FI85440C - Foerfarande foer utvinnande av foer naturlig och konstgjord befruktning laempade fortplantningsprodukter fraon daeggdjur. - Google Patents

Description

85440

Menetelmä luonnolliseen ja keinotekoiseen hedelmöitykseen sopivien suvunjatkamistuotteiden talteenottamiseksi nisäkkäistä

Keksinnön kohteena on menetelmä luonnolliseen ja keinotekoiseen hedelmöitykseen sopivien suvunjatkamistuotteiden eli seuraavassa lyhyesti sukutuotteiden talteenottamiseksi syntymää edeltävässä ja sen jälkeisessä vaiheessa, lapsen-iässä, esipuberteetissä ja täysikasvuisessa tilassa olevista nisäkkäistä säätämällä niiden sukuelinten toimintaa. Keksinnön kohteena on edelleen myös mahdollisesti jälkeläisten tuottaminen näistä sukutuotteista sekä - suhteessa lajille luonteenomaiseen elintehoon - sukutuotetuotannon moninkertaistaminen .

Sukutoiminnan stimuloimiseksi tai vastaavasti ovulaation käynnistämiseksi käytetään ensisijassa hyöty- ja jalostettujen eläinten yhteydessä laajalti erilaisia hormonivalmisteita, kuten esimerkiksi steroideja, gonadotropiinia tai vastaavasti nykyisin GnRH:ta ja määrättyjä tämän hormonin superaktiivisia analogeja. Tällä hetkellä tunnetut aineet tai vastaavasti menetelmät saavat ainoastaan aikaan jo kypsän, mutta jostakin syystä vapautumattoman munasolun ovulaation tai vastaavasti ne sopivat ainoastaan poistamaan normaalissa syklinkulussa esiintyneen eston hormonaalisella vaikutuksella kerran, impulssimaisesti ja siten indusoimaan ovulaation. Tällä hetkellä ei tunneta mitään hormonivalmistetta tai vastaavasti menetelmää, joka stimuloi yleisesti munasarjojen toimintaa, edistää preantraalisten tai primor-diaalisten follikkelien kypsymisprosessia tai vastaavasti lisää kehityksessä olevien follikkelien määrää.

Tällä hetkellä ei myöskään tunneta mitään valmistetta tai vastaavasti menetelmää, jonka avulla sukukypsymättömistä eläimistä tai vastaavasti eläimistä, joissa sukutuotteiden kehittyminen on pysähtynyt määrätyssä varhaisessa vaiheessa, tai vahingoittumattomista eläimistä in vitro tai vastaavasti 2 «5440 gonadeista post mortem voidaan valmistaa hedelmöitykseen sopivia sukutuotteita.

Gonadien toiminta tai vastaavasti sukutuotteiden tuotanto on taantunut tai pysähtynyt useiden jalostettujen eläinten kohdalla sopimattoman hoidon johdosta, määrättyjen arvokkaiden eksoottisten villi- ja turkiseläinten kohdalla ei-luonnolli-sen hoidon johdosta. Näiden eläinten kohdalla ovat tähän asti tunnetut hormonivalmisteet osoittautuneet yleensä tehottomiksi .

Viime aikoina tunnetuksi tulleet lajispesifiset GnRH-johdannaiset [J.A. King ja R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257, 10722-28 (1982); N. Sherwood et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 2794-2798 (1983)] sekä se seikka, että ammattikirjallisuudessa esitetään erilaisten GnRH-tyyppisten tekijöiden läsnäolo gonadeissa tai vastaavasti munasarjoissa [R. M. Sharpe et ai., Nature 290, 785-787 (1981); N. Dekel et ai., Biol. Reprod. 28, 161-166 (1983)], asettava kysymyksen erityisistä tekijöistä ja näiden kanssa tapahtuvasta vuorovaikutuksesta.

Tunnetussa tekniikassa (HU-patenttihakemus 4457/83) esitetyt kala- tai vastaavasti lintuspesifiset GnRH-johdannaiset soveltuvat muuten vankeudessa lisääntymättömien kalojen kohdalla tuottamaan sukutuotteita. Tämä vaikutus perustuu fol-likkelikehityksen stimulointiin.

Keksinnön tehtävänä on saada aikaan menetelmä, jolla voidaan stimuloida nisäkäsembryoiden ja nisäkkäiden sukuelinten toimintaa niin, että voidaan valmistaa luonnolliseen tai keinotekoiseen hedelmöitykseen sopivia sukutuotteita ja näitä voidaan käyttää jälkeläisten tuottamiseen. Keksinnön tehtävänä on edelleen moninkertaistaa koiraspuolisten ja naaraspuolisten nisäkkäiden sukutuotetuontanto - suhteessa lajille luonteenomaisen elinkykyyn.

Keksintö perustuu siihen tietoon, että käyttämällä yleisen kaavan (I)

3 ö 5 4 4 O

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4 (I) mukaisia nonapeptidi-(C^-C4-alkyyli)-amideja tai vastaavasti dekapept idiamideja, jossa kaavassa

Xl merkitsee glysyyliryhmää tai jotakin mielivaltaista luonnollista tai synteettistä D-aminohappotähdettä, X2 merkitsee sivuketjuna 1-4 hiiliatomia sisältävän alkyy-liryhmän, fenyyli- tai tryptofyyliryhmän sisältävän L-aminohapon tähdettä, X3 merkitsee sivuketjuna 1-4 hiiliatomia alkyyliryhmän tai 2-4 hiiliatomia sisältävän alkanoyyliamidiryhmän sisältävän L-aminohapon tähdettä ja X4 merkitsee glysyyliamidiryhmää tai 1-4 hiiliatomia sisältävää alkyyliamidiryhmää, sekä näiden suoloja ja metallikomplekseja voidaan saavuttaa tämä päämäärä, eli näillä yhdisteillä voidaan valmistaa sukukypsymättömistä sekä kausiluonteisessa hedelmöittymisen välivaiheessa tai ei-luonnollisen hoidon aiheuttamissa hedelmöittymisen välivaiheissa olevista nisäkkäistä in vivo ja in vitro intakteista eläimistä sekä sukuelimistä post mortem luonnolliseen tai keinotekoiseen hedelmöitykseen sopivia sukutuotteita tai vastaavasti niiden määrää voidaan lisätä.

Yleisen kaavan (I) mukaisten yhdisteiden valmistus on tunnettu HU-patenttihakemuksesta 4458/83 sekä US-patentti-julkaisusta 4 410 514.

