TW201029666A - Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor - Google Patents

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201029666 六、發明說明：

t ^ fifr Λ J 本申請案主張美國臨時申請案第60/419,964號之優先權， 其申請曰為2002年10月22日，其整體係被納入於此作為參考資 5 料。 發明領域 本技術領域關於抗生長與分化因子-8(GDF-8)之抗體，特定 地人類抗體’以及抗體片段，特別是於活體外及/或活體内抑制 e GDF-8活性者。本領域進一步關於肌肉或骨頭的退化性疾患， 10 或胰島素代謝疾患之診斷、預防或治療。 【先前技術2 發明背景 生長與分化因子-8 (GDF-8)，亦稱為肌肉生長抑制素 (myostatin)，係一分泌性蛋白質以及轉化生長因子_β (TGF-β) 15 超科(superfamily)的一員’ TGF-β超科係結構上相關的生長因 子，其等存有生理上重要的生長調節及形態演發(morphogenetic) φ 性質（Kingsley et al. (1994) Gene Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol·，228: 235-272)。相似 於TGF-β ’人類GDF-8係被形成為一375個胺基酸長的前驅蛋白 20 質。該前駆GDF-8蛋白質形成一同型二聚體(homodimer)。在加 工期間，該胺基末端原胜肽(propeptide)係於Arg-266處被切斷。 該經裁切的原胜肤’稱為”潛伏關連的胜肽（latency-associated peptide)”(LAP)，可維持非共價地結合至該同型二聚體，藉此去 活化該複合艘（Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem.，263: 3 201029666 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 7646-7654; Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43;及 Thies et al. (2001) Growth Factors, 18: 251-259)。該成熟的 GDF-8與原胜肽之複合體係普遍地稱為”小潛伏複合體（small 5 latent complex)” (Gentry et al. (1990) Biochemistry, 29: 6851-6857; Derynck et al· (1995) Nature, 316: 701-705;及 Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol·, 12: 597-641)。其他蛋白質 也已知會結合至成熟的GDF-8且抑制其生物活性。此類抑制性 蛋白質包括濾泡抑制素(follistatin)以及濾泡抑制素相關的蛋白 10 質（Gamer et al_ (1999) Dev. Biol” 208: 222-232)。 來自不同物種的經演繹胺基酸序列之列校(alignment)展示 GDF-8在演化過程係高度守怪的（conser.ved)(McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A·，94: 12457-12461)。事實上， 該等人類、小鼠、大鼠、豬以及雞的GDF-8於C端區域係100% 15 相同，而於狒狒、牛以及羊隻之間只有3個胺基酸不同。斑馬 魚的GDF-8係最趨異的；然而，其仍有88%相同於人類。 該高度守恆性暗示GDF-8具有一必要的功能。GDF-8係高 度表現於發育以及成人骨骼肌中且被發現涉及肌肉及成骨作 用中關鍵的生物過程之調節。例如，GDF-8剔除(knockout)的基 20 因轉殖小鼠係有一顯著的骨路肌肥大及增生之特徵(McPherron et al. (1997) Nature，387: 83-90)以及改變的骨頭皮層結構 (Hamrick et al. (2000) Bone, 27 (3): 343-349) 〇 相似的骨路肌量 之增加也明顯於自然發生GDF-8突變的牛中。（Ashmore et al. (1974) Growth, 38: 501-507; Swatland et al. (1994) J. Anim. Sci., 201029666 5 38: 752-757; McPherron et al. (1997) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94: 12457-12461;及Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7·· 910-915)。研究以指出與HIV感染關連的肌肉消痩係伴隨著 GDF-8表現之增加（Gonzalez-Cadavidetal.(1998)Proc.Nat· Acad. Sci. U.S.A” 95: 14938-14943)。GDF-8也牽涉於肌肉特異 的酵素之製造（如，肌酸激酶）以及肌母細胞(myoblast)之增生 (WO 00/43781)。除了其生長調節及形態演發性質，GDF-8也被 認為涉及許多其他生理過程，包括第二型糖尿病發展過程的葡 Ο 萄糖恆定、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群（如，X症候 10 群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起的胰島素抗性，以 及脂肪組織疾患（如，肥胖）（Kim et al· (2000) BBRC, 281: 902-906)。 15 許多人類及動物疾患係與肌肉組織的功能性缺失關連， 如，肌肉營養不良（包括Duchenne，s肌肉營養不良）、肌萎縮 性脊髓側索硬化症(ALS)、肌肉萎縮、器官萎縮、虛弱、遺傳 性阻塞性肺部疾病、少雜(sajXQpenia)、惡病質（_刪以及 ❹ 由其他疾病及狀況引起的肌肉消瘦症候群。目前，很少有可靠 的或有效的療法被發展來治療這些疾患。 20 也有許多與月質流失的狀況，包括骨質疏鬆症以及骨關節 炎，特別地在老人及停經後婦女。此外，代謝性骨頭疾病以及 疾患包括源自慢騎皮f素療法之低骨f、早雜腺衰竭、雄 性素抑制Μ、維生素D缺乏、次發性副甲狀腺機能歧、營 養缺乏以及厭食症。目討麟之祕這絲_療法藉由抑 制骨質再《來進行。—魏騎„形奴療㈣是這些療 5 201029666 法之一所欲的替代。 因此，存在一需求於發展新療法來促成肌肉質量整體及/ 或強度及/或骨密度之增加，特別地，在人類中。 【發明内容3 5 發明概要 本發明的一目標係提供安全及有效的用於肌肉及/或骨頭 關連疾患之治療方法。 本發明的另一目標係提供增加脊椎動物的肌肉質量及/或 骨強度及/或密度之方法。 10 本發明的另一目標係提供GDF-8的抑制劑，其在活體内係 安全且有效的。 本發明的另一目標係提供以高特異性及親和力結合至 GDF-8之人類抗體及其片段。 因此，用以治療肌肉及骨退化性疾患之方法係被提供。該 15 方法係有用於在正常動物中增加肌肉質量及骨密度。也提供新 穎之人類抗GDF-8抗體，名為Myo29、Myo28及Myo22，以及衍 生自其等之抗體及抗原結合片段。本發明之抗體擁有許多有用 的性質。首先，該等抗體係能以高親和力結合至成熟的GDF-8。 第二，該等經揭露的抗體在活體外及活體内抑制gDF_8活性係 20被展示，例如’藉由ActRIIB結合以及報導基因（reporter gene) 檢定。第三，該等經揭露的抗體可抑制之GDF_8活性，該GDF 8 活性與骨路肌肉質量及骨密度的負向調控關聯。 本發明的某些具體例包含Myo29、Myo28或Myo22的Fv片 段之VH及/或VL部位(domain)。進一步的具體例包含任何這些Vh 201029666 及VL部位之一或更多互補決定區域（CDRs)。其他具體例包含 Myo29、Myo28或Myo22的 VH部位之一H3片段。

其他態樣提供含有本發明抗體或其等抗原結合片段之組 成物，以及其等於抑制或中和GDF-8方法之使用，包括人類或 5 動物的治療方法。本發明的抗體可被用以治療或預防欲求肌肉 組織或骨密度之增加的狀況。舉例言之，目前揭示的抗體可被 用於修復受損的肌肉（如，心肌、橫膈等）之療法。例示的疾 病及疾患包括肌肉及神經肌肉疾患諸如：肌肉營養不良 (Duchenne’s肌肉營養不良）、肌萎縮性脊趙侧索硬化症、肌 10 肉萎縮、器官萎縮、虛弱、腕隧道症候群(tunnel syndrome)、遺 傳性阻塞性肺部疾病、少肌症（sarcopenia)、惡病質（cachexia) 以及由其他疾病及狀況引起的肌肉消痩症候群、脂肪組織疾患 (如，肥胖）、第二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性 症候群（如，X症候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起 15 的胰島素抗性以及骨退化疾病（如，骨關節炎及骨質疏鬆症）。 此外，目前揭示的抗體可被用作為一診斷工具來定量地或 定性地偵測在一生物性樣品中的GDF-8或其片段。該偵測到的 GDF-8之存在或量可能與一或更多前述醫學狀況相互關連》 另一態樣提供一經單離的核酸，其包含一序列編碼 20 Myo29、Myo28或Myo22的Fv片段之一 VH或VL部位。一經單離 的核酸，其包含一序列編碼至少一源自任何目前所揭露之VH或 VL部位的CDR，係被揭露。另一態樣提供包含此核酸之宿主細 胞。 另一態樣提供一方法以製造新vH及vL部位及/或功能性抗 7 201029666 體，其等包含衍生自Myo29、My〇28或Myo22的vH或VL部位之 部位的全部或部分。 本發明的其他目標將被置於說明書之隨後部分，以及某部 分將從本說明書變的明顯，或可從本發明之實施而習得。本發 5明的各種目標、態樣及優點將藉由隨附的申請專利範圍所特定 指出之要件及其組合而被認知及獲致。 被了解的是前述一般描述及隨後的詳細描述係僅是本發 明的例示和解釋，且不是限制，如所聲明者。 t實施方式]J 10 I.定義 於此使用之“抗體，，用語，指一免疫球蛋白或其之一部分， 以及包括任何包含一抗原-結合部位之胜肽，不管該胜肽之來 源、起源之物種、製造之方法及特性。作為一非限制的實例， 該“抗體”用語包括人類、猩猩、小鼠、大鼠、山羊、綿羊以及 15 難抗體。該用語包括但不限於多株、單株、單一特異性、多特 異性、非特異性、擬人化、單鍵、嵌合的（chimeric)、合成的、 重組的、雜交的、突變的以及CDR-移接的（CDR-grafted)抗體。 用於本發明之目的，其亦包括，除非有其他載述，抗體片段諸 如：Fab、F(ab’)2、Fv ' scFv、Fd、dAb以及其他抗體片段，其 20 等保有該抗體结合功能。 抗體可經由’例如，傳統的融合瘤技術（Kohler及

Milstein(1975)Nature，256: 495-499)，重組DNA方法(U.S.專利第 4,816,567號）’或是使用抗體庫之噬菌體呈現技術(ciackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 201029666 222: 581-597)。關於多種其他抗體製造技術，參考Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al·, Cold Spring Habor Laboratory, 1988。 該，，抗原-結合部位，，用語指一抗體分子之一部分其包含特 5異地結合或互補至部分或全部抗原之範圍。當一抗原係大的’ 一抗體可僅結合至一抗原的特定部份。該”抗原決疋基或抗原 決定區，，係一抗原分子的區位其專責於與一抗體之抗原-結合部 位之特異性交互作用。一抗原-結合部位可由一或更多抗體可變 % 部位提供（如，由一VH部位構成之所謂的Fd抗體片段）。一抗 10原-結合部位包含一抗體輕鏈可變區域(Vl)以及一抗體重鏈可 變區域(VH)。 該，，匯集（repertoire)，，用語指遺傳性多樣收集之核苷酸 (如，DNA)序列，其等衍生自整體或部分地編碼經表現的免 疫球蛋白之序列。此等序列係藉由如，H鏈的V、0及】節段 15 (segment)以及L鏈的V、D及J節段之活體内重組而產生。任擇 地，該等序列可藉由對一細胞株之活體外刺激作用且對此反應 β 發生重組而產生。任擇地’該等序列的部分或全部可藉由組合 如，未重組的V節段與D及J節段’藉由核苷酸合成、隨機突變 以及其他揭示於美國專利第5,565,332號的方法來獲得。 20 該，，特異性交互作用（specific interaction)’’或”特異地結合 (specifically binds)用語或相似者’意指兩個分子形成一複合體 其在生理狀況下係相對穩定。該用語也可應用於例如，一抗原 -結合部位係特異於一特定抗原決定基’該抗原決定基係由數個 抗原攜帶，此例中該攜帶有該抗原-結合部位之抗體將能結合至 9 201029666 多種攜帶有該抗原決定基之抗原。因此，一抗體可特異地結合 至，例言之，BMP-11以及GDF-8，只要該抗體係結合至該二者 都攜帶之抗原決定基。 特異性結合的特徵係高親和力及低至中等容力 5 (capacity)。非特異性結合通常具有低親和力與中等至高的容 力。典型地，當親和常數Ka係高於1〇6Μ-1時，或較佳的高於 ’該結合被認為是特異性的。若必要的，非特異性結合 可藉由改變結合條件被減少而不實質地影響特異性結合。此類 條件係已知於習知技藝，以及一熟習本項技藝者使用例行技術 10 可選擇適當條件。該等條件通常係由抗體濃度、溶液的離子強 度、溫度、准予結合的時間、不相關之分子（如，血清白蛋白、 奶酪蛋白）的濃度，等等來界定。例示性條件係如實例4、7及 10所載示者。 該”實質地如展示”用語意指該相關的CDR、VH或VL部位將 15 是相同或高度相似於該特異的區域，該特異的區域之序列係被 展示於此。例言之，此取代包括一CDR序列（HI、H2、H3、L1、 L2或L3)中任5個胺基酸之1或2者。 該’’TGF-β超科”用語指結構上相關的生長因子之家族。此 相關的生長因子家族係詳知於習知技藝(Kingsley et al. (1994) 20 Genes Dev., 8: 133-146; Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Microbiol· Immunol” 228: 235-72)。該TGF-β超科包括骨形態演 發蛋白質（BMP)、促進素(activin)、抑制素(inhibin)、穆勒氏抑 制物質（mullerian inhibiting substance)、膠質細胞性神經營養因 子以及數量仍在增加的生長與分化因子(GDF)，如GDF 8(肌肉 201029666 生長抑制素）。許多此類蛋白質係結構上及/或功能上相關於 GDF-8。例言之，人類BMP-11，亦稱為GDF-11，在胺基酸程度 係 90% 相似於 GDF-8(Gamer et al. (1999) Dev· Biol. 208: 222-232; Nakshima et al. (1999) Mech. Dev” 80: 185-189)。 5 該’’GDF-8”用語指一特異的生長與分化因子-8，適當時， 亦指該等結構上或功能上相關於GDF-8之因子，例如，BMP-11 以及其他屬於TGF-β超科之因子。該用語指全長未經加工的前 驅形式之GDF-8以及得自於轉譯後裂解（post-translational φ cleavage)之成熟的及原胜肽形式。該用語亦指任何GDF-8之片 10 段及變異體，其維持至少某些相關於成熟的GDF-8之生物活 性’如此所揭示，包括序列已被改變者。成熟的人類GDF-8之 胺基酸序列係被提供於序列辨認編號：49。本發明相關於來自 所有脊椎動物種之GDF-8，包括，但不限於：人類、牛、難， 小鼠、大鼠、豬、羊、火難、狒狒以及魚（關於序列資訊，參 15 見，例如McPherron et al. (1997) Pr〇c. Nat. Acad· Sci. U.S.A·，94: 12457-12461)。 ® 該”成熟的GDF-8”用語指該蛋白質係裂解自該GDF-8前軀 蛋白質的羧基末端部位者。該成熟的GDF_8可以一單體、同質 二聚趙(homodimer)存在或於— GDF-8潛伏複合體中。依據情 20況，成熟的GDF-8可與任何或所有這些不同形式者之間建立帚 衡。於其生物上活性形式，該成熟的GDF-8係亦被指為’，活性 GDF-8”。 該’’GDF-8原胜狀”用語指該多太係裂解自該gdF-8前驅黃 白質的胺基末端部位者《該GDF-8原胜肽係能結合至該成熟的 11 201029666 GDF-8上之原胜肽結合部位。 該’警·8潛伏複合判語指㈣成熟的gdf_8同質二聚 體以及該GDF_8祕肽之間所形成之蛋自質複合體。咸相信兩 個GDF-8原胜狀與兩個成熟的咖，質二聚體關連以形成一 5去活化的四聚體複合體。該潛伏複合趙可包括其他㈣抑· 以取代或外加至一或更多該等GDF_8原胜肽。 該” G购活性，，用語指與活性的gdf_8蛋白質相關連之一 或更多生理上生長調節或形態_活性。例言之活性的GDF8 係骨路肌質量的-負向調節劑。活性的祕8也可調整肌肉特 10異的酵素之製造（如’肌酸激酶）、刺激肌母細胞之增生以及 調整前脂肪細胞(preadiP〇cyte)分化成脂肪細胞。用以於活體内 及活艘外測量GDF-8活性之例示性步驟係被載示於實例2、3、6 及13中。 該’’GDF-8抑制劑’’用語包括任何能抑制GDF 8的活性、表 15現、加工處理或分泌之藥劑。此類抑制劑包括蛋白質、抗體、 胜肽、模擬胜肽(peptidomimetics)、核醣核酸酵素（rib〇zymes)、 反義募核苷酸、雙鏈RNA以及其他特異地抑制gdF_8之小分 子。此類抑制劑係被認為”抑制，’、”中和’，或”減少”GDF_8之生物 活性。 20 該等”中和（i^tralize)’’、’’ 中和（i^itralizing)’，、’’抑制”用語 以及其等同性質者指藉由一 GDF-8抑制劑而該GDF-8活性之減 少係，該減少係相對於該相同抑制劑不存在時之GDF-8活性。 該GDF-8活性較佳的係至少約1〇%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%、90%或更高。 12 201029666 該”治療”用語被使用於此係可與”醫療方法”互換以及指醫 療處理及預防性/防止性措施。需要治療者可包括已有—特定醫 學疾患之個體與最終可能患有該及患者（即，需要防止性措施 者）。 5 該”經單離的(isolated)”用語指一分子係實質地無其自然環 繞者。例如，一經單離的蛋白質係實質地無來自於衍生該蛋白 質者之細胞或組織來源之細胞性物質或其他蛋白質。該用語指 該製備物中該經分離的蛋白質係足夠純的以被投予作為一醫 參 療組成物，或至少70%至80%(w/w)純，更佳的，至少8〇%至 10 90%(w/w)純，又更佳的，90%至95%純；以及，最佳的，至少 95%、96%、97%、98%、99%或 l〇〇%(w/w)純。 -該”哺乳類”用語指任何被歸類為此類動物者，包括人類、 „ 家畜及農場動物、動物園、運動或寵物動物，諸如：狗、馬、 貓、羊、豬、牛，等等。 15 該”有效劑量”或”有效量”用語指化合物的量係造成一患者 的症狀改善或一所欲的生物性結果（如，增加骨絡肌質量及/ ® 或骨密度）。此量應足以減少GDF-8活性關於骨骼肌質量及骨密 度之負向調控。該有效量可如後續的部分所述而被測定。 20 H.抗GDF-8抗«以及抗原結合片段 A.人類抗體Myo29、Myo28以及Myo22 本揭露内容提供新穎的抗GDF_8抗體及其等之抗原結合片 段。此類抗體之非限制的例示具體例係稱為My〇29、My〇28a 及My〇22。這些示範具體例係以人類IgGi抗體形式被提供。 13 201029666 本發月的抗想持有獨特且有益的特性。第一，該等抗體係 能、间親和力結合至成熟的gdf_8。第二，本發明之抗體可在 活艘外及活想内抑制GDF8活性例如藉由八㈣见結合之抑 制作用以及報導基因檢測所展示者。本發明之抗體亦能特異地 5結口及/或抑制BMp_u的活性，例如，藉由ActRHB結合之抑制 作用乂及報導基因檢測所展示者。第三，該等經揭露之抗體可 抑制GDF-8的活性，該GDF_8活性與骨路肌肉質量及骨密度的 負向調控關聯。 於—範例不具體例中，現行經揭露的抗體係能特異地縣 ❹ 10至GDF-8及BMP-11。預期該等抗艘亦可與其他蛋白質，例如， 屬於TGF β超科者（諸如：穆勒氏抑制物質、膠質細胞性神經 營養因子或GDF-8以外之其他生長及分化因子） 反應。於某些 具體例中’ My〇29與一蛋白質反應，該蛋白質包含相同於序列 辨認編號：49之胺基酸72至88的序列。進一步的具體例中， 15 Myo29結合至一蛋白質，該蛋白質包含序列

