SU1519522A3

SU1519522A3 - Способ получени пригодных дл оплодотворени половых продуктов у половозрелых рыб в любое врем года

Info

Publication number: SU1519522A3
Application number: SU843827994A
Authority: SU
Inventors: Гулиаш Тамаш; Хорват Анико; Кери Дьердь; Николич Карой; Секе Балаж; Теплан Иштван
Original assignee: Кезпонти Валто-Еш Хительбанк Рт, Инновациош Алап (Инопредприятие)
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-21
Publication date: 1989-10-30
Also published as: IT1178776B; HU189394B; FI81722C; SE8406555L; LU85709A1; HUT35920A; IL73905A0; ES8801084A1; SE461631B; CS262420B2; DK162698C; FR2556970A1; GR82555B; BE901308A; NO168926B; IL73905A; ATA404384A; CS1020984A2; NL8403889A; FI845052L

Abstract

Изобретение относитс к рыбоводству и направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получени у рыб различных видов. Дл этого рыбам в качестве соединени с гормональным действием ввод т нонапептид-C₁-C₄ - алкиламиды или декапептидамиды общей формулы GLP-HIS-TRP-SER-TYR-X₁-X₂-X₃-PRO-X₄, где X₁ - D-PHE, D-TRP, D-ALA, D-LEU, D-SER

X₂ - TRP, PHE, LEU

X₃ - GLN или LEU

X₄ - GLYNH₂ или C₁-C₄-алкил NH₂, или их соли. Соединение ввод т периодически дозами, количество которых составл ет 2-15. Величину доз устанавливают в соотсветствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 табл.

Description

1

(21)3827994/28-13

(22)21.12.84

(31)4457/83

(32)23.12.83

(33)ни

(46) 30.10.89. Бюл. № 40

(71)Кёзпонти Валто-Еш Хитель- банк РТ, Ииновациош Алап (HU)

(72)Тамаш Гулиаш, Анико Хорват, Дьёрдь Кери, Карой Николич, Балаж Сёке и Иштван Теплан (HU)

(53) 639.3.034 (088.8)

(56) Сельское хоз йство за рубежом,

1978, № 1, с. 43-44.

Aquaculture, 1983, № 35, 1985, с. 173-176.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ половых ПРОДУКТОВ У ПОЛОВОЗРЕЛЫХ РЫБ В ЛЮБОЕ ВРЕМЯ ГОДА (57) Изобретение относитс к рыбоводству , направлено на улучшение качества получаемых половых продуктов и на возможность их получени у рыб различных видов. Дл этого рыбам в качестве соединени с гормональным действием ввод т нонапеп- тид - С,-С4.-алкилам1ады или декапеп- тидамиды общей формулы Glp-His-Trp- Ser-Tyr-X -Xj -X -Pro-X., где X - -p-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu, D-Ser; Xj. Trp, Phe, Leu; X, - Gin или Leu; X - Gly NHj или С ,-С((.-алкил NHj, или их соли. Соединение ввод т периодически дозами, количество которых составл ет 2 - 15. Величину доз устанавливают в соответствии с данными, приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или превышает ее в 1,5 раза. 2 Табл.

Кл

Изобретение относитс к рыбоводству , а именно к способу получени половых продуктов у половозрелых рыб в любое врем года, независимо от естественного периода нереста.

Полова активность рыб обоих полов регулируетс выдел ющимис из аденогипофиза гонадотропинами, которые способствуют морфологическому и функцис нальному развитию половых желез ( онлд), их гаметогенетической

( йце- и спермопродуцирующей) де тельности и секреции половых гормонов .

Аденогипофиз обоих полов у рыб выдел ет два одинаковых гонадотро- пина: один носит обозначение FSH (стимулирующий фолликул гормон), другой - LH (лютеинизирующий гормон).

Гонадотропины не специфичны дл полов, так как один и тот же FSH способствует гаметогенетической к

О4

тивностн как у самцов, так и у самок; один и тот же LH возбуждает у особей мужского пола секрецию андро гена, а у особей женского пола - строна или прогестерона, как FSH, так и I.H вл ютс гликопротеинами, которые обладают вндовон специфичностью дл рыб.

Функцию эндокринной системы у ры координирует Г ипофиэ. Кроме тог о, он координирует де тельность эндокринной и нервной систем, в первую очередь через вегетативное клеточное дро, образующее нижнюю часть 1-ипоталамуса.