Keksinnön kohteena on siten menetelmä luonnolliseen ja keinotekoiseen hedelmöitykseen sopivien sukutuotteiden talteen-ottamiseksi pre- ja postnataalisessa vaiheessa, infantiili-sessä iässä, esipuberteetissä ja täysikasvuisessa tilassa olevista nisäkkäistä (joita seuraavassa kutsutaan lyhyesti kantajiksi) säätämällä niiden sukuelinten toimintaa, edelleen mahdollisesti jälkeläisten tuottamiseksi näistä suku-tuotteista ja sukutuotetuotannon moninkertaistamiseksi -suhteessa lajille luonteenomaiseen elinkykyyn. Menetelmälle 4 ö 5 440 on tunnusomaista se, että kantajia käsitellään vähintään kerran, korkeintaan kuitenkin 60 kertaa, sopivimmin 1-5 kertaa, yleisen kaavan (I) mukaisilla yhdisteillä, joiden määrä on 0,01 - 500 yg/kg, sopivimmin 1 - 100 μ g/kg, ja pidetään yksittäisten käsittelyjen välillä vähintään 2 tunnin, korkeintaan kuitenkin 7 päivän, sopivimmin 2-8 tunnin taukoja. Yhdisteitä käytetään edullisesti liuosten, jauheiden, injektioiden tai suihkeiden muodossa, anto voi tapahtua intramuskuläärisesti, intraperitoneaalisesti, subkutaanises-ti, intraunterinäärisesti jne.

Useiden eläinlajien kohdalla parannetaan keksinnön mukaisella menetelmällä sukutuotteiden tuotantoa, toisten eläinten kohdalla (kliinisissä tapauksissa) normalisoidaan vähentynyt tai levossa oleva sukutoiminta ja saadaan aikaan lajille tyypillinen intensiivisyys. Keksinnön mukainen menetelmä sopii myös sukuelinten hypertuottavuuden laukaisemiseksi ja siten lajille ominaisten sukutuotteiden määrän moninkertai-semiseksi (superovulaatio ).

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla stimuloidaan alkiokal-voa ja siten liikuntakykyisten siemensolujen määrä kasvaa ejakulaatissa.

Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu edelleen laukaisemaan hypofyysin hypertuotannon, minkä jälkeen hypofyysistä tulee kestävä ja siten syntyy turta tila; tällä tavalla menetelmä soveltuu myös ehkäisyyn.

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla lopputuotteet voidaan valmistaa luonnollisissa ja keinotekoisissa sekä laboratoriossa ylläpidetyissä elinolosuhteissa.

Esitetyt, GnRH-analogien annostuksella eri rytmeissä säädetyt sukutoimintojen muodot ovat tähän asti esittämättömiä, uusia ilmiöitä.

Keksinnön mukaisen menetelmän pääedut voidaan esittää tiivistetysti seuraavasti: 5 85440 a) Käyttämällä menetelmää voidaan parantaa ei-luonnollisissa olosuhteissa pidettyjen nisäkkäiden gonaditoimintaa tai vastaavasti palauttaa normaali'toiminta, eläimet soveltuvat jälleen jälkeläisten tuotantoon.

b*) Menetelmällä voidaan saada aikaan munasarjojen hypertuo-tanto, minkä ansiosta voidaan ottaa talteen lajille ominaisen ovulaatioiden määrän suhteen munasolujen moninkertainen määrä. Nämä voidaan säilyttää in vitro-hedelmöityksen jälkeen sikiöiden muodossa tai ne voidaan poistaa vastaanottajina toimivista eläimistä.

c) Menetelmällä voidaan saada aikaan nisäkkäiden infantiili-sistä yksilöistä gonadien hyperstimulointi ja siten super-ovulaatio. Tällä tavalla välittäjästä voidaan saada jo ajankohtana jälkeläisiä, jolloin välittäjä itse ei ole vielä sukukypsä.

d) Menetelmä soveltuu erityisissä laboratorio-olosuhteissa elinviljelyissä in vitro-munasolujen valmistamiseksi intak-teista munasoluista post mortem. Tällä tavalla voidaan arvokkaista jalostetuista eläimistä tuottaa myös välittäjän kuoleman jälkeen jälkeläisiä.

e) Menetelmällä valmistettujen sukutuotteiden myynti mahdollistaa suurien maanosien välisen etäisyyden johdosta estyneen lajien hybridaation ja siten on mahdollisuus jalostaa uusia hyötyeläinlajeja.

f) Menetelmällä voidaan valmistaa teollisissa tuotanto-olosuhteissa mielivaltisista koiraspuolisten ja naaraspuolisten nisäkkäiden ikäluokista suuria määriä munasoluja, siemenso-luja tai alkioita, mikä mahdollistaa esimerkiksi alkiopank-kien aikaansaannin ja mannerten välisen jälkeläisten myynnin .

g) Menetelmällä voidaan kumota nisäkkäiden kaudesta riippuvainen hedelmöittymisen välivaihe ja koko nisäkkäiden sper-matogeneesi. Siten voidaan tuottaa joka hetki jälkeläisiä, 6 85440 mikä johtaa taloudellisten kohteiden parempaan hyödyntämiseen .

h) Menetelmä soveltuu suojeltavien harvinaisten lajien keinotekoiseen hedelmöitykseen.

• i) Menetelmällä voidaan tehdä sekä koiraspuolisten että naaraspuolisten nisäkkäiden hypofyysi turraksi ja siten voidaan välttää ei-toivottu kantavuus myös tapauksissa, joissa ei voida käyttää tunnettuja ehkäisyaineita.

Keksinnön mukaista menetelmää selitetään lähemmin seuraavien suoritusesimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Superovulaation laukaisu infantiilisissä naaraspuolisissa rotissa 60 kpl 21 päivää vanhoja, infantiisilisiä naaraspuolisia rottia, jotka painoivat 7 - 8 g, käsiteltiin fysiologiseen keittosuolaliuokseen liuotetulla D-Phe6,Gln®-GnRH:lla. Käsittelytyypin mukaan eläimet jaettiin useihin ryhmiin. Päivästä 8 päivään kestävässä käsittelysarjassa annettiin 1 tai vastaavasti 2 ^g:n esiannoksia/päivä tai vastaavasti kaksi kertaa päivässä.

