TW200808351A - Cell death-inducing agents - Google Patents

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200808351 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於HLA-辨識抗體及包括作為活性成份的這 些抗體之細胞死亡誘導試劑。 【先前技術】 HLA為免疫反應中一個很重要的分子，其牵涉辨識外源 抗原、細菌、病毒感染之細胞等外來物並消滅它們。該Η[α 分子由大約8-10個胺基酸所組成，其最主要角色是代表 CD8+T細胞胞内產生之抗原胜肽，因此，它在由胜肽存在引 起之免疫反應及免疫耐受性（immune tolerance)扮演非常 重要角色。HLA分子被分成I型及Π型。I型分子由12 一 kd点2-微球蛋白（冷2M)及包含三個區域，α1-3,組成之雜二聚 體（heterodimer ) 。11型分子由30 - 34 KD包含兩區域， αΐ及α2，之α-鏈及26 - 29 KD包含兩區域，αι及α2, 之β鏈組成之雜二聚體。亦知HLA I型（HLA-Ι)可進一步分 成HLA-A、B、C等（之後HLA-A亦稱為“HLA IA型 (HLA-IA)” ）。 至今，已有關細胞生長抑制及細胞死亡誘導作用已在 淋巴細胞的報導，其以抗-HLA IA型抗體接合，隱喻hla分 子可月b為息傳遞分子。舉例來說’已知活化淋巴細胞之 細胞生長為抗人類HLA IA型αΐ區域之B9.12.1抗體、 抗α2區域之W6/32抗體及抗α3區域之ΤΡ25.99和Α1.4 抗體所抑制（非專利文獻1及2)。此外，抗α 1區域之兩抗 體，MoAb90及ΥΤΗ862，誘導活化淋巴細胞凋亡已報導（非專 2125-8963-PF 5 200808351 利文獻2、3及4)。這兩抗體誘導凋亡為凋亡蛋白酶Caspase (Cysteine asparate protease，半胱胺酸蛋白酶）介導 反應（非專利文獻4)，因此，淋巴細胞表現之hla IA型亦推 測參與凋亡訊息傳遞。 此外，抗人類HLA IA型α 3區域之5H7抗體（非專利文 獻5)及抗小鼠MHC I型α2區域之RE2抗體（非專利文獻6) 亦報導誘導活化淋巴細胞等細胞死亡。 使人類骨髓瘤細胞免疫所獲得單株抗體2D7 (非專利 文獻9)亦報導為辨識HLAIA型之抗體，假如製成低分子量 抗體（雙功能抗體），可快速誘導人類骨髓瘤細胞嚴重細胞 死亡。此2D7雙功能抗體（diabody )為發展中用以治療骨 髓瘤之治療試劑’其顯示在各種人類骨髓瘤細胞株及活性 淋巴細胞有強的細胞死亡誘導活性，且在以人類骨髓瘤細 胞移植至小鼠產生之多發性骨髓瘤（multiple myeloma) 模型小鼠中，展現出顯著存活效益（專利文獻1、2、3及4 ; 非專利文獻7及8)。進一步利用牽涉HLA I型之細胞死亡 的治療期望帶領發展出高度有效治療骨髓瘤等藥物。 與本發明申請案相關之先前技術文獻如下： [專利文獻 1] W02004/033499 [專利文獻 2] W02005/056603 [專利文獻 3] W02005/1 00560 [專利文獻4] PCT/JP2006/30989 0 [非專利文獻 1] Fayen et al. , Int. Immunol. 10 : 1347-1358(1998) 2125-8963-PF 6 200808351 [非專利文獻 2] Genestier et al., Blood 90 · 3629-3639 (1997) [非專利文獻 3] Genestier et al. , Blood 90 · 726-735 (1997) [非專利文獻 4] Genestier ei a/·，J· Biol. Chem. 273 : 5060-5066 (1998) [非專利文獻 5] Woodle et al., J. Immunol. 158 ： 2156-2164 (1997) [非專利文獻 6] Matsuoka et al., J. Exp. Med. 181 ： 2007-2015 (1995) [非專利文獻 7] Goto, etal. Blood 84： 1 922-30 ( 1 994) [非專利文獻 8] Kimura, et al. Biochem Biophys Res Comraun., 325 ： 1201-1209 (2004) [非專利文獻 9] Oka, Τ·， “ Sankyo

Seimei-kagaku-zaidan Kenkyu Hokoku-shu ( Sankyo Foundation of Life Science )之研究報告），，12 : 46 - 56 (1998) 【發明内容】 鑑於上述情況，本發明之目的係提供包含重鏈變異區 (variable region)之抗體，該重鏈變異區包括由胺基酸 序列SEQ ID NOs : 7、8及9所構成之互補決定區 (complementarity-determining region，CDR) 1、2及 3。 此外，本發明之目的係提供包含輕鏈變異區之抗體，該輕 2125-8963-PF 7 200808351 鏈變異區由胺基酸序列SEQ ID NOs ·· 1〇、11及12所構成之 CDR 1、2及3。更特別地，本發明之目的係提供辨識hla ΙΑ型及較以前有較高細胞死亡誘導活性之抗體。 本案發明人投入專注研究，以達成上述目的。首先， 使小鼠產生免疫抗體以獲得單株抗體，該小鼠具共表現人 類HLA IΑ型及人類/5 2-微球蛋白之細胞。之後，筛選所声 付之抗體以得到1 0株具細胞死亡誘導活性之新穎抗體。分 析這些抗體，其中三株抗體（抗體C3B3、C11B9及C17D11) 它們的抗原決定位為HLA I型抗原中α 2區域，當與抗小鼠 Ϊ gG抗體交聯時，顯示有較強的細胞毒殺作用。此外，本案 發明人修飾所獲得之C3B3成低分子量之抗體（C3B3雙功能 抗體），成功構築細胞死亡誘導激動性抗體（agonistic antibody)，該抗體自身具有抗腫瘤活性，超過於傳統抗 HLA IA型低分子量抗體（2D7雙功能抗體）。 更特別地，本發明提供下列[1 ]至[25 ]: [1]包含重鏈變異區之抗體，該重鏈變異區包括由胺 基酸序列SEQ ID NOs : 7、8及9所構成之CDR1、2及3 ; [2 ]包含輕鏈變異區之抗體，該輕鏈變異區包括由胺 基酸序列SEQ ID NOs ·· 10、11及12所構成之CDR1、2及3 ; [3] 包含重鏈變異區及輕鏈變異區之抗體，該重鏈變 異區包括由胺基酸序列SEQ ID NOs: 7、8及9所構成之CDR1、 2及3;以及該輕鏈變異區包括由胺基酸序列SEQ ID NOs: 10、11及12所構成之CDR1、2及3 ; [4] 包含下列任一之重鏈變異區的抗體： 2125-8963-PF 8 200808351 (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 2之重鏈變異區； (b) 包括具有在胺基酸序列8即id NO: 2有一或多個 胺基酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能 等同於重鏈變異區（a)的重鏈變異區； (c) 包括包含核苷酸序列SEQ ID NO : 1之DNA所編碼之 胺基酸序列的重鏈變異區；以及 (d) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ ID NO : 1 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的重鏈變異區； [5 ]包含下列任一之輕鏈變異區的抗體： (e) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 4之輕鏈變異區； (f) 包括具有在胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 4有一或多個 胺基酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能 等同於輕鏈變異區（e)的輕鏈變異區； (g) 包括包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 3之DNA所編碼之 胺基酸序列的輕鏈變異區；以及 (h) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 3 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的輕鏈變異區； [6]包含（a)至（d)任一之重鏈變異區及（e)至（h)任一 輕鏈變異區的抗體： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 2之重鏈變異區； (b) 包括具有在胺基酸序列SEQ ID N0: 2有一或多個 胺基酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能 等同於重鏈變異區（a)的重鏈變異區； (c) 包括包含核苷酸序列SEQ ID NO : 1之DNA所編碼之 2125-8963-PF 9 200808351 胺基酸序列的重鏈變異區；以及 (d) 與包含核苷酸序列SEQ IDN0: 1之DNA在嚴袼條件 下雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的重鏈變異區； (e) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 4之輕鏈變異區； (f) 包括具有在胺基酸序列SEQ ID N0 : 4有一或多個 胺基酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能 等同於輕鏈變異區（e)的輕鏈變異區； (g) 包括包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 3之DNA所編碼之 胺基酸序列的輕鏈變異區；以及 (h) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEq id N0: 3 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的輕鏈變異區； [7 ]包含下列任一胺基酸序列之抗體： (a) 胺基酸序列SEQ ID N0 : 6 ; (b) 具有在胺基酸序列SEQ ID NO: 6有一或多個胺基 酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列； (c) 包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 5之DNA所編碼之胺基 酸序列；以及 (d) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEq id N0 ·· 5 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列； [8 ]結合至與[1 ]至[8 ]任一之抗體所結合之人類白血 球抗原（human leukocyte antigen，HLA)蛋白抗原決定位 相同的抗原決定位之抗體； [9 ][ 1 ]至[8 ]任一之抗體，該抗體為單株抗體； [1 〇 ][ 1 ]至[9 ]任一之抗體，該抗體辨識人類白血球抗 2125-8963-PF 10 200808351 原（HLA); [11] 抗體[10]，其中該HLA為HLA I型 ； [12] 抗體[11]，其中該HLA I型為HLA-A ; [1 3 ][ 1 ]至[12 ]任一之抗體，該抗體為低分子量抗體； [14 ]抗體[1 3 ]，其中該低分子量抗體為雙功能抗體； [1 5 ]聚核苷酸（a )或（b ) ·· (a) 包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1、3或5之聚核苷酸； 或 (b) 在嚴格條件下與聚核苷酸（a)雜交之聚核苷酸，且 該聚核苷酸編碼具活性等同於[1 ]至[14 ]任一抗體的抗體； [16 ]包含聚核苷酸[1 5 ]之載體； [1 7 ]包括聚核苷酸[1 5 ]或載體[1 6 ]之宿主細胞； [18 ]製造[1 ]至[14 ]任一之抗體的方法，其中該方法 包括下列步驟： (a) 製備聚核苷酸[15]; (b) 構築包含聚核苷酸（a)之載體； (c) 將載體（b)導入宿主細胞；以及 (d) 培養宿主細胞（c); [1 9 ]包含作為活性成份之[1 ]至[14 ]任一之抗體的細 胞死亡誘導試劑； [2 0 ]誘導B細胞或T細胞死亡之細胞死亡誘導試劑 [19]； [21 ]細胞死亡誘導試劑[2 0 ]，其中該b細胞或T細胞為 活化B細胞或活化T細胞； 2125-8963-PF 11 200808351 [22 ]包含作為活性成份之[丨]至[丨4 ]任一之抗體的細 胞生長抑制試劑； [23 ]包含作為活性成份之[丨]至[丨4 ]任一之抗體的抗 腫瘤試劑； [24 ]抗腫瘤試劑[23 ]，其中該腫瘤為造血細胞腫瘤 (hematopoietic tumor);以及 [25 ]用以自體免疫疾病之治療試劑，該試劑包括作為 活性成份之[1]至[14]任一之抗體。 【實施方式】 本發明有關於包含重鏈變異區之抗體，該重鏈變異區 包括由胺基酸序列SEQ ID NOs : 7、8及9所構成之CDR1、2 及3 ° 此外，本發明有關於包含輕鏈變異區之抗體，該輕 鏈變異區由胺基酸序列SEQ ID NOs : 10、11及12所構成之 CDR 1 、 2及 3 。 本案發明人以HLA I型作為抗原，獲得具細胞死亡誘導 活性之新抗體。它們之中，抗原決定位為HLA I型抗原中α 2 區域的三株抗體（抗體C3B3、C11B9及C17D11)，當其與 抗小鼠I gG抗體交聯時，顯示具有較強的細胞毒殺作用。此 外，本案發明人以抗體工程技術修飾該C3B3成低分子量之 抗體（雙功能抗體），成功提供細胞死亡誘導激動性抗體 (C3B3雙功能抗體），該抗體自身具有較強的抗腫瘤效果， 勝於傳統2D7抗體之雙功能抗體。本發明係以這些發現為基 礎。 2125-8963-PF 12 200808351 本發明係提供包含重鏈變異區之抗體，該重鏈變異區 包括由胺基酸序列SEQ ID NOs: 7、8及9所構成之CDR 1、2 及3 °本發明亦提供包含輕鏈變異區之抗體，該輕鏈變異區 由胺基酸序列SEQ ID NOs : 10、11及12所構成之CDR 1、2 及 3。 本發明之抗體並不特別限定，只要它們包含包括由胺 基酸序列SEQ ID NOs : 7、8及9所構成之CDR1、2及3之重鏈 受異或包括由胺基酸序列SEQ ID NOs: 10、11及12所 構成之CDR 1、2及3之輕鏈變異區。 本發明抗體較佳例包括包含下列（a)至（d)任一之重鏈 變異區： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 2之重鏈變異區； (b) 包括具有在胺基酸序列邡9 π N0: 2有一或多個 胺基酸取代、删除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能 等同於重鏈變異區（a)的重鏈變異區； (c) 包括包含核苷酸序列SEQ ID NO : 1之DNA所編碼之 胺基酸序列的重鏈變異區；以及 (d) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEq N〇 :工 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的重鏈變異區。 另外，本發明抗體較佳例包括包含下列（e)至（h)任一 之輕鏈變異區： (e) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 4之輕鏈變異區· (f) 包括具有在胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 4有一或多個 胺基酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能

2125-8963-PF 13 200808351 等同於輕鏈變異區（e)的輕鏈變異區； (g) 包括包含核苷酸序列SEQ ID N0 ·· 3之DNA所編碼之 胺基酸序列的輕鏈變異區；以及 (h) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEq IE) N〇 : 3 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的輕鏈變異區。 此外’包含這樣重鏈變異區及輕鏈變異區之抗體的案 例為包含下列（a)至（d)任一之胺基酸序列的抗體： (a) 胺基酸序列SEQ ID N0 : 6 ; (b) 具有在胺基酸序列SEQ ID NO : 6有一或多個胺基 酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列； (c) 包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 5之DNA所編碼之胺基 酸序列；以及 (d) 在嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEq ip N0 : 5 之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列。 該重鏈變異區或輕鏈變異區之胺基酸序列可包含取 代、刪除、添加及/或插入。此外，它亦可能缺少部份重鏈 變異區及/或輕鏈變異區，或可添加其它多肽，只要該重 鏈變異區及輕鏈變異區之結合複合物維持它的抗原結合活 性。此外，該變異區可為嵌合式或人類化的。 此處，該術語「功能等同（functional ly equivalent)」 意指所要之抗體具有等同包含重鏈變異區或輕鏈變異區之 抗體的活性（如，HLA-A結合能力、細胞死亡誘導活性 等），該重鏈變異區包括由胺基酸序列SEQ ID NOs : 7、8 及9所構成之CDR1、2及3 ;該輕鏈變異區由胺基酸序列seq 2125-8963-PF 14 200808351 ID NOs ·· 10、11及 12所構成之 CDR 1、2及 3。 製備功能等同特定多肽之方法為熟悉該項技術者所熟 知，並包括導入多肽的突變方法。如，熟悉該項技術者可 利用定點突變（site-directed mutagenesis)使抗體產生 適當突變，製備功能等同本發明抗體之抗體 (Hashimoto-Gotoh, T. etal. ( 1 995) Gene 1 52, 271-275; Zoller，MJ及 Smith, Μ· ( 1 983) Methods Enzymol. 1〇〇, 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Proc Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol· 85，2763-2 766)。胺基酸突變亦可自然發生。因 此，本發明之抗體亦包括功能等同本發明抗體之抗體，其 中该抗體包括本發明抗體之胺基酸序列有一或多個胺基酸 突變之胺基酸序列。 突變之胺基酸之數目並不特別限定，但一般為3 〇個胺 基酸或更少，較佳為1 5個胺基酸或更少，更佳為5個胺基酸 或更少（如3個胺基酸或更少）。較佳地，該突變之胺基酸保 存在犬變之胺基酸中胺基酸旁鍵（side chain)的特性。 胺基酸旁鏈特性案例包括：疏水胺基酸（A、 I、L、Μ、F、 P、W、Υ及 V)、親水胺基酸（R、d、N、C、E、Q、G、Η、Κ、 S及T)、包含下列旁鏈胺基酸：脂肪旁鏈、A、v、L ' I 及P)、含羥基旁鏈（S、T及Y)'含硫旁鏈（C及Μ)、含羧 酸及醯胺基旁鏈（D、Ν、 Ε及Q)、鹼性旁鏈（R、κ及Η)及含 2125-8963-PF 15 200808351 芳香環旁鏈（H、F、Y及W)(胺基酸於括號中以一個字母代 表）。包含據一或多個胺基酸殘基被刪除、添加及/或以其 它胺基酸取代之經修飾之胺基酸序列的多肽為熟知維持它 們原本生物活性（Mark, D. F. eia/·，Proc. Natl. Acad Sci. USA ( 1 984) 81, 5662-5666; Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500； Wang, A. etal., Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ( 1 982) USA 79, 6409-6413)。 本發明之抗體亦包括含有數個胺基酸殘基的抗體。本 發明亦包括這樣抗體與其它胜肽或蛋白質融合在一起的融 合蛋白質。融合蛋白質的製備可為：連接編碼本發明抗體 之聚核苷酸及編碼其它胜肽或多肽之聚核苷酸，以便與該 編譯碼（reading frame)相配，插入這至表現載體，及於 宿主表現該融合構築體。熟悉該項技術者所熟知技術可用 於本目的。與本發明抗體融合之胜肽或多肽包括，如FLAG (Ηορρ， Τ. Ρ· et al. , Biotechnology ( 1 988) 6, 1 204-1 21 0)、由 6個His (組胺酸（histidine))殘基所構 成之6x Hi s、1 Ox Hi s、流感病毒血細胞凝集素（inf 1 uenza hemagglutinin，HA)、人類 c-myC片段、vs V-GP片段、pi 8HIV 片段、T7-標籤、HSV-標籤、E-標籤、SV40T抗原片段、lck 標籤、α -微管蛋白（α -tubul in)片段、B-標籤、蛋白質 C片段等。與本發明抗體融合之其它多肽案例包括麩胱胺 酸-S-轉移酶（glutathi〇ne-S-transferase，GST)、HA (流 2125-8963-PF 16 200808351 感病毒血細胞凝集素）、免疫球蛋白固定區、点—半乳糖苦 酶（θ-gaUctosidase)、麥芽糖結合蛋白（mait〇se_ binding Pr0tein，MBP)等。商業上可得之編碼這些胜肽或 多肽聚核苷酸可與編碼本發明抗體之聚核普酸融合。該融 合多肽可由表現該融合構築體所製備。 此外，本發明亦提供結合至與本發明所揭露抗體結合 之抗原決定位相同之抗原決定位的抗體。較特別地，有關 於辨識與本發明抗體所辨識之抗原決定位相同之抗體及其 應用。這樣抗體可以如以下方法獲得。 不管是測試抗體結合至與特定抗體結合之抗原決定位 相同之抗原決定位，即不管是抗原決定位於測試抗體及特 定抗體間共有，可以兩抗體間對於相同抗原決定位之競爭 確認。本發明中，抗體間競爭可以FACS、交叉阻斷分析 (cross-blocking assay)等偵測。在FACS中，單株抗體 首先結合至在它們表現HLA-1A之細胞，及測量該螢光訊 息。接著，候選競爭抗體與該細胞反應後，本發明抗體與 相同之細胞反應，以及以與FACS類似之方式進行分析。另 外’本發明單株抗體及測試競爭抗體可於同一時間與相同 細胞反應。假如當該競爭抗體與該細胞反應，本發明抗體 FACS分析圖式改變，則可確定該競爭抗體及本發明抗體辨 識相同的抗原決定位。 另外，競爭性EL ISA分析，如為較佳之交又阻斷分析。 較特別地，交叉阻斷分析中，HLA-IA-表現細胞固定於微量 滴定板（microti ter plate)之孔洞。有或無候選競爭抗 2125-8963-PF 17 200808351 體w培育後，加入本發明單株抗體。於孔洞中結合至該 HLA-IA-表現細胞之本發明抗體的數量與競爭相同抗原決 定位之候選競爭抗體（測試抗體）的結合活性成倒數關係。 車父佳地’結合相同抗原決定位之測試抗體的親和力越大， 則本發明抗體越少數量將結合至固定該[^丨人蛋白質表 現細胞之孔洞。換句話說，結合相同抗原決定位之測試抗 體的親和力越大’則本發明抗體越多數量將結合至固定該 HL A -1A蛋白質表現細胞之孔洞。 結合至孔洞之抗體數量可以預先標定抗體輕易測得。 如，生物素（biotin)標定抗體可以卵白素_過氧化氫酶標 口己物（avidin-peroxidase conjugate，Avidin-HRP)及適 菖义貝/貝J侍。使用酵素標記物，如過氧化酶之交叉阻斷分 析特別地為所謂競爭ELISA分析。該抗體可以其它可偵測 或可測里之標記物標定。較特別地，放射標記物或螢光標 吕己物為已知。 此外’ *該測試抗體包括衍生自不同物種而非本發明 抗體的那個之固定區，結合至該孔洞之任一抗體可以專一 性辨識衍生自任一物種之固定區的標定抗體測得。即使該 抗體何生自相同物種，假如該型不同，結合至該孔洞之抗 體仍可以專一性區分每一類型之抗體測得。 〃在缺夕候選競爭抗體中對照實驗所獲得之結合活性 ，較J，假如該候選抗體可以阻斷本發明單株抗體結合至 =〇/°、較铨為至少20 —50%，最佳為至少50%，候選競爭抗 體可視為大體結合至相同的抗原決定位抗體或競爭與本發