Lys-Xaal-Xaa2-Pr〇-Xaa3-Asn(序列辨認編號：54)，其中Xaal、

Xaa2及Xaa3各自為任何胺基酸。進一步的具體例中，符合以下 〇 至少一條件：（1) Xaal=Met，（2) Xaa2=Ser，以及（3) Xaa3=Ile ; 全部係各自獨立的。其他具體例中，Myo22辨認一抗原決定基， 20 該抗原決定基係於成熟的GDF-8序列的前44個N-末端胺基酸 (序列辨認編號：49中的胺基酸1至44)。 一般的熟習本項技藝者將認知到本發明之抗體可被用以 偵測、測量以及抑制不同於前述之蛋白質。一般地’本發明之 抗體能被與任何蛋白質一起使用，該蛋白質係包含一序列至少 14 201029666 約70%、80%、90%、95%或更多相同於成熟型的GDF-8 (序列 辨認編號：49所示）的任何100、80、60、40或20個連續的胺 基酸序列。此類蛋白質的非限制實例包括得自許多物種之 GDF-8序列，其等係描述於本說明書中。該百分比相似度係藉 5 由標準列校演算（alignment algorithms)來測定，例如，Basic Local Alignment Tool (BLAST)描述於八1*8(：111116131_(1990)11· Mol. Biol., 215: 403-410 > the algorithm of Needleman et al. (1970) J· Mol· Biol., 48: 444-453，或the algorithm of Meyers et 參 al. (1988) Comput. Appl· Biosci” 4: 11-17。 10 B.可變部位 完整的抗體，亦稱為免疫球蛋白，典型地係四聚體式糖化 蛋白由兩個各為近25kDa之輕鍵(L)以及兩個各為近50kDa之重 鏈(H)。兩種形式的輕鏈，稱為λ及κ，被發現於抗體中。依據重 15 鏈的固定部位之胺基酸序列，免疫球蛋白可被區分為五個主要 分類(class) : A、D、Ε、G及Μ，以及此等之某些可被進一步區 參 分為次分類（subclass)(同型（isotypes))，如：IgGi、IgG2、IgG〗、

IgG4、IgA〗以及lgA2 »該不同分類的免疫球蛋白之次單元結構 以及三維構形係詳知於習知技藝中。關於抗體結構之回顧’參 20 見 Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, eds. Harlow et al” 1988。簡要地，各輕鏈係由一N-末端可變(V)部位(vL)以及一固定(C)部位(CL)構成。各重鏈係由 一 N-末端V部位、三或四個C部位以及一鉸鏈區域（hinge region)。該CH部位最接近VH者係被定為CH卜該Vh及VL部位包 15 201029666 括四個相當守恆的序列，稱為架構區域（FRl、FR2、FR3及 FR4 )，其形成一骨架於三個超可變（hypervariable)序列之區域 (互補決定區域(CDRs))。該CDRs含有絕大多數殘基負責於與 抗原之交互作用。CDRs係、被指稱為CDR1、CDR2以及CDR3。 5 依據地，該重鏈上之CDR組成份子係被指稱為HI、H2及H3， 而輕鏈上之CDR組成份子則被指稱為LI、L2及L3。CDR3係抗 艘結合位址中分子多變性(diversity)的最大來源。H3，例如， 可短如兩個胺基酸或大於26個胺基酸。最小的抗原結合片段係 Fv，其由 VH及VL部位構成。該Fab片段（£ragmentantigenMnding © 10 (抗原結合片段））由VH-CH1及VL-CL1部位構成，藉由一雙硫鍵 於該固定區域間共價地連接。為了克服當共表現(co-expression) 於一宿主時，該Fv中的非共價地連接的VH及VL部位之解離傾 向，一稱為單鏈(sc)Fv片段(scFv)可被建構，其中一可撓的且適 當長的多太連接該VH的C-末端至該VL的N-末端或連接該VL的 15 C-末端至該VH的N-末端。最常用的連接物(linker)係為一 15殘基 ((Gly4Ser3)3)胜肽，但其他連接物亦已知於習知技藝中。 抗體多變性係藉由多重生殖細胞(germlined)基因之使用而 ◎ 編碼多個可變區域以及多種體細胞效應。該等體細胞效應包括 可變基因區段與多變（D)及連結(J)基因區段之重組作用以製造 20 —完整的VH部位以及可變基因區段與連結基因區段之重組作 用以製造一完整的VL部位。該重組過程本身係不精確的，導致 位於該V(D)J連結處之胺基酸的漏失或添加。該多變性的機制發 生在發展中的B細胞且在抗原曝露之前。抗原性刺激之後，該b 細胞中經表現的抗體基因進行體突變。基於生殖細胞基因區段 16 201029666 數目之估計，這些區段的隨機重組，以及隨機vH-vL配對，高 達 1.6x107種不同抗體可被產生（Fundamental Immunology, 3rd ed·，ed· Ed. Paul，Raven Press, New York，NY, 1993)。當其他有 助於抗體多樣性之過程（如，體突變）被加入計算，則認為高 5 於 lxl010種不同抗體可被產生（Immunoglobulin Genes，2nd ed·, eds. Jonio et al·，Academic Press, San Diego, CA，1995)。因為許 多過程涉及抗體多樣性之產生，所以獨立地衍生之具有相同抗 原特異性之單株抗體不太可能有相同的氨基酸序列。 Φ 因此，本發明進一步提供新穎的衍生自人類免疫球蛋白基 10 因庫之CDRs。用於攜帶本發明的一CDR之結構一般地將是一抗 體重鏈或輕鏈序列或一其等之實質區位，其中該CDR係位於一 . 對應於自然發生的VH及VL之CDR位置。該等免疫球蛋白可變部 位之結構及位置可被測定，如描述於Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human 15 Services, eds. Kabat et al., 1991。 現在被揭露的抗鱧之DNA以及胺基酸(AA)序列，其等scFV φ 片段，VH及VL部位以及CDRs係載述於序列表以及被列舉於第1 表中。方便起見，VH及VL部位中的各個CDR之位置係被列於第 2表中。該Myo29、Myo28及Myo22中，除了 VH及VL部位以外之 20 重鏈及輕鏈序列係相同的。 17 201029666 第1表：scFV、VH及Vl部位以及CDRs之DNA與胺基酸序列 Myo29 Myo28 Myo22 scFV的DNA序列 序列辨認編 號：13 序列辨認編 號：7 序列辨認編 號：1 scFV的AA序列 序列辨認編 號：14 序列辨認編 號：8 序列辨認編 號：2 VH的DNA序列 序列辨認編 號：15 序列辨認編 號：9 序列辨認編 號：3 VH的AA序列 序列辨認編 號：16 序列辨認編 號：10 序列辨認編 號：4 Vl的DNA序列 序列辨認編 號：17 序列辨認編 號：11 序列辨認編 號：5 VL的AA序列 序列辨認編 號：18 序列辨認編 號：12 序列辨認編 號：6 scFV的經生殖細胞化 DNA序列 序列辨認編 號：25 序列辨認編 號：19 scFV的經生殖細胞化AA 序列 序列辨認編 號：26 序列辨認編 號：20 VH的經生殖細胞化DNA 序列 序列辨認編 號：27 序列辨認編 號：21 VH的經生殖細胞化AA序 列 序列辨認編 號：28 序列辨認編 號：22 Vl的經生殖細胞化DNA 序列 序列辨認編 號：29 序列辨認編 號：23 VL的經生殖細胞化AA序 列 序列辨認編 號：30 序列辨認編 號：24 H1的AA序列 序列辨認編 號：31 序列辨認編 號：37 序列辨認編 號：43 H2的AA序列 序列辨認編 號：32 序列辨認編 號：38 序列辨認編 號：44 H3的AA序列 序列辨認編 號：33 序列辨認編 號：39 序列辨認編 號：45 L1的AA序列 序列辨認編 號：34 序列辨認編 號：40 序列辨認編 號：46 L2的AA序列 序列辨認編 號：35 序列辨認編 號：41 序列辨認編 號：47 L3的AA序列 序列辨認編 號：36 序列辨認編 號：42 序列辨認編 號：48 18 201029666 第2表：SCFV中的CDRs位置 ^CDR Myo29 (序列辨認編 號：26) 「My〇28 (序列辨認編 號：20) Myo22 (序列辨認編 號：2) _Η] 31-35 31-35 31-35 H2 50-66 50-66 50-66 H3 99-106 99-110 99-113 LI 157-167 160-173 163-176 —_ L2 183-189 189-195 192-198 L3 H 222-228 228-233 231-242 現在被揭露的抗體可進一步包含抗體固定區域或其等之 ® 部份。舉例之，一 VL部位可於其C-末端被貼附至抗體輕鏈的固

5 定部位’包括人類Ck或CX鏈，較佳地以鏈。相似地，以一VH 部位為主的一特異性抗原·結合片段可於其C末端末位被貼附 至竹生自任何同型抗體（諸如：IgG、igA、igE以及IgM，以及 任何同型抗體次分類，特定地1§〇1及1§(}4)之免疫球蛋白重鏈 的全部或部份。在例示的具體例中，抗體包含人類Ig(3^的重及 10 輕鏈之C_末端片段。該等用於λ輕鏈的C-末端片段之DNA及胺 基酸序列係被載述於序列辨認編號：5〇以及序列辨認編號： φ 5卜分別地。 本發明的某些具體例包含Myo29、Myo28或Myo22的Fv片 #又之Vh及/或Vl部位。進一步的具體例包含任何這些vh及乂1^部 15 位之一或更多互補決定區域(CDRs)。其他具體例包含My〇29、 Myo28或Myo22的VH部位之_H3片段。在某些具體例中，該等 本發明的VH及VL部位係經生殖細胞化的，意即，這些部位的架 構區域(FRs)係利用傳統的分子生物技術被改變以符合人類生 殖細胞基因產物之共通的胺基酸序列。在其他具體例中，該架 19 201029666 構區序列保持相異於該生殖細胞。 c·經改變的抗體及其等片段 本發明的另一態樣提供_用以獲得一對GDF8有特異性抗 5原-結合部值之抗體。熟f本項技藝者將認知到本發明的抗禮係 不偈限於該等如第1表所載述之特定的VH及VL序列，且亦包括 這些序列的變異者，其等維持抗原結合能力。此等變異者可利 用習知技藝中已知技術而被自該等經提供之序列衍生。胺基酸 之取代、刪除或添加，可被進行於該FRs或CDRs*。而該架構 10區域之變化係通常地被設計以改良該抗艘的穩定性及減少其 免疫原性’該CDR中的變化係通常地被設計以增加該抗體對其 標的之親和力。此使親和力増加之變化係藉由改變該cdr區域 及測試該抗體且典型地憑經驗來測定。此改變可被依據描述於

