TW200423958A

TW200423958A - Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor

Info

Publication number: TW200423958A
Application number: TW092129316A
Authority: TW
Inventors: Geertruida M Veldman; Monique V Davies; Kening Song; Neil M Wolfman; Kristie Grove-Bridges; Anne Field; Caroline Russell; Viia Valge-Archer
Original assignee: Wyeth Corp; Cambridge Antibody Tech
Priority date: 2002-10-22
Filing date: 2003-10-22
Publication date: 2004-11-16
Also published as: AR047392A1; MXPA05004225A; RU2360925C2; US7655763B2; WO2004037861A3; WO2004037861A2; ES2535872T3; JP4886986B2; US7261893B2; RU2005115477A; ZA200503249B; IS7770A; US8940874B2; SG178619A1; JP2010148513A; AU2003274448A1; TW201029666A; TW201029665A; US20080044410A1; CN100374465C

Description

200423958 玖、發明說明：【^日月々貝】本申請案主張美國臨時申請案第6〇/419,964號之優先權，其申請曰為2002年10月22曰，其整體係被納入於此作為參考資 5 料。發明領域本技術領域關於抗生長與分化因子-8(GDF-8)之抗體，特定地人類抗體，以及抗體片段，特別是於活體外及/或活體内抑制 GDF-8活性者。本領域進一步關於肌肉或骨頭的退化性疾患， 10 或胰島素代謝疾患之診斷、預防或治療。 C litr USl 】發明背景

生長與分化因子-8 (GDF-8)，亦稱為肌肉生長抑制素 (myostatin)，係一分泌性蛋白質以及轉化生長因子_β (TGFj) 15 超科（superfamily)的一員，TGF-β超科係結構上相關的生長因子’其荨存有生理上重要的生長調節及形態演發(m〇rph〇genetic) 性質（Kingsley et al· (1994) Gene Dev·，8: 133-146; Hoodless et al· (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol·，228: 235-272)。相似於TGF-β ’人類GDF-8係被形成為一375個胺基酸長的前驅蛋白 2〇質。该刖驅GDF-8蛋白質形成一同型二聚體(homodimer)。在加工期間，該胺基末端原胜肽(propeptide)係於Arg-266處被切斷。該經裁切的原胜肽，稱為’’潛伏關連的胜肽（latency-associated peptide)”(LAP)，可維持非共價地結合至該同型二聚體，藉此去活化該複合體（Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem.，263: 6 200423958

6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43;及 Thies et al. (2001) Growth Factors，18: 251-259)。該成熟的 GDF-8與原胜肽之複合體係普遍地稱為”小潛伏複合體（smaH 5 latent complex)” （Gentry et al. (1990) Biochemistry，29: 6851-6857; Derynck et al· (1995) Nature，316: 701-705;及 Massague (1990) Ann· Rev. Cell Biol” 12: 597-641)。其他蛋白質也已知會結合至成熟的GDF-8且抑制其生物活性。此類抑制性蛋白質包括滤泡抑制素(follistatin)以及濾泡抑制素相關的蛋白 10 質（Gamer et al. (1999) Dev. Biol·，208: 222-232)。來自不同物種的經演繹胺基酸序列之列校(alignment)展示 GDF-8在演化過程係高度守怪的（conserved)(McPherron et al. (1997) Proc. Nat· Acad. Sci. U.S.A·，94: 12457-12461)。事實上，該等人類、小鼠、大鼠、豬以及雞的GDF-8於C端區域係100% 15 相同，而於狒狒、牛以及羊隻之間只有3個胺基酸不同。斑馬魚的GDF-8係最趨異的；然而，其仍有88%相同於人類。該高度守恆性暗示GDF-8具有一必要的功能。GDF_8係高度表現於發育以及成人骨骼肌中且被發現涉及肌肉及成骨作用中關鍵的生物過程之調節。例如，GDF-8剔除(knockout)的基 20 因轉殖小鼠係有一顯著的骨骼肌肥大及增生之特徵(McPherron et al· (1997) Nature, 387: 83_90)以及改變的骨頭皮層結構 (Hamrick et al. (2000) Bone，27 (3): 343-349)。相似的骨骼肌量之增加也明顯於自然發生GDF-8突變的牛中。（Ashmore et al. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci.? 7 200423958 38: 752-757; McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A·，94: 12457-12461;及Kambadur et al· (1997) Genome Res·， 7: 910-915)。研究以指出與HIV感染關連的肌肉消瘦係伴隨著 GDF-8表現之增加（Gonzalez-Cadavid et al. (1998) Proc. Nat. 5 Acad· Sci. U.S.A·，95: 14938-14943)。GDF-8也牽涉於肌肉特異的酵素之製造（如，肌酸激酶）以及肌母細胞(myoblast)之增生 (WO 00/43781)。除了其生長調節及形態演發性質，GDF-8也被 #忍為涉及§午多其他生理過程’包括第二型糖尿病發展過程的葡萄糖恆定、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群（如，X症候 10 群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起的胰島素抗性，以及脂肪組織疾患（如，肥胖）（Kim et al· (2000) BBRC，281: 902_906)。許多人類及動物疾患係與肌肉組織的功能性缺失關連，如，肌肉營養不良（包括Duchenne’s肌肉營養不良）、肌萎縮 15 性脊髓側索硬化症(ALS)、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、遺傳性阻塞性肺部疾病、少肌症（sarcopenia)、惡病質（cachexia)以及由其他疾病及狀況引起的肌肉消痩症候群。目前，很少有可靠的或有效的療法被發展來治療這些疾患。也有許多與骨質流失的狀況’包括骨質疏鬆症以及骨關節 20 炎，特別地在老人及停經後婦女。此外，代謝性骨頭疾病以及疾患包括源自慢性糖皮質素療法之低骨質、早期性腺衰竭、左隹性素抑制低落、維生素D缺乏、次發性副甲狀腺機能宄進、營養缺乏以及厭食症。目前可獲得之用於這些狀況的療法藉由抑制骨質再吸收來進行。一種促進新骨質形成之療法將是這些療 8 200423958 法之一所欲的替代。因此，存在一需求於發展新療法來促成肌肉質量整體及/ 或強度及/或骨後度之增加，特別地，在人類中。 C發明内容U 5 發明概要本發明的一目標係提供安全及有效的用於肌肉及/或骨頭關連疾患之治療方法。本發明的另一目標係提供增加脊椎動物的肌肉質量及/或骨強度及/或密度之方法。 10 本發明的另一目標係提供GDF-8的抑制劑，其在活體内係安全且有效的。本發明的另一目標係提供以高特異性及親和力結合至 GDF-8之人類抗體及其片段。因此，用以治療肌肉及骨退化性疾患之方法係被提供。該 15方法係有用於在正常動物中增加肌肉質量及骨密度。也提供新穎之人類抗GDF_8抗體，名為Myo29、Myo28及Myo22，以及衍生自其等之抗體及抗原結合片段。本發明之抗體擁有許多有用的性質。首先，該等抗體係能以高親和力結合至成熟的gDF-8。第二，該等經揭露的抗體在活體外及活體内抑制GDF_8活性係 2〇被展示，例如，藉由ActRIIB結合以及報導基因（reporter gene) 檢疋第二’該等經揭露的抗體可抑制之GDF-8活性，該GDF-8 /舌I4生與骨路肌肉質量及骨密度的負向調控關聯。本發明的某些具體例包含My〇29、Myo28或My〇22的Fv片羊又之VH及/或Vl部位(d〇main)。進一步的具體例包含任何這些 9 200423958 及VL部位之一或更多互補決定區域（CDRs)。其他具體例包含 Myo29、Myo28或Myo22的VH部位之一H3片段。其他態樣提供含有本發明抗體或其等抗原結合片段之組成物，以及其等於抑制或中和GDF-8方法之使用，包括人類或 5 動物的治療方法。本發明的抗體可被用以治療或預防欲求肌肉組織或骨密度之增加的狀況。舉例言之，目前揭示的抗體可被用於修復受損的肌肉（如，心肌、橫膈等）之療法。例示的疾病及疾患包括肌肉及神經肌肉疾患諸如：肌肉營養不良 (Duchenne’s肌肉營養不良）、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、肌 10 肉萎縮、器官萎縮、虛弱、腕隧道症候群(tunnel syndrome)、遺傳性阻塞性肺部疾病、少肌症（sarcopenia)、惡病質（cachexia) 以及由其他疾病及狀況引起的肌肉消痩症候群、脂肪組織疾患 (如，肥胖）、第二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群（如，X症候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起 15的胰島素抗性以及骨退化疾病（如，骨關節炎及骨質疏鬆症）。

此外，目前揭示的抗體可被用作為一診斷工具來定量地或定性地偵測在一生物性樣品中的GDF-8或其片段。該偵測到的 GDF-8之存在或量可能與一或更多前述醫學狀況相互關連。另一態樣提供一經單離的核酸，其包含一序列編碼 20 My〇29、My〇28或Myo22的Fv片段之一 γΗ或VL部位。一經單離的核酸，其包含一序列編碼至少一源自任何目前所揭露之Vh或 VL部位的CDR，係被揭露。另一態樣提供包含此核酸之宿主細胞。另一態樣提供一方法以製造新VH&VL部位及/或功能性抗 10 200423958 體’其等包含衍生自Myo29、Myo28或Myo22的VH或VL部位之部位的全部或部分。本發明的其他目標將被置於說明書之隨後部分，以及某部分將從本說明書變的明顯，或可從本發明之實施而習得。本發 5明的各種目標、態樣及優點將藉由隨附的申請專利範圍所特定指出之要件及其組合而被認知及獲致。被了解的是前述一般描述及隨後的詳細描述係僅是本發明的例示和解釋，且不是限制，如所聲明者。 10 圖式簡單說明第1圖呈現生物素標記的（biotinylated) GDF-8及BMP_11結合至ActRIIB受器而有一ED%為15 ng/ml及40 ng/ml，個別地。第2圖呈現本發明的scFv片段對GDF-8結合至ActRIIB受器之抑制作用。如圖示，該等Myo29、Myo28及Myo22的scFv之IC50 15 係2.4 nM、1.7 nM及60 nM，個別地。第3A及3B圖呈現Myo29與10 ng/ml生物素標記的GDF-8或 BMP-11之預培育（preincubation)在ActRIIB結合檢定中抑制了第4B及4C圖描述pGL3(CAGA)12報導基因檢定之結果，其 20 中Myo29係被測試。第4A圖展現基準狀況，即，GDF-8、BMP-11 以及促進素Octivin)對報導基因活性之誘導作用。第4B及4C圖呈現Myo29以一劑量反應性（dose-responsive)方式減低GDF-8活性，有一IQo係15-30 ng/ml，且抑制BMP-11的生物活性至相同程度。第4D圖例示Myo29不影響促進素的活性於此檢定中。 11 200423958 第5圖呈現Myo22、Myo28及Myo29之抗原決定基定位 (epitope mapping)結果。該Myo29的抗原決定基係經定位介於成熟GDF-82的胺基酸72及88之間；Myo22是介於胺基酸1及44之間；Myo28則是介於胺基酸1及98之間。 5 第6圖展現Myo29抗原決定基之取代分析（substitution analysis)的結果。成熟GDF_8 中的殘基(residue)Lys-78、Pro-81 以及Asn-83對於Myo29結合至GDF-8係重要的。

第7圖描述以Myo29及Myo28進行一免疫沉澱作用實驗之結果。來自表現有GDF-8之CH0細胞的條件化培養基 10 (conditioned medium)，該GDF-8係經35S-甲硫酸胺/半胱胺酸標記，該條件化培養基係被用於與Myo29或Myo28之免疫沉澱作用。該免疫沉澱作用接著藉由SDS-PAGE於還原條件下被分析。於膠體上之帶區（band)係經辨認為成熟的GDF-8、GDF-8原胜肽以及未加工的GDF-8。 15 第8圖描述一藥物動力學研究之結果，其中C57B6/SCID小

鼠接受一 1 mg/kg劑量之以單次靜脈内（IV)或腹腔内（IP)投予之 Myo29。Myo29呈現約一星期長之延長的終半衰期以及低廓清率約1 ml/hr/kg。在IP注射後之經吸收的部分係約77%。第9圖呈現母星期經多種My〇29劑量（60、10及1 mg/kg)，或 20 載體（PBS)，處理之雄性C57B6/SCID小鼠的四頭肌質量之比較。以10及60 mg/kg劑量位準之Myo29處理四星期，導致統計上有意義的肌肉質量增加為19%及23%，個別地。第10A及10B圖呈現每星期經多種Myo29劑量（10、5、2.5 及1 mg/kg)或PBS處理四星期之雌性CB17 SCID小鼠的腓腸 12 200423958 肌、四頭肌質量。相較於載體對照組，以Myo29處理之小鼠的肌肉質量係增加10至20%。第11A及11B圖展現每星期經多種Myo29劑量（10、5、2.5 及1 mg/kg)或PBS處理十二星期之雌性CB17 SCID小鼠的腓腸 5 肌、四頭肌質量。以Myo29處理之小鼠的肌肉質量係增加12至 28%範圍。

第12圖呈現每星期經Myo29 (10及5 mg/kg)或PBS處理十二星期之雌性CB17 SCID小鼠的前肢肌肉強度，藉由一抓握強度計測量。以5及10 mg/kg的Myo29處理之小鼠的前肢強度係增加 10 17%及23%，個別地。 I：實施方式3 I.定義於此使用之“抗體，，用語，指一免疫球蛋白或其之一部分，以及包括任何包含一抗原-結合部位之胜肽，不管該胜肽之來 15源、起源之物種、製造之方法及特性。作為一非限制的實例，該“抗體”用語包括人類、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊以及雞抗體。該用語包括但不限於多株、單株、單一特異性、多特異性、非特異性、擬人化、單鍵、嵌合的（chimeric)、合成的、重組的、雜交的、突變的以及CDR_移接的（CDR_grafted)抗體。 20用於本發明之目的，其亦包括，除非有其他載述，抗體片段諸如：Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、dAb以及其他抗體片段，其等保有該抗體結合功能。抗體可經由，例如，傳統的融合瘤技術（K〇hler及 MilStein(1975)NatUre，256: 495-彻），重組DNA方法(u s 專利第 13 200423958 4,816,567號），或是使用抗體庫之噬菌體呈現技術(Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al· (1991) J. Mol. Biol·， 222: 581-597)。關於多種其他抗體製造技術，參考Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al.9 Cold Spring Habor 5 Laboratory, 1988 o

該”抗原-結合部位”用語指一抗體分子之一部分其包含特異地結合或互補至部分或全部抗原之範圍。當一抗原係大的，一抗體可僅結合至一抗原的特定部份。該”抗原決定基”或”抗原決定區”係一抗原分子的區位其專責於與一抗體之抗原-結合部 10 位之特異性交互作用。一抗原-結合部位可由一或更多抗體可變部位提供（如，由一VH部位構成之所謂的Fd抗體片段）。一抗原-結合部位包含一抗體輕鏈可變區域(VL)以及一抗體重鏈可變區域(Vh)。該”匯集（repertoire)”用語指遺傳性多樣收集之核苷酸 15 (如，DNA)序列，其等衍生自整體或部分地編碼經表現的免

