以下所示的结构(B-1)的双链RNA。结构(A-1)如下：双链RNA在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，而且该有义链及该反义链分别由27个核苷酸组成；结构(A-2)如下：双链RNA在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，而且该有义链及该反义链分别由23个核苷酸组成；结构(A-3)如下：双链RNA在有义链的5’末端侧为平端，而且该有义链由25个核苷酸组成，该反义链由23个核苷酸组成；结构(B-1)如下：双链RNA在有义链的3’末端及反义链的3’末端具有分别由2个核苷酸组成的悬端，而且该有义链及反义链分别由21个核苷酸组成。
更具体而言，在上述(A-1)及(A-2)的结构中，有义链和反义链杂交，在末端不形成悬端。在上述(A-3)的结构中，有义链和反义链杂交，使双链RNA在有义链的5’末端为平端，并且从有义链3’末端起第1～2个核苷酸形成悬端。上述(B-1)的结构如下：从有义链5’末端起第1～19个核苷酸与反义链3’末端起第3～21个核苷酸杂交，使从有义链3’末端起第1～2个核苷酸和从反义链3’末端起第1～2个核苷酸分别形成悬端。
本发明的脂质修饰的双链RNA具有至少一个与从有义链的5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个连接的脂质。本发明的脂质修饰的双链RNA在除有义链5’末端区之外的其他任何部位都不存在取代基。更具体而言，除有义链的5’末端之外的任何区域及反义链中不存在取代基，这些区域由核苷酸组成。仅通过有义链的5’末端区域与脂质连接，可以提高细胞内导入率，并且可以发挥非常优异的RNA干涉效果。
与本发明的脂质修饰双链RNA的有义链连接的脂质没有特别的限制，其例子包括单纯脂质(脂肪酸与各种醇形成的酯)；磷脂、糖脂等复合脂质；脂肪酸、高级醇、脂溶性维生素、类固醇及烃等衍生脂质。为了提高细胞导入率及RNA干涉效果，使用的脂质优选为衍生脂质，较优选具有6～50个碳原子的脂肪酸，更优选具有10～22个碳原子的脂肪酸，特别优选具有12～18个碳原子的脂肪酸，进一步特别优选月桂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸，最优选棕榈酸。
脂质与有义链连接形成本发明的脂质修饰的双链RNA的方式没有特别的限制。脂质可以与有义链直接连接，或者也可以通过连接体与有义链连接。在本发明中，连接上述脂质与上述有义链的连接体不是由核酸组成的连接体。连接体没有特别的限制，只要上述脂质与上述有义链能够通过其连接即可。例如，可以使用具有下述结构的连接体作为连接体：
-O-Co-O-    (L-1)
-NH-CO-O-   (L-2)
-NH-CO-NH-  (L-3)
-NH-(CH2)n1-(L-4)
-S-(CH2)n1- (L-5)
-CO-(CH2)n1-CO-                  (L-6)
-CO-(CH2)n1-NH-                  (L-7)
-NH-(CH2)n1-NH-                  (L-8)
-CO-NH-(CH2)n1-NH-CO-            (L-9)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-CO-        (L-10)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-NH-C-(＝S)-   (L-11)
-CO-O-(CH2)n1-O-CO-              (L-12)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-CO-          (L-13)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-O-C-(＝S)-     (L-14)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-15)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-CO-         (L-16)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C-(＝S)-    (L-17)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO-             (L-18)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-CO-           (L-19)
-C(＝S)-O-(CH2)n1-NH-CO-         (L-20)
-C(＝S)-NH-(CH2)n1-O-C-(＝S)-    (L-21)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)-       (L-22)
-NH-(CH2CH2O)n2--CH2-            (L-23)
在上述结构式(L-4)～(L-21)中，n1为1～40的整数，优选为2～20的整数，更优选为2～12的整数。
在上述结构式(L-22)～(L-23)中，n2为1～20的整数，优选为1～10的整数，更优选为1～6的整数。
上述结构式(L-4)～(L-23)表示的连接体可以在其右侧或左侧与有义链连接。优选上述结构式(L-4)～(L-23)表示的连接体的右侧与上述有义链(或核酸结合物中的核酸)的特定位点连接，该连接体的左侧与脂质连接。
脂质与连接体的连接位点可以根据使用的脂质和连接体的类型进行适当选择。例如，当使用脂肪酸作为脂质时，可以通过脂肪酸的羧基与连接体之间形成的酯键、酰胺键或类似键进行连接。更具体而言，当使用脂肪酸作为脂质时，脂质优选通过脂肪酸的羧基的-OH被连接体取代而连接。
连接体根据所要连接的脂质的种类进行适当选择。使用脂肪酸作为脂质时，优选使用结构式(L-4)所代表的连接体。