2125-8963-PF 18 200808351 明抗體結合之抗原決定位的相同抗原決定位的抗體。 結合至與本發明抗體結合之抗原決定位相同之抗原決 定位的抗體為上述抗體[8]或[9]。 如上所述，上述抗體[8 ]或[9 ]包括單價抗體 (monovalent antibody)及多價抗體（polyvalent antibody)。本發明多價抗體包括具相同抗原結合位之多價 抗體及具部分或完全不同抗原結合位之多價抗體。 本發明抗體可依胺基酸序列、分子量及等電點 (isoelectric point)不同，且亦可在糖鏈（sugar chain) 有無及構形不同，來決定生產該抗體之細胞或宿主或純化 的方法。然而，只要所獲得之抗體功能等同本發明抗體， 亦包括在本發明中。如，當在原核細胞，如昃表現 本發明抗體，甲硫胺酸（methionine)殘基加至該原始抗體 胺基酸序列N端。本發明抗體亦將包括這樣抗體。 本發明抗體可為結合至各種分子之共軛的抗體，該分 子包括如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG )、放射 性物及毒素。這共軛抗體可以化學修飾所得抗體而獲得。 抗體修飾之方法於這領域已建立（如美國專利號5〇5731 3 及51 5 6 8 4 0)。據此，本處用之術語「抗體」包括這共輛抗 體。 假如需要，小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體、錦羊抗 體、路騎抗體、喪合式抗體、人類化抗體、人類抗體等可 用於本發明抗體。此外，低分子量抗體等可作為本發明抗 體。 2125-8963-PF 19 200808351 對於本發明抗體，以抗體基因併入適當載體並利用基 因工程技術將這載體導入宿主而產製基因修飾抗體（如參 閱 Carl， A. Κ· Borrebaeck， James, W. Larrick， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，英國MACMILLAN出 版社出版，1 990 )可用。更特別地，當獲得編碼重鏈變 異區或輕鏈變異區之DNA，該重鏈變異區包括由胺基酸序列 SEQ ID NOs : 7、8及9所構成之CDR1、2及3 ;或該輕鏈變異 區包括由胺基酸序列SEQ ID NOs : 10、11及12所構成之 CDR1、2及3,它們連接至編碼所要抗體固定區（(：區）之關八， 然後將這併入表現載體。另外，編碼抗體變異區之DNa可併 入包含抗體固定區之DNA的表現載體。該DNA併入該表現載 體’以便在表現調控區（強化子或啟動子）控制下表現。然 後可以轉形至宿主細胞，利用這表現載體表現該抗體。 本發明亦提供編碼本發明抗體之聚核苷酸，或在嚴格 條件下與本發明聚核苷酸雜交且編碼具有等同本發明抗 體活性之活性的抗體之聚核苷酸。本發明聚核苷酸為包含 多種核酸驗基或去氧核糖核酸（rib〇nucleic acid)或核糖 核S夂（ribonucleic acid)驗基對之聚合物，但不特別限 疋’只要它們編碼本發明抗體。本發明聚核苷酸亦可包含 非自然核苷酸。本發明聚核苷酸可利用基因工程技術表現 抗體。此外，它們作為在篩選功能等同本發明抗體之抗體 的奴針。特別地’在嚴格條件下與編碼本發明抗體之聚核 苦I雜父’且編碼具有等同本發明抗體活性之活性的抗體 之DNA可以技術獲得，如利用本發明聚核苷酸或其部分作為

2125-8963-PF 20 200808351 探針雜交及基因增殖（如PCR)。本發明聚核苷酸包括這 DNA °雜交技術為熟悉該項技術者熟知（Sambr〇〇k，j· ^ 5/., Molecular Cloning 2nd ed. , 9. 47-9. 58, Cold

Spring Harbor Lab· press, 1 989)。雜交條件可包括如低 度嚴袼那些。低度嚴格條件之例子包括後-雜交以〇· lx ssc 及〇·1% SDS於42°C清洗，較佳為〇·ιχ SSC及0.1% SDS於 5〇°C。更佳雜交條件包括高度嚴格那些。高度嚴格條件包 括’如以5x SSC及〇· 1% SDS於65。(：清洗。這些條件中， 溫度越高，越可期望獲得具高度同一性之聚核苷酸。然而， 幾個因子，如溫度及鹽類濃度可影響雜交嚴格性，熟悉該 項技術者可適度選擇這些因子已完成相似嚴格性。 以雜交及基因增殖技術獲得之聚核苷酸所編碼且功能 等同本發明抗體之抗體一般與本發明抗體胺基酸序列具有 高度同一性。本發明抗體包括功能等同且與本發明抗體胺 基酸序列具有高度同一性之抗體。術語「高度同一性（h i gh homology)」一般意指至少5〇%或更高胺基酸同一性水準， 較佳為75%或更高，更佳為85%或更高，又更佳為95%或更 高。多肽同一性可以敘述於^1131^，界_1抓(11^{)111抓，])· J. Proc. Natl· Acad· Sci. USA 80，726-730 ( 1 983)之 演算法測得。 較佳編碼本發明抗體之聚核苷酸例子包括聚核苷酸（a) 及（b):

(a)包含核苷酸序列SEQ ID NOs : 1、3或5之聚核 苷酸；或 X

2125-8963-PF 21 200808351 (b )在嚴格條件下與聚核苷酸（a )雜交之聚核苷酸，且 該聚核苷酸編碼具活性等同於本發明抗體的抗體。 當抗體以下列產出：先分離抗體基因，然後將它導入 適合宿主’可用適當宿主及表現載體組合。 本發明提供包含上述聚核苷酸之載體。該載體包括， 如 M13 載體、puc 載體、pBR322、pBiuescript 及 pCR-Script。除以上載體，如 pGEM_T、p])IREC1^pT7 亦可 用於cDNA次選殖及切除。當使用載體生產本發明抗體，表 現載體是特別有用。當表現載體於及⑶"表現，如它應該 有上述特性以便於昃增殖。另外，當昃⑶"如 JM109、DH5 α、HB101或XL1-Blue用作為該宿主細胞，該載 體較佳有啟動子，如alacZ啟動子（Wardeia/· ( 1 989)

Nature 341 : 544-546; (1992) FASEB J· 6 : 2422-2427)、 araB 啟動子（Better ei W· ( 1 988) Science 240 ··

1 041-1 043)或T7啟動子，以便所要基因在义⑶"有效表 現 其匕載體案例包括pGEX-5X-1 (Pharmacia)、 “ QIA 表現系統 （QIAGEN)、pEGFP及pET (其中BL21，表現T7 R N A聚合_之菌株較佳作為該宿主）。 此外’該載體可包括用以多肽分泌之訊息序列。當生 產蛋白貪分泌到兄"胞外質（periplasm)，該叶訊 心序列（Lei，S. P. ei a/· J· Bacteriol· 1 69 : 4379 ( 1 987))可用作為蛋白質分泌之訊息序列。如氣化鈣法或 電穿孔法（electroporation)可用以將該載體導入宿主細 胞0

2125-8963-PF 22 200808351 除用以昃 co//之表現載體，衍生自哺乳動物（如 pCDNA3(Invitrogen) ^ pEGF-BOS(Nucleic Acids Res. ( 1 990) 18( 1 7) : 5322)、pEF、pCDM8)、昆蟲細胞（如 “Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統” （GIBC0—BRL)、 pBacPAK8)、植物（如 ρΜίΠ、pMH2)、動物病毒（如 pHSV、pMV、 pAdexLcw)、逆轉錄病毒（retroviruses )(如 pZIPneo)、 酵母囷（如 Pichia 表現套組” （Invitrogen)、pNVll、 SP-Q01)及枯草桿菌（方)(如 ppL6〇8、 PKTH50)的表現載體亦可作為生產本發明多肽之載體。 為於動物細胞，如CH0、C0S及NIH3T3表現，該載體較 佳有在這細胞表現必需之啟動子，如SV40啟動子 (Mulligan ei a/· ( 1979) Nature 277 ·· 108)、匪LV-LTR 啟 動子、EF1 啟動子（Mizushima a/· ( 1 990 ) Nucleic Acids Res· 18 : 5322)、CMV啟動子等）。甚至更佳為該載 體亦攜帶用以篩選轉形株之標記基因（marker gene )(如 可以藥物，如新黴素（neomycin)及G418筛選之抗藥物基 因）。具這樣特性之載體案例包括pMAM、pDR2、pBK-RSV、 pBK-CMV 、 pOPRSV 、 p0P13等。 另外，為在細胞基因表現穩定及放大該基因拷貝數， 具缺失性核酸合成途徑之CH0細胞可導入包含DHFR基因 (如pCHOI)之載體，以補償該缺失，且可利用氨甲喋呤 (methotrexate，MTX)放大該拷貝數。另外，攜帶SV40 ΐ 抗原-表現基因於它的染色體的COS細胞可以含SV40複製區 (replication origin)(如pcD)之載體轉形，用以短暫基 2125-8963-PF 23 200808351 因表現（transient gene expression)。該複製區可衍生 自多瘤病毒（polyoma virus)、腺病毒（adenovirus)、牛 乳頭瘤病毒（bovine papi 1 loma viruses，BPV )等。此外， 為增加在宿主細胞該基因拷貝數，該表現載體可包含作為 師選標記之胺基糖普轉移酶（aminoglycoside transferase ’ ΑΡΗ)基因、胸腺。密 口定激酶（thymidine kinase，TK )基因、尼co//黃嘌呤鳥嘌呤鱗酸核糖轉移酶 (xanthine guanine phosphoribosy1 transferase 5

Ecogpt )基因、二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，dhfr)基因等 ° 在動物體表現本發明聚核苷酸的方法包括下列方法·· 將本發明聚核苷酸併入適當載體，並以如逆轉錄病毒法、 微脂粒法、陽離子微脂粒法或腺病毒法將它們導入活體。 使用之載體包括腺病毒載體（如pAdexlcw)及逆轉錄病毒載 體（如pZIPneo)，但不限定於此。一般基因操做如插入本發 明聚核苷酸至載體可按傳統方法（M〇lecular cl〇ning， 5.61-5· 63)執行。活體之實施可以體表外（或體 内（//? f/fo)方法操作。 此外，本發明提供導入本發明載體之宿主細胞。該宿 主T胞並不特別限定，如昃⑶"及各種動物細胞對本目 的是可用的。本發明宿主細胞可作為， 明抗链之生產系統。趙外或雜内生產系統可用於="產 系、、充使用真核細胞或原核細之生產系統為體外生產系統 之案例。 '

2125-8963-PF 24 200808351 可使用之真核細胞包括，如動物細胞、植物細胞及真 菌細胞。已知動物細胞包括：哺乳動物細胞，如CHO (J. Exp. Med· ( 1 995) 1 08，945)、COS、NIH3T3、骨髓瘤、幼年倉氣 腎細胞（baby hamster kidney，BHK)、HeLa、Vero、如非 洲爪蟾（Xenopus Laevis)卵母細胞之兩棲類動物 (amphibian)細胞（Valle, ei a/· (1981) Nature 291， 358-340)或昆蟲細胞（如Sf9、Sf21及Tn5)。已刪除DHFR 基因之CH0 細胞，如 dhf r-CHO (Proc. Nat 1. Acad. Sci β USA ( 1 980) 77，4216-4220)及 CHO K-l (Proc. Natl. Acad·

Sc i· USA (1968) 60，1 275)特佳作為CHO細胞。動物細胞 中，CHO細胞特別適用大量表現。載體可以下列方法導入 宿主細胞，如磷酸鈣法、DEAE-葡聚醣（DEAE-dextran)法、 使用陽離子微脂粒DOTAP (Boehringer-Mannheim)之方 法、電穿孔法、微脂粒轉染法（lipofection method)等。 植物細胞包括，如菸草（㈣）衍生細 胞’熟知為多肽生產系統。可以從這細胞培養癒合組織。 熟知真達細胞包括酵母囷細胞’如像釀酒酵母 {Saccharomyces之酵母屬；以及絲狀菌，如 像票、觀蛰（Aspergi i lus niger)之觀蛰魇。 細囷細胞可於原核生產糸統。細菌細胞案例包括# (如，JM109、DH5 α、HB101 等）及枯草桿菌（如 subti1 is ) ° 可將所要聚核苷酸轉形至該細胞，然後體外培養這些 轉形株（transformant)獲得抗體。轉形株可用已知方法 25

2125-8963-PF 200808351 培養。如DMEM、 MEM、RPMI 1 640或IMDM可用作動物細胞之 培養基’且可有無血清添加劑，如胎牛血清（fetal calf serum，FCS)。無血清配養亦可接受。培養過程較佳邱大約 6至8。一般培育於溫度約3〇至4(rc約15至2〇〇小時。若需 要，培養基可互換、通氣或攪拌。 另外一方面’使用動物或植物宿主之生產系統可用作 為體内生產多肽系統。如所要之聚核苷酸可導入至動物或 植物’然後回收該動物或植物體所產生之多肽。本發明之 「宿主（hosts)」包括這動物及植物。 當使用動物，有使用哺乳動物或昆蟲之生產系統。哺 礼動物如山羊、豬、綿羊、小鼠及牛可用（Vicki Glaser SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。另外， 該哺乳動物可為基因轉殖動物。 舉例來說，所要之聚核苷酸可製備為具編碼多肽之基 因的融合基因，該多肽專一性地於乳汁產出，編碼多肽之 基因如山羊万―酪蛋白（万—casein)基因。包含該融合基 因之聚核苷酸片段注射至山羊胚胎，然後導回至雌性山 羊。然後，所要之抗體可由該基因轉殖山羊泌乳中獲得， 該基因轉殖山羊從接受該胚胎之山羊或從它們子代出生。 適度為爾蒙可投予該基因轉殖山羊，以增加含該基因轉殖 山羊生產之多肽的乳汁量（Ebert， K M. et al·，

Bio/Technology 12， 699-702 (1994))。 昆蟲，如蠶，亦可用。攜帶所要之聚核苷酸的桿狀病 毒可感染蠶，而所要之抗體可由它們體液獲得（Sus_u，

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Nature 315， 592-594 (1985))。 當使用植物’可用於草。採用於草時，所要之聚核普 酸可插入至植物表現載體’如ρ Μ 0 N 5 3 0，然後該載體可導 人至細蛰，如 Α 择蛰 Ugrobacterium tumefaciens)。然後^ 該細囷感染於草，如於草（yVicoi/s/za ，而所要 之多肽由該葉回收（Julian K.-C. Ma ei a/·， Eur· J. Immunol· 24， 131-138 (1994))。 因而產生之本發明抗體可由宿主細胞内或外（如培養 基）中分離，純化成大體純且同源之抗體。任何分離及純 化抗體標準方法可用，且不限定於任何特定方法。抗體可 選擇適當下列組合進行分離及純化：如層析管柱法、過濾、 超過濾、鹽析（sa 11 i ng out)、溶劑沈澱法、溶劑萃取、蒸 餾、免疫沉澱（immunoprecipi tat ion )、SDS-聚丙烯醯胺 電泳（SDS-PAGE)、等電聚焦（IEF)、透析、再結晶等其它 方式。

層析（chromatography )包括，如親和層析（affinity chromatography )、離子交換層析（ion exchange chromatography ， IEC )、疏水層析（hydrophobic chromatography)、膠體過濾（Gel filtration)、逆相 層析（reverse-phase chromatography )、吸附層析 (adsorption chromatography) 等 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A

Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 996)。這些層 2125-8963-PF 27 200808351 析可使用液相層析實施，如HPLC及FPLC。用於親和層析中 官柱例子包括蛋白質A管柱及蛋白質G管柱。用蛋白質A管柱 之官柱包括，如 Hyper D、P〇R〇s、Sephar〇se F· F· (Pharmacia)等。本發明亦包括使用這些純化方法高度純化 之抗體。 本务明中，製備之抗體的抗原-結合活性（Antib〇dies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory，1 988)可用習知方法測得。如 酵素連結免疫吸附分析（ELISA)、酵素免疫分析（EIA)、放 射免疫分析（RIA)或螢光免疫分析。 本發明提供抗體生產方法，包括下列步驟··製備上述 聚核苷酸；製備包含該聚核苷酸之載體，將該載體導入宿 主細胞；以及培養該宿主細胞。 另外，本發明中，人工修飾基因重組抗體，如嵌合式 及人類化抗體，可用以減少抗人類之異源抗原性 (antigenicity )等。這些修飾抗體可以習知方法製備。 肷合式抗體為包含自非人類哺乳動物，如小鼠，之抗體的 重鏈及輕鏈變異區，以及人類抗體之重鏈及輕鏈固定區。 該欲合式抗體可下列製備：將編碼小鼠抗體變異區之DNA 與編碼人類抗體固定區之DNA連接，將這併入表現載體，然 後將該載體導入宿主。 人類化抗體亦指「改型人類抗體（reshaped human antibodies )」。這人類化抗體乃將衍生自非人類哺乳動 物’如小鼠’之抗體的互補決定區（c〇mplementarity 2125-8963-PF 28 200808351 determining region ，CDR)嫁接於人類抗體之c⑽而獲 得這I又基因重組方法亦為習知。特別地，設計連接鼠 科動物抗體CDR至人類抗體框架區（framew〇rk “幻⑽， 之DNA序列乃使用數個製備包含末端區重疊部分之寡核苷 酉文，以PCR合成。獲得之DNA連接至編碼人類抗體固定區 之DNA，然後將這整合至表現載體，而該抗體係將這載體導 入宿主而製備（可參照EP239400及W0 96/02576)。選擇連结 CDR之人類抗體FR，以便該CDR形成，適合的抗原結合位。= 了孩改型人類抗體之Cdr形成適當之抗原結合位，若需要， 該抗體變異區之框架區中胺基酸可被取代（Sat〇，κ.以 a/·, 1993， Cancer Res· 53， 851-856)。 獲得人類抗體之方法亦為習知。舉例來說，人類淋巴 細胞可於體外以所要之抗原或表現所要之抗原細胞使之變 知敏感，而該致敏淋巴細胞（sensjtized lymph〇Cytes) 可與人類骨髓瘤細胞，如U266，融合以獲得具抗原-結合活 性之所要人類抗體（參閱日本專利公告公報號（jp — B)平 卜598 78 (出版用以異議之審查、獲准日本專公報））。再 者，可藉由所要之抗原使具全套人類抗體基因之基因轉殖 動物免疫而獲得所要之人類抗體（參閱W〇 93/12227、W0 92/03918 、 W0 94/02602 、 W0 94/25585 、 WQ 96/34096及W0 96/33735)。此外，以人類抗體庫篩選獲得人類抗體之技術 亦為習知。舉例來說，使用噬菌體表現法，將人類抗體變 異區可表現作為噬菌體外表上單鏈抗體（ScFv)，可篩選 結合抗原之嗟菌體。編碼結合該抗原之人類抗體變異區的

2125-8963-PF 29 200808351 DNA序列可分析該所篩選 巫囷體之基因而測定。由顯示 、、口否该抗原之scFvs的DNA序列來砉，^ ^ 、 a汁幻术有，攜帶該序列之適當 表現載體可製備以& $ , ^ 一 j|侑以生產人類抗體。這些方法為已知，下列 A開貝料可作為參考：W〇 92/〇1〇47、肋心別州、w〇 93/06213 ^ W0 93/1 1236 > W0 93/1 91 72 ^ WO 95/01 438AWO 95/15388 。 軏佺地，本發明抗體為辨識人類白血球抗原（HU)之抗 體。辨識人類白血球抗原（HLA)之本發明抗體為有用的，由 於它們具有提高的活性。此處「活性（活性）」意指產生 抗原-抗體結合結果之生物作用。該生物作用具體例包括： 細胞死亡誘導、〉周亡誘導、細胞生長抑制、細胞分化抑制、 細胞分裂抑制、細胞生長抑誘導、細胞分化誘導、細胞分 裂誘導及細胞周期調節等。較佳為細胞死亡誘導及細胞生 長抑制。 造血細胞及非貼附性細胞（non —adherent ceU)較 佳，但變為上述作用，如細胞死亡誘導及細胞生長抑制之 標的的細胞並不特別限定，雖然造血細胞（hemat〇p〇ietic cel 1 )及非貼附性細胞（non-adherent cel 1)。造血細胞具 體例包括· 淋巴球（B細胞、T細胞）、嗜中性球 (neutrophil)、嗜酸性球（eosinophii)、嗜鹼性球 (basophi 1 )、單核球（monocyte)(較佳為活化之外周血單 核細胞（activated peripheral blood mononuclear cel 1， PBMC )及造血腫瘤細胞（骨髓瘤細胞、淋巴瘤細胞及血癌細 胞），較佳為淋巴球（B細胞、T細胞、活化之B細胞及活化之 2125-8963-PF 30 200808351 τ細胞），特別為活化之B細胞或活化之τ細胞，最佳為造血 腫瘤細胞。「非貼附性細胞」意指培養時，非貼附狀態生 長’無貼附於如玻璃或塑膠）表面之細胞。本發明中，非 貼附性細胞較佳例包括Jurkat細胞及ARH77細胞。另外一 方面’ 「貼附性細胞」意指培養時，貼附於培養管（如玻 璃或塑膠）表面之細胞。 一般而言，全長之抗-HLA抗體可與抗-igG抗體交 聯’以提升的細胞死亡誘導活性，交聯可以習知方法實施。 本發明抗體是否誘導非貼附性細胞之細胞死亡可觀察 Jurkat細胞或ARH77細胞中誘導之細胞死亡。本發明抗體是 否誘導貼附性細胞之細胞死亡可觀察HeLa細胞中誘導之細 胞死亡（W02004/033499)。 本發明中，上述HLA-辨識抗體投藥可治療或預防疾 病，如腫瘤，包括造血腫瘤（具體例包括白血病 (leukemia )、骨髓發育不良症候群（myei〇dyspiastic syndrome，MDS)、惡性淋巴瘤（mal ignant lymphoma)、慢 性骨髓性白血病（chronic myelogenous leukemia)、浆細 胞疾病（plasmacytic disorder )及骨髓增生性疾病 (myeloproliferative disease，MPD)等；漿細胞疾病如骨 體瘤、多發性骨髓瘤（multiple myeloma)及巨球蛋白血 症（macroglobulinemia);骨髓增生性疾病如真性多紅血 球症（polycythemia vera，PV )、原發性血小板增多症 (essential thrombocythernia，ET)及原發性骨髓纖維化 (idiopathic myelofibrosis))及自體免疫疾病（具體例 2125-8963-PF 31 200808351 包括風濕（rheumatism)、自體免疫性肝炎（autoimmune hepat i t i s，AIH)、自體免疫性甲狀腺炎（thyroidi t i s )、 自體免疫水皰病（bu 11 os i s )、自體免疫腎上腺皮質疾病 (adrenocortical disease )、自體免疫性溶血性貧血 (autoimmune hemolytic anemia，AIHA)、自體免疫血小板 缺乏紫斑症（thrombocytopenic purpura)、自體免疫萎 縮性胃炎（atrophic gastritis )、自體免疫嗜中性白血球 過低症（neutropenia)、自體免疫睪丸炎（orchitis)、自 體免疫腦脊鰱炎（encephalomyel itis)、自體免疫受體疾 病、自體免疫不孕症（infertility)、克隆氏疾病（Crohn’ s disease)、系統性紅斑性狼瘡 （systemic lupus erythematosus)、多發性硬化症（Multiple Sclerosis， MS)、巴塞杜氏病（Basedow’ s di sease )、幼年型糖尿病 (juvenile diabetes)、愛迪生氏症（Addison，s disease)、重症肌無力（Myasthenia Gravis，MG)、晶 體誘發性葡萄膜炎（lens-induced uveitis )、牛皮癬 (psoriasis )及 Behchet 氏症（Behchet, s disease， BD ))。此外，投予活體時，本發明抗體體内絕佳穩定性將 特別有效。 本卷明中，HLA意指人類白血球抗原。hla分子分成 I型及11型。I型已知例子為hla_a、b、c、e、f、g、h、j 等；而II型已知例子為hla__dr、DQ、仰等。本發明抗體辨 識之抗原並不特別限定，只要它們是HLA分子，較佳為分類 為I型之分子，更佳為HLA—IA。

2125-8963-PF 32 200808351 本發明抗體可為低分子量抗體。本發明中，分子量抗 體包括抗體片段，但不限定，只要它們有抗原—結合能力， 該抗體片段為整個抗體（如整個IgG)部份不見。本發明 抗片段並不特別限定，只要它們是整個抗體部份。然而， 包§重鏈變異區（VH)或輕鏈變異區（VL)之片段較佳，包含 VH及VL兩者之片段特佳。抗體片段之具體例包括·· Fab、 Fab 、F(ab ) 2、Fv、scFv (單鏈 Fv)、sc(Fv)2 等，但較 佳為雙功能抗體（!1113^:011，：^8.43人，？1'〇(3.1七1.人〇&(1· Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun “The

Pharmacology 〇f Monoclonal Antibodies" Vol. 113， Resenburg and Moore ed., Springer Verlag, New York, PP· 269-31 5，（ 1 994))。這抗體片段可將抗體以酵素處理， 如木瓜蛋白酶（papain )或胃蛋白酶（pepsin)，以產生 抗體片段而獲得，或構築編碼這抗體片段之基因，將它們 導入表現載體，然後於適當宿主細胞表現這（參閱如，c〇， M. S. et al., J. Immunol. ( 1 994) 1 52, 2968-2976;

Better, M. and Horwitz， A. H·， Methods Enzymol· (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. ( 1 989) 1 78, 497-51 5; Lamoyi, E. , Methods

Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121， 663-669; Bird, R. E. and Walker， B· W·， Trends Biotechnol. (1991)9， 132-137)。 本發明低分子量抗體之分子量較佳為較低於整個抗體 之分子量，但構成多聚體，如二聚體、三聚體及四聚體 2125-8963-PF 33 200808351 (tetramer )，該分子量可能較高於整個抗體之分子量。 本發明低分子量抗體較佳為包含抗體中兩個或多個VH 及兩個或多個VL之抗體，而這些變異區直接或間接透過連 接子（1 inker )連接。該連接可為共價鍵、非共價鍵或共 價及非共價鍵兩者。更佳低分子量抗體為包含兩個或多個 VH-VL對之抗體，該VH-VL對為將VH及VL以非共價鍵連接形 成。於此案，VH-VL對與另一個VH-VL對間有較短之距離勝 於整個抗體中距離的低分子量抗體較佳。 本發明中，scFv藉由將抗體Η鏈V區與抗體L鏈V區連接 而獲得。於此scFv，該Η鏈V區及L鏈V區透過連接子連接， 較佳為透過胜肽連接子（Huston，J. S. eia/·，Pr〇c. Natl

Acad. Sci· U.S.A. (1988) 85，5879 — 5883)。scFv中，該Η 鏈V區及L鏈V區可衍生自此處所述任一抗體。舉例來說，任 一由1 2至1 9個胺基酸殘基所組成之單鏈胜肽可作為胜肽 連接子，用以連接該V區。 編碼scFv之DNA可以下方式獲得：編碼上述抗體η鏈或η 鏈V區及該抗體l鏈或L鏈V區之DNA作為模版，在這些序列 中’以明確兩端之引子進行PCr以擴增編碼所要之胺基酸 序列之DNA部分，然後使用編碼該胜肽連接子部分之 及明確用以分別連接該Η鏈及L鏈之連接子!)NA兩端的引子 對進行後續增殖。 一旦構築編碼SCFVS之DNA、包含該DNA之表現載體及以 該表現載體轉形之宿主可按習知方法獲得。此外，scFvs 可利用這些宿主按習知方法獲得。

2125-8963-PF 34 200808351 這些抗體片段可藉由獲得它們的基因並於類似上述之 情形下表現它們，而於宿主生產。這些抗體片段包括在本 發明「抗體」。 本發明中，特佳之低分子量抗體為雙功能抗體。雙功 能抗體為連接兩個片段形成之二聚體（如SCFVS，此後意指 為構成雙功能抗體之片段），其中一變異區透過連接子連接 至另一變異區。一般地，雙功能抗體包括兩個VL及兩個VH(P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6444-6448 (1993); EP 404097; WO 93/11161; Johnson et al· ， Method in Enzymology, 203， 88-98， （1991);

Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299-305, (1996); Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994); John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999); Holliger et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 90, 6444-6448, (1993); Atwell et al., Mol. Immunol· 33，1301 -1312，（ 1 996))。構成雙功能抗體之片 段間化學鍵可為共價鍵或非共價鍵，但較佳為非共價鍵。 另外’構成雙功能抗體之片段可以連接子連接彼此， 形成單鏈雙功能抗體（sc雙功能抗體）。於此案，使用大約 20個胺基酸長的連接子連接之構成雙功能抗體之片段允許 構成雙功能抗體之片段在相同鏈上以形成彼此透過非共價 鍵鍵結之二聚體。 構成雙功能抗體之片段包括連接VL-VH、VL-VL及VH-VH 那些’較佳為連接VH-VL。構成雙功能抗體之片段中，用以

2125-8963-PF 35 200808351 連接一變異區至—變異區的連接子並不特別限定，但較佳 為夠短而避免在相同片段中變異區間非共價鍵結之連二 子。^連接子之長度可為熟悉該項技術者適度判斷，一般 為2至14個胺基酸，較佳為3至9個胺基酸，最佳為4至6個胺 基酸。於此案I，編碼在相同片段之几及”間的連接子為短 的，因此在相同股之vlmh不开》成非共㈣，因此單鏈v 區片段將無法形成。更確切地，片段與另一片段透過非共 價鍵結形成二聚體。此外，按雙功能抗體建構之相同原則， 三或多個構成雙功能抗體之片段可連接以形成多聚體之抗 體，如三聚體或四聚體。 几 本發明雙功能抗體之案例包括但不限定包含胺基酸序 列SEQIDN0·· 6之雙功能抗體、功能等同於包含序列seqid NO: 6及在胺基酸序列SEQ IDN〇: 6有一或多個胺基酸突變 (取代、刪除、插入及/或添加）的雙功能抗體、包含⑶r(或 變異區）胺基酸序列SEq ID N〇: 2及SEQ ID N〇: 4之雙功能 抗體、及功能等同於包含CDR(或變異區）胺基酸序列seq ID NO: 2及SEQ ID NO : 4且在CDR(或變異區）胺基酸序列 SEQ ID N0 : 2及SEQ ID N0具有一或多個胺基酸突變（取代、 刪除、插入及/或添加）之胺基酸序列的雙功能抗體。 此處，「功能等同」意指所要之雙功能抗體有與包含 序列SEQ ID N0 : 6或包含CDR(或變異區）序列SEQ ID N〇 : 2 及SEQ ID NO ·· 4等同活性（如 誘導活性）。 HLA-A結合活性及細胞死亡 但通常為30個胺基 突變之胺基酸數目並不特別限定

2125-8963-PF 36 200808351 酸或更少，較佳為1 5個胺基酸或更少，更佳為5個胺基酸或 更少（如，3個胺基酸或更少）。 此外，包含胺基酸序列SEQ ID N0 : 6之雙功能抗體或 包含CDR(或變異區）胺基酸序列SEQ ID N0 : 2及SEQ ID N0 : 4之雙功能抗體可為人類化或嵌合式以減少抗人類異源抗 原性。 在胺基酸序列SEQ ID N0: 2中，胺基酸1至125對應於 該變異區；胺基酸31至35對應於CDR1 (SEQ ID N0 : 7); 胺基酸50至66對應於CDR2 (SEQ ID NO : 8)及胺基酸99至114 對應於CDR3 (SEQ ID N0 : 9)。在胺基酸序列SEQ ID N0 : 4 中，胺基酸1至107對應於該變異區；胺基酸24至34對應於 CDR1 (SEQ ID N0 : 10);胺基酸 50 至 56 對應於 CDR2 (SEQ ID NO: 11)及胺基酸 89 至 97對應於 CDR3 (SEQ ID NO: 12)。 本發明中，專一性結合HLA之HLA-辨識低分子量抗體並 不限定’只要它們具有生物活性。該低分子量本發明抗體 可以熟悉該項技術者習知方法製備。舉例來說，如實施例 所述，該抗體按HLA-辨識抗體（特別地，該變異區及CDR 之序列）之序列以熟悉該項技術者習知基因工程技術製備。 對該HLA-辨識抗體序列而言，可用已知之抗體序列。 另外，抗-HLA抗體可以熟悉該項技術者習知方法使用作為 抗原之HLA製備，然後獲得這抗體之序列並用它。具體地， 舉例來說，這可以下列方式進行：Hu蛋白質或它的片段用 作為致敏抗原’按傳統免疫方法使之免疫，獲得之免疫細 胞按傳統細胞融合方法與已知母細胞融合，然後以一般筛