疫球蛋白之序列。此等序列係藉由如，Η鏈的V、D及J節段 (segment)以及L鏈的V、D及J節段之活體内重組而產生。任擇地，該等序列可藉由對一細胞株之活體外刺激作用且對此反應發生重組而產生。任擇地，該等序列的部分或全部可藉由組合 20 如，未重組的V節段與D及J節段，藉由核苷酸合成、隨機突變以及其他揭示於美國專利第5,565,332號的方法來獲得。該”特異性交互作用（specific interaction)’’或”特異地結合 (specifically binds)用語或相似者，意指兩個分子形成一複合體其在生理狀況下係相對穩定。該用語也可應用於例如，一抗原 14 π合部位係特異於一特定抗原決定基，該抗原決定基係由數個抗原攜V ’此例中该攜帶有該抗原_結合部位之抗體將能結合至多種攜帶有該抗原決定基之抗原。因此，一抗體可特異地結合至例吕之，ΒΜΡ-11以及GDF_8，只要該抗體係結合至該二者 5都攜帶之抗原決定基。特異性結合的特徵係高親和力及低至中等容力 (capacity)。非特異性結合通常具有低親和力肖中等至高的容力典型地，當親和常數Ka係高於ιο6]^-1時，或較佳的高於 10 Μ ，該結合被認為是特異性的。若必要的，非特異性結合可藉由改變結合條件被減少而不實質地影響特異性結合。此類條件係已知於習知技藝，以及一熟習本項技藝者使用例行技術可選擇適當條件。該等條件通常係由抗體濃度、溶液的離子強度、概度、准予結合的時間、不相關之分子（如，血清白蛋白、奶酿蛋白濃度，等等來界定。例示性條件係如實例4、7及 15 10所載示者。 4實質地如展示”用語意指該相關的CDR、V^VL部位將是相同或高度相似於該特異的區域，該特異的區域之序列係被展不於此。例言之，此取代包括一CDR序列（H1、h2、H3、L1、 L2或L3)中任5個胺基酸之1或2者。 20 該”TGF-P超科，，用語指結構上相關的生長因子之家族。此相關的生長因子家族係詳知於習知技藝(Kingsky d以(1994) Genes Dev., 8. 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics

MiCr〇bi〇1· ImmUn〇1·，228: 235-72)。該TGF_p超科包括骨形態演發蛋白質(BMP)、促進素(activin)、抑制素(i祕⑹穆勒氏抑 15 200423958 制物質（mullerian inhibiting substance)、膠質細胞性神經營養因子以及數量仍在增加的生長與分化因子（GDF)，如GDF-8(肌肉生長抑制素）。許多此類蛋白質係結構上及/或功能上相關於 GDF-8 〇例言之，人類BMP_U，亦稱為GDF_U，在胺基酸程度 5 係 90% 相似於 GDF-8(Gamer et al· (1999) Dev. Biol· 208: 222-232; Nakshima et al. (1999) Mech. Dev.，80: 185-189)。該’’GDF-8”用語指一特異的生長與分化因子-8，適當時，亦指該等結構上或功能上相關於GDF-8之因子，例如，BMP-11 以及其他屬於TGF-β超科之因子。該用語指全長未經加工的前 10驅形式之GDF-8以及得自於轉譯後裂解（p0st七ansiati〇nal cleavage)之成熟的及原胜肽形式。該用語亦指任何gdf-8之片段及變異體，其維持至少某些相關於成熟的GDF-8之生物活性，如此所揭示，包括序列已被改變者。成熟的人類qdF-8之胺基酸序列係被提供於序列辨認編號：49。本發明相關於來自 15所有脊椎動物種之GDF_8，包括，但不限於：人類、牛、雞、小鼠、大鼠、豬、羊、火雞、狒狒以及魚（關於序列資訊，參見，例如McPhemm et al. (1997) Pr〇c Nat Acad Sei^ s A，94: 12457-12461)〇該”成熟的GDF-8”用語指該蛋白質係裂解自該gdf_8前驅 20蛋白質的羧基末端部位者。該成熟的GDF-8可以一單體、同質二聚體(homodimer)存在或於一 GDF_8潛伏複合體中。依據情況，成熟的GDF-8可與任何或所有這些不同形式者之間建立平衡。於其生物上活性形 <，該成熟的，_8係亦被指為，，活性 GDF-8”。 16 200423958 該”GDF_8原胜肽”用語指該多太係裂解自該gdf_8前驅白質的胺基末端部位者。該GDF_8原胜肽係能結合至該成熟蛋 GDF-8上之原胜肽結合部位。 “、、的該”GDF-8潛伏複合體，，用語指由該成熟的咖貝"〜聚 5體以及該GDF-8原胜肽之間所形成之蛋白質複合風相信兩個GDF-8原㈣與兩個成熟的咖侧冑二聚體關連以形成一去活化的四聚體複合體。該潛伏複合體可包括其他抑制、以取代或外加至一或更多該等gDF-8原胜肽。該”gdf_8活性，，用語指與活性的gdf_8蛋白質相關連之— 10或更多生理上生長調節或形態演發活性。例言之，活性的咖4 係骨胳肌質量的-負向調節劑。活性的咖_8也可調整肌肉_特異的酵素之製造（如，肌酸激峰）、刺激肌母細胞之增生以及調整前脂肪細胞(preadip〇Cyte)分化成脂肪細胞。用以於活體内及活體外測量GDF.8活性之例示性步驟係被載示於實例2、3、6 15 及13中。該GDF-8抑制劑”用語包括任何能抑制gdf_8的活性、表現、加工處理或分泌之藥劑。此類抑制劑包括蛋白質、抗體、 · 胜肽、模擬胜肽(peptidomimetics)、核醣核酸酵素⑽〒⑻、反義募核苦酸、雙鏈匪以及其他特異地抑制gdf_8之小分 20子。此類抑制劑係被認為，，抑制，，、”中和，，或，，減少”gdf_8之生物活性。 /等中和、中和、抑制’’用語以及其等同性質者指藉 . 由-GDF-8抑制劑而該祕8活性之減少係該減少係相對於該相同抑制劑不存在時之GDF·8活性。該咖_8活性較佳的係 17 200423958 至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 或更高。該”治療”用語被使用於此係可與”醫療方法”互換以及指醫療處理及預防性/防止性措施。需要治療者可包括已有一特定醫 5 學疾患之個體與最終可能患有該及患者（即，需要防止性措施者）。該”經單離的（isolated)”用語指一分子係實質地無其自然環繞者。例如，一經單離的蛋白質係實質地無來自於衍生該蛋白質者之細胞或組織來源之細胞性物質或其他蛋白質。該用語指 10 該製備物中該經分離的蛋白質係足夠純的以被投予作為一醫療組成物，或至少70%至80%(w/w)純，更佳的，至少80%至 90%(w/w)純，又更佳的，90%至95%純；以及，最佳的，至少 95%、96%、97%、98%、99%或 100°/〇(w/w)純。該”哺乳類”用語指任何被歸類為此類動物者，包括人類、 15 家畜及農場動物、動物園、運動或寵物動物，諸如：狗、馬、貓、羊、豬、牛，等等。該”有效劑量”或”有效量”用語指化合物的量係造成一患者的症狀改善或一所欲的生物性結果（如，增加骨骼肌質量及/ 或骨密度）。此量應足以減少GDF-8活性關於骨骼肌質量及骨密 20 度之負向調控。該有效量可如後續的部分所述而被測定。 II·抗GDF_8抗體以及抗原結合片段 A.人類抗體Myo29、Myo28以及Myo22 本揭露内容提供新穎的抗GDF-8抗體及其等之抗原結合片 18

類抗體之非限制的例示具體例係稱為MyoM 、Myo28 以 y〇22。這些示範具體例係以人類机抗體形式被提供。

At本發明的抗體持有獨特且有益的特性。第-，該等抗體係 $域高响m咖GDF_m她抗體可在活體外及活體内抑制GDF.8活性，例如，藉由a識⑽合之抑制作用以及報導基因檢測所展示者。本發明之抗體亦能特異地結合及/或抑制腑七的活性，例如，藉由切麵結合之抑制作用以及報導基因檢測所展示者。第三，該等經揭露之抗體可 P制GDF 8的雜’該GDF_8活性與骨絡肌肉質量及骨密度的 10 負向調控關聯。於一範例示具體例中，現行經揭露的抗體係能特異地結合至GDF-8及BMP-n。預期該等抗體亦可與其他蛋白質，例如，屬於TGF-β超科者（諸如：穆勒氏抑制物質、膠質細胞性神經營養因子或GDF-8以外之其他生長及分化因子）反應。於某些 15具體例中，My〇29與一蛋白質反應，該蛋白質包含相同於序列辨5忍編號· 49之胺基酸72至88的序列。進一步的具體例中， Myo29結合至一蛋白質，該蛋白質包含序列

Lys_Xaal-Xaa2_Pro_Xaa3-Asn(序列辨認編號：54)，其中Xaa卜

Xaa2及Xaa3各自為任何胺基酸。進一步的具體例中，符合以下 20 至少一條件：（1) Xaal=Met，（2) Xaa2=Ser，以及（3) Xaa3=Ile ; 全部係各自獨立的。其他具體例中，Myo22辨認一抗原決定基，該抗原決定基係於成熟的GDF-8序列的前44個N·末端胺基酸 (序列辨認編號·· 49中的胺基酸1至44 )。一般的熟習本項技藝者將認知到本發明之抗體可被用以 19 200423958

偵測、測量以及抑制不同於前述之蛋白質。一般地，本發明之抗體能被與任何蛋白質一起使用，該蛋白質係包含一序列至少約70%、80%、90%、95%或更多相同於成熟型的GDF-8 (序列辨認編號：49所示）的任何100、80、60、40或20個連續的胺 5 基酸序列。此類蛋白質的非限制實例包括得自許多物種之 GDF-8序列，其等係描述於本說明書中。該百分比相似度係藉由標準列校演算（alignment algorithms)來測定，例如，Basic Local Alignment Tool (BLAST)描述於 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410 » the algorithm of Needleman et al. 10 (1970) J· Mol. Biol·，48: 444-453，或the algorithm of Meyers et al· (1988) Comput. Appl· Biosci.，4: 11-17 o B.可變部位完整的抗體，亦稱為免疫球蛋白，典型地係四聚體式糖化 15 蛋白由兩個各為近25kDa之輕鏈(L)以及兩個各為近5〇kDa之重鏈(H)。兩種形式的輕鏈，稱為λ及κ，被發現於抗體中。依據重鏈的固定部位之胺基酸序列，免疫球蛋白可被區分為五個主要分類（class) : A、D、Ε、G及Μ，以及此等之某些可被進一步區分為次分類（subclass)(同型（isotypes))，如：IgG!、IgG2、IgG3、 20 IgG4、IgA!以及IgA2。該不同分類的免疫球蛋白之次單元結構以及三維構形係詳知於習知技藝中。關於抗體結構之回顧，參見 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory，eds. Harlow et al·，1988。簡要地，各輕鏈係由一]νμ 末端可變(V)部位(vL)以及一固定(c)部位(cL)構成。各重鏈係由 20 200423958 一 N-末端V部位、三或四個c部位以及一较鏈區域（hinge region)。該CH部位最接近VH者係被定為cHl。該VH及VL部位包括四個相當守恆的序列，稱為架構區域（FR1、FR2、FR3及 FR4 )，其形成一骨架於三個超可變（hypervariable)序列之區域 5 (互補決定區域(CDRs))。該CDRs含有絕大多數殘基負責於與抗原之交互作用。CDRs係被指稱為CDR1、CDR2以及CDR3。依據地，該重鏈上之CDR組成份子係被指稱為HI、H2及H3，而輕鏈上之CDR組成份子則被指稱為LI、L2及L3。CDR3係抗體結合位址中分子多變性(diversity)的最大來源。H3，例如， 10 可短如兩個胺基酸或大於26個胺基酸。最小的抗原結合片段係

Fv，其由VH及VL部位構成。該Fab片段（£ragment达ntigen finding (抗原結合片段））由Vh-Ch1及VL-CL1部位構成，藉由一雙硫鍵於該固定區域間共價地連接。為了克服當共表現(co-expression) 於一宿主時，該Fv中的非共價地連接的VH及VL部位之解離傾 15 向，一稱為單鏈(sc)Fv片段(scFv)可被建構，其中一可撓的且適當長的多太連接該Vh的C-末端至該Vl的N-末端或連接該Vl的〇末端至該VH的N_末端。最常用的連接物(linker)係為一 15殘基 ((Glyjer3)3)胜肽，但其他連接物亦已知於習知技藝中。抗體多變性係藉由多重生殖細胞(germlined)基因之使用而 2〇編碼多個可變區域以及多種體細胞效應。該等體細胞效應包括可變基因區段與多變(D)及連結（J)基因區段之重組作用以製造一完整的VH部位以及可變基因區段與連結基因區段之重組作用以製造一完整的VL部位。該重組過程本身係不精確的，導致位於該V(D)J連結處之胺基酸的漏失或添加。該多變性的機制發 21 200423958 生在發展中的B細胞且在抗原曝露之前。抗原性刺激之後，該B 細胞中經表現的抗體基因進行體突變。基於生殖細胞基因區段數目之估計，這些區段的隨機重組，以及隨機VirvL配對，高達 1·6χ 1〇種不同抗體可被產生（Fundamental Immunology，3rd 5 ed·，ed· Ed· Paul，Raven Press，New York，NY，1993)。當其他有助於抗體多樣性之過程（如，體突變）被加入計算，則認為高於lx 1010種不同抗體可被產生（Immunoglobulin Genes，2nd ed.， eds. Jonio et al·，Academic Press，San Diego, CA，1995 )。因為許多過程涉及抗體多樣性之產生，所以獨立地衍生之具有相同抗 10原特異性之單株抗體不太可能有相同的氨基酸序列。因此，本發明進一步提供新穎的衍生自人類免疫球蛋白基因庫之CDRs。用於攜帶本發明的一CDR之結構一般地將是一抗體重鏈或輕鏈序列或一其等之實質區位，其中該CDR係位於一對應於自然發生的VH及VL之CDR位置。該等免疫球蛋白可變部 15 位之結構及位置可被測定’如描述於Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services，eds. Kabat et al.，1991。現在被揭露的抗體之DNA以及胺基酸(aa)序列，其等scFV 片段，VH及VL部位以及CDRs係載述於序列表以及被列舉於第1 20表中。方便起見，VH及VL部位中的各個CDR之位置係被列於第 2表中。該Myo29、Myo28及Myo22中，除了 vH及VL部位以外之重鏈及輕鏈序列係相同的。 22 200423958 第1表：scFV、VH及VL部位以及CDRs之DNA與胺基酸序列 Myo29 Myo28 Myo22 scFV的DNA序列序列辨認編號·· 13 序列辨認編號·· 7 序列辨認編號·· 1 scFV的AA序列序列辨認編號：14 序列辨認編號：8 序列辨認編號：2 VH的DNA序列序列辨認編號：15 序列辨認編號：9 序列辨認編號·· 3 VH的AA序歹ij 序列辨認編號：16 序列辨認編號：10 序列辨認編號：4 Vl的DNA序歹ij 序列辨認編號·· 17 序列辨認編號：11 序列辨認編號：5 Vl的AA序列序列辨認編號：18 序列辨認編號·· 12 序列辨認編號：6 scFV的經生殖細胞化 DNA序列序列辨認編號·· 25 序列辨認編號：19 scFV的經生殖細胞化 A A序列序列辨認編號：26 序列辨認編號：20 VH的經生殖細胞化 DNA序列序列辨認編號·· 27 序列辨認編號·· 21 VH的經生殖細胞化AA 序列序列辨認編號·· 28 序列辨認編號·· 22 Vl的經生殖細胞化 DNA序列序列辨認編號：29 序列辨認編號·· 23 VL的經生殖細胞化AA 序列序列辨認編號：30 序列辨認編號·· 24 H1的AA序列序列辨認編號：31 序列辨認編號：3 7 序列辨認編號：43 H2的AA序列序列辨認編號：32 序列辨認編號：38 序列辨認編號：44 H3的AA序歹ij 序列辨認編號：33 序列辨認編號：39 序列辨認編號·· 45 L1的AA序歹ij 序列辨認編號：34 序列辨認編號：40 序列辨認編號：46 L2的AA序列序列辨認編號·· 35 序列辨認編號：41 序列辨認編號：47 L3的AA序列序列辨認編號：36 序列辨認編號：42 序列辨認編號：48