除上述连接体之外，也可以使用其他连接体。其例子包括双官能连接体(含有两个官能团的连接体)，如N-琥珀酰亚胺基＝3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯、N-4-马来酰亚胺丁酸、S-(2-吡啶基二硫基)巯基乙胺、碘乙酸基琥珀酰亚胺、N-(4-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺、N-[5-(3’-马来酰亚胺丙酰胺)-1-羧戊基]亚氨基二乙酸、N-(5-氨基戊基)-亚氨基二乙酸等。在有义链中，与脂质或与用于连接脂质的连接体连接的核苷酸没有特别的限制，只要是从有义链的5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个核苷酸即可，但优选为从5’末端起第1～4个核苷酸中的至少一个核苷酸，更优选为从5’末端起第1及/或第2个核苷酸，特别优选在5’末端的核苷酸(从5’末端起第一个核苷酸)。
有义链与脂质或与用于连接脂质的连接体的连接位点没有特别的限制。优选通过取代有义链特定核苷酸的磷酸部分的羟基上的氢原子进行连接。
与本发明的脂质修饰的双链RNA连接的脂质的数量没有特别的限制。例如，可以连接1～3个脂质，优选为1～2个脂质，更优选为1个脂质。
本发明的脂质修饰的双链RNA可以如下制备：分别合成连接了至少一个脂质的有义链及反义链，按照公知的方法使上述有义链与反义链杂交。连接了脂质的有义链也可以根据公知的合成方法进行制备。
本发明的修饰的双链RNA可以被导入细胞内来抑制或减弱靶基因的表达，因此可以用作抑制或减弱靶基因表达的药物或基因治疗组合物，即药物组合物。本发明的药物组合物可以配制成各种剂型。本发明的药物组合物剂型的例子包括液体制剂，如液体(如糖浆剂)、滴剂及注射剂；固体制剂，如片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂及胶囊剂(如软胶囊)；等。本发明的药物组合物为液体制剂时，组合物可以冷冻保存或在通过冻干法等除去水分后进行保存等。冻干制剂及干糖浆剂等可以通过临用时加入注射用蒸馏水、无菌水等，以溶液的形式进行使用。本发明的药物组合物为固体制剂时，上述组合物可以通过临用时加入注射用蒸馏水、无菌水等，以溶液的形式进行使用。
上述药物组合物可以仅由脂质修饰的双链RNA组成，或者也可以根据需要进一步含有药学上可接受的载体。使用的载体只要不减弱本发明的修饰的双链RNA的靶基因表达抑制效果即可，没有特别的限制，而且可以根据剂型进行适当选择。可以使用的载体的例子包括纯水、糖水溶液、缓冲液、生理盐水、聚合物水溶液、不含RNase的水等。当本发明的药物组合物含有载体时，上述组合物中的成分的比例没有特别的限制，只要不减弱本发明的修饰的双链RNA的靶基因表达抑制及减弱效果即可，并且可以根据剂型进行适当选择。
例如，本发明的药物组合物可以含有0.001～50、较优选0.01～10、更优选0.1～1的量的修饰的双链RNA。基于组合物的总重量，本发明的药物组合物可以含有50～99.999重量％，优选90～99.99重量％，更优选99～99.9重量％的载体。
本发明的药物组合物所针对的靶基因及疾病没有特别的限制。靶基因与疾病之间的关系是公知的。导入本发明的药物组合物的细胞的类型没有特别的限制。使用的细胞可以为来自人的细胞或来自非人动物的细胞。本发明的药物组合物可以在体外或体内使用。
本发明的脂质修饰的双链RNA导入细胞的量及方法与常规的siRNA法相同。例如，当本发明的药物组合物用于在体外将脂质修饰的双链RNA导入细胞内时，可以采用在适量的药物组合物存在下培养细胞的方法。当本发明的药物组合物用于在体外将脂质修饰的双链RNA导入培养的细胞或从活体提取的细胞内时，可以将本发明的脂质修饰的双链RNA在血清存在下进行导入。当本发明的药物组合物用于在体内将脂质修饰双链RNA导入细胞时，可以采用下述方法：将药物组合物直接注射到组织内；静脉内、皮下、肌肉、腹膜内、眼内、胃肠道或牙齿注射；对鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；通过皮肤的经皮给与；通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜及子宫粘膜的经粘膜给与；及类似方法。
使用本发明的药物组合物时，可以任选地同时使用用来将siRNA转染到细胞中的公知的基因转染试剂。或者，本发明的药物组合物可以含有基因转染试剂。本发明的药物组合物中含有的脂质修饰的双链RNA即使在单独使用时也具有优异的细胞转染能力。因此，可以不使用用来将siRNA转运到细胞内的公知的基因转染试剂，或使用少量的基因转染试剂，将脂质修饰的双链RNA导入细胞内。
本发明的药物组合物可以以有效量进行使用，例如脂质修饰的双链RNA的导入量为每个细胞0.001～10pM，优选为0.001～1pM，更优选为0.01～0.1pM。
本发明的药物组合物可以抑制或减弱靶基因的表达，从而预防、改善或治疗由靶基因的表达而引起的疾病。
本发明进一步提供一种抑制靶基因表达的方法。上述抑制靶基因表达的方法包括将脂质修饰的双链RNA转染到细胞内。
如上所述，靶基因或疾病没有特别的限制，而且靶基因与疾病之间的关系是公知的。导入本发明的脂质修饰的双链RNA的细胞的类型没有特别的限制。使用的细胞可以为来自人的细胞或非人动物的细胞。本发明的脂质修饰的双链RNA可以在体外或体内导入。
在本发明的抑制靶基因表达的方法中，本发明的脂质修饰的双链RNA导入细胞的量及方法与常规siRNA法相同，而且可以进行适当选择。例如在本发明的抑制靶基因表达的方法中，为了将本发明的脂质修饰的双链RNA在体外导入细胞内，可以采用在适量的脂质修饰的双链RNA存在下培养细胞的步骤。在本发明的抑制靶基因表达的方法中，为了将脂质修饰的双链RNA在体外导入培养的细胞内或从活体提取的细胞内，可以采用在血清存在下将本发明的脂质修饰的双链RNA导入细胞内的步骤。在本发明的抑制靶基因表达的方法中，为了将上述脂质修饰的双链RNA在体内导入细胞内，可以采用如下所述的步骤：将本发明的脂质修饰的双链RNA直接注射到组织内；静脉内、皮下、肌肉、腹膜内、眼内、胃肠道或牙齿等注射；对鼻腔、口腔、肺等吸入给与；口服给与；通过皮肤的经皮给与；通过口腔粘膜、阴道粘膜、眼粘膜、直肠粘膜及子宫粘膜的经粘膜给与；以及类似步骤。通过使有效量的脂质修饰的双链RNA与细胞接触，本发明的脂质修饰的双链RNA可以被导入细胞内。例如，以每个细胞0.001～10pM、优选0.001～1pM、更优选0.01～0.1pM的量给与脂质修饰的双链RNA。
本发明的脂质修饰的双链RNA即使在单独使用时也具有优异的细胞转染能力。因此，可以不使用公知的基因转染试剂或使用少量的基因转染试剂将脂质修饰的双链RNA导入细胞内。
本发明的抑制靶基因表达的方法可以抑制或减弱靶基因的表达，从而预防、改善或治疗由靶基因的表达引起的疾病。
实施例
以下参考实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：5’脂质修饰的双链RNA对萤光素酶基因表达的抑制效果