Antibody Engineering, 2nd. Ed., ed. Borrebaeck, Oxford 15 University Press, 1995 之方法來進行。 用以製造一vH部位之方法，該Vh部位係如載述於此之Vh 部位的一胺基酸序列變異者，包含添加、刪除、取代或插入一 或更多胺基酸於現在所揭示之VH部位的胺基酸序列之步驟，可 選擇地組合該VH部位與一或更多VL部位，以及測試該vH部位或 20 VH/VL組合或特異結合至GDF-8之組合，可選擇地測試此抗原_ 結合部位能中和GDF-8活性之能力。該vL部位可具有實質地如 載述於此之一胺基酸序列。 一類似的方法可被施行，其中被揭示於此之一位的一 或更多序列變異者係被與一或更多VH部位組合。 20 201029666 本發明的另一態樣提供一製備一特異地與GDF-8反應之抗 原-結合片段之方法。該方法包含： ⑷提供一編碼一 vH部位之核酸序列的起始匯集（staring repertoire)，該核酸匯集係包括一欲被取代之CDR3或缺乏~ 5 CDR3編碼區域； (b) 令該匯集與一供體(donor)核酸組合，該供體核酸蝙 碼一VH CDR3 (即H3)之胺基酸序列（實質地如載述於此者）， 使得該供體核酸係經插入該匯集之CDR3區域於是提供一編碼 ❹ 一 VH部位之核酸序列的產物匯集(pr〇duct repert〇ire); 10 (c)表現該產物匯集之核酸； (d) 選擇一對於GDF-8特異之特異的抗原-結合片段；以及 (e) 回收該特異的抗原-結合片段或編碼其之核酸。 再者，一類似的方法可被施行，其中本發明之一VlCDR3 (即L3)係被與編碼一vL部位之核酸匯集組合，該核酸匯集係 15 包括一欲被取代之CDR3或缺乏一 CDR3編碼區域。 本發明之一 CDR編碼序列（如CDR3 )可被導入一缺乏CDR ® (如CDR3 )的可變區域之匯集中，利用重組DNA技術。例如，

Marks et al. (Bio/Technology (1992) 10: 779-783)描述產生抗體 可變部位匯集之方法，其中該等經支配於或鄰接至該可變部位 20 處的5’端之共有引子係被用以接合至該人類VH基因的第三架 構區之共有引子，而提供一缺乏CDR2Vh可變區域的匯集。該 匯集可被與一特定的抗體之一CDR3結合。利用類似的技術， 本發明之CDR3衍生序列可被與缺乏CDR3之Vh或义部位匯集 混接，且該經混接的完整vH或vL部位與一同質的VLaVH部位 21 201029666 組合以提供本發明之特異的抗原_結合片段。該匯集可接著被表 現於一合適的宿主系統中，諸如W〇 92/01047之噬菌體呈現 (phage display)系統’使得合適的抗原_結合片段可被選擇。 類似的混接獲組合技術亦被Stemmer (Nature (1994) 3 70: 5 389_391)揭露，其描述該技術於相關於一乙内醯胺酶基因 (β-lactamase)但觀察該方式可被使用於抗體之產生。 另一選擇係產生新的攜帶一本發明之CDR衍生序列之VH 或VL區域’利用一或更多經選擇的Vh及/或Vl*因之隨機突變 來產生在該整個可變部位中之突變。此一技術係由Gram et al. ^ 10 (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576-3580)描述，其使 用錯誤傾向PCR (error-prone PCR)。 另一可被使用的方法係使該VH或VL基因之CDR區域直接 突變。此一技術係由Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809-3813)以及Schier et al· (J· Mol_ Biol. (1996) 263: 15 551-567)描述。 相似地，一或更多，或所有的三個CDR可被移接至一VH 或VL部位的匯集，其等之後被用以篩選對GDF-8特異之一特異 Ο 的結合夥伴或結合片段。 一免疫球蛋白可變部位之實質的區位將包含至少該CDR 20 區域以及，可選擇的，該等scFv片段之間的架構區域（如載述 於此者）。該區位也將包括至少約50%的FR1或FR4，或該50% 係50%FR1的C-末端以及50%FR4的N-末端。在該可變部位之實 質的區位之N-末端或C-末端之額外的殘基可為通常與自然發 生的可變部位區城不相關者。例如’本發明的特異抗原-結合片 22 201029666 段之建構可藉由重組dna技術製得，而可產生由連接物所編碼 之N-或C-末端殘基之導入，以促進選殖或其他處置步驟。其他 處置步驟包括：連接物之導入以使本發明的可變部位連結至進 一步的蛋白質序列，該蛋白質序列包括免疫球蛋白重鏈、其他 5 可變部位（例如：雙抗體(diabodies)之產生）或蛋白質標記（如 以下所詳加討論者）。 雖然實例中所例示之具體例包含一對，，相配的（matching)，， VH以及VL部位，本發明亦包含含有一單個可變部位之結合片 Φ 段’該單個可變部位係衍生自νΗ或vL部位序列，特別是VH部 10 位。在該單鏈特異性結合部位之任一例中，這些部位可被用於 篩選能形成二部位特異性(two-domain specific)抗原結合部位 之互補部位（complementary domains)，其等係能結合GDF-8者。 這可藉由噬菌體呈現篩選法達成，其利用所謂的階層式雙組合 式方法（hierarchical dual combinatorial approach)如揭示於WO 15 92/01047，其中一個別的含有一Η或L鏈的選殖株(clone)之菌落 (colony)係被用以感染一完整庫之編碼另一鏈（L或H)之選殖 Φ 株，並且產生二部位特異性抗原結合部位，其係依據噬菌體呈 現技術被選擇，如該參考資料中所描述。此技術亦被Marks et al. 揭露，如前。 20 抗體可藉由化學方法而被與放射性核種、藥物、巨分子或 其他藥劑共軛，或可被作成包含一或更多本發明之CDRs之融合 蛋白質。 一抗體融合蛋白質含有一VH-VL對，其中這些鏈中之一者 (通常是VH)以及另一蛋白質係經合成為一多胜肽鏈》這些類 23 201029666 型的產物不同於抗體處在於，其等一般地具有一附加的構件、 一小分子的活性基團（moiety)或該經共軛的或融合的聚分子之 主要分子結構特徵。 除了上述之胺基酸序列之變化以外，該等抗體可被糖化、 5 聚乙烯二醇化(peglyated)或被連接至白蛋白或一奈米蛋白質性 (nanoproteinaceous)聚合物。例言之，現在揭示之抗體可被連接 至多種奈米蛋白質性聚合物之一者，諸如：聚乙二醇、聚丙二 醇或聚氧化稀，採用如美國專利號：4,640,835、4,496,689、 4,301，144、4,670,417、4,791，192或4,179,337載述之方法。例如， 10 該等抗體係經化學地改質而共價的共輛至一聚合物以增加其 等之循環半衰期。例示性的聚合物，以及將其等附接至胜肽之 方法也呈現於美國專利號：4,766,106、4，179,337、4,495,285及 4,609,285 中。 在其他具體例中，該抗體可經改質以具有一經改變的糖化 15 型樣（即，從原有的或自然的糖化型樣改變）。此處所使用之”經 改變的（altered)”意指具有一或更多碳水化合物基團被刪除，及/ 或具有一或更多糖化處被添加至該原有的抗體。將糖化處添加 Ο 至目前揭示之抗體係藉由使該胺基酸序列改變而含有習知技 藝已知之糖化處共同序列來被完成。另一種增加該抗體上的碳 20 水化合物基團數之手段係藉由化學或酵素耦合糖苷至該抗體 的胺基酸殘基上。這些方法係被描述於WO 87/05330以及Aplin 與Wriston(1981)CRC Crit. Rev. Biochem·，22: 259-306。任何出 現於該抗體上之碳水化合物基團之移除可藉由化學地或酵素 地完成，如描述於Hakimuddin et al.(1987) Arch. Biochem. 24 201029666

Biophys·，259: 52 ;以及Edge et al. (1981) Anal. Biochem·，118: 131 以及Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350。 本發明之抗體也可被以一可偵測的或功能性標記來標 識。可偵測的標記包括放射性標記，諸如1311或99Tc，利用習知 5 技藝已知的傳統化學法其可被貼附至本發明抗體上。標記亦包 括酵素標記’諸如山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)或驗性 去磷酸酶(alkaline phosphatase)。標記又包括化學基團，諸如： 生物素(biotin)，其可經由結合至一特定的同質可偵測的基團， 如：經標記的卵白素(avidin)，被憤測。 10 抗體，其中CDR序列僅非實質地不同於如序列辨認編號 η ’ 其中η係2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47或48，係被含納於本發明的範疇中。 非實質的不同處包括次要的胺基酸變化，如一 CDR序列中任5 15個胺基酸中1或2者之取代。典型地，—胺基酸係被一相關的胺 基酸取代，仙關的胺基酸具有相似的電荷、疏水性或立體化 學的特徵。此類取代係落於一習知技藝人士之普通技藝中。不 像CDRs中’更多實質的變化可被進行於結構架構區域(FRs)中 而不負面地影響-抗體的結合性質。FRs之變化包括，但不受 2〇 限於’擬人化何生自非人類之架構或設計某些對於抗原接觸 或穩定該結合處係重要之架構殘基，諸如：改變該固定區域之 分類(dass)或次分類(subclass)，？文變可改造一作用體 功能之特定的胺基酸殘基，諸如：&受器結合(Lund付d (觀） J. Immun. 147: 2657-1662^Morgan et al. (1995) Immunology 86: 25 201029666 319-324)，或改變衍生該固定區域之物種。抗體可具有突變位 於該重鏈的CH2區域中，其減少或改變作用體功能，例如Fc受 器結合以及補體活化作用。例如，抗體可具有諸如美國專利 號：5,624,821及5,648,260所描述之突變。例如，在4〇1或坨02 5 重鏈中，此突變可被進行在序列辨認號：53之胺基酸殘基117 及120 ’該序列辨認號：53係表示IgG1的Fc區位（這些殘基對應 於IgG1*IgG2全長序列中的胺基酸234及237)。抗體也可具有突 變使一免疫球蛋白的兩個重鏈之間的雙硫鍵穩定，諸如：該IgG4 的鉸鏈區域(hinge region)中之突變，如揭示於Angal et al. (1993) G .10 Mol. Immunol. 30: 105-108。 D.核酸、選殖以及表現系統 本發明更提供一經單離的核酸其本發明之編碼抗體或結 合片段。依據本發明之核酸可包含以及可全部或部 15 份地係合成的。關於如於此所載述之核苷酸序列包括有該特定 序列之DNA分子，且包括有該特定序列之RNA分子其中口係經 取代為T，除非内容中有其他要求。 ❹ 本發明之核酸包含一如於此所載述之本發明CDR或VH或 VL部位之編碑序列。 2〇 本發明亦提供以下形式之構築體(construct)··質體'載體、 轉錄或表現組合體(e瞻tte)，其包含至少—上述之本發明核酸。 本發明亦提供一宿主細胞，其包含一或更多如上述之構築 體核酸其編碼任何於此所提供之CDR(H1H2、阳、 L2或L3)、％或义部位，或特異性抗原結合片段，形成本發明 26 201029666 之一態樣，以一編碼產物之製造方法。該方法包含該編碼核酸 之表現。表現可藉由於適當條件下培養含有該核酸之重組的宿 主細胞來達成。藉由一部位，或特異性抗原結合片段表 現之製造後，其等可使用任何合適的技術被單離及/或純化，接 5 著被適當地使用。 依據本發明之特異性抗原結合片段，VH及/或VL部位，以 及編碼核酸分子以及載體可被提供從，例如其等之自然環境， 被單離及/或純化，於實質地純或均質的形式，或，例如，核酸 其係無或實質地無其他非編碼一有所欲功能的多太之核酸或 10 基因序列。 於多種不同的宿主細胞内選殖及表現一多太之系統係被 詳知的。合適的宿主細胞包括：細菌、哺乳類細胞、酵母以及 桿狀病毒系統。可獲得自習知技藝之用於一異源性多太之表現 的哺乳類細胞，包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎 15 臟細胞、NS0小鼠黑色素瘤細胞以及許多其他者。一普遍的細 菌宿主係co/i。關於適於用來生產抗體之細胞，參見Gene Expression Systems，eds. Fernandez et., Academic Press，1999。 任何相容於本發明之細胞可被用於生產現今揭露之抗體。 合適的載體可被選用或被構築，其含有適合的調節序列’ 20 包括啟動子(promoter)序列、終端子(terminator)序列、多腺皆酸 化（polyadenylation)序列、增強子（enhancer)序列、標籤基因 (marker genes)以及其他適合的序列。載體可為質體或病毒， 如：嗟菌趙或菌質鱧(phagemid)，適合的。關於進一步的細知 參見，例如，Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd ed” 27 201029666