23 200423958 第2表：scFV中的CDRs位置 CDR Myo29 (序列辨認編號：26) Myo28 (序列辨認編號：20) Myo22 (序列辨認編號：2) H1 31-35 31-35 31-35 H2 50-66 50-66 50-66 H3 99-106 99-110 99-113 L1 157-167 160-173 163-176 L2 183-189 189-195 192-198 L3 222-228 228-233 231-242

現在被揭露的抗體可進一步包含抗體固定區域或其等之部份。舉例之，一 VL部位可於其C-末端被貼附至抗體輕 5 鏈的固定部位，包括人類Ck或（：λ鏈，較佳地(：λ鏈。相似地，以一 VH部位為主的一特異性抗原·結合片段可於其C-末端末位被貼附至衍生自任何同型抗體（諸如：IgG、IgA、IgE 以及IgM，以及任何同型抗體次分類，特定地IgG1&IgG4) 之免疫球蛋白重鏈的全部或部份。在例示的具體例中，抗 10 體包含人類IgGu的重及輕鏈之C-末端片段。該等用於λ輕鏈的(：_末端片段之DNA及胺基酸序列係被載述於序列辨認編號：50以及序列辨認編號：51，分別地。本發明的某些具體例包含Myo29、Myo28或Myo22的Fv 片段之Vh及/或Vl部位。進一步的具體例包含任何這些Vh 15 及VL部位之一或更多互補決定區域（CDRs)。其他具體例包含Myo29、Myo28或Myo22的VH部位之一 H3片段。在某些具體例中，該等本發明的VH及VL部位係經生殖細胞化的，意即，這些部位的架構區域（FRs)係利用傳統的分子生物技術被改變以符合人類生殖細胞基因產物之共通的胺基酸序 24 200423958 列。在其他具體例中胞0 該架構區序列保持相異於該生殖細 c.經改變的抗體及其等片段 10 15 本發明的另一態樣提供-用以獲得-對GDF-8有特異性抗原'结合部位之抗體。熟習本項技藝者將認知到本發明的抗體係不侷限於該等如第1表所載述之特定的vH及VL序列’且亦包括這些序列的變異者’其等維持抗原結合能力。此等變異者可利用習知技藝中已知技術而被自該等經提供之序列衍生。胺基酸之取代、删除或添加，可被進行於該 FRs或CDRs中。而該架構區域之變化係通常地被設計以改良該抗體的穩定性及減少其免疫原性，該CDR中的變化係通常地被設計以增加該抗體對其標的之親和力。此使親和力增加之變化係藉由改變該CDR區域及測試該抗體且典型地憑經驗來測定。此改變可被依據描述於Antib〇dy Engineering, 2nd. Ed.? ed. Borrebaeck, Oxford University Press，1995之方法來進行。

用以製造一 VH部位之方法，該Vh部位係如載述於此之 vH部位的一胺基酸序列變異者，包含添加、刪除、取代或 20 插入一或更多胺基酸於現在所揭示之VH部位的胺基酸序列之步驟，可選擇地組合該VH部位與一或更多VL部位，以及測試該VH部位或VH/VL組合或特異結合至GDF-8之組合，可選擇地測試此抗原·結合部位能中和GDF_8活性之能力。該 VL部位可具有實質地如載述於此之一胺基酸序列。 25 200423958 一類似的方法可被施行，其中被揭示於此之一 vL部位的一或更多序列變異者係被與一或更多vH部位組合。本發明的另一態樣提供一製備一特異地與GDF-8反應之抗原-結合片段之方法。該方法包含： 5 (a) 提供一編碼一 VH部位之核酸序列的起始匯集 (staring repertoire)，該核酸匯集係包括一欲被取代之CDR3 或缺乏一 CDR3編碼區域；

(b) 令該匯集與一供體（donor)核酸組合，該供體核酸編碼一 VH CDR3 (即H3)之胺基酸序列（實質地如載述於 10 此者），使得該供體核酸係經插入該匯集之CDR3區域於是提供一編碼一 VH部位之核酸序列的產物匯集（product repertoire)； (c) 表現該產物匯集之核酸； (d) 選擇一對於GDF-8特異之特異的抗原-結合片段；以 15 及

(e) 回收該特異的抗原-結合片段或編碼其之核酸。再者，一類似的方法可被施行，其中本發明之一 CDR3 (即L3)係被與編碼一 VL部位之核酸匯集組合，該核酸匯集係包括一欲被取代之CDR3或缺乏一 CDR3編碼區 20 域。本發明之一 CDR編碼序列（如CDR3)可被導入一缺乏 CDR(如CDR3)的可變區域之匯集中，利用重組DNA技術。例如，Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10: 779-783)描述產生抗體可變部位匯集之方法，其中該等經支配於或鄰接 26 200423958 至該可變部位處的5’端之共有引子係被用以接合至該人類 VH基因的第三架構區之共有引子，而提供一缺乏cdR之VH 可變區域的匯集。該匯集可被與一特定的抗體之一 CDR3結合。利用類似的技術，本發明之CDR3衍生序列可被與缺乏 5 CDR3之VH或VL部位匯集混接，且該經混接的完整Vh*Vl 部位與一同質的VL或VH部位組合以提供本發明之特異的抗原-結合片段。該匯集可接著被表現於一合適的宿主系統中，諸如WO 92/01047之噬菌體呈現（phage display)系統，使得合適的抗原-結合片段可被選擇。 10 類似的混接獲組合技術亦被Stemmer (Nature (1994) 370: 389-391)揭露，其描述該技術於相關於一乙内醯胺口基因（β-lactamase)但觀察該方式可被使用於抗體之產生。另一選擇係產生新的攜帶一本發明之CDR衍生序列之 VH或VL區域，利用一或更多經選擇的vH及/或VL基因之隨 15 機突變來產生在該整個可變部位中之突變。此一技術係由 Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580)描述，其使用錯誤傾向 PCR (error-prone PCR)。另一可被使用的方法係使該VH或VL基因之CDR區域直接突變。此一技術係由Barbas et al· (Proc. Nat· Acad. Sci. 20 U.S.A. (1994) 91: 3809-3813)以及 Schier et al· (J· Mol. Biol. (1996) 263: 551-567)描述。相似地，一或更多，或所有的三個CDR可被移接至一 VH或VL部位的匯集，其等之後被用以篩選對GDF-8特異之一特異的結合夥伴或結合片段。 27 200423958

一免疫球蛋白可變部位之實質的區位將包含至少該 CDR區域以及，可選擇的，該等scFv片段之間的架構區域 (如載述於此者）。該區位也將包括至少約50%的FR1或 FR4，或該50%係50%FR1的C-末端以及50%FR4的N-末端。 5 在該可變部位之實質的區位之N-末端或C·末端之額外的殘基可為通常與自然發生的可變部位區域不相關者。例如，本發明的特異抗原-結合片段之建構可藉由重組DNA技術製得，而可產生由連接物所編碼之N·或C-末端殘基之導入，以促進選殖或其他處置步驟。其他處置步驟包括··連 10 接物之導入以使本發明的可變部位連結至進一步的蛋白質序列，該蛋白質序列包括免疫球蛋白重鏈、其他可變部位 (例如：雙抗體（diabodies)之產生）或蛋白質標記（如以下所詳加討論者）。

雖然實例中所例示之具體例包含一對”相配的 15 (matching)’’ VH以及VL部位，本發明亦包含含有一單個可變部位之結合片段，該單個可變部位係衍生自VH或VL部位序列，特別是VH部位。在該單鏈特異性結合部位之任一例中，這些部位可被用於篩選能形成二部位特異性（two-domain specific)抗原結合部位之互補部位（complementary 2〇 domains)，其等係能結合GDF-8者。這可藉由嗟菌體呈現篩選法達成’其利用所謂的階層式雙組合式方法（hierarchical dual combinatorial approach)如揭示於WO 92/01047，其中一個別的含有一 Η或L鍵的選殖株（clone)之菌落（colony)係被用以感染一完整庫之編碼另一鏈（L或Η)之選殖株，並 28 200423958 一 °卩位特異性抗原結合部位，其係依據噬菌體呈現技術被選擇’如該參考資料中所描述。此技術亦被Marks et al·揭露，如前。抗體可藉由化學方法而被與放射性核種、藥物、巨分 5子或其他藥劑共軛，或可被作成包含一或更多本發明之 CDRs之融合蛋白質。

一抗體融合蛋白質含有一 vh_vl對，其中這些鏈中之一者（通常是VH)以及另一蛋白質係經合成為一多胜月太鍵。這二類型的產物不同於抗體處在於，其等一般地具有一附力的構件小分子的活性基團（moiety)或該經共輛的或融合的聚分子之主要分子結構特徵。除了上述之胺基酸序列之變化以外，該等抗體可被糖化、聚乙烯二醇化（peglyated)或被連接至白蛋白或一奈米蛋白質性（nan〇pr〇teinaceous)聚合物。例言之，現在揭示之抗 15體可被連接至多種奈米蛋白質性聚合物之一者，諸如：聚乙一醇、聚丙二醇或聚氧化烯，採用如美國專利號：

4,640,835、4,496,689、4,301，144、4,670,417、4,791，192或 4，179,337載述之方法。例如，該等抗體係經化學地改質而共價的共軛至一聚合物以增加其等之循環半衰期。例示性 20的聚合物，以及將其等附接至胜肽之方法也呈現於美國專利號：4,766，106、4，179,337、4,495,285及4,609,285 中。在其他具體例中，該抗體可經改質以具有一經改變的糖化型樣（即，從原有的或自然的糖化型樣改變）。此處所使用之’’經改變的（altered)，，意指具有一或更多碳水化合物 29 200423958

基團被刪除，及/或具有一或更多糖化處被添加至該原有的抗體。將糖化處添加至目前揭示之抗體係藉由使該胺基酸序列改變而含有習知技藝已知之糖化處共同序列來被完成。另一種增加該抗體上的碳水化合物基團數之手段係藉 5 由化學或酵素耦合糖苷至該抗體的胺基酸殘基上。這些方法係被描述於 WO 87/05330 以及 Aplin與 Wriston( 1981 )CRC Crit· Rev· Biochem·，22: 259-306。任何出現於該抗體上之碳水化合物基團之移除可藉由化學地或酵素地完成，如描述於Hakimuddin et al.(1987) Arch. Biochem. Biophys·，259: 10 52 ;以及Edge et al. (1981) Anal. Biochem·，118: 13 1 以及

Thotakura et al· (1987) Meth. Enzymol·，138: 350 〇本發明之抗體也可被以一可偵測的或功能性標記來標識。可偵測的標記包括放射性標記，諸如1311或"Tc，利用習知技藝已知的傳統化學法其可被貼附至本發明抗體上。

15 標記亦包括酵素標記，諸如山葵過氧化酶（horseradish peroxidase)或驗性去填酸酶（alkaline phosphatase)。標記又包括化學基團，諸如：生物素（biotin)，其可經由結合至一特定的同質可偵測的基團，如：經標記的卵白素（avidin)，被偵測。 20 抗體，其中CDR序列僅非實質地不同於如序列辨認編號η，其中 η係2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、 40、41、42、43、44、45、46、47 或 48，係被含納於本發明的範疇中。非實質的不同處包括次要的胺基酸變化，如 30 200423958

一 CDR序歹ij中任5個胺基酸中1或2者之取代。典型地，一胺基酸係被一相關的胺基酸取代，該相關的胺基酸具有相似的電荷、疏水性或立體化學的特徵。此類取代係落於一習知技藝人士之普通技藝中。不像CDRs中，更多實質的變化 5 可被進行於結構架構區域（FRs)中而不負面地影響一抗體的結合性質。FRs之變化包括，但不受限於，擬人化一衍生自非人類之架構或設計某些對於抗原接觸或穩定該結合處係重要之架構殘基，諸如：改變該固定區域之分類（class) 或次分類（subclass)，改變可改造一作用體（effector)功能之 10 特定的胺基酸殘基，諸如：Fc受器結合（Lund et al· (1991) J· Immun· 147: 2657-1662及Morgan et al· (1995) Immunology 86: 319-324)，或改變衍生該固定區域之物種。抗體可具有突變位於該重鏈的CH2區域中，其減少或改變作用體功能，例如Fc受器結合以及補體活化作用。例如，抗體可具有諸 15 如美國專利號：5,624,821及5,648,260所描述之突變。例如，在IgGiSIgG〗重鏈中，此突變可被進行在序列辨認號：53 之胺基酸殘基117及120，該序列辨認號：53係表示4〇1的 Fc區位（這些殘基對應於IgGi*IgG2全長序列中的胺基酸 234及237)。抗體也可具有突變使一免疫球蛋白的兩個重鏈 20 之間的雙硫鍵穩定，諸如：該IgG4的鉸鏈區域（hinge region) 中之突變，如揭示於 Angal et al· (1993) Mol. Immunol· 30: 105-108 。 D.核酸、選殖以及表現系統 31 本發明更提供一經單離的核酸其本發明之編碼抗體或結合片段。依據本發明之核酸可包含DNA*RNA以及可全 4或部份地係合成的。關於如於此所載述之核苷酸序列包括有該特定序列之DNA分子，且包括有該特定序列之rna 5刀子其中U係經取代為T，除非内容中有其他要求。本發明之核酸包含一如於此所載述之本發明cdr或或VL部位之編碼序列。本發明亦提供以下形式之構築體（construct):質體、載體、轉錄或表現組合體（cassette)，其包含至少一上述之本 10 發明核酸。本發明亦&供一宿主細胞，其包含一或更多如上述之構築體。一核酸其編碼任何於此所提供之CDr ( Η丨、η〕、 H3、L1、L2或L3)、VH或VL部位，或特異性抗原結合片段，形成本發明之一態樣，以一編碼產物之製造方法。該方法 15包含該編碼核酸之表現。表現可藉由於適當條件下培養含有該核酸之重組的宿主細胞來達成。藉由一 Vh*Vl部位，或特異性抗原結合片段表現之製造後，其等可使用任何合適的技術被單離及/或純化，接著被適當地使用。依據本發明之特異性抗原結合片段，vH及/或vL部位， 20以及編碼核酸分子以及載體可被提供從，例如其等之自然環境，被單離及/或純化，於實質地純或均質的形式，或，例如，核酸其係無或實質地無其他非編碼一有所欲功能的多太之核酸或基因序列。於多種不同的宿主細胞内選殖及表現一多太之系統係 32 200423958 被詳知的。合適的宿主細胞包括：細菌、哺乳類細胞、酵母以及桿狀病毒系統。可獲得自習知技藝之用於一異源性多太之表現的哺乳類細胞，包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa 細胞、幼倉鼠腎臟細胞、NS0小鼠黑色素瘤細胞以及許多其 5 他者。一普遍的細菌宿主係五· co/z·。關於適於用來生產抗體之細胞，參見 Gene Expression Systems，eds. Fernandez et·， Academic Press, 1999。任何相容於本發明之細胞可被用於生產現今揭露之抗體。