1.针对萤光素酶基因的脂质修饰的双链RNA的合成
1-1.有义链及反义链的序列
设计含有21～27个碱基长度的有义链及21～27个碱基长度的反义链的双链RNA，所述双链RNA具有与海肾萤光素酶相同的序列，并且能够抑制海肾萤光素酶基因的表达。该双链RNA根据反义链与有义链的组合可以形成各种形式的双链。给予这些双链RNA以下名称。“DS(双链)RNA”：不具有悬端(单链区域)的完全双链RNA(即，在有义链的5’末端侧及3’末端侧均具有平端的双链RNA)；“Si RNA”：在双链RNA的两末端具有悬端(突出端)的双链RNA；“RO(右侧突出端)RNA”：当有义链的5’末端侧表示在左侧时，仅在右侧具有悬端的双链RNA。各种双链RNA的命名如下进行区别：将有义链称为“A”(A1或A2)，将反义链称为“B”，并且标出每个单链RNA即有义链及反义链的碱基的数量。由于设计了两种类型的有义链，所以为了区别将其分别命名为“A1”及“A2”。对于在有义链的5’末端区域用脂质修饰的双链RNA，在各有义链的名称之后标明Cx(x＝16或12)。使用的RNA序列如下所述。
有义链：
27nt 27A 1：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3’(序列号：1)
25nt 25A 1：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGC-3’(序列号：2)
23nt 23A 1：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’(序列号：3)
21nt 21A1：5’-CUGGCCUUUCACUACUCCUAC-3’(序列号：4)
21nt 21A2：5’-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3’(序列号：5)
反义链：
27nt 27B：5’-GUGCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’(序列号：6)
25nt 27B：5’-GCUCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’(序列号：7)
23nt 27B：5’-UCGUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’(序列号：8)
21nt 27B：5’-GUAGGAGUAGUGAAAGGCCAG-3’(序列号：9)
1-2.针对萤光素酶基因的脂质未修饰的双链RNA的合成
使用上述列举的有义链及反义链制备各种双链RNA。各双链RNA如下制备，即在通用缓冲液(林化成株式会社)中混合等摩尔量的有义链及反义链，在92℃下加热上述混合物2分钟，缓慢降低温度至4℃。上述得到的各种双链RNA使用20％聚丙烯酰胺凝胶在250V的条件下进行电泳60分钟，之后用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)通过染色进行确认。图1A表示未修饰的双链RNA的结构。
1-3.针对萤光素酶基因的脂质修饰的双链RNA的合成
合成脂质修饰的有义链，其中脂质与能够抑制萤光素酶基因表达的双链RNA的有义链的5’末端连接。在该脂质修饰的有义链中，脂质通过与上述有义链的5’末端连接的氨烷基(氨基修饰剂C6；Glen Research)共价连接。脂质修饰的有义链如下合成：在液相中使具有活性酯基团的脂质化合物(以下称作“含有活性酯的脂质化合物”)与对5’末端进行氨基化修饰的有义链反应(反应式1、2)。
反应式1
Figure GPA00001113346700161
反应式2
Figure GPA00001113346700162
具体的合成过程如下所述。为了将有义链的5’末端氨基化，可以在RNA固相合成上使用5’-氨基修饰剂C6(Glen Research)进行常规方法(亚磷酰胺合成法)，由此可以合成5’末端用氨烷基修饰的有义链(21个碱基长度)。经HPLC纯化并且进行了MALDI-TOF MS分析的上述5’末端用氨烷基修饰的有义链购自林化成株式会社。得到的5’末端用氨烷基修饰的有义链具有与5’末端(从5’末端起第1个核苷酸的磷酸残基)连接的-(CH2)6-NH2。通过使用UV分光计测定260nm的吸光度，确定得到的单链RNA的浓度。在缩合反应条件下，将上述用氨烷基修饰的单链RNA与溶解在DMF(N，N’-二甲基甲酰胺)中的含有活性酯的脂质化合物(棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma-Aldrich)或月桂酸-4-硝基苯基酯(TCI))混合，合成脂质修饰的有义链。反应后，为了除去含有脂质修饰的有义链的反应液中不需要的试剂，通过HPLC纯化反应液。HPLC纯化如下进行：使用缓冲液A：100％20mM TEAA(pH7.0)及缓冲液B：70％CH3CN/20mM TEAA(pH7.0)，在50分钟内从10％缓冲液B至100％缓冲液B的线性梯度。使用CAP CELL(4.6×150mm、5μm；Shiseido)作为纯化柱。示例性的HPLC分析结果示于图2。将通过HPLC纯化的脂质修饰的有义链冻干，使之溶解在纯水中，然后通过UV光谱分析确定其浓度及合成收率。
以下表示得到的脂质修饰的有义链的结构模型及收率。
Figure GPA00001113346700171
得到的脂质修饰有义链与反义链配对，得到脂质修饰的双链RNA。双链RNA的形成按照与上述同样的方法进行，通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行确认。脂质修饰的双链RNA的结构示于图1B。在图1B中，连接棕榈酸衍生物时X为16，连接月桂酸衍生物时X为12。
2.脂质修饰的双链RNA的降解酶抗性
评价脂质修饰的27nt dsRNA(Ds 27A1C16/27B)的核酸酶抗性。首先，在37℃下在含有10％FBS(三光纯药株式会社)的RPMI-1640培养基(Invitrogen)(最终体积为110μl)中，温育调节至最终浓度为2μM的、在有义链的5’末端用脂质修饰的27nt dsRNA。在0小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时及48小时后分别取10μl等份，将其加入含有2μl加样染料的样品管中。然后，为了终止降解反应，将采集后的样品迅速在液氮中冻干，并且在-20℃下保存。将得到的样品产物在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(Alpha Innotech公司)进行凝胶分析。作为对照，也同样对通常广泛使用的21个碱基长度的21siRNA(si 21A2/21B)及未修饰的27nt dsRNA(Ds 27A1/27B)的核酸酶抗性进行评价。凝胶电泳的结果示于图3。