Käsittelyn loputtua kaikki eläimet tapettiin eetterihöyryllä ja niiden munasarjat poistettiin kuoleman jälkeen, 24 tunnin kuluttua viimeisestä käsittelystä. Arviointi tapahtui visuaalisesti ja histologisten näytteiden avulla. Kontrolli-eläinten munasarjoissa havaittiin useita kehityksessä olevia follikkeleita, mutta mikään ei saavuttanut Graafin follikkelin kokoa, myöskään ei esiintynyt keltarauhasia eikä Corpus haemorrhagicumia. Sitä vastoin kaikissa käsitellyissä ryhmissä voitiin osoittaa hormonivaikutus, joka nähtiin follikkelien kasvussa, Graafin follikkelien muodostuksessa, suurten follikkelien ovulaatiossa ja normaalien keltarauhasten muodostuksessa. Myös munajohtimet ja kohtu olivat kasvaneet. 60 käsitellystä eläimestä kaikkiaan neljällä ei esiintynyt

7 ö 5 4 4 O

reaktiota käsittelyyn. Eläimissä, jotka olivat saaneet 4 päivän ajan päivittäin 2 kertaa 2 ug GnRH-analogia ja oli käsitelty 4. päivänä 6 tuntia 2 yg-annoksen jälkeen 10 yg:n annoksella, oli munasarjoissa välittömästi ovulaation edessä olevia, pehmenneitä Graafin follikkeleja suurina määrinä. Lopullisesti kypsien Graafin follikkelien määrä eläintä kohden oli 60 - 90, kun taas täysikasvuisten eläinten kohdalla nomraaliarvo on 12. Toinen eläinryhmä käsiteltiin samalla tavalla sillä erotuksella, että käsittely kesti 6 päivää. Tässä ryhmässä superovulaatioteho arvioitiin munasarjoissa muodostuneiden normaalien keltarauhasten määrän mukaisesti. Samoin kuin yllä yksityiskohtaisesti esitetyissä tuloksissa keltarauhasten määrä eläintä kohden oli 60 - 90. Histologi-nen arviointi vahvisti tämän tuloksen täysin.

Esitetyllä tavalla tuotettiin toisaalta jo vielä infantiili-sissä lajin yksilöissä kypsiä munasoluja, toisaalta moninkertaistettiin munasolujen määrä verrattuna täysikasvuisten eläinten fysiologiseen arvoon.

Esimerkki 2

Superovulaation laukaisu infantiilisissä naaraspuolisissa hiirissä.

Esimerkissä 1 esitetyllä tavalla käsiteltiin kaikkiaan 105 naaraspuolista hiirtä, jotka olivat 28 päivää vanhoja ja painoivat 5 - 6 g. 1 - 8 päivän ajan käsitellyt eläimet saivat päivittäin kaksi kertaa 1 - 5 ug D-Phe^,Gln®,desGlyl0-GnRH-etyyliamidia. Yksittäisten käsittelyjen väli oli 4 tuntia. Munasarjat poistettiin 27 tunnin kuluttua viimeisestä injektiosta.

Kontrolliryhmän munasarjat olivat väriltään himmeän keltaiset ja ne olivat homogeenisia, useissa munasarjoissa oli 1 -2 kasvavaa follikkelia. Käsiteltyjen eläinten ryhmissä voitiin todeta kaikissa munasarjoissa, suurentuneissa munajoh-timissa ja kohdussa hormonin vaikutus. Eläimissä, jotka olivat saaneet päivittäin kerran 1 yg:n annoksen ja 3. päivänä 8 85440 neljän tunnin kuluttua 1 μ g-annoksesta 5 μ g mainittua GnRH-analogia, munasarjoissa löydettiin lopullisesti kypsyneitä, epätasaisina tuntuvia Graafin follikkeleita, nimittäin eläintä kohden 45 - 70 kpl. Samankaltaisesti, mutta 5 päivän ajan käsitellyssä ryhmässä Graafin follikkeleiden sijasta muodostui normaaleja keltarauhasia mainittuna määränä. His-tologisen tutkimuksen tulos oli yhtäpitävä visuaalisen arvioinnin kanssa.

Tulokset vahvistivat esimerkin 1 mukaisen menetelmän tulokset .

Esimerkki 3

Superovulaation laukaisu infantiilisissä kaneissa.

20 joukkohoidossa syntyneitä nuoria "Weisse Perle"-kaneja, joiden ikä oli 42 päivää, käsiteltiin kolmen päivän päivittäin kaksi kertaa intraperitoneaalisesti 5ygslla D-Phe8,Gln8-GnRH:lla. Sitten eläimet jaettiin kahteen ryhmään. Toinen ryhmä käsiteltiin 4. päivänä 50 ygslla vaikuttavaa ainetta, toinen ryhmä tapettiin eetterihöyryllä. Ennen käsittelyä tapetun ryhmän kypsien Graafin follikkelien määrä toimi kontrollina todettaessa 50 yg:n annoksella esiintyvä muutos. Elävien eläimien kohdalla tutkittiin ovulaation esiintymistä kahdessa eläimessä 10 tuntia kestävällä, narkoosissa suoritetulla laparoskooppisella (vatsaontelon peilaus) tutkimuksella. Käsittely 50 y'grlla aiheutti 26 tunnin kuluttua eläintä kohden 30 - 45 ovulaatiota tai vastaavasti Corpus haemorrhagicumin, kun taas kontrollieläinten munasarjat olivat inaktiivisia.

Tällä menetelmällä voitiin valmistaa jo kanien infantiili-sistä yksilöistä kypsiä munasoluja ja moninkertaistaa niiden määrä fysiologisen arvon suhteen.

9 H 5 4 40

Esimerkki 4

Superovulaation laukaisu infantiilisissä sioissa.

20 infantiilista naaraspuolista porsasta, jotka olivat 100 päivää vanhoja, käsiteltiin 6 päivän ajan päivittäin kaksi kertaa intramuskuläärisesti lOygrlla D-Phe*>,Gln®-GnRH:lla. Arviointia varten poistettiin kontrollieläimistä kulloinkin yksi munasarja, tutkimusmenetelmät vastasivat esimerkissä 3 esitettyjä, muodostuneiden Graafin follikkelien määrää ja ovulaation jälkeen muodostuneiden keltarauhasten määrää verrattiin. Ovulaation esiintymistä tarkkailtiin laparoskoo-pilla. 7. päivänä annettu 100yg:n annos D-Phe*>,Gln®-GnRH:ta aiheutti 41 tunnin kuluttua 10 käsitellyssä porsaassa 15 -36 ovulaatiota. Infantiilisten porsaiden käsittely tuotti saman tuloksen kuin esimerkeissä 1-3 esitettyjen eläinlajien kohdalla.

Esimerkki 5

Superovulaation laukaisu infantiilisissä lampaissa.

10 Jerke-lammasta, jotka olivat 50 päivää vanhoja, käsiteltiin 5 päivän ajan päivittäin kaksi kertaa 10yg:lla D-Phe®,Gln®,desGly^O-GnRH-etyyliamidia intramuskuläärisesti. 6. päivänä annettu 70 μ gsn annos vaikuttavaa ainetta sai aikaan eläintä kohden 3-9 ovulaatiota. Kontrollieläimissä ei tapahtunut mitään muutosta. Arviointi tapahtui sekä käsiteltyjen eläinten että kontrollin kohdalla laparoskopialla. Tulokset olivat yhtäpitävät esimerkeissä 1-3 esitettyjen kanssa.

Esimerkki 6

Superovulaation laukaisu infantiilisissä naudoissa.