Sambrook etal” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。許 多已知的核酸操作技術及方法，例如，核酸構築體之製備、突 變作用、定序、導入DNA至細胞以及基因表現，以及蛋白質之 分析，係被詳述於Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed. 5 Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons，1992。 因此’本發明的進一步態樣提供一宿主細胞其包含描述於 此之核酸。另一態樣提供一方法其包含導入此核酸至一宿主細 胞中。該導入可採用任何可獲用之技術。對於真核細胞，合適 的技術可包括填酸約轉染作用（transfection)、DEAE-dextran、 10 電穿孔法(electroporation)、微脂體(liposome)媒介的轉染作用以 及轉導作用（transduction)，利用反轉錄病毒或其他病毒，如： 牛痘’或用於昆蟲細胞之桿狀病毒。對於細菌細胞，合適的技 術可包括氣化約轉形作用（transformation)、電穿孔法以及利用 細菌噬菌體之轉染作用。 15 該導入作用隨後可引起或促使該核酸之表現，如，藉由培 養宿主細胞於表現該基因之條件下。 E.生物寄存 個別地經該菌質體載體PCANTAB 6 (其編碼非生殖細胞化 20 的scFv’sMyo29、Myo28或Myo22)轉形之E. c〇li 培養物係於二 〇〇二年十月二日被寄存在美國組織培養儲存中心(ATCC)分 別為寄存編號PTA-4741、PTA-4740以及PTA-4739。該寄存地點 係 10801 University Blvd，Manassas，VA 20110, U.S.A.。 28 201029666 Π.治療疾病的方法及其他用途 本發明之抗體係有用於防止、診斷或治療人類或動物的醫 學疾病。該等抗體可被用以抑制或減少一或更多相關於GDF-8 或相關的蛋白質之活性。最佳地’該抗體抑制或減少一或更多 5 GDF-8之活性，相對於一未被一抗體結合之GDF_8。在某些具 體例中，該GDF-8的活性，當被一或更多本發明所揭露之抗體 結合時，係被抑制至少50%，較佳地至少60、62、64、66、68、 70、72、74、76、78、80、82、84、86或88%，更佳地至少 90、 β 91、92、93或94% ’以及甚至更佳地至少95%至100%相對於一 10 未被一或更多本發明所揭露之抗體結合之成熟的GDF-8蛋白 質。GDF-8活性之抑制可被測量於一pGL3(CAGA)12報導基因檢 測（RGA)中，如描述於Thies et al. (Growth Factor (2001) 18: 251-259)以及例示於實例2及9，或被測量於ActRiiB受器檢測中 如例示於實例3及6。 15 該藉由本發明之抗體來防止、診斷或治療之醫學疾患係一 肌肉或神經肌肉疾病，以及一脂肪組織疾病（諸如肥胖）、第 ® 二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性症候群（如，X症 候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起的胰島素抗性， 或骨頭退化性疾病（諸如，骨質疏鬆症）。 20 其他藉由本發明之抗體來防止、診斷或治療之醫學疾患係 與月質流失相關的疾病，其包括骨質疏鬆症（特別地在老年 人及/或停經後婦女）、糖皮質素引發的骨質疏鬆症、骨質缺少 症、骨關節炎，以及骨質疏鬆相關的骨折。其他標的代謝性骨 頭疾病及疾患包括源自慢性糖皮質素療法之低骨質、早期性腺 29 201029666 衰竭、雄性素抑制低落、維生素D缺乏、次發性副甲狀腺機能 宄進、、營養缺乏以及厭食症。該等抗體係較佳地被用以防止、 診斷或治療哺乳類之此類醫學疾患，特別地，人類。 本發明之該等抗體或抗體組成物係以一治療上有效量被 5 投予。一般地，一治療上有效量可依受試者(subject)的年齡、 狀況及性別，以及該受試者的醫療狀況嚴重度而有變化。需要 時該劑量可由一醫師決定或調整，以符合經觀察的治療效果。 此等化合物之毒性以及治療效果可藉由標準藥學程序被於細 胞培養或實驗動物中測定，例如，測定LD5〇 (對於50%族群致 @ 10 命之劑量）以及ED% (對於50%族群治療上有效之劑量）。毒性 及治療效果之間的劑量比率係治療指數且其可被以ld5〇/ed50 之比率表現。展現大的治療指數之抗體係較佳的。 該獲得自細胞檢測及動物研究之數據可被用以訂定一使 用於人類的剤量範圍。此化合物之劑量較佳地存在於一包括 15 ED5〇而有小的或無毒性之循環濃度範圍内。該劑量可在此範圍 内依採用的劑型及利用之投予路徑而變化。對於任何被使用於 本發明中之抗體，該治療上有效劑量可從細胞培養檢測被初始 ◎ 地評估。一劑量可被訂定於動物模式中以達到一循環血漿濃度 範圍其包括如細胞培養中測定之該κ：5〇 (即，該測試抗體的濃 20 度係達致對徵狀有半-最大的抑制作用）。jk漿中的位準(ieveis) 可被測定，例如，藉由高效能液相層析法。任何特定劑量之效 用可藉由—合適之生物檢測(bioassay)被監測。合適之生物檢測 實例包括DNA複製作用檢定、基於轉錄作用之檢定、GDF 8蛋 白質/又器結合檢定、肌酸激酶檢定、基於前脂肪細胞的分化 30 201029666 作用之檢定、基於脂肪細胞的葡萄糖攝取之檢定，以及免疫性 檢定。 一般地，該等組成物係被投予使得抗體或其等結合片段係 以介於 1 pg/kg與20 mg/kg、1 pg/kg與 10 mg/kg、1 pg/kg與 1 5 mg/kg、10 pg/kg與 1 mg/kg、10 pg/kg與 100 pg /kg、100 pg/kg 與1 mg/kg以及500 pg/kg與lmg/kg之間被給予。較佳地，該等 抗體係被以一批式劑量(bolus)給予’以儘可能擴大該抗體的循 環位準於劑量給予後之最長的時間。在批式劑量後，連續式注 入也可被使用。 10 以現今揭露的抗體來治療、診斷或防止前述醫學狀況之方 法也可被使用在其他TGF-β超科之蛋白質上。許多這些蛋白質 係結構上與GDF-8相關，諸如BMP_U。依據地，另一具體例提 供治療前述疾患之方法，其藉由單獨投予一能抑制BMpil或促 進素(activin)至一受試者，或組合上其他TGF_p抑制劑，諸如一 15 GDF_8之巾和抗體。本發明之料抗體也可削以治療一疾病 或與BMH目關或由BMP齡讀況。參考，如，美國專利第 φ 5,639,638 號及第 6,437，111 號。 本發明之該等抗體也可被用以偵測屬於TGF-0超科之蛋白 質的存在，諸如腑-U以及G_，㈣内或活體外。藉由這 20些蛋白質的存在或位準與—醫學狀況之關連熟習本項技敲者 可診斷該相關的醫學狀況。可藉由現今揭露之抗想來診斷之醫 學狀況係如前所載述者。 以及包括ELISA、免疫放 、免疫螢光法、免疫沉殿 這些積測方法係詳知於習知技藝 射檢測法、免疫墨點法、西方墨點法 31 201029666 法以及其他相似的技術。該等抗髏可進一步被提供於一診斷套 組中’其納入一或更多這些技術來偵測一蛋白質（如，GDF-8 )。 此一套組可含有其他組份、包裝、說明書或其他幫助蛋白質的 偵測及該套組之使用之物質。 5 當該等抗體係欲被用於診斷目的時，其可被所欲的修飾其 等，例如，以一配位子基群(ligand group)(諸如生物素）或一 可偵測的標籤基群（諸如一螢光基群、一輻射同位素或一酵 素）°若所欲的，該等抗體（不論多株或單株）可使用傳統的 技術被標記。合適的標記包括螢光團（fluoroph〇res)、色素團 © 10 (chr〇moph〇res)、輻射性原子、電子緻密試劑、酵素、以及具有 特定結合夥伴之配位子。酵素係典型地藉由其等活性被偵測。 例如，山葵過氧化酶可藉由其將四甲基聯苯胺(tmb)轉換至一 藍色素之能力被偵測’可被以一分光光度計來定量。其他適合 的標D己可包括生物素以及印白素或鍵菌印白素（streptavidin)， 15 IgG及蛋白質A，以及眾多習知技藝已知之受器_配位子對。其 他變化或可能性對於熟習此項技藝者將是輕易明顯的，且被視 為本發明的範疇之同等者。 ❹ 本發明又一態樣提供一方法其辨認有用於肌肉及骨頭疾 患之治療劑。適當的篩選檢測，如，基於ELISA之檢測，係習 20知技藝所知。於此一篩選檢測中，一第一結合混合物係由組合 一本發明之抗體及一配位子形成，如，GDF_8、BMP-11、促進 素’以及該第一結合混合物中該配位子與該抗體間的結合量 (M〇)係被測量。一第二混合物也由組合該抗體及該配位子以及 一欲被筛選之化合物或藥劑而形成，以及該第二結合混合物中 32 201029666 該配位子與該抗體間的結合量（Μι)係被測量。接著該第一與第 二結合混合物中的結合量被比較，例如，藉由計算該比 率。當相較於該第一結合混合物，若觀察到一減低之結合於該 第二結合混合物中，該化合物或藥劑係被認為能抑制GDF-8活 5 性者。結合混合物之配方及完善化係熟習此項技藝者所知，此 結合混合物也可含有緩衝劑及必要於加強或改善化結合之鹽 類’以及附加的對照檢測可被包括於本發明的篩選檢測中。 被發現能減低該抗體-配位子之結合達至少約1〇% (即 ® Mi/Mg<0·9)之化合物，較佳地大於約30%，於是可被辨認且 10 之後，若所欲的，再次篩選其抑制GDF-8之能力於其他檢測中， 諸如ActRIIB結合檢測（實例2)，以及其他基於細胞及活體内的 檢測，如實例13、15及16之描述。 III.藥學組成物及投予方法 15 本發明提供包含現今所揭露的抗體之組成物。此等組成物 係可適於藥學使用以及投予至患者。該等組成物典型地包含一 ® 或更多本發明之抗體以及一藥學上可接受的賦形劑。就如使用 於此’該片語’’藥學上可接受的賦形劑”包括任何以及所有的溶 劑、散佈介質、塗覆物、抗細菌及抗真菌劑、等張劑及吸收延 2〇 遲劑’以及相似者，其等係相容於藥學上投予。此等介質及藥 劑於藥學上活性物質之使用係習知技藝所詳知。該等組成物也 可含有其他活性化合物其提供補充的、額外的或增強的治療功 能。該藥學組成物也可被包括於一容器、包裝或分配器中，且 與投予說明書一起。 33 201029666 本發明的藥學組成物係經配方以符合其所欲投予之路 ^ 成該^予之方法係一般熟習該項技藝者已知的。也可能 獲得**被局D卩地或口服地投予之組成物，或能穿透黏膜者。該 扠予可為，例如，靜脈内腹腔内肌肉内腔内、皮下或穿 5 透皮膚的。 被使用於真皮内或皮下施用之溶液或懸浮液典型地包括 或更多以下之組份：一無菌的稀釋劑諸如用於注射之水、鹽 命液固定性油脂、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其他合成的 溶劑’抗細菌劑諸如笨基醇或對羥基苯曱酸甲酯；抗氧化劑諸 10如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二銨四醋酸；緩衝劑 諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用於調整張力（tonicity) 之藥劑諸如氣化鈉或葡萄糖。該pH可被以酸或鹼（諸如氫氣酸 或氫氧化鈉）調整。此製備物可被裝於瓶(ampoules)、可丟棄 的注射筒或玻璃或塑膠製的多劑型瓶中。 15 適於注射之藥學組成物包括無菌的液態溶液或散佈液以 及無菌的粉末其係用於臨場製備無菌的可注射溶液或散佈 液。對於靜脈内投予，合適的載劑包括生理鹽水、抑菌水、 Cremophor TM EL(BASF，Parsippany，NJ)或緩衝的雄酸生理鹽 (PBS)。所有例子中，該組成物必須是無菌的且應是可容易的注 20 射出程度之流體。其在製造與儲存狀況下必須是穩定的且必須 經保存對抗微生物（諸如細菌或真菌）的污染作用。該載劑可 為一溶劑或散佈介質含有，例如，水、乙醇、多元醇（例如， 甘油' 丙二醇’以及液態聚乙二醇，以及相似者），以及適合 的其等混合物。該恰當的流體性可被維持，例如，藉由一塗覆 201029666 5

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物（諸如卵磷脂）之使用，在分散液狀況中藉由需求的顆粒大 小之維持以及’藉由界面活性劑之使用。微生物作用之防止可 藉由多種抗細菌及抗真菌劑達成，例如，羥基苯甲酸鹽 '氣丁 醇、紛、抗壞血酸、硫柳汞(thimerosal)以及相似者。許多狀況 中’較佳的將包括等張劑，例如，糖類、多元醇，諸如甘露醇、 山梨醇以及氣化鈉於該組成物中。該可注射組成物之延長的吸 收可被引起，藉由包括一延緩吸收之藥劑於該組成物十，例 如，單硬脂酸鋁以及明膠(gelatin)。 口服組成物一般地包括一純性稀釋劑或一可食用的載 劑。其等可被裝於明膠囊中或壓縮成藥片。用於口服治療投予 之目的，該抗體可被納入賦形劑以及被以藥片或膠囊形式使 用。藥學上相容的結合劑，及/或佐劑物質可被包括做為該組成 物的一部份。該等藥片、藥丸、膠囊及相似者可含有任何下述 成分’或有相似性質之化合物：一結合劑諸如微晶纖維質、黃 蓍谬(gumtragacanth)或明穋，一賦形劑諸如澱粉或乳糖，一崩 解劑諸如藻脫酸(Aliginic acid)、Primogel TM或玉米搬粉，一潤 滑劑諸如單硬脂酸钱或Sterotes TM，一助滑劑諸如膠體二氧化 矽，一甜味劑諸如蔗糖或糖精，或一調味劑諸如薄荷、水楊酸 甲S旨或撥味劑。 20 用於吸入投予，抗體係以一來自加壓的容器或分配器或嘴 霧器之喷霧形式被傳遞，該容器或分配器含有一合適的推進 劑，諸如一如二氧化碳之氣體。 全身性投予亦可經由穿透黏膜或穿透皮膚之手段。例如， 包含Fc區位之抗體的例子，組成物係可能經由FcRn受器媒介的 35 201029666 路徑傳送通過黏膜層（如，小腸、口或肺）（美國專利第 6,030,613號）。穿透黏膜投予可透過錠劑(lozenges)、鼻腔喷霧 器、吸入器或栓劑之使用來完成。關於穿透皮膚投予，該活性 化合物係被配方成軟膏、油膏、膠或乳霜，一般地係如習知技 5 藝所知。關於穿透黏膜或穿透皮膚投予，適於該欲滲透障壁之 穿透劑係被使用於該配方中。此類穿透劑一般地為習知技藝所 知’以及包括，例如，清潔劑、膽鹽以及褐黴酸(fusidic acid) 衍生物。 現今揭露之抗體可被製備有載劑，該載劑將保護該化合物 10 對抗自身體快速排除，諸如一經控制釋放之配方，包括植入物 以及微膠囊化傳遞系統。生物可降解的、生物相容的聚合物可 被使用，諸如：乙烯醋酸乙烯、聚酐、聚甘醇酸、膠原、聚正 酯以及聚乳酸。此類配方之製備方法對於熟習本項技藝者將是 明顯的。微脂體懸浮液含有現今揭露之抗體也可被使用作為藥 15學上可接受的載劑。這些可依據熟習本項技藝者已知之方法來 製備，例如，描述於美國專利第4,522,811號。 將口服或非口服的組成物配方成劑量單元形式可有利於 溶液投予以及劑量的均-性。於此所使用之劑量單元形式指物 理性分離的單元其適於用於欲處理之受試者的單元性劑量；各 加個單元含有-預定量之活性化合物，其經計算以產生所欲的治 療效用，相關於所需的藥學載劑。關於本發明之劑量翠元形式 的說明係被指示且直接依據該活性化合物_特特徵以及所 欲達製的特定製療效用，以及習知技藝配方此一活性化合物來 治療個體之固有限制。 201029666 隨後的實例提供例示性的本發明具體例，其在任何方面不 會限制本發明。一般的熟習本項技藝者將認知具體例以外的眾 多者係包含於本發明範缚内。 載述於本案之參考資料、專利以及公開的專利申請案的整 5 體内容係被納入於此作為參考。 較佳實施例之詳細說明 實例1 : GDF-8之純化 來自一經選擇的表現重組人類GDF-8蛋白質（成熟的 ® GDF-8以及GDF-8原胜肽）的細胞之條件化的培養基係經酸化 10 至pH 6.5，以及被施用至一80x50 mm POROS™ HQ陰離子交