结果，21siRNA在含有血清的培养基中迅速降解，并在1～2小时左右证实21siRNA消失。另一方面，未修饰的27nt dsRNA及脂质修饰的27nt dsRNA与21siRNA相比具有非常高的核酸酶抗性，甚至在48小时后这些双链RNA仍然存在。由上述结果可以得到下述新的发现：脂质修饰的双链RNA与通常广泛使用的21siRNA相比具有明显更高的体内稳定性。
3.利用切酶对针对萤光素酶基因的脂质修饰的双链RNA的加工
评价重组切酶对合成的双链RNA及脂质修饰的双链RNA的加工。切酶切割试验如下所述地进行。在20mM Tris-HCl(pH为8.0)、15mMNaCl及2.5mM MgCl2的溶液中，在样品管中准备10μl 0.5U重组切酶(Gene Therapy Systems)及将最终浓度调节至2μM的未修饰的双链RNA或脂质修饰的双链RNA，然后在37℃的培养箱中温育样品12小时。之后为了终止切酶的切割反应，向反应液中加入2μl切酶终止溶液(Gene Therapy Systems)，再加入2μl加样染料。将得到的样品产物在250V下使用20％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳70分钟。之后，用银染色试剂盒(GE Health Care Bioscience)对产物进行染色(染色条件参见产品手册)，用ChemiImager 4000(Alpha Innotech公司)进行凝胶分析。作为对照，对未修饰的21siRNA(si21A2/21B)也进行电泳分析。上述结果示于图4。
结果表明，在Ds RNA(Ds 27A1/27B、Ds 25A1/25B、Ds 23A1/23B及Ds 21A1/21B)的有义链用脂质修饰的双链RNA中，通过重组切酶的作用，Ds 27A1C16/27B及Ds 27A1C12/27B在与未修饰的21siRNA相似的位置观察到条带，强有力地表明通过切酶切割产生了具有2个碱基悬端的21个碱基长度的siRNA。另外，对于Ds 25A1C 16/25B及Ds23A1C16/23B，在切酶存在下在与21siRNA相似的位置观察到新的条带，表明其被切酶加工。另一方面，对于Ds 21A1C16/21B，在切酶存在下没有观察到显著的变化，表明其没有被切酶加工。
另外，对于在有义链的3’末端区域各具有2个碱基悬端的RO RNA(RO 27A1/25B、RO 25A1/23B、RO 23A1/21B及RO 21A1/19B)的有义链用脂质修饰的双链RNA，类似地评价其被切酶的加工。结果，对于RO 27A1C16/25B、RO 25A1C16/23B及RO23A1C16/21B这三种类型，在切酶存在下在与21siRNA相似的位置观察到新的条带，表明其被切酶加工。特别是证明了RO 27A1C16/25B及RO 25A1C16/23B有显著的切酶加工效果。另一方面，对于比较短的RO 21A1C16/19B，即使在切酶存在下也没有观察到双链RNA发生变化，提示其没有被切酶加工。
进而，对于在有义链的3’末端区域具有4个碱基悬端的RORNA(RO27A1/23B及RO 25A1/21B)的有义链用脂质修饰的双链RNA、以及在有义链的3’末端区域具有6个碱基悬端的RO RNA(RO 27A1/21B)的有义链用脂质修饰的双链RNA，评价其被切酶的加工。结果，上述全部RO RNA均被切酶加工，在与21nt siRNA相同的位置观察到新的条带。
进而，对于在反义链的5’末端区域具有悬端的RO RNA(RO25A1/27B、RO23A1/25B及RO23A1/27B)的有义链用脂质修饰的双链RNA，类似地评价其被切酶的加工。结果，对于一部分在反义链的5’末端区域具有悬端的脂质修饰的RO RNA，观察到切酶加工产生的条带，但同时与不存在切酶时相比在相似的位置观察到条带，表明切酶的加工速度低于对Ds RNA和其他RO RNA的加工速度。
4.脂质修饰的双链RNA对萤光素酶基因表达的抑制
使用海肾萤光素酶作为靶标评价了合成的未修饰双链RNA及脂质修饰的双链RNA的RNA干涉效果。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入不合抗生素的新培养基，每孔80μl，将表达萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶的载体(psiCHECKTM-2Vector：Promega)和LipofectamineTM2000(商品名；Invitrogen)的复合溶液各10μl分别加入含有HeLa细胞的孔中。调节表达载体使每个孔为0.02μg，另外，调节LipofectamineTM2000使每个孔为0.2μl，使用OptiMem(Invitrogen)调节体积至所需量。为了形成复合体，使用OptiMem将表达载体与LipofectamineTM2000混合，然后将上述混合物在室温下温育30分钟。加入复合溶液后，在5％CO2存在下，于37℃培养细胞4小时。培养之后，含有与海肾萤光素酶的基因序列同源的反义序列的未修饰双链RNA及末端用脂质修饰的双链RNA与LipofectamineTM 2000(Invitrogen)复合，最终浓度为0nM、0.2nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM，将各10μl得到的复合溶液添加到导入了表达载体的HeLa细胞中。使每个孔的最终体积为100μl。各种RNA与LipofectamineTM 2000的复合溶液如下制备：混合每个孔5μl的RNA水溶液和每个孔5μl的LipofectamineTM 2000(0.2μl)及OptiMem的溶液，将上述混合溶液在室温下温育30分钟。导入RNA后，培养细胞48小时，使用Dual-GloTM萤光素酶分析系统(Promega)和发光计(MicroLumat LB96p、Berthold)测定萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶的表达水平，并以萤火虫荧光素酶的表达水平为对照确定对海肾萤光素酶表达的抑制效果。