8 infantiilistä vasikkaa, jotka olivat 65 päivää vanhoja, käsiteltiin 8 päivän ajan päivittäin kolme kertaa 2 ygrlla D-Phe6,Gln®,desGly^0-GnRH-etyyliamidia. päivän tauon jälkeen 10. päivänä eläimille annettiin 100 yg vaikuttavaa ainetta intramuskuläärisesti. Viimeisen injektion jälkeen molemmat munasarjat poistettiin; yleensä löydettiin munasarjaa kohden 10 d 5440 n. 5 - 11 kehittynyttä Graafin follikkelia. Puolet follikkeleista ei tuntunut enää kovilta, joten ne olivat välittömästi ovulaation edessä.

Tämä koe osoittaa, että myös nautojen kohdalla voidaan valmistaa jo infantiilisistä eläimistä useita kypsiä munasoluja, kun taas täysikasvuinen nauta ovuloi normaalisti vain yhden munasolun.

Esimerkki 7

Fysiologisen oligospermian käsittely simpansseilla normo-spermian aikaansaamiseksi.

Pienissä ryhmissä eläville eläinlajeille, etenkin kuitenkin kädellisille on luonteenomaista se ammattikirjallisuudessa usein julkaistu seikka, että tosin kaikilla koirailla on parvessa aktiivinen libido, mutta ainoastaan johtoeläimet parittelevat, kun taas alempiarvoiset koiraat ovat fysiologisesti ja reversiibelisti oligospermisiä. Esillä olevassa tapauksessa tarvittiin johtoeläimeltä kerätyn ja spermapankkiin varastoidun sperman lisäksi yksinomaan inseminaatiota varten vielä 4 alempiarvoisen koiraan (kaikki sukukypsiä) sperma. Ennen käsittelyä eläimet saatettiin ejakuloimaan narkoosissa sähköisesti. Ejakulaatit tutkittiin mikroskoopilla tiheyden ja liikkuvuuden suhteen ja sitten ne syväjäädytettiin <-196°C). Omat aikaisemmat spermatologiset tutkimukset ovat nimittäin osoittaneet, että mikroskooppisesti huonosti nähtävät vialliset siemensolut eivät kestä syväjäädytystä. Syväjäädytyksen jälkeen saatu suotuisa spermakuva osoitti, että spermiogeneesi tapahtuu normaalisti. Ennen käsittelyä tutkituista koiraista otetussa ejakulaatissa oli fysiologinen oligospermia. Tämän jälkeen 60 - 90 kg painavat simpanssit saivat viikottain kerran 100 μ g D-Phe®,Gln®,desGly^-^-GnRH-etyyliamidia 1 mlrssa fysiologista keittosuolaliuosta. Anto tapahtui intramuskuläärisesti pai-neilmapyssyllä. Ejakulaateissa, jotka oli otettu talteen 4. viikkona ensimmäisen käsittelyn jälkeen narkoosissa sähköisesti, voitiin rekisteröidä 40 - 60 %:n sperma-esimuotojen 11 B5440 osuus , joiden liikkuvuus oli syväjäädytyksen jälkeen alle 10 %. Ejakulaateissa, jotka otettiin 60 päivän kuluttua ensimmäisen käsittelyn jälkeen, oli viallisten siemensolujen määrä alle 30 % ja liikkuvuus kasvoi 60 %. Ejakulaattien kyantitatiiviset ja kvalitatiiviset ominaisuudet olivat yhtäpitäviä johtoeläimestä otetun ejakulaatin ominaisuuksien sekä ammattikirjallisuuden tietojen kanssa. Syväjäädytettäessä 1:l-suhteessa laimennettuja ejakulaatteja 60 %:nen liikkuvuus laski vain 45 %:iin. Tämänlaatuinen sperma on sekä tuoreena että syväjäädytettynä sopiva inseminaatioon.

Esitetyllä tavalla alempiarvoisista koiraista voidaan saada hedelmöitykseen sopiva, spermapankkiin varastoitava sperma sopivana määränä ja sopivanlaatuisena.

Esimerkki 8

Spermiogeneesin laukaisu kausiluonteisesti oligospermisessä visenttihärässä inseminaatioon ja syväjäädytysvarastointiin sopivan ejakulaatin talteenottamiseksi.

Eläintarhassa olevasta, n. 700 kg painavasta visenttihärästä otettiin siemennäyte toukokuussa narkoosissa sähköisesti. Todettiin, että härkä oli kausiluonteisen oligospermian tilassa. Oireet olivat seuraavat: spermatutkimukseen yleisesti käytetyn, 1500-kertaisesti suurentavan mikroskoopin kentässä 011 spermamäärä 5 - 20, virheellisten siemensolujen osuus oli 75 - 80 % ja sperman tiheys oli 0,5. Tämänlaatuinen sperma ei sovellu hedelmöitykseen.

Eläintä käsiteltiin nyt intramuskuläärisesti (paineilmapyssyn avulla) viikottain kaksi kertaa 200 pg:lla D-Phe6,Gln8-GnRHrta. 55. päivänä käsittelyn alusta eläin saatettiin eja-kuloimaan kaksi kertaa tunnin välein. Molemmat ejakulaatit yhdistettiin; tiheys oli 4, liikkuvuus 55%. Sperma syväjäädytettiin ja sitten määritettiin syväjäädytyksen aiheuttama liikkuvuuden väheneminen. Tämä oli ainoastaan 5%.

Tällä menetelmällä onnistuttiin vaikuttamaan jalostuseläimen spermiogeneesiin siten, että hedelmöitykseen käyttökelvotto- 12 h 5 440 man ejakulaatin sijasta voitiin ottaa talteen sekä tuoreena että syväjäädytyksen jälkeen useiden lehmien (kaikkiaan 14) hedelmöitykseen sopiva erittäin hyvälaatuinen sperma.

Esimerkki 9

Spermiogeneesin laukaisu kausiluonteisesti oligospermisissä punaketuissa (Vulpes vulpes).

Eläintarhassa olevien, kausiluonteisesti oligospermisten punakettujen spermiogeneesiin tulisi vaikuttaa sitä varten, että jalostusasemilla pidetyt hopea- ja siniketut voidaan keinosiementää, jotta voidaan valmistaa erityisiä ja korkealuokkaisia hydriditurkiksia. Ammattikirjallisuudesta on tunnettua, että kaikki kettujen alalajit ovat vain kerran vuodessa kiimaisia ja tämän yhden jakson ulkopuolella molempien sukupuolten gonadit ovat täysin inaktiivisia. Yksittäisten alalajien kiiman välillä on useiden kuukausien väli (puna-kettu: tammikuu, sinikettu: huhtikuu - toukokuu). Tutkimusten tuloksia verrattiin kausiluonteisessa kiimassa olevan populaation spermakuvaan, jossa keskimääräinen ejakulaatti-määrä oli 2 ml, tiheys 3 ja liikkuvuus 50 - 60 %. Tätä pidettiin fysiologisena arvona.