Г ипофиэ с помощью видовых специфических тропогормонов регулирует также процесс размножени . 3 естественных услови х овул ци у рыб происходит в специфический дл данного конкретного вида среде, ову- л ционно зрела икра рыб выметываетс не самопроизвольно, а находитс в состо нии вынужденного поко вплоть до более или менее продолжительного установлени пригодных дл овул ции условий окружающей среды.

Эта характерна дл рыб адаптаци к услови м размножени регулируетс гипофизом и центральной нервной системой совместно. R таком состо нии поко в кровь рыб выдел етс мало гонадотропина.

Дл возникновени и формировани среды, подход щей дл икрометани , требуетс какой-то отрезок времени (например, поздн осень или начало лета). Это означает, что репродуктивный (воспроизвод щий) механизм регулировани у рыб делает возможной адаптацию процесса размножени внешней окружающей среде. Это регулирование представл ет собой результат координирующей сыгранности функций гипоталамуса и гипофиза.

Выбрасывание некоторых тропогормонов аденогипофиза регулируетс нейрогормонами, которые освобождаютс на идущих к отдельным драм клеток гипоталамуса нервных окончани х тотчас резорбируютс в так называемых портальных капилл рах и попадают с кровью в синус аденогипофиза.

Все известные нейрогормоны вл юс олигопептидами или полипептидами

Нейрог ормоны, стимулирующие секрецию тропогормонов, обозначаютс как высвобождающий фактор (RF);

нейрогормоны, поданл ющие секрецию гормонов, - как ингиПируюп1ИЙ фактор (IF).

Дл всех нейрогормонон отличительным вл етс то, что их действи у .hypophysektomierten животных соответствуют действию, по вл ющемус после введени соответствующего

тропогормона.

Базофильные плоскости гипофиза рыб обладают различи ми обусловленными сезоном: их количество в период икрометани уменьшаетс .

В процессе адаптации к окружаю- дей среде образуютс высвобождаю- 11 1ие гормоны (RH), которые с током крови попадают в гипофиз и там регулируют- выброс тропогормонов в

кровь.

Таким образом, рыбы получают сведени о существовании окружающей среды, пригодной дл икрометани , благодар чему в гипоталамусе регулир тощий лютеииизирующкй гормон - гормон LH/RH - активизирует гипофиз и выброс гонадотропина в кровь, в результате чего возбуж,ааетс процесс овул ции.

Когда рыбами воспринимаетс внешн окружающа среда, обеспечивающа большие возможности дл выживани потомства, то возникают импульсы , которые через органы чувств передаютс эндокринной системе желез,

и этот механизм активизирует наход щуюс в вынужденном состо нии поко репродуцирующую (воспроизвод щую ) систему.

Нейрогормоны чрезвычайно интерспецифичны: LH/RH рыб имеет не такую последовательность, как LH/RH млекопитающих , и оказывает на них такое же малое вли ние, как и LH/RH млекопитающих на рыб.

Использование метода гипофизировани (введение гипофиза рыбам путем инъекции) дает возможность индуцировать искусственное размножение рыб.

Дл гормонального возбуткдени опул ции используют отбираемые у половозрелых или почти половозрелых карпов гипофизы и консервируют последние . Нативные гормоны другого

происхождени не принесли однознач- Hoi o положительного результата.

Г ипофиз карпов примен ют при размножении многочисленных видов рыб.

51

Исключение составл ют чуждые карпо- вым по систематике рыбы, например осетровые, дл стимул ции которых используют гипофизы этих же видов рыб. Гипофизы берут у половозрелых рыб, обезвоживают их с помощью ацетона и высушивают при комнатной температуре в течение 24 ч, затем размельчают в ступке и раствор ют в физиологическом растворе.

Полученный раствор инъецируют в мышечную ткань рыб, а у маленьких рыб и у рыб с более рыхлым м сом инъекцию провод т в брюшную полость

Способ гипофизарных инъекций дает хорошие результаты не во всех случа х. Основна причина этого заключаетс в том, что не всегда известно , в каком состо нии зрелости наход тс рыбы, у которых отбирают гипофизы, поэтому неизвестно и количество содержащихс в них гонадотро- пинов. Гормоны гипофиза карпов действуют только на карпов и на генетически близких к ним по виду рыб, поэтому многочисленные экономически важные виды рыб вообще не могут размножатьс с помощью инъекций гипофиза или размножаютс с незначительной эффективностью.

