TR201802122T4 - HMGB1 fragmanı kullanarak kardiyak infarksiyonun tedavisine yönelik yeni yöntem. - Google Patents

Abstract

Bir HMGB1 proteininin bir parçasından oluşan uygun bir uzunluğa sahip olan bir fragman peptidi sentezlenmiştir ve peptidin miyokard infarktüsü üzerinde terapötik etkiler gösterdiği ortaya konmuştur.

Description

TARIFNAME HMGB1 FRAGMANI KULLANARAK KARDIYAK INFARKSIYONUN TEDAVISINE YÖNELIK YENI YÖNTEM Teknik Saha Mevcut bulus, miyokard infarktüsünün tedavisinde kullanilmaya yönelik yeni farmasötik bilesimler ile ilgilidir, burada bilesim, SEO ID NO: 3'ün amino asit dizisinden olusan bir HMGB1 fragman peptidini içerir.

Teknigin Altyapisi Koroner arter oklüzyonuna bagli kalp kasi nekrozu ile sonuçlanan akut miyokard infarktüsü, yetersiz prognozu olan bir hastaliktir ve Japonya'da ikinci ölüm nedeni olan kalp hastaligina yönelik esas altinda yatan kosuldur. Var olan tedaviler, akut faz kateterizasyonu ve koroner arter baypas ameliyati, miyokard hasarini hafifletir ve ölüm oranini azaltmaya katkida bulunur; bununla birlikte, bloke olmus koroner kan dolasiminin yeniden baslamasi (iskemi-reperfüzyon hasari) durumunda, meydana gelen miyokard hasari gibi problemler vardir. Bu nedenle, daha ileri tedavilerin gelistirilmesi istenir.

Yakin zamanda, hayvan modellerini kullanan temel deneylerde, kemik iligi mezenkimal kök hücre naklinin, nakledilen hücrelerin kurucu kalp kasi hücrelerine dogrudan diferansiyasyonu yoluyla kalp kasinin rejenerasyonu araciligiyla ve ayrica, üretilen sitokinlerin parakrin etkisinden kaynaklanan sol ventrikülerin yeniden yapilanmasinin baskilanmasi araciligiyla miyokard infarktüsünün gelisimini bastirdigi rapor edilmistir.

Mevcut durumda, otolog hücre transplantasyonlarinin çesitli uygulama yollari araciligiyla, klinik çalismalar yürütülür. Bununla birlikte, otolog hücre nakli ile ilgili sorunlar, örnegin hücre toplulugunda, maliyet ve insan gücünün hücre kültürlenmesinde yer alan fiziksel yük gibi sorunlar ve hücre nakiline kadar gerekli olan sürede bir çok sorun çözülmeye devam eder. Bu süre içerisinde, son zamanlarda, hasar gören dokunun hasar gören bölgede doku rejenerasyonunu baslatmak üzere kana kemik iligi pluripotent kök hücrelerini dahil edecek faktörleri serbest birakan bir mekanizmanin var oldugu onaylandi. Kemik iligi kök hücre indükleyici faktörlerin uygulanmasi yoluyla hasar görmüs dokunun in vivo olarak rejenerasyonunu saglayan mekanizmayi kullanan doku rejenerasyonu, rejeneratif tedavide konvansiyonel olmayan yeni bir konsepttir ve insan gücüne gerek duyulmadigi, dengeli beslenmenin mümkün oldugu ve hasarin erken evresinde uygulanmasinin mümkün oldugu konusunda kök hücre kullanan hücre tedavisine kiyasla avantajli olduguna inanilir. Önceki arastirmalarda, mevcut bulusçular, HMGB1 proteinini, kemik iligi pluripotent kök hücrelerini mobilize eden yeni bir faktör olarak tanimlamistir. HMGB1, histon olmayan nükleer proteinin esas bilesenidir ve hasar gören bölgelerde biriken dendritik hücreler, makrofajlar veya nekrotik hücrelerden ekstraselüler olarak salinir ve çesitli hastaliklarla iliskili oldugu onaylanir. Önceki Teknik Belgeleri Bulusun Kisa Açiklamasi Son zamanlarda, serebral infarktüs gibi hastaliklarda hasar gören dokularin, hasar gören bölgede kemik iligi pluripotent kök hücrelerini kana mobilize eden faktörler salarak doku rejenerasyonunu indükledigi bir mekanizmanin var oldugu ve mekanizmanin, hasarin daha fazla genislemesinin önlenmesine katkida bulundugunu onaylanmistir. Mevcut bulusçular, yeni bir kemik iligi pluripotent kök hücre harekete geçirici faktör olarak tanimlanan bir HMGB1 proteinden türetilmis fragman peptitlerini kullanarak miyokard infarktüsüne yönelik yeni terapötik ajanlar gelistirmeyi amaçlarlar.