图5表示未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA的浓度为0.2nM时对基因表达的抑制效果。结果发现用脂质修饰在有义链5’末端侧含有平端的双链RNA如Ds RNA和RO RNA时，证明这些双链RNA比未经脂质修饰的同样结构的双链RNA显示出显著提高的RNA干涉效果。还发现与RO RNA中悬端的链长和位置无关，通过用脂质修饰有义链的5’末端，与未修饰的具有相同结构的RO RNA相比，得到高的RNA干涉效果。上述结果得到新的发现：用脂质修饰在DS RNAs和RO RNA之类有义链的5’末端含有平端的RNA干涉分子的有义链5’末端，可以显著地提高RNA干涉效果。此外，也发现用脂质修饰21nt siRNA的有义链5’末端得到的si 21A2C16/21B及si 21A2C12/21B比未修饰的21ntsiRNA具有更强的RNA干涉效果。
5.针对萤光素酶基因的脂质修饰的双链RNA的RNA干涉效果(不使用 基因转染剂)
不使用如LipofectamineTM 2000等任何基因转染剂，将脂质修饰的双链RNA单独转染到细胞内，并且评价其是否显示RNA干涉效果。
将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)接种在96孔板上，每孔为100μl，在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入不含抗生素的新培养基，每孔为80μl，将表达萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶的载体(psiCHECKTM-2Vector：Promega)与LipofectamineTM 2000(商品名；Invitrogen)的复合溶液各10μl分别加入含有HeLa细胞的孔中。调节表达载体使每个孔为0.02μg，另外，调节LipofectamineTM 2000使每个孔为0.2μl，使用OptiMem(Invitrogen)将其体积调节为所需量。为了形成复合体，使用OptiMem将表达载体与Lipofectamine TM 2000混合，然后将上述混合物在室温下温育30分钟。加入复合溶液后，在5％CO2存在下，于37℃培养细胞4小时。然后为了从孔中除去LipofectamineTM2000，用100μl培养基清洗每个孔各3次。之后将含有90μl抗生素的培养基加入到细胞中，用OptiMem调节含有与海肾萤光素酶基因序列同源的反义序列的未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA，以制备样品，最终浓度为0nM、25nM、50nM、100nM、200nM、400nM、600nM、800nM及1μM，将各10μl得到的样品加入到细胞中，在37℃下培养48小时。使用Dual-GloTM萤光素酶分析系统(Promega)和发光计(MicroLumatLB96p；Berthold)测定萤火虫萤光素酶及海肾萤光素酶的表达水平。作为对照，在上述相同条件下也评价未修饰的21nt siRNA(si 21A2/21B)和27nt dsRNA(Ds 21A1/27B)的RNA干涉效果。
通过以萤火虫萤光素酶的表达水平为对照评价海肾萤光素酶的表达水平，确定RNA干涉效果。图6A表示最终浓度为50nM～1μM时的si 21A2/21B、Ds 27A1/27B、Ds 27A1C16/27B的结果，图6B表示最终浓度为25nM～800nM时的Ds 23A1/23B和Ds 23A1C16/23B的结果。结果表明，在有义链的5’末端区域用棕榈酸修饰的Ds 27A1C16/27B及Ds 23A1C16/23B以依赖于双链RNA浓度的方式抑制海肾萤光素酶的表达；因此，这些双链RNA由于用棕榈酸进行了修饰，被单独转染到细胞内，由此产生RNA干涉反应。另一方面，确认未修饰的双链RNA(si21A2/21B、Ds 27A1/27B及Ds 23A1/23B)即使在高浓度下也不显示明显的基因表达抑制效果。这进一步证明了用棕榈酸修饰的双链RNA具有非常优异的细胞内导入率，并且在不使用基因转染试剂的情况下也具有优异的基因表达抑制能力。
6.脂质修饰的双链RNA的细胞导入率的评价
将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)、A549细胞(人肺癌细胞；东北大学老年医学研究所)、SH10-TC细胞(人胃癌细胞；东北大学老年医学研究所)及实验前调节至2×105细胞/ml的Jurkat细胞(急性淋巴性白血病细胞；东北大学老年医学研究所)、K-562细胞(慢性骨髓性白血病细胞)接种到24孔板中，每孔1ml，在含有10％胎牛血清(FBS；三光纯药株式会社)及抗生素的培养基中，在5％CO2存在下、于37℃培养细胞。关于此处使用的抗生素及培养基，细胞均使用链霉素作为抗生素，HeLa细胞使用MEM培养基(Invitrogen)作为培养基，其他细胞使用RPMI-1640(Invitrogen)作为培养基。在荧光标记的寡核苷酸转染前，将上述培养基更换为不含抗生素的培养基(450μl)。使用在27nt反义链的5’末端区域用6-FAM标记的寡核苷酸作为荧光标记的寡核苷酸，该寡核苷酸与未修饰的27nt有义链或在5’末端区域用脂质修饰的27nt有义链配对形成双链。细胞导入率实验如下进行。为了形成荧光标记的寡核苷酸与LipofectamineTM2000(Invitrogen)的复合体，将10μl 10μM荧光标记的寡核苷酸的水溶液与15μl OptiMem溶液的混合溶液25μl和2μlLipofectamineTM2000(Invitrogen)溶液与23μl OptiMem溶液的混合溶液25μl混合在一起得到50μl混合溶液，将上述混合溶液在室温下温育30分钟。不使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen)时(图7中的F；-LF2000)，在上述复合体形成条件下使用OptiMem溶液代替2μl的LipofectamineTM 2000溶液，并按照同样的操作制备样品。将得到的50μl荧光标记的寡核苷酸复合体加入到450μl上述制备得到的细胞(双链RNA的最终浓度为200nM)中，在5％CO2存在下、于37℃培养4小时。之后，用PBS(-)或培养基清洗细胞3次，使用共聚焦荧光激光显微镜及流式细胞术评价双链RNA的细胞导入率。
在利用共聚焦荧光激光显微镜进行的评价中，使用Radiance 2000系统(Bio Rad)，并利用氩激光观察荧光。在流式细胞术中，使用coulterEPICS XL细胞计数器(Beckman coulter)测定每10,000个细胞的细胞导入率。在流式细胞分析中使用XL EXPO32TM软件(Beckman coulter)。