2125-8963-PF 37 200808351 選方法師選生產單株抗體細胞（融合瘤（hybj· i d〇ma ))。抗 原以習知方法製備，如使用桿狀病毒之方法 (W098/46777)。融合瘤可按如 Milstein 等人（K〇hler，G. and Milstein， C·， Methods Enzymol· (1981) 73: 3-46) 方法製備。can be prepared according to the method of Mi 1 stein a/# (Kohler, G. and Milstein, C. , Methods Enzymol· (1981 ) 73 : 3-46)。當抗原具有低致免疫力 (immunogenicity)，免疫可藉結合該抗原以產生致免疫 大分子如球蛋白進行。然後，該抗體變異區〇區）〇：1)1^以逆 轉錄酶（reverse transcriptase)由該融合瘤mRNA合成， 獲得cDNA之序列可以習知方法判斷。 辨識HLA之抗體並不限定，只要它們結合至jjla。若需 要’可用小鼠抗體、大鼠抗體、兔子抗體、綿羊抗體、人 類抗體等。另外，人工修飾基因重組抗體，如嵌合式及人 類化抗體，可用以減少抗人類異源抗原性。這些修飾抗體 可以習知方法製備。嵌合式抗體為包含自非人類哺乳動 物，如小鼠，之抗體的重鏈及輕鏈變異區，以及人類抗體 之重鏈及輕鏈固定區。該嵌合式抗體可下列製備：將編碼 小机抗體變異區之D N A與編碼人類抗體固定區之d n a連 接’將這併入表現載體，然後將該載體導入宿主。 本發明發現本發明抗體誘導細胞死亡。基於本發現， 本發明提供作為活性成份之本發明抗體的細胞死亡誘導試 劑及細胞生長抑制劑。本案發明人先前發現降低抗-HLA 抗體分子量之雙功能抗體有抗人類骨髓瘤模型動物之抗腫 2125-8963-PF 38 200808351 瘤效果⑽2004/033499)。此外，本發明抗體細胞死亡誘導 活性被認為具顯著效果，特別是在活性了細胞或&細胞。因 此，本發明抗體將對於治療或預防特別腫瘤，如癌症（具 體為造血細胞腫瘤）及自體免疫疾病特別有效。本發” 提供抗腫瘤試劑或用以自體免疫疾病之治療試劑，該試劑 包括作為活性成份之本發明抗體。 此外，本發明提供包含作為活性成份之本發明抗體的 細胞死亡誘導試劑及細胞生長抑制試劑。在本發明中，該 抗體細胞死亡誘導活彳生；^切$目女 乃守成注被 < 為具有巨大效果，特別是在活 性Τ細胞或&細胞’因此’它被認為對於治療或預防特別腫 瘤’如癌症（具體為造血細胞腫瘤）及自體免疫疾病特別 有效。據此，本發明提供使用本發明抗體治療或預防腫瘤， 如癌症（具體為造血細胞腫瘤）&自體免疫疾病的方法。 當使用分子量未被降低之抗體作為活性成份，它們較佳與 抗IgG抗體等交聯。 、 本發明醫藥試劑可與干擾素（interfer〇n)併用。抗 一HU I型抗體與干擾素併用強力強化抗-HLA Ϊ型抗體活 性，如細胞死亡誘導等（曰本專利申請號。 一般而言，干擾素具抗病毒作用且由動物細胞經病毒 誘導之蛋白質或糖蛋白、雙股RNA、凝集素（Lectin)等通用 術與。除抗病毒作用外，干擾素具細胞抑制作用及免疫調 節作用依據生產它們之細胞、對專一受體之結合能力及 生物和物化特性，它們可分成幾種類型。最主要類型為《、 石及T，已知其它類型為IFNo及IFNr。此外，已知存在

2125-8963-PF 39 200808351 20或多種次類型干擾素α。現在，不僅自然衍生配方另外 各種基因重組類型配方，如PEG-干擾素及-致性干擾素 (C〇nSenSUS interferQn，CIFN)等已發展出來且商業化。 本發明干擾素可為上述任一类㈣，但它較佳為“戈 7此外八要可強化抗-HLA I型抗體細胞死亡誘導，本 發明干擾素可為自然衍生類型、人工修飾基因重組類型、 自然界中存在之突變型、融合蛋白f或其片段任—。本發 明干擾素並不特別限定，可衍生自如人類、黑猩猩、猩猩、 狗馬、綿羊、山羊、猴子、豬、I苗、小鼠、天竺鼠、大 鼠、兔子等或其它哺乳類動物。該干擾素較佳為人類—衍生 干擾素。 本發明中，本發明抗體與干擾素併用意指與干擾素一 起投予或使用（此後，簡化為「投藥、給藥⑻」 本發明抗體’並不限制給藥順序或給藥間間隔。本發明抗 體及干擾素給藥順序可為干擾素給藥後投予本發明抗體、 本lx月抗體及干擾素同時給藥或干擾素給藥前投予本發明 抗體’但較佳為干擾素給藥後投予本發明抗體或本發明抗 體及干擾素同時給藥，更佳為干擾素給藥前投予本發明抗

干擾素給藥後投予本發明抗體時，該間隔介於該干擾 素及該本發明抗體間並不特別限定，依採用因素，如投藥 途逕及劑型考量而可調正。給藥間隔例子通常為0小時至 小時，較佳為〇小時至24小時，更佳為〇小時至12小時。 本發明抗體可製成具干擾素單一醫藥組合物。此外， 2125-8963-PF 40 200808351 本發明抗體可製成醫藥組合物，其特徵為與干擾素併用。 本發明醫藥試劑可以醫藥劑型給藥，可為口服或胃腸 外（parenteral)給藥及全身性或局部性給藥。舉例來說， 如點滴注射之靜脈（intraven〇us )注射、肌肉 (intramuscular)注射、腹腔（intraperit〇neal)注射、 皮下（subcutaneous)注射、栓劑（supp〇sit〇ry)、結 腸輸注（colonic infusion)或口服腸溶劑（〇ral enteric coating agent)可選擇，可依照病患年紀及症狀選擇適當 給藥方法。每次給藥有效劑量範圍為〇 〇1 mg至1〇()mg/kg 體重。另外，每一病患該劑量為卜100““較佳為5_50 mg。舉例來說，HLA-辨識抗體案例中，給藥較佳劑量及方 法意指可以使血液無抗體存在之數量之有效量，具體例包 括依兩次/週、一次/週、一次/兩週、一次/四週等給藥時 程（administration schedule)如包括靜脈注射如點滴 輸注或皮下注射之投藥方法，如投予〇5邶至4〇邶每月（四 週）/每公斤體重’較佳為一至數個劑量i岐至2〇邶。該 給藥時程可觀察給藥後症狀及血液測試值改變㈣長給= 間隔，從兩次/週或一次/週至—次/兩週、一次/三週或一 次/四三週而調整。 較—醫藥可接受載體’如防腐劑或穩定劑可添加至本發明 -樂試劑。「醫藥可接受載體」意指本身可為有或無： 活性之材料的載體，該載體為 —‘，，、" 彳殹妒t 返酉樂蜮劑一起給華 之醫樂可接受材料。此外，它可為不具上述活性之= 當與抗-HLA抗體併用時，具加成或附加效果。 一

2125-8963-PF 41 200808351 醫藥可接受材料例子包括··無菌水、生理鹽水、穩定 劑、賦型劑、緩衝物、防腐劑、界面活性劑、螯合劑（如， EDTA)及結合劑等。 本發明中，約0.2%明膠或葡聚醣（dextr an)、0.1-10% 麵胺酸納（sodium glutamate)、大約5%乳糖或大約2% 山梨酸等可作為穩定劑，但並不限定。一般防腐劑例子包 括大約0.01%硫汞撒（1：1^11161'〇3&1)、大約0.1%)5—丙内醋 (beta-propiolactone )等。 本發明中，界面活性劑可包括非離子界面活性劑。例 如，無水山梨醇脂肪酸酯，如無水山梨醇單辛酸酯 (sorbitan monocapri late )、無水山梨醇單月桂酸酯 (sorbitan monolaurate )或無水山梨醇單棕搁酸酯 (sorbitan monopalmitate);甘油脂肪酸酯，如甘油單 辛酸酯、甘油肉豆蔻酸酯或甘油單硬脂酸酯；脂肪酸聚甘 油酯，如單硬脂酸十聚甘油醋（decaglyceryi monostearate)、二硬脂酸十聚甘油酯或單亞油酸十聚甘 油酯（deCaglyceryl monolin〇leate);聚氧乙稀無水山 梨醇脂肪酸酯，如聚氧乙烯無水山梨醇單 乙婦無水山梨醇單油«(PQlyGxyethylenes〇rbZ moriostearate)、聚氧乙烯無水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧 乙稀無水山梨醇三油酸酯或聚氧乙稀無水山梨醇三硬脂酸 醋；聚氧乙烯山梨醇脂肪酸醋，如聚氧乙稀山梨醇四硬脂 酸醋 U〇ly〇Xyethylene sorbit〇1 如咖⑽⑷、聚 氧乙烯山梨醇四油酸醋；聚氧乙稀甘油脂肪酸醋，如聚氧

2125-8963-PF 42 200808351 乙烯甘油單硬脂酸酯；聚乙烯甘油脂肪酸酯，如聚乙烯甘 油二硬脂酸酯；聚氧乙烯烷醚，如聚氧乙烯月桂醚 (P〇lyoxyethylene iauryl ether);聚氧乙烯聚氧丙烯 烷醚，如聚氧乙烯聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚 或聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚（cetylether);烷基酚 κ氧乙炸喊’如壬基紛聚氧乙稀醚（p〇iy〇xyethyiene nonylphenyl ether );聚氧乙烯硬t痳油 (polyoxyethylene hardened castor oil)，如聚氧乙烯 寛麻油或聚氧乙烯硬篦痳油（聚氧乙烯氫化蓖麻油）；聚氧 乙烯蜂蝶衍生物，如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟；聚氧乙烯羊毛 月曰竹生物’如聚氧乙浠羊毛脂（p〇ly〇xyethyiene lanolin);以及具HLB 6至18之聚氧乙烯脂肪酸醯胺，如 聚氧乙烯硬脂醯胺。 離子界面活性劑亦可列為離子界面活性劑。一般離子 界面活性劑例子可包括具1 〇至18個碳原子之烷基的烷基硫 酸鹽，如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉（s〇dium lauryl sulfate，SLS)或油醇硫酸酯納（s〇dium oleyl sulfate); 聚氧乙浠烧硫酸鹽，其加入平均摩爾之環氧乙烧 (ethyleneoxide)為2至4個，且烷基之碳原子數目為1〇 至18個’如5^氧乙浠十一烧基硫酸鈉（s〇dium polyoxyethylene lauryl sulfate) ; 8-18個碳原子烧基 之烧基石頁基破J白酸S日鹽（alkyl sulfosuccinate ester salt )，如月桂磺基琥珀酸酯鈉（s〇dium lauryl sulfosuccinate ester );自然界中存在之界面活性劑， 43

2125-8963-PF 200808351 如卵磷脂（lecithin)或磷酸甘油脂（glycer〇i lipid phosphate);抱合磷脂質（sphingophospholipid )，如 神經磷脂質（sphingomyel in);以及12至18個碳原子之脂 肪酸的脂肪酸蔗糖酯。 這些界面活性劑之一或兩或多個之組合可添加至本發 明w藥试劑。在本發明配方中，較佳界面活性劑為聚氧乙 烯無水山梨醇脂肪酸酯，如聚山梨醇20、40、60、80等， 而聚山梨醇20及80特佳。聚氧乙烯聚氧丙烯之代表泊洛沙 姆（Poloxamer )(如Pluronic F-68⑧）甘油亦為較佳。 加入之界面活性劑數量視所用界面活性劑類型而不 同但對於I山梨醇20或聚山梨醇80，通常為〇.〇〇卜1〇〇 mg/mL，較佳為〇· 003-50 mg/mL，更佳為聚山梨醇〇· 〇〇5 —2 mg/mL 〇 本發明中，緩衝物例子包括磷酸、擰檬酸緩衝物、醋 酸、蘋果酸、酒石酸、琥、乳酸、鱗酸詞、葡萄糖酸 (gluconic acid)、羊脂酸（capryUc acid)、脫氧膽 酸（deoxych〇lic acid)、水揚酸（saHcylic aci幻、 三乙醇胺（计4让抓〇1抓4〇、富馬酸（仏肋4〇此1(1)、 其它有機酸、碳酸緩衝物、Tris緩衝物、組胺酸緩衝物、 口米峻（imidazole )緩衝物等。 水溶液配方可將之沒絃# 〜 ^ i，合解成水溶液配方配方領域習知之 液態緩衝液製備。該續彳私、、念、曲 有豕緩衝液濃度一般為卜500 mM，較佳為 5-100 mM，更佳為 10 —2〇 囊。 此外，該本發明醫藥試劑可包括其它低分子量多

2125-8963-PF 44 200808351 胺基酸、 像是血清白蛋白之蛋白質、明膠及免疫球蛋白 糖及碳水化合物，如多醣或寡醣、及糖醇。 在本發明中，胺基酸例子包括驗性胺基酸，如精胺酸 (arginine)、離胺酸 Uysine)、組胺酸（ΗΜΗΗ 及鳥胺酸（ornithine)及這些胺基酸之無機鹽類（較佳為 氯鹽或磷酸鹽形式，更佳為胺基酸鱗酸）。使用游離胺基 酸，添加適當生理可接受緩衝物，如無機酸，特別是鹽酸、 磷酸、硫酸、富馬酸或其鹽類以調整邱成較佳值。於此案 例，使用磷酸鹽特別有用，因為可以獲得特別穩定冷凍乾 燥產物。該製劑大體未包含有機酸，如蘋果酸、酒石酸、 檸檬酸、琥珀酸或富馬酸，或相對應陰離子（蘋果酸離子、 酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等）不 存在時，特別有用。較佳胺基酸為精胺酸、離胺酸、組胺 酸或鳥胺酸。此外，酸性胺基酸，如麩胺酸及天冬胺酸 (asparticacid)及其鹽類（較佳為鈉鹽）。中性胺基酸， 如異白胺酸（isoleucine)、白胺酸（ieucine)、甘胺酸 (glycine)、絲胺酸（serine)、，穌胺酸（threonine)、 綠胺酸（valine)、甲硫胺酸（methionine)、半胱胺酸 (cysteine )或丙胺酸（alanine )或芳環胺基酸，如苯丙 胺酸（phenylalanine)、酪胺酸（tyrosine)、色胺酸 (tryptophan )或它的衍生物乙醯色胺酸可用。 本發明中，糖及碳水化合物，如多醣或寡醣之例子包 括：葡聚醣、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽 糖、蔗糖、海藻糖（trehalose )及棉籽糖（raffinose)。 2125-8963-PF 45 200808351 本發明中，糖醇例子包括甘露醇、山梨糖醇、肌醇 (inositol )等。 用以注射之水溶液包括如生理鹽水及等張溶液 (isotonic solution) ’包括葡萄糖或其它佐劑 (ad junctive agent )，如D-山梨糖醇、d-甘露糖、D-甘 露醇及氣化鈉。它們亦可與適當增溶劑（s〇lubilizing agent)併用，如酒精（如乙醇）、聚合醇（如丙二醇或pEG) 或非離子界面活性劑（如聚山梨醇8〇或HC〇 —5〇)。 若需要，可包括稀釋劑、增溶劑、pH-調整劑、緩解劑 (soothing agent)、含硫還原劑及抗氧化劑。 本發明中’含硫還原劑例子包括：，乙醯基半胱胺酸 (’acetyl cysteine) 、#-乙醯基同半胱胺酸（舲acetyl homocysteine)、硫辛酸（thi〇cticacid)、硫代乙二醇 (thiodiglycol)、硫代乙醇胺（thioethanolamine)、 硫代甘油（thioglycerol )、硫代山梨醇、硫代乙醇酸 (thioglycolic acid )及其鹽類、硫代硫酸鈉（sodium thiosulfate)、麩胱甘肽（glutathione，GSH)及攜帶硫氫 基（sulfhydryl group)之化合物，如1個7個碳原子之硫 代醇酸（thioalkanoic acid)。 本發明中，抗氧化劑例子包括異抗壞血酸（erythorbic acid)、二丁基經基甲苯（di butyl hydroxy toluene )、丁 基經基® 香醚（butylhydroxyanisole ) 、α -生育醇 (a -tocopherol )、醋酸鹽維他命 E ( tocopherol acetate) 、L-抗壞血酸（L-ascorbic acid)及其鹽類、 2125-8963-PF 46 200808351 L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸鈉 (sodium bisulfite)、硫酸鈉、沒食子酸三戊酯（tri amy 1 gal late)、沒食子酸丙酯（propyl gal late);螯合劑 (chelating agent )，如乙二胺四醋酸二鈉鹽 (ethylenediamine tetraacetic acid disodium，EDTA )、 焦填酸鈉（sodium pyrophosphate)及偏填酸鈉（sodium metaphosphate) ° 若需要，該醫藥試劑可裝於微膠囊内（羥甲基纖維素、 明膠、聚[甲基丙稀酸曱酯](poly [methyl methacrylate]) 等所作成之微膠囊）或製作成膠體藥物傳遞系統系統 (colloidal drug delivery system )(如微脂粒 (liposomes)、白蛋白微球（albumin microsphere)、 微乳化液（microemulsion)、奈米粒子及奈米膠囊）（參 閱’如 “Remington’ s Pharmaceutical Science 16th edition”，Oslo Ed.，1 980)。製備該醫藥試劑作為控制 釋放醫藥試劑之方法亦為熟知，這方法可應用於本發明 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15 ： 167-277 ; Langer, Chem. Tech. 1982, 12 ： 98-105 ； U· S· Patent No· 3, 773, 91 9 ;歐洲專利申請號 58, 481 ; Sidman ei s人，Biopolymers 1 983，22 : 547-556 ;歐洲 專利號1 33, 988)。 醫藥可接受載體按該劑型適當選擇自上述那些或其組 合物，但不限定於此。 製備注射劑時，如需要加入PH-調整劑、緩衝物、穩

2125-8963-PF 47 200808351 疋劑、防腐劑等以常用方法製備皮 注射劑可製備成固態配方製 =静脈注射。 乾燥儲存於容器。單劑可儲存即將溶液冷康 容器。 谷杰或多劑可儲存於相同

各種習知方法可用作A 作馮杈予本發明醫藥試 本發明中，「給筚f 之方法。 梁（t〇administer)包 腸外給藥。口服給藥白虹、， 」匕秸口服或月 服、、口梁包括以口服試劑於 劑齋I形可；登白里s #十丨 "，口 > ’該口服試 了、自顆叔劑、藥粉、藥錠 乳液、懸浮液等。 胃腸外給藥包括以可注鼾 — 了，主射形式給藥’注射劑例子包括 如點滴注射之靜脈注射、， · 皮下，主射、肌肉注射及腹腔注射 (intraperitoneal injectirm^ L...