合適的載體可被選用或被構築，其含有適合的調節序 10 列，包括啟動子（promoter)序列、終端子（terminator)序列、多腺苷酸化（polyadenylation)序列、增強子（enhancer)序列、標籤基因（marker genes)以及其他適合的序列。載體可為質體或病毒，如：嗤菌體或菌質體（phagemid)，適合的。關於進一步的細節參見’例如，Molecular Cloning: a Laboratory 15 Manual: 2nd ed·，Sambrook etal.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。許多已知的核酸操作技術及方法，例如，核酸構築體之製備、突變作用、定序、導入DNA至細胞以及基因表現’以及蛋白質之分析，係被詳述於Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., Ausubel et al. eds.5 20 John Wiley & Sons，1992。因此，本發明的進一步態樣提供一宿主細胞其包含描述於此之核酸。另一態樣提供一方法其包含導入此核酸至一宿主細胞中。該導入可採用任何可獲用之技術。對於真核細胞’合適的技術可包括磷酸鈣轉染作用（transfecti〇n)、 33 200423958 DEAE-dextran、電穿孔法（electroporation)、微脂體（liposome) 媒介的轉染作用以及轉導作用（transduction)，利用反轉錄病毒或其他病毒，如：牛痘，或用於昆蟲細胞之桿狀病毒。對於細菌細胞，合適的技術可包括氯化鈣轉形作用 5 (transformation)、電穿孔法以及利用細菌嗟菌體之轉染作用。該導入作用隨後可引起或促使該核酸之表現，如，藉由培養宿主細胞於表現該基因之條件下。

10 E.生物寄存個別地經該菌質體載體PCANTAB6 (其編碼非生殖細胞化的 scFv’sMyo29、Myo28 或 Myo22)轉形之 E· coli 培養物係於二〇〇三年十月二日被寄存在美國組織培養儲存中心（ATCC)分別為寄存編號PTA-4741、PTA-4740以及 15 PTA-4739 〇該寄存地點係 10801 University Blvd，Manassas,

VA 20110, U.S.A. 〇 II.治療疾病的方法及其他用途本發明之抗體係有用於防止、診斷或治療人類或動物 20 的醫學疾病。該等抗體可被用以抑制或減少一或更多相關於GDF_8或相關的蛋白質之活性。最佳地，該抗體抑制或減少一或更多GDF_8之活性，相對於一未被一抗體結合之 GDF-8。在某些具體例中，該GDF-8的活性，當被一或更多本發明所揭露之抗體結合時，係被抑制至少50%，較佳地 34 200423958 至少 60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、 84、86或88%，更佳地至少9〇、91、92、93或94%，以及甚至更佳地至少95%至100%相對於一未被一或更多本發明所揭露之抗體結合之成熟的GDF_8蛋白質。GDF-8活性之抑制 5可被測量於一 pGL3(CAGA)i2報導基因檢測（RGA)中，如描述於Thies et al· (Growth Factor (2001) 18: 251-259)以及例示於實例2及9,或被測量於ActRIm受器檢測中如例示於實例3及6。該藉由本發明之抗體來防止、診斷或治療之醫學疾患 1〇係一肌肉或神經肌肉疾病，以及一脂肪組織疾病（諸如肥胖）、第二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群 (如X症候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起的騰島素抗性，或骨頭退化性疾病（諸如，骨質疏鬆症）。其他藉由本發明之抗體來防止、診斷或治療之醫學疾 15患係與一骨質流失相關的疾病，其包括骨質疏鬆症（特別地在老年人及/或停經後婦女）、糖皮質素引發的骨質疏鬆症、骨質缺少症、骨關節炎，以及骨質疏鬆相關的骨折。其他標的代謝性骨頭疾病及疾患包括源自慢性糖皮質素療法之低骨質、早期性腺衰竭、雄性素抑制低落、維生素D W缺t次發性副甲狀腺機能宄進、、營養缺乏以及厭食症。該等抗體係較佳地被用以防止、診斷或治療哺乳類之此類醫學疾患，特別地，人類。本發明之該等抗體或抗體組成物係以—治療上有效量被投予。一般地’ 一治療上有效量可依受試者㈣㈣的年 35 200423958 齡、狀況及性別，以及該受試者的醫療狀況嚴重度而有變化。需要時該劑量可由一醫師決定或調整，以符合經觀察的治療效果。此等化合物之毒性以及治療效果可藉由標準藥學程序被於細胞培養或實驗動物中測定，例如，測定乙^⑼ 5 (對於50%族群致命之劑量）以及ED”（對於50%族群治療上有效之 > 丨丨虿）。毋性及治療效果之間的劑量比率係治療指數且其可被以LD^/ED^之比率表現。展現大的治療指數之抗體係較佳的。該獲得自細胞檢測及動物研究之數據可被用以訂定一 10使用於人類的劑量範圍。此化合物之劑量較佳地存在於一包括EDw而有小的或無毒性之循環濃度範圍内。該劑量可在此範圍内依採用的劑型及利用之投予路徑而變化。對於任何被使用於本發明中之抗體，該治療上有效劑量可從細胞培養檢測被初始地評估。一劑量可被訂定於動物模式中 15以達到一循環血漿濃度範圍其包括如細胞培養中測定之該 IC5〇 (即，該測試抗體的濃度係達致對徵狀有半-最大的抑制作用）。血漿中的位準（levels)可被測定，例如，藉由高效能液相層析法。任何特定劑量之效用可藉由一合適之生物檢測（bioassay)被監測。合適之生物檢測實例包括dna複製 20 作用檢定、基於轉錄作用之檢定、GDF_8蛋白質/受器結合檢定、肌酸激酶檢定、基於前_脂肪細胞的分化作用之檢疋、基於脂肪細胞的葡萄糖攝取之檢定，以及免疫性檢定。一般地’該等組成物係被投予使得抗體或其等結合片段係以介於 1 Bg/kg與20 mg/kg、1 pg/kg與 10 mg/kg、1 pg/kg 36 200423958 與 1 mg/kg、10 pg/kg與 1 mg/kg、10 pg/kg與 loo 叫 /kg、1〇〇 pg/kg與1 mg /kg以及500 pg /kg與lmg/kg之間被給予。較佳地，該等抗體係被以一批式劑量（bolus)給予，以儘可能擴大該抗體的循環位準於劑量給予後之最長的時間。在批式 5 劑量後，連續式注入也可被使用。以現今揭露的抗體來治療、診斷或防止前述醫學狀況之方法也可被使用在其他TGF-β超科之蛋白質上。許多這些蛋白質係結構上與GDF_8相關，諸如BMP-U。依據地，另一具體例提供治療前述疾患之方法，其藉由單獨投予一能 10抑制BMP-U或促進素（activin)至一受試者，或組合上其他 TGF-β抑制劑，諸如一GDF_8之中和抗體。本發明之該等抗體也可被用以治療一疾病或與BMP相關或由BMP媒介之狀況。參考，如，美國專利第5,639,638號及第6,437，111號。本發明之該等抗體也可被用以偵測屬於TGF-β超科之 15蛋白質的存在，諸如BMP-11以及GDF-8，活體内或活體外。藉由這些蛋白質的存在或位準與一醫學狀況之關連，熟習本項技藝者可診斷該相關的醫學狀況。可藉由現今揭露之抗體來診斷之醫學狀況係如前所載述者。這些谓測方法係詳知於習知技藝以及包括elisa、免 2〇疫放射檢測法、免疫墨點法、西方墨點法、免疫螢光法、免疫沉澱法以及其他相似的技術。該等抗體可進一步被提供於一診斷套組中，其納入一或更多這些技術來偵測一蛋白質（如，GDF-8)。此一套組可含有其他組份、包裝、說明書或其他幫助蛋白質的偵測及該套組之使用之物質。 37 200423958 當該等抗體係欲被用於診斷目的時，其可被所欲的修飾其等，例如，以一配位子基群（ligand gr〇up)(諸如生物素）或一可偵測的標籤基群（諸如一螢光基群、一輻射同位素或一酵素）。若所欲的，該等抗體（不論多株或單株） 5可使用傳統的技術被標記。合適的標記包括螢光團 (fluorophores)、色素團（chr〇mophores)、輻射性原子、電子緻密試劑、酵素、以及具有特定結合夥伴之配位子。酵素係典型地藉由其等活性被偵測。例如，山葵過氧化酶可藉由其將四甲基聯苯胺（TMB)轉換至一藍色素之能力被偵 1〇測，可被以一分光光度計來定量。其他適合的標記可包括生物素以及卵白素或鏈菌卵白素（streptavidin)，igG及蛋白質A ’以及眾多習知技藝已知之受器·配位子對。其他變化或可能性對於熟習此項技藝者將是輕易明顯的，且被視為本發明的範疇之同等者。 15 本發明又一態樣提供一方法其辨認有用於肌肉及骨頭疾患之治療劑。適當的篩選檢測，如，基於ELISA之檢測，係習知技藝所知。於此一篩選檢測中，一第一結合混合物係由組合一本發明之抗體及一配位子形成，如，GDF-8、 BMP 11促進素，以及該第一結合混合物中該配位子與該 20抗體間的結合量（M〇)係被測量。一第二混合物也由組合該抗體及該配位子以及一欲被篩選之化合物或藥劑而形成，以及遺第一結合混合物中該配位子與該抗體間的結合量 (M!)係被測量。接著該第一與第二結合混合物中的結合量被比較’例如，藉由計算該Μι/Μ〇比率。當相較於該第一結 38 200423958 合混合物’若觀察到一減低之結合於該第二結合混合物中，該化合物或藥劑係被認為能抑制gDF-8活性者。結合混合物之配方及完善化係熟習此項技藝者所知，此結合混合物也可含有緩衝劑及必要於加強或改善化結合之鹽類， 5以及附加的對照檢測可被包括於本發明的篩選檢測中。被發現能減低該抗體-配位子之結合達至少約丨(即 Mi/MoCO.9)之化合物，較佳地大於約3〇%，於是可被辨認且之後，若所欲的，再次篩選其抑制GDF_8之能力於其他檢測中，諸如ActRIIB結合檢測（實例2 )，以及其他基於細 10胞及活體内的檢測，如實例13、15及16之描述。 III·藥學組成物及投予方法本發明提供包含現今所揭露的抗體之組成物。此等組成物係可適於藥學使用以及投予至患者。該等組成物典型 15地包含一或更多本發明之抗體以及一藥學上可接受的賦形劑。就如使用於此，該片語，，藥學上可接受的賦形劑，，包括任何以及所有的溶劑、散佈介質、塗覆物' 抗細菌及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑，以及相似者，其等係相容於藥學上投予。此等介質及藥劑於藥學上活性物質之使用係 20習知技藝所詳知。該等組成物也可含有其他活性化合物其提供補充的、額外的或增強的治療功能。該藥學組成物也可被包括於一容器、包裝或分配器中，且與投予說明書一起。本發明的藥學組成物係經配方以符合其所欲投予之路 39 徑。完成該投予之方法係一般熟習該項技藝者已知的。也可旎獲得可被局部地或口服地投予之組成物，或能穿透黏膜者忒投予可為，例如，靜脈内、腹腔内、肌肉内、腔内、皮下或穿透皮膚的。 5 被使用於真皮内或皮下施用之溶液或懸浮液典型地包括一或更多以下之組份：一無菌的稀釋劑諸如用於注射之水、鹽溶液、固定性油脂、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其他合成的溶劑；抗細菌劑諸如苯基醇或對羥基苯甲酸甲酉曰，抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙 10二銨四醋酸；緩衝劑諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調整張力（tonicity)之藥劑諸如氣化鈉或葡萄糖。該 pH可被以酸或鹼（諸如氫氣酸或氫氧化鈉）調整。此製備物可被裝於瓿（ampoules)、可丟棄的注射筒或玻璃或塑膠製的多劑型瓶中。 15 適於注射之藥學組成物包括無菌的液態溶液或散佈液以及無菌的粉末其係用於臨場製備無菌的可注射溶液或散佈液。對於靜脈内投予，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ™ EL(BASF，parsippany，nj)或緩衝的磷酸生理鹽(PBS)。所有例子中，該組成物必須是無菌的且應是 20可容易的注射出程度之流體。其在製造與儲存狀況下必須是穩定的且必須經保存對抗微生物（諸如細菌或真菌）的污染作用。該載劑可為一溶劑或散佈介質含有，例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇，以及液態聚乙二醇，以及相似者），以及適合的其等混合物。該恰當的流體性可 40 200423958 被維持，例如，藉由一塗覆物（諸如卵磷脂）之使用，在分散液狀況中藉由需求的顆粒大小之維持以及，藉由界面活性劑之使用。微生物作用之防止可藉由多種抗細菌及抗真菌劑達成，例如，羥基苯曱酸鹽、氯丁醇、酚、抗壞血 5酸、硫柳汞（thimer〇sal)以及相似者。許多狀況中，較佳的將包括等張劑，例如，糖類、多元醇，諸如甘露醇、山梨醇以及氣化鈉於該組成物中。該可注射組成物之延長的吸收可被引起，藉由包括一延緩吸收之藥劑於該組成物中，例如，單硬脂酸鋁以及明膠丨㈣以⑷。修 1〇口服組成物一般地包括一鈍性稀釋劑或一可食用的載劑。其等可被裝於明膠囊中或壓縮成藥片。用於口服治療投予之目的，該抗體可被納入賦形劑以及被以藥片或膠囊形式使用。藥學上相容的結合劑，及/或佐劑物質可被包括做為該組成物的一部份。該等藥片、藥丸、膠囊及相似者 15可含有任何下述成分，或有相似性質之化合物：一結合劑諸如微晶纖維質、黃蓍膠（gum tragacanth)或明膠，一賦形劑諸如澱粉或乳糖，一崩解劑諸如藻朊酸（AHginic acid)、 ®