С помощью гипофизов при условии размножени в большом масштабе достигнуто в насто щее врем только LH-действие, FSH-действие нереализуемо по причине, указанной вьш1е (неизвестно, в каком состо нии поло возрелости наход тс рыбы, у которых берут гипофизы).

Недостаток FSH-действи позвол ет примен ть гипофизирование только дл индукции рыб с овул ционно зрелой икрой.

Кроме того, возможность индуцированного искусственного размножени при использовании гипофиза ограничена отрезком времени, составл ющим естественный период нереста, что ведет к ограниченному использованию производственной мощности.

Получение гипофизов у рыб св зано с уничт эжением потенциально очень ценных и имеющихс в ограниченном количестве производителей, что также вл етс недостатком известного способа.

Известно использование дл получени половых продуктов рыб других соединений, обладающих гормональным

19522

действием и вл ющихс синтетическими лналогами LH/RH-гормонов. Однако получаемые при их использовании ик5 ;

10

.ринки окружены фолликул рной оболочкой , котора преп тствует их оплодотворению и получению нового потомства . Область применени этого способа ограничена карповыми рыбами и и лососем.

0

Целью изобретени вл етс улучшение качества полученных половых продуктов и возможность их получени у рыб различных видов.

5 Поставленна цель достигаетс путем введени в организм половозрелой рыбы новых производных гона- долиберина, так как известно, что выделенные в гипоталамусе рыб гона0 дотропины FSH - LH/RH успешно замен ютс указанными соединени ми. Инъецирование этими соединени ми вызывает развитие спермы и икры, а также овул ц1те).

5 Сущность способа получени пригодных дл оплодотворени половых продуктов у половозрелых рыб в любое врем года состоит в том, что у рыб исследуют половые продукты д икру и сперму и п6 их состо нию устанавливают биологическую зрелость рыб.

Овул ционно зрельпс рыб отбирают, отдел их от незрелых, и ввод т им путем инъекции соединение с гормональным действием, представл ющее собой нонапептид С : 4 ал к ил амиды или декапептидамиды общей формулы

Clp-His-Trp-Ser-Tyr-X, -X -Xj-Pro-X,

где X, -.D-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu,

D-Ser;

Xj - Trp, Phe, или Leu; Xj - Gin или Leu; - X. - GlyNH2 или С,.4-алкил NH.

Рыбам могут быть введены также соли этих соединений.

Соединение ввод т рыбам последовательно дозами, количество которых составл ет от 2 до 15.

Величина дозы, устанавливаема в зависимости от вида соединени , составл ет от 0,1 до 500 мкг/кг веса тела рыбы, при этом величина последней дозы равна величине предьщущей

5 или превьш1ает ее в 1,5 раза.

I

Поскольку используемые соеднне- ни нетоксичны, то превьш1ение дозы не наносит никакого вреда.

При обработке рыб число инъекций в клждом случае зависит от того, насколько данна рыба подготовлена к икрометанию: чем ближе это состо ние , тем меньше доз препарата ей следует вводить.

После введени инъекций у рыб отбирают половые продукты, например , путем сцеживани , причем рыба считаетс созревшей в том случае, если у самцов сперма активизируетс тотчас же после соприкосновени С водой, а у самок - если клеточное дро йце.клетки находитс в непосредственной близости от оболочки йца . Отобранные половые продукты используют при искусственном рыборазведении .

Примен емые согласно описываемому способу соединени получают с помощью обр;еприн тьгх методов синтеза пептидов в твердой фазе.

В зависимости от структуры желательного соединени в случае пепти- далкиламидов исход т из хлорметили- рованных полистиролдивинилбензоль- ньк смол, в случае амидов пептидных кислот - из беизгидриламинных смол

Отдельные аминокислоты в форме их N-n-бутилоксикарбонильных производных могут постепенно соедин тьс со смолой с помощью дициклогексилкар бодиимида, или диизопропилкарбодними да, или с помощью соединени через активные сложные эфиры.

Целевой продукт можно удал ть с твердого носител путем кислотного или щелочного отщеплени . В зависимости от химического характера измен емых частей аминокислот соединени общей формулы могут быть получены также путем соответствующих комбинаций постепенной (ступенчатой) кондесации ифрагментной конденсации из известных в насто щее врем аминокислот

Описываемый способ обладает сле- дуюп1ими преимуществами:

позвол ет проводить искусственное размножение рыб, генетически чуждых карпам, которых до сих пор н удавалось размножать из-за отсутстви специфических гипофизов рыб и их синтетических аналогов;

может быть применен в широких биологических границах окружающей среды, так как соединени общей формулы оказывают свое действие при различных биологических услови х;

5

0

5

0

5

0

5

0

5

позвол ет более полно использовать Производственные мощности.