換管柱，之後被施用至一80x50 mm POROSTM SP陽離子交換管 柱（PerSeptive Biosystems，Foster City, CA)。該流過的流體係 經調整至卩115.0以及被施用至一75\2〇111111?01108頂8?陽離 子交換管柱（PerSeptive Biosystems )以及被以一 NaCl梯度沖 15 提。分液（fraction)含有該GDF-8潛伏複合體，當經SDS-PAGE 確認，係被共同收集，經以三氟醋酸(TFA)酸化至pH2-3，接著 ® 被以0.1%TFA加成200 ml以降低其黏度。該共同收集物係接著 被施用至一 250x21.2 mm C5管柱（Phenomenex, Torrance, CA )， 先前施用至一 60 x21.2 mm保護管柱（guard column) 20 ( Phenomenex )以及以一 TFA/乙腈梯度沖提，以將成熟的 GDF-8從GDF-8原胜肽分開。含有成熟的GDF-8之分液係藉由冷 凍乾燥以移除該乙腈而被濃縮，且20 ml的0.1%TFA係被添加。 該樣品係接著被施用至一250x10 mm C5管柱（Phenomenex)加 熱至60°C以幫助分離。此係被重複直到更進一步的分離無法再 37 201029666 被達到。含有成熟的GDF-8之分液係被共同收集且被加成4〇% 乙腈以及被施用至一600x21.2 BioSep™ S-3000尺寸排除管柱 (size exclusion column) ( Phenomenex )，先前施用至一 60χ21 2 mm保護管柱。含有經純化的成熟GDF-8之分液係被共同收集以 5 及被濃縮用於隨後實驗之使用。 在SDS-PAGE上，經純化的成熟GDF-8於未還原 (nonreducing)條件下移動如一寬帶在25 kDa處以及於還原 (reducing)條件下係在13 kDa處。一相似的SDS-PAGE輪廓圖 (profile)已被McPherron et al.(Proc. Nat. Acad. Sci· U.S.A· (1997) 10 94: 12457-12461)報告關於鼠類GDF-8以及反映該成熟蛋白質 的二聚體性質。該活性成熟的BMP-11二聚體係以一相似手段， 從來自一表現重組人類BMP-11的細胞株之經條件化的培養基 中被純化。 活性成熟的BMP-11係從來自一表現重組人類GDF-8原胜 15 肽/成熟BMP-11嵌合蛋白質的細胞株之經條件化的培養基中被 純化。該經條件化的培養基係被載入一 10 ml TALONtm管柱 (Clonetech，Palo Alto，CA)於50 mM Tris pH 8.0，1M NaCl，1 ml/min。該被結合的蛋白質係被以50 mM Tris pH 8.0，1M NaCl，500 mM咪唑沖提。該含有GDF-8原胜肽/BMP-11潛伏複 20 合體之經共同收集的分液係被以10% TFA酸化至pH 3。該共同 收集物接著被施加至一 250 X 4.6 mm Jupiter C4管柱 (Phenomenex，Torrance, CA) ’ 被加熱至 60°C 使成熟的 BMP-11 及 GDF-8原胜肽有更好的分離，以及被以一TFA/乙腈梯度沖提。 含有成熟BMP-11之經共同收集的分液係被冷凍乾燥濃縮。在 201029666 SDS-PAGE上，經純化的成熟BMP-11在未還原條件下移動於25 kDa處以及在還原條件下於12kDa處。 實例2 :經纯化的重组人類GDF-8之生物活性 5 ❹ 10 15 20 為了展示GDF-8的活性，一報導基因檢測（RGA)係被發 展，其使用一表現螢光酵素（luciferase)之報導載體 pGL3(CAGA)12。該CAGA序列係先前係被報告為一TGF-β反應 序列，其位於TGF-β誘發基因PAI-1的啟動子中（Dernier et al. (1998) EMBO J.，17: 3091-3100)。 一含有12個CAGA盒之報導載體係被製造，其使用基本螢 光酵素報導質體pGL3(Promega，Madison，WI)。來自腺病毒主要 後啟動子（latter promoter) (-35/+10)之TATA盒以及轉錄起始位 係被插入介於Bglll及Hindlll位置間。含有12重複的CAGA盒 AGCCAGACA之寡核苷酸係被接合(annealed)且選殖進入Xh〇l 位置。人類橫紋肌肉瘤細胞株A204(ATCC HTB-82)係被以 pGL3(CAGA)12暫時地轉染’利用FuGENE™ 6反應劑 (Boehringer Manheim，Germany)。轉染之後，細胞係被培養在 48井盤於McCoy’s 5A培養基中達16 hrs，該培養基經補充有 2mM楚醯胺酸、1〇〇 u/ml鏈黴素、盤尼西林以及1〇%胎牛血 清。接著細胞於有或無1〇叩/1111〇0?-8的]^(：(^3 5八培養基中 在37°C下被處理6 hrs，該培養基含有麩醯胺酸、鏈黴素、盤尼 西林以及1 mg/ml牛血清白蛋白。經處理的細胞中之螢光酵素 係被定量’利用螢光酵素檢測系統(pr〇mega)。 第4A圖呈現GDF-8最大地活化該報導構築體1〇倍，有一 39 201029666 ED50為10 ng/ml，指出該經純化的重組GDF-8係生物活性的。 BMP-11以及促進素引起一相似的生物性反應。 實例3 :經純化的GDF_8於ActRIIB結合檢測中之結合性質 5 該GDF-8潛伏複合體於一20莫耳EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, Cat. No. 21217)對 1莫耳GDF-8 複 合體的比例下，在冰上被生物素標記共2小時。該反應係藉由 使用0.5% TFA來降低該pH而被終止，且該複合體係於一 C4 Jupiter 250x4.6 mm管柱（Phenomenex)受到層析，以使該成熟 ❿ 10 GDF-8與GDF-8原胜肽分離。被以一TFA/CH3CN梯度沖提之經 生物素標記的成熟GDF-8分液係被共同收集、濃縮以及藉由 MicroBCATM 蛋白質檢測反應套組(Pierce, Rockford. IL, Cat.

No. 23235)被定量。 經生物素標記的成熟BMP-11係被從該BMP-11潛伏複合體 15 製備，以相似於前述之手段。重組的ActRIIB-Fc嵌合體（R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat. No. 3590)係被塗覆於96井平底 測試盤（Costar, NY，Cat. No. 3590)上，以 1 pg/ml 於0.2 Μ 破酸 〇 氫鈉緩衝液中在4°C下隔夜。該等盤接著被以1 mg/ml牛血清白 蛋白封堵且清洗，照著標準ELISA程序。100 μΐ量的多種濃度之 20 經生物標記的GDF-8或BMP-11係被加入該經封堵的ELISΑ盤 中，培育1 hr、經清洗，且該被結合的GDF-8或BMP-11係被偵 測，藉由鏈菌卵白素-山葵過氧化酶(SA-HRP, BD PharMingen,

San Diego, CA, Cat. No. 13047E)隨後加入 TMB (KPL，） Gaithersburg, MD, Cat. No. 50-76-04)。於一Molecular Devices 40 201029666 微盤讀值器中，色度測量係被在450 nM下進行。 如第1圖所示，經生物標記的GDF-8及BMP-11結合至 ActRIIB (推定的GDF-8第二型受器），個別地有ED50為15及4〇 11吕/1111，指出該八(^11118結合檢測對於〇0[-8及81^>-11係一敏感 5 的活體外結合檢測。 實例4 :藉由GDF-8於scFv庫之挑選來單離Myo22 一scFv菌質體庫，其係該1·38χ101()庫之一放大版本經描述 參 的（Vaughan et al. (1996) Nature Biotech” 14: 309-314)，被用以 10 選擇對GDF-8特異的之抗體。可溶的GDF-8蛋白質（10网/如於 50 mM碳酸氳鈉緩衝液中，pH 9.6)係被塗覆至一微效價盤的井 中，於4°C下隔夜。該等井被以PBS清洗以及經封堵於37°C下 MPBS(3% Marvel™脫脂奶粉於PBS中）中2 hrs。經純化的嗟菌 體（1012轉導單位(tu))於100 L的3%MPBS申係被加入至經封堵 15 的井中且經培育於室溫下1小時。該等井係被以PBST(PBS含有 0_1% v/vTween™20)清洗1〇次，接著以PBS清洗10次。經結合 ® 的嗤菌體顆粒係於100 μΐ的100 mM三乙基胺中在室溫下1〇分 鐘被沖提，接著馬上被以50 μΐ的1M Tris-Hcl pH 7.4中和。該經 沖提的嗟菌體係被用以感染10 ml指數成長的五c〇// TG1。經 20 感染的細胞被生長於2TY培養液在37。(：下靜止的30分鐘’隨後 在37°C曝氣下30分鐘’接著塗劃於2TYAG盤上且被培養在30°c 隔夜。菌落(colony)係被從盤上刮下放入1〇 ml 2τγ培養液以及 15%甘油係被添加以儲存在_7〇。^。 來自第一回挑選作用之甘油存放的培養物係被重複感染 41 201029666 辅助噬菌體(helper phage)以及被取回以產生scFv抗體表現之噬 菌體顆粒來用於第二回挑選。此方式共進行全部三回之挑選。 實例5 :從scFv庫中篩選Myo28以及My029 5 可溶的篩選係使用經生物素標記的GDF-8蛋白質 (bioGDF-8)來進行。bioGDF-8係以1 pg/ml的濃度被使用。一scfv 庫，如實例4所述，係被使用。經純化的scFv喔菌艘（1〇12 tu)於 100 μΐ的3% MPBS中係被封堵30分鐘，接著經生物素標記的抗 原被加入以及培育在室溫下1小時。噬菌體/抗原係被加入5〇 μΐ ❹ 10 的Dynal™ Μ280鏈菌卵白素磁珠以及再被培育於室溫下15分 鐘’該等磁珠已先經於1 ml的3%MPBS中在37°C下被封堵1小 時。該等磁珠係被使用一磁條來抓取，以及被於1 ml的3% MPBS(含有0.1%v/vTweenTM20)中清洗四次，隨後於pbs中清 洗。在最後的PBS清洗後，磁珠係被懸浮於100 μΐ PBS中且被用 15 以感染5 ml指數成長的[cW TG1細胞。細胞以及噬菌體係被 培養在37°C下1小時（30分鐘靜止的，30分鐘搖動於250 rpm)， 以及接著被分布在2TYAG盤上。該等盤係被培養在3(rC隔夜以 @ 及菌落可見於隔天。產生的菌落係被從盤中刮下以及嗔菌體係 被如前述取回。一第二回的可溶的篩選係被如前述進行。 20 實例6 : ActRIIB受器抑制檢測以及篩選 產生的菌落，如實例4及5所述而獲得，係被挑進含有1〇〇 μΐ 2TYAG的96井盤中。ScFv之產生係被引發，藉由加入imM IPTG 至指數生長的培養物中以及培養在30。(：隔夜。粗略的含scFv培 42 201029666 養物懸浮液係被篩選其主要抑制bi〇GDF-8與ActRIIB結合的能 力，如實例3所述。該檢測係稍微地被改變，其中bioGDF-8之 結合係被以銪標記的鏈菌卵白素偵測以及使用該DELFIAtm& 應套組(PerkinElmer Life Sciences，Boston, ΜΑ)，於時間解析 5 (time-resolved)螢光儀檢測(TRF)。陽性菌落，呈現抑制結合的 訊號大於不相關的菌落者，係被挑取且經檢測以確認活性。 來自該受器抑制篩選確認之陽性菌落的經純化的scFv係 被測試於如上述抑制檢測中。該檢測中scFv濃度之效價分析 馨I (titration)係被使用為了建立如藉由IC50值所測量之菌落潛力。 10 該等實驗結果係如第2圖所呈現者。就如這些檢測所測量， Myo29、Myo28以及Myo22等 scFv之IC5〇係2.4 ηΜ、1·7ηΜ及60 . ηΜ，個別地。因此，這些抗體係GDF-8活性之潛在的抑制劑。 實例7 :藉由噬謫《ELISA之特異性表述 15 為了測定該等抗體之特異性，一噬菌體ELISA係被進行於 該等來自ActRIIB對GDF-8篩選之陽性菌落以及不相關的蛋白 G 質。個別的含有質菌體之昃co/i菌落係被種植入96井盤中，每 井含有100 μΐ 2TYAK培養液。M13K07輔助噬菌體係以10之感 染多重性(moi)被加至指數生長的培養物以及該盤被再在37°C 20 下培養1小時。該等盤在一桌上離心機中被離心2000 rpm 10分 鐘。該懸浮液係被移除以及細胞團係被重懸浮於100 μΐ 2TYAG 中以及在30°C搖動培養隔夜。隔天，該等盤係被離心2000 ι·ριη 10分鐘以及100 μΐ來自各井之含噬菌體上清液係被轉移至一新 的96井盤。噬菌體樣品係於一最終濃度為3%MPBS中在室溫下 43 201029666 被封堵1小時，ELSA之前。 GDF-8或不相關的蛋白質係以！ yg/mi在4。〇下被塗覆至％ 井微效價盤中。塗覆之後，該等溶液係被從該等井中移除，以 及該等盤係於3%MPBS中在室溫下被封堵〗小時。該等盤係經培 5 育於室溫下1小時以及之後被以PBST清洗3次，接著以PBS清洗 3次。50 μΐ的抗-M13-HRP共耗物(Pharmacia)之1:5000稀釋液係 被加入各井中，該等盤係被在培育於室溫下丨小時。各盤係被 以PBST清洗3次’接著以pbs清洗3次。50 μΐ的TMB受質 (substrate)係被加入各井中且經培育直到顏色展出。該反應係藉 10 由加入25 W的〇·5Μ HJO4而被終止。該產生的訊號係被測量， 藉由使用一微效價盤讀機讀取在450 nm的吸光值。特定結合至 GDF-8係經確認。 實例8 : scFv的定序、轉換至lgG以及生殖細胞化(germiining) 15 中和的scFv五.co/f選殖株係被塗劃於2TYAG盤上且被培 養在30°C隔夜。三重複的來自這些盤中之菌落係被定序，使用 pCANTAB6載體序列寡體（oligos)來放大來自該scFv選殖株的 VH及VL區。被用來製造Myo29、Myo28以及Myo22 IgG之該等 scFv片段的DNA序列係被呈現於序列辨識編號：π、序列辨識 20 編號：7以及序列辨識編號：1，個別地。 來自該scFv選殖株的重及輕鏈區係使用PCR及選殖株-特 定的引子被放大。PCR產物係被以適當的限制酶切解且被次選 殖進入含有人類IgG,重鏈固定部位（VH部位）的載髏，或適當 的含有人類λ輕鏈固定部位（VL部位）的載體。V區部位正轉的 44 201029666 插入質體係經確認，藉由來自個別的五· 菌落之質體DNA的 定序。質體藉由標準技術被從[co/ί培養物中製備，以及重及 輕鏈構築體係使用標準技術被共轉染進入COS細胞。經選擇的

IgG係被純化’使用 Protein A Sepharose (Pharmacia, Peapack，NJ) 5 以及緩衝液被改成PBS。 該等scFv選殖株的定序資料係被用以辨認各個選殖株的 重及輕鏈之最接近生殖細胞序列》適當的突變係被進行，使用 標準的位址直接突變法技術與適當的致突變性引子。ScFv序列 ® 的突變係藉由序列分析被確認。經生殖細胞化的My〇29及 10 Myo28之scFv及VH及VL部位序列係載述於序列辨識編號：19以 及序列辨識編號：25，個別地。 實例9:抗艟的生物活性 第3A圖呈現Myo29與10 ng/ml生物素標記的GDF-8之預培 15 育（Preincubation)在ActRIIB結合檢定中抑制了 GDF-8結合至 ActRIIB，如描述於實例3 ’其IC50係0.2-0.4 nM。相似地在第3B ® 圖中，My〇29抑制了 BMP-11結合至ActRIIB，有相同的IC50。 於一活體外生物檢測中Myo29也封堵了 GDF-8活性。附帶 為例，當GDF-8被與Myo29在室溫下預培育1小時，以RGA檢定 20 測量該GDF-8的生物活性係被減低’該檢定係基本上如實例2 所述進行。第4C圖呈現在Myo29存在下，GDF-8(20 ng/ml)對 pGL3(CAGA)1:^導基因活性的誘發之ed50。Myo29以一劑量反 應性（dose-responsive)方式減低GDF-8活性，有一IC5〇係 15-30 ng/ml(0.1-0.2 nM)。Myo29也抑制BMP-11的生物活性至相同程 45 201029666 度（第4B圖）。相反的，於此檢測中該促進素（activin)的活性不 受Myo29影響（第4D圖），推定地因為相較於GDF-8及BMP-11， GDF-8及促進素之間相當低的相同性。

Myo22及Myo28也被測試於RGA及ActRIIB結合檢測。兩者 5 抗體都封堵了 GDF-8及BMP-11活性。例如，Myo28的IC50係 0.2-0.35 nM。 實例10 : Myo22、Myo28及Myo29之抗原決定基定位 為了正確定位該等抗髏之抗原決定基，代表整個如序列辨 © 10 識編號：49所示之成熟GDF-8序列之48個重疊的13殘基胜肽係 被直接地合成在纖維素紙上，利用點合成技術(Molina et al. (1996) Peptide Research, 9:151-155; Frank et al. (1992)