Mevcut bulusçular, bir hücre göç aktivitesine sahip olan bir HMGB1 proteininin bir fragman peptidini (1-44) hazirlamistir ve miyokard infarktüsü modelinde, ilk kez fragman peptidinin sistemik uygulanmasinin Infarktüs bölgelerinde ve yakinlarindaki PDGFRci-pozitif hücrelerinin birikimini arttirdigini ortaya koymustur. Ayrica, fragman peptidi (1-44) ile uygulanan miyokard infarktüsü modelindeki hayvanlarda kalp fonksiyonunun uzun süreli gelismesi gösterilmistir. Yukaridaki örnek, fragman peptidinin (1-44), in vivo olarak hasar görmüs doku rejenerasyonu indükleme mekanizmasinin kullanilmasi yoluyla doku rejenerasyonunu uyarir ve akut miyokard infarktüsünün gelisimini baskilar. Bu nedenle, mevcut bulusun fragman peptidinin, yetersiz prognozlu insan akut miyokard infarktüsüne yönelik yararli bir terapötik ajan oldugu gösterilir.

Mevcut bulus, miyokard infarktüsünün tedavisinde kullanilmasina yönelik yeni bir farmasötik bilesimi açiklar, burada bilesim, SEQ ID NO: 3'ün amino asit dizisinden olusan bir HMGB1 fragman peptidini içerir.

Spesifik olarak, mevcut bulusçular, peptit sentezi yoluyla, bir HMGB1 proteininin (SEQ Miyokard infarktüsü üzerine terapötik etkinin degerlendirilmesini saglayan fareleri modellemek üzere, üretilen HMGB1 fragmanlarinin her biri uygulanmistir ve fragmanlarin miyokard infarktüsü üzerindeki terapötik etkileri dogrulanmistir.

Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1A, miyokard infarktüsünün olusturulmasindan yedi gün sonra, infarktüs bölgelerinde (INFARCT), sinir bölgelerinde (BORDER) ve infarktüs olmayan bölgelerde (REMOTE) PDGFRoi-pozitif kemik iligi mezenkimal kök hücrelerinin sayisini gösteren bir grafiktir. PDGFRd-pozitif kemik iligi mezenkimal kök hücreleri, negatif kontrol grubuna (CONT; N = 4) kiyasla, fragman peptit (1-44) uygulanan grupta (1-44; N = 4), infarktüs, sinir ve infarktüs olmayan bölgelerin tüm alanlarinda, önemli derecede dahil edilmistir (1-YÖNLÜ ANOVA, *P < 0.05, 1-44 ile karsilastirildiginda).

Sekil 18, bir fragman peptidi (1-44) uygulanan fare sinir bölgesinde immünofloresan boyanmayi gösteren bir fotograftir. Yesil floresan için pozitif olan hücreler, GFP pozitif kemik iliginden türetilmis hücrelerdir ve kirmizi floresan için pozitif olan hücreler, PDGFRd olarak ifade edilen hücreleri gösterir.

GFP ve PDGFRa için pozitif olan hücreler oklarla gösterilir.

Sekil 10, miyokard infarktüsü olusturulmasindan 7 ve 56 gün sonra infarktüs bölgelerinde (INFARCT), sinir bölgelerinde (BORDER) ve infarktüs olmayan bölgelerde (REMOTE) iltihapli sitokin TNFd 'nin, mRNA seviyesini gösteren bir grafiktir. Infarktüslü olmayan bölgelerdeki iltihapli sitokin (TNFoi, IL-1ß) seviyeleri, fragman peptidi (1-44) uygulanan grupta (1-44; N = 4) negatif kontrol grubuna kiyasla (CONT: N = 4) önemli derecede düsüktür (1-YÖNLÜ ANOVA, CONT ile karsilastirildiginda, #P < 0.05 1-44).

Sekil 1D, miyokard infarktüsü olusturulmasindan 7 ve 56 gün sonra infarktüslü bölgeler (INFARCT), sinir bölgeleri (BORDER) ve infarktüs olmayan bölgelerde (REMOTE) iltihapli sitokin lL-1ß'nin, mRNA seviyesini gösterir. Infarktüslü olmayan bölgelerdeki iltihapli sitokin (TNFd, lL-1ß) seviyeleri, fragman peptidi (1-44) uygulanan grupta (1-44; N = 4) negatif kontrol grubuna kiyasla (CONT: N = 4) önemli derecede düsüktür (1-YÖNLÜ ANOVA, CONT ile karsilastirildiginda, #P < 0.05 1-44).

Sekil 1E, negatif kontrol grubu ve fragman peptidi (1-44) uygulanan grupta, sol ventriküler ejeksiyon fraksiyonu (EF), sol ventriküler diyastol sonu çapi (DD) ve sol ventriküler sistol sonu çapi (DS), miyokard infarktüsü olusturulmasindan 56 gün sonrasini gösteren bir grafiktir.

Bulusun Yürütülmesine Yönelik Modlar Mevcut bulus, miyokard infarktüsünün tedavisinde kullanilmaya yönelik bir farmasötik bilesim saglar; bu bilesim, SEQ ID NO: 3 amino asit dizisinden olusan bir HMGB1 fragman peptidini içerir. Söz konusu HMGBl fragman peptidi bir hücre göçünü uyarici aktiviteye sahiptir.

Mevcut bulusta, bir hücre göçünü uyarici aktivite, hücre göçünü uyaran aktivite ile refere edilir. Ayrica burada, bir hücre göçünü uyarici aktivite, bir hücre göçünü indükleyici aktivite veya bir hücre çekici aktivite olarak ifade edilir.