JeCtlon)。此外，本發明方法之效 果可以下列達成：將包令寘〗 竹匕5养核苷酸之基因以基因治療技術 V入投予活之有機體。本菸明罄 +心月*樂试劑可局部投藥至治療 之，域。舉例來說，該試劑可以局部輸注或於手術間使用 導管或編碼本發明抑制劑之DNA標的基因傳輸投藥。 投藥至病患可以如動脈注射（ injection)、靜脈注射或皮下注射，aHernativeiy財 鼻腔（intranasal )給藥、經支氣管（transbr〇nchiai ) 給藥、肌肉給藥、經皮（transdermal)給藥或口服給藥進 行γ亦可使用熟悉該項技術者熟知方法：鼻腔（intranasal) 給藥、經支氣管（transbronchial )給藥、肌肉給藥、經 皮（transdermal )給藥或口服給藥。劑量視病患體重及 年紀、給藥方法等而定，不過，熟悉該項技術者可適度選

2125-8963-PF 48 200808351 擇適合劑量。此外，倘若化合物為dna 汀、、扁碼，该DNA可併 ;=治療載體，以完成基因治療。劑量及給藥方法視 ，體重、年紀及病症而定，但又它們可為熟 者適度選擇。 何 本發明醫藥試劑單一劑 病症及給藥方法而定。然而 劑量如每天約〇· ；1至1 000邶 約 1. 0 to 20 mg 〇 量視給藥標的、該標的器官、 ，一般成人（體重60 kg)注射 車又仏約1. 〇至5 0 mg，更佳 胃腸外給藥時，單一劑量視給藥標的、該標的器官、 病症及給藥方法而冑，然而，以注射方式，如每天單劑量 約0.01至30mg，較佳約0J至20邶，更佳約〇1至1〇1^ 可有利方便地靜脈脈射投藥於成人（體重6〇kg)。對其它 動物’基於體重6G kg之數量的換算數量或身體表面積對數 量之換算數量可用於給藥。 適當接種（inoculation)方法考量醫藥試劑類型、接 種實驗對象類型等而定。可用之容器為小玻璃瓶或填充前 注射器。倘若需要，溶液或冷凍乾燥製備之粉末可用。該 產品可為用以單次接種或多次接種。該劑量視給藥方法、 接種實驗對象類型、體重及年紀等而《，但又它們可為熟 悉該項技術者適度選擇。 本發明提供新穎之抗—HLA-A抗體及C3B3抗體，該抗體 與抗-小鼠IgG抗體交聯時，有細胞死亡誘導活性。在體外 腫瘤細胞分析系統，無添加抗—小鼠IgG抗體之C3B3抗體 (雙功能抗體）的低分子量抗體顯示較強的細胞死亡誘導活

2125-8963-PF 49 200808351 它們的活性遠超過傳統低分子量抗體 之〉舌。从.

骨髓細胞免 疫疾病（myeloid i immunological disorder ) isorder)、自體免疫 該低分子量抗體可預 疾病等之治療試劑的低分子量抗體， 期有較好之藥效。 此處所述之所有專利、公開專利申請及公開資料之全 部内容結合於此為參考。 實施例 本發明將進一步說明下列之實施例，但非用以侷限本 發明如後附之申請專利範圍。 實施例1 表現HLA IA型/y5 2M之Ba/F3細胞株的建立 建立表現人類HLA IA型及人類冷2M Ba/F3細胞 。 首先，全長HLA IA型（HLA- full)-表現載體製備如 下。編碼全長HLA IA型之基因片段使用編碼該全長HLA IA 型之cDNA作為模版及下列引子（sHLA-1及fHLA-3’ ）進行 PCR以擴增： 2125-8963-PF 50 200808351 sHLA-l ： TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (SEQ ID NO : 13);以及

fHLA-3’ ： TTG CGG CCG CTC ACA CTT TAC AAG CTG TGA GAG ACA (SEQ ID NO : 14)。 獲得之DNA片段以EcoRI/Notl消化並插入該動物細胞 表現載體PCXND3之EcoRI/Notl空隙，以構築全長HLA ΙΑ 型（fHLA-Α)表現載體（pCXND3-HLA- full)。 然後，全長/3 2-微球蛋白（/3 2M)-表現載體製備如 下。全長冷2M-編碼基因片段使用人類脾臟衍生之cDNA (人 類脾臟cDNA，Clontech #S1 206)作為模版及下列引子 (/3 2M-1及Θ2Μ-2)進行PCR以擴增： β 2Μ-1 ： AAG CGG CCG CCA CCA TGT CTC GCT CCG TGG C (SEQ ID NO : 15);以及 β 2M-2 ： TTT CTA GAT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA ACT (SEQ ID NO : 16)。 獲得之DNA片段以Notl/Xbal消化並插入pC0S2-ZEO之 Notl/Xbal位，以構築全長/3 2M 表現載體 (pC0S2zeo-/3 2M)。 表現HLA-A/A2M之Ba/F3細胞株建立如下。每一 20//g 之 pCXND3-HLA-full 及 pC0S2zeo-3 2M 以 Pvul消化，然後以 電穿孔（BIO-RAD電穿孔儀，〇· 33 kV，950 // F，時間常數 27.0)導入至懸浮於Ba/F3細胞PBS(-) (1 X 1〇7細胞 /Ml，800/zL)。細胞以生長培養基（rpmi 1 640 + 1 0% FCS + P/S + 1 ng/mL IL-3)稀釋成適當數量，平鋪於96—穴盤， 2125-8963-PF 51 200808351 隔天分別加入 400 // g/mL G418 及 800 // g/mL Zeocin 至細 胞。之後，每3至4天換掉一半培養基，10天後，篩選出單 株0 在獲得之表現HLA-A/ /3 2M之Ba/F3細胞株（#9、#10及 #22)及ARH77細胞中，HLA IA型表現水準以2D7 IgG (10 // g/mL)染色而判斷，細胞膜上抗原表現以FACS (COULTER, ELITE)分析（圖1)。結果顯示，細胞株#9HLA ΙΑ 型表現與ARH77細胞表現水準是相同。因此，這細胞株大 量培養於包含 1 ng/mL IL-3、500 // g/mL G418、800 // g/mL Zeocin (Invitrogen #46-0072)及 10%FCS 之 RPMI 1 640 培養 基’這用於細胞性免疫。 實施例 2 細胞性免疫 表現 HLA-Α/θ 2M 之 Ba/F3細胞株、BaF-HLA #9 以 PBS (-） 清洗兩次’懸浮於PBS( —)，形成濃度15 —2.〇 χ 1〇7細胞 /20 0 // L ’以腹腔注射（卜mL泰爾茂針筒，26 G針）這懸浮液 20 0 // L至小鼠（MRL/lpr，雄性，4週大，日本查理士河 (Japan Charles River))使之免疫。 接種免疫進行每週一次，共八次接種免疫，第九次接 種免疫（最後一次接種免疫）以2〇〇从L 25 χ 1〇?細胞 /200 " L-懸浮液進行，最後接種免疫後4天，進行細胞融合。 實施例 3 融合瘤的製備

2125-8963-PF 52 200808351 自小鼠無菌移除脾臟，於培養基1 [RPMI 1 640( + P/S)] 使之均質以產生單細胞懸浮液。這以70- // m尼龍網 (FaIcon)過濾，移除脂肪組織等，計算細胞數量。獲得之β 細胞與小鼠骨趙瘤細胞（Ρ 3 U1細胞），以細胞計算比約2 ·· 1 混合，加入1 mL 50% PEG (Roche，cat # : 783 641，lot # : 149820 00)，進行細胞融合。該融合細胞懸浮於培養 基 2 [RPMI 1 640( + P/S，10%FCS)]，於96-穴盤適當數目（十） 分配成100//L/穴，培育於37°C。隔天，加入100/zL/穴培 養基 3 [RPMI 1 640(+P/S、10%FCS、HAT(Sigma，H0262)、 5% BM Condiraed HI (Roche, cat # ： 1088947, lot # : 14994800))]，之後每穴每天移除10〇 培養基，並添加 100 // L/穴新培養基3，為期4天。 實施例4 細胞死亡誘導抗體的篩選 細胞融合後約1週篩選具細胞死亡誘導活性之融合 瘤。細胞死亡誘導抗體篩選以誘導細胞聚集能力作為指標 進行如下。 表現HLA-A//3 2M之Ba/F3細胞移植至96-穴盤，2.5 x 1〇4細胞/井，加入每一融合瘤培養上清液 (supernatant)80//L，培養該細胞於 37°C 1小時。之後， 加入抗-小鼠IgG抗體（Cappel #55482，#55459)，濃户 6 // g/mL。進行交聯反應培育4個多小時後，以顯微鏡觀疼 該細胞’篩選顯示細胞聚集之孔洞。篩選1〇〇〇細胞株培養

2125-8963-PF 53 200808351 上清液結果，獲得丨0株陽性融合瘤。來自這些陽性孔洞之 細胞再移植於至96 —孔盤，2.5細胞/井，培養約1〇天，再 次分析誘導細胞聚集活性。這操作獲得丨〇類單源細胞株。 實施例5 抗體群的製備 5 -1.抗體的純化 抗體從所獲得細胞株的融合瘤培養上清液8 〇 mL以1 mL HiTrap蛋白 S G HP管柱（女瑪西亞（Amersham Biosciences) #1 7-0404-01 )純化。該融合瘤培養上清液以流速1 mL/min 吸除，以20 mM磷酸缓衝液（ρΗ7·0) 20 mL清洗後，以0.1 Μ 甘胺酸-HC1 (ρΗ2·7)進行洗提（elution)。收集該洗提分 液（eluted fraction)於預置 50//LIMTris-HCl (ρΗ9·0) 之艾本德（Eppendorf)管，每管0·5 mL 。測量OD28〇nm， 合併含抗體分液，加入PBS(-)，以便整體積為2. 5 mL，然 後，該緩衝液使用PD-10管柱（安瑪西亞#1 7-085卜01) 取代成PBS(-)。 該純化抗體以〇· 22//m濾紙（MILL I PORE #SLGV033RS)過濾，檢驗每一純化抗體特性，詳述如下。 5-2.次型態（subtype)判斷 抗體次型態判斷以Is〇StriP(R〇che #1 493 027)進 行。對於次型態判斷係用1 〇X PBS(-)-稀釋融合瘤培養上清 液0 2125-8963-PF 54 200808351 5 - 3 ·抗原決定位分析 5-3-1.小鼠MHC IA型基因選殖 為分析該HLA IA型分子之區域為獲得之抗體所辨識， 細胞株表現嵌合式HLA IA型建立如下，其中嵌合式HLA IA 型中，該HLA IA型區域1區域、α 2區域及α 3區域）之一 以相對應之小鼠MHC I型區域取代（圖2 )。 首先，選殖以下列方法使用該小鼠MHC IΑ型基因作為 模版進行。 在小鼠脾臟cDNA (MTC群，Clontech)中，以PCR使用 下列引子（mHLA-1及mHLA-2)及pyrobest DNA聚合酶進行 以擴增該小鼠HLA IA型基因片段。 mHLA-Ι ： CTG CTC CTG CTG TTG GCG GC (SEQ ID NO ： 17) raHLA-2 ： CAG GGT GAG GGG CTC AGG CAG (SEQ ID NO ： 18) 獲得基因片段為TA -選殖至pCRII - Τ0Ρ0 (Invitrogen Τ0Ρ0 ΤΑ-選殖套組，#45-0640)以確任它的核苷酸序列。 5-3-2·用以抗原決定位分析之嵌合式Hla-Α表現載體構築 隨後’用於抗原決定位分析之嵌合式HLA-A表現載體 構築如下。 以下列方法構築該MHH表現載體，pC0S2-chHLA-MHH f lag，其中該HLA-Αα 1區域來自小鼠（MHH)。

該HLA-A訊息序列（片段A)以PCR使用pyr〇best MA 2125-8963-PF 55 200808351 聚合酶（TAKARA #R005)及攜帶作為模版之全長HLA-A (pCXND3-HLA full)表現載體、下列引子（sHLA-A及 chHLA-Hl)進行擴增。 sHLA-A ： TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (包括 EcoRI位置）（SEQ ID NO : 19);以及 chHLA-Hl ： AAT CTA GAC TGG GTC AGG GCC AGG GCC CC (包括 Xbal位置）（SEQ ID NO ·· 20)。 從HLA-A a 2區域至終止密碼子之序列（片段B)以PCR 使用下列引子 （chHLA - H2及chHLA-H3)擴增： chHLA-H2 ： TTT CTA GAG CCG GTT CTC ACA CCA TCC AGA GG (包括 Xbal 位置）（SEQ ID NO : 21);以及 chHLA-H3 ： AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (包括 BamHI 位置）（SEQ ID NO: 22)。 片段A及片段 B分別以Eco-RI-Xbal及Xbal-BamHI切 割，這些片段插入至PC0S2-FLAG之EcoRI-BamHI位置。確認 獲得質體之核苷酸序列，構築pC0S2-(M)HH。 同時，小鼠MHC ΙΑ型α 1區域（片段C)以PCR使用 pyrobest DNA 聚合酶（TAKARA #R005)及該小鼠 MHC ΙΑ 型 基因作為模版、下列引子（chHLA-ΜΙ及 chHLA-M2)進行擴 增： chHLA-ΜΙ ： TTT CTA GAG CGG GCC CAC ATT CGC TGA GG (包括 Xbal位置）（SEQ ID NO ·· 23);以及 chHLA-M2 ： TTT CTA GAC TGG TTG TAG TAT CTC TGT GCG GTC C (包括 Xbal 位置）（SEQ ID NO: 24)。 2125-8963-PF 56 200808351 獲得片段C以Xbal切割，這插入至以Xbal打開之 pC0S2-(M)HH 。確認該核苷酸序列，並這構築 pC0S2-chHLA-MHH-flag，α 1區域以小鼠MHC-A取代之表現 載體 。 以下列方法構築該ΜΗΗ表現載體，pC0S2-chHLA-ΗΜΗ f lag，其中該α 2區域來自小鼠（HMH)。 該HLA-A訊息序列-α 1區域（片段D)以PCR使用 pyrobest DNA聚合酶（TAKARA #R005)及攜帶作為模版之全 長HLA-A (pCXND3-HLA full)表現載體、下列引子（sHLA-A 及chHLA_H4)進行擴增。 sHLA-A ： TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (包括 EcoRI 位置）（SEQ ID NO: 19);以及 chHLA-H4 ： TTG TCG ACC CGG CCT CGC TCT GGT TGT AGT AG (包括 Sail 位置）（SEQ ID NO: 25). 下列引子（chHLA-H5及chHLA-H3)用以PCR擴增從 HLA-Αα 3區域至終止密碼子之序列（片段E)。 chHLA-H5 ： AAG TCG ACG CCC CCA AAA CGC ATA TGA CT (包括 Sail 位置）（SEQ ID NO: 26);以及 chHLA-H3 ： AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (包括 BamHI 位置）（SEQ ID NO: 22). 片段D及片段E分別以EcoRI-Sal I及Sail-BamHI消化， 這些片段插入至 pC0S2-FLAG之EcoRI-BamHI位置。確認獲 得質體之核苷酸序列，構築pC0S2-H(M)H 。 同時，小鼠MHC IA型α 2區域（片段F)以PCR使用 2125-8963-PF 57 200808351 pyrobest DNA聚合酶（TAKARA #R005 )及該小鼠 MHC ΙΑ型 基因作為模版、下列引子（chHLA-M3及chHLA-M4)進行擴 增： chHLA-M3 ： TTG TCG ACC ACG TTC CAG CGG ATG TTC GGC (包括 Sal I位置）（SEQ ID NO : 27);以及 chHLA-M4 : GAG TCG ACG CGC AGC AGC GTC TCA TTC CCG (包括 Sail 位置）（SEQ ID NO: 28)。 獲得片段F以Sal I消化，且插入至以Sal I打開之 pC0S2-H(M)H。確認該核苷酸序列，並這構築 pC0S2-chHLA-HMH-f lag，α 2區域以小鼠MHC-A取代之表現 載體。 以下列方法構築該ΗΗΜ表現載體，pC0S2-chHLA-HHM flag，其中該HLA-Aa3區域來自小鼠（MHH)。 該HLA-A 訊息序列-α 2區域（片段G)以PCR使用 pyrobest DNA聚合酶（TAKARA #R005)及攜帶作為模版之全 長（PCXND3-HLA full)表現載體、下列引子（sHLA-A及 chHLA-H6)進行擴增。 sHLA-A ： TCC GAA TTC CAC CAT GGC CGT CAT GGC GCC CCG AAC (包括 EcoRI 位置）（SEQ ID NO: 19);以及 chHLA-H6 ： TTT CTA GAG TCC GTG CGC TGC AGC GTC TCC T (包括 Xbal 位置）（SEQ ID NO: 29). HLA-A細胞内區域（片段H) 以PCR使用下列引子 (chHLA-H7 及 chHLA-H3)進行擴增：

chHLA-H7 ： TTT CTA GAA TGG GAG CCG TCT TCC CAG CCC 2125-8963-PF 58 200808351 A (包括 Xbal 位置）（SEQ ID NO: 30);以及 chHLA-H3 ： AAG GAT CCC ACT TTA CAA GCT GTG AGA GAC ACA T (包括 BamHI 位置）（SEQ ID NO: 22)。 片段 G及片段H分別以EcoRI - Xbal及Xbal-BamHI消 化，這些片段插入至pC0S2-FLAG之EcoRI-BamHI位置。確 認獲得質體之核苷酸序列，構築pC0S2-HH(M)。 同時，小鼠MHC IA型α 3區域（片段I)以PCR使用 pyrobest DNA 聚合酶（TAKARA #R005)及該小鼠 MHC ΙΑ 型 基因作為模版、下列引子（chHLA-M5及 chHLA-M6)進行擴 增： chHLA-M5 : AAT CTA GAA AGG CCC ATG TGA CCT ATC ACC CC (包括 Xbal 位置）（SEQ ID N0: 31);以及 chHLA-M6 ： TAT CTA GAG TGA GGG GCT CAG GCA GCC CC (包括 Xbal 位置）（SEQ ID NO: 32)。 獲得片段I以Xbal切割，這插入至以Xbal打開之 pC0S2-HH(M)。確認該核苷酸序列，並這構築 pC0S2-chHLA-HHM-flag，α 3區域以小氣MHC-A取代之表現 載體。 以下列方法構築該Μ匪表現載體，pC0S2-chHLA-Μ匪 f 1 ag，其中該α 1 - α區域來自小鼠（ΜΜΜ)。 片段Α及片段Η分別以EcoRI-Xbal及Xbal-BamHI切割， 這些片段插入至pCOS 2-FLAG之EcoR I-BamHI位置。確認獲得 質體之核苷酸序列，構築pC0S2-(MMM)。 該小鼠MHC IA型α 1 - α 3區域（片段J)以PCR使用 2125-8963-PF 59 200808351 0乂1'〇&63七〇^聚合酶（丁人1^{^#1?〇〇5)及該小鼠龍(：1人塑基 因作為模版、下列引子（chHLA-Ml及chHLA-M6)進行擴增： chHLA-Ml ： TTT CTA GAG CGG GCC CAC ATT CGC TGA GG (包括 Xbal位置）（SEQ ID NO : 23);以及 chHLA-M6 ·· TAT CTA GAG TGA GGG GCT CAG GCA GCC CC (包括 Xbal位置）（SEQ ID NO : 32)。 獲得片段J以Xbal切割，且插入至以Xbal打開之 pC0S2-(MMM)。確認該核苷酸序列，並這構築 pC0S2-chHLA-MMM-flag，其中該α 1-α 3區域來自小鼠 MHC-A ° 5-3-3·用以抗原決定位分析之嵌合式表現HLA-A/ /5 2M之 Ba/F3細胞株建立 每 一 pC0S2-chHLA-MHH-flag 、 pC0S2-chHLA-HMH-flag 、 pC0S2-chHLA-HHM-flag 及 pC0S2-chHLA-MMM-flag 20/zg 以 Pvul消化，然後以電穿孔 (BIO-RAD電穿孔儀，0· 33 kV，9 50 // F，時間常數27· 0)導 入至懸浮於Ba/F3細胞 PBS(-)(1 X 107細胞/mL， 80 0 // L) ° 細胞以生長培養基（RPMI 1 640 + 1 0% FCS + P/S + 1 ng/mL IL-3)稀釋成適當數量，平鋪於96-穴盤，隔天分 別加入500 // g/mL G418。10天後，以顯微鏡觀察篩選單源 細胞株。 至於這些細胞株，1 X 105細胞溶於50 // L 0· 5% NP40 裂解緩衝液（含 0· 5% NP40、150 mM NaCl及 5 mM EDTA之 10 祕 2125-8963-PF 60 200808351