Primogel TM或玉米澱粉，一潤滑劑諸如單硬脂酸鎂或 Sterotes TM，一助滑劑諸如膠體二氧化矽，一甜味劑諸如蔗 20糖或糖精，或一調味劑諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。用於吸入投予’抗體係以一來自加壓的容器或分配器 · 或喷霧器之喷霧形式被傳遞，該容器或分配器含有一合適 · 的推進劑，諸如一如二氧化碳之氣體。全身性投予亦可經由穿透黏膜或穿透皮膚之手段。例 41 200423958 如’包含Fc區位之抗體的例子，組成物係可能經由以以受器媒介的路徑傳送通過黏膜層（如，小腸、口或肺）（美國專利第6,030,613號）。穿透黏膜投予可透過錠劑 (lozenges)、鼻腔喷霧器、吸入器或栓劑之使用來完成。關 5於穿透皮膚投予，該活性化合物係被配方成軟膏、油膏、膝或乳霜，一般地係如習知技藝所知。關於穿透黏膜或穿透皮膚投予，適於該欲滲透障壁之穿透劑係被使用於該配方中。此類穿透劑一般地為習知技藝所知，以及包括，例如，清潔劑、膽鹽以及褐黴酸（fusidie acid)衍生物。馨| 1〇現今揭露之抗體可被製備有載劑，該載劑將保護該化合物對抗自身體快速排除，諸如一經控制釋放之配方，包括植入物以及微膠囊化傳遞系統。生物可降解的、生物相容的聚合物可被使用，諸如··乙烯醋酸乙烯、聚酐、聚甘醇酸、膠原、聚正酯以及聚乳酸。此類配方之製備方法對 15於熟習本項技藝者將是明顯的。微脂體懸浮液含有現今揭露之抗體也可被使用作為藥學上可接受的載劑。這些可依據熟習本項技藝者已知之方法來製備，例如，描述於美國 φ 專利第4,522,811號。將口服或非口服的組成物配方成劑量單元形式可有利 2〇於溶液投予以及劑量的均一性。於此所使用之劑量單元形式才曰物理性分離的單元其適於用於欲處理之受試者的單元性劑量；各個單元含有一預定量之活性化合物，其經計算以產生所欲的治療效用，相關於所需的藥學載劑。關於本發明之劑量單元形式的說明係被指示且直接依據該活性化 42 200423958 合物的獨特特徵以及所欲達製的特定製療效用，以及習知技藝配方此一活性化合物來治療個體之固有限制。隨後的實例提供例示性的本發明具體例，其在任何方面不會限制本發明。一般的熟習本項技藝者將認知具體例 5 以外的眾多者係包含於本發明範缚内。載述於本案之參考資料、專利以及公開的專利申請案的整體内容係被納入於此作為參考。較佳實施例之詳細說明 10 實例1 : GDF-8之純化來自一經選擇的表現重組人類GDF-8蛋白質（成熟的 GDF-8以及GDF-8原胜肽）的細胞之條件化的培養基係經酸化至pH 6.5，以及被施用至一 80x 50 mm POROSTM HQ陰離子交換管柱，之後被施用至一 80x 50 mm POROS™ SP 15 陽離子交換管柱（PerSeptive Biosystems，Foster City, CA)。該流過的流體係經調整至pH 5.0以及被施用至一75 X 20 mm POROS™ SP 陽離子交換管柱（PerSeptive Biosystems )以及被以一 NaCl梯度沖提。分液（fraction)含有該GDF-8潛伏複合體，當經SDS-PAGE確認，係被共同收 20 集，經以三氟醋酸（TFA)酸化至pH2_3，接著被以0.1%TFA 加成200 ml以降低其黏度。該共同收集物係接著被施用至一 250x 21.2 mm C5 管柱（Phenomenex，Torrance，CA)，先刖施用至一 60 x 21.2 mm保護管柱（gUard column) (Phenomenex)以及以一 TFA/乙腈梯度沖提，以將成熟的 43 200423958

GDF-8從GDF-8原胜肽分開。含有成熟的GDF-8之分液係藉由冷凍乾燥以移除該乙腈而被濃縮，且20 ml的0.1% TFA係被添加。該樣品係接著被施用至一 250X 10 mm C5管柱 (Phenomenex )加熱至60°C以幫助分離。此係被重複直到 5 更進一步的分離無法再被達到。含有成熟的GDF-8之分液係被共同收集且被加成40%乙腈以及被施用至一 600x 21.2 BioSep™ S-3000 尺寸排除管柱（size exclusion column) (Phenomenex )，先前施用至一 60x 21 ·2 mm保護管柱。含有經純化的成熟GDF-8之分液係被共同收集以及被濃縮用 10 於隨後實驗之使用。

在SDS-PAGE上，經純化的成熟GDF-8於未還原 (nonreducing)條件下移動如一寬帶在25 kDa處以及於還原 (reducing)條件下係在13 kDa處。一相似的SDS-PAGE輪廓圖（profile)已被 McPherron et al.(Proc. Nat. Acad. Sci. 15 U.S_A_ (1997) 94: 12457· 12461)報告關於鼠類GDF-8以及反映該成熟蛋白質的二聚體性質。該活性成熟的BMP-11二聚體係以一相似手段，從來自一表現重組人類BMP-11的細胞株之經條件化的培養基中被純化。活性成熟的BMP-11係從來自一表現重組人類GDF-8原 20 胜肽/成熟BMP_11嵌合蛋白質的細胞株之經條件化的培養基中被純化。該經條件化的培養基係被載入一 1 〇 ml TALONtm 管柱（Clonetech, Palo Alto, CA)於50 mM Tris pH 8-0，1M NaCn，1 ml/min。該被結合的蛋白質係被以50 mM Tris pH 8.0，1M NaCM，500 mM 咪唑沖提。該含有 GDF-8 44 200423958 原胜肽/BMP-11潛伏複合體之經共同收集的分液係被以 10% TFA酸化至pH 3。該共同收集物接著被施加至一 250x 4·6 mm Jupiter C4 管柱（Phenomenex，Torrance，CA)，被加熱至60°C使成熟的BMP_11及GDF-8原胜肽有更好的分離， 5 以及被以一 TFA/乙腈梯度沖提。含有成熟BMP-11之經共同收集的分液係被冷凍乾燥濃縮。在SDS_PAGE上，經純化的成熟BMP-11在未還原條件下移動於25 kDa處以及在還原條件下於12 kDa處。

10 實例2 :經純化的重組人類GDF-8之生物活性為了展示GDF-8的活性，一報導基因檢測（RGA)係被發展，其使用一表現螢光酵素（luciferase)之報導載體 pGL3(CAGA)12。該CAGA序列係先前係被報告為一 TGF-β 反應序列，其位於TGF-β誘發基因PAI_1的啟動子中（Denner 15 et al· (1998) EMBO J·，17: 3091-3100)。一含有12個CAGA盒之報導載體係被製造，其使用基本

螢光酵素報導質體pGL3(Promega，Madison，WI)。來自腺病毒主要後啟動子（latter promoter) (-35/+10)之TATA盒以及轉錄起始位係被插入介於Bglll及Hindlll位置間。含有12重 20 複的CAGA盒AGCCAGACA之募核苷酸係被接合（annealed) 且選殖進入Xhol位置。人類橫紋肌肉瘤細胞株A204(ATCC HTB-82)係被以pGL3(CAGA)12暫時地轉染，利用FuGENEtm 6反應劑（Boehringer Manheim，Germany)。轉染之後，細胞係被培養在48井盤於McCoy’s 5A培養基中達16 hrs，該培養 45 200423958 基經補充有2mM麩醯胺酸、100 U/ml鏈黴素、盤尼西林以及10%胎牛血清。接著細胞於有或無10 ng/ml GDF-8的 McCoy’s 5A培養基中在37°C下被處理6 hrs，該培養基含有麩醯胺酸、鏈黴素、盤尼西林以及1 mg/ml牛血清白蛋白。 5 經處理的細胞中之螢光酵素係被定量，利用螢光酵素檢測系統(Promega)。

第4A圖呈現GDF-8最大地活化該報導構築體10倍，有一ED50為10 ng/ml，指出該經純化的重組GDF-8係生物活性的。BMP-11以及促進素引起一相似的生物性反應。 10 實例3 :經純化的GDF-8於ActRIIB結合檢測中之結合性質該GDF-8潛伏複合體於一 20莫耳EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce，Rockford，Illinois，Cat. No_ 21217)對1莫耳GDF-8複合體的比例下，在冰上被生物素 15 標記共2小時。該反應係藉由使用0.5% TFA來降低該pH而

被終止，且該複合體係於一 C4 Jupiter 250x 4.6 mm管柱 (Phenomenex)受到層析，以使該成熟GDF_8與GDF-8原胜肽分離。被以一 TFA/CH3CN梯度沖提之經生物素標記的成熟 GDF-8分液係被共同收集、濃縮以及藉由MicroBCATM蛋 20 白質檢測反應套組（Pierce, Rockford. IL，Cat. No. 23235) 被定量。經生物素標記的成熟BMP_ 11係被從該BMP-11潛伏複合體製備，以相似於前述之手段。重組的ActRIIB-Fc嵌合體（R&D Systems，Minneapolis，MN，Cat. No· 3590)係被塗 46 200423958 覆於96井平底測試盤（Costar，NY，Cat· No. 3590)上，以1 pg/ml於0.2 Μ碳酸氫鈉緩衝液中在4°C下隔夜。該等盤接著被以1 mg/ml牛血清白蛋白封堵且清洗，照著標準ELISA 程序。100 μΐ量的多種濃度之經生物標記的GDF-8或BMP-11 5 係被加入該經封堵的ELISA盤中，培育1 hr、經清洗，且該

被結合的GDF·8或BMP-11係被偵測，藉由鏈菌卵白素-山葵過氧化酶（SA-HRP，BD PharMingen，San Diego，CA，Cat. No· 13047E)隨後加入TMB (KPL，）Gaithersburg，MD，Cat-No. 50-76-04)。於一Molecular Devices 微盤讀值器中，色 10 度測量係被在450 nM下進行。如第1圖所示，經生物標記的GDF-8及BMP-11結合至 ActRIIB (推定的GDF-8第二型受器），個別地有ED50為15 及40 ng/ml，指出該ActRIIB結合檢測對於GDF-8及BMP-11 係一敏感的活體外結合檢測。 15 實例4 :藉由GDF-8於scFv庫之挑選來單離Myo22

一 scFv菌質體庫，其係該1·38χ 101G庫之一放大版本經描述的（Vaughan et al. (1996) Nature Biotech., 14: 309_314)，被用以選擇對GDF-8特異的之抗體。可溶的 20 GDF-8蛋白質（10 pg/ml於50 mM碳酸氫鈉緩衝液中，pH 9·6)係被塗覆至一微效價盤的井中，於4°C下隔夜。該等井被以PBS清洗以及經封堵於37°C下MPBS(3% Marvel™脫脂奶粉於PBS中）中2 hrs。經純化的噬菌體（1〇12轉導單位（tu)) 於100 L的3%MPBS中係被加入至經封堵的井中且經培育於 47 200423958 室溫下1小時。該等井係被以PBST(PBS含有0.1% v/v TweenTM 20)清洗10次，接著以PBS清洗10次。經結合的噬菌體顆粒係於100 μΐ的100 mM三乙基胺中在室溫下10分鐘被沖提，接著馬上被以50 μΐ的lMTris-HclpH7.4中和。 5 該經沖提的嗤菌體係被用以感染10 ml指數成長的五.co// TG卜經感染的細胞被生長於2TY培養液在37°C下靜止的30 分鐘，隨後在37°C曝氣下30分鐘，接著塗劃於2TYAG盤上且被培養在30 °C隔夜。菌落（colony)係被從盤上刮下放入10 ml2TY培養液以及15%甘油係被添加以儲存在-70°C。 10 來自第一回挑選作用之甘油存放的培養物係被重複感染輔助嗤菌體（helper phage)以及被取回以產生scFv抗體表現之噬菌體顆粒來用於第二回挑選。此方式共進行全部三回之挑選。 15 實例5 ··從scFv庫中篩選Myo28以及My029 可溶的篩選係使用經生物素標記的GDF-8蛋白質

(bioGDF-8)來進行。bioGDF-8係以1 pg/ml的濃度被使用。一 scFv庫，如實例4所述，係被使用。經純化的scFv嗜菌體 (1012 tu)於100 μΐ的3% MPBS中係被封堵30分鐘，接著經生 20 物素標記的抗原被加入以及培育在室溫下1小時。噬菌體/ 抗原係被加入50 μΐ的DynalTM Μ280鏈菌卵白素磁珠以及再被培育於室溫下15分鐘，該等磁珠已先經於1 ml的3%MPBS 中在37°C下被封堵1小時。該等磁珠係被使用一磁條來抓取，以及被於 1 ml的 3% MPBS(含有 0.1% v/v Tween™ 20) 48 200423958 中清洗四次，隨後於PBS中清洗。在最後的PBS清洗後’磁珠係被懸浮於100 μΐ PBS中且被用以感染5 ml指數成長的五. co/z· TG1細胞。細胞以及噬菌體係被培養在37 C ^ 1小時（30 分鐘靜止的，30分鐘搖動於250 rpm)，以及接著被分布在 5 2TYAG盤上。該等盤係被培養在3〇°C隔夜以及菌落可見於隔天。產生的菌落係被從盤中刮下以及禮菌體係被如前述取回。一第二回的可溶的篩選係被如前述進行。實例6 : ActRIIB受器抑制檢測以及篩選 10 產生的菌落，如實例4及5所述而獲得，係被挑進含有 100 μΐ 2TYAG的96井盤中。ScFv之產生係被引發’藉由加入ImM IPTG至指數生長的培養物中以及培養在3〇(：隔夜。粗略的含scFv培養物懸浮液係被筛選其主要抑制 bioGDF-8與ActRIIB結合的能力，如實例3所述。該檢測係 15稍微地被改變，其中bioGDF-8之結合係被以銷標記的鍵菌卵白素偵測以及使用該DELFIA™反應套組（PerkinElmer Life Sciences，Boston，ΜΑ)，於時間解析（time-res〇lved)螢光儀檢測（TRF)。陽性菌落，呈現抑制結合的訊號大於不相關的菌落者，係被挑取且經檢測以確認活性° 20 來自該受器抑制篩選確認之陽性菌落的經純化的scFv 係被測試於如上述抑制檢測中。該檢測中scFv濃度之效價分析（titration)係被使用為了建立如藉由ICso值所測量之菌落潛力。該等實驗結果係如第2圖所呈現者。就如這些檢測所測量，Myo29、Myo28 以及My〇22 等 scFv之IC5〇係 2.4 nM、 49 200423958 1·7ηΜ及60 nM，個別地。因此，這些抗體係GDF-8活性之潛在的抑制劑。實例7 :藉由噬菌體ELISA之特異性表述 5 為了測定該等抗體之特異性，一噬菌體ELISA係被進行於該等來自ActRIIB對GDF-8篩選之陽性菌落以及不相關的蛋白質。個別的含有質菌體之[菌落係被種植入96 井盤中，每井含有1〇〇 μΐ 2TYAK培養液。M13K07輔助噬菌體係以10之感染多重性（moi)被加至指數生長的培養物以 10 及該盤被再在37°C下培養1小時。該等盤在一桌上離心機中被離心2000 rpm 10分鐘。該懸浮液係被移除以及細胞團係被重懸浮於100 μΐ 2TYAG中以及在30°C搖動培養隔夜。隔天，該等盤係被離心2000 rPm 10分鐘以及100 μΐ來自各井之含嗤菌體上清液係被轉移至一新的96井盤。嗤菌體樣品 15 係於一最終濃度為3%MPBS中在室溫下被封堵1小時， ELSA之前。 GDF-8或不相關的蛋白質係以1 Mg/ml在4°C下被塗覆至96井微效價盤中。塗覆之後’該等溶液係被從該等井中移除，以及該等盤係於3%MPBS中在室溫下被封堵1小時。 20 該等盤係經培育於室溫下1小時以及之後被以PBST清洗3 次，接著以PBS清洗3次。50 μΐ的抗-M13-HRP共輛物 (Pharmacia)之1:50〇〇稀釋液係被加入各井中，該等盤係被在培育於室溫下1小時。各盤係被以PBST清洗3次，接著以 PBS清洗3次。50 μΐ的TMB受質（substrate)係被加入各井中 50 200423958 且經培育直到顏色展出。該反應係藉由加入25 μΐ的0.5M H2S04而被終止。該產生的訊號係被測量，藉由使用一微效價盤讀機讀取在450 nm的吸光值。特定結合至GDF-8係經確認。 5 實例8 : scFv的定序、轉換至IgG以及生殖細胞化 (germlining)