Mevcut bulusun farmasötik bilesimi, herhangi bir bölgeye uygulanabilir/eklenebilir.

Diger bir deyisle, bilesim, infarktüs bölgesi disindaki bir bölgeye veya kana gibi, rejenerasyona ihtiyaç duyan bir miyokard infarktüsü bölgesi gibi, hangi bölgeye uygulandigina bakilmaksizin etkilerini gösterebilir. Örnegin, bilesimin, uygulanmasi/eklenmesi durumunda, hücreler, uygulama/ekleme bölgesine veya yakin bölgelerine dahil edilir, böylece lezyonun rejenerasyonunu indükler veya tesvik eder.

Ayni zamanda, örnegin, bilesimin bir infarktüs bölgesine veya onun yakinina uygulanmasi/eklenmesi durumunda, hücreler infarktüs alanina dahil edilir, böylece enfarktüs alaninin rejenerasyonunu indükler veya tesvik eder. Ayrica, örnegin, bilesimin, rejenerasyon ihtiyaci duyan bir doku disindaki bir dokuya uygulanmasi/eklenmesi durumunda, kemik iligi hücreleri, periferik dolasim yoluyla rejenerasyon ihtiyaci duyulan bölgeye kemik iliginden mobilize edilir ve böylece rejenerasyonu indükler ya da tesvik eder. Burada, ayrica, "periferik dolasim", "kan dolasimi" veya "periferik dolasim kan dolasimi" olarak adlandirilir.

Rejenerasyona ihtiyaç duyan bir doku haricindeki bir dokuya uygulamak, rejenerasyona ihtiyaç duyan bir bölgede (rejenerasyona ihtiyaci olan bir bölge disinda bir bölgeye) uygulanmayi refere eder. Buna göre, ayrica, "rejenerasyona ihtiyaç duyan bir doku disinda bir doku“ su sekilde refere edilebilir: rejenerasyona ihtiyaç duyan bir doku disindaki bir bölge; rejenerasyona ihtiyaç duyan bir bölge disindaki bir site; rejenerasyona ihtiyaç duyan bir dokudan uzak bir bölge; rejenerasyona ihtiyaç duyan bir bölgeden uzak bir bölge; rejenerasyona ihtiyaci duyan bir bölgenin distalindeki bir bölge; rejenerasyona ihtiyaç duyan bir dokunun distalindeki bir doku; distal bir bölge; veya distal bir doku.

Dolayisiyla, mevcut bulusun bilesimi, farmasötik ajanlarin vücudun disindan dogrudan uygulanmasi zor olan dokulari yenilemek üzere etkili bir sekilde kullanilir.

Rejenerasyona ihtiyaç duyan bir doku haricindeki doku örnekleri, kari dokulari, kas dokulari, subkütan dokular, deri içi dokular, karin boslugu ve benzerlerini içerir.

Mevcut bulusta, göç etmek üzere uyarilmis hücreler veya kemik iliginden periferik kana mobilize edilen hücreler, farklilasmamis hücreleri ve farklilasma evrelerindeki hücreleri içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Mevcut bulusta, göç etmek üzere uyarilan hücreler veya kemik iliginden periferik kana mobilize edilen hücreler, kök hücreler, kök olmayan hücreler ve benzerlerini içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Kök hücreler, dolasim kök hücrelerini ve dolasim disi kök hücrelerini içerir. Dolasim disi kök hücreler, örnegin, bir dokuda bulunan kök hücrelerdir. Dolasim kök hücreleri, örnegin, kan dolasim kök hücreleridir.

Ayrica, göç etmek üzere uyarilan hücreler veya kemik iliginden periferik kana mobilize edilen hücreler, kemik iliginden türetilmis hücreler ve hematopoietik kök hücreler içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Mevcut tarifnamede, "hematopoietik kök hücreler", alyuvarlar, trombositler, mast hücreleri ve dendritik hücreler gibi kan hücrelerine ayrim yapabilen kök hücreleri ve nötrofiller, eozinofiller, bazofiller, Ienfositler, monositleri, makrofajlari ve benzerlerini içeren beyaz kan hücreleridir. Bunlarin markörlerinin, insanlarda CD34-pozitif ve CD133-pozitif, farede CD34-negatif, c-Kit-pozitif, Sea-1- pozitif ve soy markörü-negatif oldugu bilinir. Hematopoietik kök hücrelerin, kültür kaplarinda kültürlenmesi durumunda, tek basina kültürlenmesi zordur ve kök hücrelerle birlikte kültürlenmesi gerekir.

Mevcut tarifnamede, "kemik iliginden türetilen hücreler", kemik iliginden kemik iliginin disina mobilize edilen "kemik iligi hücreleri" anlamina gelirken, "kemik iligi hücreleri", kemik iliginde bulunan hücreler anlamindadir. "Kemik iligi hücreleri", kemik iliginin içinde mevcut olan doku öncü hücre popülasyonlarini içeren hücreleri içerir. Ayrica, arindirilmis hücreler içeren hücreler olabilir.