Tris-HCl (pH7.5))，使用 12//L 上清液以 SDS-PAGE 進 行電泳。轉印至PVDF膜後，以抗-Flag M2抗體（SIGMA #F3165)及HRP-抗-小鼠抗體（安瑪西亞#财9310)進行西方 墨點法分析，以筛選生產chHLA細胞株。篩選具高度chHLA 表現這些，chHLA-MHH #8、chHLA-HMH #6、chHLA-HHM #2 及 chHLA-MMM #4，並放置含 1 ng/mL IL-3、500 // g/mL G418 及10% FCS之RPMI1640培養基，以放大培養。將以Pvui (15 // g)消化之pC0S2zeo-万2M以電穿孔法導入至每株這些 表現chHLA細胞株。隔天，分別加入500 /zg/mL之G418及 800 /zg/mL 之 Zeocin(Invitrogen #46-0072)至細胞。12 天 後’以顯微鏡觀察師選皁源細胞株（s i n g 1 e c 1 ο n e )。這 些細胞以抗-人類点2M抗體（SIGMA #M7398)及抗-小鼠 IgG-FITC 抗體（貝克曼庫爾特（Beckman Coulter ) #IM0819)染色，以FACS (貝克曼庫爾特，ELITE)分析細胞 膜/5 2M表現。具高度A 2M表現這些，chHLA-MHH/ /3 2M #1-3、chHLA-HMH/0 2M #2-1、chHLA-HHM//3 2M #3-4 及 chHLA-MMM/3 2M #4-6放置含 1 ng/mL IL-3、500 /ig/mL G418、80 0 // g/mL Zeocin及 10°/〇 FCS之 RPMI 1 640培養基，以 放大培養及用作抗原決定位分析。 5-3-4·流式細胞南速分選（Fluorescent activated cell sorting，FACS)之抗原決定位分析

為判斷獲得之抗體（1 0株）之抗原決定位，分析結合至 嵌合式表現HLA/0 2M之細胞的能力。嵌合式表現HLA//3 2M 2125-8963-PF 61 200808351 之細胞放置於96-穴盤，8 x 105細胞/井，每一抗體加入 至濃度1 〇//g/mL。於冰育一小時後，該細胞以150 //L FACS 緩衝液清洗，以抗-小鼠IgG-FITC抗體（貝克曼庫爾特 #IM0819)染色，然後以FACS(貝克曼庫爾特，ELITE)分析 (圖 3)。 結果，由於C3B3、C11B9及C17D11未結合至HMH/Ba/F3 (具有小鼠HLA α 2區域），發現該抗原決定位為α 2區 域。另外一方面，雖然C17A4、C17E9、C23H12及C26D8未 與小鼠MHC I型融合（未顯示結果），它們結合至所有嵌 合式HLA，且它們FACS染色圖式與以該抗-/3 2Μ抗體之染 色圖式相稱；因此，判斷為這些細胞株與/5 2M而非HLA反 應。由於C7C5及C20D4未結合至HMH (具小鼠HLA α 2區 域）或ΗΗΜ (具小鼠HLA α 3區域）之HLA，這些細胞株推斷 為辨識α2及α3間之區域。 5-4· 細胞死亡誘導活性 獲得抗體對ARH77細胞之細胞死亡誘導活性評估如 下。每一純化抗體（5 //g/mL)加至ARH77細胞，然該細胞 培養於有第二抗體（抗-小鼠IgG抗體，Cappel #55482, #55459)存在下（120 /zg/mL)或無在37 °C 4小時。培養後， 收集該細胞，以鐵化丙唆（prop id ium iodide，PI )染色， 以FACS (貝克曼庫爾特，ELITE)測量PI-陽性細胞（死亡細 胞）百分比（圖4)。 結果，C3B3、C17D11及C11B9抗體在交聯存在下確認有 2125-8963-PF 62 200808351 相對強之細胞死亡誘導活性。 5-5.變異區的選殖 總RNA從約5 X 106融合瘤以RNeasy迷你套組（QIAGEN #741 04)及 QIAshredder (QIAGEN #79654)純化。從總 RNA 1 β g ，cDNA 使用 SMART RACE cDNA 擴增套組（CLONTECH #PT3269-1 )合成。用包括於該套組之5’ -CDS引子。使用獲 得cDNA作為模版，該重鏈變異區（Vh)及輕鏈變異區 （VL) 以PCR於下列條件進行擴增。 引子：UPM —G2a (Vh; IgG2a)，UPM —— k(VL; k) 94°C 5秒，72°C 2分鐘，5循環 94°C 5 秒，70°C 10秒，72°C 2 分鐘，5循環 94〇c 5 秒，68°C 10秒，72°C 2 分鐘，27循環 獲得基因片段為ΤΑ -選殖至pCRII - Τ0Ρ0 (Invitrogen Τ0Ρ0 ΤΑ-選殖套組，#45-0640)，確認該核苷酸序列。序列

以分析每個基因至少二或多個質體以確認。本實施例中， 包括前導序列之重鏈變異區的核苷酸序列經確認，如SEQ ID NO : 46所示；以及為這核苷酸序列所編碼之重鏈變異區 胺基酸序列如SEQ ID NO : 47所示。從SEQ ID NO ·· 46 (SEQ ID NO: 1)第58至432個核苷酸之核苷酸序列及從SEQ ID NO · 47 (SEQ ID NO : 2)第20至144個胺基酸之胺基酸序列 相對應於該重鍵變異區。 此外’包括前導序列之輕鏈變異區的核苷酸序列經確 為’如SEQ ID NO : 48 ;以及為這核苷酸序列所編碼之輕鏈

2125-8963-PF 63 200808351 變異區胺基酸序列如SEQ ID NO : 49。從SEQ ID NO : 48 (SEQ ID NO: 3)第61至381個核苷酸之核苷酸序列及從SEQ ID NO : 49(SEQ ID NO : 4)第21至127個胺基酸之胺基酸序列相 對應於該輕鏈變異區。 5-6.抗體群研究結果產出 關於上述獲得抗體資訊摘要於板中。該資訊包括同種 型（isotype)抗體分類、編碼該抗體變異區之基因序列、抗 原決定位、與A R Η 7 7細胞結合活性、細胞死亡誘導活性等（表 1)。 分析該變異區-編碼胺基酸序列結果顯示，具有α 2區 域作為抗原決定位的三株細胞株（C3B3、C17D11及Cl 1Β9) 之重鏈變異區中，C3B3及C17D11有相同胺基酸序列，但 C11B9序列有一個胺基酸不同於C3B3/C17D11序列（圖 5-1)。該輕鏈變異區序列在三株細胞株所有是相同（圖 5-2)。 表1 群別 細胞株 編號 小鼠品糸 同種型 (isotype) 抗體 抗原決 定位 和ARH77 結合 α模型） 細胞死亡誘導 (死亡細胞百分比（％)) 交聯（-） 交聯（+) 2D7 Balb/c IgG2b a2 98.8 33.4 63.6 A C3B3 MRL/lpr IgG2a at 74 14.3 47.7 C17D11 MRL/lpr IgG2a a 2 82 8.5 53.1 C11B9 MRL/lpr IgG2a a 2 71 10.2 51.1 B C23H12 MRL/lpr IgG2a 冷2M 69. 6 4.8 42.3 C26D8 MRL/lpr IgG2a 輝 66.5 11.2 45.1 2125-8963-PF 64 200808351 C17E9 MRL/lpr IgG2a 69.6 8.7 32 C17A4 MRL/lpr IgG2a jsm 11.6 4.2 10.4 c C20D4 MRL/lpr IgG2a a 2/3 14.2 4.4 4.7 C7C5 MRL/lpr IgGl/2a a 2/3 7.8 4 4.8 D C14C7 MRL/lpr IgGl ? 2.9 3.8 5.2 實施例 6 雙功能抗體之製備 6-1.雙功能抗體載體之製備 雖然C3B3抗體顯示在第二抗體（GAM)存在下，對ARH77 細胞具細胞死亡誘導活性，該抗體單獨時未顯示有強的細 胞死亡誘導活性。因此，製備雙功能抗體，該雙功能抗體 中，該C3B3抗體變異區以5-mer胜肽（GGGGS) (SEQ ID N0 : 33)連接。 從H-鏈變異區訊息序列至FR4的部份以PCR使用Vh TA-轉殖至pCRII-TOPO作為模版及pyrobest DNA聚合酶 (TAKARA #R005)擴增。使用加入EcoRI位置之5’引子及加 入連接子序列（胺基酸GGGGS)之3’引子。 類似地，從L鏈變異區FR1至FR4的序列使用擴增Vl TA-轉殖至pCRII-TOPO作為模版及pyrobest DNA聚合酶 (TAKARA #R005)擴增。使用加入連接子序列（胺基酸： GGGGS)之5’引子及加入連接子序列（胺基酸：GGGGS)及 Flag標籤及Not I位置之3’引子。

擴增之Vh及Vl互相煉合，然後該雙功能抗體基因以 PCR使用用於兩端之引子擴增。該獲得片段以EcoRI/Not I 2125-8963-PF 65 200808351 消化，插入PCXND3之EcoRI/Notl位置。確認該核苷酸序 列，構築該表現載體。製備該C3B3雙功能抗體（連接子：5 胺基酸），該引子及PCR反應條件如下。 引子： C3B3DB-H1 ： CAG CTC AG (SEQ C3B3DB-H2 ： AGA CGG TGA CTG C3B3DB-L1 ： TGA CAC AGA CTA C3B3DB-L2 ： cct gaa ttc CAC CAT GTA CTT CAG GCT ID NO ： 34)

GGA TAT Cgc tac cgc etc cac cTG AGG AAA TTC CTT (SEQ ID NO ： 35)

CAg gtg gag geg gta geG ATA TCC AGA CAT CCT CC (SEQ ID NO : 36) att geg gee get tat cac tta teg teg

tea tee ttg tag teT TTT ATT TCC AGC TTG GTC CCC GAT CCG (SEQ ID NO : 37) PCR反應條件： 94〇C 1分鐘 94〇C 30分鐘，72°C 30分鐘，25循環 隨之，獲得PCR產物以S-300 HR管柱（安瑪西亞 #27-51 30-01 )純化，於下列條件使用pyrobest DNA聚合 酶，Ι/zLVh及 Vl相互煉合。 94〇C 1分鐘 94〇C 30分鐘，72t： 30分鐘，5循環 煉合後獲得反應溶液1 // L於下列條件，使用 C3B3DB-5’ 及 C3B3DB-3’ 進行 PCR ，其中 C3B3DB-5’ 及 C3B3DB-3’ 為較短之引子超過C3B3DB-H1 及 C3B3DB-L2。 2125-8963-PF 66 200808351 C3B3DB-5，： (SEQ ID NO ： 38) C3B3DB-3, ID NO ·· 39)

cct gaa ttc CAC CAT GTA CTT CAG GC

att gcg gcc get tat cac tta teg (SEQ 94〇C 1分鐘 94°C 30分鐘，72°c 1分鐘，25循環 擴增之片段以S - 400 HR管柱（安瑪西亞#27-5140-01 ) 純化’以EcoRI/Notl消化，並插入至pcxND3之EcoRI/Notl 位置。讀認該插入之核苷酸序列，構築 pCXND3-C3B3DB-Flag。本實施例確認後，包含前導序列及 Flag-標籤之該雙功能抗體核苷酸序列如SEq ID no ·· 50 所示；這核普酸序列所編碼之雙功能抗體胺基酸序列如seq ID NO : 51所示。在SEQ ID NO ·· 50中，從第58至432個核苷 酸之核苦酸序列相對應於該重鏈變異區；從第433至447個 核皆酸之核苷酸序列相對應於該連接子序列；以及從第448 至768個核苦酸之核苷酸序列相對應於該輕鏈變異區。在 SEQ IDN0: 51中，從第20至144個胺基酸之胺基酸序列相 對應於該重鏈變異區；從第145至149個胺基酸之胺基酸序 列相對應於該連接子序列；以及從第150至256個胺基酸之 胺基酸序列相對應於該輕鏈變異區 6 - 2 ·表現雙功能抗體細胞株的建立 這些載體導入至DG44細胞以建立生產C3B3雙功能抗 體之細胞株。每一雙功能抗體表現載體丨〇 # g以Pvu丨消化， 2125-8963-PF 67 200808351 然後以電穿孔法（BIO-RAD電穿孔儀，1· 5 kV，25 // F)導入 至懸浮於 PBS(-) (1 x 1〇7 細胞/mL，800 //L)之 DG44 細 胞。該細胞以生長培養基（CHO-S-SFMII/PS)稀釋成適當 數量，平鋪於96-穴盤，隔天加入G418，最終濃度500 // g/mL。約2週後，於顯微鏡篩選具單源細胞株之孔洞，使 用每一上清液1 0 // L以SDS-PAGE進行電泳。轉印至PVDF 膜後，以抗-Flag M2抗體（SIGMA #F3165)及HRP-抗-小鼠抗 體（安瑪西亞#NA9310)進行西方墨點法分析，以篩選生產 雙功能抗體之細胞株。可大量培養高產率之細胞株。 6-3.雙功能抗體的純化 表現C 3 B 3雙功此抗體之D 4 4細胞株的培養上清液1 〇 〇 mL 以 0.22//m 濾紙（MILLIPORE#SLGV033RS)過濾，然後以 pi 幫浦流速1 mL/min將這吸至填充1 mL抗-FLAG M2瓊脂糖膠

體（Agarose Affinity Gel) (SIGMA#A-2220)之 K9 管柱（安 瑪西亞 #1 9-0870-01 )。以 50 mM Tris-HCl (ρΗ7· 4) 、150 mM

NaCl、0· 01% Tween20 6 mL 清洗管柱後，以 〇· 1 M 甘 胺酸-HC1 (ρΗ3· 5)，0· 01% Tween20 7 mL 洗提。使用 AKTAexplorer 10S於流速1 mL/min下進行清洗及洗提。 收集該洗提分液於預置50//L 1M Tris-HCl(pH8.0)之5-mL 管’以波長280 nm讀取吸光值。合併該收集之分液，以離 心超濾裝置 Centricon YM-10 (amicon #4205)濃縮至 3〇〇 // L，然後立即進行凝膠過濾層析。

凝膠過濾層析使用Super dex 200 HR管柱（安瑪西亞 2125-8963-PF 68 200808351 #1 7-1 088-01 )及 AKTAexplorer 10S 流速 〇·4 mL/min 進行。 以0.01% Tween20之PBS(-)平衡後，上述m2-純化樣本人工

注射。以波長280 nm讀取吸光值，0.5 mL分液收集至5-mL 官。收集對應每一尖峰之分液，以〇· 22 // m濾紙（MILLI PORE #SLGV033RS或SLGV004SL)過濾然後儲存於4°c。 6-4·雙功能抗體之細胞死亡誘導活性分析 請參照第6圖，C3B3迷你抗體按分子量差異（三維結 構）以凝膠過濾層析分離成三個主要小部份（波峰（1 )、波 峰（2)及波峰（3))。這些小部份每一個測量它們的細胞死亡 誘導活性，並與2D7雙功能抗體細胞死亡誘導活性比較。 結果只有微弱細胞死亡誘導活性發現於高分子量小部 份（波峰（1)及（2) ·· C3B3多聚體），但雙聚體小部份（波峰 (3 )· C3B3雙功能抗體）發現有強的細胞死亡誘導活性， 超過2D7雙功能抗體之活性（圖7)。 6-5.比較C3B3雙功能抗體及2D7雙功能抗體間的生長抑制 作用 該純化C3B3雙功能抗體（圖6，波峰（3))和最近已知2])7 雙功能抗體比較生長抑制能力。ARH77細胞置於96-孔盤， 細胞濃度1-2 X 1〇4細胞/井，加入適當濃度之每一獲得之 抗體，培養3天後，計算細胞。養活的細胞計算以WST_8 (養 活的細胞計算試劑SF; Nacalai Tesque)判斷。更具體地， 這试劑添加10 #L/well至該細胞，該細胞培養m37°c 15

2125-8963-PF 69 200808351 小時，於分光光譜儀（spectrophotometer)，以波長45〇⑽ 頃取吸光值。該數值作為相對活細胞數量（圖8) · 結果為相較於2D7雙功能抗體，C3B3雙功能抗體於低 濃度顯示強生長抑制能力。這說明C3B3雙功能抗體為低分 子量抗體且具較強之抗腫瘤作用勝於2D7雙功能抗體。 實施例7 大量製備雙功能抗體 7-1 ·細胞上清液之製備

1 X 10 C3B3雙功能抗體—nag-表現DG44細胞懸浮 於 2 L CHO-S-SFMII (Invi trogen，c/n ·· 1 2052-098)/PS (Invitrogen，c/n: 1 5140-1 22)培養基，置於細胞 TACK (康 寧（Corning)，c/n : 3271 )。細胞培養於37°c 在 5% c〇2 培 育箱，當存活率低於60%時（培養約7天），收集細胞上清液。 a亥收集之細胞上清液在4°C下以3 0 0 0 rpm離心2 0分鐘，上清 液以0.22//Π1濾紙（康寧，c/n : 430513)過濾，然後儲存 於 4°C。 7 - 2 ·層析純化（1) 7 - 2-1·陰離子交換柱粗略純化 XK50管柱以瓊脂糖離子交換劑q Sepharose Fast Flow (安瑪西亞，c/n : 17-0510-01)(柱床體積1〇〇 mL)填充。 這連續以 500 mLinilliQ 水及 500 mL 含lMNaCl 及 0.01% Tween20 之 20 mMTris-HCl (ρΗ7·5) (QB)清洗，然後以 500 2125-8963-PF 70 200808351 mL 含 0.01% Tween20 之 20 mM Tris-HCl (ρΗ7·5) (QA)平衡。 兩倍稀釋，2 L培養上清液加入2L mill iQ水，以約20 mL 1 M Tris調整pH至7· 8，這吸至該平衡管柱。吸取以pi 幫浦於最大流速10 mL/min於4°C進行約15小時。隨之，使 用 AKTAprime 流速 10 mL/min清洗及洗提。以 30 0 mL 16% QB 清洗該管柱後，使用400 mL 25% QB及100 mL 30% QB洗提。 12 mL分液收集於15-mL管。轉換成25% QB後，以波長280 nm 讀取吸光值，分液從第一尖峰收集直到通過3〇% QB 100 mL。 收集之分液以0· 22 // m濾紙（康寧，c/n : 430626)過濾 後，加入0· 6當量之QA，該鹽類濃渡調整約150 mM，並將這 儲存於4°C。