中和的scFv £：. co"選殖株係被塗劃於2TYAG盤上且被培養在30 °C隔夜。三重複的來自這些盤中之菌落係被定 10 序，使用pCANTAB6載體序列寡體（oligos)來放大來自該 scFv選殖株的VH及VL區。被用來製造Myo29、Myo28以及 Myo22 IgG之該等scFv片段的DNA序列係被呈現於序列辨識編號：13、序列辨識編號：7以及序列辨識編號：1，個別地。 15 來自該scFv選殖株的重及輕鏈區係使用PCR及選殖株- 特定的引子被放大。PCR產物係被以適當的限制酶切解且被次選殖進入含有人類IgG!重鏈固定部位（VH部位）的載體，或適當的含有人類λ輕鏈固定部位（VL部位）的載體。 V區部位正確的插入質體係經確謬，藉由來自個別的五.co/z· 20 菌落之質體DNA的定序。質體藉由標準技術被從五.co/z·培養物中製備，以及重及輕鏈構築體係使用標準技術被共轉染進入COS細胞。經選擇的IgG係被純化，使用Protein A Sepharose (Pharmacia，Peapack，NJ)以及緩衝液被改成 PBS。 51 200423958 該等scFv選殖株的定序資料係被用以辨認各個選殖株的重及輕鏈之最接近生殖細胞序列。適當的突變係被進行，使用標準的位址直接突變法技術與適當的致突變性引子。ScFv序列的突變係藉由序列分析被確認。經生殖細胞 5 化的Myo29及Myo28之scFv及VH及VL部位序列係載述於序列辨識編號：19以及序列辨識編號：25，個別地。實例9 :抗體的生物活性

第3A圖呈現Myo29與10 ng/ml生物素標記的GDF-8之 10 預培育（preincubation)在ActRIIB結合檢定中抑制了 GDF-8 結合至八(^尺118，如描述於實例3，其1(：5()係〇.2-〇.4 11]^。相似地在第3B圖中，Myo29抑制了BMP-ll結合至ActRIIB，有相同的IC50。

於一活體外生物檢測中Myo29也封堵了 GDF-8活性。附 15 帶為例，當GDF-8被與Myo29在室溫下預培育1小時，以RGA 檢定測量該GDF-8的生物活性係被減低，該檢定係基本上如實例2所述進行。第4C圖呈現在Myo29存在下，GDF_8(20 ng/ml)對pGL3(CAGA)12報導基因活性的誘發之ED50。 Myo29以一劑量反應性（d〇se_responsive)方式減低GDF-8活 20 性，有一 IC5〇係 15-30 ng/ml(0.1-0_2 nM)。Myo29也抑制 BMP-11的生物活性至相同程度（第4B圖）。相反的，於此檢測中該促進素（activin)的活性不受Myo29影響（第4D 圖），推定地因為相較於GDF-8及BMP-11，GDF-8及促進素之間相當低的相同性。 52 200423958

Myo22及Myo28也被測試於RGA及ActRIIB結合檢測。兩者抗體都封堵了 GDF-8及BMP-11活性。例如，Myo28的 IC50係0.2-0.35 nM。 5 實例10 : Myo22、Myo28及Myo29之抗原決定基定位

為了正確定位該等抗體之抗原決定基，代表整個如序列辨識編號：49所示之成熟GDF-8序列之48個重疊的13殘基胜肽係被直接地合成在纖維素紙上，利用點合成技術 (Molina et al. (1996) Peptide Research, 9:151-155; Frank et 10 al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232)。該等胜肽重疊處係 11個胺基酸。在此陣列中，半胱胺酸殘基係經絲胺酸取代，為了減少因半胱胺酸存在所引起之化學複雜性。經聚乙二醇改質的纖維素膜及經Fmoc保護的胺基酸係購買自 Abimed (Lagenfeld，Germany)。該陣列係藉由搞合一 β_丙胺 15 酸區隔物被限在該膜上，以及該等胜肽係被合成其利用標準DIC (二異丙基碳二亞胺）/HOBt (羥基苯並三唑）耦合化學係如先前描述的（Molina et al· (1996) Peptide Research， 9:151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232))。 20 經活化的胺基酸係被點上，使用一 Abimed ASP 222機械。清洗及去保護作用步驟係被手動地進行以及在該最終的合成循環後該胜肽係經N末端地乙醯化。胜肽合成之後，該膜係被於甲醇中清洗10分鐘以及在封堵物（TBS (Tris緩衝的生理鹽與0.1%(v/v)TweenTM20)及l%(w/v)酪蛋白） 53 200423958

中10分鐘。該膜接著被與2.5 gg/ml抗GDF-8抗體於封堵物中緩緩搖動培育1小時。以封堵物清洗3次各10分鐘後，該膜係被與HRP標示的二級抗體（0.25 pg/ml於封堵物中）培育 30分鐘。該膜接著被以封堵物清洗3次各10分鐘以及以 5 TBST清洗2次各10分鐘。被結合的抗體係被可見化，使用 SuperSingalTM West反應劑（Pierce)以及一數位相機 (Alphananotech Fluoromager)。結果係如第5圖所示。特定地，從第5圖可見，該Myo29抗原決定基係經定位在該成熟 GDF-8的胺基酸72及88之間。另一方面，Myo22經辨認有一 10 抗原決定基於該成熟GDF-8的前44個N末端胺基酸序列（序列辨識編號：49的胺基酸1至44)。最後，該Myo28的抗原決定基包含殘基係位於該成熟GDF-8的前98個N末端胺基酸。為了更進一步描述該Myo29抗原決定基的特徵，刪除 15 (deletion)及取代（substition)分析係使用點合成而進行。在

取代分析中，此胜肽的各個殘基係個別地被以除了半胱胺酸以外的20個自然胺基酸取代。合成以及結合分析係被進行如前述。該等結果係如第6圖所示，其中第一排、前二欄以及後三欄表示野生型胜肽控制組。該等結果展現當 20 Lys-78、Pro-81以及Asn-83係個別地被突變成其他胺基酸， Myo29對該胜肽的結合親和力係重大地減少。因此，My〇29 辨識一序列包含Lys-Xaal-Xaa2- Pro-Xaa3_Asn (序列辨識編號：54)，其中Xaal、Xaa2及Xaa3各自係任何胺基酸，或 Xaal=Met，Xaa2=Ser，以及Xaa3=Ile，各自係獨立的。 54 200423958 實例11 : GDF_8之免疫沉澱作用為了評估Myo29及Myo28與成熟GDF-8及GDF-8複合體之結合，一免疫沉澱作用研究係被進行。CHO細胞其表現 5 GDF-8係經35S-甲硫胺酸及35S_半胱胺酸標示。100 μΐ的來自這些細胞之條件化培養液，含有GDF-8蛋白質（成熟GDF-8 及潛伏複合體）係被與20 pg/ml Myo29或Myo28在4°C下培育1小時。Protein A-SepharoseTM係被加入以及被在4°C下培育隔夜。該免疫沉澱物係被收集，重懸浮於還原樣品緩 10 衝液中以及被藉由SDS-PAGE分析。該膠係經固定，被以自動放射顯像增強劑溶液增強、經乾燥以及自動放射顯像係經顯影。第7圖呈現Myo29及Myo28兩者都可免疫沉澱成熟 GDF-8、GDF-8潛伏複合體以及未經加工的GDF-8。就如西方墨點法所測定，於非還原條件下該兩種抗體都結合至 15 GDF-8 二聚體。

實例12 :藥物動力學

Myo29的藥物動力學（PK)係被於C57B6/SCID小鼠中評量，在以一單次靜脈内（IV)或腹腔内（IP)投予1 mg/kg劑量 20 後。該等動物接受未標示的及125I-標示的Myo29混合物於前述劑量，以及血清濃度係基於血清中1251的放射活性及該經注射的特定活性而被測量。第8圖呈現Myo29之IV或IP投予後血清濃度對時間的繪圖。

Myo29呈現約一星期長之延長的終半衰期以及低廓清 55 200423958 率約1 ml/hr/kg。起始分佈容積係約83 ml/kg。表觀分布容積係約227 ml/kg。Myo29在注射後約6 hrs達到一尖峰濃度。在IP注射後之經吸收的部分係約77%。 5 實例13 :活體内Myo29對肌肉質量及強度的效用

為了測量在活體内Myo29是否封阻GDF-8的活性， Myo29被於SCID成鼠中測試。SCID小鼠係處於一嚴重的混合型免疫缺乏症，且因此在注射人類抗體（如Myo29)之後並不會產生一免疫反應。肌肉質量係被作為經Myo29處 10 理之小鼠中GDF-8活性之指標。

八週大的雄性C57B6 SCID小鼠係被秤重且平均地依體重被分成八組。Myo29於PBS緩衝液中係每週以多種劑量 (60、10以及1 mg/kg)被腹腔内注射至小鼠。在第一週被給予雙份劑量。經載劑（vehicle，PBS)處理的或未經處理的小 15 鼠係作為控制組。該處理持續四週。處理後肌肉質量係被評估，藉由分割以及秤重腓腸肌以及四頭肌。在四週的處理後，所有被Myo29處理的組別中肌肉質量係增加的，從 10%至23%，處理較高劑量的組別達到顯著的程度（第9圖， ρ<0·01 ) 〇 20 在另一實驗中，雌性C57B6 SCID小鼠係每週被以多種劑量的My〇29 (10、5、2.5以及1 mg/kg)處理達4或12週。同樣地，以Myo29處理四週後導致腓腸肌以及四頭肌重量增加自10%至20% (第10A及10B圖）。更長的處理（12週）導致更大的肌肉增加（12%至28%)且所有被Myo29處理的組 56 200423958 別都達到統計上的顯著程度（第11A及11B圖）。為了測定經增加的肌肉是否促使更強的肌肉，前肢的肌肉強度係被以一抓握強度計（model 1027 csx，Columbus Instruments，Columbus，OH)測量。12週的處理後，相較於 5 載劑對照組，在被以5 mg/kg或10 mg/kg的Myo29處理的小鼠中前肢的強度係比該對照組高17°/。與23% (ρ<0·01，第12 圖）。這些研究結果展現在活體内Myo29抑制GDF-8活性而使肌肉質量及肌肉強度重大地減少。

10 第14圖：活艘内GDF-8於小樑骨（trabecular bone)中的角色

如實例13所示，GDF-8之抑制增加了肌肉質量。增加的機械性負重，不論是源自於增加的肌肉活性或增加的體重，係關連於骨質量及骨密度。因此，GDF-8剔除（knockout, KO)的小鼠係被評估經改變的骨質量及微架構 15 (microarchitecture)。對成鼠的初始評估呈現在剔除的小鼠脊體中其骨密度係南於其專之同窩出生的野生型小鼠近兩倍。這樣的增加遠超過僅僅是源自於該GDF-8KO小鼠中肌肉質量增加所預期者。高解析度的微斷層掃描影像（μ(：Τ40，Scanco Medical， 20 Switzerland)係被用以評估GDF-8野生型（WT)及KO成鼠之小樑骨體積部份以及第五腰椎與遠端股骨的微架構以及股骨中骨幹(mid-diaphysis)處的皮質骨幾何構造。檢體係採自 9-10個月大的GDF-8 KO及同窩出生的對照者（各基因型與性別各四隻小鼠）。整個脊椎體及股骨係被掃描，使用12 μηι 57 200423958 解析度之微電腦斷層掃描。感興趣之包圍脊椎體處的小樑骨以及遠端股骨骨骸（metaphysis)處（即，次海綿質 (secondary spongiosa))的小樑骨之區域係被辨認，使用一半自動的輪摩運算（contouring algorithm)。以下參數係使用 5 直接3D評量被計算：骨體基部份（％)、小樑骨厚度（μηι)、區隔（μιη)以及數目（l/mm)。此外，該連接密度（該小樑網絡被連接的程度之指標）以及股骨中骨幹區之皮質骨參數係被評估，包括整體面積、骨面積以及皮質厚度。相較於同窩出生的WT小鼠，雄性及雌性KO小鼠的脊 10 椎體之小樑骨密度都有戲劇化地增加（n=4, +93%及70%，個別地，p<0.0001)。此增加的小樑骨密度係伴隨14%的小樑厚度增加（ρ=0·03)，38%的小樑數目增加（ρ=〇·0002)，以及 10%的小樑區隔減少（ρ=〇,〇〇9)。相較於同窩出生的wt小鼠，這些變化之整合效果對於架構及密度導致雄性及雌性 15 ΚΟ小鼠的連接增加3.4至1.7倍（ρ<0.0001)，個別地。此外，該小樑骨的礦物化作用位準之一粗略測量指出該小樑的平均礦物含量，相較於該對照組，該ΚΟ小鼠係高8% (ρ<0·0001)。在此有一暗示，該效用在雄性小鼠高於雌性小鼠，但該樣品數太小而無法做確定結論。藉由高解析度微 20電腦斷層掃描評估之脊椎小樑骨特徵係呈現於第3表。相反於脊髓中之觀察，雄性及雌性ΚΟ小鼠在遠端股骨中具有較低於同窩出生的WT小鼠的小樑骨密度（η=4, ρ=0·05對於所有的基因型效用）（第4表）。此一骨頭密度減少在雌性κο小鼠中係較明顯於雄性反0小鼠。GDF_8 κ〇小鼠 58 200423958 具有相似於其等同窩出生的WT小鼠之小樑厚度，但相較於同窩出生的對照組，具有較少的小樑以及增加的小樑區隔。然而，雖然雄性κο小鼠在骨股中骨幹的皮質厚度係相似於其等同窩出生的對照組，但是雌性KO小鼠者係大於其等同窩出生的對照組近10%(n=4, p=0 04)(見第5表）。在兩種基因型之間’皮質骨面積或骨面積部份並無差異。第3表··脊椎小樑骨特徵（平均值± sem)

雄性WT 23.3+ 4/7~ ~52± 3 ~210± 4.6+ 0A 雄性KO 4^5.0+ 5.5~ 58± 6 T45 + T.0± 〇.4~ ~^7±TJ ^52±T^ Τδ3±ΤΓ Τ2Γ〇74~ 46j±T〇J Τό9± 7.6土一 rj $553¾¾ 度（μηι) j、襟區隔（μπι) 1樑數目 Qjmm) 連接密度股骨骨=處的小㈣特徵（平均值土 SEM)