Viisi sukukypsää koiraspuolista punakettua, jotka painoivat keskimäärin 8 kg, käsiteltiin huhtikuusta alkaen 7 viikon ajan viikottain kaksi kertaa 1, 5, 10, 50yg:lla D-Phe^, Gln®-GnRH:11a. 3. viikkona käsittelyn alettua otettiin spermanäyte. Näytteissä siemensolujen määrä oli suunnilleen 60 - 70 % fysiologisesta arvosta, degeneroitujen siemensolujen määrä oli yli 40 %. Vialliset muodot olivat etupäässä nuoria muotoja (plasmapisaroita kaulaosan keskiosassa). 7. viikkona käsittelyn alettua kerättiin narkoosissa uudelleen ejakulaatti. Kaikista eläimistä voitiin ottaa sperma tuloksellisesti talteen, ejakulaatin tilavuus oli 1,2 - 3,1 ml, tiheys oli 3, liikkuvuus oli 65 % ja ylitti numeerisesti olennaisesti fysiologisen arvon. (Koiraspuoliset eläimet olivat erillään tänä aikana naaraspuolisista, parittelulla tapahtuva tyhjennys ei ollut mahdollista.) Spermanäytteet 13 85440 jaettiin laadun mukaan ryhmiksi ja syväjäädytettiin. Laimentamisen ja syväjäädytyksen ja lopuksi sulattamisen jälkeen -196°C:seen jäädytetyn sperman'liikkuvuus oli 45 %. Käyttämällä syväjäädytettyä spermaa - käyttämällä GnRH-ohjelmoin-tia (ks. esim. 17) ja inseminaatiotekniikkaa - voitiin puna-ketuissa saada aikaan normaali kantavuus.

Ottamalla kerran 5 ketusta ejakulaatti voitiin valmistaa 56 annosta hedelmöitykseen sopivaa spermaa. Tekniikka soveltuu suurtiloilla hydridijaloturkisten valmistukseen.

Esimerkki 10

Degeneroituneen spermakuvan johdosta hedelmättömän siperialaisen tiikerin käsittely.

Eläintarhassa oleva 8 vuotta vanha siperialaistiikeri, joka painoi 120 kg, eli kolmen vuoden ajan yhdessä naarastiikerin kanssa. Naaraan kiiman aikana tapahtui säännöllisiä paritteluja, mutta koskaan ei syntynyt jälkeläisiä. Oli suljettava pois se, että kantavuutta ei syntynyt naaraan johdosta, koska naaras oli ollut aikaisemmin jo kantava toisesta koiraasta ja oli kasvattanut myös pentunsa.

Koirastiikeriltä otettiin spermanäyte narkoosissa sähköisesti. Ejakulaatti oli hyvin ohutta, kenttää kohden nähtiin 4 -5 degeneroitunutta siittiötä, jotka suorittivat värisevää liikettä. Degeneroitumisten muoto on luonteenomaista sperma-togeneesin varhaisemmille vaiheille. Eläin käsiteltiin viikottain kerran intramuskuläärisesti (paineilmapyssyn avulla) 100 yg:lla D-Phe6,Trp7,Leu8-GnRH:lla, joka oli liuotettu 1 ml saan fysiologista keittosuolaliuosta. Koirastiikeri pidettiin yhdessä naarastiikerin kanssa ja myös käsittelyn aikana tapahtui säännöllisesti paritteluja. Naaras tuli kantavaksi ja synnytti kolme tervettä pientä tiikeriä. Syntymän ajankohdasta voidaan päätellä, että hedelmällinen yhdyntä tapahtui 40 - 50 päivän kuluttua ensimmäisestä käsittelystä.

Menetelmä soveltuu siten hedelmättömien koirastiikereiden degeneroituneen spermakuvan hoitamiseksi ja tällä tavalla jälkeläisten tuottamiseksi.

14 «5440

Esimerkki 11

Fysiologisen normospermian stimulointi bengalilaisessa tiikerissä syväjäädytyksen mahdollistavan hyperspermian aikaansaamiseksi .

Eläintarhassa oleva, 8 vuotta vanha bengalilainen tiikeri, joka painoi n. 200 kg, paritteli säännöllisesti, sen naaras oli ollut aikaisemmin joka vuosi kantava. Tämän tietäen tiikeristä otettiin spermanäyte narkoosissa sähköisesti parit-teluaikana. Todettiin, että sperman tiheys oli 3, liikkuvuus 30% ja ejakulaatin määrä 0,2 ml. Ejakulaatissa oli fysiologisen normospermian kuva. Näin pientä ejakulaattimäärä ei voida syväjäädyttää teknisistä syistä. Maksavaurion välttämiseksi narkoosi saadaan suorittaa korkeintaan joka 4. päivä ja sitä saadaan ylläpitää korkeintaan 4-5 tunnin ajan. Tällaista sperman keräämistä ei voida suorittaa.

Koiras suljettiin erilliseen häkkiin ja sitä käsiteltiin 12 päivän ajan päivittäin 10 yg:lla D-Phe6,Gln®,desGly*®-GnRH-etyyliamidia. Vaikuttava aine liuotettiin 1 ml:aan fysiologista keittosuolaliuosta ja se annettiin paineilmapyssyn avulla intramuskuläärisesti. 12. päivänä eläin saatettiin ejakuloimaan narkoosissa sähköisesti kaksi kertaa tunnin välein, tällöin saatiin 1 ml tai vastaavasti 0,8 ml spermaa. Yhdistettyjen näytteiden tiheys oli 4, liikkuvuus oli 70 %. Spermanäytteet syväjäädytettiin ja jaettiin 21 yksittäisan-nokseksi keinohedelmöitystä varten. Sperman sulattamisen jälkeen liikkuvuus oli 60 %.

Tällä tavalla bengalilaisesta tiikeristä voitiin ottaa talteen spermapankkiin varastoitavaa spermaa huomattava määrä.

Esimerkki 12

Vankeudessa aiheutuneen aspermian hoitaminen orangissa.