Действие препаратов, используемых при ос тцествлении способа, совпадает с действием собственных гона- дотропинов рыб, причем эти препараты интерспецифичны, т.е. активны в случае генетически чуждых одни другим рыб.

Пример 1. Провод т искусственное размножение осетра (Acipenser ruthenus). Дл этого из попул ции рыб данного местообитани отбирают половозрелых рыб и транспортируют на станцию дл размножени . Рыб сортируют по полу, затем определ ют сте- пекъ зрелости икры ( йцеклеток самок ) , относ к зрелым те из них, у которых клеточные дра йцеклеток наход тс на периферии. Степень зрелости самцов не определ ют, так как в попул ции рыб данного местообитани половые продукты самцов и самок наход тс практически в идентичном состо нии.

Рыбам, котовым к овул ции (самцам и самкам), ввод т путем инъекции декапептид формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu- Gln-Pro-Gly-NHj в одноразовой дозе 70 мкг/рыба.

Если рыбы не созрели дл овул ции , то их выдерживают при естественной температуре нереста, ввод т соединени последовательно, двукратно , самое большее дес тикратно, дозами по 10 мкг указанного соединени до тех пор, пока клеточные дра не перемест тс от центра к периферии; число обработок зависит от степени зрелости рыб.

Процесс созревани протекает при 15°С 100-650 градусодней.

Спуст 28 ч после введени - последней дозы происходит овул ци , а в последующие 50 мин получают половые продукты рыб.

П р и м е р 2. Индуцируют нерест карпа (Cyprinus carpio Z).

В любое врем года и при любой температуре воды отбирают из попул ции половозрелых рыб, которых транспортируют дл размножени на станцию. Рыб раздел ют по полу и определ ют состо ние зрелости, как в примере 1. Если рыбы зрелые, то самкам и самцам ввод т декапептид формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Trp- .eu-Pro-Gly NH . He созревших дл овул ц11и рыб выдерживают при естесвенной температуре нереста и обраба тывают по крайней мере двукратно ил ( самое большее) п тнадцатикратно указанным соединением в дозах по 5 мкг/рыба.

Процесс созревани при 22°С зани мает от 100 до 750 градусодней.

Через 250 градусодней после введни последней дозы происходит овул ци . В течение 50 мин у рыб отцеживают половые продукты.

П р и м е р 3. Осуществл ют индуцирование нереста у окуней (Регса fluviatilis), дл чего рыб отбирают так же, как в примере 1, а затем обрабатывают , самцов и самок декапепти дом формулы Glp-His-Trp-Ser-D-Phe- Leu-Gln-Pro-Gly NH в разовой дозе 20 мкг/рыба.

Несозревших рыб выдерживают при температуре нереста и обрабатывают по крайней мере двукратно или дес тикратно , ввод указанное соединение в дозе 2 мкг/рыба. Процесс созревани при занимает от 100 до 400 градусоденй. Спуст 30 ч после введени последней дозы происходит икрометание. Окуни выметывают икру в бассейнах сами, что исключает от- цеживание половых продуктов.

П р и м е р 4. Провод т искусственное размножение макрели (Trachu- rus trachurus), дл чего из пойманных в но бре мес це адриатических макрелей отбирают экземпл ры длиной 24 см и транспортируют на станцию дл размножени . Рыбы упом нутого размера вл ютс половозрелыми.

Кождой рыбе ввод т путем инъекци разовую дозу (10 мкг) соединени формулы Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe- Leu-Gln-Pro-Gly NH.

При температуре 21°С происходит овул ци в течение 24 ч.

В течение 2 ч провод т отцежива- ние половых продуктов.

П р и м е р 5. Провод т индуцированное размножение щук (Esox lucius)

Рыб отбирают из попул ции, транспортируют , раздел ют по полу, как в примере 1. Созревшим дл овул ции рыбам ввод т такое же соединение с гормональными свойствами, как в примере 4.. ,

5

0

5

г

)Q

0

с

0

5

0

5

Соелиненпе т поц т двукратно, са- Mfie большее 10-кратно п дозе по 5 мкг/рыба.