Doku öncü hücreler, kan sisteminden baska belirli bir dokunun hücrelerine farklilasmak üzere tek yönlü bir potansiyele sahip farklilasmamis hücreler olarak tanimlanir ve yukarida belirtildigi gibi, mezenkimal dokulara, epitel dokulara, sinir dokularina, parankimatöz organlarina ve vasküler endotelyuma farklilasma potansiyeline sahip olan farklilasmamis hücreleri içerir. ve lökositler, eritrositler, plateletler, osteoblastlar ve fibrositler gibi türetilmis farklilasmis hücrelerdir veya simdiye kadar kemik iligi mezenkimal kök hücreler, kemik iligi stromal pluripotent kök hücreler veya kemik iligi pluripotent kök hücreler olarak adlandirilan hücreler tarafindan temsil edilen kök hücrelerdir. Burada kullanildigi sekliyle, "kemik iliginden türetilen kök hücreler", kemik iliginden kemik iliginin disina mobilize edilen bulunan kök hücreleri refere eder. Mevcut bulusta, göç etmek üzere uyarilan hücreler veya kemik iliginden periferik kana mobilize edilen hücreler "kemik iliginden türetilen kök hücreler" içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. "Kemik iligi hücreleri" ve "kemik iliginden türetilen hücreler", kemik iligi toplama (kemik iligi hücre toplama) veya periferik kan toplama yoluyla izole edilebilir. "Kemik iligi hücrelerinin" ve "kemik iliginden türetilen hücrelerin" bazilari, kemik iligi toplama (kemik iligi hücre toplama) veya periferik kari toplama yoluyla elde edilen bir monosit fraksiyon kaninin bir hücre kültürü araciligiyla adherent hücreler olarak elde edilirken, hematopoietik kök hücreler birbirine yapisik degildir.

Ayrica, "kemik iligi hücreleri" ve "kemik iliginden türetilen hücreler" mezenkimal kök hücreler içerir ve tercihen osteoblastlara (farklilasmayi indükledikten sonra kalsifikasyon gözlemlenerek tanimlanabilir), kondrositlere (alsi mavi pozitif boyama, safranin O pozitif boyama veya benzerleri ile tanimlanabilir), adipositlere (Sudan Ill pozitif boyama ile tanimlanabilir) ve fibroblastlar, düz kas hücreleri, stromal hücreler ve tendon hücreleri gibi diger mezenkimal hücrelere; ve diger sinir hücreleri, epitel hücreleri (örnegin, epidermal keratinositler ve bagirsak epitel hücreleri, sitokeratin ailesini ifade eder) ve vasküler endotel hücreleri farklilastirma potansiyeline sahiptir.

Farklilastirilacak hücreler, yukaridaki hücrelerle sinirli degildir ve ayrica, karaciger, böbrek ve pankreas gibi parankimatöz organlarin hücrelerini farklilastirma potansiyeli dahil edilir.

Burada, "kemik iligi mezenkimal kök hücreleri", "kemik iligi stromal pluripotent hücreleri" veya "kemik iligi pluripotent kök hücreleri", dogrudan kemik iliginden toplanan veya dolayli olarak diger dokulardan (kari, cilt, yag ve diger dokular) toplanan, adherent hücreler olarak kültür kabinda (plastik veya camdan yapilmis) kültürlenebilen ve çogaltilabilen kemik iliginde bulunan hücrelere refere edilir. Bu hücreler, kemik, kikirdak ve yag gibi mezenkimal dokulara (mezenkimal kök hücreler) veya iskelet kasi, kalp kasi, sinir dokulari ve epitel dokularin (pluripotent kök hücreler) farklilastirma potansiyeline sahip olmasi ile karakterize edilir ve kemik iligi hücrelerinin toplanmasiyla elde edilebilir.

Bununla birlikte, kemik iliginden kemigin disina mobilize edilen "kemik iliginden türetilen kemik iligi mezenkimal kök hücreleri", “kemik iliginden türetilen kemik iligi stromal pluripotent hücreleri" veya "kemik iliginden türetilen kemik iligi pluripotent kök hücreleri", periferik kandan, yag gibi mezenkimal dokulardan, cilt gibi epitel dokulardan veya beyin gibi sinir dokularindan toplanmasi yoluyla elde edilebilen hücrelerdir.

Buna ek olarak, ayni zamanda, bu hücrelerin, toplama isleminden hemen sonra veya bir kez bir kültür kabina yapistirildiktan sonra, canli vücudun bir lezyon alanina uygulanmasi durumunda, örnegin, cildi olusturan keratinositler veya beyini olusturan sinir dokulari gibi epitel dokulara farklilasma potansiyeline sahip olmasi ile karakterize Kemik iligi mezenkimal kök hücreleri, kemik iligi stromal pluripotent kök hücreler, kemik iligi pluripotent kök hücreler veya kemik iliginden kemik iliginin disina dahil edilen bu hücreler, tercihen asagidakilere farklilasabilecek bir potansiyele sahiptir: osteoblastlar (farklilasmayi indükledikten sonra kalsifikasyon gözlemlenmesi yoluyla tanimlanabilir), kondrositler (alsi mavi pozitif boyama, safran O pozitif boyama veya benzerleri ile tanimlanabilir), adipositler (Sudan IIl pozitif boyama veya benzerleri ile tanimlanabilir) ve fibroblastlar, düz kas hücreleri, iskelet kasi hücreleri, stromal hücreler ve tendon hücreleri gibi diger mezenkimal hücreler; sinir hücreleri, pigment hücreleri, epidermal hücreler, saç follikülü hücreler (sitokeratin ailesi, saç keratin ailesi veya benzerlerini ifade eder), epitel hücreleri (örnegin epidermal keratinositler ve bagirsak epitel hücreleri, sitokeratin ailesi veya benzerlerini ifade eder) ve endotel hücreleri; ve ayrica karaciger, böbrek ve pankreas gibi parankimatöz organlarin hücreleri. Bununla birlikte, farklilasmis hücreler yukaridaki hücrelerle sinirli degildir.