Eläintarhassa oleva, 18 vuotta vanha koirasoranki, joka painoi n. 350 kg, oli vangittu nuorena. Sillä oli ollut peräkkäin kolme omistajaa. Anamnesian mukaan sillä ei ollut koskaan ollut partneria, vaan se oli pidetty aina yksinään eikä is 8 5 4 40 se ollut koskaan paritellut. Eläintarhassa se oli ollut 11 vuotta ilman toisia orangeja ja ilman naarasta. Sen käyttäytyminen oli flegmaattista, inaktiivista, sillä oli laitostumiselle luonteenomaisia oireita. Eläintarha sai tarjouksen, jonka mukaan eräs instituutio ostaisi eläimen, jos se kuuluisi Borneo-alalajiin ja olisi hedelmällinen. Kromosomitut-kimus osoitti, että eläin kuuluu Borneo-alalajiin, s.o. se on erittäin harvinainen yksilö (koko maailmassa on 153 yksilöä). Anamnesiassa hedelmällisyys osoittautui kyseesenalai-seksi, koska koiraspuolisille kädellisille luonteenomainen aggressiivisuus ja säännöllinen masturbointi oli täysin loppunut n. 5 - 6 vuotta alkaneesta laitosajasta lähtien. Eläimestä otettiin narkoosissa spermanäyte sähköisesti.

Ejakulaattiin oli tyhjentynyt yksinomaan lisärauhasten erite, kolme kertaa kulloinkin pisara, kaikkiaan 0,1 ml. Ejaku-laatissa ei voitu löytää liikkuvia siittiöitä, siinä esiintyi ainoastaan muutamia inaktiivisia siemensoluja. (Mikroskooppisessa tutkimuksessa laskettiin 10 kentässä kaikkiaan 1 - 2 kpl).

Eläintä käsiteltiin nyt viikottain kaksi kertaa 100yg:lla D-Phe6,Gln®,desGlylO-GnRH-etyyliamidia. Käsittely tapahtui esimerkeissä 1-11 esitetyllä tavalla. Käsittelyn aikana eläimen liikkeet muuttuivat elävämmiksi, aktiivisemmiksi, mutta sitä ei voitu pitää libidon kasvuna, sillä sen olisi voinut aiheuttaa myös pelko ampumalla suoritetuista injektioista. Käsittely päätettiin 47. päivänä ensimmäisestä injektiosta. Eläin saatettiin ejakuloimaan uudessa narkoosissa kaksi kertaa, tunnin välein, minkä avulla otettiin talteen kaikkiaan 3,2 ml spermaa. Sperman tiheys oli 3, liikkuvuus 35 %. Degeneroituneiden siemensolujen osuus oli 20 %, kysymys oli käytännössä ainoastaan nuorista kehitysmuodoista (plasmapisarat kaulaosan keskiosassa).

Eläimen erittäin korkean arvon johdosta ja myös käsittelyjä suorittavan henkilökunnan vahingoittumisvaaran johdosta käsittelyä ei enää jatkettu. Ostajaa tyydytti kontrolloitu spermakuva, joka vastasi hedelmällisille kädellisille luonteenomaisia arvoja.

i6 «5440 Tällä tavalla voitiin palauttaa erittäin harvinaisen arvokkaan eläimen hedelmällisyys ja muodostaa säilyttämällä sen sperma kansainväliseen luetteloon merkitty geenivarasto.

Esimerkki 13

Leijonien ovariaalinen ehkäisy hedelmöittymisen ehkäisemiseksi .

Maailman eläintarhoissa suurista petoeläimistä on näytteillä leijona. Erilaisia panoraamoja ja safaripuistoja varten on tarpeen esittää molemmat sukupuolet samanaikaisesti yhdessä ja samassa elintilassa. Suurista petoeläimistä leijona on ainoa, joka lisääntyy hyvin vankeudessa riittävissä ruokintaolosuhteissa. "Leijonamarkkinoiden" absoluuttisen täyttymisen johdosta on toivottavaa saada aikaan ehkäisymenetelmä, joka on eläimelle vaaraton, ei muuta sen ulkoista olemusta eikä käyttäytymistä ja huolimatta hedelmällisestä kopulaatiosta estää hedelmöittymisen. Sukupuolisteroideihin perustuva ehkäisy johtaa lyhyessä ajassa sairaalloiseen lihavuuteen ja eläimen esittelyarvon menetykseen.

Eläintarhassa olevaa intaktia, hedelmällistä naarasleijonaa, joka painoi n. 200 kg ja joka oli poikinut elämässään jo viisi kertaa, käsiteltiin joka kolmas viikko kaksi kertaa D-Phe®,Gln®-GnRH:11a, ensin 50 yg:lla, 4 tunnin kuluttua 500 pg:lla ja sitten pidettiin kolmen viikon tauko. Tämä joka kolmas viikko tapahtuva käsittely suoritettiin kiiman alusta kiiman lajille ominaisen 50. päättymispäivään asti (siis huhtikuusta elokuuhun). Eläin käyttäytyi normaalisti ja pa-ritteli säännöllisesti kiiman aikana, kyseinen koiras oli tutkimuksen mukaisesti normosperminen. Naarasleijona ei tullut käsittelyn aikana kantavaksi eikä sen käyttäytymisessä eikä sen ulkonäössä havaittu poikkeamia normaalista.

17 85440

Esimerkki 14

Joukkokasvatusolosuhteissa puberteetissa olevien naaraspuolisten juoksijoiden sukutoiminnan käynnistäminen hedelmöit-tymisvalmiuden laukaisemiseksi ensimmäistä kertaa.

Joukkokasvatusolosuhteissa pyritään käyttämään kannan säilyttämiseksi tarkoitettuja jalostuseläimiä mahdollisimman pian jalostukseen ja synkronisoimaan hedelmöitys ja poikiminen niiden sovittamiseksi jatkuvaan teknologiaan. Suurena joukkona kasvatettavien naaraspuolisten juoksijoiden gonadiak-tiivisuus on esipuberteetin ja puberteetin aikana labiili, siitä syystä tapahtuu harvoin ja koko populaatiolle hajanaisesti, että sinänsä hedelmöittymisvalmista tilaa seuraa myöhemmin kantavuus.

Koetta varten etsittiin sianjalostusasemalla käytössä olevasta 200 jalostusemakosta - parhaimman kehityksen, parhaimman rehunkäyttökyvyn jne. perusteella - 60 eläintä. Nämä jaettiin sattumanvaraisesti 2 ryhmään, joissa kummassakin oli 30 eläintä. Kumpaakaan ryhmää, samoin tämän aseman teknologian mukaisesti, ei syötetty eikä niille annettu vettä 24 tuntiin. Eläimiä käsiteltiin niiden valinta-ajankohtana intramuskuläärisesti fysiologiseen keittosuolaliuokseen liuotetulla D-Phe®,Gln®-GnRH:lla. Injektiot, joissa oli 20 ug mainittua yhdistettä, toistettiin vielä kaksi kertaa 24 tunnin välein. Sekä käsittelemättömässä kontrolliryhmässä että käsitellyssä ryhmässä esiintyi hedelmöittymisvalmis tila ensimmäisen eläimen kohdalla 5 päivän kuluttua eläinten valinnan jälkeen. Molemmat kannat pidettiin samassa navetassa, samassa ilmatilassa, identtisissä olosuhteissa teknologian salliman 26 päivän ajan. Tänä aikana käsittelemättömistä kontrollieläimistä 3 eläintä (10 %), käsitellyistä eläimistä 21 eläintä (70 %) saavutti tuloksellisesti hedel-möittymisvalmiin tilan. Tuloksillisina kirjattiin ainoastaan ne tapaukset, joissa hedelmöittymisvalmista tilaa seurasi normaali kantavuus ja synnytys.