Tetrahedron, 48: 9217-9232)。該等胜肽重疊處係11個胺基酸。 在此陣列中，半胱胺酸殘基係經絲胺酸取代，為了減少因半胱 15 胺酸存在所引起之化學複雜性。經聚乙二醇改質的纖維素膜及 經Fmoc保護的胺基酸係購買自Abimed (Lagenfeld，Germany)。 該陣列係藉由耦合一β-丙胺酸區隔物被限在該膜上，以及該等 ® 胜肽係被合成其利用標準DIC (二異丙基碳二亞胺）/HOBt (羥 基苯並三唑）耦合化學係如先前描述的（Molina et al. (1996) 20 Peptide Research, 9:151-155; Frank et al. (1992) Tetrahedron, 48: 9217-9232))。 經活化的胺基酸係被點上，使用一 Abimed ASP 222機械。 清洗及去保護作用步驟係被手動地進行以及在該最終的合成 循環後該胜肽係經N末端地乙醯化。胜肽合成之後，該膜係被 46 201029666 於曱醇中清洗10分鐘以及在封堵物（TBS (Tris緩衝的生理鹽與 0.1% (v/v) Tween™ 20)及1% (w/v)路蛋白）中 1〇分鐘。該膜 接著被與2_5 pg/ml抗GDF-8抗體於封堵物中緩緩搖動培育卜^、 時。以封堵物清洗3次各10分鐘後，該膜係被與HRP標示的二級 5 抗體(0.25 gg/ml於封堵物中）培育30分鐘。該膜接著被以封堵物 清洗3次各10分鐘以及以TBST清洗2次各10分鐘。被結合的抗體 係被可見化’使用SuperSingalTM West反應劑（Pierce)以及一數 位相機（Alphananotech Fluoromager)。結果係如第5圖所示。特 Φ 定地，從第5圖可見’該Myo29抗原決定基係經定位在該成熟 10 GDF-8的胺基酸72及88之間。另一方面，Myo22經辨認有一抗 原決定基於該成熟GDF-8的前44個N末端胺基酸序列（序列辨識 編號：49的胺基酸1至44)。最後，該Myo28的抗原決定基包含 殘基係位於該成熟GDF-8的前98個N末端胺基酸。 為了更進一步描述該Myo29抗原決定基的特徵，刪除 15 (deledon)及取代(substition)分析係使用點合成而進行。在取代 分析中’此胜肽的各個殘基係個別地被以除了半胱胺酸以外的 ® 20個自然胺基酸取代。合成以及結合分析係被進行如前述。該 等結果係如第6圖所示，其中第一排、前二欄以及後三欄表示 野生型胜肽控制組。該等結果展現當Lys-78、Pro-81以及Asn-83 20 係個別地被突變成其他胺基酸，Myo29對該胜肽的結合親和力 係重大地減少。因此，Myo29辨識一序列包含Lys-Xaal-Xaa2-Pro-Xaa3-Asn (序列辨識編號：54)，其中Xaal、Xaa2及Xaa3 各自係任何胺基酸，或Xaal=Met，Xaa2=Ser，以及Xaa3=Ile， 各自係獨立的。 47 201029666 實例11 : GDF-8之免疫沉激作用 為了評估Myo29及Myo28與成熟GDF-8及GDF-8複合體之 結合，一免疫沉澱作用研究係被進行。CHO細胞其表現GDF-8 5 係經35S-甲硫胺酸及35S-半胱胺酸標示。100 μΐ的來自這些細胞 之條件化培養液，含有GDF-8蛋白質（成熟GDF-8及潛伏複合 體）係被與20 pg/ml Myo29或Myo28在4。〇下培育1小時。Protein A-SepharoseTM係被加入以及被在4。(：下培育隔夜。該免疫沉激 物係被收集，重懸浮於還原樣品緩衝液中以及被藉由 10 SDS-PAGE分析。該膠係經固定，被以自動放射顯像增強劑溶 液增強、經乾燥以及自動放射顯像係經顯影。第7圖呈現My〇29 及Myo28兩者都可免疫沉澱成熟GDF-8、GDF-8潛伏複合體以及 未經加工的GDF-8。就如西方墨點法所測定，於非還原條件下 該兩種抗體都結合至GDF-8二聚體。 15 實例12 :藥物動力學

Myo29的藥物動力學（pk)係被於C57B6/SCID小鼠中評 量，在以一單次靜脈内（IV)或腹腔内（IP)投予1 mg/kg劑量後。 該等動物接受未標示的及125I-標示的Myo29混合物於前述劑 2〇 量，以及血清濃度係基於血清中1251的放射活性及該經注射的特 定活性而被測量。第8圖呈現Myo29之IV或IP投予後血清濃度對 時間的繪圖。

Myo29呈現約一星期長之延長的終半衰期以及低廓清率 約1 ml/hr/kg。起始分佈容積係約83 mi/kg。表觀分布容積係約 201029666 227 ml/kg。Myo29在注射後約6 hrs達到一尖峰濃度。在ip注射 後之經吸收的部分係約77%。 實例13 :活艟内Myo29對肌肉質量及強度的效用 5 為了測量在活體内Myo29是否封阻GDF-8的活性，Myo29 被於SCID成鼠中測試。SCID小鼠係處於一嚴重的混合型免疫 缺乏症，且因此在注射人類抗體（如Myo29)之後並不會產生 一免疫反應。肌肉質量係被作為經Myo29處理之小鼠中GDF-8 φ 活性之指標。 10 八週大的雄性C57B6 SCID小鼠係被秤重且平均地依體重 被分成八組。Myo29於PBS緩衝液中係每週以多種劑量(6〇、1〇 以及1 mg/kg)被腹腔内注射至小鼠。在第一週被給予雙份劑 量。經載劑(vehicle, PBS)處理的或未經處理的小鼠係作為控制 組。該處理持續四週。處理後肌肉質量係被評估，藉由分割以 15 及秤重排腸肌以及四頭肌。在四週的處理後’所有被My〇29處 理的組別中肌肉質量係增加的，從10%至23%，處理較高劑量 Φ 的組別達到顯著的程度（第9圖，p<0.01)。 在另一實驗中，雌性C57B6 SCID小鼠係每週被以多種劑量 的Myo29 (10、5、2.5以及1 mg/kg)處理達4或12週。同樣地，以 20 Myo29處理四週後導致腓腸肌以及四頭肌重量增加自1〇%至 .20% (第10A及10B圖）。更長的處理（12週）導致更大的肌肉 增加（12%至28%)且所有被Myo29處理的組別都達到統計上的 顯著程度（第11A及11B圖）。 為了測定經增加的肌肉是否促使更強的肌肉，前肢的肌肉 49 201029666 強度係被以一抓握強度計（model 1027 csx，Columbus Instruments，Columbus, OH)測量。12週的處理後，相較於載劑 對照組，在被以5 mg/kg或10 mg/kg的Myo29處理的小鼠中前肢 的強度係比該對照組高17%與23% (p<0.01，第12圖）。這些研 5 究結果展現在活體内Myo29抑制GDF-8活性而使肌肉質量及肌 肉強度重大地減少。 第14圈：活||内GDF-8於小梯骨(trabecular bone)中的角色 如實例13所示，GDF-8之抑制增加了肌肉質量。增加的機 10 械性負重，不論是源自於增加的肌肉活性或增加的體重，係關 連於骨質量及骨密度。因此’ GDF-8剔除(knockout, KO)的小鼠 係被評估經改變的骨質量及微架構(microarchitecture)。對成鼠 的初始評估呈現在剔除的小鼠脊髓中其骨密度係高於其等之 同窩出生的野生型小鼠近兩倍。這樣的增加遠超過僅僅是源自 15 於該GDF-8KO小鼠中肌肉質量增加所預期者。 高解析度的微斷層掃描影像（μ(：Τ40，Scanco Medical,

Switzerland)係被用以評估GDF-8野生型（WT)及ΚΘ成鼠之小樑 骨體積部份以及第五腰椎與遠端股骨的微架構以及股骨中骨 幹(mid-diaphysis)處的皮質骨幾何構造。檢體係採自91〇個月大 20 的GDF_8 KO及同窩出生的對照者（各基因型與性別各四隻小 鼠）。整個脊椎體及股骨係被掃描，使用12叫^解析度之微電腦 斷層掃描。感興趣之包圍脊椎艘處的小樑骨以及遠端股骨骨骺 (metaphysis)處（即，次海綿質（sec〇ndarysp〇ngi〇sa))的小樑骨 之區域係被辨認，使用一半自動的輪廓運算（c〇nt〇uring 50 201029666 5

10 15

algorithm)。以下參數係使用直接3D評量被計算：骨體基部份 (%)、小樑骨厚度(μιη)、區隔（μιη)以及數目（Ι/mm)。此外，該連 接密度（該小樑網絡被連接的程度之指標）以及股骨中骨幹區 之皮質骨參數係被評估，包括整體面積、骨面積以及皮質厚度。 相較於同窩出生的WT小鼠，雄性及雌性KO小鼠的脊椎體 之小樑骨密度都有戲劇化地增加(n=4, +93%及70%，個別地， P<0_0001)。此增加的小樑骨密度係伴隨14%的小樑厚度增加 (Ρ=0·03)，38%的小樑數目增加(p=〇 〇〇〇2)，以及1〇%的小樑區 隔減少（p=0,009)。相較於同窩出生的WT小鼠，這些變化之整 合效果對於架構及密度導致雄性及雌性&〇小鼠的連接增加3 4 至1.7倍(p<0.0001)，個別地。此外，該小樑骨的礦物化作用位 準之一粗略測量指出該小樑的平均礦物含量，相較於該對照 級’該KO小鼠係高8% (p<〇 〇〇〇1)。在此有一暗示，該效用在 雄性小鼠高於雌性小鼠’但該樣品數太小而無法做確定結論。 藉由高解析度微電腦斷層掃描評估之脊椎小樑骨特徵係呈現 柃第3表。 20 相反於脊髓中之觀察，雄性及雌性Κ〇小鼠在遠端股骨中 具有較低於同窩出生的WT小鼠的小樑骨密度㈣，"〇5對於 斤有的基因型效用）(第4表）。此一骨頭密度減少在雌性κ〇小鼠 中係較明顯於雄性κο小鼠。GDF_8 κ〇小鼠具有相似於其等同 高出生的wt小鼠之小樑厚度，但相較於同窩μ的對照組，具 有較少的小樑以及增加的小樑區隔、然而，雖然雄性小鼠在 月股中骨幹的皮質厚度係相似於其等同窩出生的對照组，但是 雄性ΚΟ小鼠者係大於其等同窩出生的對照組 51 201029666 ρ=0·04)(見第5表）。在兩種基因型之間，皮質骨面積或骨面積 部份並無差異。 第3表：脊椎小樑骨特徵(平均值±8£?4) 雄性WT 雄性KO 雌性WT 雌性KO 骨體積部份(％) 23.3±4.7 45.0±5.5 27.7±5.5 46.9+10.8 小樑厚度(μιη) 52±3 58±6 52±5 61+8 小樑區隔（μηι) 210±21 145±8 183±21 169+41 小樑數目（1/mm) 4.6±0.4 7.0+0.4 5.2±0.4 6.6±1.3 連接密度 (1/mm3) 137+15 470±114 198±29 339±81 向異性程度 1.68+0.008 1.29+0.02 1.54+0.12 1.34+0.03

5 第4表：遠端股骨骨骺處的小樑骨特徵(平均值±8£皿) 雄性WT 雄性ΚΟ 雌性WT 雌性ΚΟ 骨體積部份 (%) 5·1±1·8 2.9±1.7 11.9±7.0 5.4±3.1 小樑厚度 (μιη) 68±1.2 68±2.7 73±7 63+9 小樑區隔 (μιη) 353±16 472+90 296±73 464±98 小樑數目 (1/mm) 2.84±0.12 2.24±0.51 3.46±0.69 2.26+0.57 連接密度 (1/mm3) 5.9±3.7 4.0±6.9 31.5±25.2 15.4+15.1