59 10 200423958 第5表1骨的t骨幹^質骨特徵（平歸+ sem) 雄性WT 雄性ΚΟ 雌性WT 雌性KO j面積（mm2) 皮質厚度（μπι) 5·1± 1·8 丨 68± 1.2~ 11.9± 7.0 ~~n±l 5·4± 3.1 —63土 9 骨面積/全面積(〇/〇) 353+ 16 472± 90 296± 73 464± 98 實例15 :肌肉及骨退化疾患之治療 GDF-8之抑制劑，諸如抑制性抗體，係有用於對肌肉 5質量增加之治療，且亦有用於骨質疏鬆症之防止及治療。此外，GDF-8之抑制作用可能有用於其他狀況，該狀況中月頭的同化效用係所欲的，諸如骨療合（即，骨折的修復、椎體融合）之擴大。本發明的抗GDF_8抗體係被用以治療一受試者，其係發生或具有一確定的肌肉或骨頭退化 10 性疾病。抗GDF-8抗體對骨頭疾患，如：骨質疏鬆症，治療之功效係使用建立好的骨質疏鬆症模式來確認。例如，卵巢切除的小鼠以被使用來測試新的骨質疏鬆症藥物療效 (Alexander et al. (2001) J. Bone Min. Res. 16: 1665-1673; 15 以及 Anderson et al. (2001) J· Endocrinol. 170: 529-537)。相似於人類，這些嚅齒類在卵巢切除後展現一快速的骨質流失，特別是海綿骨。結果之評估係基於骨礦物密度、血 ✓月及尿液中之月頭異動的生化標記、骨頭強度以及組織學/ 組織型態測量。 20 在研九中’正常及/或免疫缺損的雌性小鼠在12-16週大時係被切除即巢，且使其骨質流失四至六週。在此骨質流 60 失期間後，以一抗GDF_8抗體（諸如Myo29，IP注射）或載劑治療’進行一至六個月。該治療流程可變化，依不同的劑量之測試或治療療程（諸如：每天、每週或每兩週地注射）。預期的是相對於完整的（即，未切除卵巢的）、年齡相符者’未經治療的小鼠（或大鼠）將流失接近1〇_3〇%的骨密度。預期的是以抗GDF-8抗體治療之小鼠將比接受安慰劑之小鼠有10至50%較高的骨質及骨密度，以及甚至此一骨密度增加係相關於增加的骨強度，特定地於有一大比例的海綿骨相較於皮質骨之區域。另一研究的目標係展現抗GDF-8抗體（諸如Myo29)係有效於防止相關於雌激素（estr〇gen)缺乏之骨頭質量、微架構及強度之衰退。因此，該研究具有相似於前述者之設計，除了抗GDF-8抗體之治療係在卵巢切除後被馬上開始，而不疋在骨質流失期間後。預期的是相較於以載劑治療之小鼠，以該抗體治療之小鼠在卵巢切除後將重大地減少骨質流失。抗GDF-8之抑制性抗體也被用以防止及/或減少該疾病的嚴重度及/或症狀。預期的是該抗(3]〇17_8抗體將被以頻繁地（如每天一次）或不頻繁地（如每月一次）之皮下注射方式投予。治療持續期可介於一個月及幾年之間。為了測試抗GDF-8抗體於人類之臨床功效，有低骨質之停經後婦女係經骨密度測試而辨認且被隨機分組至一治療組別。治療組別包括一安慰劑組以及一至三個接受抗體 (不同劑量）之組別。個體未來係被追蹤一至三年以評估 200423958 月頭異動的生化標記、骨礦物密度的變化以及脆弱性骨折之發生預期的是骨形成作用之生化標記將增加。該等抗體係被投予以作為唯一的活性化合物或與另一或合物或組成物一起投予。當被投予以作為唯一的活性化 5 口物或與另一或合物或組成物一起投予之時，該劑量係較佳地介於約1 pg/kg及20 mg/kg之間，依照該症狀之嚴重度以及疾病的進知。该適當的有效劑量係由一治療的臨床醫師來選自於以下範圍：i pg/kg及20 mg/kg、i吨/kg及 mg/kg > 1 mg/kg ^ l〇 1 mg/kg > 10 μ§^§ 10 及 _ Hg/kg、10(^g/kg及 1 mg/kg，以及 500 叫⑽及i mg/kg。例示的治療療程及結果係摘要於第6表中。第6表：臨床案例的實例病患編號治療前的狀態治療療程結果病患1 無臨床症狀，停經後及/或 60歲以上 0.01-1 mg/kg 每兩週地共 4-24 週維持及/或肌肉/骨質之增加病患2 輕微的臨床症狀，肌肉消痩及/或骨頭流失 0.01-20 mg/kg 每週地共4或更多週維持及/或肌肉/骨質之增加病患3 骨質疏鬆症晚期 0.01-20 mg/kg 每週兩次共6 或更多週臨床症狀之改善，維持及/或肌肉/骨質之增加病患4 嚴重的肌肉及骨頭流失 0.01-20 mg/kg 每天地共6或更多週臨床症狀之改善，症狀嚴重度之減輕及/ 或肌肉/骨質之增加 62 200423958 實例16 ··代謝性疾患之治療 GDF-8之抑制劑，諸如抑制性抗體，係有用於代謝性疾患之治療，諸如··第二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群（如，X症候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不 5平衡）引起的胰島素抗性，以及脂肪組織疾患（諸如，肥胖）。本發明之抗GDF-8抗體係被用以治療一受試者，其係發生或具有一確定的代謝性疾病。抗GDF-8抗體對代謝性疾病，如：第二型糖尿病及/或肥胖，治療之功效係使用建立好的鼠類肥胖、胰島素抗性 10及第一型糖尿病模式包括：〇b/ob、db/db以及帶有致死黃色犬變的品系，來確認。胰島素抗性也可藉由高脂或高卡路里飼養某些品系小鼠來引發，包括C57BL/6J。相似於人類，這些嚷齒類發展騰島素抗性、高胰島素血症、血脂異常以及葡萄糖恆定衰敗導致高血糖。結果之評估係基於血清的 15葡萄糖、胰島素及脂質測量。改善的胰島素敏感性之測量可藉由胰島素耐受性測試及葡萄糖耐受性測試來測定。更敏感的技術可包括血糖正常的胰島素注入之使用來評估血糖控制及胰島素敏感性之改善。此外，該技術將允許對主要的葡萄糖儲存組織（肌肉、脂肪及肝臟）之角色作一定 20 篁評估’於改善的血糖控制中。在一研究中，以一抗GDF-8抗體（諸如My〇29，IP注射）或載劑之治療係被進行一至六個月。該治療流程可變化，依不同的劑量之測試或治療療程（諸如：每天、每週或每兩週地注射）。預期的是相較於接受安慰劑之小鼠，該以抗 63 200423958 GDF-8抗體治療之小鼠將有更高的葡萄糖攝取、增加的糖解作用及肝糖合成、較低的游離脂肪酸及三酸甘油脂於血清中。抗GDF-8之抑制性抗體也被用以防止及/或減少該疾病 5的嚴重度及/或症狀。預期的是該抗GDF-8抗體將被以頻繁地（如每天一次）或不頻繁地（如每月一次）之皮下注射方式投予。治療持續期可介於一個月及幾年之間。為了測試抗GDF_ 8抗體於人類之臨床功效，處於第2型糖尿病獲此危險者係經辨認且被隨機分組至一治療組別。 10治療組別包括一安慰劑組以及一至三個接受抗體（不同劑量）之組別。個體未來係被追縱一至三年以評估葡萄糖代謝的變化。預期的是接受治療的個體將展現改善。該等抗體係被投予以作為唯一的活性化合物或與另一或合物或組成物一起投予。當被投予以作為唯一的活性化 15合物或與另一或合物或組成物一起投予之時，該劑量係較佳地介於約1 pg/kg及20 mg/kg之間，依照該症狀之嚴重度以及疾病的進程。該適當的有效劑量係由一治療的臨床醫師來選自於以下範圍·· i料/kg及2〇 mg/kg、i阳/4及1〇 mg/kg、1 pg/kg&1 mg/kg、1〇 μ§/]^及 i 、i〇 ^/kg 20 及 100 Kg/kg、lOOgg/kg 及 1 mg/kg，以及 5〇〇叩/“及 i mg/kg。例示的治療療程及結果係摘要於第7中。 64 200423958 第7表：臨床案例的實例病患編號治療前的狀態治療療程結果病患1 無臨床症狀、第二型糖尿病家族史 0.01-1 mg/kg 每4週地共48 週第二型糖尿病之防止病患2 輕微的X症候群臨床症狀 0.01-20 mg/kg 每週地共4或更多週改善的騰島素耐受性以及葡萄糖代謝，以及較低的血壓病患3 第二型糖尿病晚期 0.01-20 mg/kg 每週兩次共6 或更多週臨床症狀之改善，症狀嚴重度之減輕及/ 或肌肉/體脂肪比例之增加病患4 嚴重的胰島素抗性及/肥胖 0.01-20 mg/kg 每天地共6或更多週臨床症狀之改善，症狀嚴重度之減輕及/ 或體脂肪之減少

在載述於本說明書中的參考資料之整體教示下，本說明書係最完全地被了解，全部的參考資料之整體因此被納 5 入參考。本說明書中的具體例係提供本發明的具體例之例示且不能被用以限制本發明的範疇。熟習本項技藝者認知到許多其他具體例係被包含於本請求的發明中以及所企求的係本說明書及實例係被視為僅是例適性的，本發明的真正範圍及精神係被指出於隨後的申請專利範圍中。 10 【圖式簡單說明】第1圖呈現生物素標記的（biotinylated) GDF-8及 BMP-11結合至ActRIIB受器而有一 ED50為15 ng/ml及40 ng/ml，個別地。 65 200423958 第2圖呈現本發明的scFv片段對GDF-8結合至ActRIIB 受器之抑制作用。如圖示，該等Myo29、Myo28及Myo22的 scFv之IC5〇係2·4 nM、1.7 nM及60 nM，個別地。第3A及3B圖呈現Myo29與10 ng/ml生物素標記的 5 GDF-8或 BMP-11 之預培育（preincubation)在 ActRIIB結合檢定中抑制了 GDF-8或BMP-11結合至ActRIIB，其IC50係 0.2-0.4 nM 〇

第4A圖展現基準狀況，即，GDF_8、BMP-11以及促進素（activin)對報導基因活性之誘導作用。 10 第4B及4C圖呈現Myo29以一劑量反應性 (dose-responsive)方式減低GDF-8活性，有一IC5〇係 15-30 ng/ml，且抑制BMP-11的生物活性至相同程度。第4D圖例示Myo29不影響促進素的活性於此檢定中。

第5圖呈現Myo22、Myo28及Myo29之抗原決定基定位 15 (epitope mapping)結果。該Myo29的抗原決定基係經定位介於成熟GDF-82的胺基酸72及88之間；Myo22是介於胺基酸1 及44之間；Myo28則是介於胺基酸1及98之間。第6圖展現My〇29抗原決定基之取代分析（substitution analysis)的結果。成熟 GDF-8 中的殘基（residue)Lys-78、 20 Pro-81以及Asn-83對於Myo29結合至GDF-8係重要的。第7圖描述以Myo29及Myo28進行一免疫沉澱作用實驗之結果。來自表現有GDF-8之CHO細胞的條件化培養基 (conditioned medium)，該GDF-8係經35S·甲硫酸胺/半胱胺酸標記，該條件化培養基係被用於與Myo29或Myo28之免疫 66 200423958 沉澱作用。該免疫沉澱作用接著藉由SDS_PAGE於還原條件下被分析。於膠體上之帶區（band)係經辨認為成熟的 GDF-8、GDF-8原胜肽以及未力口工的GDF-8。第8圖描述一藥物動力學研究之結果，其中 5 C57B6/SCID小鼠接受一 1 mg/kg劑量之以單次靜脈内（IV) 或腹腔内（IP)投予之Myo29。Myo29呈現約一星期長之延長的終半衰期以及低廓清率約1 ml/hr/kg。在IP注射後之經吸收的部分係約77%。

第9圖呈現每星期經多種Myo29劑量（60、10及1 10 mg/kg)，或載體（PBS)，處理之雄性C57B6/SCID小鼠的四頭肌質量之比較。以10及60 mg/kg劑量位準之Myo29處理四星期，導致統計上有意義的肌肉質量增加為19%及23%，個別地。第10A及10B圖呈現每星期經多種Myo29劑量（10、5、 15 2.5及1 mg/kg)或PBS處理四星期之雌性CB17 SCID小鼠的

腓腸肌、四頭肌質量。相較於載體對照組，以Myo29處理之小鼠的肌肉質量係增加10至20%。第11A及11B圖展現每星期經多種Myo29劑量（10、5、 2.5及1 mg/kg)或PBS處理十二星期之雌性CB17 SCID小鼠 20 的腓腸肌、四頭肌質量。以Myo29處理之小鼠的肌肉質量係增加12至28%範圍。第12圖呈現每星期經Myo29 (10及5 mg/kg)或PBS處理十二星期之雌性CB17 SCID小鼠的前肢肌肉強度，藉由一抓握強度計測量。以5及10 mg/kg的Myo29處理之小鼠的前 67 200423958 肢強度係增加17%及23%，個別地。【圖式之主要元件代表符號表】 (無）序列表 <110〉Wyeth

Cambridge Antibody Technology <120>抗GDF-8之中和抗體及其用途 <130> 8702.020-304 <160〉 54

< 170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 786 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 1

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtga gagaatgggg 300 ccctgtactg gtggaagctg ctacgacacc cttggcaact ggggccgggg caccctggtc 360 accgtctcga gtggaggcgg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggaagtgca 420 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 480 68 200423958 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 540 cttccaggcg cggcccccaa actcctcatc aggggtaatg gcaatcggcc ctcaggggtc 600 cctgaccgat tctctgtctc caagtctggc tactcagcct ccctggccat cactgggctg 660 cagcctgccg atgagggtgt ttattactgc cagtcctatg acagcagtct gagtggttcg 720 aaggtgttcg gccaagggac caagctgacc gtcctaggtg cggccgcaca tcatcatcac 780 catcac 786

<210> 2 <211> 262 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 2

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Glu Arg Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly 100 105 110

Asn Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu 130 135 140

Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie 145 150 155 160 69 200423958

Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 165 170 175

Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu lie Arg Gly 180 185 190

Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Val Ser Lys 195 200 205

Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Pro Ala Asp 210 215 220

Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser 225 230 235 240

Lys Val Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala 245 250 255

His His His His His His 260

<210> 3 <211> 372 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 3

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtga gagaatgggg 300 ccctgtactg gtggaagctg ctacgacacc cttggcaact ggggccgggg caccctggtc 360 accgtctcga gt 372 <210〉 4 70 200423958 <211> 124

<212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 4

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Glu Arg Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly 100 105 110

Asn Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210〉 5 <211> 336 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉5 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 120 cttccaggcg cggcccccaa actcctcatc aggggtaatg gcaatcggcc ctcaggggtc 180 71 200423958 cctgaccgat tctctgtctc caagtctggc tactcagcct ccctggccat cactgggctg 240 cagcctgccg atgagggtgt ttattactgc cagtcctatg acagcagtct gagtggttcg 300 aaggtgttcg gccaagggac caagctgacc gtccta 336

<210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens)

<400〉6

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Arg Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Val Ser Lys Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Pro Ala Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Ser Lys Val Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

<210> 7 <211> 774 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 7 72 200423958 caggtcacct tgaaggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acagtctgtg 420 ctgacgcagc cgccctcagt gtctggggcc ccagggcaga gggtcaccat ctcctgcact 480

gggagcagct ccaacatcgg ggacggttat gatgtacact ggtatcagca gcttccagga 540 acagccccca aactcctcat ctatggtaac agtcatcggc cctcaggggt ccctgaccga 600 ttctctggct ecaagtctga cacctctgcc tccctggcca tcactgggct ceaggttgag 660 gatgaggctg attatttctg ccactcctat gacggcagtg tgagtggctg gattttcggc 720 ggagggacca agctgaccgt cctaggtgcg gccgcacatc atcatcacca tcac 774

<210> 8 <211> 258 <212〉PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 8

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 73 200423958

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro 130 135 140

Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie Ser Cys Thr 145 150 155 160

Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin 165 170 175

Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Asn Ser His 180 185 190

Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr 195 200 205

Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Val Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220

Tyr Phe Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser Val Ser Gly Trp lie Phe Gly 225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His 245 250 255

His His <210〉 9 <211> 363

<212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 caggtcacct tgaaggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc

74 200423958 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363

<210〉 10 <211> 121 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 10

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 75 200423958

<210> 11 <211> 336 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 11 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gacggttatg atgtacactg gtatcagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gtcatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctgac acctctgcct ccctggccat cactgggctc 240 caggttgagg atgaggctga ttatttctgc cactcctatg acggcagtgt gagtggctgg 300 attttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336

<210> 12 <211> 111 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 12

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 76 200423958

Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser 85 90 95

Val Ser Gly Trp lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

<210> 13 <211> 747 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 13

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag tggaggcggc 360 ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggaagtgcac tttcctatga gctgactcag 420 ccaccctcag tgtccgtgtc tccaggacag acagccacca ttacctgctc tggacatgca 480 ctgggggaca aatttgtttc ctggtatcag cagggatcag gccagtcccc tgtattggtc 540 atctatgacg atacccagcg gccctcaggg atccctgggc gattctctgg ctccaactct 600 gggaacacag ccactctgac catcagcggg acccaggcta tggatgaggc tgactatttt 660 tgtcaggcgt gggacagcag cttcgtattc ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctaggt 720 gcggccgcac atcatcatca ccatcac 747 <210> 14 77 200423958