該管柱以 400 mL QB、200 mL 0· 1 M NaOH及 200 mL QB 連續清洗，然後以5 0 0 mL QA使之平衡以作離心。 7-2-2·抗-FLAG M2親和性管柱（M2管柱）純化

XK26管柱以抗-FLAG M2親合性膠體Freezer-Safe (SIGMA，c/n : A2220)(柱床體積 10 mL)填充。這以 5〇 mL 含 150 mM NaCl及0.01% Tween20之50 mM Tris-HCl (ρΗ7·4) (ΜΑ)及 30 mL 含 0· 01% Tween20 之 〇. 1 μ Glycine-HC1 (ρΗ3·5) (MB)清洗，以50 mL MA使之平衡。

然後’將540 mL陰離子交換柱-粗略純化樣本（對應於 約 2 L培養上清液）吸至兩串聯Μ 2管柱。吸取以p 1幫浦於 最大流速10 mL/m in於4°C進行約15小時。隨之，使用 AKTAexplorer 10S 流速 4 mL/min 清洗及洗提。以 5〇 mL MA 2125-8963-PF 71 200808351 清洗該管柱後，使用30 mL 100% MB洗提。收集該洗提液於 預填 200 //L of 1 M Tris-HCl (ρΗ8·0)之 5-mL 管，以波長 280 nm讀取吸光值。合併該收集分液及將這以Centriprep ¥肘-10(3111丨〇:〇11，（：/11:43 04)離心至5 11^後，這立即凝膠過 濾、用以緩衝液更換。肉眼觀察發現不溶物時，該溶液以q . 2 2 /zm 濾紙（MILLIPORE，c/n: SLGV013SL)過濾，然後凝膠 過濾。 洗提樣本後’該管柱以50 mL ΜA使之平衡，儲存於4 °C。當該管柱超過一週不使用，以30mL或更多含15〇錢

NaCl 及 0.02% NaN3 之 50 mM Tris-HCl (ρΗ7·4)流通該管 柱，將之儲存於4°C。 7-2-3.凝膠過濾層析純化 使用 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (安瑪西亞，c/n : 1 7 -1 0 71 - 01)凝膠過渡以分離該雙功能抗體及緩衝液更 換。這操作使SAKTAexplorer 10S流速2mL/min進行。以 含0.01% Tween20之PBS(-)使之平衡後，上述M2-純化樣本 人工注射。以波長280 nm讀取吸光值同時，收集約200 mL 保留體積之洗提尖峰2.5 mL至5 _mL管。合併該收集分液以 0·22 //m 濾紙（MILLIPORE，c/n: SLGV033RS)過濾，然後 儲存於4°C。 測試每一區域純化雙功能抗體活性，合併它們並以

Centriprep YM-10( am icon，c/n : 4304)濃縮成約 1 mg/mL， 以 0·22 //m 濾紙（MILLIPORE，c/n: SLGV033RS)過滤， 2125-8963-PF 72 200808351 然後儲存。 7-3.層析純化（2) 從上述（7-1)獲得培養上清液，該C3B3雙功能抗體以 三步驟純化：離子交換層析、氫氧基構灰石層析 (hydroxyapatite chromatography)及膠體過渡層析。

該培養上清液以超純透析水（u 1 trapure water)三倍 稀釋後，以1 M Tris調整pH至8. 0。這以0. 0 2% Tween2 0 之20 mM Tri-HC1 (pH8.0)平衡的瓊脂糖離子交換劑（Q

Sepharose Fast Flow ) 管柱（通用電氣醫療 （GE

Heal thcare ))層析，該管柱以相同緩衝液清洗。吸至管 柱之多肽然後使用具NaCl線性濃度梯度（從〇 μ至0.5 M) 的相同緩衝液洗提。獲得之分液以SDS-PAGE分析，收集所 有含该C 3 B 3迷你抗體（C3B3多聚體及C3B3雙功能抗體） 分液。 第一步驟獲得之C3B3分液加至以含0.02% Tween20之 10 Mm磷酸緩衝液（ΡΗ7·0)平衡的氫氧基磷灰石管柱 (BI0-RAD，I型，20//m)，該管柱以相同緩衝液清洗後，磷 酸緩衝液濃度線性增加至2 5 0 mM，洗提吸至該管柱之多 肽。經洗提之尖峰以SDS_PAGE及使用Superdex 2〇〇 pc 3· 2/30管柱（通用電氣醫療）膠體過濾層析分析。只收集顯 示具所要C3B3雙功能抗體分子量之尖峰。 第二步驟獲得之C3B3雙功能抗體尖峰部份使用amic〇n ultra 10 kDa cut(MILLIP0RE)濃縮，平衡於含 Q 〇i%

2125-8963-PF 73 200808351

Tween2〇之pBS( —)，然後加至HiL〇ad 26/6〇如㈧以以2〇〇叩 吕柱（通用電氣醫療）。獲得分液以SDS_pAGE分析，判斷含 所要之C 3 B 3雙功能抗體的主要尖峰以為經純化之部份。 經純化之C3B3雙功能抗體使用Superdex 200 PC 3· 2/30管柱進行分析膠體過濾層析，產生單一尖峰該明 顯的分子量約52 kDa。 该C3B3雙功能抗體SDS-PAGE分析顯示，在還原及非還 原條件下，單一條帶發現於單體分子量位置（約Μ kDa)。 因此’這顯示該C3B3雙功能抗體為雙聚體，該雙聚體中， 兩分子單鏈Fv以非共價鍵結。 實施例8 C3B3雙功能抗體藥效之評估 8-1. C3B3雙功能抗體對體外細胞生長之抑制作用 為詳細分析C3B3雙功能抗體抗腫瘤作用，該雙功能抗 體對各種人類造血腫瘤細胞細胞株之生長抑制作用測試如 下。 所用之細胞為EBV-轉形B細胞株ARH-77、IM-9及 MC/CAR ;以及人類 Burkitt’ s 淋巴瘤細胞株、 HS-Sultan。包含10% FCS之RPMI 1 640培養基用以培養 ARH - 77、IM-9 及 HS-Sultan。包含 20%FCS 之 Iscove’ s改良 Dulbecco培養基用以培養MC/CAR。細胞置於96-孔盤， 八1?11-77及1^1-9濃度3又103細胞/井，丛(：/0八以農度5\1〇3 細胞/穴及HS-Sultan濃度1 X 104細胞/井；該細胞培養在 2125-8963- PF 74 200808351 C3B3雙功能抗體或2D7雙功能抗體存在下，5%C〇2培養箱 中 37C 3天。WST-8 (Cat. No· 07553-1 5，Nakalai Tesque) 加至每一孔洞，繼續培養另一 4小時，然後使用多功能微盤 分析儀（MicroPlate Reader)·以波長450 nm讀取吸光值（參 考波長655 nm)。無添加抗體之孔洞吸光值定義為100%而 無添加細胞之孔洞吸光值定義為〇%，以檢測細胞生長。檢 測實施三重複，計算平均及標準差（圖9)。 用作實驗之所有細胞株中，該C3B3雙功能抗體及2D7 雙功此抗體兩者顯示濃度依賴細胞生長抑制。然而，比較 下’該C3B3雙功能抗體顯示生長抑制作用勝於低濃度2D7 雙功能抗體最大活性。 8-2· C3B3雙功能抗體體内抗腫瘤作用 8-2-1.小鼠血清人類igG*析 小鼠血清中人類IgG數量以下述ELISA測量。以0. 1 mol/L 石反酸氣鹽緩衝液（bicarb〇nate buffer) (ρΗ9· 6)稀 釋成 1/zg/mL 山羊抗—人類 IgG (bi〇SOURCE)100//L 置於 96-孔盤（Nunc)。這培養於4°c過夜，使該抗體固定。阻斷 後’加入逐步稀釋之小鼠血清，並加入1〇〇 # L人類IgG (Cappel)作為標準樣本。這培養於室溫兩小時。清洗後， 加入100//L稀釋5〇〇〇倍鹼性磷酸酶（aikaline phosphatase)-標定抗-人類 IgG 抗體（BI〇s〇URCE)，培 養於室溫兩小時。清洗後，加入受質溶液並培養，然後使 用 MICROPLATE READER 型號 3550 (BI0-RAD)以波長 405 nm 讀取吸光值。

2125-8963-PF 75 200808351 8-2-2. C3B3雙功能抗體對人類EBV-轉形B細胞（IM-9)-移 植小鼠之抗腫瘤作用 8-2-2-1· IM-9移植小鼠之製備 IM-9移植小鼠以下列製備。體外次培養於含1 〇% pcs (Hyclone)之 RPMI 1 640培養基（SIGMA-ALDRICH)的 IM-9細胞 於上述培養基δ周整為5 X 106細胞/mL 。前一天以腹腔注 射100 // L抗-asialo-GMl (日本和光純藥工業株式會社 (Wako Pure Chemical Indurstries))預處理之 scid 小 鼠（6-週大雌鼠，japan clea)經鼠尾靜脈注射20〇 # L上述 IΜ-9細胞製劑溶液。 8-2-2-2.抗體之投予 ΙΜ - 9-移植後，第一、二及三天一天給藥兩次，總計六 次給藥，該抗體（2D7雙功能抗體或C3B3雙功能抗體）透過尾 巴靜脈投予上述ΙΜ-9-移植小鼠1〇 mg/kg。對照組，透過尾 巴靜脈投予含Tween20之PBS 10 mL/kg。 8-2-2-3· C3B3雙功能抗體對im-9移植小鼠之抗腫瘤之評 估 該C3B3雙功能抗體抗腫瘤作用使用該小鼠存活時間 及血清中人類IgG數量作為評估。請參照第1〇圖，相較於對 照組小鼠，投予C3B3雙功能抗體之小鼠存活時間明顯延 長。該存活時間甚至與投予2D7雙功能抗體之小鼠比較仍 有延長。此外，IM-9移植後第14天，收集小鼠之血清，如 2125-8963-PF 76 200808351 8 2 1上述以EL ISA測量（第11圖）。結果，相較於對照組小 亂’投予C3B3雙功此抗體之小鼠在血清中人類IgG水準明 顯減少，如圖11所示。與投予2D7雙功能抗體之小鼠比較， 該血清中人類IgG水準於投予C3B3雙功能抗體之小鼠顯示 仍有降低之趨勢。因此，這顯示該C3B3雙功能抗體對於人 類EBV-轉形B細胞-移植小鼠有較強抗腫瘤作用評估勝於 該2D7雙功能抗體。 實施例9 C3B3雙功能抗體誘導人類PBMC細胞死亡之測試 測試C3B3雙功能抗體及2D7雙功能抗體對人類外周血 單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC) 之細胞死亡誘導作用。PBMC從健康成人外周血液以比重離

心（specific gravity centrifugation)單離。該PBMC 置於96-孔盤，5 x 105細胞/六（刀豆素A (concanavalin A，Con A)刺激下）或1· 5 x 105細胞/井（SAC刺激下）。 加入刀豆素A (之後簡稱ConA，曰本和光純藥工業株式會社） 最終濃度10 //g/mL及加入SAC(Pansorbin細胞，

Carbiochem)最終濃度0· 01%。此外，加入該C3B3雙功能抗 體或2D7雙功能抗體最終濃度10 /zg/mL。細胞培養在5% C〇2培養箱於37°C三天。培養第三天，每孔洞加入10 # g/mL 之 Cell Counting Kit-8 (Dojindo)，在 5% C〇2 培養箱於 37°C 反應7 小時後，使用 MICROPLATE READER (BIO-RAD)以 波長450 nm讀取吸光值（參考波長630 nm)。 2125-8963-PF 77 200808351 如圖1 2所示’該結果顯示以c〇nA及SAC刺激時，該C3B3 雙功此抗體具有較強細胞死亡誘導活性勝於該2 D 7雙功能 抗體。 實施例10 C 3 B 3雙功能抗體於體外抑制細胞生長 C3B3雙功能抗體對人類τ_細胞腫瘤細胞之生長抑制 作用測試如下。使用（Ε6-1)品系細胞（購自ATCC)。含1〇% FCS之RPMI 1 640培養基用以培養jurkat(E6-1)細胞。 Jurkat細胞置於96-穴盤，2xl04細胞/穴，並在該C3B3雙功 能抗體或2D7雙功能抗體存在下，培養在5% c〇2培養箱於 3 7 C 3天。隨之’每孔洞加入細胞計數試劑盒_ 8 (編號 CKO4，Do j indo Laboratories，日本）。培育兩小時後， 使用多功能微盤分析儀（MicroPlate Reader)以波長450 nm 頊取吸光值（參考波長6 3 0 nm)。為測量細胞生長，無添加 抗體之孔洞吸光值定義為1 〇 〇 %，而無添加細胞之孔洞吸光 值定義為0%。測試為三重複並計算該平均及標準差（SE) (圖13)。該C3B3雙功能抗體及2D7雙功能抗體兩者在 Jurkat細胞表現為濃度-依賴細胞生長抑制。然而，相較 下，該C3B3雙功能抗體顯示較高生長抑制作用勝於2D7雙功 能抗體，甚至在較低濃度。 先前研究顯示HLA抗體一般來說對淋巴細胞有作用 (WO2 0 04/033499及W0200 5/1 00560)，而本發明中新發現之 全長抗體及低分子量抗體按上述結果來看，一般期望對淋 2125-8963-PF 78 200808351 巴細胞有所作用。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示以FACS確認於表現HLA之Ba/F3細胞株及 ARH77細胞中HLA IA型表現水準之結果。 第2圖顯示細胞株表現嵌合式HLA I a型之示意圖，其中 欲合式HLA IA型中，HLA IA型區域（α卜α 3區域）之一以相 對應之小鼠MHC IΑ型區域取代。 第3圖顯示1 〇株抗體株之抗原決定位分析結果表，該 抗體株以共表現HLA-A / 2-微球蛋白（石2M)之Ba/F3細胞 使小鼠免疫所獲得。與每一類表現人類—小鼠嵌合式HLA IA型之Ba/F3細胞（MHH、HMH及HHM)結合活性以FACS分 析，（+ )表示癌定結合；而（-)表示無結合。每一株抗原決 定位從各自染色圖案判斷。 第4圖顯示測試在有無第二抗體存在下，1 〇株抗體株對 ARH77細胞之細胞死亡誘導活性之結果，該抗體株以共表現 HLA-A/ /3 2-微球蛋白（石2M)之Ba/F3細胞使小鼠免疫所獲 得。 第5-1圖顯示2D7及新得到之C3B3、C17D11及C11B9之重 鏈變異區胺基酸序列。 第5_2圖顯示2D7及新得到之C3B3、C17D11及C11B9之輕 鏈變異區胺基酸序列。 第6圖顯示該C3B3迷你抗體使用凝膠過濾層析純化所 獲得之分離樣品的層析圖。 2125-8963-PF 79 200808351 第7圖顯示以凝膠過濾層析分離之C3B3迷你抗體尖蜂 (1)-(3)每一個對ARH77之體外細胞毒殺活性的圖表。 第8圖顯示該C3B3雙功能抗體（C3B3 DB)及2D7雙功能 抗體（2D7 DB)對ARH77之體外細胞生長抑制活性的圖表。 第9圖顯示該C3B3雙功能抗體（C3B3 DB)及2D7雙功能 抗體（2D7 DB)對人類骨髓瘤細胞（ARH77、IM —9、 奶-8111七311、诞(：/0人1〇之體外細胞生長抑制活性的圖表。 第10圖顯示PBS/Tween20 (對照組）、該2D7雙功能抗體 (2D7 DB)或C3B3雙功能抗體（C3B3 DB)給藥，IM-9-移殖小 鼠存活時間的圖表。 第11圖顯示移植後第14天，IM-9移植小鼠中，血清中 人類IgG數量之圖表。PBS/Tween2〇(對照組）、該2D7雙功能 抗體（2D7 DB)或C3B3雙功能抗體（C3B3 DB)給藥。 第12圖顯示該C3B3雙功能抗體及2D7雙功能抗體對人 類外周血單核細胞（PBMC)體外細胞毒殺活性之圖表。 第13圖顯示該C3B3雙功能抗體及2D7雙功能抗體對人 類T-細胞腫瘤細胞之生長抑制作用。每一抗體對培養3天 之Jurkat細胞生長抑制作用如圖所示。 【主要元件符號說明】 益

o' 2125-8963-PF

Claims (1)