上述结果示于图7-1～7-3。图7-3中的F(-LF2000)表示不使用LipofectamineTM 2000时的结果，图7-1～7-3中的A～E(+LF2000)表示使用LipofectamineTM 2000作为基因转染剂时的结果。图7-1中的A表示使用LipofectamineTM 2000作为基因转染试剂时各种双链RNA向HeLa细胞内的细胞导入率的结果；图7-1中的B表示A549细胞的结果；图7-2中的C表示SH10-TC细胞的结果；图7-2中的D表示K-562细胞的的结果；图7-3中的E表示Jurkat细胞的结果。图7-3中的F表示不使用市售的基因转染试剂时各种双链RNA向HeLa细胞内的细胞导入率结果。结果确认在LipofectamineTM 2000存在下未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA转染到所有细胞(HeLa细胞、A549细胞、SH10-TC细胞、Jurkat细胞及K-562细胞)内。特别是对于在有义链的5’末端用棕榈酸修饰的Ds 27A1C 16/27B，与未修饰的双链RNA及用月桂酸修饰的双链RNA相比，使用共聚焦荧光激光显微镜及流式细胞术观察到非常高的细胞导入率。另外，使用共聚焦荧光激光显微镜进行的观察显示用棕榈酸修饰的双链RNA积极地局部化到细胞的细胞质中。特别是在粘附细胞(HeLa细胞、A549细胞及SH10-TC细胞)中，这种导入率非常明显。此外，流式细胞分析证实，在LipofectamineTM2000存在下，用棕榈酸修饰的双链RNA也具有比未修饰的双链RNA更高的细胞导入率。上述结果可以得到下述发现：当双链RNA在有义链的5’末端区域与棕榈酸等脂质共价连接时，双链RNA可以显示出显著提高的细胞导入率，并且可以局部化到细胞的细胞质中。
实施例2：5’脂质修饰的双链RNA对VEGF基因表达的抑制效果
1.针对VEGF基因的脂质修饰的双链RNA的合成
1-1.有义链及反义链的序列
设计含有27个或21个碱基长度的有义链和27个或21个碱基长度的反义链的双链RNA，所述双链RNA具有与VEGF(血管内皮生长因子)同源的序列、且能够抑制VEGF基因的表达。使用上述双链RNA进行以下实验。27nt dsRNA为不合悬端(单链区域)的完全双链RNA(即，在有义链的5’末端侧及3’末端侧均具有平端的双链RNA)，21siRNA为在有义链及反义链两者的3’末端具有2个碱基悬端的双链RNA。使用的27nt dsRNA及21siRNA的序列如下所述。
27nt dsRNA：
有义链：v27A：5’-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3’(序列号：10)
反义链：v27B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5’(序列号：11)
21siRNA：
有义链：v21A：5’-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3’(序列号：12)
反义链：v21B：3’-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5’(序列号：13)。
1-2.针对VEGF基因的脂质未修饰的双链RNA的合成
按照与实施例1同样的方法将上述有义链及反义链进行退火，形成双链，从而产生脂质未修饰的双链RNA。按照与实施例1相同的方法，通过20％丙烯酰胺凝胶电泳确认双链的形成。
1-3.针对VEGF基因的脂质修饰的双链RNA的合成
合成脂质修饰的双链RNA，其中脂质连接到能够抑制VEGF基因表达的上述双链RNA的有义链的5’末端。在脂质修饰的双链RNA中，脂质通过连接到上述有义链的5’末端的氨烷基(氨基修饰剂C6、GlenResearch)共价连接。按照与实施例1相同的方法合成脂质修饰的单链RNA(有义链)。
针对VEGF基因的脂质修饰的RNA的结构模型及收率如下所述。
Figure GPA00001113346700251
得到的脂质修饰的有义链与反义链配对形成脂质修饰的双链RNA。双链的形成按照与实施例1相同的方法，通过20％丙烯酰胺凝胶电泳进行确认。图8表示脂质修饰的双链RNA的结构。在针对VEGF基因的脂质修饰的RNA中，洗脱时间也与实施例1基本相同。
2.利用切酶对针对VEGF基因的脂质修饰的双链RNA的加工
评价重组切酶对合成的脂质未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA的加工。按照与实施例1相同的方法进行切酶切割实验。结果示于图9。
结果对于Ds v27AC16/v27B及Ds v27AC12/v27B，通过重组切酶的作用，在与未修饰21siRNA相似的位置观察到条带，因此强有力地表明通过切酶切割生成含有2个碱基悬端的21个碱基长度的siRNA。上述结果确认27nt dsRNA有义链的5’末端与脂质连接不会妨碍切酶加工。在另一方面，对于si v21AC16/v21B及si v21AC12/v21B，在切酶存在下与切酶不存在下相比，没有观察到变化，表明其没有被切酶加工。
3.脂质修饰的双链RNA对VEGF基因表达的抑制
使用HeLa细胞(人子宫颈癌细胞；东北大学老年医学研究所)、A549细胞(人肺癌细胞；东北大学老年医学研究所)、SH10-TC细胞(人胃癌细胞；东北大学老年医学研究所)、Jurkat细胞(急性淋巴性白血病细胞；东北大学老年医学研究所)及K-562细胞(慢性骨髓性白血病细胞；东北大学老年医学研究所)，评价具有未修饰末端的21ntsiRNA、具有未修饰末端的27nt dsRNA、在有义链的5’末端用脂质修饰的27nt dsRNA(在末端用脂质修饰的27nt dsRNA)及在有义链的5’末端用脂质修饰的21nt siRNA(在末端用脂质修饰的21nt siRNA)对VEGF基因表达的抑制效果。另外，也类似地评价了不具有与VEGF基因同源的基因序列的双链RNA(27nt dsRNA(随机)和21nt siRNA(随机))及这些双链RNA有义链的5’末端与脂质连接的脂质修饰的双链RNA。