Insan kemik iligi hücreleri ve insan kemik iliginden türetilen hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, dogrudan kemik iligi (kemik iligi hücreleri), periferik kan veya yag toplanmasi yoluyla elde edilebilen veya izole edilmis bir monosit fraksiyonunun kültürlenmesi yoluyla adherent hücreler olarak elde edilebilen hücrelerle örneklendirilebilir. Insan kemik iligi hücreleri ve insan kemik iliginden türetilen hücrelere yönelik markörler, örnegin, bunlarla sinirli olmamak üzere, asagidakilerin tümünü veya bazilarini içerir: PDGFRa-pozitif, Lin-negatif, CD45-negatif, CD44-pozitif, CD90-pozitif, Stro-1 -pozitif, CD106-pozitif, CD166-pozitif ve CD31-negatif.

Ayrica, fare kemik iligi hücreleri ve fare kemik iliginden türetilen hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, dogrudan kemik iligi (kemik iligi hücreleri), periferik kan veya yag toplanmasi yoluyla elde edilebilen veya izole edilmis bir monosit fraksiyonunun kültürlenmesi yoluyla adherent hücreler olarak elde edilebilen hücrelerle örneklendirilebilir. Fare kemik iligi hücreleri ve fare kemik iligi türevi hücrelerine yönelik markörler, örnegin, bunlarla sinirli olmamak üzere, asagidakilerin tümünü veya bazilarini içerir: CD44-pozitif, PDGFRd-pozitif, PDGFRß-pozitif, CD45-negatif, Lin- negatif, Sca-1 -pozitif, c-kit-negatif, CD90-pozitif, CD29-pozitif ve FIk-1-negatif.

Mevcut bulusta, göç etmek üzere uyarilmis hücreler , PDGFRor-pozitif hücreleri içerir, ancak bunlarla sinirli degildir. Ek olarak, göç etmek üzere uyarilan PDGFRoi-pozitif hücreler, özellikle sinirli degildir, ancak, tercihen kemik iliginden türetilen PDGFRd- pozitif hücrelerdir. Ayrica, PDGFRG disindaki markörler, CD29-pozitif, CD44-pozitif, CD90-pozitif, CD271-pozitif, CD11b-negatif ve FIk-1-negatifin tümü veya bazilari ile örneklendirilebilir. ancak bunlarla sinirli degildir. PDGFRd-pozitif hücreler, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin, PDGFRd-pozitif kemik iliginden türetilen hücreler, PDGFRa-pozitif kemik iliginden türetilen mezenkimal kök hücreler, PDGFRa-pozitif dokularda (örnegin fibroblastlar ve benzerleri) bulunan doku hücreleri, kemik iligi toplama (kemik iligi hücresi toplanmasi) veya periferik kan toplama yoluyla elde edilen bir monosit fraksiyonunun hücre kültürü araciligiyla adherent hücreler olarak elde edilen PDGFRa-pozitif kemik iliginden türetilen hücreleri içerir.

Mevcut açiklamadaki HMGBi proteini, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin insan- türevi bir HMGBi proteini olarak SEO ID NO: 1'in amino asit dizisini içeren bir protein ve söz konusu proteini kodlayan DNA, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin SEQ ID NO: 2'nin nükleotid dizisini içeren bir DNA'yi içerir.

Mevcut bulusta, "bir hücre göçünü uyaran aktiviteye sahip olan bir HMGB1 fragman peptidi", bir HMGBi proteininin bir bölümünden olusan ve bir hücre göçünü uyarici aktiviteye sahip olan bir peptidi refere eder. Mevcut bulusa ait farmasötik bilesim tarafindan içerilen HMGB1 fragman peptidi, bir hücre göçünü uyarici aktiviteye sahip olan bir fragman peptidi olan HMGBi proteininin (SEQ ID NO: 3), 1 ila 44 pozisyonlarinin amino asit dizisinden olusur.

Mevcut bulusun bir bilesiminin uygulanmasina yönelik yöntemler, oral uygulamayi ve parenteral uygulamayi içerir. Spesifik olarak, parenteral uygulama, bunlarla sinirli olmamak üzere, enjeksiyon, transnazal uygulama, transpulmoner uygulama, transdermal uygulama ve benzerlerini içerir. Enjeksiyon örnekleri olarak, intravenöz enjeksiyon, intramüsküler enjeksiyon, intraperitoneal enjeksiyon, subkütan enjeksiyon ve benzerleri, mevcut bulusa ait bir bilesimi, sistemik veya lokal olarak (örnegin, cilt alti, cilt, cilt yüzeyi, göz yuvarlagi veya palpebral konjunktiva, burun boslugu mukozasi, intraoral mukoza ve gastrointestinal sistem mukozasi, vajinal mukoza/intrauterin mukoza, hasar bölgesi veya benzerleri) uygulamak üzere kullanilabilir.