10 第5表：股骨的中骨幹的皮質骨特徵(平均值±8£1^) 雄性WT 雄性ΚΟ 雌性WT 雌性ΚΟ 骨面積(mm2) 5.1±1.8 2.9±1.7 11.9+7.0 5.4±3_1 皮質厚度(μηι) 68±1_2 68±2.7 73±7 63±9 骨面積/全面積 (%) 353±16 472±90 296±73 464±98 52 201029666 實例15 :肌肉及骨退化疾患之治療 GDF-8之抑制劑，諸如抑制性抗體，係有用於對肌肉質量 增加之治療，且亦有用於骨質疏鬆症之防止及治療。此外， GDF-8之抑制作用可能有用於其他狀況，該狀況中一骨頭的同 5 化效用係所欲的，諸如骨癒合（即，骨折的修復、椎體融合） 之擴大。本發明的抗GDF-8抗體係被用以治療一受試者，其係 發生或具有一確定的肌肉或骨頭退化性疾病。 抗GDF-8抗體對骨頭疾患，如：骨質疏鬆症，治療之功效 ® 係使用建立好的骨質疏鬆症模式來確認。例如，卵巢切除的小 10 鼠以被使用來測試新的骨質疏鬆症藥物療效(Alexander et al. (2001) J· Bone Min. Res. 16: 1665-1673; a&Andersonetal. (2001) J. Endocrinol. 170: 529-537)。相似於人類，這些嚙齒類 在卵巢切除後展現一快速的骨質流失，特別是海綿骨。結果之 評估係基於骨礦物密度、血清及尿液中之骨頭異動的生化標 15 記、骨頭強度以及組織學/組織型態測量。 在研究中，正常及/或免疫缺損的雌性小鼠在12-16週大時 ® 係被切除卵巢，且使其骨質流失四至六週。在此骨質流失期間 後，以一抗GDF-8抗體（諸如My〇29，IP注射）或載劑治療， 進行一至六個月。該治療流程可變化’依不同的劑量之測試或 20 治療療程（諸如：每天、每週或每兩週地注射）„預期的是相 對於完整的（即，未切除卵巢的）、年齡相符者，未經治療的 小鼠（或大鼠）將流失接近10-30%的骨密度。預期的是以抗 GDF-8抗體治療之小鼠將比接受安慰劑之小鼠有川至知％較高 的骨質及骨密度，以及甚至此一骨密度増加係相關於增加的骨 53 201029666 強度，特定地於有一大比例的海綿骨相較於皮質骨之區域β 另一研究的目標係展現抗GDF_8抗體（諸如My〇29)係有 效於防止相關於雌激素(estrogen)缺乏之骨頭質量、微架構及強 度之衰退。因此，該研究具有相似於前述者之設計，除了抗 5 GDF_8抗體之治療係在卵巢切除後被馬上開始，而不是在骨質 流失期間後。預期的是相較於以載劑治療之小鼠，以該抗體治 療之小鼠在卵巢切除後將重大地減少骨質流失。 抗GDF-8之抑制性抗體也被用以防止及/或減少該疾病的 嚴重度及/或症狀。預期的是該抗GDF-8抗體將被以頻繁地（如 10 每天一次）或不頻繁地（如每月一次）之皮下注射方式投予。 治療持續期可介於一個月及幾年之間。 為了測試抗GDF-8抗體於人類之臨床功效，有低骨質之停 經後婦女係經骨密度測試而辨認且被隨機分組至一治療組 別。治療組別包括一安慰劑組以及一至三個接受抗體（不同劑 15 量）之組別。個體未來係被追蹤一至三年以評估骨頭異動的生 化標記、骨礦物密度的變化以及脆弱性骨折之發生。預期的是 骨形成作用之生化標記將增加。 該等抗體係被投予以作為唯一的活性化合物或與另一或 合物或組成物一起投予。當被投予以作為唯一的活性化合物或 20 與另一或合物或組成物一起投予之時，該劑量係較佳地介於約 1 pg/kg及20 mg/kg之間，依照該症狀之嚴重度以及疾病的進 程。該適當的有效劑量係由一治療的臨床醫師來選自於以下範 圍：1 pg/kg及 20 mg/kg、1 pg/kg及 10 mg/kg、1 pg/kg及 1 mg/kg、 10 pg/kg及 1 mg/kg、10 gg/kg及 100 pg/kg、lOOpg/kg及 1 mg/kg， 54 201029666 以及500 pg/kg及1 mg/kg。例示的治療療程及結果係摘要於第6 表中。 第6表：雎床案例的實例 病患編號 治療前的狀態 治療療程 結果 1 病患1 無臨床症狀，停 經後及/或60歲 以上 0.01-1 mg/kg 每兩週地共 4-24 週 維持及/或肌肉/ 骨質之増加 病患2 輕微的臨床症 狀，肌肉消痩及 /或骨頭流失 0.01-20 mg/kg 每週地共4或更 多週 維持及/或肌肉/ 骨質之増加 病患3 骨質疏鬆症晚 期 0.01-20 mg/kg 每週兩次共6或 更多週 臨康^症狀之改 善，維持及/或 肌肉/骨質之增 加 病患4 嚴重的肌肉及 骨頭流失 0.01-20 mg/kg 每天地共6或更 多週 臨床症狀之改 善，症狀嚴重度 之減輕及/或肌 増加 5 實例16 :代謝性疾患之治療 GDF-8之抑制劑，諸如抑制性抗體，係有用於代謝性疾串 ® 之治療，諸如：第二型糖尿病、缺失的葡萄糖耐受性、代謝性 症候群（如，X症候群）、創傷（諸如，燒傷或氮不平衡）引起 的騰島素抗性，以及脂肪組織疾患（諸如，肥胖）。本發明之 抗GDF-8抗體係被用以治療—受試者，其係發生或具有—確— 的代謝性疾病。 抗GDF-8抗體對代謝性疾病，如：第二型糖尿病及/戋肥 胖，治療之功效係使用建立好的鼠類肥胖、胰島素抗性及第二 15 型糖尿病模式包括：ob/ob、db/db以及帶有致死黃色突變的。 55 201029666 系’來確認。胰島素抗性也可藉由高脂或高卡路里飼養某些品 系小鼠來引發’包括C57BL/6J。相似於人類，這些嚆齒類發展 肤島素抗性、高胰島素血症、血脂異常以及葡萄糖恆定衰敗導 致尚血糖。結果之評估係基於血清的葡萄糖、胰島素及脂質測 5 量。改善的胰島素敏感性之測量可藉由胰島素耐受性測試及葡 萄糖耐受性測試來測定。更敏感的技術可包括血糖正常的胰島 素注入之使用來評估血糖控制及胰島素敏感性之改善。此外， 該技術將允許對主要的葡萄糖儲存組織（肌肉、脂肪及肝臟） 之角色作一定量評估，於改善的血糖控制中。 0 1〇 在一研究中，以一抗GDF-8抗體（諸如Myo29 , IP注射） 或載劑之治療係被進行一至六個月。該治療流程可變化，依不 同的劑量之測試或治療療程（諸如：每天、每週或每兩週地注 射）。預期的是相較於接受安慰劑之小鼠，該以抗〇〇1?_8抗體治 療之小鼠將有更高的葡萄糖攝取、增加的糖解作用及肝糖合 15 成、較低的游離脂肪酸及三酸甘油脂於血清中。 抗GDF-8之抑制性抗體也被用以防止及/或減少該疾病的 嚴重度及/或症狀。預期的是該抗GDF_8抗體將被以頻繁地（如 · 每天一次）或不頻繁地（如每月一次）之皮下注射方式投予。 治療持續期可介於一個月及幾年之間。 2〇 , 為了測試抗GDF-8抗體於人類之臨床功效，處於第2型糖尿 病獲此危險者係經辨認且被隨機分組至一治療組別。治療組別 包括一安慰劑組以及一至三個接受抗體（不同劑量）之組別。 個體未來係被追蹤一至三年以評估葡萄糖代謝的變化。預期的 是接受治療的個體將展現改善。 56 201029666 該等抗體係被投予以作為唯一的活性化合物或與另一或 合物或組成物一起投予。當被投予以作為唯一的活性化合物或 與另一或合物或組成物一起投予之時，該劑量係較佳地介於約 1 pg/kg及20 mg/kg之間，依照該症狀之嚴重度以及疾病的進 5 程。該適當的有效劑量係由一治療的臨床醫師來選自於以下範 圍 1 pg/kg及 20 mg/kg、1 pg/kg及 10 mg/kg、1 pg/kg及 1 mg/kg、 10 pg/kg及 1 mg/kg、10 pg/kg及 100 pg/kg、100pg/kg及 1 mg/kg， 以及500 pg/kg及1 mg/kg。例示的治療療程及結果係摘要於第7 參 中。 第7表：雄床案例的實例 病患編號 ] 治療前的狀態 治療療程 結果 病患1 無臨床症狀、第 二型糖尿病家 族史 001-1 mg/kg 每4週地共48週 第二型糖尿病 之防止 病患i 輕微的X症候 群臨床症狀 0-01-20 mg/kg 每週地共4或更 多週 改善的胰島素 耐受性以及葡 萄糖代謝，以及 較低的血壓 病患^~~ 第二型糖尿病 晚期 U.01-20 mg/kg 每週兩次共6或 更多週 臨床症狀之改 善，症狀嚴重度 之減輕及/或肌 肉/體脂肪比例 之增加 病患4 — 嚴重的胰島素 抗性及/肥胖 0 01-20 mg/kg 每天地共6或更 多週 臨床症狀之改 善，症狀嚴重度 之減輕及/或體 脂肪之減少 57 201029666 在載述於本說明書中的參考資料之整體教示下，本說明書 係最完全地被了解，全部的參考資料之整體因此被納入參考。 本說明書中的具體例係提供本發明的具體例之例示且不能被 用以限制本發明的範疇。熟習本項技藝者認知到許多其他具體 5 例係被包含於本請求的發明中以及所企求的係本說明書及實 例係被視為僅是例適性的，本發明的真正範圍及精神係被指出 於隨後的申請專利範圍中。 【圖式簡半說明】 第1圖呈現生物素標記的（biotinylated) GDF-8及BMP-11結 © 10 合至ActRIIB受器而有一ED50為15 ng/ml及40 ng/ml，個別地。 第2圖呈現本發明的scFv片段對GDF-8結合至ActRIIB受器 之抑制作用。如圖示，該等Myo29、Myo28及Myo22的scFv之IC50 係2.4 nM、1.7 nM及60 nM，個別地。 第3A及3B圖呈現Myo29與10 ng/ml生物素標記的GDF-8或 15 BMP-11之預培育（preincubation)在ActRIIB結合檢定中抑制了 GDF-8或BMP-11 結合至ActRIIB，其IC5。係0.2-0·4ηΜ。 第4Α圖展現基準狀況，即，GDF-8、BMP-11以及促進素 © (activin)對報導基因活性之誘導作用。 第4B及4C圖呈現Myo29以一劑量反應性（dose-responsive) 20 方式減低GDF-8活性，有一IC5G係15-30 ng/m卜且抑制BMP-11 的生物活性至相同程度。 第4D圖例示Myo29不影響促進素的活性於此檢定中。 第5圖呈現Myo22、Myo28及Myo29之抗原決定基定位 (epitope mapping)結果。該Myo29的抗原決定基係經定位介於成 58 201029666 熟GDF-82的胺基酸72及88之間；Myo22是介於胺基酸1及44之 間；Myo28則是介於胺基酸1及98之間。 第6圖展現Myo29抗原決定基之取代分析（substitution analysis)的結果。成熟 GDF-8 中的殘基(residue)Lys-78、Pro-81 5 以及Asn-83對於Myo29結合至GDF-8係重要的。 第7圖描述以Myo29及Myo28進行一免疫沉澱作用實驗之 結果。來自表現有GDF-8之CH0細胞的條件化培養基 (conditioned medium) ’該GDF-8係經35S-甲硫酸胺/半胱胺酸標 〇 記，該條件化培養基係被用於與Myo29或Myo28之免疫沉澱作 10 用。該免疫沉澱作用接著藉由SDS-PAGE於還原條件下被分 析。於膠體上之帶區（band)係經辨認為成熟的GDF-8、GDF-8原 . 胜肽以及未加工的GDF-8。 第8圖描述一藥物動力學研究之結果，其中C57B6/SCID小 鼠接受一 1 mg/kg劑量之以單次靜脈内（iv)或腹腔内（IP)投予之 15 Myo29。Myo29呈現約一星期長之延長的終半衰期以及低廓清 率約1 ml/hr/kg。在IP注射後之經吸收的部分係約77%。 Φ 第9圖呈現每星期經多種Myo29劑量（60、10及1 mg/kg)， 或載體(PBS)，處理之雄性C57B6/SCID小鼠的四頭肌質量之比 較。以10及60 mg/kg劑量位準之Myo29處理四星期，導致統計 2〇 上有意義的肌肉質量增加為19%及23%，個別地。 第10A及10B圖呈現每星期經多種My〇29劑量（10、5、2.5 及1 mg/kg)或PBS處理四星期之雌性CB17 SCID小鼠的腓腸 肌、四頭肌質量。相較於載體對照組，以My〇29處理之小鼠的 肌肉質量係増加10至20%。 59 201029666 第11A及11B圖展現每星期經多種Myo29劑量（10、5、2_5 及1 mg/kg)或PBS處理十二星期之雌性CB17 SCID小鼠的腓腸 肌、四頭肌質量。以Myo29處理之小鼠的肌肉質量係增加12至 28%範圍。 5 第12圖呈現每星期經Myo29 (10及5 mg/kg)或PBS處理十 二星期之雌性CB17 SCID小鼠的前肢肌肉強度，藉由一抓握強 度計測量。以5及10 mg/kg的Myo29處理之小鼠的前肢強度係增 加17%及23%，個別地。 【主要元件符號說明】 (無） 60 201029666 序列表 <110> Wyeth

Cambridge Antibody Technology <120>抗GDF-8之中和抗體及其用途 <130> 8702.020-304 <160〉 54

< 170> Patentln version 3.1 <210 1 <211> 786 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 1 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtga gagaatgggg 300 ccctgtactg gtggaagctg ctacgacacc cttggcaact ggggccgggg caccctggtc 360 accgtctcga gtggaggcgg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggaagtgca 420 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 480 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 540 cttccaggcg cggcccccaa actcctcatc aggggtaatg gcaatcggcc ctcaggggtc 600 cctgaccgat tctctgtctc caagtctggc tactcagcct ccctggccat cactgggctg 660 cagcctgccg atgagggtgt ttattactgc cagtcctatg acagcagtct gagtggttcg 720 201029666 aaggtgttcg gccaagggac caagctgacc gtcctaggtg cggccgcaca tcatcatcac 780 catcac 786

<210> 2 <211> 262 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 2

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Glu Arg Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly 100 105 110

Asn Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu 130 135 140

Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie 145 150 155 160

Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 165 170 175

Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu lie Arg Gly 180 185 190

Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Val Ser Lys 195 200 205 2 201029666

Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Pro Ala Asp 210 215 220

Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser 225 230 235 240

Lys Val Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala 245 250 255

His His His His His His 260 <210〉 3 <211> 372 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 3

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtga gagaatgggg 300 ccctgtactg gtggaagctg ctacgacacc cttggcaact ggggccgggg caccctggtc 360 accgtctcga gt 372

<210〉 4 <211> 124 <212〉PRT <213 > 現代人（Homo sapiens) <400> 4 3 201029666

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Tip Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Glu Arg Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly 100 105 110

Asn Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210〉 5 <211> 336 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 5 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 120 cttccaggcg cggcccccaa actcctcatc aggggtaatg gcaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctgtctc caagtctggc tactcagcct ccctggccat cactgggctg 240 cagcctgccg atgagggtgt ttattactgc cagtcctatg acagcagtct gagtggttcg 300 aaggtgttcg gccaagggac caagctgacc gtccta 336 201029666

<210〉 6 <211> 112 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 6

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 1 5 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Arg Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Val Ser Lys Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Pro Ala Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95

Leu Ser Gly Ser Lys Val Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

<210> 7 <211> 774 <212〉DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 7 caggtcacct tgaaggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 201029666

ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acagtctgtg 420 ctgacgcagc cgccctcagt gtctggggcc ccagggcaga gggtcaccat ctcctgcact 480 gggagcagct ccaacatcgg ggacggttat gatgtacact ggtatcagca gcttccagga 540 acagccccca aactcctcat ctatggtaac agtcatcggc cctcaggggt ccctgaccga 600 ttctctggct ccaagtctga cacctctgcc tccctggcca tcactgggct ccaggttgag 660 gatgaggctg attatttctg ccactcctat gacggcagtg tgagtggctg gattttcggc 720 ggagggacca agctgaccgt cctaggtgcg gccgcacatc atcatcacca tcac 774 <210> 8 <211> 258 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 8

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 201029666 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro 130 135 140

Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie Ser Cys Thr 145 150 155 160

Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin 165 170 175

Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Asn Ser His 180 185 190

Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Asp Thr Q 195 200 205

Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Val Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220

Tyr Phe Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser Val Ser Gly Tip lie Phe Gly 225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His 245 250 255

His His

<210〉 9 <211> 363 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 9 caggtcacct tgaaggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtac gaaaggacag 300 7 201029666 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363

<210> 10 <211> 121 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 10

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Tip Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 11 <211> 336

<212> DNA 201029666 <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 11 120 180 240 300 336 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gacggttatg atgtacactg gtatcagcag cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gtcatcggcc ctcaggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctgac acctctgcct ccctggccat cactgggctc caggttgagg atgaggctga ttatttctgc cactcctatg acggcagtgt gagtggctgg attttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt e

<210〉 12 <211> 111 . <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 12

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Φ 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Asp ΊΊιτ Ser Ala Ser Leu Ala lie 丁hr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser 85 90 95

Val Ser Gly Trp lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 9 201029666 100 105 110 <210> 13 <211> 747 <212〉 DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 13 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag tggaggcggc 360 ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggaagtgcac tttcctatga gctgactcag 420 ccaccctcag tgtccgtgtc tccaggacag acagccacca ttacctgctc tggacatgca 480 ctgggggaca aatttgtttc ctggtatcag cagggatcag gccagtcccc tgtattggtc 540 atctatgacg atacccagcg gccctcaggg atccctgggc gattctctgg ctccaactct 600

Q gggaacacag ccactctgac catcagcggg acccaggcta tggatgaggc tgactatttt 660 tgtcaggcgt gggacagcag cttcgtattc ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctaggt 720 gcggccgcac atcatcatca ccatcac 747 <210> 14 <211> 249 <212> PRT <213〉 現代人（Homo sapiens) <400> 14 10 201029666

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 130 135 140

Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser Trp Tyr Gin Gin Gly Ser Gly Gin Ser 165 170 175

Pro Val Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Gly Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205

Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp 210 215 220

Asp Ser Ser Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245 11 201029666 <210〉 15