按以下操作进行实验。将实验前调节至1×105细胞/ml的HeLa细胞、A549细胞及SH10-TC细胞，以及实验前调节至2×105细胞/ml的Jurkat细胞及K-562细胞接种在24孔板上，每孔500μl，将其在37℃下培养一夜。次日，除去孔中的旧培养基，加入不含抗生素的新培养基，每孔450μl。HeLa细胞使用MEM培养基，其他细胞使用PRMI-1640培养基。含有与VEGF基因序列同源的反义序列的未修饰或脂质修饰的双链RNA(25μl)与LipofectamineTM2000溶液(Invitrogen)(25μl)形成复合体，然后将各50μl双链RNA溶液加入到450μl上述细胞中。使每个孔中的最终体积为500μl。每种RNA与LipofectamineTM2000溶液的复合溶液如下制备：将每孔25μl的RNA水溶液与每孔25μl的LipofectamineTM2000(2μl)和OptiMem溶液混合，将上述混合溶液在室温下温育30分钟。导入RNA后，在5％CO2存在下、于37℃培养细胞48小时。培养后，将细胞用PBS(-)清洗3次，使用RNeasy PlusMini试剂盒(Qiagen)提取细胞中的总RNA。接下来为了测定VEGF中mRNA的量进行RT-PCR反应。使用Qiagen OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行RT-PCR反应，使用5’-CCC TGA TGA GAT CGA GTACAT CTT-3’(序列号：14)及5’-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3’(序列号：15)作为用于VEGF的PCT引物。作为对照，按照同样的方法测定GAPDH基因。使用5’-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3’(序列号：16)及5’-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3’(序列号：17)作为用于GAPDH的引物。RT-PCR反应如下进行。在50℃下进行RT(逆转录)反应30分钟，进行PCR反应，该PCR反应包括在92℃下进行30秒的双链分离反应、在55℃下进行30秒的退火反应、在68℃下进行45秒的延伸反应，重复进行25～28个循环(依赖于使用的细胞)。最后在68℃下温育10分钟，使温度降低至4℃，结束反应。根据Qiagen OneStepRT-PCR试剂盒(Qiagen)的反应条件准备用于RT-PCR的试剂、总RNA、引物等。RT-PCR反应后，加入2μl加样染料，使用2％琼脂糖凝胶确认由VEGF及GAPDH的mRNA产生的RT-PCR产物。基因表达的抑制效果如下进行评价：假定对照细胞(未转染双链RNA的细胞)中的VEGF基因表达水平为100％，测定转染了双链RNA(包括未修饰的和修饰的)的细胞中的VEGF表达水平。细胞间表达水平的误差根据对照基因(GAPDH)的基因表达水平进行修正。
图10-1～10-3表示当以VEGF为靶标并且双链RNA的浓度为200nM时，未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA的RNA干涉效果的结果。图10-1中的A图表示未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA对HeLa细胞中的VEGF基因表达的抑制效果；图10-2中的B图表示A549细胞的结果；图10-2中的C图表示SH10-TC细胞中的结果；图10-3中的D图表示Jurkat细胞的结果；图10-3中的E图表示K-562细胞的结果。上述结果表明通过用脂质修饰27个碱基长度的双链RNA(Ds v27A/v27B)有义链的5’末端获得的Ds v27AC16/v27B及Dsv27AC12/v27B、及通过用脂质修饰21个碱基长度的双链RNA(siv21A/v21B)有义链的5’末端获得的si v21AC16/v21B及siv21AC12/v21B与未修饰的双链RNA(si v21A/21B和Ds v27A/v27B)相比，具有非常高的VEGF基因表达抑制效果。特别是在全部细胞(HeLa细胞、A549细胞、SH10-TC细胞、Jurkat细胞及K-562细胞)中，用棕榈酸修饰的Ds v27AC16/v27B与未修饰的双链RNA(si v21A/21B和Ds v27A/v27B)相比，显示出明显更高的基因表达抑制效果。这证实了通过用棕榈酸等脂质修饰双链RNA可以显著地提高RNA干涉效果。同样地也评价了不具有与VEGF基因同源的基因序列的未修饰的双链RNA及脂质修饰的双链RNA的基因表达抑制效果，但这些双链RNA均未显示出任何明显的VEGF基因抑制效果。上述结果表明此处使用的针对VEGF的双链RNA以高度序列特异性的方式抑制靶基因的表达，还表明通过将双链RNA与脂质连接可以降低对细胞的副作用。
附图说明
图1表示实施例1中合成的未修饰及脂质修饰的双链RNA的结构。
图2表示实施例1中对脂质修饰的单链RNA进行的HPLC分析的结果。
图3表示实施例1中测定的5’末端用脂质修饰的双链RNA的核酸酶抗性。
图4表示实施例1中各脂质修饰的双链RNA被切酶加工的评价结果。
图5表示实施例1中浓度为0.2nM的脂质修饰的27nt dsRNA的RNA干涉效果的评价结果。
图6表示实施例1中5’末端用脂质修饰的双链RNA的RNA干涉效果的评价结果(不使用基因转染剂)。
图7-1表示实施例1中脂质修饰的双链RNA向HeLa及A549细胞内的细胞导入的评价结果；其中，“FL”表示用荧光显微镜拍摄的图像；“Trans”表示用相差显微镜拍摄的与上述FL图像同一视野的图像；“Merge”表示重叠上述FL图像与Trans图像得到的图像。
图7-2表示实施例1中脂质修饰的双链RNA向SH10-TC及K562细胞内的细胞内导入的评价结果；其中，“FL”表示用荧光显微镜拍摄的图像；“Trans”表示用相差显微镜拍摄的与上述FL图像同一视野的图像；“Merge”表示重叠上述FL图像与Trans图像得到的图像。
图7-3表示实施例1中脂质修饰的双链RNA向Jurkat及HeLa细胞内的细胞导入的评价结果；其中，“FL”表示用荧光显微镜拍摄的图像；“Trans”表示用相差显微镜拍摄的与上述FL图像同一视野的图像；“Merge”表示重叠上述FL图像与Trans图像得到的图像。
图8表示实施例2中合成的未修饰及脂质修饰的双链RNA的结构。
图9表示实施例2中各脂质修饰的双链RNA被切酶加工的评价结果。
图10-1表示实施例2中脂质修饰的双链RNA对HeLa细胞中VEGF基因的RNA干涉效果的评价结果。
图10-2表示实施例2中脂质修饰的双链RNA对A549及SH10-TC细胞中VEGF基因的RNA干涉效果的评价结果。
图10-3表示实施例2中脂质修饰的双链RNA对Jurkat及K567细胞中VEGF基因的RNA干涉效果的评价结果。
序列表
<110>独立行政法人产业技术综合研究所
<110>大塚制药株式会社
<110>林化成株式会社
 