Mevcut bulusa ait bir bilesimin uygulanmasina yönelik yöntemler, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin intravasküler uygulama (intra-arteriyel uygulama, intravenöz uygulama veya benzerleri), kan uygulamasi, intramüsküler uygulama, subkütan uygulama, intradermal uygulama, intraperitoneal uygulamayi içerir.

Uygulama bölgesinde sinir yoktur ve örnegin, rejenerasyon ihtiyaci duyan bir doku bölgesi veya yakin çevresi, rejenerasyona ihtiyaç duyan dokudan farkli bir bölge veya rejenerasyona ihtiyaç duyan dokudan uzak ve farkli olan bir bölge olabilir. Bölge, örnegin, kanda (arterler, damarlar ve benzerleri), kasta, cilt altinda, ciltte, karin boslugunda veya benzerlerinde bunlarla sinirli kalmaz.

Uygulama yöntemi, hastanin yasina ve semptomlarina göre uygun bir sekilde seçilebilir. Mevcut bulusun bir peptidinin uygulanmasi durumunda, peptidin her bir zaman basina dozaji, bir hastanin vücut agirliginin kilogrami basina 0.0000001 mg ila 1000 mg araliginda seçilebilir. Alternatif olarak, doz, örnegin, hasta vücudu basina salgilayan hücreleri veya peptidi kodlayan DNA ile yerlestirilen gen terapi vektörlerini uygularken, peptit miktari yukaridaki aralikta olacak sekilde uygulanabilir. Bununla birlikte, mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin dozu bununla sinirli degildir.

Mevcut bulusa ait farmasötik bilesim tarafindan içerilen HMGB1 fragman peptidi, peptidi kodlayan bir DNA'yi uygun bir ekspresyon sistemine dahil ederek rekombinant olarak elde edilebilir veya yapay olarak sentezlenebilir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimi alisilmis yöntemlere (örnegin, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) göre formüle edilebilir ve birlikte farmasötik açidan kabul edilen tasiyicilar ve katki maddeleri içerebilir. Örnekler, bunlarla sinirli olmamakla birlikte yüzey aktif maddeler, eksipiyanlar, renklendiriciler, parfümler, koruyucular, dengeleyiciler, tamponlar, süspansiyon ajanlari, izotoniklestirici ajanlar, baglayicilar, parçalayicilar, yaglayicilar, akis arttiricilar ve aroma ajanlarini içerir ve diger yaygin tasiyicilar uygun sekilde kullanilabilir. Spesifik örnekler, hafif anhidrit silik asit, Iaktoz, kristalin selüloz, mannitol, nisasta, karmeloz kalsiyum, karmeloz sodyum, hidroksipropilselüloz, hidroksipropilmetilselüloz, polivinilasetaldietilamino asetat, polivinilpirolidon, jelatin, orta zincir yag asidi trigliserid, polioksietilen hidrojene hint yagi (60), beyaz seker. karboksimetil selüloz, misir nisastasi ve inorganik tuzlari içerir.

Asagida mevcut bulus, örnekler referans alinarak daha detayli olarak açiklanacaktir, ancak bunlarla sinirli olarak yorumlanmamalidir.

HMGB1 protein fragmani peptidinin (1-44) sistemik uygulanmasiyla, terapötik etki, bir akut evre miyokard infarktüsü fare modeli kullanilmasi yoluyla kardiyak fizyoloji, histopatoloji ve moleküler biyoloji araciligiyla kapsamli bir sekilde degerlendirilir.

(Materyaller ve Yöntemler) Kemik iligi hücreleri, üç haftalik farelerin (C57BL6-CAG-GFP transgenik fareler) uyluk kemigi/alt bacak kemiginden toplanmistir ve kemik iligi hücre süspansiyonu, isinlama (10GY) sonrasinda alti haftalik farelerin (C57BL6) kuyruk damarina kemik iligi kimerik fareleri üretmek üzere ( uygulanmistir. Kemik iligi transplantasyonundan altmis gün sonra, sol dördüncü ara torakotomi, sirtüstü pozisyonda genel anestezi altinda gerçeklestirilmistir ve proksimal sol anterior inen koroner arter, genis bir miyokard infarktüsü modeli (sol anterior koroner arter/sirkumfleks oklüzyon modeli) üretmek üzere baglanmistir. HMGBi proteini düsük moleküllü hale getirilirken, HMGB1 proteininin bir fragman peptidi (1-44), kemik iligi mezenkimal kök hücrelerinin dahil edilme aktivitesinin korunmasi göz önüne alinarak gelistirilmistir. Infarktüs (5 tig/, kuyruk damarina bes kez uygulanmistir. Farelere fazla ketamin ve ksilazin uygulanmasi yoluyla ötenazi yapilmistir ve kalpleri toplanmistir. Dokular OCT bilesigine gömüldükten sonra, 5 um kalinliktaki donuk kesitler hazirlanmistir. Immünohistolojik çalismalar, bir anti-fare PDGFRd antikoru kullanilmasi yoluyla asagidaki gibi gerçeklestirilmistir. Birincil antikor olarak PDGFRoi Tavsan Anti-PDGF Reseptör Alfa Antikoru (Abcam, ABG1219) kullanilmistir. ikincil antikor olarak Alexa (555) Keçi Anti-tavsan Antikoru (Moleküler Problar) kullanilmistir ve nükleer boyamaya yönelik 4,6-diamino-2-fenilnodol (DAPI.