<211> 249 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 14

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Tip Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 130 135 140 Φ

Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gin Gin Gly Ser Gly Gin Ser 165 170 175

Pro Val Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205 -

Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp 210 215 220 78 200423958

Asp Ser Ser Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245 <210> 15

<211> 351 <212〉DNA <213〉現代人（Homo sapiens)

<400〉 15 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351

<210> 16 <211> 117 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 16

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 79 200423958

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 17 <211> 315 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 17

tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccaccatt 60 acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gggatcaggc 120 cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgggcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actatttttg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300 aaggtcaccg tecta 315 <210〉 18 <211> 105

<212〉 PRT 80 200423958 <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 18

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Gly Ser Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Asp Ser Ser Phe Val Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105

<210〉 19 <211> 774 <212> DNA

<213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 19 gaggtccagt tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acagtctgtg 420 81 200423958 ctgacgcagc cgccctcagt gtctggggcc ccagggcaga gggtcaccat ctcctgcact 480 gggagcagct ccaacatcgg ggacggttat gatgtacact ggtatcagca gcttccagga 540 acagccccca aactcctcat ctatggtaac agtcatcggc cctcaggggt ccctgaccga 600 ttctctggct ccaagtctgg tacctctgcc tccctggcca tcactgggct ccaggctgag 660 gatgaggctg attattactg ccactcctat gacggcagtg tgagtggctg gattttcggc 720 ggagggacca agctgaccgt cctaggtgcg gccgcacatc atcatcacca tcac 774

<210> 20 <211> 258 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 20

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro 130 135 140 82 200423958

Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie Ser Cys Thr 145 150 155 160

Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin 165 170 175

Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Asn Ser His 180 185 190

Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr 195 200 205

Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220

Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser Val Ser Gly Trp lie Phe Gly 225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His 245 250 255

His His

<210> 21 <211> 363 <212〉DN A <213〉現代人（Homo sapiens)

<400> 21 gaggtccagt tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 83 200423958

<210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 22

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 23 <211> 333 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 23 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gacggttatg atgtacactg gtatcagcag 120 84 200423958

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gtcatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggt acctctgcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cactcctatg acggcagtgt gagtggctgg 300 attttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc eta 333 <210> 24 <211> 111 <212> PRT

<213〉現代人（Homo sapiens) <400> 24

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser 85 90 95

Val Ser Gly Trp lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210〉 25 <211> 747 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) 85 200423958 <400> 25 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag tggaggcggc 360 ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggaagtgcac tttcctatga gctgactcag 420 ccaccctcag tgtccgtgtc tccaggacag acagccagca ttacctgctc tggacatgca 480 ctgggggaca aatttgtttc ctggtatcag cagaagccag gccagtcccc tgtattggtc 540 atctatgacg atacccagcg gccctcaggg atccctgagc gattctctgg ctccaactct 600 gggaacacag ccactctgac catcagcggg acccaggcta tggatgaggc tgactattac 660 tgtcaggcgt gggacagcag cttcgtattc ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctaggt 720 747 gcggccgcac atcaccatca ccatcac

<210> 26 <211> 249 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 26

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 86 200423958 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 130 135 140

Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 165 170 175

Pro Val Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205

Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp 210 215 220

Asp Ser Ser Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245 <210> 27 <211> 351 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 27

87 200423958 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351

<210> 28 <211> 117 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 28

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 88 200423958

<210〉 29 <211> 315 <212〉DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 29

tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccagcatt 60 acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300 aaggtcaccg tecta 315

<210> 30 <211> 105 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 30

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val 20 25 30

Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 89 200423958

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp Asp Ser Ser Phe Val Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105

<210> 31 <211> 5 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 31

Ser Tyr Tyr Met His 1 5

<210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 32 lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15

Gly

<210> 33 <211> 8 <212> PRT

90 200423958 <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 33

Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro 1 5

<210> 34 <211> 11 <212> PRT

<213〉現代人（Homo sapiens) <400> 34

Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser 1 5 10

<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens)

<400〉 35

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser 1 5

<210> 36 <211〉 7 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 36 91 200423958

Gin Ala Trp Asp Ser Ser Phe 1 5

<210> 37 <211> 5 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 37

Arg Tyr Val lie Asn 1 5

<210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 38

Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Arg 15 10 15

Gly

<210〉 39 <211> 12 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 39

Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 92 200423958 <210〉 40 <211> 14

<212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 40

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His 1 5 10

<210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 41

Gly Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5

<210> 42 <211〉 6 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 42

His Ser Tyr Asp Gly Ser 1 5 <210〉 43 93 200423958

<211> 5 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 43

Ser Tyr Ala Met Ser 1 5

<210> 44 <211> 17 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 44

Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210〉 45 <211> 15 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 45

Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 46 94 200423958

<211> 14 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 46

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10

<210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 47

Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser 1 5

<210〉 48 <211> 12 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 48

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Lys Val 1 5 10

<210> 49 <211> 109 <212> PRT 95 200423958 <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 49

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie 20 25 30 lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45

Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly 85 90 95

Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 50 <211> 320

<212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 50 gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60 ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120 cctggaaggc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180 aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240 cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300 cccctacaga atgttcatag 320 96 200423958

<210〉 51 <211> 106 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 51

Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15

Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp 20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn 50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys 65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

<210〉 52 <211> 992 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 52 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 97 200423958 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720 · tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 992 <210> 53 ·

<211> 330 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 53

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys ， 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 98 200423958 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

99 200423958 320 305 310 315

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210〉 54 <211> 6 <212> PRT <213> 任何 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (2)..(3) <223>任何胺基酸 <220> <221> MISC—FEATURE <222> (5)..(5) <223> 任何胺基酸 <400> 54 Lys Xaa Xaa Pro Xaa Asn 1 5

100

Claims

200423958 拾、申請專利範圍： 1 · 一種經單離的抗體，其包含一實質地如載述於序列辨認編號：η之胺基酸序列，其中η係2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47或48 ;以及其中該抗體係能特異地結合GDF-8或 BMP-11。

2·如申請專利範圍第丨項之抗體，其包含該序列辨認編號：η之胺基酸序列，其中η係2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、22、24、26、28、30、3卜 32、33、 34 、 35 、 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 、 42 、 43 、 44 、 45 、 46 、 47或48 ° 3·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係一 scFv# 段，該scFv片段係由ATCC寄存編號PTA-474卜PTA-4740 以及PTA-4739之五·⑶"表現者。

4·如申請專利範圍第丨項之抗體，其中該抗體係能特異地結合至一蛋白質，該蛋白質包含如載述於序列辨認編號：54之胺基酸序列。 5_如申請專利範圍第4項之抗體，其中至少（a)該序列辨認編號：54之自N-末端起的第二個胺基酸係甲硫胺酸， (b)自N-末端起的第三個胺基酸係絲胺酸，或（c)自末端起的第五個胺基酸係異白胺酸，各自獨立的。 6·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係人類的。 7 •如申請專利範圍第i項之抗體，其中該抗體係IgGi或 101 200423958 IgG4。 8·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體的胺基酸序列係經修飾以減低或改變作用體（effector)功能。 9·如申請專利範圍第8項之抗體，其中該胺基酸序列係經修飾在對應於序列辨認號·· 53之胺基酸117或胺基酸120 處的殘基。 1〇.如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係IgGu* IgGlK。 11· 一種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1項之抗體。 12·種治療方法，其包含投予一有效劑量之如申請專利範圍第11項之樂學組成物。 13_如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止一疾患選自於：肌肉疾患、神經肌肉疾患及骨退化疾患。 14·如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被才又予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止一疾患選自於·肌肉營養不良、Duchenne’s肌肉營養不良、肌肉萎縮、器官萎縮、腕隧道症候群、遺傳性阻塞性肺部疾病、少肌症、惡病質、肌肉消痩症候群以及肌萎縮性脊髓側索硬化症。 15.如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止 Duchenne’s肌肉營養不良。 102 200423958 16= t iMm其中該藥學組成物係被投予至-哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止1患選自於：肥胖及脂肪組織疾患。 7.如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止—疾患選自於：X症候群、缺失的葡萄糖耐受性、創傷引起㈣島素抗性以及第2型糖尿病。 18·”請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被才又予至哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止一疾患選自於：骨關節炎及骨質疏鬆症。 19.如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止第2型糖尿病。 15 2〇·如申請專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要治療或防止肥胖。 21 ·如申睛專利範圍第12項之方法，其中該藥學組成物係被投予至一哺乳類，該哺乳類係需要修復受損的肌肉。 22·如申請專利範圍第21項之方法，其中該受損的肌肉係心肌。 20 23·如申請專利範圍第21項之方法，其中該受損的肌肉係橫月鬲。 24·如申請專利範圍第12項之方法，其中該抗體係被以一有效劑量投予，該有效劑量係選自於：1 pg/kg至20 mg/kg、1 gg/kg 至 10 mg/kg、1 pg/kg 至 1 mg/kg、10 gg/kg 103 200423958 至 1 mg/kg、10 pg/kg至 100 pg/kg、l〇〇pg/kg至 1 mg/kg，以及 500 pg/kg至 1 mg/kg。 25. —種經單離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1項之抗體。 5 26. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第25項之核酸。 27· —種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第26項之載體。 28·如申請專利範圍第27項之宿主細胞，其中該宿主細胞係 ATCC 寄存編號PTA_4741、PTA-4740 以及PTA-4739之五. coli ° 10 29·如申請專利範圍第25項之核酸，其中該核酸包含一序列辨認編號：η之核苷酸序列，其中η係1、3、5、7、9、 11 、 13 、 15 、 17 、 19 、 21 、 23 、 25 、 27或29 。 3〇· —種製備一特異地與GDF_8反應之抗體的方法，該方法包含： 15 (a)提供一編碼一可變部位之核酸序列的起始匯集’該核酸匯集係包括一欲被取代之CDR3或缺乏一 CDR3編碼區域； (b)令該匯集與一供體核酸組合，該供體核酸編碼一實質地如載述於序列辨認編號：η之胺基酸序列，其中 20 η係一從31至48之整數，使得該供體核酸係經插入該匯集之CDR3區域於是提供一編碼一可變部位之核酸序列的產物匯集； (e)表現該產物匯集之核酸； (d)選擇一對於gdf_8特異之特異的抗原-結合片 104 200423958 段；以及 ⑷回收該特異的抗原·結合片段或編碼該結合片段之核酸。 31· —種抗體，其係由如申請專利範圍第3〇項之方法所製 5 造。 32· —種辨認GDF-8的抑制劑之方法，其包含： ⑷製備-第-結合混合物，其包含如巾請專利範圍第1項之抗體以及GDF-8 ; (b) 測量該第一結合混合物中該抗體與（}〇1?_8之間 10 的結合量； (c) 製備一第二結合混合物，其包含該抗體、 GDF-8、一湏試化合物；以及 (d) 測量該第二結合混合物中該抗體與GDF_8之間的結合量。 15 33· 一種增加肌肉強度或質量的方法，該方法包含投予一治療有效量的如申請專利範圍第丨項之抗體至一哺乳類，猎此使肌肉強度或質量增加。 34. —種增加小樑骨密度的方法，該方法包含投予一治療有效量的如申請專利範圍第1項之抗體至一哺乳類，藉此 20 使小樑骨密度增加。 35. —種經單離之抗GDF-8抗體，其中該抗體係能抑制 GDF-8結合至 ActRIIB。 36·如申請專利範圍第35項之抗體，其包含一實質地如載述於序列辨認編號：η之胺基酸序列，其中η係2、4、6、 105 200423958 8 、 10 、 12 、 14 、 16 、 18 、 20 、 22 、 24 、 26 、 28 、 30 、 31 、 32 、 33 、 34 、 35 、 36 、 37 、 38 、 39 、 40 、 41 、 42 、 43 、 44 、 45 、 46 、 47或48 ° 37·如申請專利範圍第35項之抗體，其包含一如載述序列辨 5 認編號：η之胺基酸序列，其中n係2、4、6、8、1 〇、 12 、 14 、 16 、 18 、 20 、 22 、 24 、 26 、 28 、 30 、 31 、 32 、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45 、 46 、 47或48 ° 38· —種增加肌肉強度的方法，該方法包含投予一治療有效 1〇量的如申請專利範圍第％項之抗體至一哺乳類，藉此使肌肉強度增加。 39· —種增加小樑骨密度的方法，該方法包含投予一治療有效量的如申請專利範圍第35項之抗體至一哺乳類，藉此使小樑骨密度增加。 15 40.如申請專利範圍第35項之抗體，其中該抗體係能特異地結合 ΒΜΡ-11。 41· 一種製造一抗體之法，其包含培養ATCC寄存編號 PTA-474卜PTA-4740以及PTA-4739之五.co//·以及回收該抗體。 20 42·如申請專利範圍第41項之方法，其進一步包含使該編碼 My〇29、Myo28或Myo22之scFv與編碼一免疫球蛋白的 Fc區位之核酸融合以及將該經融合的核酸表現於一細胞中。 43 ·如申請專利範圍第41項之方法，其包含生殖細胞化。 106 200423958 44. 一種抗體，其係使用如申請專利範圍第4丨項之方法來製造者。 45_ —種能特異地結合至一抗原決定基之抗體，該抗原決定基的特徵在於其胺基酸序列係如載述序列辨認編號：54 5 者。 46. —種如申請專利範圍第、31、％、％、37、4〇、44 及45項的抗體之用途，其係用於一醫藥之製備，該醫藥係用以治療或防止哺乳類中至少一肌肉、骨頭或葡萄糖恆定之疾患。 · 47·如申研專利範圍第46項之用途，其中該哺乳類係人類。 48.如申請專利範圍第仏項之用途，其中該疾患係一神經肌肉疾患。 49·如申請專利範圍第46項之用途，其中該疾患係肌肉營養不良、Duchenne，s肌肉營養不良、肌肉萎縮、器官萎 15 冑、韻道症候群、遺傳性阻塞性肺部疾病、少肌症、惡病質、肌肉消痩症候群或肌萎縮性脊髓側索硬化症。如申明專利範圍第46項之用途，其中該疾患係肥胖或脂鲁肪組織疾患 2〇如申5月專利範圍第46項之用途，其中該疾患係X症候群缺失的葡萄糖财受性、創傷引起的胰島素抗性或第 2型糖尿病。申明專利範圍第46項之用途，其中該疾患係骨關節炎 · 或骨質疏鬆症。 53. 一種如中請專利範圍第、31、35、36、37、40、44 107 200423958 及45項的抗體之用途，其係用於一用於以下至少一者之醫藥的製備：於一哺乳類中之（a)肌肉受損之修復，（b) 增加肌肉質量或強度，（c)增加小樑骨密度，以及（d)增加葡萄糖财受性。 5 54.如申請專利範圍第53項之用途，其中該受損的肌肉係心肌或橫脑。 55.如申請專利範圍第46至53項中任一項之用途，其中該抗體係被以一有效劑量投予，該有效劑量係選自於：1 pg/kg 至 20 mg/kg、 1 |Lig/kg 至 10 mg/kg、 1 jug/kg 至 1 10 mg/kg、10 pg/kg 至 1 mg/kg、10 pg/kg 至 100 pg/kg、 100pg/kg至 1 mg/kg，以及 500 pg/kg至 1 mg/kg o