С)(1тревание рыб при 1 1 С занимает от 70 до 350 градусодней. Спуст 39ч после введени последней дозы происходит овул ци . В б.пюкайшие 5 ч отцеживают половые продукты.

П р и м е р 6. Провод т индуцированный нерест толстолобика (Нуро- phalnychtys molitrix).

В отличие от примера 1, созревшим рыбам ввод т декапептид Glp- Нл s-Trp-Ser-Tyr-D-Plie-Trp-Leu-Pro- Gly-Nli,, в одноразовой дозе 100 мкг/ /рыба. Не созревших дл овул ции рыб выдерживают при естественной температуре нереста и обрабатывают от 2 до 15 раз (в зависимости от степени зрелости) указанным соединением, которое ввод т в дозе 10 мкг/рыба. При этом величина последней дозы составл ет 15 мкг/рыба. Процесс созревани при 23 С занимает от 150 до 850 градусодней. Спуст 250 градусодней после введени последней дозы происходит овул ци . Затем половые продукты сцеживают.

Дальнейшие примеры осуществлени способа с использованием соединени обн1ей формулы приведены в табл.1 с указанием доз, которые необходимо ввести дл получени требуемого результата .

В таблице указаны только изменен ные члены аминокислот в соединении общей формулы

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X -X -X,- Рго-Х.

Согласно примерам, приведенным в табл.1, опыты проводили со стерл дью . Дл каждой дозы и каждого соединени испопьзовали 10 рыб. В таблице приведены данные показывающие в процентах количество рыб, которые овулировали после введени им соединени с гормональным действием . 1

Соединени , приведенные в табл.1 под №№ 1, 4 и 5,очищены хроматогра- фически, поэтому в данных примерах способ осуществл етс с использованием солей 3Tifx соединений.

Из таблицы видно, что каждое соединение действует в специфичных дл него дозах, лежащих в пределах от 0,1 до 500,0 мкг/рыба.

В табл.2 приведены физико-химические константы соединений, используемых дл осуществлени способа.

Claims

Формула изобретени

Способ получени пригодных дл оплодотворени половых продуктов у половозрелых рыб в любое врем года, предусматривающий определение биологической зрелости рыб путем исследовани их половых продуктов, отделение овул ционно незрелых рыб от зрелых , введение зрелым рыбам путем инъекции соединени с гормональньм действием и сбор полученных после инъекции половых продуктов, отличающийс тем, что, с целью улучшени качества полученных половых продуктов и возможности их получени у рыб различных видов, в качестве соединени с гормональным действием рыбам ввод т нонапептид - С -С -алкиламиды или декапептидамиды общей формулы

X

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X, -Рго

4

где

X,- D-Phe, D-Trp, D-ala, D-leu, D-Ser;

Xj - Trp, Phe, Leu;

Xj,- Gin или Leu;

Gly NHi или С -С -алкил NH, или их соли, соединени ввод т пос- |ледовательно дозами, количество которых составл ет 2 - 15, величину доз устанавливгиот в соответствии с данными,приведенными в табл.1, при этом величина последней дозы или равна величине предыдущей, или пре- вьппает ее в 1,5 раза.

Таблица 1

IZZI

Тгр Leu des Gly

5D-Phe Gln des Gly ° GnRH-этиламид

6КЬе Leu GnRH

7 Phe Gln GnRH

8Trp Gin des Gly GnRH-этиламйд

9D-Trp Leu® GnRH

10D-ala Gln GnRH

11D-Leu Gin GnRH

12О-трет-бут-D-Ser - G In -GnRH

167-164 -5,9 0,5 0,1 H. уксусна

кислота

181-183 -10,2 1,0 10%-на уксусна

кислота 175-178 -19,0 0,1 0,1 н. уксусна

кислота 182 -21,0 0,1 0,1 н. уксусна

кислота 179-180 -29,0 0,1 0,1 н, уксусна

кислота 168-170 -15,5 0,1 0,1 н, уксусна

кислота 182 -32,3 1,0 0,1 н. уксусна

кислота 183-185 -35,0 1,0 0,1 н. уксусна

кислота 178-179 -23,0 1,0 0,1 н. уксусна

кислота

Составитель С.Филиппова Редактор А.Маковска Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 6615/59

Тираж 470

В11ИИПИ Государственного по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5

Г

Продолжение табл. 2 5

0,69 0,55 0,57 0,63

Подписное