Moleküler Problar) kullanilmistir. Fotograflamaya yönelik konfokal lazer tarama mikroskobu (FV300, Olympus) kullanilmistir. Dokuda biriken kemik iliginden türetilen mezenkimal kök hücrelerin sayisi ile ilgili olarak, rasgele seçilen 5 bölümün tüm alanlarinda mevcut GFP ve PDGFRorya yönelik pozitif olan hücrelerin sayisi tespit edilmistir ve ortalama deger hesaplanmistir. Ayrica RNA, RNeasy Kiti (Qiagen) kullanilarak miyokard dokusundan çikarilmistir ve CDNA, Omniscript Ters Transkriptaz (Qiagen) kullanilarak ters transkripsiyon reaksiyonu yoluyla elde edilmistir. Gerçek zamanli PCR, yukarida sözü geçen cDNA'yi sablon olarak kullanarak Gene Amp® PCR Sistemi ile gerçeklestirilmistir ve TNFd ve lL-1ß mRNA seviyeleri, GAPDH mRNA seviyesine oran olarak belirlenmistir. Kardiyak fonksiyonda gelisme, Vivid 7 Ekokardiyografi Sistemi ve 12-MHZ Dönüstürücü (General Electric) kullanilarak sol ventrikül diyastol sonu çapi (LVDd: Dd), sol ventrikül sistol sonu çapi (LVD'Ier: Ds) ve sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF: EF) ölçülmesi yoluyla degerlendirilmistir.

HMGB1 protein fragman peptidin (1-44) sistemik olarak uygulanmasi yoluyla, infarktüs olusumundan sonra 7. günde infarktüs olmayan bölgeler, sinir bölgeleri ve infarktüs bölgelerinin tüm alanlarinda PDGFRa-pozitif kemik iligi kaynakli mezenkimal hücreler önemli derecede dahil edilmistir. (infarktüs olmayan bölge: negatif kontrol; HMGB1 proteininin kismi fragmani (1-44 peptit), 52 ± 11#*, negatif kontrol ile karsilastirildiginda; 32 ± 9 hücre/ mm2, N = 4, # P <0.05) (Sekil 1A). Ayrica, HMGBi protein fragman peptit (1-44) grubunda, infarktüslü olmayan bölgelerde iltihapli sitokinlerin (TNFci, IL-1ß) seviyeleri önemli derecede düsüktür. (TNFci: negatif kontrol, kontrol ile karsilastirildiginda, # P <0.05) (IL-1ß: HMGBI proteini kismi negatif kontrol, 6 ± 1 GAPDH, her biri N = 4, negatif kontrol ile karsilastirildiginda, #P <0.05) (Sekiller , 1D). 56. günde kalbin ultrason muayenesinde miyokard infarktüsünden sonra sol ventrikül sistolik disfonksiyonunun HMGB1 protein fragman peptit (1-44) grubunda (EF: ± 4, negatif kontrol ile karsilastirildiginda, #P <0.05) önemli derecede bastirildigi ortaya çikmistir. Ayrica, sol ventrikül genislemesi HMGB1 protein fragman peptit (1-44) grubunda (DD: HMGB1 protein fragman peptit (1-44) (N = 8), 5.8 ± 0.2 * *, negatif kontrol (N = 16 ), 6.3 ± 0.2 mm, negatif kontrol ile karsilastirildiginda, #P <0.05) önemli derecede bastirilmistir (Sekil 1E).

Mevcut arastirmada, HMGB1 protein fragman peptidinin (1-44) bes gün süreyle uygulanmasinin, infarktüs olusumundan (Sekil 1A, 1B) sonra akut evrede (Gün 7) infarktüs bölgesine ve komsu bölgeye PDGFRa-pozitif kemik iligi mezenkimal kök hücrelerinin dahil edildigi gösterilmistir. Özellikle, fragman peptidinin (1-44) uygulanmasinin infarktüslü olmayan bölgenin miyokard dokusuna PDGFRci-pozitif mezenkimal kök hücrelerin alimini arttirdigi gösterilmistir. Kemik iligi mezenkimal kök hücrelerinin, bir iltihap baskilayici etkisi ve bir doku yenileyici etkisi oldugu bilinir.

Mevcut örnekte, ayni zamanda, iltihaplanma reaksiyonlarini bastirdigi bulunmustur (Sekiller 1C, 1D). Ayrica, HMGB1 fragman peptidinin (1-44) uygulanmasi, sol ventrikül sistolik fonksiyonunun, sol ventrikül genislemesinin ve sol ventriküler yeniden modellemenin siddetlenmesini önemli derecede bastirmistir. Miyokard fonksiyonunun önemli derecede uzun süredir gelismesi gözlenmistir (Sekil 1E).