Tässä koesarjassa päämääränä ei ollut ovulaatioajankohdan tarkka säätäminen, koska ei ellut tarpeeksi käytettävissä

ia o 5 4 4 O

jalostuskarjuja. Tästä syystä päämääränä oli "ensimmäinen tuloksellinen hedelmöittymisvalmis tila" 26 päivän kuluessa. Kontrolliryhmän 10 %:n kantavan eläimen osuus vastasi aseman keskimäärää. Tästä syystä käsittelyllä aikaansaatu 60 %:nen kasvu merkitsee huomattavaa taloudellista hyötyä.

Esimerkki 15

Pitkään hedelmättömien chinchillojen käsittely.

20 chinchillas, jotka olivat vähintään 2 vuotta olleet hedelmättömiä, käsiteltiin intraperitoneaalisen injektion avulla kolmen päivän ajan päivittäin kaksi kertaa 10 g:11a D-Phe8,Gln8-GnRH:a. 4. päivänä annettiin 75 yg hormoniana-logia. Sitten eläimet jätettiin teknologian mukaisesti koiraiden luo. 12 chinchillaa poiki 4 kuukauden kuluessa.

Rinnan tämän kokeen kanssa käsiteltiin 3 erittäin arvokasta chinchillaa ("black"-mutanttia), jotka olivat olleet yli 2 vuotta hedelmättömiä, 3 päivän ajan päivittäin kaksi kertaa 10yg:lla D-Phe6,Gln8-GnRH:a. Vaikuttava aine annettiin intraperitoneaalisena injektiona. 4. päivänä annettiin 75 y g hormonianalogia, sitten eläimet jätettiin tavanomaisesti koiraan luo. 4 kuukauden kuluttua kaikki kolme eläintä poiki .

Tällä menetelmällä voidaan ottaa uudestaan jalostukseen pitkään hedelmättöminä olleita, korkaluokkaisia turkiseläimiä.

Esimerkki 16 Täysikasvuisten villikissojen kausiluonteisen hedelmöitty-misvälivaiheen eliminoiminen (Felis silvestris).

Kahta eläintarhassa olevaa naaraspuolista villikissaa, jotka painoivat keskimäärin 6 kg ja joiden sykli on luonnollisissa olosuhteissa helmi-/maaliskuussa, käsiteltiin elokuussa D-Phe6,Gln8-desGlyl8-GnRH-etyyliamidilla. Ennen käsittelyä molempien munasarjojen tilan tarkastamiseksi vatsaontelo avattiin narkoosissa. Sen jälkeen kun vatsaontelo oli ommeltu jälleen kiinni, eläimiä käsiteltiin pitämällä kaksipäiväisiä i9 85440 taukoja kaikkiaan neljä kertaa vaikuttavalla aineella, joka annettiin intramuskuläärisesti fysiologiseen keittosuola-liuokseen liuotettuna. Ensimmäisen ja toisen injektion välillä pidettiin 2 tunnin tauko; ensimmäinen annos oli 100 yg, toinen annos oli 500 y g. 48 tunnin kuluttua annettiin kolmas annos (100y g) ja kahden tunnin kuluttua tästä neljäs annos (500y g). 0., 2., 4. ja 8. päivänä vatsaontelo avattiin narkoosissa, munasarjojen tilan muutos arvioitiin visuaalisesti. Käsittelyjen jälkeen molemmat munasarjat poistettiin operatiivisesti, kiinnitettiin ja arvioitiin histo-logisesti.

0. päivänä molempien eläinten kohdalla vasemmassa munasarjassa oli 3-4 todennäköistä sekundääristä follikkelia, yksi surkastunut vanha keltarauhanen ja oikeassa munasarjassa 5-6 todennäköistä sekundääristä follikkelia. Käsittelyn avulla 4 päivän kuluttua kaikki sekundääriset follikkelit olivat kehittyneet Graafin follikkeleiksi, ovulaatio oli tapahtunut ja follikkelien tilalla oli keltarauhasiksi muodostuvia Corpora haemorrhagicumeja. Viimeksi mainittujen lisäksi kasvoi visuaalisesti ei-laskettavissa oleva määrä sekundäärisiä follikkeleita, jotka kehittyivät edelleen toisten käsittelyjen vaikutuksesta ja kasvoivat viimeisen 500 y g-an-noksen jälkeen intrafollikuläärisen luteinisoinnin kanssa. Visuaalisia löydöksiä tuki täysin histologinen arviointi.

Esitetyn käsittelyn avulla aikaansaatu ovulaatio osoittaa, että kissalajien kohdalla voidaan saada aikaan myös kauden ulkopuolella hedelmöitys ja voidaan saada myös aikaan vankeudessa eläviä jälkeläisiä.

Esimerkki 17

Kausiluonteisessa hedelmöittymisvälivaiheessa olevan sini-kettunaaraan käsittely hedelmällisen kiiman laukaisemiseksi.

Kausiluonteisessa hedelmöittymisvälivaiheessa oleva siniket-tunaaras tutkittiin laparoskooppisesti narkoosissa joulukuussa. Todettiin, että molemmat munasarjat olivat inaktii- 20 85440 visia, ne eivät sisältäneet kehittyviä follikkeleita eikä Graafin follikkeleita.

Eläintä käsiteltiin 10 päivän ajan päivittäin kaksi kertaa intramuskuläärisesti 1-5 pgslla D-Phe6,Gln8-GnRH:a. 10. päivänä suoritettiin jälleen laparoskooppinen tutkimus narkoosissa. Molemmissa munasarjoissa oli suuria keltarauhasia, joiden määrä - joka voitiin ainoastaan arvioida teknisten puutteiden johdosta - oli 10 - 20. Samanaikaisesti todettiin, että kohdun kaula oli avoin.

Samoin joulukuussa nisäsurkastuman johdosta jalostuksesta poistettavaa naarasta käsiteltiin samalla tavalla päivittäin kaksi kertaa 2 yg:lla D-Phe8,Gln8-GnRH:a. Käsittelyn vaikutus todettiin kohdun kaulan tilan muutoksena. 6. päivänä ensimmäisen käsittelyn jälkeen kohdun kaula avautui. Tämän jälkeen annettiin 50 yg:n annos. 16 tunnin kuluttua munasarjojen tila tutkittiin peilauksella; ovulaatio oli välittömästi edessä. Nyt avattiin vatsaontelo kokonaan, munasarjat poistettiin ja kaikkiaan 11 Graafin follikkelista poistettiin munasolut punktion avulla. Löydettiin kuusi normaalia munasolua, joita peitti normaali Corona radiata.