1. 200808351 十、申請專利範圍： 1· 一種抗體，包含複數個重鏈變異區，其中該些重鍵 變異區包括由胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 7、8及9所構成之 CDR1、2及 3。 2 · —種抗體，包含複數個輕鏈變異區，其中該些輕鏈 變異區包括由胺基酸序列SEQ ID N0 ·· 10、11及12所構成之 CDR1、2及 3。 3· 一種抗體，包含複數個重鏈變異區及輕鏈變異區， 其中該些重鏈變異區包括由胺基酸序列SEQ ID N0 : 7、8 及9所構成之C DR 1、2及3;以及該些輕鏈變異區包括由胺基 酸序列SEQ ID N0 : 10、11及12所構成之CDR1、2及3。 4 · 一種抗體，包含下列任一之重鏈變異區： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 2之重鏈變異區； (b) 包括在胺基酸序列SEQID no·· 2上有一或多個胺 基酸取代、删除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能等 同於重鏈變異區（a)之重鏈變異區； (C)包括含有核普酸序列SEQIDN0: iiDNAK編碼之 胺基酸序列的重鏈變異區；以及 (d)在一嚴格條件下 1之DNA雜交之DNA所編碼之 ，與包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 胺基酸序列的重鏈變異區。 種抗體’包含下列任一之輕鏈變異區： 5. (e) 包含胺基酸序列SEQ ID N0 · I* a , iNU · 4之輕鏈變異區； (f) 包括在胺基酸序列SEQ ID ΝΠ· ^ · 4有一或多個胺基 酉夂取代、刪除、插入及/或添加之胺基 馱序列，且功能等同 2125-8963-PF 81 200808351 於輕鏈變異區（e)的輕鏈變異區； (g) 包括含有核苷酸序列SEQ ID N0 : 3之DNA所編碼之 胺基酸序列的輕鏈變異區；以及 (h) 在一嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ I]} : 3之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的輕鏈變異區。 6· —種抗體，包含（a)至（d)任一之重鏈變異區及（e) 至（h)任一輕鏈變異區： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 2之重鏈變異區； (b) 包括在胺基酸序列SEQ ID N0: 2有一或多個胺基 酸取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列，且功能等同 於重鏈變異區（a)的重鏈變異區； (c) 包括含有核苷酸序列SEq iDN0:之DNA所編碼之 胺基酸序列的重鏈變異區；以及 (d) 在一嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ ID : 1之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列的重鏈變異區； (e) 包含胺基酸序列SEQ ID N0: 4之輕鏈變異區· (〇包括具有在胺基酸序列SEQ ID N0: 4有一或多個 胺基酸取代、删除、插入及/或添加之胺基酸序列，且匕 月匕 等同於輕鏈變異區（e)的輕鏈變異區； (g) 包括含有核苷酸序列SEQ ID N0 : 3之DNA所編碼之 胺基酸序列的輕鏈變異區；以及 (h) 在一嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ Μ。： 3之DNA雜父之DNA所編碼之胺基酸序列的輕鏈變異區。 7· 一種抗體，包含下列任一胺基酸序列·· 2125-8963-PF 82 200808351 (a) 胺基酸序列SEQ ID NO : 6 ; (b) 在胺基酸序列SEQ ID NO : 6中有一或多個胺基酸 取代、刪除、插入及/或添加之胺基酸序列； (c) 包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 5之DNA所編碼之胺基 酸序列；以及 (d) 在一嚴格條件下，與包含核苷酸序列SEQ ID N0 : 5之DNA雜交之DNA所編碼之胺基酸序列。 8 · —種抗體，該抗體結合至一抗原決定位，其與申請 專利範圍第1至7項任一所述之抗體所結合之人類白血球抗 原（HLA)蛋白抗原決定位相同。 9·如申請專利範圍第1至8項任一所述之抗體，其中該 抗體為一單株抗體。 10·如申請專利範圍第1至9項任一所述之抗體，其中 該抗體辨識一人類白血球抗原（HLA)。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項所述之抗體，其中該HLA 為HLA I型。 12.如申請專利範圍第丨丨項所述之抗體，其中該HLA I 型為HLA-A。 1 3 ·如申請專利範圍第1至丨2項任一所述之抗體，其中 該抗體為一低分子量抗體。 14·如申請專利範圍第13項所述之抗體，其中該低分 子量抗體為一雙功能抗體。 1 5· —種（a)或（b)之聚核苷酸，其中 (a)包含核苷酸序列SEq id NO ·· 1、3或5之聚核苷 2125-8963-PF 83 200808351 酸；或 酸，且該聚核 (\)在嚴袼條件下，與聚核苦酸（a)雜交之-聚核苦 碼一抗體，該抗體與申請專利範圍第1 至14項任一抗體之活性相同。 ’種載體’包括如申請專利範圍第15項之聚核苷 酸0 1 7· 一種宿主細胞，包括如申請專利範圍第丨5項之聚 核普酸或如中請專利範圍第16項之載體。 18· 一種製造如申請專利範圍第1至14項任一所述之 抗體的方法，包括下列步驟： (a) 製備如申請專利範圍第15項所述之聚核苷酸； (b) 構築一包含聚核苷酸（a)之載體； (c) 將該載體（b)導入複數個宿主細胞；以及 (d) 培養該些宿主細胞（c)。 19· 一種細胞死亡誘導試劑，包括作為活性成份之申 請專利範圍第1至14項任一項所述之抗體。 20·如申請專利範圍第19項所述之細胞死亡誘導試 劑’該試劑誘導B細胞或T細胞死亡。 21 ·如申請專利範圍第20項所述之細胞死亡誘導試 劑，其中該B細胞或T細胞為一活化B細胞或活化T細胞。 22. —種細胞細胞生長抑制試劑’包括作為活性成伤 之申請專利範圍第1至14項任一項所述之抗體。 23. —種抗腫瘤試劑，包括作為活性成份之申請專利 範圍第1至14項任一所述之抗體。 2125-8963-PF 84 200808351 24. 如申請專利範圍第23項所述之抗腫瘤試劑，其中 該腫瘤為造血細胞腫瘤（hematopoietic tumor)。 25. —種治療自體免疫疾病之試劑，包括作為活性成 份之申請專利範圍第1至14項任一項所述之抗體。 2125-8963-PF 85 1 200808351 序列表 <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120〉細胞死亡誘導試劑（CELL DEATH-INDUCING AGENTS) <130〉 C1-A0604 <150〉 JP 2006-193053 <151> 2006-07-13 <160> 51 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211〉 375 <212> DNA <213〉 Mus musculus <220> <221> CDS <222〉 （1)..(375) <400〉 1 gaa gtg aag ctg gtg gag tct gag gga ggc tta gtg cag cct gga agt Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 10 15 tcc atg aaa etc tcc tgc aca gcc tct gga ttc act ttc agt gac cat Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 tac atg get tgg gtc ege cag gtt cca gaa aag ggt eta gaa tgg gtt Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 48 96 144 192 2 200808351 gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg gac tcc ttg Ala Asp lie Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 aag age cgt ttc ate ate teg aga gac aat gga aag aac att eta tac Lys Ser Arg Phe lie lie Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn lie Leu Tyr 65 70 75 80 eta caa atg age agt ctg aag teg gag gac aca gee aeg tat tac tgt Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gat agg gtt agg tec tec tac tat agt aat etc ttt get atg Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga att tea gtc acc gtc tec tea Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 2 <211> 125 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 2 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 240 288 336 375 3 200808351 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe He lie Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn lie Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 3 <211〉 321 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <400〉 3 gat ate cag atg aca cag act aca tcc tcc ett tet gcc tet ctg gga Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 96 4200808351 15 10 15 gac aga gtc acc ate agt tgc agg gca agt cag gat att gee aat tat Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ala Asn Tyr 2〇 25 30 tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa etc ctg ate Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45 tac tac aca tea aga tta cac tea gga gtc cca tea agg ttc agt ggc Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tet ggg aca gat tat tet etc acc ate age aac ctg gaa cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat att gee act tac tat tgt cag cag tat age aag ett ccg tat Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 aeg ttc gga teg ggg acc aag ctg gaa ata aaa Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 144 192 240 288 321 <210> 4 <211〉 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 4 Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 5 200808351 Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ala Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu He 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 5 <211〉 711 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成聚核苷酸序列 <220> <221〉 CDS <222> (1)..(711) 6 200808351 <400〉 5 gaa gtg aag ctg gtg gag tct gag gga ggc tta gtg cag cct gga agt 48 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 10 15 tcc atg aaa etc tcc tgc aca gcc tct gga ttc act ttc agt gac cat 96 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 tac atg get tgg gtc ege cag gtt cca gaa aag ggt eta gaa tgg gtt 144 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg gac tcc ttg 192 Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 aag age cgt ttc ate ate teg aga gac aat gga aag aac att eta tac 240 Lys Ser Arg Phe He lie Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn He Leu Tyr 65 70 75 80 eta caa atg age agt ctg aag teg gag gac aca gcc aeg tat tac tgt 288 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga gat agg gtt agg tcc tcc tac tat agt aat etc ttt get atg 336 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 gac tac tgg ggt caa gga att tea gtc acc gtc tcc tea ggt gga ggc 384 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 ggt age gat ate cag atg aca cag act aca tcc tcc ett tct gcc tct 432 Gly Ser Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 480 7200808351 ctg gga gac aga gtc acc ate agt tgc agg gca agt cag gat att gee Leu Gly Asp Arg Val Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ala 145 150 155 160 aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt aaa etc Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 165 170 175 ctg ate tac tac aca tea aga tta cac tea gga gtc cca tea agg ttc Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 agt ggc agt ggg tet ggg aca gat tat tet etc acc ate age aac ctg Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu 195 200 205 gaa cct gaa gat att gee act tac tat tgt cag cag tat age aag ett Glu Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 ccg tat aeg ttc gga teg ggg acc aag ctg gaa ata aaa Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 225 230 235 528 576 624 672 711 <210> 6 <211> 237 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223> 合成構築體Synthetic Construct <400〉 6 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 8 200808351 15 10 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe lie He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn He Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp He Ala 145 150 155 160 9 200808351 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu 165 170 175 Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu 195 200 205 Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu 210 215 220 Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 225 230 235 <210〉 7 <211〉 5 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asp His Tyr Met Ala 1 5 <210> 8 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus 10 10200808351 <400> 8 Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu Lys 15 10 15 Ser <210> 9 <211> 16 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 9 Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met Asp Tyr 15 10 15 <210〉 10 <211> 11 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 10 Arg Ala Ser Gin Asp He Ala Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210〉 11 <211〉 7 <212> PRT <213> Mus musculus 200808351 <400〉 11 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210〉 12 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 12 Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr ’ 1 5 <210〉 13 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223> 人工合成引子序列 <400〉 13 tccgaattcc accatggccg tcatggcgcc <210〉 14 <211〉 36 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成引子序列 36 12200808351 <400〉 14 ttgcggccgc tcacacttta caagctgtga <210〉 15 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220> <223> 人工合成引子序列 <400〉 15 aagcggccgc caccatgtct cgctccgtgg <210〉 16 <211> 33 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220> <223> 人工合成引子序列 <400〉 16 tttctagatt acatgtctcg atcccactta <210〉 17 <211〉 20 <212〉 DNA <213> 人工序列 <220〉 <223> 人工合成引子序列 31 33 200808351 <400〉17 ctgctcctgc tgttggcggc <210〉 18 <211> 21 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>人工合成引子序列 <400> 18 cagggtgagg ggctcaggca g <210> 19 <211> 36 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 19 tccgaattcc accatggccg tcatggcgcc ccgaac <210〉 20 <211〉 29 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 20 14200808351 aatctagact gggtcagggc cagggcccc 29 <210〉 21 <211> 32 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 21 tttctagagc cggttctcac accatccaga gg <210> 22 <211> 34 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 22 aaggatccca ctttacaagc tgtgagagac acat <210〉 23 <211〉 29 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成引子序列 <400> 23 32 34 tttctagagc gggcccacat tcgctgagg 29 200808351 <210〉 24 <211〉 34 <212〉 <213〉 DNA 人工序列 <220〉 <223〉 人工合成引子序列 <400> 24 tttctagact ggttgtagta tctctgtgcg gtcc <210〉 25 <211> 32 <212〉 <213> DNA 人工序列 <220〉 <223> 人工合成引子序列 <400> 25 ttgtcgaccc ggcctcgctc tggttgtagt ag <210〉 26 <211> 29 <212〉 <213〉 DNA 人工序列 <220〉 <223> 人工合成引子序列 <400〉 26 aagtcgacgc ccccaaaacg catatgact 16 200808351 <210〉 27 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工合成引子序列 <400〉 27 ttgtcgacca cgttccagcg gatgttcggc 30 <210〉 28 <211> 30 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>人工合成引子序列 <400> 28 gagtcgacgc gcagcagcgt ctcattcccg 30 <210〉 29 <211> 31 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 29 31 tttctagagt ccgtgcgctg cagcgtctcc t 200808351 <210> 30 <211> 31 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 30 tttctagaat gggagccgtc ttcccagccc a <210〉 31 <211〉 32 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 31 aatctagaaa ggcccatgtg acctatcacc cc <210〉 32 <211> 29 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <223>人工合成引子序列 <400〉 32 tatctagagt gaggggctca ggcagcccc <210〉 33 18 200808351 <211> 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成多肽序列 <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 34 <211〉 35 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 34 cctgaattcc accatgtact tcaggctcag ctcag 35 <210〉 35 <211> 48 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工合成引子序列 <400> 35 48 ggatatcgct accgcctcca cctgaggaga cggtgactga aattcctt 19 200808351 <210〉 36 <211〉 47 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉人工合成引子序列 <400> 36 caggtggagg cggtagcgat atccagatga cacagactac atcctcc 47 <210> 37 <211> 69 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223〉人工合成引子序列 <400> 37 attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt cttttatttc cagcttggtc 60 cccgatccg 69 <210> 38 <211〉 26 <212〉 DNA <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400> 38 26 cctgaattcc accatgtact tcaggc 20 200808351 <210〉 39 <211〉 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223>人工合成引子序列 <400〉 39 attgcggccg cttatcactt atcg <210〉 40 <211> 115 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成多肽序列 <400〉 40 Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Phe He His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Trp He Phe Pro Gly Asp Asp Thr Thr Asp Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 21 200808351 Arg Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 lie Leu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Val Arg Ser Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210〉 41 <211> 106 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成多肽序列 <400〉 41 Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15 Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Thr Phe Pro Lys Leu Trp He Tyr 22 22200808351 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr He Ser Arg Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Thr Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 42 <211〉 125 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成多肽序列 <400> 42 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 23 200808351 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe lie lie Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn He Leu Asn 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 43 <211> 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成多肽序列 <400〉 43 Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 24 200808351 Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ala Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210> 44 <211〉 125 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工合成多肽序列 <400〉 44 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Ser 15 10 15 25 200808351 Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp lie Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Phe He He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn lie Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu Phe Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly lie Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210〉 45 <211〉 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工合成多肽序列 26 26200808351 <400〉 45 Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15 Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ala Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu He 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210〉 46 <211> 432 <212〉 DNA <213> Mus musculus 27 200808351 <220> <221> CDS <222〉 （1)..(432) <400〉 46 atg tac ttc agg etc age tea gtt ttt ett gtt ett att tta aaa gga 48 Met Tyr Phe Arg Leu Ser Ser Val Phe Leu Val Leu He Leu Lys Gly 15 10 15 gtc cag tgt gaa gtg aag ctg gtg gag tet gag gga ggc tta gtg cag 96 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 cct gga agt tcc atg aaa etc tee tgc aca gee tet gga ttc act ttc 144 Pro Gly Ser Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt gac cat tac atg get tgg gtc ege cag gtt cca gaa aag ggt eta 192 Ser Asp His Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 gaa tgg gtt gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg 240 Glu Trp Val Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 gac tec ttg aag age cgt ttc ate ate teg aga gac aat gga aag aac 288 Asp Ser Leu Lys Ser Arg Phe He He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn 85 90 95 att eta tac eta caa atg age agt ctg aag teg gag gac aca gee aeg 336 He Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat tac tgt gca aga gat agg gtt agg tec tec tac tat agt aat etc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu 115 120 125 28 200808351 ttt get atg gac tac tgg ggt caa gga att tea gtc acc gtc tee tea Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210〉 47 <211〉 144 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 47 Met Tyr Phe Arg Leu Ser Ser Val Phe Leu Val Leu lie Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp His Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Asp He Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Leu Lys Ser Arg Phe He He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn 85 90 95 lie Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr 29200808351 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu 115 120 125 Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly lie Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 48 <211> 381 <212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 CDS <222〉 （1)..(381) <400〉 48 atg atg tcc tct get cag ttc ett ggt etc ctg ttg etc tgt ttt caa Met Met Ser Ser Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gin 15 10 15 ggt acc aga tgt gat ate cag atg aca cag act aca tcc tcc ett tct Gly Thr Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc ate agt tgc agg gca agt cag gat Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 att gcc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt He Ala Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 48 96 144 192 240 30 200808351 aaa etc ctg ate tac tac aca tea aga tta cac tea gga gtc cca tea Lys Leu Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tet ggg aca gat tat tet etc acc ate age Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser 85 90 95 aac ctg gaa cct gaa gat att gee act tac tat tgt cag cag tat age Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser 100 105 110 aag ett ccg tat aeg ttc gga teg ggg acc aag ctg gaa ata aaa Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 115 120 125 288 336 381 <210〉 49 <211> 127 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 49 Met Met Ser Ser Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gin 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr He Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 31 200808351 lie Ala Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser 100 105 110 Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 115 120 125 <210〉 50 <211> 798 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工合成聚核苷酸序列 <220> <221> CDS <222> (1)..(792) <400〉 50 atg tac ttc agg etc age tea gtt ttt ett gtt ett att tta aaa gga Met Tyr Phe Arg Leu Ser Ser Val Phe Leu Val Leu lie Leu Lys Gly 15 10 15 32 200808351 gtc cag tgt gaa gtg aag ctg gtg gag tct gag gga ggc tta gtg cag 96 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 cct gga agt tcc atg aaa etc tcc tgc aca gcc tct gga ttc act ttc 144 Pro Gly Ser Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt gac cat tac atg get tgg gtc ege cag gtt cca gaa aag ggt eta 192 Ser Asp His Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 gaa tgg gtt gca gac att aat tat gat ggt agt aga acc tac tat ttg 240 Glu Trp Val Ala Asp lie Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 gac tcc ttg aag age cgt ttc ate ate teg aga gac aat gga aag aac 288 Asp Ser Leu Lys Ser Arg Phe lie He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn 85 90 95 att eta tac eta caa atg age agt ctg aag teg gag gac aca gcc aeg 336 lie Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat tac tgt gca aga gat agg gtt agg tcc tcc tac tat agt aat etc 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu 115 120 125 ttt get atg gac tac tgg ggt caa gga att tea gtc acc gtc tcc tea 432 Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 ggt gga ggc ggt age gat ate cag atg aca cag act aca tcc tcc ett 480 Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu 145 150 155 160 528 33 200808351 tct gcc tct ctg gga gac aga gtc acc ate agt tgc agg gca agt cag Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin 165 170 175 576 gat att gcc aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act Asp He Ala Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr 180 185 190 624 gtt aaa etc ctg ate tac tac aca tea aga tta cac tea gga gtc cca Val Lys Leu Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 195 200 205 tea agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gat tat tct etc acc ate Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr He 210 215 220 age aac ctg gaa cct gaa gat att gcc act tac tat tgt cag cag tat Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 225 230 235 240 age aag ett ccg tat aeg ttc gga teg ggg acc aag ctg gaa ata aaa Ser Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 245 250 255 672 720 768 798 gac tac aag gat gac gac gat aag tgataa Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260 <210〉 51 <211> 264 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成構築體 34 34200808351 <400〉 51 Met Tyr Phe Arg Leu Ser Ser Val Phe Leu Val Leu He Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asp His Tyr Met Ala Trp Val Arg Gin Val Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Asp lie Asn Tyr Asp Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Leu Lys Ser Arg Phe lie He Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn 85 90 95 lie Leu Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Val Arg Ser Ser Tyr Tyr Ser Asn Leu 115 120 125 Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly He Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 35 200808351 Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu 145 150 155 160 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Gin 165 170 175 Asp lie Ala Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr 180 185 190 Val Lys Leu Leu He Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro 195 200 205 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie 210 215 220 Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp He Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 225 230 235 240 Ser Lys Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 245 250 255 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 260