Endüstriyel Uygulanabilirlik Mevcut bulus, miyokard infarktüsünün tedavisinde kullanilmak üzere PDGFRd-pozitif hücrelerin dahil edilme aktivitesini koruyan bir HMGBt fragman peptidi baz alinir. Bu fragman peptidi, peptit sentezleyiciler kullanilarak kimyasal sentez yoluyla üretilebilir ve böylece, safligi arttirmasi, stabil üretim saglamasi ve peptitlerin farmasötik olarak üretiminde maliyetleri düsürmesi beklenir.

Buna ek olarak, tam uzunlukta HMGB1'in, bir endotoksin türü olan Iipopolisakaritlere (LPS) baglanma aktivitesi oldugu bilinir. Farmasötik maddelerde LPS'nin iz miktarinin dahi kontaminasyonu, atese sebep olur ve genellikle ciddi yan etkilerle sonuçlanir.

Dolayisiyla, farmasötiklerde LPS kontaminasyonu siki bir sekilde düzenlenir. HMGB1'in LPS'ye yakinligi oldugu için, LPS'nin kontaminasyona ugrayan farmasötik maddelerden tamamen ortadan kaldirilmasi zordur. Bununla birlikte, HMGB1'in peptit haline getirilmesi, LPS'ye olan yakinligini azaltir ve bu nedenle farmasötiklerde LPS kontaminasyonunu azaltmasi beklenir. Buna göre, mevcut bulusta belirtildigi gibi PDGFRa-pozitif hücreleri dahil etmeye yönelik kisim içeren bir HMGB1 fragmani kullanarak, miyokard infarktüsünün tedavisine yönelik daha güvenli farmasötik bilesimlerin gelistirilmesi mümkündür.

Mevcut bulusa uygun olarak kullanilan HMGBt fragman peptidinin, rejenerasyona veya buna yakin miyokard infarktüsü bölgesine dogrudan uygulanmasi, infarktüs bölgesinin veya infarktüs ile hasar gören dokunun rejenerasyonunu indükleyebilir veya güçlendirebilir. Ayrica, miyokard infarktüsünün rejenerasyonu, mevcut bulusa uygun olarak kullanilan HMGB1 fragman peptidinin, örnegin intravenöz uygulama araciligiyla rejenerasyona ihtiyaç duyan bölgeden farkli bir bölgeye uygulanmasiyla indüklenebilir veya arttirilabilir. Bunun gibi, mevcut bulus, yaygin olarak genel pratikte uygulanan intravenöz uygulama ile miyokard infarktüsünün tedavisini mümkün kilar; ve böylece, terapötik maddeler rasgele seçilmis konsantrasyonlarda rasgele olacak sekilde birkaç kez güvenlice ve kolaylikla uygulanabilir. Bu gerçek, konvansiyonel terapötik yöntemlerle karsilastirildiginda mevcut bulusun son derece üstün yönlerinden biridir.

Günümüzde, rejeneratif tip veya hücre tedavisi uygulamalarinda, hastalardan türetilen kit kemik iligi pluripotent kök hücreleri, ex vivo olarak kültürlenir ve proliferasyondan sonra tedavilere yönelik kullanilir; bununla birlikte. kültür islemi, hücre bozulmasi (kanserlesme veya bakterilerin, virüslerin ve benzerlerinin kontaminasyonu) riskini tasir, yeterli emniyet kontrolü gereklidir. Bunun aksine, mevcut bulusu baz alan terapötik maddeler, hücreleri vücudun disina çikarma adimini veya manuel islemi dahil etmeyi içermez ve dolayisiyla, nispeten güvenli olduklarina inanilir. Bu gerçek, ayni zamanda, konvansiyonel terapötik yöntemlerle karsilastirildiginda mevcut bulusun üstün yönlerinden biridir.

DIZI LISTESI <110> Genomix Co., Ltd.

Osaka University <120> HMGB1 fragmani kullanilarak kardiyak infarktüs tedavisine yönelik yeni yöntem <130> SIO1P005WOEP <160> 3 <170> Patentln versiyonu 3.5 <210> 1 < 211› 215 < 212› PRT < 213› Homo sapiens <400> 1 <210>2 < 211> 648 < 212> DNA < 213› Homo sapiens <400> 2 <210>3 < 211> 44 QGQBQQGOCG < 212› PRT < 213> Yapay Dizi <220> < 223› Yapay olarak sentezlenmis bir peptit dizisi <400> 3 Met Giy Lya Giy Asp Pro Lys Lys Pro Arg Giy Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe Vai Gin Thr Cys Arg Giu Glu His Lys Lya Lya His Pro Asp Ala Ser Vai Asn Phe Ser Giu Phe Ser Lys Lys PDGFRa- pozitif ve GFP-pozitif hücreler Sinir bölgesi Infarktüs bölgesi Infarktüs olmayan boige Negatifkontrol grubu (n=4) I1-44(n:4) *p<0.05 SEKIL 1A SEKIL 1B SEKIL 1c ÜNegatifkontrolgrubu (n24) .1-44(n:4) *p<0,05 SEKIL 1D

Claims (1)

ISTEMLER

1. Miyokard infarktüsünün tedavisinde kullanilmak üzere farmasötik bir bilesim olup, özelligi, bilesimin SEQ ID NO: 3 amino asit dizisinden olusan bir HMGBl