<120>具有强RNA干涉效果的脂质修饰的双链RNA
 
<130>P08-117
 
<150>JP 2007-276985
<151>2007-10-24
 
<160>17
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>27
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>27nt 27A1的序列
 
<400>1
cuggccuuuc acuacuccua cgagcac    27
 
<210>2
<211>25
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>25nt 25A1的序列
 
<400>2
cuggccuuuc acuacuccua cgagc     25
 
<210>3
<211>23
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>23nt 23A1的序列
 
<400>3
cuggccuuuc acuacuccua cga      23
 
<210>4
<211>21
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>21nt 21A1的序列
 
<400>4
cuggccuuuc acuacuccua c        21
 
<210>5
<211>21
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>21nt 21A2的序列
 
<400>5
ggccuuucac uacuccuacg a        21
<210>6
<211>27
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>27nt 27B的序列
 
<400>6
gugcucguag gaguagugaa aggccag    27
<210>7
<211>25
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>25nt 27B的序列
 
<400>7
gcucguagga guagugaaag gccag      25
 
<210>8
<211>23
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>23nt 27B的序列
 
<400>8
ucguaggagu agugaaaggc cag       23
 
<210>9
<211>21
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>21nt 27B的序列
 
<400>9
guaggaguag ugaaaggcca g         21
 
<210>10
<211>27
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>v27A的序列
 
<400>10
cuuccuacag cacaacaaau gugaaug   27
<210>11
<211>27
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>v27B的序列
 
<400>11
gaaggauguc guguuguuua cacuuac    27
 
<210>12
<211>21
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>v21A的序列
 
<400>12
uccuacagca caacaaaugu g       21
 
<210>13
<211>21
<212>RNA
<213>人工
 
<220>
<223>v21B的序列
 
<400>13
gaaggauguc guguuguuua c       21
 
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>用于VEGF的PCR引物-1
 
<400>14
ccctgatgag atcgagtaca tctt    24
 
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>用于VEGF的PCR引物-2
 
<400>15
accgcctcgg cttgtcac           18
 
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>用于GAPDH的PCR引物-1
 
<400>16
ggaaagctgt ggcgtgatg          19
 
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>用于GAPDH的PCR引物-2
 
<400>17
ctgttgctgt agccgtattc         20

Claims (14)

1.一种脂质修饰的双链RNA，其包含具有与靶基因中的靶序列互补的核苷酸序列的有义链，及具有与所述有义链互补的核苷酸序列的反义链，所述双链RNA能够抑制所述靶基因的表达，并且所述有义链具有直接或通过连接体连接到从5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个上的脂质。
2.如权利要求1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧为平端，并且在有义链的3’末端侧为平端或具有悬端。
3.如权利要求1所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均具有悬端。
4.如权利要求1～3中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中所述有义链由21～27个核苷酸组成。
5.如权利要求2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，并且有义链及反义链各自由27个核苷酸组成。
6.如权利要求2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧及3’末端侧均为平端，并且有义链及反义链各自由23个核苷酸组成。
7.如权利要求2所述的脂质修饰的双链RNA，其在有义链的5’末端侧为平端，有义链由25个核苷酸组成，且反义链由23个核苷酸组成。
8.如权利要求3所述的脂质修饰的双链RNA，其中有义链及反义链各自由21个核苷酸组成。
9.如权利要求1～8中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中所述脂质为具有6～50个碳原子的脂肪酸。
10.如权利要求1～9中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中所述脂质为月桂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸或棕榈酸。
11.如权利要求1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA，其中所述脂质通过连接体与从有义链的5’末端起第1～6个核苷酸中的至少一个连接，所述连接体由下述结构式表示
-NH-(CH2)n1-  (L-4)
其中，n1为1～40的整数。
12.一种药物组合物，含有权利要求1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA及药学上可接受的基质。
13.权利要求1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA在制备用于抑制靶基因表达的药物组合物中的应用。
14.一种抑制靶基因表达的方法，包括将权利要求1～10中任一项所述的脂质修饰的双链RNA导入细胞来抑制靶基因的表达。
CN200880113141A 2007-10-24 2008-10-24 具有强rna干涉效果的脂质修饰的双链rna Pending CN101835497A (zh)

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