<211> 351 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 15

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351

<210〉 16 <211> 117 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 16 Θ

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 12 201029666 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 17 <211> 315 <212> DNA ❹ <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 17 tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccaccatt 60 acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gggatcaggc 120 ' cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgggcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actatttttg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300 _ aaggtcaccg tecta 315

<210〉 18 <211> 105 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 18

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Vial Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15 13 201029666

Thr Ala Thr lie Thr Cys Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val 20 25 30

Ser Tip Tyr Gin Gin Gly Ser Gly Gin Ser Pro Val Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Ala Trp Asp Ser Ser Phe Val Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 <210> 19 <211> 774 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 19

gaggtccagt tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ❹ ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agtggaggcg gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggaagtgc acagtctgtg 420 ctgacgcagc cgccctcagt gtctggggcc ccagggcaga gggtcaccat ctcctgcact 480 gggagcagct ccaacatcgg ggacggttat gatgtacact ggtatcagca gcttccagga 540 acagccccca aactcctcat ctatggtaac agtcatcggc cctcaggggt ccctgaccga 600 14 201029666 ttctctggct ccaagtctgg tacctctgcc tccctggcca tcactgggct ccaggctgag 660 gatgaggctg attattactg ccactcctat gacggcagtg tgagtggctg gattttcggc 720 ggagggacca agctgaccgt cctaggtgcg gccgcacatc atcatcacca tcac 774

<210> 20 <211> 258 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) ❹ <400〉 20

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala He Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ❹ Leu Gin Met Asn Ser Leu Aig Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Gin Tip Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro 130 135 140

Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin Arg Val Thr lie Ser Cys Thr 145 150 155 160

Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His Tip Tyr Gin 165 170 175 15 201029666

Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Gly Asn Ser His 180 185 190

Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr 195 200 205

Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp 210 215 220

Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser Val Ser Gly Trp lie Phe Gly 225 230 235 240

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala His His His His 245 250 255

His His

<210> 21 <211> 363 <212〉DN A <213 > 現代人（Homo sapiens) <400〉 21 gaggtccagt tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agatatgtca tcaactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggaatg ggtctcagct attagtgtta ctggtggtag cacggcctac 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga atagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggacag 300 tgggaacggg gaagttacta ctttgactac tggggccggg gaaccctggt caccgtctcg 360 agt 363 <210> 22 <211> 121 16 201029666

<212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 22

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30

Val lie Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val

Arg Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 23 φ <211> 333

<212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 23 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60 tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gacggttatg atgtacactg gtatcagcag 120 cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca gtcatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggt acctctgcct ccctggccat cactgggctc 240 17 201029666 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cactcctatg acggcagtgt gagtggctgg 300 attttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc eta 333

<210〉 24 <211> 111 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 24

Gin Ser Val Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gin 15 10 15

Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly 20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gin Gin Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Leu lie Tyr Gly Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 65 70 75 80

Gin Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ser Tyr Asp Gly Ser 85 90 95

Val Ser Gly Trp lie Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110

<210> 25 <211〉 747 <212〉DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 25 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaage ctggggcctc agtgaaggtt 60 201029666 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag tggaggcggc 3 60

❿ ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggaagtgcac tttcctatga gctgactcag 420 ccaccctcag tgtccgtgtc tccaggacag acagccagca ttacctgctc tggacatgca 480 ctgggggaca aatttgtttc ctggtatcag cagaagccag gccagtcccc tgtattggtc 540 atctatgacg atacccagcg gccctcaggg atccctgagc gattctctgg ctccaactct 600 gggaacacag ccactctgac catcagcggg acccaggcta tggatgaggc tgactattac 660 tgtcaggcgt gggacagcag cttcgtattc ggcggaggga ccaaggtcac cgtcctaggt 720

gcggccgcac atcaccatca ccatcac 747 <210> 26 <211〉 249 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 26

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie He Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60 19 201029666

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val 130 135 140

Ser Val Ser Pro Gly Gin Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Ala 145 150 155 160

Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser Tip Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 165 170 175

Pro Val Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro 180 185 190

Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie 195 200 205

Ser Gly Thr Gin Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Trp 210 215 220

Asp Ser Ser Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 225 230 235 240

Ala Ala Ala His His His His His His 245

<210〉 27 <211> 351 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 27 caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 20 201029666

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagacgag 300 aactgggggt tcgacccctg gggccaggga accctggtca ccgtctcgag t 351 <210> 28 <211> 117 <212〉PRT

<213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 28

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp "Thr Ala Vd Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 21 201029666

<211> 315 <212〉DN A <213 > 現代人（Homo sapiens) <400〉 29

tcctatgagc tgactcagcc accctcagtg tccgtgtctc caggacagac agccagcatt 60 acctgctctg gacatgcact gggggacaaa tttgtttcct ggtatcagca gaagccaggc 120 cagtcccctg tattggtcat ctatgacgat acccagcggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacagcc actctgacca tcagcgggac ccaggctatg 240 gatgaggctg actattactg tcaggcgtgg gacagcagct tcgtattcgg cggagggacc 300 aaggtcaccg tecta 315

<210> 30 <211> 105 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 30

Ser Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gin 15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val 20 25 30

Scr TYp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Vial Leu Val lie Tyr 35 40 45

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gin Ala Met 65 70 75 80 22 201029666

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Ala Tip Asp Ser Ser Phe Val Phe 85 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105

<210> 31 <211> 5 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens)

<400 31

Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210〉 32 <211> 17 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 32

He lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gin Lys Phe Gin 15 10 15

Gly <210> 33 <211> 8 <212〉PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 33 23 201029666

Asp Glu Asn Trp Gly Phe Asp Pro 1 5

<210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 34

Ser Gly His Ala Leu Gly Asp Lys Phe Val Ser 1 5 10

<210> 35 <211> 7 <212> PRT <213 > 現代人（Homo sapiens) <400> 35

Asp Asp Thr Gin Arg Pro Ser 1 5

<210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 36

Gin Ala Trp Asp Ser Ser Phe 1 5 24 201029666

<210> 37 <211> 5 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 37

Arg Tyr Val lie Asn 1 5

<210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 38

Ala lie Ser Val Thr Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val Arg 15 10 15

Gly

<210〉 39 <211> 12 <212> PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 39

Gly Gin Trp Glu Arg Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 25 201029666 <210> 40 <211> 14

<212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 40

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asp Gly Tyr Asp Val His 1 5 10

<210> 41 <211> 7 <212> PRT <213 > 現代人（Homo sapiens) <400> 41

Gly Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5

<210> 42 <211> 6 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 42

His Ser Tyr Asp Gly Ser 1 5 <210> 43 <211> 5 26 201029666

<212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 43

Ser Tyr Ala Met Ser 1 5

<210> 44 <211> 17 <212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 44

Ala lie Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210〉 45 <211> 15 <212〉PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 45

Met Gly Pro Cys Thr Gly Gly Ser Cys Tyr Asp Thr Leu Gly Asn 1 5 l〇 15 <210> 46 <211> 14 27 201029666

<212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 46

Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10

<210> 47 <211> 7 <212> PRT <213 > 現代人（Homo sapiens) <4〇〇> 47

Gly Asn Gly Asn Arg Pro Ser 1 5

<210> 48 <211> 12 <212〉PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 48

Gin Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Lys Val 1 5 10 <210> 49 <211> 109

<212〉PRT <213> 現代人（Homo sapiens) 28 201029666 <400〉 49

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp lie 20 25 30 lie Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45

Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin lie lie Tyr Gly 85 90 95

Lys lie Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105

<210> 50 <211> 320 <212> DNA <213> 現代人（Homo sapiens) <400> 50 gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag gagcttcaag 60 ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg 120 cctggaaggc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac 180 aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct atctgagcct gacgcctgag cagtggaagt 240 cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg 300 cccctacaga atgttcatag 320 29 201029666

<210> 51 <211> 106 <212〉PRT <213〉現代人（Homo sapiens) <400〉 51

Gly Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15

Glu Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp 20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn 50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys 65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105

<210> 52 <211> 992 <212> DNA <213〉現代人（Homo sapiens) <400> 52 cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60 gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120 ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180 gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240 30 201029666

acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300 aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360 cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420 aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480 acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540 gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600 agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660 aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga 720 tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780 ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840 tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900 agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc 960 agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 992

<210> 53 <211> 330 <212> PRT <213> 現代人（Homo sapiens) <400〉 53

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 31 201029666

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80

Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Aig Glu 165 170 175

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 32 201029666

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys . 325 330 <210> 54 <211> 6 <212〉PRT <213> 任何 <220〉 <221> MISCFEATURE <222> (2)..(3) <223>任何胺基酸

A > <220> <221 > MISCFEATURE <222> (5)..(5) <223>任何胺基酸 Φ <400〉 54

Lys Xaa Xaa Pro Xaa Asn 1 5 33

Claims (1)

1. 201029666 七、申請專利範圍： 1. 一種經單離的抗體，其包含一選自於由以下所構成的群 組之胺基酸序列： a)序列辨認編號：2; 5 b)序列辨認編號：43、序列辨認編號·· 44 ;序列辨 認編號：45、序列辨認編號：46 ;序列辨認編號：47、 及序列辨認編號：48 ; c)序列辨認編號：43、序列辨認編號：44 ;序列 辨認編號：45、序列辨認編號：46 ;序列辨認編號：47 10 及序列辨認編號：48，其中序列辨認編號：43、序列辨 認編號：44 ;序列辨認編號：45、序列辨認編號：46 ; 序列辨認編號：47或序列辨認編號：48中一或多個胺基 酸藉由被具有相似電荷、疏水性或立體化學的特徵的相 關胺基酸所取代而經修飾； 15 d)序列辨認編號：4 ;以及 e)序列辨認編號：6。 2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含人類的 架構序列。 3. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係1801或 20 IgG4。 4. 如申請專利範圍第2項之抗體，其中該架構的胺基酸序 列係經修飾以減低或改變作用體(effector)功能，其中該 架構包含序列辨認編號：53，且其中序列辨認編號：53 在對應於胺基酸117或胺基酸120處的殘基處經修飾。 1 201029666 5.如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體係IgG15l4 IgGlK。 6. —種藥學組成物，其包含如申請專利範圍第1項之抗體 及一藥學上可接受的賦形劑。 7. 如申請專利範圍第6項之藥學組成物，其係用於治療肌 肉疾患、神經肌肉疾患及骨退化疾患。

   10 8. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，，其係用於治療 肌肉營養不良、Duchenne’s肌肉營養不良、肌肉萎縮、 器官萎縮、腕隧道症候群、遺傳性阻塞性肺部疾病、少 肌症、惡病質、肌肉消痩症候群以及肌萎縮性脊髓側索 硬化症。 9. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療 Duchenne’s肌肉營養不良。 10. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療一 15 疾患選自於：肥胖及脂肪組織疾患。 11. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療一 疾患選自於：X症候群、缺失的葡萄糖耐受性、創傷引 起的胰島素抗性以及第2型糖尿病。 12. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療一 20 疾患選自於：骨關節炎及骨質疏鬆症。 13. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療第2 型糖尿病。 14.如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療肥 胖。 2 201029666 15. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其係用於治療受 損的肌肉。 16. 如申請專利範圍第15項之藥學組成物，其中該受損的肌 肉係心肌。 5 17.如申請專利範圍第15項之藥學組成物，其中該受損的肌 肉係橫膈。 18. 如申請專利範圍第7項之藥學組成物，其中該抗體係被 以一有效劑量投予，該有效劑量係選自於：1 Kg/kgS20 mg/kg、1 pg/kg至 10 mg/kg、1 pg/kg 至 1 mg/kg、10 pg/kg 10 至 1 mg/kg、10 pg/kg至 100 pg/kg、lOOpg/kg至 1 mg/kg， 以及 500 pg/kg至 1 mg/kg。 19. 一種經單離的核酸，其編碼如申請專利範圍第1至5項中 任一項之抗體。 20. 如申請專利範圍第19項之核酸，其中該核酸包含一序列 15 辨認編號：1、序列辨認編號：3及序列辨認編號：5之 核苷酸序列。 21. —種表現載體’其包含如申請專利範圍第19項之核酸。 22. —種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第21項之載體。 23. —種製備如申請專利範圍第1項之抗體的方法，其中該 20 方法包含： (a)提供一編碼一可變部位之核酸序列的起始匯 集，該核酸匯集係包括一欲被取代之CDR3或缺乏一 CDR3編碼區域； (b)令該匯集與一供體核酸組合，該供體核酸編碼一 201029666 實質地如載述於序列辨認編號：η之胺基酸序列，其中 η係一從43至48之整數，使得該供體核酸係經插入該匯 集之CDR3區域於是提供一編碼一可變部位之核酸序列 的產物匯集； (c) 表現該產物匯集之核酸； (d) 選擇一對於GDF-8特異之特異的抗原-結合片 段；以及

   (e)回收該特異的抗原_結合片段或編碼該結合片段 之核酸。 10 15 24. —種辨認會抑制、中和或減少GDF 8之生物活性的化合 物之方法，其包含： (a) 製備一第一結合混合物，其包含如申請專利範圍 第1項之抗體以及GDF-8 ; (b) 測量該第一結合混合物中該抗體與gd F - 8之間 的結合； (c) 製備一第二結合混合物，其包含該抗體、 GDF-8、一測試化合物；以及 (d) 測量該第二結合混合物中該抗體與GDF_8之間 的結合。 2〇 25 .一種如申請專利範圍第1項之抗體之用途，其係用於— 醫藥之製備，該醫藥係用於使肌肉強度或質量增加。 26· —種如申請專利範圍第丨項之抗體之用途，其係用於一 醫藥之製備’該醫藥係用於使小樑骨密度增加。 種如申清專利範圍第1至5項中任一項的抗體之用 4 201029666 途，其係用於一醫藥之製備，該醫藥係用以治療或防止 哺乳類中至少一肌肉、骨頭或葡萄糖恆定之疾患。 28. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該哺乳類係人類。 29. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該疾患係一神經肌 5 肉疾患。 30. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該疾患係肌肉營養 不良、Duchenne’s肌肉營養不良、肌肉萎縮、器官萎 縮、腕隧道症候群、遺傳性阻塞性肺部疾病、少肌症、 惡病質、肌肉消痩症候群或肌萎縮性脊髓側索硬化症。 10 31.如申請專利範圍第27項之用途，其中該疾患係肥胖或脂 肪組織疾患。 32.如申請專利範圍第27項之用途，其中該疾患係X症候 群、缺失的葡萄糖耐受性、創傷引起的胰島素抗性或第 2型糖尿病。 15 33.如申請專利範圍第27項之用途，其中該疾患係骨關節炎 或骨質疏鬆症。 34. —種如申請專利範圍第1至5項中任一項的抗體之用 途，其係用於一用於以下至少一者之醫藥的製備：於一 哺乳類中之(a)肌肉受損之修復，（b)增加肌肉質量或強 20 度，（c)增加小樑骨密度，以及(d)增加葡萄糖耐受性。 35. 如申請專利範圍第27項之用途，其中該受損的肌肉係心 肌或橫膈。 36. 如申請專利範圍第27至35項中任一項之用途，其中該抗 體係被以一有效劑量投予，該有效劑量係選自於：1 201029666 pg/kg 至 20 mg/kg、1 pg/kg 至 10 mg/kg、1 pg/kg 至 1 mg/kg、10 pg/kg 至 1 mg/kg、10 pg/kg 至 100 pg/kg、 100pg/kg至 1 mg/kg，以及500 pg/kg至 1 mg/kg。