Tällä menetelmällä mahdollistettiin in vitro-hedelmöitykseen sopivien munasolujen, embryoiden valmistus kausiluonteisessa hedelmöittymisvälivaiheessa häiritsemättä normaalia vuosittaista sykliä. Tämä mahdollistaa erityisten hybridi jälkeläisten tuottamisen käyttämällä vähemmän arvokkaita vastaan-ottajaeläimiä.

Esimerkki 18

Infantiilisten kotikissojen (Felis cattus domesticus ) munasarjatoiminnan stimulointi D-Phe8,Gln8-GnRH:11a.

5 nuorta kissaa, joiden ikä oli 45 päivää ja jotka painoivat n. 0,3 kg, käsiteltiin kahden päivän välein kaikkiaan neljä kertaa 100 μ g :11a D-Phe8,Gln8-GnRH:a. Vaikuttava aine liuotettiin fysiologiseen keittosuolaliuokseen ja annettiin intramuskuläärisesti. Käsittelyn päätyttyä molemmat munasarjat 2i 8 5 4 40 poistettiin narkoosissa ja arvioitiin visuaalisesti. Tämän jälkeen munasarjat kiinnitettiin formaliiniin ja ne tutkittiin histologisesti. Molemmissa munasarjoissa oli 5-7 kpl Corpus haemorrhagicumia. Kuoren alta löydettiin kirkkaasta, vpinvärisesti munasarjasta hyvin erotettavia, kehityksessä olevia follikkeleita, joista muutamilla oli Graafin follikkelin koko.

Nämä tulokset osoittavat selvästi, että vielä infantiilisten kotikissojen munasarjassa on esitetyn menetelmän vaikutuksen ansiosta sukukypsälle eläimelle luonteenomaiset histologiset ja morfologiset ominaisuudet. Tällä tavalla eläin soveltuu ennen tavanomaisessa mielessä tarkoitettua biologista sukukypsyyttä hedelmöitykseen in vitro-sopivien munasolujen tuottamiseksi.

Esimerkki 19

Infantiilisten kotikissojen munasarjatoiminnan stimulointi D-Phe8,Trp7,Leu8-GnRH:lla.

5 nuorta kissaa, joiden ikä oli 45 päivää ja jotka painoivat noin 0,3 kg, käsiteltiin D-Phe6,Trp7,Leu8-GnRH:lla. Ennen käsittelyä vasen munasarja poistettiin operatiivisesti. Eläimille annettiin 2 päivän välein kaikkiaan kolme kertaa 100 yg:n annokset fysiologisessa keittosuolaliuoksessa valmistetun liuoksen muodossa intramuskuläärisesti. Käsittelyn päätyttyä jäljellä oleva (oikea) munasarja poistettiin, arvioitiin visuaalisesti ja tutkittiin kiinnityksen jälkeen histologisesti.

Ennen käsittelyä operatiivisesti poistetut munasarjat olivat täysin homogeenisia ja väriltään voinkeltaisia, kehittyviä follikkeleita ei voitu nähdä niissä visuaalisesti eikä histologisesti. Käsittelyn jälkeen munasarjoissa oli 7-8 kpl Corpus haemorrhagicumia ja useita (ei laskettavissa olevia) kehityksessä olevia follikkeleita.

Tämä tulos vahvistaa täysin esimerkin 18 mukaisesti saadut löydökset myös toisen hormonianalogin kohdalla ja tuottaa lisää kokemuksia munasarjojen muun syklin fysiologiasta.

22 ci 5 4 40

Esimerkki 20

Infantiilisten naaraspuolisten kotikissojen (Felis cattus domesticus) primordiaalisten follikkelien stimulointi.

5 nuorta kissaa, joiden ikä oli 45 päivää ja jotka painoivat noin 0,3 kg, käsiteltiin D-Phe^,Gln®-GnRH:lla. Ennen käsittelyä vasen munasarja poistettiin narkoosissa operatiivisesti. Sitten eläimet saivat 3 päivän ajan päivittäin kolme kertaa 4 tunnin välein kaikkiaan yhdeksän kertaa 0,1 y g vaikuttavaa ainetta intramuskuläärisesti fysiologisessa keitto-suolaliuoksessa ja propyleeniglykolissa valmistetun suspension muodossa. Käsittelyn päätyttyä jäljellä oleva munasarja poistettiin operatiivisesti, arvioitiin visuaalisesti ja tutkittiin kiinnityksen jälkeen histologisesti. Visuaalisesti molemmat munasarjat olivat homogeenisia ja väriltään voinkeltaisia, käsitelty munasarja oli hieman suurempi. Käsittelemättömissä munasarjoissa voitiin todeta ainoastaan primordiaalisia follikkeleita, kun taas käsiteltyjen munasarjojen leikkauspinnassa todettiin ei-laskettavissa oleva määrä (useita satoja) kehityksessä olevia, erilaisia ontelo-muodostuksen tiloja omaavia follikkeleita.

Tällä menetelmällä onnistuttiin stimuloimaan samanaikaisesti useita satoja munasarjojen primordiaalisia follikkeleita.

Esimerkki 21

Naudan munasolujen valmistus embryojalostusta varten in vitro post mortem-elinviljelystä.

Naudoista poistettiin 30 - 55 minuutin kuluttua siitä, kun ne oli tapettu teurastamolla ja annettu niiden veren valua pois, intaktit munasarjat ja ne asetettiin laboratorio-olosuhteissa komplettiin adujuvanttiin. Ravinnenesteeseen lisättiin 10“® - 10"® g/ml:n konsentraationa D-Phe®,Gln®, . desGlylO-GnRH-etyyliamidia· Elinviljelyssä pidetut munasar-jakannat ovuloivat 16 - 43 tunnin kuluttua. Munasarjoista spontaanilla in vitro tapahtuvalla ovuloinnilla ja tämän jälkeen punktiolla talteenotetuista munasoluista 85% pystyi 23 8 5 4 40 jatkamaan meioosia (reduktiivistä solujakautumista) ja ne voitiin hedelmöittää in vitro menestyksellisesti käyttökelpoisella naudan spermalla. Tarkkailtiin viljelyssä in vitro hedelmöitettyjen munasolujen ensimmäistä kahta solujakautumaa .

Tällä menetelmällä oli mahdollista samoin kuin maailmanlaajuisesti levinneessä nautojen keinosiemennysteknologiassa "keinosiementää", s.o. istuttaa välittömästi eläviä embryoi-ta. Teurastamoilla on mahdollista tuottaa tarvetta paljon suurempia määriä embryoita.

Claims (2)

1. 24 H 5 4 4 O